KR101389072B1 - siRNA for inhibiting BHRF1 expression and composition comprising the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EBV(Epstein-Bar virus)의 BHRF1 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 이용한 항암제 내성 저해에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BHRF1 의 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to siRNA that inhibits BHRF1 expression of EBV (Epstein-Bar virus) and anticancer drug resistance inhibition using the same. More specifically, the present invention relates to a siRNA that inhibits the expression of BHRF1 and a composition for inhibiting anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer comprising the same. The present invention also relates to a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising the siRNA and an anticancer agent.

Description

ＢＨＲＦ１ 발현 억제를 위한 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 조성물 {siRNA for inhibiting BHRF1 expression and composition comprising the same}SiRNA for inhibiting expression of GHHF1 and composition comprising same {siRNA for inhibiting BHRF1 expression and composition comprising the same}

본 발명은 EBV(Epstein-Bar virus)의 BHRF1 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 이용한 항암제 내성 저해에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BHRF1 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to siRNA for inhibiting BHRF1 expression of EBV (Epstein-Bar virus) and anticancer drug resistance inhibition using the same. More specifically, the present invention relates to a siRNA for inhibiting BHRF1 expression and a composition for inhibiting anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer comprising the same. The present invention also relates to a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising the siRNA and an anticancer agent.

엡스타인-바 바이러스(Epstein-Bar virus; EBV)는 아프리카에서 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)과 관련되어 최초로 발견된 감마 허피스 바이러스이다.Epstein-Bar virus (EBV) is the first gamma herpes virus found in Africa associated with Burkitt's lymphoma.

상기 바이러스는 버킷 림프종 또는 비인두 종양 등 다양한 종양과 연관성을 보이는데, 최근에는 일부 위암에 EBV 유전자가 발현하는 것으로 판명되었고 전세계 위암 환자의 4-18% 정도가 EBV-양성 위암으로 알려져 있다. 그러나, 위암에서의 EBV 의 병리학적인 역할에 대해서는 명확히 규명된 바가 없다. 또한, EBV는 여러 잠복 유전자(latent gene) 및 용균 유전자(lytic gene)를 가지고 있는데, 일반적으로 EBV 관련 종양에서 잠복 유전자들이 발현하는 것으로 생각되고 있으나 용균 유전자와의 관련성에 대해서는 많이 연구되지 않은 실정이다.The virus is associated with a variety of tumors, including Burkitt's lymphoma or nasopharyngeal tumors. Recently, it has been shown that EBV genes are expressed in some gastric cancers, and about 4-18% of gastric cancer patients worldwide are known as EBV-positive gastric cancers. However, the pathological role of EBV in gastric cancer has not been elucidated. In addition, EBV has several latent genes and lytic genes. Generally, EBV has been thought to express latent genes in EBV-related tumors, but its relationship with lytic genes has not been studied. .

본 발명은 EBV-양성 위암이 EBV-음성 위암에 비해 높은 항암제 내성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 본 발명자들은 또한, EBV-양성 위암에 항암제를 처리하면 BHRF1을 포함한 EBV 용균 유전자들이 발현되기 시작하는데 이렇게 발현된 BHRF1 등이 항암제 내성을 나타내는 요인으로 작용할 가능성이 있음을 확인하였다. 따라서, EBV 의 BHRF1을 감소시킴으로써 항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암 세포의 항암제 감수성을 높이기 위하여, BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하는데 중점을 두고 연구를 진행하였다.The present invention is based on the discovery that EBV-positive gastric cancer exhibits high anticancer drug resistance compared to EBV-negative gastric cancer. The present inventors also found that when EBV-positive gastric cancer is treated with an anticancer agent, EBV lytic genes including BHRF1 begin to be expressed, and thus, the BHRF1 expressed in this manner may act as a factor indicating anticancer drug resistance. Therefore, in order to increase the anticancer drug sensitivity of EBV-positive gastric cancer cells showing anticancer drug resistance by reducing the BHRF1 of EBV, the study was focused on providing siRNA against BHRF1.

siRNA(small interference RNA)는 RNAi(RNA interference)를 유도하는 물질로서 십여 개에서 수십 개 정도의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 이중사슬의 RNA를 말한다. RNAi는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. 이와 같이 RNAi는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 방법을 대신하는 간단한 유전자 넉-다운(knock down) 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 표적 유전자의 mRNA의 유전자 발현을 억제하게 된다.siRNA (small interference RNA) is a substance that induces RNA interference (RNAi) refers to a short double-chain RNA consisting of dozens to dozens of nucleotides. RNAi introduces double stranded RNA composed of sense RNA having a sequence homologous to mRNA of a target gene and antisense RNA having a complementary sequence to a cell to selectively induce degradation of the mRNA of the target gene. Or a phenomenon that can inhibit the expression of a target gene. As described above, since RNAi can selectively inhibit the expression of target genes, it has attracted considerable attention as a simple gene knock-down method that replaces conventional methods of gene destruction by inefficient homologous recombination. The siRNA is injected into cells to inhibit the gene expression of mRNA of the target gene complementary to the siRNA.

그러나, RNAi 기술은 모든 유전자의 RNA 에 적용됨으로써 선택적 발현 억제가 가능할 것이라는 애초의 기대와는 달리, 근래 대규모의 RNAi 탐색 과정에서 일부 유전자는 알려지지 않은 이유로 인해 RNAi 기술이 적용되지 않음이 밝혀지고 있다 (Krueger et al., Oligonucleotides, 17:237-250, 2007). 또한, 지난 수 년 간의 데이터베이스를 바탕으로 통계 분석을 통해 siRNA 서열을 예측하는 알고리즘이 개발되고 있으나, 컴퓨터 알고리즘이 불완전하기 때문에 이를 이용하여 인 실리코(in silico) 방법으로 결정된 모든 siRNA 가 실제 세포 및 생체 중에서 표적 mRNA 를 효과적으로 억제하는 것은 아니며 실험을 통한 검증을 통해서만 가장 효율적인 siRNA 를 결정할 수 있다는 것이 알려져 있다 (Derek et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 8:377-402, 2006).However, contrary to the original expectation that RNAi technology would be able to suppress selective expression by applying RNA to all genes, it has recently been found that some genes are not applied in the course of large-scale RNAi search due to unknown reasons. Krueger et al., Oligonucleotides, 17: 237-250, 2007). In addition, algorithms for predicting siRNA sequences through statistical analysis based on the database of the past several years have been developed, but since the computer algorithms are incomplete, all siRNAs determined by in silico method are used in real cells and in vivo. Among them, it is known that the most effective siRNA can be determined only through experimental verification, not effectively inhibiting the target mRNA (Derek et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 8: 377-402, 2006).

이와 같이, 이론적으로 예상되는 siRNA가 반드시 목표로 하는 mRNA의 능력을 효과적으로 억제시키지는 않으며, 고효율의 siRNA 염기 서열을 찾아야 치료 목적을 달성할 수 있기 때문에, 표적 mRNA 상에서 억제 효율이 높은 특정 타겟 부위 (hyperactive target)을 찾는 것이 매우 중요하다. 또한, 한 유전자의 mRNA 당 다수의 타겟 부위를 선정하여 siRNA를 제조하고 적어도 세포 수준에서 직접적으로 이들의 효과를 확인함으로써 발현 억제 효능이 우수한 최적 위치의 서열을 발굴하는 과정이 필요하다. As such, the theoretically predicted siRNA does not necessarily inhibit the ability of the target mRNA effectively, and a high efficiency siRNA base sequence can be used to achieve therapeutic goals, so that specific target sites with high inhibitory efficiency on the target mRNA (hyperactive) Finding a target is very important. In addition, it is necessary to prepare siRNAs by selecting a large number of target sites per mRNA of one gene and to identify their effect at least directly at the cellular level, thereby finding a sequence having an optimum position with excellent expression inhibiting effect.

이와 관련하여, 현재까지 BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 의 개발에 대한 연구 및 BHRF1 에 대한 siRNA 를 이용한 항암 치료에 관한 연구는 거의 보고된 바가 없는 실정이다. In this regard, few studies have been conducted on the development of siRNA capable of effectively inhibiting the expression of BHRF1 and on the anticancer treatment using siRNA against BHRF1.

이에, 본 발명자들은 BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 를 제조하여 이를 항암제 내성을 저해하는 용도로 제공하기 위하여 노력한 결과, BHRF1 의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 타겟 부위를 규명할 수 있었으며, 상기 타겟 부위에 상보적인 siRNA 를 항암제와 함께 EBV-양성 위암세포에 처리하면 세포 생존률을 감소시킴과 동시에 세포 사멸을 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 siRNA가 EBV-양성 위암세포에서 항암제 내성을 저해함으로써 결과적으로 효과적인 EBV-양성 위암 치료에 기여할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors have tried to provide a siRNA capable of effectively inhibiting the expression of BHRF1 and to provide it for the purpose of inhibiting the anticancer resistance, it was possible to identify a target site that can effectively suppress the expression of BHRF1, Treatment of EBV-positive gastric cancer cells with an anticancer agent with siRNA complementary to the target site could reduce cell viability and promote cell death. Accordingly, the present invention has been completed by confirming that the siRNA may contribute to effective EBV-positive gastric cancer treatment by inhibiting anticancer drug resistance in EBV-positive gastric cancer cells.

본 발명의 목적은 BHRF1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 의 타겟 부위를 규명하고 이 타겟 부위에 결합하는 siRNA 를 제공하는 것이다. 또한 상기 siRNA 를 항암제 내성 저해를 위한 용도로 제공하는 것이다.An object of the present invention is to identify a target site of siRNA that can effectively inhibit the expression of BHRF1 and to provide an siRNA that binds to the target site. It is also to provide the siRNA for the purpose of inhibiting anticancer drug resistance.

구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 를 제공하는 것이다.Specifically, one object of the present invention is the 18-36 nucleotide sequence, 165-184 nucleotide sequence, 243-262 nucleotide sequence, 487-506 nucleotide sequence of BHRF1 mRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and To provide an siRNA that binds to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 519 to 539 nucleotide sequences and inhibits the expression of the BHRF1 gene.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 siRNA를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a composition for inhibiting anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer comprising the siRNA.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising the siRNA and an anticancer agent.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 BHRF1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 특정 타겟 부위에 결합하는 siRNA 에 관한 것이다.As one aspect for solving the said subject, this invention relates to the siRNA which binds to the specific target site which can suppress the expression of BHRF1 effectively.

바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 에 관한 것이다.In a preferred embodiment, the present invention provides the 18-36 nucleotide sequence, the 165-184 nucleotide sequence, the 243-262 nucleotide sequence, the 487-506 nucleotide sequence, and the 519-539 of the BHRF1 mRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 The present invention relates to an siRNA that binds to a nucleotide sequence selected from the group consisting of the first nucleotide sequence and inhibits the expression of the BHRF1 gene.

바람직하게, 상기 siRNA 는 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이를 가지는 이중가닥 siRNA 일 수 있다.Preferably, the siRNA may be a double stranded siRNA having a length of 19 to 21 nucleotides.

또한 바람직하게, 상기 siRNA 는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍, 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍, 및 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다.Also preferably, the siRNA is a nucleotide pair of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, a nucleotide pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, a nucleotide pair of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, a nucleotide pair of SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 29 , Nucleotide pair of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, nucleotide pair of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, nucleotide pair of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, nucleotide pair of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47, and SEQ ID NO: 62 and It may be an siRNA consisting of nucleotide pairs selected from the group consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 63.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 BHRF1 siRNA를 포함하는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물에 관한 것이다.As another aspect, the present invention relates to a composition for inhibiting anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer comprising the BHRF1 siRNA.

또 하나의 양태로서, BHRF1 siRNA 및 항암제를 포함하는 EBV-양성 위암 치료용 조성물에 관한 것이다.As another aspect, the present invention relates to a composition for treating EBV-positive gastric cancer comprising BHRF1 siRNA and an anticancer agent.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 용어, "siRNA" 란 표적 mRNA 의 절단을 통하여 표적 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 짧은 이중사슬의 RNA 를 의미한다. As used herein, the term "siRNA" refers to a short double-chain RNA capable of inducing degradation of a target mRNA or inhibiting expression of a target gene through cleavage of a target mRNA.

본 발명의 siRNA 는 표적 mRNA와 완전히 상보적 결합을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음) 또는 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명 siRNA 를 이루는 뉴클레오타이드 길이는 BHRF1의 활성 및 발현을 방해할 수 있는, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 19 내지 21 뉴클레오타이드 길이의 이중가닥 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 길이는 뉴클레오타이드가 이중가닥(페어링)을 이루는 길이를 말한다.The siRNA of the present invention is not limited to being completely complementary to the target mRNA and is not paired by mismatches (corresponding bases are not complementary) or bulges (no bases corresponding to one chain). This may include. The nucleotide length constituting the siRNA of the present invention may be 10 to 40 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides, more preferably 19 to 21 nucleotides in length, which may interfere with the activity and expression of BHRF1. As used herein, the length of an siRNA refers to the length of a nucleotide double stranded (pairing).

본 발명 siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단이 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 쪽이 돌출(overhang)한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출하는 뉴클레오타이드 수는 한정되지 않으나, 예를 들어 1 내지 8 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1 내지 4 뉴클레오타이드일 수 있다. 또한, siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서, 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 dTdT, UU, 또는 이중가닥 형성부에서 계속해서 BHRF1 mRNA 와 일치하는 또는 상보적인 서열 등을 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.The siRNA terminal structure of the present invention can be blunt or cohesive at both ends, as long as it can inhibit the expression of the target gene by the RNAi effect. The cohesive end structure can be both a structure overhanging the 3 'end and a structure overhanging the 5' end. The number of protruding nucleotides is not limited, but may be, for example, 1 to 8 nucleotides, preferably 1 to 4 nucleotides. In addition, siRNA is a sequence consistent with or complementary to the BHRF1 mRNA in the range capable of maintaining the expression inhibitory effect of the target gene, for example, dTdT, UU, or double-stranded formation at one end of the protruding portion. It may include. The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure on both sides, and a stem loop structure in which one terminal region of double-stranded RNA is connected by linker RNA may be used. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with the pairing of the stem portions.

본 발명에서 제공하는 siRNA 는 서열번호 1로 표시되는 BHRF1 mRNA 에서 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열, 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열, 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열, 및 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 이다.The siRNA provided by the present invention is the BHRF1 mRNA represented by SEQ ID NO: 1 18-36 nucleotide sequence, 165-184 nucleotide sequence, 243-262 nucleotide sequence, 487-506 nucleotide sequence, and 519-539 nucleotide It is siRNA which binds to the nucleotide sequence selected from the group which consists of sequences, and suppresses the expression of BHRF1 gene.

바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 siRNA #26 으로 명명한다.Preferably, the siRNA that binds to the 18th to 36th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA may be an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63. In the present specification, the siRNA is named siRNA # 26.

바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #2 및 #3 으로 명명한다.Preferably, the siRNA binding to the 165th to 184th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA may be an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, or an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17. In the present specification, the siRNA is named siRNA # 2 and # 3, respectively.

또한 바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #C 및 #9 로 명명한다.Also preferably, the siRNA binding to the nucleotides 243 to 262 of the BHRF1 mRNA may be an siRNA composed of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, or an siRNA composed of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 . In the present specification, the siRNA is named siRNA #C and # 9, respectively.

또한 바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA 일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #14 및 #15 로 명명한다.Also preferably, the siRNA binding to the nucleotides 487 to 506 of the BHRF1 mRNA may be an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, or an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 . In the present specification, the siRNA is named siRNA # 14 and # 15, respectively.

또한 바람직하게, 상기 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA 는 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA일 수 있다. 본 명세서 내에서는 상기 siRNA 를 각각 siRNA #17 및 #18 로 명명한다.Also preferably, the siRNA binding to the 519th to 539th nucleotide sequence of the BHRF1 mRNA may be an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, or an siRNA consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 . In the present specification, the siRNA is named siRNA # 17 and # 18, respectively.

또한, 본 발명의 siRNA 는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당(ribose ring)의 2'-위치의 수산기를 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기, 구체적으로는 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 수식하거나 (이 때 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 수식할 수 있다.In addition, the siRNA of the present invention can be chemically modified in a general manner known in the art in order to prevent rapid degradation by nucleic acid enzymes in vivo and to increase in vivo stability. For example, the hydroxyl group at the 2'-position of the rib ring of at least one nucleotide contained in the siRNA is a hydrogen atom, a halogen atom, an -O-alkyl group, an -O-acyl group or an amino group, specifically H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br, I, etc., wherein R is alkyl or aryl, preferably 1 carbon An alkyl group of ˜6, R ′ may be alkylene, preferably alkylene having 1 to 6 carbon atoms), the phosphoric acid backbone being phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, phosphoramidate, or It can be modified with boranophosphate.

또한, 상기 화학적 변형은, 본 발명의 siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), 몰포리노(morpholino), PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나의 핵산 유사체 형태를 가지도록 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이들 LNA, UNA, PNA, 몰포리노 등의 제조는 본 발명에서 제공하는 siRNA 서열 정보를 바탕으로 당업계에 알려진 지식에 의하여 제조할 수 있으며, 기존의 문헌을 참고할 수 있다 (Veedu RN, Wengel J.Chem Biodivers. 7(3):536-42, 2010; Demidov VV. Trends Biotechnol. 21(1):4-7, 2003; Shantanu Karkare, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 71:575-586, 2006).In addition, the chemical modification, at least one of the nucleotides included in the siRNA of the present invention is a nucleic acid of any one of LNA (unlocked nucleic acid), UNA (unlocked nucleic acid), morpholino, peptide nucleic acid (PNA) And may be substituted to have an analog form. Preparation of these LNA, UNA, PNA, morpholino and the like can be prepared by knowledge known in the art based on the siRNA sequence information provided in the present invention, reference can be made to existing literature (Veedu RN, Wengel J. Chem Biodivers. 7 (3): 536-42, 2010; Demidov VV.Trends Biotechnol.21 (1): 4-7, 2003; Shantanu Karkare, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 71: 575-586, 2006) .

또한, 본 발명의 siRNA 는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 각 해당 서열번호의 siRNA 와 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오타이드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.In addition, siRNAs of the invention may include variants having one or more substitutions, insertions, deletions and combinations thereof, which are functional equivalents with changes that do not degrade their activity. For example, the siRNA of the present invention may exhibit at least 80% homology with the siRNA of each corresponding SEQ ID NO, and may preferably include 90%, more preferably at least 95% homology. Such homology can readily be determined by comparing the sequence of the nucleotide with the corresponding portion of the target gene using computer algorithms well known in the art, for example Align or BLAST algorithms.

본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA 가 쌍을 이루어 이중가닥을 형성하는 완전한 형태, 즉 인 비트로에서 siRNA를 직접 합성한 뒤 트랜스펙션(transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR-유도 siRNA 발현 카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.The siRNA of the present invention is basically a form in which two strands of RNA are paired to form a double strand, that is, a form in which siRNA is directly synthesized in vitro and then introduced into a cell through transfection, or a plasmid system. It may be a modified form with a structure having a short hairpin to be used for transfection by shRNA vectors and PCR-induced siRNA expression cassettes.

상기 siRNA 를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법 (Brummelkamp TR et al., Science 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseIII 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법 (Paul CP et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.As a method of preparing the siRNA, a direct chemical synthesis method (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-5520, 2002), a method using synthetic in vitro transcription (Brummelkamp TR et al. , Science 296: 550-553, 2002), Method for cleaving long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using RNaseIII family enzymes (Paul CP et al., Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002) And the like can be synthesized by various methods known in the art.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, EBV-음성 위암 세포주와 EBV-양성 위암 세포주에 도세탁셀을 처리한 경우, EBV-음성 위암 세포주에 비해 EBV-양성 위암 세포주에서 세포 생존률이 높은 반면 세포 사멸률은 적게 나타나, EBV-양성 위암 세포의 항암제 내성이 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 참조). 또한, 상기 두 세포주에 각각 도세탁셀을 처리하였을 때 EBV 용균 유전자들의 발현 여부 및 발현 정도를 확인해 본 결과, 두 세포가 항암제에 대한 내성 차이를 보이는 농도에서, EBV-양성 위암 세포에서 BHRF1을 포함한 EBV 용균 유전자들이 발현함을 확인할 수 있었다 (도 2 참조). 이는, EBV-양성 위암에 나타나는 항암제 내성에 BHRF1 등의 EBV 용균 유전자들이 관여함을 시사하는 결과이다.In a specific embodiment of the present invention, when docetaxel is treated in the EBV-negative gastric cancer cell line and the EBV-positive gastric cancer cell line, the cell survival rate is higher in the EBV-positive gastric cancer cell line than in the EBV-negative gastric cancer cell line, but the cell death rate is low. , EBV-positive gastric cancer cells were confirmed to have high anticancer drug resistance (see Fig. 1). In addition, as a result of confirming the expression and expression level of EBV lytic genes when docetaxel was treated in each of the two cell lines, EBV lysates including BHRF1 in EBV-positive gastric cancer cells at concentrations at which the two cells showed different resistance to anticancer drugs. Gene expression was confirmed (see Figure 2). This suggests that EBV lytic genes such as BHRF1 are involved in anticancer drug resistance in EBV-positive gastric cancer.

이에, 본 발명자들이 EBV 의 siRNA 가 BHRF1 발현을 감소시킴으로써 항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암 세포의 항암제 감수성을 높일 수 있는지를 살펴보았다. 그 결과, EBV-양성 위암 세포에 BHRF1 siRNA 를 처리한 후 항암제를 처리한 경우 scramble siRNA 를 처리한 경우에 비하여 60% 정도의 세포 생존률 감소 효과를 나타내고 세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있었다 (도 4 및 도 5 참조). 나아가 이러한 항암제 내성 억제 과정에서 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자들이 관여할 가능성을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 따라서, BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 항암제에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다. Thus, the present inventors examined whether siRNA of EBV can increase anticancer drug sensitivity of EBV-positive gastric cancer cells showing anticancer drug resistance by reducing BHRF1 expression. As a result, after treatment with BHRF1 siRNA on the EBV-positive gastric cancer cells, the anticancer drug treatment showed a 60% reduction in cell viability and induced cell death compared to the scramble siRNA treatment (FIG. 4 and 5). Furthermore, it could be confirmed that genes related to cell death and cell cycle control were involved in the process of inhibiting anticancer drug resistance (see FIG. 6). Therefore, siRNA against BHRF1 was found to be effective in inhibiting the resistance to anticancer drugs in AGS-EBV cells.

나아가, 본 발명자들은 EBV-양성 위암에서 EBV 의 BHRF1을 감소시킴으로써 항암제 감수성을 높이기 위한 목적으로 BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하고자, BHRF1 의 mRNA 서열 중 실제로 고효율로 항암제 감수성을 유도할 수 있는 siRNA 표적 서열을 규명하였다.Furthermore, the present inventors have provided siRNAs against BHRF1 for the purpose of enhancing anticancer drug sensitivity by reducing BHRF1 of EBV in EBV-positive gastric cancer. It was clarified.

이를 위하여, 본 발명자들은 BHRF1 mRNA 상의 다양한 부위에 결합하는 40종(siRNA #A~#E 및 #1~#35로 명명)의 이중가닥 siRNA을 합성하였고 (도 3 참조), 이들이 실제로 BHRF1 유전자 발현을 억제하는지 여부를 단백질 수준 및 mRNA 수준에서 각각 확인하였다.To this end, we synthesized 40 double-stranded siRNAs (named siRNAs # A- # E and # 1- # 35) that bind to various sites on BHRF1 mRNA (see Figure 3), and they actually expressed BHRF1 gene expression. Inhibition at the protein and mRNA levels, respectively.

그 결과, 40종의 siRNA 중에서 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #26, 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #2 및 #3, BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #C 및 #9, BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #14 및 #15, 그리고 BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 siRNA #17 및 #18이 각각 BHRF1 유전자 발현을 80~90% 정도 감소시키는 것으로 확인되었으며 (도 7 내지 도 11 참조), 이러한 효과는 EBV-양성 위암 세포주 AGS-EBV 뿐 아니라 자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에서도 유지되었다 (도 12 참조). As a result, siRNA # 26, which binds to the 18th to 36th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA, siRNAs # 2 and # 3 that bind to the 165th to 184th nucleotide sequence of 40 siRNAs, and 243 to 262th nucleotide sequences of BHRF1 mRNA were identified. SiRNAs #C and # 9 that bind to, siRNAs # 14 and # 15 that bind to the 487-506th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA, and siRNAs # 17 and # 18 that bind to the 519-539th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA are each BHRF1 It has been shown to reduce gene expression by 80-90% (see FIGS. 7-11), and this effect was maintained in SNU-719, a naturally EBV infected gastric cancer cell line, as well as the EBV-positive gastric cancer cell line AGS-EBV (FIG. 12).

반면, 상기 mRNA 서열을 조금이라도 벗어난 경우 siRNA 의 BHRF1 발현 억제 효능이 현저히 떨어졌는데, 예를 들어 siRNA #A, #4~#6 의 경우 siRNA #2 및 #3 과 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았고, siRNA #10~13 의 경우 siRNA #C 및 #9 과 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았다. 또한, siRNA #16의 경우 siRNA #14 및 #15 타겟 서열이 상당 부분 중복됨에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않았고, siRNA #D~E, #19~25 의 경우 siRNA #17 및 #18과 타겟 서열이 중복되거나 인접해 있음에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 현저히 떨어졌다. 또한, siRNA #27~28 의 경우 siRNA 26 과 인접해 있음에도 불구하고 유전자 발현 억제 효과가 현저히 떨어졌다.On the other hand, if any deviation from the mRNA sequence, siRNA significantly inhibited the inhibitory effect of BHRF1 expression, for example, siRNA #A, # 4 ~ # 6 in the case of siRNA # 2 and # 3 and the target sequence is a significant overlap even Almost no gene expression inhibitory effect was observed, and siRNA # 10-13 showed little gene expression inhibitory effect despite the substantial overlap of siRNA #C and # 9 with the target sequence. In addition, siRNA # 16 showed almost no gene expression inhibitory effect despite the substantial overlap of siRNA # 14 and # 15 target sequences, and siRNA # D ~ E, # 19-25 and siRNA # 17 and # 18 Despite overlapping or adjacent target sequences, the gene expression inhibitory effect was remarkably decreased. In addition, siRNA # 27 ~ 28, although adjacent to siRNA 26, gene expression inhibitory effect was significantly reduced.

따라서, BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째, 165 내지 184 번째, 243 내지 262 번째, 487 내지 506 번째, 및 519 내지 539 번째 부위가 siRNA 제작시 주요 타겟이 될 핫스팟(hotspot)임을 확인할 수 있었으며, 이 부위에 결합하는 siRNA 가 BHRF1 발현을 고효율로 억제함으로써 EBV-양성 위암에서 항암제 내성 억제 효과를 유도하는 효과적임을 규명할 수 있었다. Therefore, it was confirmed that the 18th to 36th, 165 to 184th, 243 to 262th, 487 to 506th, and 519 to 539th sites of the BHRF1 mRNA were hotspots that would be the main targets in siRNA production. SiRNA that binds to BHRF1 expression can be found to be effective in inducing anticancer drug inhibitory effect in EBV-positive gastric cancer.

상기 본 발명에서 제공하는 타겟 부위를 도 13에 나타내었다.13 illustrates a target site provided by the present invention.

따라서, 본 발명에서 제공하는 siRNA 는 EBV 의 BHRF1 발현을 억제함으로써 종국적으로 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성을 저해하는 조성물로 제공될 수 있다.Therefore, the siRNA provided by the present invention can be provided as a composition that inhibits anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer by inhibiting BHRF1 expression of EBV.

본 발명에서 용어, "항암제 저항성" 이란 항암제 투여시 투여한 약물이 암세포를 사멸시키지 못하거나 사멸시키는 정도가 미비한 것을 말하며, 항암제 저항성은 항암제 내성의 가장 빈번한 원인이다. 일반적으로 "항암제에 대한 내성" 이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 이와 같이, 항암제를 암환자에게 투여하면, 투여함에 따라 효과가 감소하는 것이 잘 알려져 있다. 이는 생체 내에서 항암제에 대하여 내성의 암세포가 출현하여 암의 화학요법을 곤란하게 하는 것에 기인하는 것이다.As used herein, the term "anticancer drug resistance" refers to a drug that is administered or not enough to kill cancer cells when the anticancer drug is administered, and the anticancer drug resistance is the most frequent cause of anticancer drug resistance. Generally, "tolerance to anticancer drugs" means that when treating cancer patients with anticancer drugs, there is no therapeutic effect from the beginning of the treatment or early cancer treatment effect, but the cancer treatment effect is lost in the continuous treatment process. As such, it is well known that when an anticancer agent is administered to a cancer patient, the effect decreases with administration. This is due to the appearance of cancer cells resistant to anticancer agents in vivo, making the chemotherapy of cancer difficult.

본 발명에서 용어, "항암제 내성 저해" 는 항암제로 암을 치료시 본 발명의 siRNA 가 없을 때보다 있을 때 항암제의 암세포에 대한 독성이 더 강화되거나 증가되는 것을 말한다. 본 발명에서 BHRF1 siRNA 는 항암제에 대해 EBV-양성 위암 세포를 민감화시킴으로써 항암제에 대한 암세포의 저항성을 줄이고 항암제의 효과를 높일 수 있다. 바람직하게, 상기 항암제는 도세탁셀이다.As used herein, the term "inhibition of anticancer agent resistance" refers to the enhanced or increased toxicity of the anticancer agent to cancer cells when the cancer is treated with the anticancer agent than when the siRNA of the present invention is absent. In the present invention, BHRF1 siRNA can reduce the resistance of cancer cells to anticancer drugs by sensitizing EBV-positive gastric cancer cells to anticancer drugs, thereby increasing the effect of anticancer drugs. Preferably, the anticancer agent is docetaxel.

본 발명의 조성물은 상기한 BHRF1 siRNA를 단독으로 사용하거나, 2종 이상의 siRNA 를 혼합하여 사용할 수 있다.The composition of the present invention may be used alone as described above BHRF1 siRNA, or a mixture of two or more siRNA.

본 발명의 조성물에서 siRNA 는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체와 복합체 형태로 포함될 수 있다. 예컨대, siRNA 는 siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. 또한, 전달 시약으로 G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 조합된 네이키드 siRNA로 포함되어 대상자에게 투여될 수 있다. 또한 siRNA의 체내 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시키는 등 당업계에 알려진 일반적인 siRNA 세포 내 전달 기술을 이용하도록 제제화될 수 있다.In the composition of the present invention siRNA may be included in complex form with various nucleic acid carriers known in the art in order to increase the efficiency of delivery in vivo. For example, siRNA can be used as a recombinant plasmid or viral vector that expresses siRNA. In addition, delivery reagents include G-fectin, Mirus TrasIT-TKO lipid affinity reagents, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, cationic phospholipid nanoparticles, cationic polymers, cationic micelles, cationic emulsions or liposomes. It may be included as a naked siRNA in combination with a delivery reagent comprising a and administered to the subject. It may also be formulated to use common siRNA intracellular delivery techniques known in the art, such as conjugating biocompatible polymers, such as polyethyleneglycol, to increase cellular uptake in order to enhance the in vivo stability of siRNA.

본 발명의 항암제 내성 저해용 조성물은 siRNA 또는 siRNA 와 핵산 전달체와의 복합체 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화 될 수 있다.The composition for inhibiting anticancer drug resistance of the present invention may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier in addition to siRNA or a complex of siRNA with a nucleic acid carrier. Such compositions may be formulated to provide fast release, or sustained or delayed release of the active ingredient after administration.

경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있다. 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 이외의 본 발명 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.In the case of oral administration, binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavorings, and the like can be used. It may be prepared in the form of. In the case of injections, buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc. may be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives, etc. may be used, and unit dosage ampoules or It may be prepared in multiple dosage forms. Other inventive compositions can be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations.

본 발명의 siRNA 는 하나 이상의 항암제와 함께 항암 조성물로 제공될 수 있다. The siRNA of the present invention may be provided in an anticancer composition with one or more anticancer agents.

항암제란 암세포를 죽이기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 약제는 암 세포의 DNA의 복제, 전사, 번역 과정을 차단하게 된다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항암제는, 바람직하게는 도세탁셀이다.Anticancer drugs are all drugs used to kill cancer cells, and most drugs block the replication, transcription, and translation of cancer cell DNA. The anticancer agent which can be used in the composition of the present invention is preferably docetaxel.

본 발명의 항암제 내성 저해용 조성물 또는 항암용 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 강내 투여, 경막내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 BHRF1 siRNA는 항암제와 함께 또는 항암제를 투여하기 전 또는 투여하고 난 후에 일정 시차를 두고 항암제와 별도로 투여될 수 있다. The anticancer drug resistance inhibiting composition or the anticancer composition of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. Oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraluminal administration, intradural administration, but is not limited thereto. The BHRF1 siRNA according to the present invention may be administered together with the anticancer agent or separately from the anticancer agent at a certain time before or after administration of the anticancer agent.

상기 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병적 상태, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The dosage of the composition may vary depending on various factors such as the age, sex, weight, pathological condition, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient, and can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명은 BHRF1 발현을 고효율로 억제하는 siRNA 를 제공하며, 상기 siRNA 는 EBV-양성 위암에 대한 항암제 내성을 저해함으로써, 항암제와 함께 이용시 EBV-양성 위암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.The present invention provides an siRNA that inhibits BHRF1 expression with high efficiency, and the siRNA inhibits anticancer drug resistance to EBV-positive gastric cancer, and thus can be usefully used to treat EBV-positive gastric cancer when used with an anticancer agent.

도 1의 (a)는 EBV-음성 위암세포(AGS)와 EBV-양성 위암세포(AGS-EBV) 에 도세탁셀을 처리하였을 때 세포 생존률(cell viability)을 나타낸 것으로, Triplicate로 3번 반복하여 실험한 결과의 평균값과 SD값을 그래프로 나타낸 것이다 (*, p<0.05; **, p<0.01을 의미함). (b)는 AGS 세포와 AGS-EBV 세포에 도세탁셀을 처리하였을 때 세포 사멸(apoptosis) 비율을 나타낸 것으로, 3번 반복하여 실험한 결과의 평균값과 SD값을 그래프로 나타낸 것이다 (**, p<0.01을 의미함).
도 2는 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀 처리하였을 때 EBV 용균 유전자(BZLF1, BRLF1, BMRF1, BHRF1)들이 발현되는지의 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 BHRF1 유전자의 mRNA 서열 및 본 발명에서 제작한 40종의 BHRF1 siRNA #A~#E 및 #1~#35의 결합 부위를 나타낸다.
도 4의 (A)는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 세포 수의 변화를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B)는 AGS 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 5는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA #C를 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 세포 사멸 비율의 변화를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 6은 AGS-EBV 세포와 AGS 세포에 각각 siRNA #C 및/또는 도세탁셀을 처리했을 때 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 7의 (A) 는 BHRF1 siRNA 5종(#A~#E)을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B) 는 BHRF1 siRNA 4종(#A~#D)에 대하여 다시 한 번 확인한 결과이다.
도 8의 (A) 는 BHRF1 siRNA 35종(#1~#35)을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다. (B) 는 다시 한 번 확인한 결과이다. (C) 는 로딩 대조군으로 사용한 β-actin 에 대한 BHRF1 의 발현을 normalization한 결과를 종합하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 siRNA 9종(#2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32) 을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 실시간 RT-PCR 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 10은 BHRF1을 발현시킨 상태에서 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 11은 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA들을 다양한 농도 범위로 처리하고(1, 5, 10 nM) 도세탁셀을 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 12는 SNU-719 세포에 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때 BHRF1 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 scramble siRNA 를 사용하였다.
도 13은 본 발명에서 제공하는 BHRF1 mRNA 상의 siRNA 타겟 부위 및 이에 결합하는 siRNA를 나타낸다.FIG. 1 (a) shows cell viability when docetaxel was treated to EBV-negative gastric cancer cells (AGS) and EBV-positive gastric cancer cells (AGS-EBV), which were repeated three times with Triplicate. The mean and SD values of the results are plotted (*, p <0.05; **, p <0.01). (b) shows the apoptosis rate when AGS cells and AGS-EBV cells were treated with docetaxel, and the graph shows the mean and SD values of the results of three repeated experiments (**, p < Means 0.01).
2 shows Western blot results confirming whether EBV lytic genes (BZLF1, BRLF1, BMRF1, BHRF1) are expressed when docetaxel is treated in AGS-EBV cells.
Figure 3 shows the mRNA sequence of the BHRF1 gene and binding sites of 40 BHRF1 siRNAs #A to #E and # 1 to # 35 produced in the present invention.
Figure 4 (A) shows the change in the number of cells when treated with docetaxel after treatment of BHRF1 siRNA #C, # 2 and # 32 to AGS-EBV cells, respectively. Scramble siRNA was used as a negative control. (B) shows the results in AGS cells.
Figure 5 shows the change in the rate of cell death when treated with docetaxel after treatment with BHRF1 siRNA #C in AGS-EBV cells. Scramble siRNA was used as a negative control.
6 shows Western blot results confirming cell death and cell cycle control-related gene expression when AGS-EBV cells and AGS cells were treated with siRNA #C and / or docetaxel, respectively. Scramble siRNA was used as a negative control.
FIG. 7A shows Western blot results confirming whether or not BHRF1 siRNA five species (#A to #E) are treated with AGS-EBV cells and then docetaxel is used to inhibit the expression of BHRF1 gene. Scramble siRNA was used as a negative control. (B) is the result of confirming once again about four BHRF1 siRNAs (# A- # D).
FIG. 8 (A) is a Western blot result confirming whether or not BHRF1 siRNA 35 species (# 1 to # 35) are treated with AGS-EBV cells and then docetaxel is used to inhibit the expression of BHRF1 gene. Scramble siRNA was used as a negative control. (B) is the result of confirmation once again. (C) is a graph showing the results of normalization of the expression of BHRF1 for β-actin used as a loading control.
9 shows BHRF1 when nine siRNAs (# 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26, and # 32) were treated with AGS-EBV cells and then docetaxel. Real-time RT-PCR results confirming whether or not the expression of the gene is shown. Scramble siRNA was used as a negative control.
10 shows Western blot results confirming whether or not BHRF1 gene expression is suppressed when BHRF1 siRNAs are treated in the state of expressing BHRF1. Scramble siRNA was used as a negative control.
FIG. 11 shows Western blot results confirming whether AHs-EBV cells inhibit the expression of BHRF1 gene when BHRF1 siRNAs are treated in various concentration ranges (1, 5, 10 nM) and docetaxel is treated. Scramble siRNA was used as a negative control.
Figure 12 shows the Western blot results confirming whether or not to inhibit the expression of the BHRF1 gene when BHRF1 siRNAs treated with SNU-719 cells. Scramble siRNA was used as a negative control.
Figure 13 shows siRNA target sites on the BHRF1 mRNA provided by the present invention and siRNA binding thereto.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1. 실험 재료의 준비 1. Preparation of experimental material

EBV-음성 위암(EBV-negative gastric carcinoma; GC) 세포로 AGS 세포를 사용하였고, EBV-양성 위암(EBV-positive gastric carcinoma) 세포로는 AGS 세포에 재조합 Akata virus (Shimizu et al., J. Virol. 70, 7260-7263, 1996)를 감염시킨 AGS-EBV 세포를 사용하였다. AGS는 10% 우태아혈청 (FBS; Hyclone, Logan, Utah, USA)과 항생제 (페니실린 100 Units/ml 및 스트렙토마이신100 μg/ml; Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 또한 AGS-EBV는 추가적으로 400 μg/ml 제네티신 (Gibco BRL)이 포함된 배지에서 배양하였다. 항암제로는 탁솔 계열의 항암제인 도세탁셀 (Aventis, Paris, France)을 사용하였다.
AGS cells were used as EBV-negative gastric carcinoma (GC) cells and recombinant Akata virus (Shimizu et al., J. Virol) was used for AB cells as EBV-positive gastric carcinoma cells. 70, 7260-7263, 1996) were used to infect AGS-EBV cells. AGS is a RPMI-1640 medium (Gibco BRL, Grand Island) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, Utah, USA) and antibiotics (penicillin 100 Units / ml and streptomycin 100 μg / ml; Gibco BRL) , NY, USA). AGS-EBV was also cultured in medium containing 400 μg / ml Geneticin (Gibco BRL). As an anticancer agent, docetaxel (Aventis, Paris, France), a taxol-based anticancer agent, was used.

실시예Example 2.  2. BHRF1BHRF1 에 대한 For siRNA 의siRNA 제조 Produce

서열번호 2 내지 서열번호 81 로 이루어진 군으로부터 선택된 40종의 이중가닥 siRNA를 화학적으로 합성하였다 (표 1 및 표 2). 제조한 각 siRNA 의 BHRF1 mRNA 타겟 부위는 도 3에 나타내었다. 상기 siRNA들은 제놀루션 (서울, Korea)사로부터 주문 제작하였다.Forty double-stranded siRNAs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 81 were chemically synthesized (Table 1 and Table 2). The BHRF1 mRNA target site of each prepared siRNA is shown in FIG. 3. The siRNAs were custom made by Genolus (Seoul, Korea).

siRNA
No.siRNA
No. 센스/안티센스Sense / antisense 서열order 서열
번호order
number #A#A 센스sense 5'-CGAAAUUCAGAGACAUUUA-3'5'-CGAAAUUCAGAGACAUUUA-3 ' 22 안티센스Antisense 5'-UAAAUGUCUCUGAAUUUCG-3'5'-UAAAUGUCUCUGAAUUUCG-3 ' 33 #B#B 센스sense 5'-GAAACUUGGAACAGAUUUA-3'5'-GAAACUUGGAACAGAUUUA-3 ' 44 안티센스Antisense 5'-UAAAUCUGUUCCAAGUUUC-3'5'-UAAAUCUGUUCCAAGUUUC-3 ' 55 #C#C 센스sense 5'-GGAUUUUAACUCAGUAUUU-3'5'-GGAUUUUAACUCAGUAUUU-3 ' 66 안티센스Antisense 5'-AAAUACUGAGUUAAAAUCC-3'5'-AAAUACUGAGUUAAAAUCC-3 ' 77 #D#D 센스sense 5'-UGACUUUGAGUCUGUUAGU-3'5'-UGACUUUGAGUCUGUUAGU-3 ' 88 안티센스Antisense 5'-ACUAACAGACUCAAAGUCA-3'5'-ACUAACAGACUCAAAGUCA-3 ' 99 #E#E 센스sense 5'-GUUAUAUGUAGUUAUUUAU-3'5'-GUUAUAUGUAGUUAUUUAU-3 ' 1010 안티센스Antisense 5'-AUAAAUAACUACAUAUAAC-3'5'-AUAAAUAACUACAUAUAAC-3 ' 1111

siRNA
No.siRNA
No. 센스/안티센스Sense / antisense 서열order 서열
번호order
number #1#One 센스sense 5'-CUGUAGUUCUGCGUUAUCA-3'5'-CUGUAGUUCUGCGUUAUCA-3 ' 1212 안티센스Antisense 5'-UGAUAACGCAGAACUACAG-3'5'-UGAUAACGCAGAACUACAG-3 ' 1313 #2#2 센스sense 5'-GGAGAUAAUUGAACGAAAU-3'5'-GGAGAUAAUUGAACGAAAU-3 ' 1414 안티센스Antisense 5'-AUUUCGUUCAAUUAUCUCC-3'5'-AUUUCGUUCAAUUAUCUCC-3 ' 1515 #3# 3 센스sense 5'-GAGAUAAUUGAACGAAAUU-3'5'-GAGAUAAUUGAACGAAAUU-3 ' 1616 안티센스Antisense 5'-AAUUUCGUUCAAUUAUCUC-3'5'-AAUUUCGUUCAAUUAUCUC-3 ' 1717 #4#4 센스sense 5'-GAUAAUUGAACGAAAUUCA-3'5'-GAUAAUUGAACGAAAUUCA-3 ' 1818 안티센스Antisense 5'-UGAAUUUCGUUCAAUUAUC-3'5'-UGAAUUUCGUUCAAUUAUC-3 ' 1919 #5# 5 센스sense 5'-ACGAAAUUCAGAGACAUUU-3'5'-ACGAAAUUCAGAGACAUUU ' 2020 안티센스Antisense 5'-AAAUGUCUCUGAAUUUCGU-3'5'-AAAUGUCUCUGAAUUUCGU-3 ' 2121 #6# 6 센스sense 5'-AAAUUCAGAGACAUUUACA-3'5'-AAAUUCAGAGACAUUUACA-3 ' 2222 안티센스Antisense 5'-UGUAAAUGUCUCUGAAUUU-3'5'-UGUAAAUGUCUCUGAAUUU-3 ' 2323 #7# 7 센스sense 5'-GAGACAUUUACAGAAACUU-3'5'-GAGACAUUUACAGAAACUU-3 ' 2424 안티센스Antisense 5'-AAGUUUCUGUAAAUGUCUC-3'5'-AAGUUUCUGUAAAUGUCUC-3 ' 2525 #8#8 센스sense 5'-CAGAAACUUGGAACAGAUU-3'5'-CAGAAACUUGGAACAGAUU-3 ' 2626 안티센스Antisense 5'-AAUCUGUUCCAAGUUUCUG-3'5'-AAUCUGUUCCAAGUUUCUG-3 ' 2727 #9# 9 센스sense 5'-GAUUUUAACUCAGUAUUUU-3'5'-GAUUUUAACUCAGUAUUUU-3 ' 2828 안티센스Antisense 5'-AAAAUACUGAGUUAAAAUC-3'5'-AAAAUACUGAGUUAAAAUC-3 ' 2929 #10# 10 센스sense 5'-UUUUAACUCAGUAUUUUUA-3'5'-UUUUAACUCAGUAUUUUUA-3 ' 3030 안티센스Antisense 5'-UAAAAAUACUGAGUUAAAA-3'5'-UAAAAAUACUGAGUUAAAA-3 ' 3131 #11# 11 센스sense 5'-UUAACUCAGUAUUUUUAGA-3'5'-UUAACUCAGUAUUUUUAGA-3 ' 3232 안티센스Antisense 5'-UCUAAAAAUACUGAGUUAA-3'5'-UCUAAAAAUACUGAGUUAA-3 ' 3333 #12# 12 센스sense 5'-CUCAGUAUUUUUAGAGAUA-3'5'-CUCAGUAUUUUUAGAGAUA-3 ' 3434 안티센스Antisense 5'-UAUCUCUAAAAAUACUGAG-3'5'-UAUCUCUAAAAAUACUGAG-3 ' 3535 #13# 13 센스sense 5'-CAGUAUUUUUAGAGAUAUU-3'5'-CAGUAUUUUUAGAGAUAUU-3 ' 3636 안티센스Antisense 5'-AAUAUCUCUAAAAAUACUG-3'5'-AAUAUCUCUAAAAAUACUG-3 ' 3737 #14# 14 센스sense 5'-AGGUUUAGCUGGACUUUGU-3'5'-AGGUUUAGCUGGACUUUGU-3 ' 3838 안티센스Antisense 5'-ACAAAGUCCAGCUAAACCU-3'5'-ACAAAGUCCAGCUAAACCU-3 ' 3939 #15# 15 센스sense 5'-GGUUUAGCUGGACUUUGUU-3'5'-GGUUUAGCUGGACUUUGUU-3 ' 4040 안티센스Antisense 5'-AACAAAGUCCAGCUAAACC-3'5'-AACAAAGUCCAGCUAAACC-3 ' 4141 #16# 16 센스sense 5'-GUUUAGCUGGACUUUGUUU-3'5'-GUUUAGCUGGACUUUGUUU-3 ' 4242 안티센스Antisense 5'-AAACAAAGUCCAGCUAAAC-3'5'-AAACAAAGUCCAGCUAAAC-3 ' 4343 #17# 17 센스sense 5'-GACUUUGAGUCUGUUAGUU-3'5'-GACUUUGAGUCUGUUAGUU-3 ' 4444 안티센스Antisense 5'-AACUAACAGACUCAAAGUC-3'5'-AACUAACAGACUCAAAGUC-3 ' 4545 #18# 18 센스sense 5'-CUUUGAGUCUGUUAGUUAU-3'5'-CUUUGAGUCUGUUAGUUAU-3 ' 4646 안티센스Antisense 5'-AUAACUAACAGACUCAAAG-3'5'-AUAACUAACAGACUCAAAG-3 ' 4747 #19# 19 센스sense 5'-CUGUUAGUUAUAUGUAGUU-3'5'-CUGUUAGUUAUAUGUAGUU-3 ' 4848 안티센스Antisense 5'-AACUACAUAUAACUAACAG-3'5'-AACUACAUAUAACUAACAG-3 ' 4949 #20# 20 센스sense 5'-GUUAGUUAUAUGUAGUUAU-3'5'-GUUAGUUAUAUGUAGUUAU-3 ' 5050 안티센스Antisense 5'-AUAACUACAUAUAACUAAC-3'5'-AUAACUACAUAUAACUAAC-3 ' 5151 #21# 21 센스sense 5'-UUAGUUAUAUGUAGUUAUU-3'5'-UUAGUUAUAUGUAGUUAUU-3 ' 5252 안티센스Antisense 5'-AAUAACUACAUAUAACUAA-3'5'-AAUAACUACAUAUAACUAA-3 ' 5353 #22# 22 센스sense 5'-AGUUAUAUGUAGUUAUUUA-3'5'-AGUUAUAUGUAGUUAUUUA-3 ' 5454 안티센스Antisense 5'-UAAAUAACUACAUAUAACU-3'5'-UAAAUAACUACAUAUAACU-3 ' 5555 #23# 23 센스sense 5'-UUAUAUGUAGUUAUUUAUU-3'5'-UUAUAUGUAGUUAUUUAUU-3 ' 5656 안티센스Antisense 5'-AAUAAAUAACUACAUAUAA-3'5'-AAUAAAUAACUACAUAUAA-3 ' 5757 #24# 24 센스sense 5'-UAUAUGUAGUUAUUUAUUU-3'5'-UAUAUGUAGUUAUUUAUUU-3 ' 5858 안티센스Antisense 5'-AAAUAAAUAACUACAUAUA-3'5'-AAAUAAAUAACUACAUAUA-3 ' 5959 #25# 25 센스sense 5'-AUAUGUAGUUAUUUAUUUA-3'5'-AUAUGUAGUUAUUUAUUUA-3 ' 6060 안티센스Antisense 5'-UAAAUAAAUAACUACAUAU-3'5'-UAAAUAAAUAACUACAUAU-3 ' 6161 #26# 26 센스sense 5'-GGAGAUACUGUUAGCCCUG-3'5'-GGAGAUACUGUUAGCCCUG-3 ' 6262 안티센스Antisense 5'-CAGGGCUAACAGUAUCUCC-3'5'-CAGGGCUAACAGUAUCUCC-3 ' 6363 #27# 27 센스sense 5'-AUACGGGACAGUCGUGUGC-3'5'-AUACGGGACAGUCGUGUGC-3 ' 6464 안티센스Antisense 5'-GCACACGACUGUCCCGUAU-3'5'-GCACACGACUGUCCCGUAU-3 ' 6565 #28# 28 센스sense 5'-CUGCAUCCUGUGUUGGAGC-3'5'-CUGCAUCCUGUGUUGGAGC-3 ' 6666 안티센스Antisense 5'-GCUCCAACACAGGAUGCAG-3'5'-GCUCCAACACAGGAUGCAG-3 ' 6767 #29# 29 센스sense 5'-GAGACCCAAGCCUUGGGCG-3'5'-GAGACCCAAGCCUUGGGCG-3 ' 6868 안티센스Antisense 5'-CGCCCAAGGCUUGGGUCUC-3'5'-CGCCCAAGGCUUGGGUCUC-3 ' 6969 #30# 30 센스sense 5'-GUUGGCCUGGAUGGCCUGG-3'5'-GUUGGCCUGGAUGGCCUGG-3 ' 7070 안티센스Antisense 5'-CCAGGCCAUCCAGGCCAAC-3'5'-CCAGGCCAUCCAGGCCAAC-3 ' 7171 #31# 31 센스sense 5'-AUGCAUGCCUGCAGGACAU-3'5'-AUGCAUGCCUGCAGGACAU-3 ' 7272 안티센스Antisense 5'-AUGUCCUGCAGGCAUGCAU-3'5'-AUGUCCUGCAGGCAUGCAU-3 ' 7373 #32# 32 센스sense 5'-GUAACCAGUCUACUCCUUA-3'5'-GUAACCAGUCUACUCCUUA-3 ' 7474 안티센스Antisense 5'-UAAGGAGUAGACUGGUUAC-3'5'-UAAGGAGUAGACUGGUUAC-3 ' 7575 #33# 33 센스sense 5'-GACCUGUCAGUUCGUGGGA-3'5'-GACCUGUCAGUUCGUGGGA-3 ' 7676 안티센스Antisense 5'-UCCCACGAACUGACAGGUC-3'5'-UCCCACGAACUGACAGGUC-3 ' 7777 #34# 34 센스sense 5'-AGCGAAGGCCUGGAUGGUU-3'5'-AGCGAAGGCCUGGAUGGUU-3 ' 7878 안티센스Antisense 5'-AACCAUCCAGGCCUUCGCU-3'5'-AACCAUCCAGGCCUUCGCU-3 ' 7979 #35# 35 센스sense 5'-GCUGGUCUACAUUAAUUGA-3'5'-GCUGGUCUACAUUAAUUGA-3 ' 8080 안티센스Antisense 5'-UCAAUUAAUGUAGACCAGC-3'5'-UCAAUUAAUGUAGACCAGC-3 ' 8181

실험예Experimental Example 1.  One. EBVEBV -양성 위암 세포의 항암제 저항성 확인-Anticancer drug resistance of benign gastric cancer cells

EBV-음성 위암 세포주(AGS)와 EBV-양성 위암 세포주(AGS-EBV)에 각각 도세탁셀을 처리한 후 세포 생존률(cell viability)과 세포 사멸(apoptosis) 비율을 각각 비교하였다. After treatment with docetaxel in EBV-negative gastric cancer cell line (AGS) and EBV-positive gastric cancer cell line (AGS-EBV), cell viability and apoptosis rate were compared, respectively.

구체적으로, 세포 생존률을 측정하기 위하여, AGS 세포와 AGS-EBV 세포를 각각 96 웰 플레이트에 5x104 cells/ml 의 밀도로 100 μl씩 분주한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 도세탁셀을 농도별(0-100 nM)로 처리하고 72 시간 동안 배양한 후 CCK-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan) 용액을 각 웰당 10 μl씩 분주하여 3시간 배양한 다음 SoftMax 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Specifically, to measure cell viability, AGS cells and AGS-EBV cells were each 100 μl divided into 96 well plates at a density of 5 × 10 4 cells / ml and cultured for 24 hours. Next, docetaxel was treated by concentration (0-100 nM) and incubated for 72 hours, followed by dispensing 10 μl of CCK-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan) solution for each well for 3 hours. After incubation, the absorbance was measured at 450 nm using a SoftMax instrument (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA).

또한, 세포 사멸율을 측정하기 위하여, AGS 세포와 AGS-EBV 세포를 각각 1x106 cells/ml 의 밀도로 100 mm 배양 접시에 접종한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 30 nM 의 도세탁셀을 처리하고 72 시간 배양한 후 세포들을 수확하여 차가운 생리식염수로 2회 세척하고 70% 에탄올을 넣어 -20 ℃ 에서 밤새 고정하였다. 다음날 상온에서 15분마다 볼텍싱(vortexing)하면서 1시간 배양한 후 원심분리하여 상층액을 버리고 생리식염수로 2회 세척하였다. 다음으로 생리식염수에 100 μg/ml 의 RNase A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 50 μg/ml PI (propidium iodide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 섞은 용액을 각 세포에 500 μl 씩 넣어 세포를 풀어 염색하고 37 ℃ 수조에서 20분 배양한 후 FACScaliber 기기 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포 주기를 분석하였다.In addition, in order to measure the cell death rate, AGS cells and AGS-EBV cells were inoculated in a 100 mm culture dish at a density of 1 × 10 6 cells / ml, respectively, and then cultured for 24 hours. Next, after treatment with 30 nM docetaxel and incubated for 72 hours, the cells were harvested, washed twice with cold saline, and 70% ethanol was added and fixed at -20 ° C overnight. The next day, after culturing for 1 hour while vortexing at room temperature every 15 minutes, the supernatant was discarded by centrifugation and washed twice with physiological saline. Next, a solution of 100 μg / ml RNase A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and 50 μg / ml PI (propidium iodide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in physiological saline was added to each cell. 500 μl of the cells were released, stained and incubated for 20 minutes in a 37 ° C. water bath. The cell cycle was analyzed using a FACScaliber instrument (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, EBV-음성 위암 세포주(AGS) 에 비해 EBV-양성 위암 세포주(AGS-EBV)에서 10 nM 이상의 도세탁셀 농도로 처리 시 세포 생존률이 높게 나타난 반면, 세포 사멸은 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 AGS 세포에 비해 AGS-EBV 세포가 도세탁셀에 대한 내성이 높다는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 1, compared to the EBV-negative gastric cancer cell line (AGS) EBV-positive gastric cancer cell line (AGS-EBV) when treated with a docetaxel concentration of 10 nM or more, while cell death is less It was confirmed that it appeared. Therefore, it was confirmed that AGS-EBV cells have higher resistance to docetaxel than AGS cells.

실험예Experimental Example 2.  2. 도세탁셀Doclex 처리시  When processing EBVEBV 용균 유전자의 발현 확인 Expression of lytic genes

AGS-EBV 세포에서 도세탁셀 처리에 의해 EBV 용균 유전자(lytic gene)들이 발현 되는지의 여부를 확인하였다.It was confirmed whether EBV lytic genes were expressed by docetaxel treatment in AGS-EBV cells.

구체적으로, AGS 세포에 도세탁셀 30nM 을 처리하고 AGS-EBV 세포에는 도세탁셀을 농도 별로(0-100 nM) 처리한 후 72 시간 배양하였고, 세포를 수확하여 단백질을 추출한 후 웨스턴 블랏을 통하여 EBV 용균 유전자들의 발현을 확인하였다. EBV 용균 유전자들의 확인을 위해 항-BZLF1 (Dako, Glostrup, Denmark, 1:500), 항-BRLF1 (Argene, Varilhes, France; 1:500), 항-BMRF1 (Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK; 1:500) 및 항-BHRF1 (3E8, 1:250) (Chou et al., 2004)를 각각 1차 항체로 사용하였다. 또한 로딩 컨트롤로 항-β-actin (Sigma-Aldrich, 1:2000)을 사용하였다.Specifically, AGS cells were treated with docetaxel 30 nM, and AGS-EBV cells were treated with docetaxel by concentration (0-100 nM), and cultured for 72 hours. After harvesting the cells, the proteins were extracted to obtain EBV lytic genes through Western blot. Expression was confirmed. Anti-BZLF1 (Dako, Glostrup, Denmark, 1: 500), anti-BRLF1 (Argene, Varilhes, France; 1: 500), anti-BMRF1 (Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK) for the identification of EBV lytic genes 1: 500) and anti-BHRF1 (3E8, 1: 250) (Chou et al., 2004) were used as primary antibodies, respectively. Also anti-β-actin (Sigma-Aldrich, 1: 2000) was used as a loading control.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 도세탁셀을 10 nM 이상의 농도로 처리시 AGS-EBV 세포에서 BHRF1을 비롯한 EBV 용균 유전자들이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 두 세포가 항암제에 대한 내성 차이를 보이는 농도에서 AGS-EBV 세포가 EBV 용균 유전자들을 발현함을 확인하였으므로, 항암제 내성에 BHRF1 등의 EBV 용균 유전자들이 관여할 가능성이 있음을 알 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the EBV lytic genes including BHRF1 in AGS-EBV cells when docetaxel at a concentration of 10 nM or more. That is, it was confirmed that AGS-EBV cells express EBV lytic genes at concentrations at which the two cells differ in resistance to anticancer drugs. Therefore, EBV lytic genes such as BHRF1 may be involved in anticancer drug resistance.

실험예Experimental Example 3.  3. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 가  end EBVEBV -양성 위암 세포의 세포 Cells of benign gastric cancer cells 생존률에Survival rate 미치는 영향 확인 Identify the impact

BHRF1 siRNA 가 항암제에 대한 EBV-양성 위암 세포의 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위하여, siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리하고 세포 수의 변화를 확인하였다.To determine the effect of BHRF1 siRNA on the survival rate of EBV-positive gastric cancer cells against anticancer agents, siRNA #C, # 2 and # 32 were treated with AGS-EBV cells, respectively, and then treated with docetaxel and confirmed the change in cell number. It was.

구체적으로, AGS 세포 및 AGS-EBV 세포를 8x103 cells /100μl 의 밀도로 96 웰 플레이트에 각각 접종하고, scramble siRNA 및 BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32 을 각각 10 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM씩 처리하여 72 시간 더 배양한 후 CCK-8 용액을 각 웰당 10 μl 씩 분주하여 3시간 배양한 다음 SoftMax 기기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Specifically, AGS cells and AGS-EBV cells were inoculated into 96 well plates at a density of 8 × 10 3 cells / 100 μl, respectively, and 10 nM of scramble siRNA and BHRF1 siRNA #C, # 2 and # 32 were added, respectively, followed by G-fectin. Was added to transfect and incubated for 24 hours. Next, docetaxel was treated with 30 nM and further incubated for 72 hours, followed by incubation of 10 μl of CCK-8 solution for each well for 3 hours, followed by 450 nm using a SoftMax device (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Absorbance was measured at.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, BHRF1 siRNA #C, #2 및 #32 를 처리하고 도세탁셀을 처리한 경우 모두, scramble siRNA 를 처리한 경우에 비하여 60% 정도의 세포 생존률 감소 효과를 나타내었다. 따라서 BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다(A). 다만, #32 의 경우에는 EBV 음성 세포인 AGS 세포에서도 세포 생존을 감소시키는 영향을 보여서(B), BHRF1 발현 억제에는 효과적이나 off-target 에도 영향을 미칠 가능성이 있었다.
As a result, as shown in Figure 4, the treatment of BHRF1 siRNA #C, # 2 and # 32 and docetaxel treatment all showed a 60% cell survival reduction effect compared to the scramble siRNA treatment. Therefore, siRNA against BHRF1 was found to be effective in inhibiting the resistance to docetaxel in AGS-EBV cells (A). However, in case of # 32, AGS cells, which are EBV-negative cells, also showed the effect of decreasing cell survival (B), which is effective in suppressing BHRF1 expression but may also affect off-target.

실험예Experimental Example 4.  4. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 가 end EBVEBV -양성 위암 세포의 세포 사멸에 미치는 영향 확인-Identify the effects on the cell death of benign gastric cancer cells

4-1. 4-1. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 가 세포 사멸에 미치는 영향 확인 The effects of cell death on cell death

BHRF1 siRNA 가 항암제에 대한 EBV-양성 위암 세포의 사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여, BHRF1 siRNA #C를 AGS-EBV 세포에 처리한 후 도세탁셀을 처리하고 사멸 세포(apoptotic cell)의 비율 변화를 확인하였다.In order to confirm the effect of BHRF1 siRNA on the death of EBV-positive gastric cancer cells against anticancer agents, BHRF1 siRNA #C was treated with AGS-EBV cells, followed by docetaxel treatment, and the percentage change of apoptotic cells was confirmed. .

구체적으로, AGS-EBV 세포를 1x105 cells/ml 의 밀도로 6 웰 플레이트에 접종하고, scramble siRNA 및 BHRF1 siRNA #C를 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM 처리하여 72 시간 더 배양한 후 아넥신 V 염색(annexin V staining)을 하고 FACScaliber 기기 (Becton Dickinson)를 이용하여 사멸 세포의 비율을 확인하였다.Specifically, AGS-EBV cells were inoculated into 6 well plates at a density of 1 × 10 5 cells / ml, scramble siRNA and BHRF1 siRNA #C were added at 20 nM, and then transfected with G-fectin and incubated for 24 hours. . Next, the docetaxel was treated with 30 nM and further incubated for 72 hours, followed by annexin V staining, and the ratio of dead cells was confirmed using a FACScaliber instrument (Becton Dickinson).

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, BHRF1 siRNA #C를 트랜스펙션한 후 도세탁셀을 처리하였을 때 scramble siRNA를 트랜스펙션한 경우에 비해 더 많은 세포에서 세포 사멸(apoptosis)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 BHRF1에 대한 siRNA가 AGS-EBV 세포에서 도세탁셀에 대한 내성을 저해하는데 효과가 있음을 알 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 5, when a docetaxel was treated after transfection of BHRF1 siRNA #C, apoptosis occurred in more cells than when transfected with scramble siRNA. . Therefore, siRNA against BHRF1 was found to be effective in inhibiting the resistance to docetaxel in AGS-EBV cells.

4-2. 4-2. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 가 세포 사멸 및 세포주기 제어 관련 유전자들의 발현에 미치는 영향 확인Effect of cell death on cell death and expression of cell cycle control genes

AGS-EBV 세포에 도세탁셀과 BHRF1 siRNA #C 를 같이 처리한 후에 세포 사멸 및 세포주기 제어 관련 유전자들의 발현 변화를 조사하여 BHRF1에 대한 siRNA를 사용함으로써 항암제 내성을 줄일 수 있음을 분자적 수준에서 확인하고자 하였다.To investigate the change in the expression of genes related to cell death and cell cycle control after treatment of docetaxel and BHRF1 siRNA #C in AGS-EBV cells at the molecular level to confirm that anti-cancer drug resistance can be reduced by using siRNA against BHRF1. It was.

음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 BHRF1 siRNA #C를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀을 30 nM 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자 발현을 확인하였다.20 nM of each of the scramble siRNA and BHRF1 siRNA #C used as a negative control were added, and then transfected with G-fectin and incubated for 24 hours. Next, 30 nM of docetaxel was incubated for 72 hours, and then cells were harvested and protein extracted to confirm cell death and cell cycle control-related gene expression through Western blot.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 도세탁셀을 scramble siRNA와 함께 처리한 경우 AGS와 AGS-EBV 세포에서 p53의 발현이 비슷한 정도로 증가되었으나, 도세탁셀을 BHRF1 siRNA #C와 함께 처리한 AGS-EBV 세포에서는 p53의 발현이 더 많이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 6, the treatment of docetaxel with scramble siRNA increased the expression of p53 in AGS and AGS-EBV cells to a similar degree, but in the AGS-EBV cells treated with docetaxel with BHRF1 siRNA #C It was confirmed that the expression of is increased more.

또한 AGS-EBV 세포에서 보다 AGS 세포에서 도세탁셀 처리에 의해 활성형의 Caspase-3 양과 p21이 높게 나타났으며, AGS-EBV 세포에 도세탁셀과 BHRF1 siRNA #C를 함께 처리하면 도세탁셀과 scramble siRNA를 함께 처리한 경우보다 활성화된 Caspase-3의 양과 p21이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. In addition, the amount of active Caspase-3 and p21 was higher in AGS cells than in AGS-EBV cells, and when docetaxel and BHRF1 siRNA #C were co-treated with AGS-EBV cells, both docetaxel and scramble siRNA were treated together. It was confirmed that the amount of activated Caspase-3 and p21 were increased than in one case.

한편, basal level에서 AGS 세포에 비해 AGS-EBV 세포에서 Bcl-2 발현이 높았고, AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA를 처리하였을 때 Bcl-2의 발현이 다소 감소되었다. 도세탁셀을 처리하면 AGS 세포에서는 Bcl-2의 발현이 거의 되지 않는 반면 AGS-EBV 세포에서는 Bcl-2의 발현이 증가하였다. 또한 BHRF1 siRNA #C를 도세탁셀과 같이 AGS-EBV 세포에 처리하면 Bcl-2의 발현이 조금 감소되었다. On the other hand, Bcl-2 expression was higher in AGS-EBV cells compared to AGS cells at basal level, and Bcl-2 expression was slightly decreased when BHRF1 siRNA was treated in AGS-EBV cells. Treatment with docetaxel resulted in little Bcl-2 expression in AGS cells but increased Bcl-2 expression in AGS-EBV cells. In addition, when BHRF1 siRNA #C was treated with AGS-EBV cells like docetaxel, the expression of Bcl-2 was slightly decreased.

따라서 BHRF1 siRNA 의 항암제 내성 저해 과정에서 세포 사멸 및 세포 주기 제어 관련 유전자들이 관여할 가능성을 확인할 수 있었으며, 나아가 BHRF1의 발현을 억제시켜서 세포 사멸 및 생존에 중요한 유전자들을 조절함으로써 향후 EBV 관련 암을 치료하는데 활용할 수 있을 것임을 알 수 있었다.
Therefore, it was confirmed that genes related to apoptosis and cell cycle control may be involved in the process of inhibiting the anticancer drug resistance of BHRF1 siRNA. It could be used.

실험예Experimental Example 5.  5. BHRF1BHRF1 mRNAmRNA 상의  top siRNAsiRNA 타겟target 부위의 규명 Identification of the site

항암제 내성을 보이는 EBV-양성 위암에서 항암제 감수성을 높이기 위한 목적으로 BHRF1 에 대한 siRNA 를 제공하고자, 본 발명자들은 BHRF1 의 mRNA 서열 중에서 실제로 고효율로 항암제 감수성을 유도할 수 있는 siRNA 표적 서열을 규명하기 위한 실험을 진행하였다.
To provide siRNAs against BHRF1 for the purpose of enhancing anticancer susceptibility in EBV-positive gastric cancer showing anticancer drug resistance, the present inventors have experimented to identify siRNA target sequences capable of inducing high anticancer susceptibility in the mRNA sequences of BHRF1. Proceeded.

5-1. 5-1. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 에 의한 단백질 수준에서의 At the protein level by BHRF1BHRF1 유전자 침묵 효과 확인 Confirm gene silencing effect

BHRF1 mRNA 상의 다양한 부위에 결합하는 40종의 이중가닥 siRNA 를 제조하고 (실시예 2 참조), 이들 siRNA를 각각 AGS-EBV 세포에 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현 억제 효과(gene silencing)가 나타나는지 여부를 단백질 수준에서 확인하였다.40 double-stranded siRNAs that bind to various sites on the BHRF1 mRNA were prepared (see Example 2) and treated with each of these siRNAs in AGS-EBV cells to determine whether the gene silencing of the BHRF1 gene was expressed. Confirmation at the protein level.

구체적으로, AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 실시예 3에서 제조한 40종의 BHRF1 siRNA를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.Specifically, AGS-EBV cells were dispensed at a density of 1 × 10 6 cells / ml in a 100 mm culture dish, and scramble siRNA used as a negative control and 40 BHRF1 siRNAs prepared in Example 3 were each added 20 nM, and then G. -fectin was added and transfected and incubated for 24 hours. Next, after treatment with docetaxel 30nM and incubated for 72 more hours, the cells were harvested and the proteins were extracted to confirm the expression change of the BHRF1 gene through Western blot.

도 7은 siRNA #A~#E 에 대한 두 번의 실험 결과를 나타내고, 도 8은 siRNA #1~#35 에 대한 두 번의 실험 결과 및 로딩 대조군으로 사용한 β-actin 에 대한 BHRF1 의 발현을 normalization한 결과를 종합하여 그래프로 나타낸 것이다. 실험 결과, 총 40종의 siRNA 중에서 #C, #2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32 가 BHRF1 발현을 80~90% 정도 감소시키는 것으로 확인하였다. 그러나, siRNA #A, #E, #4~6, #8, #10~13, #16, #19~#25, #27~31, #33~35 의 경우에는 유전자 발현 억제 효과가 거의 나타나지 않거나 약하게 나타났다.
7 shows the results of two experiments on siRNA # A ~ # E, and FIG. 8 shows the results of two experiments on siRNA # 1 ~ # 35 and normalization of BHRF1 expression on β-actin as a loading control. This is shown as a graph. As a result, among 40 kinds of siRNA, #C, # 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26, and # 32 reduced BHRF1 expression by 80 ~ 90%. Confirmed. However, siRNA #A, #E, # 4-6, # 8, # 10-13, # 16, # 19- # 25, # 27-31, and # 33-35 showed almost no gene expression inhibitory effect. Appeared or weak.

5-2. 5-2. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 에 의한 On by mRNAmRNA 수준에서의  At the level BHRF1BHRF1 유전자 침묵 효과 확인 Confirm gene silencing effect

BHRF1 siRNA 을 AGS-EBV 세포에 처리했을 때 BHRF1 유전자의 발현 억제 효과가 mRNA 수준에서도 나타나는지 여부를 조사하였다.When the BHRF1 siRNA was treated in AGS-EBV cells, the inhibitory effect of the BHRF1 gene was also examined at the mRNA level.

구체적으로, AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 상기 실험예 5-1 에서 80% 이상의 BHRF1 발현 억제 효과를 나타낸 BHRF1 siRNA 9종(#2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32)을 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR 로 BHRF1 의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 비교를 위하여 실험예 5-1의 웨스턴 블랏에서 유전자 발현 억제 효과가 적었던 siRNA 3종(#25, #28 및 #29)을 임의로 골라서 그들이 BHRF1 mRNA 수준에 미치는 영향도 함께 조사하였다.Specifically, AGS-EBV cells were dispensed at a density of 1 × 10 6 cells / ml in a 100 mm culture dish, and scramble siRNA used as a negative control and BHRF1 siRNA 9 showing an inhibitory effect of BHRF1 expression of 80% or more in Experimental Example 5-1. Species (# 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26 and # 32) were added 20 nM each, and then transfected with G-fectin and incubated for 24 hours. . Next, after treatment with docetaxel 30nM and incubated for 72 hours, cells were harvested and total RNA was extracted to confirm mRNA expression change of BHRF1 by real-time PCR. For comparison, three siRNAs (# 25, # 28 and # 29), which had little gene expression inhibitory effect in Western blot of Experimental Example 5-1, were randomly selected and examined for their effects on BHRF1 mRNA levels.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, siRNA 9종(#2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32) 모두 실험예 5-1 의 웨스턴 블랏 결과와 유사하게 mRNA 양을 효과적으로 억제하였다.
As a result, as shown in Figure 9, nine siRNA (# 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26 and # 32) Western blot of Experimental Example 5-1 Similarly, the amount of mRNA was effectively suppressed.

5-3. 5-3. BHRF1BHRF1 을 발현시킨 상태에서  In the state siRNAsiRNA 에 의한 On by BHRF1BHRF1 유전자 침묵 효과 확인 Confirm gene silencing effect

실험예 5-1 및 5-2 에서는 AGS-EBV 세포에 BHRF1 siRNA를 먼저 트랜스펙션시키고 도세탁셀을 처리하여 도세탁셀에 의해 유도된 BHRF1 발현을 억제하는 효율적인 siRNA를 선별하였으나, 본 실험에서는 AGS-EBV 세포에 도세탁셀을 먼저 처리하여 BHRF1 유전자 발현을 유도한 상태에서 siRNA 를 트랜스펙션하여 BHRF1 유전자 침묵 효과를 단백질 수준에서 확인하였다.In Experimental Examples 5-1 and 5-2, an efficient siRNA was selected for transfection of AGS-EBV cells with BHRF1 siRNA and treatment of docetaxel to inhibit BHRF1 expression induced by docetaxel, but in this experiment AGS-EBV cells Docetaxel was first treated to transfect siRNA in the state of inducing BHRF1 gene expression, and the effect of BHRF1 gene silencing was confirmed at the protein level.

구체적으로, AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 24 시간 배양하여 BHRF1 유전자 발현을 유도한 후, scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #2, #3, #9, #14, #17 및 #32를 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시켰다. 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.Specifically, AGS-EBV cells were dispensed at a density of 1 × 10 6 cells / ml in a 100 mm culture dish, treated with docetaxel 30 nM, and cultured for 24 hours to induce BHRF1 gene expression, followed by scramble siRNA and Experimental Examples 5-1 and Among siRNAs selected in 5-2, # 2, # 3, # 9, # 14, # 17, and # 32 were each added 20 nM, and then transfected with G-fectin. After 72 hours of incubation, the cells were harvested and the proteins were extracted to confirm the expression changes of the BHRF1 gene through Western blot.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, BHRF1을 발현시킨 상태에서 BHRF1 siRNA들을 처리하였을 때도 6종의 siRNA에서 BHRF1 발현이 모두 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 BHRF1 siRNA #2, #3에 의해 효과적으로 감소되는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 10, even when BHRF1 siRNAs were treated in the state of expressing BHRF1, it was confirmed that all BHRF1 expressions were reduced in six siRNAs, in particular, effectively reduced by BHRF1 siRNA # 2 and # 3. It confirmed that it became.

5-4. 5-4. BHRF1BHRF1 siRNAsiRNA 처리 농도에 따른  Depending on treatment concentration BHRF1BHRF1 넉다운Knockdown 효과 확인 Check the effect

AGS-EBV 세포를 100 mm 배양 접시에 1x106 cells/ml의 밀도로 분주하고, 음성 대조군으로 사용한 scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #C, #2, #3, #9, #14, #17 및 #32 를 각각 1, 5, 10 nM로 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.AGS-EBV cells were dispensed at a density of 1 × 10 6 cells / ml in a 100 mm culture dish, and scramble siRNAs used as negative controls and siCs selected from experiments 5-1 and 5-2 were #C, # 2, # 3, # 9, # 14, # 17 and # 32 were added at 1, 5 and 10 nM, respectively, and then transfected with G-fectin and incubated for 24 hours. Next, after treatment with docetaxel 30nM and incubated for 72 more hours, the cells were harvested and the proteins were extracted to confirm the expression change of the BHRF1 gene through Western blot.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, BHRF1 siRNA를 저농도로 사용했을 때도 scramble siRNA와 비교하였을 때 모두 효과가 좋은 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 11, even when using a low concentration of BHRF1 siRNA was confirmed that the effect is good when compared to scramble siRNA.

5-5. 5-5. SNUSNU -719 세포주에서 In -719 cell lines siRNAsiRNA 에 의한 On by BHRF1BHRF1 유전자 침묵 효과 확인 Confirm gene silencing effect

자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에 BHRF1 siRNA를 트랜스펙션하여 BHRF1 유전자 침묵 효과를 확인하였다.SNU-719, a natural EBV infected gastric cancer cell line, was transfected with BHRF1 siRNA to confirm the BHRF1 gene silencing effect.

SNU-719 세포에 scramble siRNA 및 실험예 5-1 및 5-2 에서 선별된 siRNA 들 중에서 #2, #3, #9, #14, #17 및 #32을 각각 20 nM씩 가한 후 G-fectin 을 첨가하여 트랜스펙션시키고 24 시간 배양하였다. 다음으로, 도세탁셀 30nM 를 처리하고 72 시간 더 배양한 후 세포들을 수확하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 통해 BHRF1 유전자의 발현 변화를 확인하였다.G-fectin was added to SNU-719 cells by adding 20 nM of scramble siRNA and siRNA selected in Experimental Examples 5-1 and 5-2, respectively, to # 2, # 3, # 9, # 14, # 17 and # 32. Was added to transfect and incubated for 24 hours. Next, after treatment with docetaxel 30nM and incubated for 72 more hours, the cells were harvested and the proteins were extracted to confirm the expression change of the BHRF1 gene through Western blot.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 자연적으로 EBV 감염된 위암 세포주인 SNU-719에서도 BHRF1 siRNA에 의한 BHRF1 유전자 발현 억제 효과를 확인할 수 있었고, 이를 통하여 상기 BHRF1 siRNA의 효과가 EBV-양성 위암 종양에 보편적으로 적용될 가능성을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 12, SNU-719, a natural EBV infected gastric cancer cell line, was able to confirm the inhibitory effect of BHRF1 gene expression by BHRF1 siRNA, and thus the effect of BHRF1 siRNA was universal in EBV-positive gastric cancer tumors. The possibility of application was confirmed.

상기 결과들을 종합적으로 살펴보았을 때, siRNA #C, #2, #3, #9, #14, #15, #17, #18, #26 및 #32 가 결합하는 부위, 즉 BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째, 165 내지 184 번째, 243 내지 262 번째, 487 내지 506 번째, 및 519 내지 539 번째 부위가 siRNA 제작시 주요 타겟이 될 핫스팟(hotspot)임을 확인할 수 있었으며, 이 부위에 결합하는 siRNA 가 BHRF1 발현을 고효율로 억제함으로써 EBV-양성 위암에서 항암제 내성 억제 효과를 유도하는데 효과적임을 규명할 수 있었다. 상기 본 발명에서 제공하는 타겟 부위를 도 13에 나타내었다.
Based on the above results, siRNA #C, # 2, # 3, # 9, # 14, # 15, # 17, # 18, # 26, and # 32 bind to each other, that is, 18 to 18 of the BHRF1 mRNA. The 36th, 165th-184th, 243-262th, 487-506th, and 519-539th sites were identified as hotspots that would be the main targets for siRNA production, and siRNA binding to these sites expressed BHRF1. Inhibition of high efficiency was found to be effective in inducing anticancer drug inhibitory effect in EBV-positive gastric cancer. 13 illustrates a target site provided by the present invention.

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Claims (13)

다음으로 이루어진 군에서 선택되는, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA:
BHRF1 mRNA 의 18 내지 36 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하며, 서열번호 62 및 서열번호 63의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA;
BHRF1 mRNA 의 165 내지 184 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하며, 서열번호 14 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA;
BHRF1 mRNA 의 243 내지 262 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하며, 서열번호 6 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA;
BHRF1 mRNA 의 487 내지 506 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하며, 서열번호 38 및 서열번호 39의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA; 및
BHRF1 mRNA 의 519 내지 539 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합하며, 서열번호 44 및 서열번호 45의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 siRNA.
SiRNAs that inhibit expression of the BHRF1 gene, selected from the group consisting of:
SiRNA binding to the 18-36th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA and consisting of nucleotide pairs of SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63;
SiRNA binding to the 165th to 184th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA and consisting of a nucleotide pair of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, or a nucleotide pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17;
SiRNA that binds to the 243-262 nucleotide sequence of BHRF1 mRNA and consists of a nucleotide pair of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, or a nucleotide pair of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29;
An siRNA that binds to the 487-506th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA and consists of a nucleotide pair of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, or a nucleotide pair of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41; And
An siRNA that binds to the 519 th-539 th nucleotide sequence of BHRF1 mRNA and consists of a nucleotide pair of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, or a nucleotide pair of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), 몰포리노(morpholinos) 또는 PNA (peptide nucleic acid) 형태를 가지는 것인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
The siRNA of claim 1, wherein the siRNA has a locked nucleic acid (LNA), unlocked nucleic acid (UNA), morpholinos (morpholinos), or peptide nucleic acid (PNA) form.
제1항에 있어서, 상기 siRNA는 이에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당의 2'-위치의 수산기가 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 및 아미노기 중 어느 하나로 치환되거나, 인산 백본이 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트 및 보라노포스페이트중 어느 하나로 치환된 것인, BHRF1 유전자의 발현을 억제하는 siRNA.
According to claim 1, wherein the siRNA is a hydroxyl group of the 2'-position of the sugar of at least one nucleotide contained therein is substituted with any one of a hydrogen atom, a halogen atom, -O-alkyl group, -O-acyl group and amino group, or phosphoric acid An siRNA that inhibits expression of the BHRF1 gene, wherein the backbone is substituted with any one of phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, phosphoramidate and boranophosphate.
제1항, 제8항 또는 제9항의 siRNA를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 양성 위암에 대한 항암제 내성 저해용 조성물.
A composition for inhibiting anticancer drug resistance to Epstein-Barr virus-positive gastric cancer comprising the siRNA of claim 1, 8 or 9.
제10항에 있어서, 상기 항암제는 도세탁셀인 조성물.
The composition of claim 10, wherein the anticancer agent is docetaxel.
제1항, 제8항 또는 제9항의 siRNA 및 항암제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 양성 위암 치료용 조성물.
Epstein-Barr virus-positive gastric cancer composition comprising the siRNA of claim 1, 8 or 9 and an anticancer agent.
제12항에 있어서, 상기 항암제는 도세탁셀인 조성물.
The composition of claim 12, wherein the anticancer agent is docetaxel.
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