JP2017038553A - Micro rna for diagnosis of asthma - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、喘息を診断するためのデータを収集する方法や喘息の診断用キットに関する。 The present invention relates to a method for collecting data for diagnosing asthma and a kit for diagnosing asthma.
現在社会においては、自動車や工場等からの排気ガス、化学物質、粉塵等による大気汚染が顕著となり、それに伴い気管支喘息患者数は増えている。喘息は、発作時に気管支平滑筋の収縮・攣縮が起こり、重積発作時は呼吸困難の状態から喘息死に至る重篤な疾患である。 Currently, in the society, air pollution from exhaust gas, chemical substances, dust, etc. from automobiles and factories has become prominent, and the number of patients with bronchial asthma is increasing accordingly. Asthma is a serious disease that causes contraction and spasm of bronchial smooth muscle during seizures and leads to death from asthma during intussusception.
喘息は要因や症状が複合的に絡み合うことが多く、その診断は難しいとされている。このため、国際指針のＧＩＮＡ（Global Initiative for Asthma）をはじめとして、各国において診断や治療のためのガイドラインが提案されている。しかしながらこのようなガイドラインは、あくまでも症状に応じた診断基準を提供するものであり、典型的な症状が現れていない患者に対しては診断を下しにくく、患者が早期に適切な診断や治療を受けられないおそれがある。また、喘息は重症度によって治療方針が異なるため、患者の負担やリスクを軽減するためにも、正確性の高い喘息の診断基準の確立が急務であった。 Asthma often has multiple factors and symptoms intertwined, making it difficult to diagnose. For this reason, guidelines for diagnosis and treatment have been proposed in various countries, including the global guidelines for GINA (Global Initiative for Asthma). However, these guidelines provide diagnostic criteria according to the symptoms, and it is difficult to make a diagnosis for patients who do not show typical symptoms. There is a risk that it will not be received. In addition, asthma has a different treatment policy depending on its severity, so it is urgent to establish a highly accurate diagnosis standard for asthma in order to reduce the burden and risk of patients.
近年、遺伝子レベルのアプローチによる喘息の診断方法が開発されてきている。例えば、気道上皮細胞の杯細胞への分化・増殖に関連する指標遺伝子の発現レベルを測定することにより、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患の検査方法が報告されている（特許文献１）。しかし、かかる方法では、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患とを区別することができず、また、喘息の重症度を判断できるかどうかや、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できるかどうか不明である。また、ＩＬ１２Ｂ遺伝子多型及びＴ−ｂｅｔ遺伝子多型を検出することにより、喘息の遺伝的要因の検査方法が報告されている（それぞれ特許文献２及び３）。しかし、かかる方法により、環境等後天的な要因によって生じる喘息や、喘息の重症度を判断できるかどうかや、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できるかどうか不明である。また、リンパ球における特定のマイクロＲＮＡが、小児喘息患者において高発現又は低発現していることが報告されている（非特許文献１）。しかし、かかる特定のマイクロＲＮＡは、喘息の重症度を判断できるものであるかや、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できるものであるかは不明である。 In recent years, methods for diagnosing asthma using a gene-level approach have been developed. For example, a test method for bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease has been reported by measuring the expression level of an indicator gene related to differentiation / proliferation of airway epithelial cells into goblet cells (Patent Document 1). However, this method cannot distinguish between bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease, can we determine the severity of asthma, and can we diagnose asthma even when atopic dermatitis is complicated? Whether it is unknown. In addition, methods for examining genetic factors of asthma have been reported by detecting IL12B gene polymorphism and T-bet gene polymorphism (Patent Documents 2 and 3, respectively). However, it is unclear whether this method can determine asthma caused by acquired factors such as the environment, the severity of asthma, and whether asthma can be diagnosed even when atopic dermatitis occurs. In addition, it has been reported that specific microRNAs in lymphocytes are highly or lowly expressed in children with asthma (Non-Patent Document 1). However, it is unclear whether such specific microRNA can determine the severity of asthma or can diagnose asthma even when atopic dermatitis is complicated.
本発明の課題は、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、喘息の有無や喘息の重症度を精度よく診断できる診断マーカーを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a diagnostic marker that can accurately diagnose the presence or absence of asthma and the severity of asthma even when atopic dermatitis is complicated.
本発明者らは、上記課題を解決するため、気管支喘息（Bronchial Asthma；ＢＡ）患者由来の血清サンプルにおけるマイクロＲＮＡや、ＢＡ及びアトピー性皮膚炎（Atopic Dermatitis；ＡＤ）患者におけるマイクロＲＮＡと、アレルギー疾患の既往歴のない対照者におけるマイクロＲＮＡとを比較して解析を進めたところ、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、特定のマイクロＲＮＡの発現量の変化を指標として、喘息の有無や喘息の重症度を判定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have developed a microRNA in a serum sample derived from a bronchial asthma (BA) patient, a microRNA in a BA and Atopic Dermatitis (AD) patient, and allergy. Analysis was conducted by comparing microRNAs in control subjects with no history of disease, and even when atopic dermatitis occurred, the presence or absence of asthma and asthma It has been found that the severity of can be determined, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の［Ａ群マイクロＲＮＡ］及び［Ｂ群マイクロＲＮＡ］から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡ（以下、「喘息診断用マイクロＲＮＡ」ということがある。）を検出することを特徴とする喘息を診断するためのデータを収集する方法。
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ
（２）喘息が気管支喘息であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）マイクロＲＮＡが、［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（２−１）のマイクロＲＮＡ、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）のマイクロＲＮＡであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）以下の［Ａ群マイクロＲＮＡ］及び［Ｂ群マイクロＲＮＡ］から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡを検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする喘息の診断用キット。
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ
（５）喘息が気管支喘息であることを特徴とする上記（４）に記載のキット。
（６）マイクロＲＮＡが、［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（２−１）のマイクロＲＮＡ、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）のマイクロＲＮＡであることを特徴とする上記（４）又は（５）に記載のキット。
That is, the present invention is as follows.
(1) Detecting at least one or more microRNAs selected from the following [Group A microRNA] and [Group B microRNA] (hereinafter sometimes referred to as “microRNA for asthma diagnosis”). A method of collecting data for diagnosing characteristic asthma.
[Group A microRNA]
(1-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
(1-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
(2-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
(2-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
[Group B microRNA]
(3-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
(3-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is increased compared to the control RNA
(2) The method according to (1) above, wherein the asthma is bronchial asthma.
(3) The microRNA is the microRNA of (1-1) and (2-1) in [Group A microRNA] and the microRNA of (3-1) in [Group B microRNA]. The method according to (1) or (2) above.
(4) A primer or probe for detecting at least one microRNA selected from the following [Group A microRNA] and [Group B microRNA], or a label thereof: Asthma diagnostic kit.
[Group A microRNA]
(1-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
(1-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
(2-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
(2-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
[Group B microRNA]
(3-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
(3-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is increased compared to the control RNA
(5) The kit according to (4) above, wherein the asthma is bronchial asthma.
(6) The microRNA is a microRNA of (1-1) or (2-1) in [Group A microRNA] and a microRNA of (3-1) in [Group B microRNA]. The kit according to (4) or (5) above.
上記本発明の方法は、医師による喘息の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。 The method of the present invention described above is a method for assisting diagnosis of asthma by a doctor, and does not include a diagnosis act by a doctor.
また、本発明の実施の他の形態として、喘息診断用マイクロＲＮＡを検出することを特徴とする喘息の診断方法を挙げることができる。 Another embodiment of the present invention includes an asthma diagnosis method characterized by detecting asthma diagnosis microRNA.
本発明によると、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、小児気管支喘息等の喘息の有無や、喘息の重症度、具体的には、軽症の喘息（軽症間欠型喘息、軽症持続型喘息）を精度よく診断できるため、喘息の早期発見に必要な定期健診等の喘息の検診者の増加が期待される他、喘息の重症度（軽症間欠型、軽症持続型、中等症持続型、及び重症持続型）をより正確に分類し、効果的な喘息治療が可能となるため、ＱＯＬ（Quality of Life）の向上や医療費削減等の効果が期待される。また、喘息炎診断用マイクロＲＮＡが制御する遺伝子の発現を解明することにより、喘息の病態を反映したエンドタイプを明らかにし、より有効な喘息の個別治療法の開発につながることが期待される。 According to the present invention, even when atopic dermatitis is complicated, the presence or absence of asthma such as childhood bronchial asthma, the severity of asthma, specifically, mild asthma (mild intermittent asthma, mild persistent asthma) As it can be diagnosed with high accuracy, it is expected that there will be an increase in the number of screening for asthma such as periodic medical checkups necessary for early detection of asthma, and the severity of asthma (slightly intermittent, mild persistent, moderate persistent, and severe) Sustainable type) can be more accurately classified and effective asthma treatment can be achieved, so that an effect of improving QOL (Quality of Life) and reducing medical expenses is expected. In addition, by clarifying the expression of genes that are controlled by microRNAs for diagnosing asthma, it is expected to clarify the end types that reflect the pathology of asthma and to develop more effective individual therapies for asthma.
本発明の喘息を診断するためのデータを収集する方法（以下、単に「本件収集方法」という）としては、例えば、被験者（提供者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ、すなわち、上記［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（１−２）のマイクロＲＮＡ（以下、これらを総称して「喘息診断用マイクロＲＮＡ１」という）、（２−１）及び（２−２）のマイクロＲＮＡ（以下、これらを総称して「喘息診断用マイクロＲＮＡ２」という）、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）及び（３−２）のマイクロＲＮＡ（以下、これらを総称して「喘息診断用マイクロＲＮＡ３」という）から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡの発現量を検出・定量し、喘息の有無や喘息の重症度、好ましくは軽症の喘息（軽症間欠型喘息、又は軽症持続型喘息）を診断するためのデータを収集する方法であれば特に制限されず、また、本発明の喘息の診断用キット（以下、単に「本件診断用キット」という）としては、喘息診断用マイクロＲＮＡを検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を、少なくとも１つ以上備える、喘息の有無や喘息の重症度、好ましくは軽症の喘息（軽症間欠型喘息、又は軽症持続型喘息）を診断するためのキットであれば特に制限されず、ここで本件診断用キットは、喘息を診断するためのキットに関する用途発明であり、このキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、喘息を診断するための説明書等の添付文書が通常含まれる。なお、喘息診断用マイクロＲＮＡには、喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）が便宜上含まれる。 As a method for collecting data for diagnosing asthma according to the present invention (hereinafter simply referred to as “the present collection method”), for example, microRNA for asthma diagnosis in a biological sample collected from a subject (provider), that is, In the above [Group A microRNA], the microRNAs of (1-1) and (1-2) (hereinafter collectively referred to as “microRNA1 for asthma diagnosis”), (2-1) and (2- 2) microRNA (hereinafter collectively referred to as "microRNA2 for asthma diagnosis"), and (3-1) and (3-2) microRNA in [Group B microRNA] (hereinafter referred to as these) The expression level of at least one or more microRNAs selected from "Asthma Diagnosis MicroRNA 3") is generally detected and quantified to determine the presence or absence of asthma and the severity of asthma, preferably The method for collecting data for diagnosing mild asthma (mild intermittent asthma or mild persistent asthma) is not particularly limited, and the asthma diagnostic kit of the present invention (hereinafter simply referred to as “this diagnosis”). As kit)), the presence or absence of asthma and the severity of asthma, preferably mild asthma, comprising at least one primer or probe for detecting asthma microRNA or a label thereof. If it is a kit for diagnosing mild intermittent asthma or mild persistent asthma), the present diagnostic kit is a use invention relating to a kit for diagnosing asthma. In addition to the components generally used in this type of diagnostic kit, such as carriers, pH buffers, stabilizers, etc., usually include package inserts such as instruction manuals and instructions for diagnosing asthma. It is. The asthma diagnosis microRNA includes a reverse transcription product (cDNA) of the asthma diagnosis microRNA for convenience.
本件収集方法及び本件診断用キットにおける喘息診断用マイクロＲＮＡとしては、具体的には、喘息診断用マイクロＲＮＡ１〜３のいずれか１つのマイクロＲＮＡの他、喘息診断用マイクロＲＮＡ１（［１−１］又は［１−２］）及び喘息診断用マイクロＲＮＡ２（［２−１］又は［２−２］）の２つのマイクロＲＮＡ、喘息診断用マイクロＲＮＡ１（［１−１］又は［１−２］）及び喘息診断用マイクロＲＮＡ３（［３−１］又は［３−２］）の２つのマイクロＲＮＡ、喘息診断用マイクロＲＮＡ２（［２−１］又は［２−２］）及び喘息診断用マイクロＲＮＡ３（［３−１］又は［３−２］）の２つのマイクロＲＮＡ、喘息診断用マイクロＲＮＡ１（［１−１］又は［１−２］）、喘息診断用マイクロＲＮＡ２（［２−１］又は［２−２］）、及び喘息診断用マイクロＲＮＡ３（［３−１］又は［３−２］）の３つのマイクロＲＮＡを挙げることができ、これらの中でも、精度よく喘息を診断できるため、喘息診断用マイクロＲＮＡ１〜３の３つのマイクロＲＮＡが好ましく、中でも上記（１−１）、（２−１）、及び（３−１）のマイクロＲＮＡ３つを好適に例示することができる。 As the asthma diagnosis microRNA in this collection method and this diagnosis kit, specifically, asthma diagnosis microRNA 1 as well as any one of asthma diagnosis microRNA1 to microRNA1 ([1-1] Or [1-2]) and two microRNAs for diagnosis of asthma 2 ([2-1] or [2-2]), microRNA1 for diagnosis of asthma ([1-1] or [1-2]) And two microRNAs for asthma diagnosis microRNA3 ([3-1] or [3-2]), asthma diagnosis microRNA2 ([2-1] or [2-2]) and asthma diagnosis microRNA3 ( [3-1] or [3-2]) two microRNAs, asthma diagnosis microRNA1 ([1-1] or [1-2]), asthma diagnosis microRNA2 ([2-1] or [2-1] 2-2 ) And microRNA 3 for asthma diagnosis ([3-1] or [3-2]), and among these, asthma can be diagnosed with high accuracy. Three microRNAs of 3 are preferable, and among them, the above three microRNAs of (1-1), (2-1), and (3-1) can be preferably exemplified.
本発明において「喘息」とは、気管や気管支等の気道、好ましくは気管支の慢性的な炎症や気道狭窄が生じた状態を意味する。また、本発明において「アトピー性皮膚炎」とは、増悪・寛解を繰り返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患を意味する。 In the present invention, “asthma” means a state in which chronic inflammation or airway narrowing of the airways such as the trachea and bronchi, preferably bronchi, has occurred. Further, in the present invention, “atopic dermatitis” means a disease in which pruritus with pruritus, which causes repeated exacerbations / remissions, is the main lesion.
本件収集方法における被験者としては、喘息かどうか不明な被験者（例えば、アトピー性皮膚炎患者）や、喘息の重症度が不明な喘息患者（例えば、アトピー性皮膚炎を併発した喘息患者）を挙げることができる。かかる喘息かどうか不明な被験者には、過去に喘息（小児喘息又は成人喘息）に罹患したことがあり、被検時に喘息かどうか不明な被験者も含まれ、また、上記喘息の重症度が不明な喘息患者には、過去に喘息（小児喘息又は成人喘息）に罹患したことがあり、被検時に喘息の重症度が不明な喘息患者も含まれる。なお、小児喘息患者とは、通常１６歳以下、好ましくは１５歳以下、より好ましくは１４歳以下の喘息患者を意味し、成人喘息患者とは、通常１５歳以上、好ましくは１６歳以上、より好ましくは１８歳以上の喘息患者を意味する。 Examples of subjects in this collection method include subjects with unknown asthma (eg, atopic dermatitis patients) and asthmatic patients with unknown asthma severity (eg, asthmatic patients with atopic dermatitis) Can do. Such subjects with unknown asthma may have suffered from asthma in the past (childhood asthma or adult asthma), including subjects with unknown asthma at the time of the test, and the severity of the asthma is unknown Asthma patients include those who have had asthma (childhood asthma or adult asthma) in the past and whose asthma severity is unknown at the time of the test. In addition, the child asthma patient means an asthma patient usually 16 years old or less, preferably 15 years old or less, more preferably 14 years old or less, and an adult asthma patient is usually 15 years old or more, preferably 16 years old or more, more Preferably, it means an asthmatic patient 18 years or older.
上記生体試料としては、組織、細胞、器官等の非液性試料や、血液、尿、唾液等の液性試料や、血液から調製された血清や血漿を挙げることができ、これらの中でも血清が好ましい。 Examples of the biological sample include non-liquid samples such as tissues, cells, and organs, liquid samples such as blood, urine, and saliva, and serum and plasma prepared from blood. preferable.
本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ａ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ１及び２）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少している場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ａ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ１及び２）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少していない場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 In this collection method, the expression level of micro RNA (micro RNA 1 and 2 for asthma diagnosis) in [Group A micro RNA] in a biological sample collected from a subject whose asthma is unknown is compared with a biological sample derived from a control person. Such a subject can collect data for diagnosing that the subject is likely to have asthma, and in a biological sample taken from a subject whose asthma is unknown [A If the expression level of the microRNA in the group microRNA] (microRNA1 and 2 for asthma diagnosis) is not decreased compared to the biological sample derived from the control, the subject is unlikely to suffer from asthma. Data for diagnosing can be collected.
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ｂ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ３）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加している場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ｂ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ３）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加していない場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 Further, in this collection method, the expression level of microRNA (microRNA3 for asthma diagnosis) in [Group B microRNA] in a biological sample collected from a subject whose asthma is unknown is compared with a biological sample derived from a control person. Such a subject can collect data for diagnosing that the subject is likely to have asthma, and in a biological sample taken from a subject whose asthma is unknown [B Group microRNA], if the expression level of microRNA (microRNA3 for asthma diagnosis) is not increased compared to the biological sample derived from the control, it is diagnosed that the subject is less likely to suffer from asthma Data can be collected.
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者（中等症持続型喘息患者、又は重症持続型喘息患者）由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ軽症喘息患者（軽症間欠型喘息患者、又は軽症持続型喘息患者）由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 In this collection method, the expression level of microRNA1 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a subject whose asthma is unknown is decreased as compared to a biological sample derived from a control person, and moderate or severe asthma Asthma diagnostic micro in a biological sample collected from a subject who is increased in comparison with a biological sample derived from a patient (moderate persistent asthma patient or severe persistent asthma patient) or whether asthma is unknown The expression level of RNA1 is decreased compared to a biological sample derived from a control, and increased or decreased compared to a biological sample derived from a mild asthmatic patient (mild intermittent asthmatic patient or mild persistent asthmatic patient). If not, such subjects can collect data to diagnose that they are likely to have mild asthma, and asthma diagnosis in biological samples taken from subjects with unknown asthma If the expression level of microRNA1 for use is decreased compared to a biological sample derived from a control and not increased compared to a biological sample derived from a patient with moderate or severe asthma, or whether the asthma is unknown If the expression level of microRNA1 for asthma diagnosis in a biological sample collected from is increased or decreased compared to a biological sample derived from a patient with mild asthma, the subject may be suffering from mild asthma Data for diagnosing low can be collected.
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少している場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少していない場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 Further, in this collection method, the expression level of microRNA2 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a subject whose asthma is unknown is reduced as compared with a biological sample derived from a control person, and moderate or severe asthma When the amount of expression of microRNA2 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a subject unknown asthma is lower than that of a biological sample derived from a patient, compared to a biological sample derived from a control person Such subjects may collect data to diagnose that they are more likely to have mild asthma if they have not decreased or increased or decreased compared to biological samples from patients with mild asthma. Expression of microRNA2 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a subject who is able to determine whether or not asthma is reduced compared to a biological sample derived from a control person, and patients with moderate or severe asthma When the amount of expression of microRNA2 for asthma diagnosis in a biological sample collected from a subject unknown asthma is not reduced compared to a conventional biological sample or compared with a biological sample derived from a control person If decreased and increased or decreased compared to a biological sample from a patient with mild asthma, such subjects can collect data to diagnose that they are less likely to have mild asthma .
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 Moreover, in this collection method, the expression level of asthma diagnosis microRNA3 in a biological sample collected from a subject whose asthma is unknown is increased as compared with a biological sample derived from a control person, and moderate or severe asthma The amount of expression of microRNA3 for asthma diagnosis in a biological sample collected from a subject whose asthma is unknown is compared with that of a biological sample derived from a control subject when it is increased compared to a biological sample derived from a patient. Such subjects may collect data to diagnose that they are more likely to have mild asthma if not increased or decreased compared to a biological sample from a patient with mild asthma. Expression of microRNA3 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a subject who is able to determine whether or not asthma is increased compared to a biological sample derived from a control person, and a patient with moderate or severe asthma When the amount of expression of microRNA 3 for asthma diagnosis in a biological sample collected from a subject unknown asthma is not increased as compared with a conventional biological sample or compared with a biological sample derived from a control person If increased and decreased or increased compared to a biological sample from a patient with mild asthma, the subject can collect data to diagnose that the subject is less likely to have mild asthma .
また、本件収集方法において、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 Moreover, in this collection method, the expression level of microRNA1 for asthma diagnosis in a biological sample collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown is compared with a biological sample derived from a patient with moderate or severe asthma. Or the expression level of microRNA1 for asthma diagnosis in a biological sample collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown is compared with a biological sample derived from a mild asthmatic patient. If not increased or decreased, data can be collected to diagnose the subject as likely to have mild asthma and collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown If the expression level of microRNA1 for diagnosis of asthma in the obtained biological sample is not increased as compared with biological samples derived from patients with moderate or severe asthma, or asthmatic patients whose asthma severity is unknown When the expression level of microRNA1 for asthma diagnosis in a biological sample collected from a person is increased or decreased compared to a biological sample derived from a mild asthma patient, the subject is suffering from mild asthma. Data can be collected for diagnosing low likelihood.
また、本件収集方法において、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少している場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少していない場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 In this collection method, the expression level of microRNA2 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown is compared with that of a biological sample derived from a patient with moderate or severe asthma. Or the expression level of microRNA2 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown is compared with a biological sample derived from a mild asthmatic patient. If not increased or decreased, data can be collected to diagnose the subject as likely to have mild asthma and collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown Asthma diagnosis microRNA2 expression level in the prepared biological sample is not decreased as compared to biological samples derived from patients with moderate or severe asthma, or asthmatic patients whose asthma severity is unknown If the expression level of microRNA2 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a person is increased or decreased compared to a biological sample derived from a patient with mild asthma, the subject is suffering from mild asthma. Data can be collected for diagnosing low likelihood.
また、本件収集方法において、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。 In this collection method, the expression level of microRNA3 for asthma diagnosis in a biological sample collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown is compared with that of a biological sample derived from a patient with moderate or severe asthma. Or the expression level of microRNA3 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown, as compared with a biological sample derived from a mild asthmatic patient If not increased or decreased, data can be collected to diagnose the subject as likely to have mild asthma and collected from an asthmatic patient (subject) whose asthma severity is unknown If the expression level of microRNA3 for diagnosis of asthma in the obtained biological sample is not increased as compared with biological samples derived from patients with moderate or severe asthma, or asthma patients whose asthma severity is unknown If the expression level of microRNA3 for diagnosis of asthma in a biological sample collected from a person is increased or decreased compared to a biological sample derived from a mild asthmatic patient, the subject is suffering from mild asthma. Data can be collected for diagnosing low likelihood.
本件収集方法において、上記対照者由来の生体試料としては、健常者由来の組織、細胞、器官、血液、尿、唾液、血清、血漿等の試料の他、医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかに喘息に罹患していないと判断されるかかる試料を例示することができ、上記軽症、中症又は重症喘息患者由来の生体試料としては、軽症喘息患者（軽症間欠型喘息患者、又は軽症持続型喘息患者）、中症喘息患者（中等症持続型喘息患者）又は重症喘息患者（重症持続型喘息患者）由来の組織、細胞、器官、血液、尿、唾液、血清、血漿等の試料を例示することができる。また、これら対照者由来の生体試料や、軽症、中症又は重症喘息患者由来の生体試料は、採取された後に、被験者由来の生体試料と同様の処理が施されたものが好ましい。 In the present collection method, the biological sample derived from the above-mentioned control subject is a sample from a healthy person, such as tissue, cells, organs, blood, urine, saliva, serum, plasma, etc. Such a sample that is clearly judged not to suffer from asthma can be exemplified, and as a biological sample derived from the above-mentioned mild, moderate or severe asthma patients, mild asthma patients (mild intermittent asthma patients, or mild Persistent asthma patients), moderate asthma patients (moderate persistent asthma patients) or severe asthma patients (severe persistent asthma patients) tissues, cells, organs, blood, urine, saliva, serum, plasma, etc. It can be illustrated. Moreover, the biological sample derived from these controls and the biological sample derived from patients with mild, moderate or severe asthma are preferably collected and then subjected to the same treatment as the biological sample derived from the subject.
本件収集方法において、喘息診断用マイクロＲＮＡの発現量を検出・定量する方法としては、喘息断用マイクロＲＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、被験者由来の生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、喘息診断用マイクロＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、被験者由来の生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いて喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）を合成した後、かかる逆転写産物を特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、被験者由来の生体試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いて喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）を合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでかかる逆転写産物をラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的に逆転写産物を標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）に相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。 In this collection method, as a method for detecting and quantifying the expression level of microRNA for asthma diagnosis, any method can be used as long as it can specifically detect part or all of microRNA for asthma diagnosis. Well, specifically, a method of extracting and purifying total RNA in cells in a biological sample derived from a subject and detecting it by Northern blotting using a probe composed of a base sequence complementary to microRNA for asthma diagnosis, Extract and purify total RNA in cells in a biological sample derived from a subject, synthesize a reverse transcript (cDNA) of a microRNA for asthma diagnosis using reverse transcriptase, and then specifically amplify the reverse transcript Detection by quantitative PCR methods such as competitive PCR and real-time PCR using primer pairs, and in cells in biological samples derived from subjects After purifying the total RNA and synthesizing the reverse transcript (cDNA) of microRNA for asthma diagnosis using reverse transcriptase, the reverse transcript is labeled with biotin or digoxigenin, and fluorescent substance After indirectly labeling the reverse transcript with an antibody that recognizes avidin or digoxigenin, which has high affinity for biotin labeled, on a support that can be used for hybridization such as glass, silicon, and plastic Examples include a method of detecting with a microarray using a probe having a base sequence complementary to a reverse transcription product (cDNA) of the immobilized microRNA for asthma diagnosis.
本件診断用キットにおけるプライマーとしては、喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）の上流又は下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー（対）であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ｃＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１０〜３０塩基を選択することができる。 The primer in this diagnostic kit is a complementary primer (pair) that can anneal to a part of the upstream or downstream sequence of the reverse transcription product (cDNA) of the microRNA for asthma diagnosis. The site of annealing with the cDNA, the length of the cDNA to be amplified, and the like can be appropriately selected in consideration of the amplification efficiency and specificity of the cDNA. For example, 10 to 30 bases can be selected as the length of the primer sequence.
本件診断用キットにおけるプローブとしては、喘息診断用マイクロＲＮＡの一部若しくは全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、ハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。 As a probe in the diagnostic kit, if part or all of the microRNA for asthma diagnosis is a probe, the length of the probe, the site to be hybridized, etc., consider the efficiency and specificity of hybridization. Can be selected as appropriate.
本件診断用キットの標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。 As a labeling substance in the labeling substance of the diagnostic kit, peroxidase (for example, horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malic acid dehydrase Enzymes such as elementary enzyme, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, urease, luciferase or acetylcholinesterase, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate, green fluorescence Protein (Green Fluorescence Protein; GFP), Cyan Fluorescence Protein (CFP), Blue Fluorescent Protein (Blue Fluor) Fluorescence proteins such as luminescence protein (BFP), yellow fluorescence protein (YFP), red fluorescence protein (RFP), luciferase, 3 H, 14 C, 125 I or 131 I Mention may be made of radioactive isotopes, biotin, avidin or chemiluminescent substances.
本発明において、「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、より好ましくは１〜４個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。 In the present invention, the “nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added” is usually in the range of 1 to 10, preferably in the range of 1 to 7, more preferably Within the range of 1-6, more preferably within the range of 1-5, more preferably within the range of 1-4, more preferably within the range of 1-3, more preferably within the range of 1-2. Most preferably, it means a nucleotide sequence in which one number of nucleotides is deleted, substituted or added.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
１．喘息（小児気管支喘息）診断用マイクロＲＮＡの同定
１−１ 血清由来のＲＮＡの抽出
千葉大学医学部附属病院小児科及び千葉県こども病院アレルギー膠原病科に通院中の、気管支喘息（ＢＡ）を罹患する１０〜１４歳の男子２名及び女子３名の計５名（ＢＡ群）、ＢＡとアトピー性皮膚炎（ＡＤ）の両方を罹患する１１〜１４歳の男子１名及び女子４名の計５名（ＢＡ／ＡＤ群）、並びにアレルギー疾患の既往歴のない１１〜１２歳の男子２名及び女子３名の計５名（対照群）から血液を採取し、血清サンプルを得た後、miRNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって血清サンプルからトータルＲＮＡを精製した。
1. Identification of microRNA for diagnosis of asthma (childhood bronchial asthma) 1-1 Extraction of RNA derived from serum Patients suffering from bronchial asthma (BA) while visiting the Department of Pediatrics, Chiba University Hospital and Department of Allergy Collagenology, Chiba Children's Hospital 10 -5 boys and 2 girls aged 14 to 3 in total (BA group), 5 boys and girls aged 11 to 14 years affected by both BA and atopic dermatitis (AD) (BA / AD group), and blood samples were collected from 5 men (control group), 2 boys and 3 girls aged 11 to 12 years who have no history of allergic disease, and after obtaining serum samples, miRNeasy Mini Using a kit (manufactured by Qiagen), total RNA was purified from the serum sample according to the attached protocol.
１−２ マイクロＲＮＡの発現量の網羅的解析
上記トータルＲＮＡを鋳型として、miScript SYBR Green PCR Kit (1000)（Qiagen社製、Cat. No. 218075）を用い、添付のプロトコールにしたがって逆転写及びリアルタイムＰＣＲ法により１７９種類のヒトマイクロＲＮＡの発現量を網羅的に解析した。
1-2 Comprehensive analysis of microRNA expression level Using the total RNA as a template, miScript SYBR Green PCR Kit (1000) (Qiagen, Cat. No. 218075), reverse transcription and real-time according to the attached protocol. The expression level of 179 types of human microRNAs was comprehensively analyzed by the PCR method.
１−３ 結果
対照群と比較してＢＡ群において増減が認められたマイクロＲＮＡを解析したところ、４種類のマイクロＲＮＡの発現量は有意に減少し、１種類のマイクロＲＮＡは有意に増加することが確認された。
また、対照群と比較してＢＡ／ＡＤ群において増減が認められたマイクロＲＮＡを解析したところ、９種類のマイクロＲＮＡの発現量は有意に減少し、１種類のマイクロＲＮＡの発現量は有意に増加することが確認された。
これら発現量の増減が認められたマイクロＲＮＡのうち、ＢＡ群とＢＡ／ＡＤ群に共通して発現量の増減が認められたマイクロＲＮＡを調べたところ、２種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p［配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ］、及びhsa-miR-486-5p［配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ］）の発現量は有意に減少し、１種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-144-5p［配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ］）の発現量は有意に増加することが確認された（表１参照）。なお、これら３種類のマイクロＲＮＡの検出に用いたプライマーセットを表２に示す。
1-3 Results Analysis of microRNAs that showed an increase / decrease in the BA group compared to the control group revealed that the expression levels of the four types of microRNAs decreased significantly, and that one type of microRNA increased significantly. Was confirmed.
In addition, when microRNA in which increase / decrease was observed in the BA / AD group as compared with the control group was analyzed, the expression level of 9 types of microRNA was significantly decreased, and the expression level of 1 type of microRNA was significantly decreased. Increase was confirmed.
Among the microRNAs in which the increase / decrease in the expression level was observed, the microRNAs in which the increase / decrease in the expression level was commonly observed in the BA group and the BA / AD group were examined. Two types of microRNAs (hsa-miR- The expression level of 185-5p [RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1] and hsa-miR-486-5p [RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2]) was significantly reduced, and one kind The expression level of the microRNA (hsa-miR-144-5p [RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3]) was confirmed to increase significantly (see Table 1). Table 2 shows primer sets used for detection of these three types of microRNAs.
以上の結果から、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できる診断マーカーとして、３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）が同定された。 From the above results, three types of microRNAs (hsa-miR-185-5p, hsa-miR-486-5p, and hsa-miR-144) can be used as diagnostic markers that can diagnose asthma even when atopic dermatitis is complicated. -5p) was identified.
２．喘息診断用マイクロＲＮＡを用いた小児気管支喘息の診断
同定した喘息診断用マイクロＲＮＡを用いて、小児気管支喘息を効果的に診断できるかどうかを、検体数を増やして解析した。対照群１３名及びＢＡ群６３名から、上記実施例１に記載の方法にしたがって、血清由来のトータルＲＮＡを精製し、上記３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量を解析した。その結果、実施例１の結果と同様に、ＢＡ群における２種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p及びhsa-miR-486-5p、）の発現量は、対照群と比べ有意に減少し（図１Ａ及びＢ参照）、また、ＢＡ群における１種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-144-5p）の発現量は、対照群と比べ有意に増加すること（図１Ｃ参照）が確認された。この結果は、２種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p及びhsa-miR-486-5p、）の発現量の減少や、１種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-144-5p）の発現量の増加を指標にして、喘息の有無を診断できることを示している。
2. Diagnosis of childhood bronchial asthma using microRNA for diagnosing asthma Using the identified microRNA for diagnosing asthma, whether or not childhood bronchial asthma can be effectively diagnosed was analyzed by increasing the number of samples. Serum-derived total RNA was purified from 13 control groups and 63 BA groups according to the method described in Example 1 above, and the above three types of microRNAs (hsa-miR-185-5p, hsa-miR-) were purified. 486-5p and hsa-miR-144-5p) were analyzed. As a result, similar to the result of Example 1, the expression levels of the two types of microRNAs (hsa-miR-185-5p and hsa-miR-486-5p) in the BA group were significantly reduced compared to the control group. (See FIGS. 1A and B), and the expression level of one type of microRNA (hsa-miR-144-5p) in the BA group was significantly increased compared to the control group (see FIG. 1C). It was. This result shows that the expression level of two types of microRNAs for diagnosis of asthma (hsa-miR-185-5p and hsa-miR-486-5p) is reduced, and one type of microRNA for diagnosis of asthma (hsa-miR- It is shown that the presence or absence of asthma can be diagnosed using the increase in the expression level of 144-5p) as an index.
３．喘息診断用マイクロＲＮＡの発現量を指標としたクラスター解析
３−１ クラスター解析
千葉大学医学部附属病院及び千葉県こども病院の小児科外来に通院中の、小児気管支喘息を罹患する、又は罹患した経験のある６〜２１歳の男子４６名及び女子２１名の計６７名（ＢＡ群）について、年令、性別、家族歴、肥満の有無、ペットの飼育歴、他のアレルギー疾患の合併、末梢血好酸球数、血清総ＩｇＥ、１５項目の吸入抗原特異的ＩｇＥ、呼吸機能、呼気中一酸化窒素濃度（ＦｅＮＯ）、治療ステップ、治療コントロール状態等約６０項目を同時期に調査した。さらに、上記実施例１に記載の方法にしたがって、上記３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量を解析し、かかる発現量を指標としてWard法によるクラスター解析を行った。
3. Cluster analysis with microRNA expression level for asthma diagnosis as an index 3-1 Cluster analysis Childhood bronchial asthma who has been or has been suffering from pediatric outpatient clinics of Chiba University Hospital and Chiba Children's Hospital For a total of 67 men (BA group) of 46 boys and 21 girls aged 6 to 21 years old, sex, family history, presence of obesity, pet breeding history, other allergic diseases, peripheral blood eosin About 60 items such as the number of spheres, total serum IgE, inhaled antigen-specific IgE of 15 items, respiratory function, exhaled nitric oxide concentration (FeNO), treatment step, treatment control status, etc. were investigated at the same time. Furthermore, according to the method described in Example 1 above, the expression levels of the three types of microRNAs (hsa-miR-185-5p, hsa-miR-486-5p, and hsa-miR-144-5p) are analyzed. Then, cluster analysis by the Ward method was performed using the expression level as an index.
３−２ 結果
ＢＡ群は４つのクラスターに分類され、そのうち、上記１種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p）の発現量が低く、かつ、上記２種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量が高いクラスター（クラスター１）は、他のクラスター（クラスタ２〜４）と比べ、末梢血好酸球数、血清総ＩｇＥ値（図２Ａ参照）、及びＦｅＮＯ（図２Ｂ参照）が低く、軽症の小児気管支喘息に分類されることが示された。この結果は、１種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p）の発現量の減少や、２種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量の増加を指標にして、ＢＡ群の中から軽症の小児気管支喘息を診断できることを示している。
3-2 Results The BA group is classified into four clusters, of which the expression level of the one type of microRNA (hsa-miR-185-5p) is low and the two types of microRNAs (hsa-miR-) 486-5p and hsa-miR-144-5p) are highly expressed in the cluster (cluster 1), compared to the other clusters (clusters 2 to 4), the number of peripheral blood eosinophils and the total serum IgE value (Fig. 2A), and FeNO (see FIG. 2B) were low, indicating that it was classified as mild childhood asthma. This result shows a decrease in the expression level of one type of asthma diagnosis microRNA (hsa-miR-185-5p) and two types of asthma diagnosis microRNAs (hsa-miR-486-5p and hsa-miR-). 144-5p) as an index, indicating that children with bronchial asthma can be diagnosed from the BA group.
本発明によると、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、小児気管支喘息等の喘息の有無や喘息の重症度を精度よく診断できるため、喘息の診断や、喘息の重症度に合わせた個別的な治療に資するものである。 According to the present invention, even when atopic dermatitis is complicated, the presence or absence of asthma such as childhood bronchial asthma and the severity of asthma can be accurately diagnosed. It is conducive to treatment.
Claims (6)
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ A method for collecting data for diagnosing asthma, comprising detecting at least one microRNA selected from the following [Group A microRNA] and [Group B microRNA].
[Group A microRNA]
(1-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
(1-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
(2-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
(2-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
[Group B microRNA]
(3-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
(3-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is increased compared to the control RNA
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ Asthma diagnosis comprising a primer or probe for detecting at least one microRNA selected from the following [Group A microRNA] and [Group B microRNA], or a label thereof: For kit.
[Group A microRNA]
(1-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
(1-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
(2-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
(2-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is reduced compared to the control RNA
[Group B microRNA]
(3-1) RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
(3-2) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added, and the expression in the subject is increased compared to the control RNA
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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- 2015-08-20 JP JP2015162356A patent/JP2017038553A/en active Pending
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