KR101291953B1 - TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same - Google Patents

TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same Download PDF

Info

Publication number
KR101291953B1
KR101291953B1 KR1020110116846A KR20110116846A KR101291953B1 KR 101291953 B1 KR101291953 B1 KR 101291953B1 KR 1020110116846 A KR1020110116846 A KR 1020110116846A KR 20110116846 A KR20110116846 A KR 20110116846A KR 101291953 B1 KR101291953 B1 KR 101291953B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sirna
atopic dermatitis
gene
tlr8
expression
Prior art date
Application number
KR1020110116846A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20130051605A (en
Inventor
윤원석
정지태
유영
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020110116846A priority Critical patent/KR101291953B1/en
Publication of KR20130051605A publication Critical patent/KR20130051605A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101291953B1 publication Critical patent/KR101291953B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 상기 siRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 치료용 조성물은 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 아토피성 피부질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a small interfering RNA having a therapeutic effect on atopic dermatitis, and more particularly, to a small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of Tolyreceptor-8 gene and transformed into a recombinant vector expressing the siRNA. It relates to a composition for treating atopic dermatitis containing bacterial cells as an active ingredient. According to the present invention, a therapeutic composition using a small interference RNA (siRNA) having a therapeutic effect on atopic dermatitis can be very useful in the pharmaceutical industry as a treatment and prevention agent for atopic dermatitis, in which an intractable disease is absent. have.

Description

톨라이크리셉터―８ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭ＲＮＡ 및 이를 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물{TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same}TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same}

본 발명은 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭RNA 및 이를 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 톨라이크리셉터-8(Toll like receptor 8; 이하, TLR8과 혼용함) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)와 이를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 성분을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 등 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a small interfering RNA that inhibits the expression of Tolyreceptor-8 gene and a composition for treating atopic dermatitis containing the same, and more specifically, toll like receptor 8 (hereinafter, used in combination with TLR8). The present invention relates to a composition for treating inflammatory diseases such as atopic dermatitis, which contains a small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of a gene and a bacterial component transformed with a recombinant vector expressing the same as an active ingredient.

아토피성 피부염은 현대인에게 빈번하게 발생되고 있는 의학적으로 원인이 불분명한 만성적 피부질환이다. 아토피성 피부염은 일반적으로 인간 면역체계의 불균형에 의해 초래된 질환으로 알려져 있다. 면역학적으로 외부의 자극에 대해 체내의 면역계가 과민반응을 유도하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 주로 혈액 중 IgE의 농도 상승을 지표로 하여 과민하게 히스타민(histamine)류의 분비가 가려움증 및 염증을 유도하는 것으로 알려져 있다. Atopic dermatitis is a chronic skin disease of unknown medical origin that is frequently occurring in modern people. Atopic dermatitis is generally known as a disease caused by imbalance of the human immune system. Immunologically, the immune system in the body is known to induce hypersensitivity to external stimuli. It is known that secretion of histamines induces itching and inflammation, mainly by increasing the concentration of IgE in the blood.

보다 구체적으로 살펴보면 우리 몸의 면역은 B 림프구가 주관하는 체액성 면역과 T 림프구가 주관하는 세포성 면역으로 이루어져 있다. 세포성 면역을 주관하는 T 세포에는 Tc-세포와 Th-세포가 있으며, Th-세포는 Th-1과 Th-2로 구분된다. 상기 Th-1과 Th-2의 균형이 깨져 Th-2의 양이 갑자기 늘어나고 Th-1의 양이 줄어들면 알레르기 질환, 즉 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 등의 질환이 발생하며, 반대로 Th-1의 양이 많이 늘어나게 되면 자가 면역 질환이 초래된다. 따라서 Th-2 면역반응의 과민은 아토피성 피부질환의 핵심요소이다. Th-2 면역반응은 즉시형 과민반응으로 IL-4, IL-5, IL-13 사이토카인의 분비를 매개로 이루어지며, IL-4와 IL-13은 B 세포의 isotype을 자극하고 Ig-E의 생성을 조절한다.More specifically, the body's immunity consists of humoral immunity administered by B lymphocytes and cellular immunity administered by T lymphocytes. T cells that control cellular immunity are Tc-cells and Th-cells, and Th-cells are divided into Th-1 and Th-2. When the balance of Th-1 and Th-2 is broken and the amount of Th-2 suddenly increases and the amount of Th-1 decreases, allergic diseases such as atopic dermatitis, allergic rhinitis, and allergic asthma occur. On the contrary, increasing the amount of Th-1 causes autoimmune diseases. Therefore, hypersensitivity of the Th-2 immune response is a key factor in atopic skin disease. Th-2 immune response is an immediate type hypersensitivity reaction mediated by the secretion of IL-4, IL-5 and IL-13 cytokines. IL-4 and IL-13 stimulate B-cell isotype and Ig-E Regulates the creation of

최근 들어 국내외적으로 아토피성 피부염 발병이 소아에서 성인에 이르기까지 광범위하게 발생하고 있어 치료제의 개발이 시급하다. In recent years, the development of a therapeutic agent is urgent because atopic dermatitis has been widespread from children to adults.

현재 아토피 피부염 치료는 양방의 경우 연고나 경구투여, 주사제를 이용하는데 약물들을 살펴보면 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등이 사용되고 있으나, 부신피질 호르몬제와 같은 스테로이드제의 경우 소염작용과 면역억제 작용이 있어 즉각적으로 증상을 완화하는 효과는 우수하지만 장기간 사용할 경우 심각한 피부 부작용이 생길 우려가 크고 세균의 감염이 발생할 수 있다. 또 항히스타민제는 가려움증을 일시적으로 경감시킬 뿐이며 항생제의 경우 포도상구균 등의 2차 세균 감염을 치료하기 위해 사용될 뿐이다. 최근에 타크로리무스(tacrolimus, Protopic™) 또는 피메크로리무스(pimecrolimus, Elidel™)와 같은 calcineurin 저해제가 아토피성 피부염 치료제로 이용되고 있는데, 이 두 가지 약물도 모두 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 면역억제제이기 때문에 신속한 증상완화를 가져오나 효과는 일시적이며 지속적으로 사용시 피부의 자연방어상태를 약하게 하는 단점이 있다. Currently, in the treatment of atopic dermatitis, ointment, oral administration, and injections are used in both cases. When looking at drugs, steroids, antihistamines, and antibiotics are used, but steroids such as corticosteroids have anti-inflammatory and immunosuppressive effects. Although the effect is immediately relieved, prolonged use may cause serious skin side effects and bacterial infections. Antihistamines only temporarily relieve itching, and antibiotics are used to treat secondary bacterial infections, such as staphylococci. Recently, calcineurin inhibitors such as tacrolimus (Protopic ™) or pimecrolimus (Elidel ™) have been used for the treatment of atopic dermatitis, both of which are immunosuppressive agents that inhibit the expression of inflammatory cytokines. Because of the rapid symptom relief, but the effect is temporary, the weakness of the natural defense of the skin when used continuously.

따라서, 아토피성 피부염 증상의 일시적인 경감효과가 아닌 원천적인 해결방법으로 부작용이 없는 안전하면서도 우수한 효능을 가진 광범위한 치료제 개발이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for developing a wide range of therapeutic agents with safe and excellent efficacy without side effects as a source solution rather than a temporary alleviation effect of atopic dermatitis symptoms.

한편, TLR8은 현재까지 바이러스의 단일가닥 RNA에 반응하여 선천면역(INNATE IMMUNITY)을 유도하는 단백질로 주로 알려져 있다(Heil, F., H. Hemmi, H. Hochrein, F. Ampenberger, C. Kirschning, S. Akira, G. Lipford, H. Wagner, S. Bauer. 2004. Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like receptor 7 and 8. Science 303: 1526-1529).On the other hand, TLR8 is known as a protein that induces innate immunity (INNATE IMMUNITY) in response to the single-stranded RNA of the virus (Heil, F., H. Hemmi, H. Hochrein, F. Ampenberger, C. Kirschning, S. Akira, G. Lipford, H. Wagner, S. Bauer. 2004. Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like receptor 7 and 8. Science 303: 1526-1529).

본 발명의 배경이 되는 기술로서 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0029187호(2009.03.20)의 TLR7 및 TLR8에 대한 안정화된 면역 조절성 RNA[SIMRA] 화합물이 공개되어 있으나, 이는 네키드 RNA(naked RNA) TLR7 및/또는 TLR 8에 대한 리간드로서 지속적으로 인식되도록 RNA를 유지하면서, 생체 내 유용한 분자가 될 수 있도록 그 안정성을 개선시키기 위한 안정화된 면역 조절성 RNA ("SIMRA") 화합물 및 면역 반응을 유도하고/거나 증가시키는 이의 사용 방법에 관한 것이다. 아직까지 TLR8 유전자의 발현을 억제하는 siRNA을 이용한 아토피성 피부염 치료제가 알려져 있지는 않다. As a background technology of the present invention, stabilized immunomodulatory RNA [SIMRA] compounds for TLR7 and TLR8 of Korean Patent Application Laid-Open Publication No. 10-2009-0029187 (2009.03.20) have been disclosed. naked RNA) Stabilized immunomodulatory RNA ("SIMRA") compounds and immunity to improve their stability to be useful molecules in vivo while maintaining RNA to be constantly recognized as a ligand for TLR7 and / or TLR 8 To a method of use thereof which induces and / or increases the response. There is no known therapeutic agent for atopic dermatitis using siRNA that inhibits expression of the TLR8 gene.

또한, 대한민국 특허공보 제10-0650451(2006.11.27)에는 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 약독화된 살모넬라 균주에 대해 기재가 되어 있으나, 살모넬라 균주를 경구 투여시 아토피성 피부염에 대한 치료효과는 거의 없었다.
In addition, Korean Patent Publication No. 10-0650451 (Nov. 27, 2006) describes attenuated Salmonella strains having a therapeutic effect on atopic dermatitis. However, the oral administration of Salmonella strains has almost no therapeutic effect on atopic dermatitis. There was no.

대한민국 공개특허공보 제10-2009-0029187호(2009.03.20)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0029187 (2009.03.20) 대한민국 특허공보 제10-0650451호(2006.11.27)Republic of Korea Patent Publication No. 10-0650451 (Nov. 27, 2006) 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0056055호(2011.05.26)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2011-0056055 (2011.05.26)

본 발명자는 TLR8 유전자 발현을 억제하는 특정 siRNA가 아토피성 피부염의 개선에 관여한다는 것을 유전체 분석을 통해 최초로 확인하고 이들의 아토피성 피부염 등의 치료효과를 시험하여 경구 투여시에도 피부염억제효과가 유도된다는 것을 규명하였다.The present inventors first confirmed through genome analysis that specific siRNAs that inhibit TLR8 gene expression are involved in the improvement of atopic dermatitis, and tested their therapeutic effects such as atopic dermatitis and induced dermatitis inhibitory effect upon oral administration. It was identified.

따라서, 본 발명의 목적은 TLR8 유전자의 발현을 억제시킴으로써 IFN-γ의 발현을 증가시켜 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to increase the expression of IFN- [gamma] by inhibiting the expression of the TLR8 gene to provide a small interfering RNA (siRNA) having a therapeutic effect on atopic dermatitis.

본 발명의 다른 목적은 상기 TLR8 유전자의 표적서열에 특이적인 siRNA를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a composition for the treatment of atopic dermatitis comprising siRNA specific to the target sequence of the TLR8 gene as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 TLR8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 이용한 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. Still another object of the present invention is to provide a composition for treating atopic dermatitis using bacterial cells transformed with recombinant vectors expressing small interfering RNAs (siRNAs) that inhibit the expression of the TLR8 gene.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 21 ~ 25개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 단일 염기 가닥인 siRNA의 RNAi(RNA interference)를 살모넬라를 캐리어로 이용하여 아토피성 피부염이 유발된 실험군에 경구 투여하는 경우, Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ의 발현을 증가시키며, 또한 아토피 질환의 지표인 가려움증을 급격히 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have diligently researched to overcome the problems of the prior arts. As a result, atopic dermatitis was induced using Salmonella as a carrier of RNAi (RNA interference) of siRNA, which is a single base strand composed of 21 to 25 nucleotides. When orally administered to the experimental group, it was confirmed that it is possible to increase the expression of IFN-γ, which is an indicator of Th-1 immune response, and to rapidly reduce the itch, which is an indicator of atopic disease, and completed the present invention.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭RNA(siRNA)을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of the Tolyreceptor-8 gene and has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명에 있어서 'siRNA(small interfering RNA)'란 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNA 간섭을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 말한다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중가닥 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 쌍을 이루는 염기 길이는 10 내지 40 염기, 바람직하게는 15 내지 30 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNA 간섭 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 또는 돌출 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출 구조와 5' 말단 돌출 구조 모두 가능하다.In the present invention, 'siRNA (small interfering RNA)' refers to a short double-stranded RNA that can induce RNA interference through cleavage of specific mRNA. siRNAs are not limited to pairs of double-stranded RNA portions that are paired with each other, but are paired by mismatch (corresponding bases are not complementary), bulge (no bases corresponding to one chain) May be included. The paired base length is 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases. The siRNA terminal structure can be either a smooth end or a protruding end if it can inhibit the expression of the target gene by RNA interference. The sticky end structure can have both a 3 'end protruding structure and a 5' end protruding structure.

본 발명의 상기 siRNA는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA인 것을 특징으로 한다. 상기 siRNA는 21 ~ 25 뉴클레오티드의 TLR8 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열로써, 바람직하게는 상기 서열번호 2의 염기서열과 이와 상보적인 서열을 포함하는 이중가닥(double-strand) siRNA일 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1과 서열번호 2의 이중가닥 올리고(top 및 bottom strand)를 합성하여 사용하였다. 상기 siRNA는 TLR8 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 번역을 방해하는 과정을 통해 유전자 기능을 억제한다. 다음 표 1 및 표 2는 siRNA에 쓰이는 TLR8 유전자의 target sequence와 siRNA의 서열을 나타낸 것이다.The siRNA of the present invention is characterized by being an siRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The siRNA is a nucleotide sequence complementary to the mRNA of the TLR8 gene of 21 to 25 nucleotides, and preferably may be a double-stranded siRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a sequence complementary thereto. In the present invention, the double stranded oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (top and bottom strand) were synthesized and used. The siRNA inhibits gene function through a process that interferes with the translation by complementarily binding to the mRNA of the TLR8 gene. Table 1 and Table 2 show the target sequence and siRNA sequence of the TLR8 gene used for siRNA.

Figure 112011088760061-pat00001
Figure 112011088760061-pat00001

Figure 112011088760061-pat00002
Figure 112011088760061-pat00002

본 발명의 siRNA는 그 활성을 저하시키지 않는 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA의 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다.SiRNAs of the invention include variants having one or more substitutions, insertions, deletions, and combinations thereof that do not degrade their activity. Such modifications may have a sequence homology of 80% or more, preferably 90%, more preferably 95% or more, with the sequence of the above siRNA.

본 발명의 siRNA는 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G 등, (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520), 인비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR 등, (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian celss, Science 296: 550-553) 등 당업계에 공지된다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.The siRNA of the present invention can be directly chemically synthesized (Sui G et al., (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520), It can be synthesized by a variety of methods known in the art, such as a method using synthetic transcription (Brummelkamp TR et al., (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian celss, Science 296: 550-553). .

본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥 siRNA를 형성하고 있는 형태이지만, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR 발현카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수도 있다.The siRNA of the present invention is basically a form in which two strands of RNA are paired to form a double stranded siRNA, but is modified into a structure having a short hairpin to be used for transfection by a plasmid shRNA vector and a PCR expression cassette. It may be in the form.

본 발명에 따른 siRNA 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)" 된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 "발현조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
The siRNA polynucleotide sequence according to the present invention may be operably linked to an expression control sequence, wherein the operably linked gene sequence and expression control sequence are one expression containing a selection marker and a replication origin together. Can be included in a vector. By “operably linked” may be a gene and expression control sequences linked in such a way as to enable gene expression when the appropriate molecule is bound to the expression control sequences. The "expression control sequence" refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for carrying out transcription, any operator sequence for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant vector comprising a gene for transcription of the siRNA.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 siRNA를 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떠한 발현벡터도 사용할 수 있다. 특별히 이에 제한되지는 않으나, 통상적인 siRNA 발현용 벡터인 psiRNA(Invitrogen, USA), pRNA(GenScript, USA), psLentGene(Promega, USA), pSIREN(Clontech, USA), pU6shX(VectorCoreA, Korea), 또는 pSilencer(ambion, USA)에 상기 siRNA에 대응하는 DNA 염기 서열이 삽입될 수 있다. 벡터의 컨스트럭트는 형질전환될 형태, 시간 및 siRNA 발현 수준 등과 같은 특정 환경에 의해 결정된다. 바람직하게는 도 1의 A에 도시된 pcDNA-TLR8miRNA의 개열지도에 나타난 발현벡터인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the recombinant vector may use any expression vector having a promoter capable of expressing the siRNA and a multicloning site for cloning. Although not particularly limited thereto, conventional siRNA expression vectors psiRNA (Invitrogen, USA), pRNA (GenScript, USA), psLentGene (Promega, USA), pSIREN (Clontech, USA), pU6shX (VectorCoreA, Korea), or The DNA base sequence corresponding to the siRNA may be inserted into pSilencer (ambion, USA). The construct of the vector is determined by the specific circumstances such as the form to be transformed, the time of day and the level of siRNA expression. Preferably, it is an expression vector shown in a cleavage map of pcDNA-TLR8miRNA shown in FIG. 1A.

벡터는 순수 플라스미드 DNA 또는 형질감염 시약 또는 표적-전달 물질과 함께 복합체로 또는 재조합 바이러스 벡터의 형태로 세포 내 핵으로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 렌티 바이러스를 포함하는 레트로바이러스 등의 바이러스 등이 사용될 수도 있다. 바람직하게 상기 벡터는 예를 들어 살모넬라와 같은 박테리아 세포에 의해 전달된다.
The vector can be delivered in complex with pure plasmid DNA or transfection reagent or target-transmitting material or into the intracellular nucleus in the form of a recombinant viral vector. As the viral vector, viruses such as adenoviruses, adeno-associated viruses, retroviruses including lenti viruses, and the like may be used. Preferably said vector is delivered by bacterial cells, for example Salmonella.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for treating atopic dermatitis containing the recombinant vector as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention is transformed with a recombinant vector comprising a gene that inhibits the expression of the Tolyreceptor-8 gene and transcribes a small interfering RNA (siRNA) having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 Provided is a composition for treating atopic dermatitis containing bacterial cells as an active ingredient.

본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물에 있어서, 상기 박테리아 세포는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 한다. 살모넬라 균주는 장티푸스를 유발하는 group D Salmonella에 속하는 병원균으로서, 본 발명에서는 상기 살모넬라 균주의 병원성을 없애기 위해 약독화된(attenuated) 살모넬라 균주를 사용하였다. 상기 약독화된 살모넬라 균주는 장티프스 예방용 약독화 백신인 것을 특징으로 한다. 상기 "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 만든 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고, 면역 체계만을 자극하여 면역성을 유도하는 것을 의미한다.In the composition for treating atopic dermatitis of the present invention, the bacterial cells are characterized in that the Salmonella typhimurium (salmonella typhimurium). The Salmonella strain belongs to the group D Salmonella which causes typhoid fever. In the present invention, an attenuated Salmonella strain was used to eliminate the pathogenicity of the Salmonella strain. The attenuated Salmonella strain is characterized in that it is an attenuated vaccine for typhoid prevention. The term " attenuation "refers to artificially weakening the toxicity of a living pathogen. It means mutating a gene involved in essential metabolism of a pathogen and inducing the immune system by stimulating only the immune system without causing disease in the body .

본 발명의 구체적인 실시예에 사용된 살모넬라 균주는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium) BRD509 균주로, 병원성이 없는 약독화된 균주이다.Salmonella strains used in the specific examples of the present invention are Salmonella typhimurium BRD509 strains, which are attenuated strains without pathogenicity.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 TLR8 유전자를 억제시키는 siRNA를 발현하는 재조합 벡터를 약독화된 살모넬라 균주에 형질도입 함으로써 본 발명의 살모넬라를 제작하고, 아토피와 유사한 피부병을 유발시킨 마우스 모델에 상기 형질도입된 살모넬라를 투여함으로써 그에 의한 아토피성 피부질환의 예방 및 치료효과를 형질도입 시키지 않은 대조군 살모넬라 자체에 의한 효과와 비교분석하여 확인하였다. 분석 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 것과 같이, 형질도입시키지 않은 살모넬라만을 경구투여시 아토피 피부염에 거의 효과가 없으며, TLR8 유전자 발현을 억제하는 siRNA를 발현하는 재조합 벡터를 형질도입시킨 살모넬라를 경구투여한 경우 아토피성 피부염을 치료하는 효과가 나타남을 확인하였다.In a specific embodiment of the present invention, by introducing a recombinant vector expressing siRNA that inhibits the TLR8 gene into an attenuated Salmonella strain, Salmonella of the present invention was produced, and transduced into a mouse model causing atopic dermatitis. Administration of Salmonella was confirmed by comparison with the effect of the control Salmonella itself, which did not introduce the prophylactic and therapeutic effects of atopic dermatological diseases. As a result of the analysis, as shown in Fig. 6 and 7, oral administration of only untransduced Salmonella has little effect on atopic dermatitis, oral administration of Salmonella transduced with a recombinant vector expressing siRNA that inhibits TLR8 gene expression. In one case, the effect of treating atopic dermatitis was confirmed.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 siRNA를 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떠한 발현벡터도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 도 1의 A에 도시된 pcDNA-TLR8miRNA의 개열지도에 나타난 발현벡터인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the recombinant vector may be any expression vector having a promoter capable of expressing the siRNA and a multicloning site for cloning, but preferably, the cleavage of pcDNA-TLR8miRNA shown in A of FIG. 1. Characterized in that it is an expression vector shown on the map.

본 발명에서 아토피성 피부염 치료 효과를 유도하는 siRNA를 발현하는 살모넬라 균주는 당업계에서 통상 사용되는 형질도입방법에 의해 제조가능하며, 제조된 살모넬라를 체내에 도입시킬 때, 상기 siRNA가 과발현될 수 있다.
Salmonella strains expressing siRNA that induces atopic dermatitis therapeutic effect in the present invention can be prepared by a transduction method commonly used in the art, and when the prepared Salmonella is introduced into the body, the siRNA may be overexpressed. .

본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물은 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있어 이를 참조할 수 있다. 또한 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다. 바람직하게는 경구 투여된다.The composition for treating atopic dermatitis of the present invention may be prepared by a method known in the pharmaceutical field for use as a medicament, and may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent, etc. to powder, granule, tablet, capsule Or in the form of an injection or the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995). They may also be administered parenterally (e. G., Intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally. Preferably orally.

본 발명의 치료용 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 질병의 증상, 투여시간, 투여방법에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.
The therapeutic composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount. The term "therapeutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and includes the age, sex, weight, , The time of administration, and the method of administration, and preferably 0.01 to 100 mg per day on an adult basis may be administered.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 TLR8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 제조할 수 있으며, 상기 박테리아 세포를 이용하여 아토피성 피부염의 유발을 억제시킬 수 있다. 상기 TLR8 유전자에 특이적인 siRNA(small interfering RNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 피부염이 유발된 쥐에 투여한 경우, 아토피성 피부염의 억제인자인 IFN-γ의 발현을 증가시켰으며 동시에 아토피 질환의 지표인 Ig-E의 면역반응을 억제시키는 효과를 확인할 수 있었다. 또한 상기 면역반응의 결과로 아토피성 피부염의 증상인 가려움증 및 피부염의 증상완화 효과가 나타남을 확인하였다. 따라서, 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 치료용 조성물은 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 아토피성 피부질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
As described above, according to the present invention, a bacterial cell transformed with a recombinant vector expressing a small interfering RNA (siRNA) that suppresses the expression of the TLR8 gene can be prepared, and induces atopic dermatitis using the bacterial cell. Can be suppressed. When Salmonella BRD509 strain transduced with a recombinant vector expressing a small interfering RNA (siRNA) specific for the TLR8 gene was administered to a dermatitis-induced rat, the expression of IFN-γ, an inhibitor of atopic dermatitis, was increased. At the same time, the effect of suppressing the immune response of Ig-E, an indicator of atopic disease, was confirmed. In addition, as a result of the immune response it was confirmed that the symptoms of atopic dermatitis itching and dermatitis symptomatic effect. Therefore, the therapeutic composition using a small interference RNA (siRNA) having a therapeutic effect on atopic dermatitis can be very useful in the pharmaceutical industry as a treatment and prevention of atopic dermatitis, in which there is no appropriate therapeutic agent for refractory diseases.

도 1은 본 발명에 의한 TLR8 유전자의 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pcDNA-TLR8miRNA의 개열지도(도 1의 A)와, 각각의 벡터의 siRNA발현에 의한 특이적으로 TLR8 유전자가 억제된 결과를 보인 도면이다(도 1의 B). control은 PBS, miRCV(CV)는 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터, miRTLR8(mi-TLR8)은 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA를 발현하는 재조합 벡터를 나타낸다. 그 결과 TLR8 유전자의 siRNA는 TLR8을 억제할 수 있음을 보여주었다.
도 2는 본 발명에 의한 TLR8 유전자의 siRNA가 타겟 유전자인 TLR8 뿐 아니라 IL-1a, IL-1b, IL-18, CCL17, CCL22 등도 동시에 억제시킬 수 있는 다중 유전자 억제효과를 가지고 있음을 확인한 도면이다. 본 발명에 의한 하나의 siRNA는 여러 유전자를 동시에 억제할 수 있다.
도 3은 본 발명에 의한 TLR8 유전자 siRNA(또는 miRNA)를 발현하는 벡터와 상기 벡터를 함유한 살모넬라를 세포에 각각 처리한 후 siRNA의 발현을 GFP 발현분석을 통해 확인한 실험 결과를 나타낸다. 이를 통해 본 발명에 의한 siRNA발현 벡터는 유전자건이나 리포좀 등의 별도의 조작 없이는 세포에 일반적으로 들어가 발현할 수 없으나 살모넬라에 들어간 벡터의 경우 효과적으로 세포 내에서 발현될 수 있음을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명에 의한 조성물에 의해 TLR8 유전자 siRNA를 발현하는 살모넬라를 경구투여한 후 염증사이토카인의 변화를 측정한 결과를 보인 도면이다. 도 4의 A는 벡터도 포함하지 않은 대조군 마우스 세럼에서의 염증사이토카인을 측정한 결과이고(control-mouse serum), 도 4의 B는 본 발명에 의한 siRNA를 발현하는 벡터를 투여한 후 마우스 세럼에서의 염증사이토카인 변화를 나타내고(control vector mouse serum), 도 4의 C는 본 발명에 의한 상기 벡터를 함유하는 살모넬라를 투여한 후 마우스 세럼에서의 염증사이토카인 변화를 나타낸다(ST-miR TLR8 mouse serum). 도 4의 C에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 siRNA를 발현하는 벡터를 함유하는 살모넬라를 경구투여하면 아토피성 피부염의 억제인자인 IFN-gamma의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명에 의한 TLR8 유전자 siRNA를 발현하는 살모넬라를 PBS에 혼탁하여 경구투여할 경우 마우스동물의 체내에 살모넬라가 이동하여 분포하고 체내의 조직에서 신장(kidney), 비장(spleen), 간(liver)에서 발현이 유도됨을 보여주는 도면이다. 대조군으로 벡터 또는 합성 siRNA만을 PBS에 혼탁하여 동일양으로 투여한 경우에는 조직 내에서 siRNA 발현이 관찰되지 않았다.
도 6은 본 발명에 의한 조성물에 의한 아토피성 피부염이 유도된 마우스에서의 miRTLR8을 경구투여한 후에 가려움증(SCRATCH/15MIN)의 저하를 확인한 결과를 보인 도면이다. CON : PBS 경구투여군, CV는 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터를 형질도입시킨 살모넬라 균주 경구 투여군, miRTLR8 : TLR8 유전자에 특이적인 siRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 균주 경구 투여군.
도 7은 아토피성 피부염을 유도시킨 마우스에서 본 발명에 의한 조성물에 의한 피부의 염증 완화를 보여주는 도면이다. CON : PBS 경구투여군, CV는 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터를 형질도입시킨 살모넬라 균주 경구 투여군, miRTLR8 : TLR8 유전자에 특이적인 siRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 균주 경구 투여군. 도 7의 C에 나타난 바와 같이, TLR8siRNA를 투여한 마우스에서 피부염증의 완화가 뚜렷하게 관찰된다.1 is a cleavage map of the recombinant vector pcDNA-TLR8miRNA comprising a gene for transcription of the siRNA of the TLR8 gene according to the present invention (A of FIG. 1), and the TLR8 gene is specifically suppressed by siRNA expression of each vector. The figure which showed the result (FIG. 1B). Control is PBS, miRCV (CV) is a vector that does not insert a miRNA specific to the TLR8 gene, miRTLR8 (mi-TLR8) represents a recombinant vector expressing a miRNA specific to the TLR8 gene. The results showed that siRNAs of the TLR8 gene could inhibit TLR8.
2 is a view confirming that the siRNA of the TLR8 gene according to the present invention has a multiple gene inhibitory effect that can simultaneously inhibit not only TLR8, which is a target gene, but also IL-1a, IL-1b, IL-18, CCL17, and CCL22. . One siRNA according to the present invention can simultaneously inhibit several genes.
Figure 3 shows the results of experiments confirming the expression of siRNA through GFP expression analysis after treating the cells expressing the TLR8 gene siRNA (or miRNA) and Salmonella containing the vector to the cells according to the present invention. Through this, the siRNA expression vector according to the present invention cannot be generally expressed in cells without a separate manipulation such as a gene gun or liposome, but it can be confirmed that the vector entered into Salmonella can be effectively expressed in cells.
4 is a view showing the results of measuring the change of inflammatory cytokines after oral administration of Salmonella expressing TLR8 gene siRNA by the composition according to the present invention. 4A is a result of measuring inflammatory cytokines in a control mouse serum which does not include a vector (control-mouse serum), and FIG. 4B is a mouse serum after administration of a vector expressing siRNA according to the present invention. Inflammatory cytokine change in (control vector mouse serum), Figure 4C shows the inflammatory cytokine change in the mouse serum after administration of Salmonella containing the vector according to the present invention (ST-miR TLR8 mouse serum). As shown in Fig. 4C, oral administration of Salmonella containing the vector expressing siRNA according to the present invention can be seen to increase the expression of IFN-gamma, an inhibitor of atopic dermatitis.
5 shows that Salmonella expressing the TLR8 gene siRNA according to the present invention in turbidity orally administered to PBS, Salmonella is distributed in the body of the mouse animal and kidney, spleen, liver ( Figure shows that expression is induced in the liver). As a control, siRNA expression was not observed in tissues when only the vector or synthetic siRNA was clouded in PBS and administered in the same amount.
Figure 6 is a view showing the result of confirming the decrease in the itch (SCRATCH / 15MIN) after oral administration of miRTLR8 in atopic dermatitis induced mice by the composition according to the present invention. CON: PBS oral administration group, CV is an oral administration group of Salmonella strains transduced with a miRNA-specific vector inserted into the TLR8 gene, miRTLR8: Oral Salmonella strains transduced with a recombinant vector expressing a siRNA specific to the TLR8 gene.
7 is a view showing the relief of inflammation of the skin by the composition according to the invention in mice induced atopic dermatitis. CON: PBS oral administration group, CV is an oral administration group of Salmonella strains transduced with a miRNA-specific vector inserted into the TLR8 gene, miRTLR8: Oral Salmonella strains transduced with a recombinant vector expressing a siRNA specific to the TLR8 gene. As shown in FIG. 7C, alleviation of dermatitis is clearly observed in mice administered with TLR8siRNA.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예Example 1.  One. TLR8TLR8 유전자에 특이적인  Gene-specific miRNAmiRNA 의 구축Build

TLR8 유전자 염기서열에서 miRNA에 상보적인 타겟(target) 염기서열을 결정하기 위해, miRNA 활성 효율에 영향을 주는 이차 구조(secondary structure), GC contents, cis-acting sequences 등을 고려하여 functional miRNA를 설계할 수 있는 알고리즘 프로그램에 TLR8 유전자 염기서열을 넣어 miRNA 타겟 염기서열을 검색하여 21-뉴클레오티드의 miRNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.In order to determine the target sequence complementary to miRNA in the TLR8 gene sequence, functional miRNAs should be designed in consideration of secondary structures, GC contents, cis-acting sequences, etc. that affect miRNA activity efficiency. 21-nucleotide miRNA oligonucleotides were synthesized by inserting the TLR8 gene sequence into an algorithm program that can search for miRNA target sequences.

각각의 단일 가닥 올리고(single strand oligo)는 miRNA 염기서열을 바탕으로 플라스미드 벡터와 연결할 수 있는 링커(linker) 염기서열(TGCT, CCTG)과 센스 가닥(sense strand)과 안티-센스 가닥(anti-sense strand)을 연결하는 루프(loop) 염기서열(TTGGCCACTGACT)을 삽입하여 설계한 각 64-뉴클레오티드의 top 및 bottom strand를 이중 가닥 올리고(double strand oligo)로 합성한 후, T4 DNA ligase를 통해 pcDNA6.2-GW/±EmGFP-miR vector(INVITROGEN, USA)의 5' 및 3' miR flanking region 사이에 삽입하여 재조합 벡터 pcDNA-TLR8(도 1의 A)를 제조하였다.Each single strand oligo has a linker sequence (TGCT, CCTG), a sense strand and an anti-sense strand that can be linked to a plasmid vector based on the miRNA sequence. The top and bottom strands of each 64-nucleotide designed by inserting a loop nucleotide sequence (TTGGCCACTGACT) connecting the strands were synthesized by double strand oligos, and then pcDNA6.2 through T4 DNA ligase. Recombinant vector pcDNA-TLR8 (FIG. 1A) was prepared by inserting between 5 ′ and 3 ′ miR flanking regions of the −GW / ± EmGFP-miR vector (INVITROGEN, USA).

상기 합성된 top 및 bottom strand 염기서열은 하기에 나타내었다.The synthesized top and bottom strand base sequences are shown below.

Top strand : 5'-TGC TGA AAC CAG GTA GAA GGA ATC GTG TTT TGG CCA CTG ACT GAC ACG ATT CCC TAC CTG GTT T-3'(서열번호 1),Top strand: 5'-TGC TGA AAC CAG GTA GAA GGA ATC GTG TTT TGG CCA CTG ACT GAC ACG ATT CCC TAC CTG GTT T-3 '(SEQ ID NO: 1),

Bottom strand : 5'-CCT GAA ACC AGG TAG GGA ATC GTG TCA GTC AGT GGC CAA AAC ACG ATT CCT TCT ACC TGG TTT C-3'(서열번호 2)Bottom strand: 5'-CCT GAA ACC AGG TAG GGA ATC GTG TCA GTC AGT GGC CAA AAC ACG ATT CCT TCT ACC TGG TTT C-3 '(SEQ ID NO: 2)

위 제조된 TLR8-siRNA의 TLR유전자의 억제는 RAW 264.7 Cell에 형질도입하여 발현양상을 RT-PCR기법을 통해 확인하였다(도 2).
Inhibition of the TLR gene of the TLR8-siRNA prepared above was transduced into RAW 264.7 Cells and the expression pattern was confirmed by RT-PCR (FIG. 2).

실시예Example 2. 구축된  2. Built TLR8TLR8 유전자 특이적  Gene specific miRNAmiRNA 벡터( vector( vectorvector )의 형질전환) Transformation

상기 실시예 1에서와 같이 구축된 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA벡터(pcDNA-TLR8miRNA)를 약독화된 살모넬라 균주인 BRD509(Salmonellatyphimurium BRD509) competent cell(J Infect Dis. 1994 Dec;170(6):1508-17, Medeva사, London으로 구입가능)에 electrophoration shock을 통해 형질도입시켰다. 본 발명의 구체적인 실시예는 하기에 나타내었다.Salmonella strain BRD509 (J Infect Dis. 1994 Dec; 170 (6): 1508-), which is an attenuated Salmonella strain miRNA vector (pcDNA-TLR8miRNA) specific to the TLR8 gene constructed as in Example 1 17, available from Medeva, London, were transduced via electrophoration shock. Specific examples of the present invention are shown below.

먼저, 약독화된 살로넬라 균주 BRD509(Salmonella typhimuriumBRD509)를 37 ℃에서 루리아 벌테니(Luria Bertani) 배지에 배양하였다. 배양된 상기 살모넬라 균주에 마우스의 pcDNA-TLR8 miRNA 벡터를 형질도입하기 위해, 상기 살모넬라 균주를 다시 100 ml의 양으로 24 시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 광학흡광도(O.D.600)를 측정하였다. 이후, 0.7을 나타내는 배양농도에서 세균을 5500rpm의 속도로 원심분리하였다. 원심분리 후, 바닥에 가라앉은 세균만을 수집하여 배양부피와 동일한 부피의 차가운 증류수로 희석하였다. 상기 희석된 세균을 다시 상기와 동일한 방법으로 원심분리하여 2 ml의 차가운 20% 글리세롤 증류수에 희석시킨 후, 또다시 원심분리의 과정을 수행하였다. 이후, 수득한 세균을 100 μl의 20% 글리세롤에 희석하였다. 상기 과정에 의해 얻어진 혼합액의 30 μl(2 μg)를 미니원심분리용기에 넣은 후, 상기 용기에 pcDNA-TLR8miRNA 벡터를 3 μl(2 μg)를 가한 후, 275-325V의 전기로 형질도입을 유도하였다.
First, the attenuated Salonella strain BRD509 (Salmonella typhimurium BRD509) was incubated in Luria Bertani medium at 37 ° C. To transduce the pcDNA-TLR8 miRNA vector of the mouse into the cultured Salmonella strain, the Salmonella strain was further incubated for 24 hours in an amount of 100 ml, and the optical absorbance (OD600) was measured at 600 nm. Thereafter, the bacteria were centrifuged at a rate of 5500 rpm at a culture concentration of 0.7. After centrifugation, only the bacteria sinking to the bottom were collected and diluted with cold distilled water of the same volume as the culture volume. The diluted bacteria were again centrifuged in the same manner as described above, diluted with 2 ml of cold 20% glycerol distilled water, and centrifuged again. Thereafter, the obtained bacteria were diluted with 100 [mu] l of 20% glycerol. 30 μl (2 μg) of the mixture obtained by the above procedure was placed in a minicentrifuge container, and then 3 μl (2 μg) of the pcDNA-TLR8miRNA vector was added to the vessel, followed by induction of transduction with 275-325V. It was.

실시예Example 3. 동물세포에서 피부염 억제효과의 측정 3. Measurement of Dermatitis Inhibitory Effect in Animal Cells

5주령 된 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각의 쥐에 피부병 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100 μl씩 도포하여 아토피와 유사한 피부병을 유발시켰다. 이후 마우스를 해부하여 비장조직을 적출한 후 10ml의 PBS용액 속에서 호모게나이저를 이용하여 단일세포로 분리하였다. 분리된 비장세포는 RBC lysing buffer(Sigma USA)에 의해 적혈구를 제거하고 RPMI1640 배지(100 units/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin and 10% FBS)에서 배양되었다. 5.0 x 107세포를 Lectin (10 μg /ml, Sigma; USA)과 IL-4(20 ng/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 처리하여 배양한 후 TLR8 siRNA 발현 플라스미드를 실시예 2의 방법으로 첨가하여 TLR8, 인터루킨, IFN-gamma 등의 발현을 RT-PCR기법을 이용하여 측정하였다(도 2). 각각의 사용된 probe는 통상의 기법에 준하여 사용하였다.
Five 5-week-old ICR mice were divided into two groups, a control group and an experimental group, and then 100 µl of DNCB, a skin disease-causing substance, was applied to each rat at a concentration of 1% for 1 week to induce atopic dermatitis. Then, the mouse was dissected and the spleen tissue was extracted and then separated into single cells using a homogenizer in 10 ml of PBS solution. The isolated splenocytes were removed from red blood cells by RBC lysing buffer (Sigma USA) and cultured in RPMI1640 medium (100 units / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin and 10% FBS). 5.0 x 10 7 cells were incubated with Lectin (10 μg / ml, Sigma; USA) and IL-4 (20 ng / ml, Invitrogen, Carlsbad, Calif.), And then TLR8 siRNA expression plasmids were prepared as in Example 2. In addition, expression of TLR8, interleukin, IFN-gamma and the like were measured using RT-PCR technique (FIG. 2). Each used probe was used according to the usual technique.

실시예Example 4. 생체 내( 4. In vivo ( inin vivovivo ) 실험을 위한 아토피성 피부염 모델 제조 및 아토피성 피부염 지표 측정Preparation of Atopic Dermatitis Model and Experimental Measurement of Atopic Dermatitis Index

5주령 된 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각의 쥐에 피부병 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100 μl씩 도포하여 아토피와 유사한 피부병을 유발시켰다. 이후, 실험군 쥐에 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA 벡터가 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 1.6 x 108의 농도로 경구투여 하였다. 투여한 지 일주일이 되는 시점에 안와채취법을 이용하여 각각의 쥐의 혈청을 뽑아 아토피성 피부염의 지표인 IFN-γ, Ig-E의 혈청 내 적정농도를 구하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다. 상기 IFN-γ는 아토피를 억제시키는 사이토카인이며, Ig-E는 아토피성 피부염을 유발하는 항체이다.Five 5-week-old ICR mice were divided into two groups, a control group and an experimental group, and then 100 µl of DNCB, a skin disease-causing substance, was applied to each rat at a concentration of 1% for 1 week to induce atopic dermatitis. Then, Salmonella BRD509 strains transduced with miRNA vectors specific for the TLR8 gene were administered orally to the experimental rats at a concentration of 1.6 × 10 8 . At one week after administration, ELISA experiments were performed to determine the serum concentrations of IFN-γ and Ig-E, which are indicators of atopic dermatitis, by extracting the serum of each rat using orbital sampling. IFN-γ is a cytokine that inhibits atopy, and Ig-E is an antibody that causes atopic dermatitis.

실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 세포에 직접 감염시킬 경우 염증세포에서 TLR8 siRNA가 발현됨을 알 수 있다. 또한 동물에 경구 투여할 때에 도 4에 나타난 바와 같이 Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ의 발현이 혈중에 증가함을 관찰하였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이 아토피 질환의 지표인 가려움증 반응이 급격히 감소하였다. 그리고 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군인 CON(PBS로 처리군)와 CV(TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터를 형질도입시킨 살모넬라 균주 처리군)를 각각 처리한 군에 비해 miRTLR8(TLR8 유전자에 특이적인 miRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 균주 처리군)를 투여한 실험군의 경우 피부염의 증상완화가 눈에 띄게 감소함을 볼 수 있었다.As a result, as shown in Figure 3 it can be seen that the TLR8 siRNA is expressed in inflammatory cells when directly infected cells with Salmonella BRD509 strain transduced with a recombinant vector expressing miRNA specific to the TLR8 gene. In addition, when orally administered to animals, it was observed that the expression of IFN-γ, which is an indicator of Th-1 immune response, increased in blood as shown in FIG. 4. In addition, as shown in Figure 6, the itch response, which is an indicator of atopic disease, was drastically reduced. As shown in FIG. 7, miRTLR8 (TLR8) compared to the control group CON (PBS-treated group) and CV (salmonella strain-treated group transduced with a vector without a miRNA specific to TLR8 gene) were treated. In the experimental group administered Salmonella strains transduced with a recombinant vector expressing a miRNA specific to the gene, the symptom relief of dermatitis was remarkably reduced.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.　따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is obvious that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the invention. It is therefore intended that the scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (5)

톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭RNA(siRNA).Small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of the Tolyreceptor-8 gene and has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 제1항의 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터. Recombinant vector comprising a gene for transcription of the siRNA of claim 1. 제2항의 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.Atopic dermatitis treatment composition comprising the recombinant vector of claim 2 as an active ingredient. 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.Treatment of atopic dermatitis containing bacterial cells transformed with recombinant vectors containing genes that inhibit the expression of Tolyreceptor-8 gene and transcrib a small interfering RNA (siRNA) having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 Composition. 제4항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.The composition for treating atopic dermatitis according to claim 4, wherein the bacterial cell is Salmonella typhimurium.
KR1020110116846A 2011-11-10 2011-11-10 TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same KR101291953B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110116846A KR101291953B1 (en) 2011-11-10 2011-11-10 TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110116846A KR101291953B1 (en) 2011-11-10 2011-11-10 TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130051605A KR20130051605A (en) 2013-05-21
KR101291953B1 true KR101291953B1 (en) 2013-08-09

Family

ID=48661508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110116846A KR101291953B1 (en) 2011-11-10 2011-11-10 TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101291953B1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014170786A1 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Pfizer Inc. N-piperidin-3-ylbenzamide derivatives for treating cardiovascular diseases
CN103421791B (en) * 2013-06-24 2015-04-15 广西医科大学 SiRNA of inhibiting expression of TLR2 of human cytomegalovirus and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110039382A (en) * 2008-08-04 2011-04-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Modulation of toll-like receptor 8 expression by antisense oligonucleotides
KR20110056055A (en) * 2009-11-20 2011-05-26 고려대학교 산학협력단 Small interfering rna having therapeutic effects on atopic dermatitis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110039382A (en) * 2008-08-04 2011-04-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Modulation of toll-like receptor 8 expression by antisense oligonucleotides
KR20110056055A (en) * 2009-11-20 2011-05-26 고려대학교 산학협력단 Small interfering rna having therapeutic effects on atopic dermatitis

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130051605A (en) 2013-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6457645B2 (en) RNA interference agent for regulating GST-π gene
KR101585036B1 (en) siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
US8188262B2 (en) Short interference ribonucleic acids for treating allergic diseases
JP6727381B2 (en) Composition for treating cancer associated with HPV infection
KR101291953B1 (en) TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same
CA2739948A1 (en) Treating hepatitis c virus infection with over-expression of microrna-196
KR101250031B1 (en) siRNA against CCL22 for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same
KR101286053B1 (en) The shRNA downregulating TGF-β1 for treatment of tumor
KR101091029B1 (en) Small interfering RNA having therapeutic effects on atopic dermatitis
CN113144194B (en) Application of GP73 inhibitor in preparing medicine for treating SARS-CoV-2 pneumonia and its complication
US8263570B2 (en) Treating picornavirus infection by targeting MicroRNA miR-141
KR101374585B1 (en) The shRNA downregulating HSP27 for treatment of tumor
CN111433360B (en) CKIP-1-targeted double-stranded RNA molecules and uses thereof
KR101292924B1 (en) Recombinant Vector Containing siRNA Targeing GCH1 and Pharmaceutical Composition for Attenuating Neuropathic Pain Comprising The Same
KR101369527B1 (en) siRNA against MDC for treatment of asthma and rhinitis, and composition of therapeutic agent comprising the same
JP6751185B2 (en) RNA interference agents for regulating the GST-π gene
CN115887480B (en) Use of Mxi1-0 inhibitors in the preparation of a formulation for the treatment of hypoxic pulmonary hypertension
KR101389072B1 (en) siRNA for inhibiting BHRF1 expression and composition comprising the same
KR20140094971A (en) Recombinant salmonella suppressing thymus and activation-regulated chemokine for treatment of asthma and composition of therapeutic agent comprising the same
AU2007250524B8 (en) Short interference ribonucleic acids for treating allegic diseases
CN102533823A (en) Antiviral preparation with HSV (Herpes Simplex Virus) amplicon as carrier
Liu et al. Small interfering RNA targeting MDR1 inhibits ovarian cancer growth and increases efficacy of chemotherapy in vivo
KR20060025647A (en) Method for inhibiting proliferation of adenovirus in animal

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160615

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170707

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180627

Year of fee payment: 6