KR20180029924A

KR20180029924A - 피더세포 없이 줄기세포 배양이 가능한 배양 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20180029924A
Application number: KR1020170116695A
Authority: KR
Inventors: 윤원준; 문성환; 김종수
Original assignee: 윤원준
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2018-03-21
Also published as: WO2018048290A1; KR102000507B1

Abstract

본원은 신규한 서열의 폴리펩타이드 및 이를 이용한 피더 프리 배아줄기세포 배양용 조성물 및 방법을 개시한다. 본원에 따른 조성물 및 방법은 xeno free 배양을 가능하게 하고, 배아줄기세포를 분화능은 유지하면서, 미분화 상태에서 장기간 증식이 가능하다.

Description

피더세포 없이 줄기세포 배양이 가능한 배양 조성물 및 방법{Composition and Methtod for feeder free and xeno free culture of stem cells}

본원은 피더세포 없이 줄기세포를 배양할 수 있는 기술과 관련된 것이다.

배아 줄기세포의 불멸성과 다분화성은 발생 및 분화에 작용하는 유전자의 규명은 물론, 줄기세포를 이용한 균질한 사람의 조직이나 세포를 이용한 약물검사, 독성검사를 통한 신약개발, 그리고 무엇보다 특히 손상된 조직 또는 장기를 대체할 수 있어 파킨슨병, 척추손상, 심장질환, 알츠하이머 및 제1형 당뇨병과 같은 난치병 치료에도 널리 이용될 수 있다. 이를 위해서는 배아 줄기세포를 인비트로에서 미분화상태에서 증식이 가능하게 장기간 배양할 수 있는 기술의 수립이 절실하다.

현재 이용되는 배아줄기세포 배양 방법은 톰슨 (Thomson JA, Science 282:1145-1147,1998)에 의해 수립된 방법을 토태로 하고 있다. 이에 의하면 마이토마이신 처리 또는 방사선 조사로 성장이 억제된 MEF (Mouse Embryonic Fibroblast) 세포 또는 이와 유사한 세포(ST0세포 등)을 피더세포를 사용하여 성장에 필요한 세포외 기질 및 싸이토카인을 배지에 발현시킨 후 그 위에 인간배아줄기세포를 접종하여 배양한다. 그 결과 배아줄기세포의 미분화성 및 증식성을 유지할 수 있으나 배양에 많은 시간이 소요됨은 물론, 배지가 피어세포 및 배아줄기세포 모두에 최적화되어야 하며, 이종(Xenogenic)세포의 사용으로 인한 문제점이 있다.

따라서 MEF 세포 대신 인간 세포를 피더 세포로 이용하는 시도(Richards et al., Nature Biotech. 20: 933, 2002) 및 피더 세포를 사용하지 않는 배양법의 개발도 보고되고 있다.

대한민국 공개특허 제2010-7007153호는 피더 세포-불포함 배양 배지 및 시스템에 관한 것으로 피더세포 대신에 다양한 성장호르몬, 성장분화인자 등을 포함하는 정의된 세포배양 배지를 개시한다.

하지만 보다 간편하고 효과적인 방법으로 다능성(pluripotent) 줄기세포를 미분화상태에서, 전능성 또는 다능성의 분화능을 유지하면서 미분화 상태에서 장기간 증식 배양할 수 있는 배양기술의 개발이 요구된다.

본원은 세포, 특히 다능성 줄기세포의 배양에 있어서, 피더 세포(feeder cell)를 사용하지 않고, xeno free, 미분화성 및 분화 다능성을 지닌 상태로 다능성 줄기세포를 증식시킬 수 있는 세포 배양 조성물을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 하기 화학식 IV의 펩타이드를 포함하는 피더프리 줄기세포 배양 조성물 또는 용도를 제공한다.

[화학식 IV]

[X¹²]_1-15 -[X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]m- [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n_,

상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]m에서,

상기 X¹ 은 임의의 아미노산이고,

상기 X², X³ 및 X⁴ 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X², X³ 또는 X⁴ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,

상기 X⁵ 는 K 또는 R의 아미노산 이고,

상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며,

상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n에서,

상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]은 결여될 수 있거나, 또는

상기 X⁶ 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁷ 는 K 또는 R의 아미노산이고,

상기 X⁸ 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁹ 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X¹⁰ 는 임의의 아미노산이고,

상기 X¹¹ 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁸ 및 X⁹ 또는 상기 X¹⁰ 및 X¹¹ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,

상기 n은 1 또는 2이고,

상기 X¹²는 F, K 또는 R 이고,

상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.

일 구현예에서, 상기 X¹의 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q일 수 있고, 상기 X²- X³- X⁴ 는 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 일 수 있다.

또 다른 구현예에서 상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나이다: QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).

또 다른 구현예에서 상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나이다: FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), FRPC (서열번호 14) 또는 FR.

또 다른 구현예에서 상기 화학식 IV의 펩타이드는 하기 중 어느 하나의 서열로 표시된다:

RQLVVK (서열번호 15); FRALPCRQLVVK (서열번호 16); RQLVVKFRALPC (서열번호 17); RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18); RQLVVKFRALP(서열번호 19); RQLVVKFRAL(서열번호 20); KQLVVKFRALPC (서열번호 21); RQKFRALPC (서열번호 22); RQEEEKFRALPC (서열번호 23); RQAAAKFRALPC (서열번호 24); RQLVVKFRPC (서열번호 25); RQLVVKFREEPC (서열번호 26); RQLVVKFRVVPC (서열번호 27); RQEEEKFREEPC (서열번호 28); EQLVVEFEALPC (서열번호 29); RQLVVKYRALPC (서열번호 30); RQLVVKWRALPC (서열번호 31); RNLVVKFRALPC (서열번호 32); RSLVVKFRALPC (서열번호 33); RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37); (R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38); (R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39); (R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40); (R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41); RQVVVKFRALPC (서열번호 42); RQIVVKFRALPC (서열번호 43); RQAVVKFRALPC (서열번호 44); RQEVVKFRALPC (서열번호 45); RQLLVKFRALPC (서열번호 46); RQLIVKFRALPC (서열번호 47); RQLAVKFRALPC (서열번호 48); RQLEVKFRALPC (서열번호 49); RQLVLKFRALPC (서열번호 50); RQLVIKFRALPC (서열번호 51); RQLVAKFRALPC (서열번호 52); RQLVEKFRALPC (서열번호 53); RQLVVRFRALPC (서열번호 54); RQLVVKFKALPC (서열번호 55); RQLVVEFEALPC (서열번호 56); RQLVVKFRLLPC (서열번호 57); RQLVVKFRILPC (서열번호 58); RQLVVKFRVLPC (서열번호 59); RQLVVKFRELPC (서열번호 60); RQLVVKFRAAPC (서열번호 61); RQLVVKFRAIPC (서열번호 62); RQLVVKFRAVPC (서열번호 63); RQLVVKFRAEPC (서열번호 64); RQEEEEFEEEPC (서열번호 65); RQLVVKFRALXC (서열번호 66); RQLVVKFRALPS (서열번호 67); RQLVVKFRALPT (서열번호 68); 또는 RQLVVKFRALPX (서열번호 69).

또 다른 양태에서 상기 화하식 IV의 X¹ 은 극성의 Q, N, S, T, P 또는 C 이고, 상기 X², X³ 및 X⁴ 는 각각 동일 또는 상이한 소수성의 L, V, I, 또는 A 이고, 상기 X⁵ 는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]에서, X⁸ 및 X⁹ 또는 상기 X¹⁰ 및 X¹¹ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14), 또는 FR 이고, 상기 X¹²는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 m 및 n은 각각 1 또는 2이고, m 또는 n 이 2인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산이다.

일 구현예에서 상기 X²- X³- X⁴ 는 LVV, AAA, LVA, LVL, LLA, LLL, 또는 LLV이거나 또는 상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵] 의 펩타이드는 하기 중 어느 하나이다: QLVVK (서열번호 1), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).

일 구현예에서 상기 펩타이드는 하기 서열로 표시된다: RQLVVKFRALPC (서열번호 17); RQLVVKFRALP(서열번호 19); RQLVVKFRAL(서열번호 20); KQLVVKFRALPC (서열번호 21); RQAAAKFRALPC (서열번호 24); RQLVVKFRPC (서열번호 25); RQLVVKFREEPC (서열번호 26); RQLVVKFRVVPC (서열번호 27); RQLVVKYRALPC (서열번호 30); RQLVVKWRALPC (서열번호 31); RNLVVKFRALPC (서열번호 32); RSLVVKFRALPC (서열번호 33); RQLVVK-(FRALPC)₂ (서열번호 37); (R)₂-QLVVKFRALPC (서열번호 38); (R)₅-QLVVKFRALPC (서열번호 39); (R)₁₀-QLVVKFRALPC (서열번호 40); (R)₁₅-QLVVKFRALPC (서열번호 41); RQVVVKFRALPC (서열번호 42); RQIVVKFRALPC (서열번호 43); RQAVVKFRALPC (서열번호 44); RQLLVKFRALPC (서열번호 46); RQLIVKFRALPC (서열번호 47); RQLAVKFRALPC (서열번호 48);RQLVLKFRALPC (서열번호 50); RQLVIKFRALPC (서열번호 51); RQLVAKFRALPC (서열번호 52); 또는 RQLVVRFRALPC (서열번호 54).

또 다른 양태에서 본원은 서열번호 15 내지 69중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하는 피더프리 줄기세포 배양 조성물 또는 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 피더세포 없이 줄기세포를 배양하는 방법 또는 용도를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 상술한 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 피더 세포 프리, 즉 피더세포의 사용을 필요로 하지 않는 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell) 증식 또는 배양용 조성물 또는 용도에 관한 것이다.

또다른 양태에서 본원은 또한 다능성 줄기세포를 미분화상태로 증식하는 방법으로, 상기 방법은 영장류 유래의 다능성 줄기세포를 본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 세포배양 조성물과 피더 프리 환경에서 접족하는 단계를 포함한다.

또다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는 피더 프리 즉 피더 세포가 필요없는 다능성 줄기세포 증식 방법으로 상기 방법은 액체 배지를 포함하며, 그 표면에 본원에 따른 펩타이드가 코팅된 배양용기를 이용하는 것을 특징으로 하며, 다능성 줄기세포는 미분화 상태에서 분화능을 유지하면서 증식 가능하다.

본원에 따른 펩타이드는 안전하면서도 접착효과가 우수한 생접착물질로서, 다능성 줄기세포의 배양에 있어서, 피더 세포(feeder cell)를 사용하지 않고, xeno free, 미분화성 및 분화 다능성을 지닌 상태로 다능성 줄기세포를 증식시킬 수 있어, 줄기세포 배양 배지로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 세포 접착능의 기전을 규명하기 위한 분석 결과이다.
도 1a는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드 (A)로 처리된 세포에 EDTA 또는 CHX를 처리한 경우에도 접착능에 차이가 없음을 나타내는 결과로 본원에 따른 펩타이드에 의한 세포접착이 세포 표면의 전해질 (EDTA 처리 결과)이나 새로운 단백질 합성 (CHX 처리 결과)을 필요로 하지 않는 반면, 혈청에 의해서는 초기에 저해가 일어나는 것을 나타내는 결과이다.
도 1b는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드 (A)에 의한 세포접착 촉진 기전으로 GAG 또는 콜라겐과의 연관성을 분석한 결과이다. 위의 도면은 콜라겐과 GAG 모두에 관련되어 있다는 결과로 효소처리에 의해 잠정적 표적을 분해함으로써 나타나는 현상을 관찰한 것이다. 콜라게나제처리에 의한 세포접착의 감소는 적어도 콜라겐과의 상호작용. 그리고 히알루로니다제 처리는 적어도 헤파린 설페이트를 가수 분해함으로써 세포접착이 감소했으며, 이는 GAG 중 헤파린 설페이트와 펩타이드의 상호작용을 나타낸다. 아래 도면은 GAG와의 관련성을 분석한 결과로 헤파린 및 C-설페이트를 첨가한 결과 본원에 따른 펩타이드를 통해 촉진되는 세포접착능이 농도의존적으로 현저히 감소하였으며, 이러한 결과는 본원에 따른 펩타이드의 세포접착능과 GAG와의 관련성을 나타내는 것이다.
도 1c는 세포에 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드와 용해성 RGDS 펩타이드를 경쟁적으로 처리한 결과로 본원에 따른 펩타이드 비처리군에서는 용해성 RGDS를 처리할 경우 분착분자인 인테그린(integrin)에 우선적으로 결합하여 바닥(기질에) 대한 접착능을 유의미하게 감소시키지만, 본원에 따른 펩타이드 처리군에서는 RGDS를 처리함에도 세포의 접착에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 본원에 따른 펩타이드가 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가짐을 나타내는 것이다.
도 2a는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 줄기세포에 대한 접착능 향상을 측정하기 위해 제작된 리포터 시스템 및 이를 이용한 실험 절차를 도식적으로 나타낸 것으로, 상기 리포터 시스템은 줄기세포의 다능성(Stemness)의 지표로 Oct4 유전자의 활성을 측정할 수 있는 구조를 포함한다.
도 2b는 도 2a에 따른 구축물을 이용하여 마우스 유도만능 줄기세포의 접착 및 다능성 유지를 세포 배양 2일 및 3일째에 Oct4의 발현여부 검출로 측정한 결과로, 대조군으로서 피더세포 및 젤라틴으로 미리 코팅된 배양접시를 사용하였으며, 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드는 미리 코팅(precoated) 되거나 또는 배양액에 혼합 (Mixed)되는 방식으로 추가되었으며, 두 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 2c는 도 2b와 동일하나, 세포배양 4일째에 측정한 결과로 본원에 따른 펩타이드는 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 3a는 다능성을 나타내는 다른 마커인 Alp (alkaline phosphotase) 유전자의 발현을 염색을 통해 관찰한 결과로, 본원에 따른 펩타이드는 미리 코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 3b는 다능성을 나타내는 다른 마커인 Nanog 유전자의 발현을 염색을 통해 관찰한 결과로, 본원에 따른 펩타이드는 미리 코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 3c는 도 3c와 동일한 실험이나 인간 배아 줄기세포 hESC를 이용한 실험결과이며, hESC에 대해서도 피더세포 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외부환경적 변화 없이도 잘 성장할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 hMSC를 이용하여 세포의 접착진행과정 (adhesion progression)이 본원에 따른 펩타이드에 의해 촉진됨을 규명하는 결과로써 세포배양 후 6시간을 기준으로 분석한 결과로, 도 4a에서 음성대조군은 여전히 부착초기단계인 actin-ring 형성이 다수를 이루고 있지만, 본원에 따른 펩타이드 처리군의 경우 이미 그 단계를 지나 스트레스 파이버 형성이 다수의 세포에서 관찰되었으며, 도 4b는 이러한 관찰결과를 정량한 그래프이며, 도 4c는 세포 부착에 따른 기하학적 양태 (geometric shape) (cell aspect ratio: 세포의 가로/세로의 비율, 1일 경우 완전한 원형이며 부착과정의 가장 초기 상태로 나타냄) 을 측정하여 나타낸 결과로써 본원에 따른 펩타이드의 처리군에서 월등히 성숙된 접착능을 보여 준다.
도 5a 및 도 5b는 본원에 따른 다양한 서열을 갖는 펩타이드와 GAG와 같은 세포외 기질간의 상호작용을 통하여 나타나는 세포 접착능 촉진을 측정한 결과이다. 도 5a의 가로축의 펩타이드 명칭은 표 2에 상응하는 서열번호가 표시되어 있다. 도 5b의 가로축의 번호는 본원에 따른 펩타이드의 서열번호를 나타낸다.
도 6은 본원에 따른 방법을 피더세포를 사용하는 기존의 방법과 비교한 것으로, 각 배양방법을 사용한 경우 배아줄기세포의 다능성(pluripotency)에 미치는 영향을 분석한 결과 및 줄기세포의 부착을 분석한 결과로, 본원에 따른 방법은 줄기세포의 다능성을 감소시키거나 또는 부정적 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 세포 또는 콜로니의 부착상태가 기존의 방법과 비교하여 차이점이 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 세포배양 조성물이 피더세포 없이 줄기세포의 다능성을 유지하면서 성장 및 증식을 포함하는 배양이 가능하게 할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 도 6에 나타난 GFP 형광신호를 FACS를 이용하여 정량적으로 분석한 결과로서 본원에 따른 방법이 피더세포를 이용한 배양과 다능성의 유지 및 부착 에서 필적하는 효과를 가짐을 나타낸다.
도 8은 도 7에 기재된 각 조건별로 세포를 회수하여 다능성을 결정하는 핵심인자인 OCT4, NANOG, SOX2를 실시간 정량 PCR로 분석한 결과이다. 이에 나타난 바와 같이 다능성의 표지인자의 발현이 기존의 피더세포를 이용한 방법과 비교하여 우수함을 나타낸다.
도 9는 도 8에서 분석한 각 표지인자를 면역염색방법으로 분석한 결과이다. 이에 나타난 바와 같이 핵에서 각 표지인자의 발현을 관찰할 수 있었으며, 이는 본원에 따른 방법에 따른 배양되는 줄기세포의 다능성이 유지되고 있음을 나타내는 것이다.
도 10은 본원에 따른 방법으로 배양된 P.16 세포를 회수하여 이를 신경 및 근육으로 분화시킨 결과이다. 이에 나타난 바와 같이, 우수한 분화능을 유지하고 있는 것으로 나타났다.
도 11은 본원에 따른 방법으로 배양된 P.16 세포를 회수하여, 이를 성체 마우스의 조직에 이식 후 형성된 테라토마(teratoma)를 나타내며, 이는 중배엽, 외배엽 및 내배엽으로의 분화능을 나타내는 것이다.
도 12는 본원에 따른 방법으로 배양된 P.16 세포를 회수하여, 이를 수정란에 주입한 후 마우스의 자궁에 착상시킨 후 키메라 형성을 관찰한 결과이다. 이에 나타난 바와 같이 키메라 배아가 형성되었으며, 키메라로부터 분리된 생식선에 주입한 배아줄기세포의 GFP 형광이 발현되는 것으로 확인되었다. 또한 키메라에서 피부, 뇌, 간, 폐, 심장, 신장 조직을 회수하여 GFP 발현을 확인한 결과 상기 모든 조직에서 GFP가 발현되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 따른 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물을 이용하여 배양된 배아줄기세포는 germ line transmission 능을 유지하고 있음을 나타낸다. Germ line transmission이 가능해야 Knock Out 마우스, Transgenic 마우스의 제작이 가능하기 때문에 본원에 따른 펩타이드, 이를 포함하는 조성물 및 방법의 우수한 효과를 나타낸다.
도 13은 본원에 따른 다양한 서열을 이용한 피더프리 줄기세포 배양에 대한 효능을 관찰한 결과로, GFP 형광을 나타내는 세포의 수를 측정한 결과로, 본원에 따른 다양한 펩타이드 처리시 다능성을 유지하면서 피더프리 증식이 가능한 것을 나타낸다.
도 14는 도 13과 동일하나, 본원에 따른 다양한 펩타이드로 처리된 세포에서 발현되는 Oct4 유전자의 발현을 측정한 결과로, 본원에 따른 다양한 펩타이드 처리시 다능성을 유지하면서 피더프리 증식이 가능한 것을 나타낸다.

한 양태에서 본원은 피더세포없이 세포, 특히 줄기세포의 다능성을 유지하면서 배양을 가능하게 하는 하기 화학식 I 내지 화학식 IV로 표시되는 펩타이드, 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 이를 포함하는 피더세포가 필요없는 줄기세포 배양용 조성물 및 방법에 관한 것이다.

정의

본원에서 아미노산 잔기는 단일문자코드(single letter code)로 나타내며 약어는 다음과 같다: A, 알라닌; R, 알지닌; N, 아스파라진; D, 아스파르트산; C, 시스테인; E, 글루탐산; Q, 글루타민; G, 글라이신; H,히스티딘; I, 아이소루인신; L, 루이신; K, 라이신; M, 메티오닌; F, 페닐알라닌; P, 프롤린; S, 세린; T, 트레오닌; W, 트립토판; Y, 타이로신; V, 발린; B, 아스파라진, 아스파르트산; Z, 글루타민,글루탐산; X, 임의의 아미노산.

본원에 사용된 용어 아미노산은 20개의 천연에서 발견되는 아미노산 및 비천연 아미노산, 생체내에서 번역 후에 변형되는 아미노산 예를 들면 포스포세린 및 포스포쓰레오닌; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 노르-발린, 노르-루이신과 같은 기타 희귀 아미노산; 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함하며, 거울상 이성질체인 D- 및 L-형태를 모두 포함하는 것이다.

본원에서 양하전 아미노산, 음하전된 아미노산, 극성의 비하전된 아미노산 및 비극성의 지방족 아미노산은 측쇄의 화학적 성질을 따라 결정되며, 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 양하전된 아미노산은 K 또는 R을 포함하고, 음하전된 아미노산은 D 또는 E을 포함하고, 극성의 비하전된 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q을 포함하고, 비극성의 지방족 아미노산은 G, A, L, V, M 또는 I을 포함할 수 있다.

본원에서 아미노산과 관련되서 사용된 용어 천연 및 비천연에서 전자는 세포, 조직 또는 생체내에서 발견되는 형태의 화합물을 칭하는 것이고, 후자는 이러한 화합물에 다양한 목적을 위해 인위적 변형이 가해진 것을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 아미노산의 단위체가 공유결합으로 연결된 분자를 일컫는 것으로, 서로 교환적으로 사용되며, 다른 언급이 없는 한 N 말단부터 C 말단 방향으로 읽혀진다. 이는 원(native) 아미노산 또는 그 분해 산물, 합성 펩타이드, 재조합 방식으로 제조된 펩타이드, 펩타이드 모방체(전형적으로 합성 펩타이드), 및 펩토이드 및 세미펩토이드와 같은 펩타이드 유사체와 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, N-말단 변형, C-말단 변형, CH₂-NH, CH₂-S, CH₂-S=O, CH₂-CH₂와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함한다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 접착은 부착 및 흡착을 포함하는 것으로, 가역적, 비가역적 접착을 포함하며, 다른 측면에서는 공유결합, 이온결합, 반데르발스 결합, 수소결합 등을 포함하는 하나 이상의 화학적 결합에 의한 접착을 포함한다.

한 양태에서 본원은 하기 화학식 I의 펩타이드에 관한 것이다.

[화학식 I]

[X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]m

상기 화학식 I에서

상기 X¹ 은 임의의 아미노산 또는 극성의 비하전된 아미노산이고,

상기 X⁵ 는 양하전된 아미노산이고,

상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.

본원에 따른 화학식 I의 화합물은 제 1 영역으로써 세포간 또는 세포와 기타 표면간의 결합에 관여할 뿐만 아니라, 본원에 따른 구체적 목적에 따라 펩타이드의 갯수를 다양하게 적용할 수 있다. 제 1 영역은 펩타이드의 2차구조에 영향을 줄 수 있는 핵심 영역으로써 후술하는 다른 기능영역의 분자특성을 잘 유지하게 해준다.

본원에 따른 펩타이드에서 제 1 영역은 5개의 아미노산으로 구성된 단위체가 한 개 이상 포함될 수 있으며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 단위체는 상이하거나 동일할 수 있다. 단위체의 개수는 펩타이드의 제조, 보관, 전달 또는 후술하는 본원에 따른 펩타이드의 효능과 용도를 위해 다양한 기능화(functionalization)에 따라 다양한 수로 포함될 수 있다. 예를 들면 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 1개를 포함한다.

화학식 I에서 X¹ 은 임의의 아미노산이고, 일 구현예에서는 극성의 비하전된 아미노산, 또는 다른 구현예에서는 S, T, C, P, N 또는 Q이다.

화학식 I에서 X², X³ 및 X⁴ 는 각각 L, V, I, E, G 및 A 중 하나로, 각 잔기는 동일 또는 상이할 수 있으며, 또는 상기 X², X³ 또는 X⁴ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, X²- X³- X⁴ 서열은 예를 들면 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 등 일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 화학식 I은 X¹-LVV-X⁵, X¹-AAA-X⁵ 또는 X¹-EEE-X⁵ 일 수 있다.

일 구현예에서, 양하전된 아미노산은 K 또는 R이다.

일 구현예에서 화학식 I의 서열은 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 로 표시되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 측면에서 본원은 하기 화학식 II의 화합물, 또는 상기 화학식 I의 화합물에 하나 이상의 하기 화학식 II의 화합물을 추가로 포함하는, 본 순서로 한정하는 것은 아니나 화학식 I-II 펩타이드에 관한 것이다.

[화학식 II]

[X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n,

상기 화학식 II에서

X⁶ 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,

X⁷ 는 K 또는 R의 아미노산이고,

X⁸ 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,

X⁹ 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,

X¹⁰ 는 임의의 아미노산이고,

X¹¹ 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁸ 및 X⁹또는 상기 X¹⁰ 및 X¹¹ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,

상기 n은 1 또는 2이고, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.

상기 화학식 II의 화합물은 상기 화학식 I의 화합물의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결될 수 있다.

본원에 따르면 상기 화학식 II의 화합물은 제 2 영역으로서, 제1 영역과 함께 펩타이드 단일 분자로써 존재할 경우 알파-헬릭스 구조를 만들 수 있으며, 본원에 따른 펩타이드에 친수성 특징을 부여한다.

화학식 I의 제 1 영역과 화학식 II의 제 2 영역은 각각 1개 이상 포함될 수 있으며, 그 배열도 다양할 수 있다. 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개 이상씩 연결되어, 화학식 I- II의 펩타이드, 화학식 I-화학식 I-화학식 II-화학식 II의 구조를 갖거나 또는 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개씩 순차적으로 연결되고, 이것이 다시 연결되어, 화학식 I-화학식 II-화학식 I-화학식 II와 같은 구조를 포함할 수 있거나, 또는 화학식 I-화학식 II- 화학식 I, 또는 화학식 II-화학식 I- 화학식 II와 같은 구조를 포함할 수 있다. 상기 구조에서 화학식 I 및 II의 순서가 바뀔 수 있다.

본원의 일 구현예에서 상기 화학식 II의 펩타이드는 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL (서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14) 또는 FR로 표시된다.

다른 측면에서 본원의 화학식 I의 펩타이드, 또는 화학식 I과 II를 모두 포함하는 펩타이드 화학식 III의 X¹² _1-15 으로 표시되는 제 3 영역을 그 N 또는 C 말단에 추가로 포함할 수 있으며, 상기 X¹²는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산이다.

일 구현예에서 상기 화학식 III에서 양하전된 아미노산은 K 또는 R, 또는 F, K 또는 R이다.

다른 구현예에서 상기 화학식 III에서 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.

화학식 III은 화학식 I의 제 1 영역 및 화학식 II의 제 2 영역 다양한 배열로 포함될 수 있으며, 화학식 I 및 화학식 II는 앞서 언급한 바와 같이 각각 1개 이상 포함될 수 있다. 예를 들면 화학식 III은 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개 이상씩 연결된 화학식 I- II의 펩타이드, 화학식 I-화학식 I-화학식 II-화학식 II의 구조, 화학식 I-화학식 II-화학식 I-화학식 II와 같은 구조, 또는 화학식 I-화학식 II- 화학식 I, 또는 화학식 II-화학식 I- 화학식 II와 같은 구조의 N 또는 C 말단에 연결될 수 있다.

일 구현예에서는 특히 화학식 I 및 II를 포함하는 펩타이드의 N-말단에 연결된다.

또 다른 구현예에서, 본원은 하기 화학식 IV로 표시되는 화학식 III-I-II가 연결된 하기 화학식의 펩타이드에 관한 것이다.

[화학식 IV]

[X¹²]_1-15-[X¹- X²-X³-X⁴-X⁵]m- [X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹]n_,

상기 화학식 IV에 포함된 각 잔기에 대한 설명은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.

다른 구현예에서는 화학식 IV는 다음과 같이 정의된다.

화학식 IV에서, [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]m에서,

상기 X¹ 은 임의의 아미노산이고,

상기 X², X³ 및 X⁴ 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X², X³ 또는 X⁴ 중 한 개, 두개, 또는 세 개 잔기 모두가 결여될 수 있으며,

상기 X⁵ 는 K 또는 R의 아미노산 이고,

상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n에서,

상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n은 결여될 수 있거나, 또는

상기 X⁶ 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁷ 는 K 또는 R의 아미노산이고,

상기 X⁸ 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁹ 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X¹⁰ 는 임의의 아미노산이고,

상기 X¹¹ 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,

상기 X⁸및 X⁹또는 상기 X¹⁰및 X¹¹중 하나 이상은 결여될 수 있으며,

상기 n은 1 또는 2이고,

상기 X¹²는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.

일 구현예에서 상기 화학식 IV의 폴리펩타이드는 두 분자 이상이 연결될 것일 수 있으며 예를 들면 두 개의 분자가 N-C 방향으로 연결된 것일 수 있다.

다른 구현예에서 상기 화학식 IV에서 X¹ 의 임의의 아미노산은 극성의 S, T, C, P, N 또는 Q일 수 있고, 상기 X²- X³- X⁴는 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 일 수 있고, 상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]의 펩타이드는 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 일 수 있고, 상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]의 펩타이드 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), FRPC (서열번호 14) 또는 FR 일 수 있다.

또 다른 구현예에서 상기 조건을 만족하는 펩타이드는 서열번호 15 내지 33, 또는 37 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 화학식 IV의 펩타이드에서 상기 X¹은 극성의 Q, N, S, T, P 또는 C 이고, 상기 X², X³및 X⁴는 각각 동일 또는 상이한 소수성의 L, V, I, 또는 A 이고, 상기 X⁵는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]에서, X⁸및 X⁹또는 상기 X¹⁰및 X¹¹중 하나 이상은 결여될 수 있으며, FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14), 또는 FR 이고, 상기 X¹²는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 m 및 n은 각각 1 또는 2이고, m 또는 n이 2인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산이다. 이 경우 상기 X²- X³- X⁴는 LVV, AAA, LVA, LVL, LLA, LLL, 또는 LLV 일 수 있다. 나아가 이 경우 상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]는 QLVVK (서열번호 1), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 일 수 있다. 일 구현예에서 상기 조건을 만족하는 펩타이드 서열은 서열번호 17, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 39, 40. 41, 42, 43, 44, 46. 47, 48, 50, 51, 52 또는 54의 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 양태에서 본원은 서열번호 15 내지 69 중 어느 하나로 표시되는 세포 펩타이드에 관한 것이다.

본원에 개시된 펩타이드는 본원에서 합성된 다양한 변이를 갖는 서열 및 실험결과를 근거로 하기 기술된 사항을 고려하여, 가능한 변이를 도입하여 생성된 서열로 그 효과 또한 본원 실시예에 기재된 것과 같이 본원에서 개시된 것으로부터 예측가능하며, 따라서 본원의 범위에 포함되는 것이다.

하지만 본원에 따른 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물(biologically equivalents)을 포함하는 것이다. 생물학적 균등물이란, 본원에 개시된 아미노산 서열에 추가적인 변형을 가하였으나, 본원에 따른 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것이다.

이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 이러한 것을 고려하면, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

일 구현예에서는 본원에 따른 폴리펩타이드에 보존적 아미노산 치환이 일어난 것을 포함한다. 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이란 특정 폴리펩타이드가 갖는 활성을 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환을 의미하는 것으로 예를 들면 1개 이상의 아미노산 잔기에서 보존적 치환이 일어난다.

보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 Blosum (BLOcks SUbstitution Matrix) 기반한 표 1에 기재된 바와 같으며, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds); 및 Henikoff, S.; Henikoff, J.G. (1992). "Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks". PNAS 89 (22): 10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915; WO2009012175 A1 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.

[표 1]

따라서 본원은 서열번호 1 내지 79로 표시되는 서열 및 상기 서열에 보존적 치환이 일어난 것을 포함하는 것이다.

또한 아미노산 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydrophobic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

상기와 같은 소수성 인덱스는 특히 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산간의 치환이 유리하다.

또한 유사한 친수성 수치(hydrophilicity value)를 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다.

예를 들면 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

또한 본원에 따른 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 예를 들면 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있다.

따라서, 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24:307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

일 구현예에서, 상술한 본원에 따른 펩타이드는 N- 또는 C-말단, 특히 C-말단이 화학 비반응성기 예를 들면 NH2 등과 같은 기로 치환되어 안정성을 높일 수 있다.

또한 본원에 따른 펩타이드는 다양한 화합물로 변형될 수 있으며, 예를 들면 엡실론 아미노기에 다양한 성능의 기능성 물질 등을 결합시키는 방식으로 개질될 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다. 폴리펩타이드는 특정 아미노산은 하나 이상의코돈에 의해 코딩되는 것을 고려하면, 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 존재할 수 있으며, 또는 코돈 적정화된 서열을 포함하는 것이다. 나아가 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포에서 클로닝된 유전자의 발현을 가능하게 하는 것으로, 이러한 벡터로의 클로닝 방법, 및 상기 벡터를 원핵 또는 진핵세포에 전달하는 방법은 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며, 당업자라면 적절한 것을 사용할 수 있을 것이다.

또 다른 측면에서 본원은 상술한 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 피더세포의 사용이 필요없이 세포의 배양이 가능한 피더프리 세포 배양용 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 펩타이드 또는 조성물이 적용될 수 있는 배양을 위해 피더세포를 필요로 하는 세포라면 특별히 제한되지 않으며, 식물, 곤충 및 동물 세포에 적용될 수 있으며, 예를 들면 동물세포, 특히 마우스 또는 사람 유래 세포에 적용될 수 있다.

본원에서 피더세포 또는 피더세포층이란 지지 세포라고도 하며, 단독으로는 생존 또는 배양할 수 없는 세포를 배양할 때, 미리 또는 함께 배양하여 배지에 부족한 영양분이나 증식 인자의 보급 등의 역할을 담당하는 세포를 의미한다. 일반적인 피더 세포는 마우스 유래의 MEF (Mouse Embryonic Fibroblast, MEF) 세포나, STO 세포 등의 간질계(stromal line) 세포 등이 사용된다.

일 구현예에서는 줄기세포의 배양에 사용된다.

본원에서 사용된 용어, 줄기세포는 개체를 구성하는 세포 또는 조직의 근간이 되는 세포로서, 반복분열하여 자가 재생산(self-renewal)하여 증식 (proliferation) 할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 일컫으며, 다능성 또는 다분화능 (pluripotent) 줄기세포, 중복성 또는 중복분화능 (multipotent) 줄기세포, 및 전구세포를 포함한다. 줄기세포는 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견되며, 배아 줄기세포 및 성체 줄기세포를 포함한다.

다분화능 세포의 예로는 ES (Embryonic Stem cells) 세포, GS (Germline Stem cells) 세포, 및 iPS (Induced Pluripotent Stem cells, 유도만능줄기세포) 세포를 포함한다.

중복분화능 줄기세포는 주로 성체 줄기세포로 MSC (mesenchymal stem cells), 조혈모세포, 및 신경줄기세포를 포함한다.

전구세포는 부분적으로 분화되어 한 종류의 세포로 분화할 수 있는 일분화능 (unipotent)인 전구세포의 예로는 피부, 진피, 내피, 표피, 근육, 심근, 신경, 골, 연골, 뇌, 상피, 심장, 신장, 췌장, 비장, 구강, 각막 또는 모발 유래의 세포를 포함한다.

일구현예에서 본원은 다능성(Pluripotent stem cell) 줄기세포의 배양에 사용을 포함한다. 다능성 줄기세포는 수정란에서 분화한 낭배(Blastocyst) 유래의, 외배엽엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화할 수 있는 inner cell mass, 또는 primordial cell 유래의 줄기세포를 포함한다. 또는 초기 배아에서 분리한 배아줄기세포(ES, embryonic stem cell), 태아기의 원시생식세포 (primordial germ cell)에서 분리한 배아 생식세포 (EG, Embryonic Germ cell), 배아줄기세포 (ES, embryonic stem cell)또는 성체줄기세포에서 생성된 유도만능줄기세포 (iPSC, Induced Pluripotent Stem cell)을 포함한다.

배아줄기세포 (ES, embryonic stem cell)는 착상 전, 상실기 (morula) 또는 낭배기(blastocyst) 단계의 배아 또는 임신 8-12주 사이에 유산된 태아에서 수득한 다능성 세포로 본원에서 배아줄기세포는 원시생식세포도 포함하는 것이며, 인간, 유인원을 포함하는 영장류 유래, 또는 포유류 유래의 세포를 포함하는 것이다.

다른 구현예에서 본원은 다능성 줄기세포로부터 분화된 중복성 줄기세포 (Multipotent stem cell)인 내피(endothelial) 줄기세포, 조혈줄기세포, 중간엽줄기세포 및 신경줄기세포를 포함하는 성체줄기세포의 배양에 사용을 포함한다. 이들 세포로부부터 혈구, 골세포, 신경세포 등이 만들어진다.

또 다른 구현예에서 본원은 인간 유래 세포의 예로는 ES 세포 iPS 세포, MSC, 연골세포, 골모세포, 골전구세포, 중간엽세포, 근아세포, 심근세포, 신경세포, 간세포, 배아세포,섬 유세포, 각막상피세포, 각막내피세포, 혈관내피세포, 및 조혈모세포의 배양에의 사용을 포함한다. 또한 치료의 목적을 위해 배양되는 경우, 세포는 동종 또는 이종, 또는 자가 또는 타가 유래일 수 있다.

본원에 따른 펩타이드를 포함하는 배양액 또는 세포배양 조성물은 피더세포를 사용하지 않고 세포, 특히 줄기세포의 배양을 가능하게 한다. 아울러 배아 줄기세포와 같은 다분화능 줄기세포는 미분화상태에서 장기간 증식이 가능하며, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 유래의 장기로 분화될 수 있는 분화능을 유지하여야 한다(Thomson JA, Science 282:1145-1147,1998).

본원에 따른 펩타이드를 포함하는 배양액 또는 세포배양 조성물은 상기와 같은 피더세포가 없어도 줄기세포의 모든 특징을 유지하면서 증식을 가능하게 한다.

본원에 따른 펩타이드는 줄기세포의 통상적인 배양 방법에 그대로 사용할 수 있다. 즉, 적절한 수의 목적하는 줄기세포를 통상적으로 이용가능한 액체 배지 또는 세포 배양액에 현탁하고, 여기에 본원에 따른 펩타이드를 첨가하면 된다. 그 후의 액체 배지의 교환 및 계대 배양도, 종래 방법과 동일하게 실시할 수 있으며, 이 과정에서 본원에 따른 펩타이드를 추가하거나 추가하지 않을 수 있다.

또한 본원에 따른 펩타이드는 배양 용기의 고상 표면에 고정 또는 코팅하여,사용될 수 있다. 배양 용기로는 플레이트나 플라스크 등의 종래부터 세포 배양에 이용되고 있는 임의의 것을 사용할 수 있다. 배양 용기는 멸균가능하며, 유리 등의 무기 재료, 또는 폴리스티렌이나 폴리프로필렌 등의 유기 재료의 것이 사용될 수 있다.

본원에 따른 펩타이드를 배양 용기의 고상 표면에 고정 또는 코팅하는 방법으로, 흡착 등의 물리적 방법이나 공유결합 등의 화학적 방법을 적용할 수 있으며 예를 들면 조작이 간편한 흡착에 의한 방법이 바람직하다.

다른 측면에서 본원은 또한 줄기세포의 배양 방법에 관한 것으로, 세포의 배양에 본원에 따른 펩타이드 (또는 줄기세포의 접착성 분자라고도 함)를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본원에 따른 방법이 적용될 수 있는 줄기세포를 포함하는 세포는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법의 일 실시예에 있어서, 본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 배양 조성물은 배양 용기의 고상 표면에 고정 또는 코팅되어 사용될 수 있다. 본 방법에 사용될 수 있는 배양용기는 줄기세포를 배양할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만 기존에 세포 배양용으로 사용되는 것이 바람직하다. 세포 배양용기는, 예컨대, 배양 접시, 플레이트, 플라스크, 챔버 슬라이드, 튜브, 롤러보틀, 스피너플라스크, 홀로파이버, 마이크로캐리어, 비즈 등을 들 수 있다. 이들 배양용기는 유리 등의 무기 재료 또는 폴리스티렌 등의 유기 재료 등으로 제조된 것일 수 있다. 배양 용기는 단백질 또는 펩타이드 등에 대한 흡착성이 높은 폴리스티렌 등의 재료, 또는 흡착성을 높이는 처리, 예를 들면 친수성 처리나 소수성 처리 등을 처리한 것이 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법의 다른 실시예에 있어서, 줄기세포의 접착성 분자를 배양용기의 고상 표면에 고정 또는 코팅하는 방법으로, 흡착 등의 물리학적 방법 또는 공유결합 등의 화학적 방법을 적용할 수 있지만, 조작이 용이한 흡착에 의한 방법이 바람직하다. 일 구현예에서 본원에 따른 펩타이드는 플레이트 등의 배양용기 표면에 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 용액을 접촉시키고, 일정시간 후에 용매를 제거함으로써, 흡착시킬 수 있다.

본원에 따른 방법의 또 다른 실시예에 있어서, 본원에 따른 펩타이드는 통상적인 세포 배양 배지에 첨가하여 사용될 수 있다. 예를 들면 적절한 수의 줄기세포를 통상적으로 이용가능한 액체 배지 또는 세포 배양액에 현탁하고, 여기에 적절한 양의 본원에 따른 펩타이드를 첨가하면 되거나, 또는 본원에 따른 펩타이드는 세포를 현탁하기 전에 액체 배지에 먼저 첨가될 수 있다. 그 후의 액체 배지의 교환 및 계대 배양도, 종래 방법과 동일하게 실시할 수 있으며, 이 과정에서 본원에 따른 펩타이드를 더 추가하거나 추가하지 않을 수 있다.

본원에 따른 방법에서 다능성 줄기세포의 배양은 본원에 따른 펩타이드를 사용하며, 피더세포를 사용하지 않는 것을 제외하고는 통상의 배양 방법이나 배양 조건을 그대로 사용할 수 있다. 줄기세포의 통상의 배양 방법이나 배양 조건은 다음 문헌을 참고할 수 있다: Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman et al. ed, Academic Press, 2010); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900-918, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual 4th ed (Behringer et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Turksen ed, Humana Press, 2002); Matsui et al., Cell 70: 841, 1992; 미국 특허 제5,843,780호; Thomson et al., Science 282: 1145-1147, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; 미국 특허 제6,090,622호; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000).

예를 들면 줄기세포를 배양하기 위한 액체 배지는 줄기세포를 이차배양하는 종래의 방법에 적용가능한 것이면, 모두 사용가능하다. 예로는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium), GMEM(Glasgow Minimum Essential Medium), RPMI1640 배지 등가 있으며, 통상적으로 약 2 mM의 글루타민 및/또는 약 100 μM의 2-메르캅토에탄올을 첨가하여 사용한다. 또한, ES 세포배양용 배지로서 시판되고 있는 Knockout DMEM(Invitrogen)이나, ES cell-qualified DMEM(Cell & Molecular Technologies), TX-WES(Thromb-X) 등도 이용할 수 있다. 이들 배지에 FBS를 약 5 내지 25% 첨가하는 것이 바람직하지만, 무혈청 배양하는 것도 가능하며, 예를 들면, 15 내지 20%의 KnockOut Serum Replacement(Invitrogen)을 대신 사용할 수 있다.

또한 필요한 경우 다능성 줄기세포를 배양하기 위한 액체 배지에는 다능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지시키는 작용을 가진 인자를 첨가할 수도 있다. 예를 들면 마우스 ES/EG 세포의 경우, LIF가 사용될 수 있다(Rathjen et al., Genes Dev. 4: 2308, 1990). 또한 Wnt계 분자(Doble and Woodgett, J. Cell Sci 116: 1175, 2003) 를 포함하는 GSK-3 저해제를 배양액에 첨가함으로써 마우스 및 인간 ES 세포의 미분화성을 효율적으로 유지시킬 수 있다(Sato et al., Nature Med. 10: 55, 2004).

본원에 따른 펩타이드를 사용하여 배양된 줄기세포는 미분화상태로 유지되며, 분화능을 유지하며, 세포의 생존성이 높아지고, 사멸 세포수가 감소하여, 세포의 현저한 증가나 증식이 확인된다.

상술한 바와 같이, 다능성 줄기세포는 미분화 상태로 장기간의 세포 증식이 가능하며, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내고, 적합한 조건 하에서 3배엽의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 지닌 상태를 의미한다. 이에 추가하여 다능성 줄기세포의 그 밖의 특성, 예컨대, 텔로머라제 활성 유지, 테라토마 형성 능력, 또는 키메라 형성 능력 등의 특징을 가질 수 있다. 이러한 특징을 분석하는 방법은 당업계에 알려진 것으로, 예를 들면, Guide to Techniques in Mouse Developme nt(Wasserman et al, eds, Academic Press, 2010); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900-918, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual 4th ed (Behringer et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Turksen ed, Humana Press, 2002) 등을 참조하여 용이하게 실시할 수 있지만, 특히 이들 기재의 방법으로만 한정되지 않는다.

미분화 상태의 다능성 줄기세포는 다음에 기술하는 적어도 하나의 마커 분자의 존재를 통해 확인 할 수 있다. 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 특이적인 여러가지 마커의 발현은, 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법에 의해 검출한다. 상기 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 면역조직화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 사용한다. 이들 방법에서는 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 결합하는 마커에 특이적 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있으며, 이는 시중에서 구입할 수 있다. 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 특이적인 마커로는, 예를 들면 ALP 활성이나, 0ct-3/4 또는 Rex-1/Zfp42 등의 유전자 산물의 발현을 이용할 수 있다. 또한, 각종 항원 분자도 이용할 수 있으며, 마우스 ES 세포에서는 SSEA-1, 인간 ES 세포에서는 SSEA-3이나 SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM-2 등을 미분화 마커로 들 수 있다. 이들 미분화 마커의 발현은 ES 세포가 분화됨에 따라 감소 및 소실된다.

또한, 미분화 상태의 다능성 줄기세포 마커의 발현은 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 혼성화 분석, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출 및 분석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 특이적인 마커 단백질(예, 0ct-3/4, Rex-1/Zfp42, Nanog 등)을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 이미 공지되어 있으며, 공지의 서열에서 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위해 필요한 마커 특이적 서열을 디자인하여 사용할 수 있다. .

본 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 본원에 따른 펩타이드는 세포의 표면의 ECM에 다량 존재하는 프로테오글리칸을 구성하는 성분에 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate) 등의 GAG(glycoaminoglycan)대한 친화력을 나타낸다. 또한 본원에 따른 펩타이드는 세포막 단백질과의 상호작용을 통해 접착능을 증가시키는 것은 아니며, RGD 펩타이드가 작용하는 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가진다. RGD와 비교하여 처리 농도면에서도 최대 100배 적게, 월등하게 적은 양의 사용이 가능한 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 접착성 펩타이드의 제조

실험에 사용된 모든 펩타이드는 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) (Fmoc) 방법을 통하여 합성된 것으로 주문제작 하였다 (루젠 Sci, 대한민국; 펩트론, 대한민국). 펩타이드 효과의 재연성 검증을 위하여 두 개의 회사를 통해 각 각 3회(루젠) 그리고 2회(펩트론)의 펩타이드 합성을 수행하였으며, 각 각의 합성물에 대해 독립된 실험을 통해 분석을 하였으며, 합성회차별로 동일한 결과를 수득하였다.

실시예 2. 접착성 펩타이드의 접착 기전 규명

본 실시예에서는 본원에 따른 펩타이드에 의한 세포의 접착능 기전을 규명하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

세포는 엥커리지 의존적 세포 (MC3T3-E1)를 사용하였으며, 여기에 본원에 따른 펩타이드 (서열번호 17) A 펩타이드 (10μM)를 처리하였다. 본원에 따른 펩타이드에 의한 접착능은 접착되지않은 세포는 PBS로 제거하고, 접착된 세포를 대상으로 피코그린 정량 키트(picogreen assay kit (Life Technologies))를 이용한 DNA 정량또는 CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo)을 이용한 세포 계수을 제조자의 방법대로 사용하여 측정하였다.

(1) 단백질 관여 여부 분석

상술한 바와 같이 세포에 본원에 따른 펩타이드를 처리한 후에 단백질 합성을 저해하는 것으로 알려진 EDTA, 사이클로헥사미드 (CHX) (10 μM, 37℃ 1시간) 또는 혈청 처리 후 상술한 바와 같이 접착능을 분석하였다.

결과는 도 1a에 있으며, 이에 나타난 바와 같이 EDTA 또는 CHX를 처리한 경우에도 접착능에 차이가 없는 것으로 나타났다. 즉, 본원에 따른 펩타이드에 의한 세포접착이 세포 표면의 전해질 (EDTA 처리 결과)이나 새로운 단백질 합성 (CHX 처리 결과)을 필요로 하지 않는 반면, 혈청에 의해서는 초기에 저해가 일어나는 것을 나타내는 결과이다.

이는 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만 혈청내 존재하는 많은 종류의 프로테오글리칸의 주성분인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate) 등의 GAG(glycoaminoglycan)가 펩타이드에 일차적으로 결합한 것이 원인으로 판단된다. 또한 본원에 따른 펩타이드는 세포막 단백질과의 상호작용을 통해 접착능을 증가시키는 것이 아님을 나타내는 것이다.

(2) 비단백질성 물질 관여 여부

다음으로는 비단백질 물질의 관여여부를 조사하였으며, 그 대상으로 세포 표면의 세포외메트릭스 (Extracellualr matrix, ECM)에 다량 함유되어 있는 탄수화물 지질인 프로테오글리칸과의 관련성을 분석하였다.

- 프로테오글리칸에 대한 펩타이드의 분자 친화력

프로테오글리칸을 구성하는 주요 성분들인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate), 데르마탄 황산(dermatan sulfate), 케라탄 황산(keratan sulafate) 등의 GAG(glycoaminoglycan)는 ECM을 구성하는 주요성분들이기도 하지만, ECM 구조의 보존성 (structural integrity of ECM)을 유지하여 세포의 형태를 유지할 뿐만 아니라, 세포의 접착, 세포의 극성 (cell polarity)을 조절한다. ECM이 갖는 이러한 기능은 환경에 대한 세포의 적응을 유도할 뿐만 아니라 복잡한 일련의 대사과정과 직접적으로 연관되어 있어서 다양한 생리학적 역할을 조절하는 복합적 기능을 가진다.

프로테오글리칸에 대한 본원 펩타이드의 분자 친화력은 (i) 친화크로마토그래피, (ii) 정제된 GAG 성분을 이용한 경쟁적 결합을 통한 세포접착, (iii) GAG성분을 포함하는 ECM을 특이적으로 분해하는 효소를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진의 억제, 이상의 세 가지 방법을 통하여 검증하였다. 효소처리의 경우 히알루로니다아제(hyaluronidase(Sigma)), 콜라게나아제(collagenase (Sigma))를 처리하였다. 정제된 GAG는 hyaluronan (Sigma), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate (Sigma)), 헤파린(heparin (Sigma)), 헤파란 황산(heparan sulfate (Sigma))를 각 각 사용하였다.

(i) 친화크로마토그래피를 이용한 펩타이드-헤파린 또는 펩타이드-N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)과의 상호작용 측정

크로마토그래피를 위해 헤파린-아가로스 비드(heparin-agarose bead (Biovision)) 그리고 GlcNAc-아가로스 비드 (Sigma)를 각 각 사용하였다. PBS-T용액에 10 ng의 FITC로 표지된 펩타이드 (F-펩타이드)를 BSA로 미리 코팅된 헤파린-아가로스 비드 그리고 GlcNAc-아가로스 비드와 상온에서 10분간 반응 시킨후 PBS-T용액에서 3회 세척후 다시 PBS용액에 현탁한 후 형광을 측정하였다. 경쟁적 결합을 유도하기 위하여 FITC가 표지되지 않은 펩타이드 (Cold)를 각 각 1:1, 1:10(10배) 그리고 1:100(100배)만큼 첨가한 후 비드와 반응시킨 후 형광을 측정하였다. 음성대조군으로써 FITC 염료만을 각 비드에 반응시켜 측정하였으며, 단지 비드를 PBS에 현탁한 다음 마이크로 플레이트로 옮겨 측정되는 형광값을 블랭크로 사용하였다. 도 1b에 나타난 결과는 헤파린 또는 GAG의 구성 성분인 GlcNAc에 펩타이드가 높은 친화력을 가지고 있음을 나타낸다.

(ii) 정제된 GAG 성분을 이용한 경쟁적 결합을 통한 세포접착능 조사

다음은 GAG처리에 의한 경쟁적 억제 방식에 의한 접착성 펩타이드에 의한 세포접착 저해를 나타내는 결과로써 펩타이드에 의한 세포의 접착 촉진은 헤파린, 헤파란 황산, 그리고 콘드로이틴 황산을 첨가할 경우 세포접착이 크게 저해 되었다.

(iii) GAG성분을 포함하는 ECM을 특이적으로 분해하는 효소를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진의 억제: ECM을 구성하는 프로테오글리칸(proteoglycan) 뿐만 아니라 콜라겐 등의 피브릴 단백질들은 GAG를 포함한다. GAG를 포함하는 콜라겐을 가수분해 하거나 GAG의 하나인 히알루로난을 가수분해하는 히알루로니다아제를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진능을 조사한 결과 모두 세포접착능력이 저해디는 것으로 나타났다. 이 역시 펩타이드에 의한 세포접착 촉진이 GAG와의 상호관련이 있음을 나타내는 증거이다.

실험방법은 다음과 같다: (i) 정제된 GAG 성분 처리에 의한 경쟁적 억제는 트립신으로 처리된 세포현탁액에 각 각의 GAG를 5mg/ml 되도록 첨가하고 37℃에서 10분간 반응 후 펩타이드가 코팅된 배양접시에 옮긴 후 30분 후 접착된 세포에 대한 DNA를 정량화하여 접착정도를 측정하였다. DNA정량은 피코그린 정량 키트(picogreen assay kit (Life Technologies))를 이용하여 수행하였다; (ii) 콜라게나아제, 히알루로니다아제 처리에 의한 세포접착 조사는 트립신으로 처리된 세포를 우태혈청을 포함하지 않는 배지에 현탁시킨 후 각 효소를 첨가 후 37도에서 30분간 반응하였다. 효소는 10,000 unit/ 10³ cell 수준에서 처리하였으며 효소반응 후 EDTA 및 우태혈청을 첨가하여 효소의 활성을 불활성화시킨 후 원심분리 후 새로운 배지에 현탁한 후 펩타이드가 코팅된 배양접시에서 2시간 배양하였다. 접착된 세포의 측정은 피코그린 정량(picogreen assay)을 수행하기 전 PBS로 2회 세척 후, 접착된 세포만 회수하여 DNA를 정량화하였다.

결과는 도 1b에 기재되어 있다. 결과는 본원의 펩타이드가 세포에 포함된 프로테오글리칸에 대해 높은 친화력이 있음을 보여주는 결과이다.

(3) RGDS와 비교

엥커리지 의존적 세포 (MC3T3-E1)에 본원에 따른 펩타이드 펩타이드 (10μM) 또는 이와 함께 용해성 RGDS 펩타이드 (0, 10, 100 및 1000μM) 를 시험튜브에서 세포와 함께 10분간 반응하여 경쟁적으로 처리한 후, 배양접시에 옮긴 후 다시 10분간 항온기에서 접착을 유도하였다. 10분 후 다시 배양액을 제거하고 PBS 용액으로 2회 세척하여 남아있는 미접착 상태의 세포를 제거하였으며, 펩타이드를 포함하지 않는 새로운 배지와 CCK-8 (Dojindo)를 혼합하여 항온기에서 1시간 반응 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. CCK-8과 혼합된 배지를 블랭크로 하여 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 1c에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, RGDS 펩타이드를 단독으로 처리한 경우, 농도의존적으로 접착이 감소되는 것으로 나타났다. 반면 본원에 따른 펩타이드과 RGD 펩타이드를 경쟁적으로 처리한 경우, 본원에 따른 펩타이드 비처리군에서는 수용성 RGD를 처리할 경우 인테그린에 결합하여 바닥(기질에) 대한 접착능을 유의미하게 감소시키지만, 본원에 따른 펩타이드 처리군에서는 RGD를 처리함에도 세포의 접착에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 본원에 따른 펩타이드는 RGD가 작용하는 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가짐을 나타내는 것이다. RGD와 비교하여 처리 농도면에서도 월등하게 적은 양의 사용이 가능한 것으로 나타났다. 즉 도 1c의 결과로부터 본원에 따른 펩타이드의 사용농도는 10μM (1.6μg/ml)로 RGD는 10배 또는 100배로 사용하였다.

이러한 결과는 RGDS 펩타이드를 이용한 세포접착 또는 조직 재생기술이 이미 잘 확립되었고 있는데, 이와는 다른 기전으로, 기술적 차별성이 있음을 나타내며, 또한 RGDS를 이용한 상용화 기술들은, 효율성이 좋지 않다고 알려져 있으며, 이를 대체할 수 있는 우수한 기술임을 나타낸다.

실시예 3. 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 줄기세포를 포함한 세포 표면의 ECM (Extra cellular matrix)에 포함된 성분에 대한 접착능 실험 I

하기 표 2과 같은 서열 및 명칭을 갖는 펩타이드를 실시예 1에서 같이 합성한 후에 헤파린 또는 N-아세틸글루코사민 (GAG)에 대한 접착능을 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법을 이용하여 측정하였다.

[표 2]

결과는 도 5a에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 본원의 펩타이드는 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역이 다양한 조합으로 배열되거나 또는 각 영역의 서열이 본원에 정의된 바와 같은 아미노산으로 치환된 경우에도 세포에 포함된 성분에 대한 접착능을 나타내며, 이는 본원에 따른 펩타이드가 줄기세포를 포함한 세포의 접착 또는 부착에 효과적으로 사용할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 4. 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 줄기세포를 포함한 세포 표면의 ECM (Extra cellular matrix)에 포함된 성분에 대한 접착능 실험 II

표 1에 A 서열로 명명된 RQLVVKFRALPC (서열번호 17) 서열을 기준으로 치환기의 화학적 성질, 크기, 전하적 특성 및 실시예 3의 실험결과 등을 고려하여 다음의 표 3과 같은 서열의 펩타이드를 합성하여, 실시예 2에서와 같이 접착능을 분석하였다.

[표 3]

상기 표 3의 서열컬럼에서 굵게 표시된 부분이 A 서열과 비교하여 치환된 부분이고, 결과는 도 5b에 기재되어 있으며, 이는 본원에 따른 펩타이드가 줄기세포를 포함한 세포의 접착 또는 부착에 효과적으로 사용할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 5. 본원에 따른 펩타이드를 이용한 줄기세포의 피더프리 배양

본원에 따른 펩타이드를 코팅하거나 또는 배양 배지에 첨가함으로써 배아 줄기세포 및 유도만능 줄기세포의 부착능, 증식 및 다능성 유지여부를 조사하였다. 본 실시예에서는 인간 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포에 Oct4-GFP vector가 안정적으로 형질전환된 세포를 사용하였는데 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포 등에서 다능성 표지자인 Oct4 전사인자의 활성을 간접적으로 검출하기 위하여 제작되었다. 즉 도 2a 도식적으로 기재된 바와 같이 Oct4 전사인자가 조절하는 프로모터(Promoter)가 활성화되면 형광단백질인 GFP유전자 발현이 촉진되는데 세포의 형광을 검출함으로써 다능성을 가진 미분화세포를 평가할 수 있다.

펩타이드를 100 μM 수준에서 배양재질에 코팅하거나 또는 배지에 첨가하여, 마우스 유도만능 줄기세포와 인간 배아줄기세포 접착 및 다능성을 다음과 같이 조사하였다.

인간 배아 줄기세포의 경우 hESC-media (일반적인 배양액 조성, Gibco BRL사로부터 구입), mTeSR (hES전용배지, Stem cell technology사로부터 구입), Essential 8 (hES 전용배지, Gibco BRL사로부터 구입), 그리고 각 각에 대해 10 ng/ml bFGF만을 첨가한 혈청 배제 배양액 (혈청에 의해 세포의 접착능력이 억제되는 현상을 방지하기 위한 배양액 조건) 조건으로 배양한 결과 배지종류에 따른 특이한 차이점이 관찰되지 않아 이 후 Essential 8배지를 사용하였다. 또한 세포의 경우 콜로니 상태의 배양기법과 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 단일세포를 이용한 배양기법을 분석하였다. 피더-프리(feeder-free)에 대한 ESC 또는 iPSC 배양효과를 검증하기 위하여 양성대조군으로 매트리겔(Matrigel (hESC)) 그리고 젤라틴(gelatin (miPSC))을 각 각 비교하였으며, 뿐만 아니라 모든 배아줄기세포 배양의 양성대조군으로 사용되는 지지세포(Feeder cell)에서의 배양도 함께 수행하였다.

해당 세포를 도 2a에 기재된 배아줄기세포의 다능성 (Stemness)의 지표로 Oct4 유전자의 활성을 측정할 수 있는 구조를 갖는 플라스미드(Szabo et al., 2002, Mechanisms of Development Vol. 115: 157-160)를 이용하여 형광현미경으로 분석하였다 (도 2a). 또한 다능성을 나타내는 다른 마커인 Alp 및 Nanog 유전자에 대한 발현을 이에 특이적인 항체를 사용하여 염색하여 형광 현미경으로 관찰하고, hES 세포 배양에서 세포의 접착성 향상 여부도 조사하였다 (도 3).

결과는 도 2 및 도 3에 기재되어 있다. 도 2에 기재된 바와 같이, 본원의 펩타이드는 미리 코팅 (precoated)되거나 또는 배양액에 혼합 (Mixed)되는 방식으로 추가된, 두 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 2b). 아울러, 세포배양 4일째의 경우도 본원에 따른 펩타이드는 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 2c). 또한 도 3a 및 도 3b에 기재된 바와 같이, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났으며, hESC를 이용한 실험에서도 피더세포 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외부환경적 변화 없이도 세포의 접착을 매개하며 다능성 또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 3c).

구체적으로 도 2 및 도 3은 트립신으로 처리된 배아줄기세포를 피더세포 위, 젤라틴 코팅 위, 본원의 펩타이드 코팅, 그리고 본원의 펩타이드를 배지에 첨가한 각각의 조건에서 2일에서 배아줄기세포의 특징인 콜로니성장이 뚜렷한 4일까지 변화를 형광현미경에서 관찰한 결과이다. MEF(mouse embryonic fibroblast)를 피더세포로 하는 전형적인 배양방법과 비교하여 펩타이드 처리조건에서 배아줄기세포의 돔형 콜로니 형성과 다능성 표지자에 해당하는 GFP형광의 발현이 상이함을 보이지 않았다. 한편 젤라틴(gelatin)을 코팅한 조건에서는 세포의 콜로니 모양이 상이할 뿐만 아니라 형광의 강도 역시 감소되는 경향을 보이고 있다. 도 3c에 나타난 바와 같이 인간 배아 줄기세포의 피더프리 배양을 시도한 결과에서도 뚜렷한 콜로니 형성과 세포의 부착이 가능함을 확인 할 수 있었다. 이 결과들은 배아 줄기세포의 배양의 가장 일차적인 문제인 부착과 줄기세포의 특성유지에 본원에 따른 펩타이드는 간단하며 효과적인 새로운 방법으로 사용할 수 있음을 입증한다. 또한 코팅의 방법 뿐만 아니라 배지에 단순 혼합만으로도 사용될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 6. 접착성 펩타이드에 의한 인간 중간엽 줄기세포인 MSC (Mesenchymal Stem Cell)의 피더프리 배양

본원에 따른 펩타이드를 100μM 수준에서 유리재질의 멸균된 커버슬립에 코팅한 후 MSC 세포 (Mesenchymal Stem Cell)를 6시간 배양한 후, 세포의 접착진행과정 (adhesion progression)을 액틴 섬유에 대한 형광 염색시약인 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin) 염색약 (Life Technology Cat.# R415) 과 세포의 핵 (DNA)를 염색하는 DAPI (Sigma D9542) 염색약을 각 각 사용하여 세포를 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 이 때 음성 대조군으로 본원에 따른 펩타이드를 코팅하지 않은 커버슬립에 세포를 접착하여 비교하였다.

결과는 도 4에 기재되어 있다. 도 4a에서 음성대조군은 여전히 접착초기단계인 액틴-링(actin-ring) 형성이 다수를 이루고 있지만, 본원에 따른 펩타이드 처리군의 경우 이미 그 단계를 지나 스트레스 파이버 형성이 다수의 세포에서 관찰되었으며, 도 4b는 이러한 관찰결과를 정량한 그래프이며, 도 4c는 세포 접착에 따른 기하학적 양태 (geometric shape) (cell aspect ratio: 세포의 가로/세로의 비율, 1일 경우 완전한 원형이며 접착과정의 가장 초기 상태로 나타냄. Prager-Khoutorsky et al., 2011. Nature Cell Biology 13, 1457-1465 참고) 을 측정하여 나타낸 결과로써 본원에 따른 펩타이드의 처리군에서 월등히 성숙된 접착능을 보여 준다.

실시예 7. 본원에 따른 펩타이드를 이용한 피더프리 배양에서 배아 줄기세포의 분화능 유지 분석

배아줄기세포의 다능성을 결정하는 표적 유전자들의 산물을 검출함으로써 다능성 슈준을 조사하였다. 도 3a는 알칼리인산효소 (alkaline phosphotase, ALP) 염색을 통한 방법이다. 펩타이드를 코팅하거나 배치에 첨가한 두 가지 조건 모두에서 뚜렷한 ALP 염색에 의한 뚜렷한 발색반응을 관찰 할 수 있었다. 또한 젤라틴과 비교하여 펩타이드 처리조건에서 더욱 뚜렷하고 강한 염색이 관찰되었다. ALP d염색 뿐만 아니라 endogenous Nanog을 면역형광염색법으로 검출한 결과 펩타이드 처리군에서 여전히 발현되고 있음을 관찰할 수 있었다. 이는 도 3b에 나타내었다.

실시예 8. 본원에 따른 펩타이드를 이용한 피더프리 배양에서 줄기세포의 다 능성 유지 분석

젤라틴과 펩타이드 처리 조건에서 지속적인 배양과정을 통하여 20 passage (P.20)의 세포를 얻은 다음 다능성 유지를 조사하고 피더프리 배양가능성을 조사하였다. 도 6에서는 펩타이드 처리농도를 달리하여 ALP 염색을 통한 다능성 특성과 부착, 그리고 배아줄기세포의 콜로니 형태를 분석하였다. 젤라틴의 경우 P.20에서 상당한 수준의 배아줄기세포의 기본 특성이 상실되어 있음이 관찰 되었다. 즉 돔모양의 콜로니 형태는 많이 상실되었으며, Oct4에 의해 조절되는 다능성을 간접적으로 확인하는 GFP 형광과 ALP 염색 역시 현저히 감소하였다. 반면 펩타이드 처리조건에서는 여전히 콜로니 형태의 세포가 관찰 되고 있으며 GFP발현과 ALP 염색 모두관찰되었다.

다능성에 관한 정량적으로 분석을 시도하였는데 FACS 분석을 통하여 세포의 GFP형광이 발현되는 세포의 수를 측정하여 백분율로 나타내었다. 도 7은 이에 관한 결과이다. 결과를 보면 펩타이드 처리조건에서 가장 높은 형광발현이 확인되었다. 이와 함께 모든 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포에서 다능성을 결정하는 주요인자인 Oct4, Nanog, Sox2의 유전자 (mRNA) 발현을 quantitative realtime PCR 방법으로 측정하였고 그 결과 펩타이드 처리조건에서 뚜렷한 유전자 발현을 확인하였다. 또한 20uM의 펩타이드 처리군에서 좀 더 높은 수준의 Oct4, Nanog, 그리고 Sox2의 발현이 검출되었다. 면역형광검출을 통해서도 각 유전자의 발현이 뚜렷하게 나타나고 있음을 확인하였다. 이는 도 9에 나타내었다. 이상의 결과들은 펩타이드와 함께 배아줄기세포를 배양할 경우 높은 효율의 다능성이 유지되고 있음을 나타내는 결과이며 피더프리 배양을 위한 새로운 방법으로써 사용될 수 있음을 의미한다.

실시예 9. 본원에 따른 펩타이드로 피더프리 배양된 배아줄기세포의 분화능 확인

본원에 따른 펩타이드를 이용하여 P.20까지 배양한 배아줄기세포의 분화능을 조사한 결과 신경, 근육 등의 분화가 원활하게 유도됨을 관찰 하였다. 각 세포별 분화는 펩타이드 처리하에 얻은 P.20의 배아줄기세포를 배아체(Embryonic body)로 유도한 다음 이미 널리 알려진 분화배지 조성액에서 세포의 분화를 유도하였다. 도 10은 각 분화표지자를 항체를 이용한 면역형광법으로 검출한 결과이다.

펩타이드 처리로부터 얻은 세포를 마우스에 이식하여 테라토마 형성을 조사하였다. 그 결과 테라토마 조직이 잘 형성될 수 있음을 관찰하였다. 이 결과는 in vivo 분화능에도 문제가 없음을 나타내는 결과이다. 테라토마 형성은 도 11에 나타내었다.

실시예 10. 본원에 따른 펩타이드로 배양된 피더프리 배아 줄기세포로부터 생식선 전이 ( germline transmission).

본원에 따른 펩타이드를 이용한 피더프리로 배양된 세포가 생식선으로 전이가 되는지 확인하였다. 마우스 수정란을 배반포 (blastocyst) 단계까지 형성시켜 앞서 펩타이드로부터 배양된 Euploid 상태의 피더프리배양세포를 미세주입하였다. 이 후 다시 암컷 쥐에 착상시켜 키메라(chimera) 형성과 생식선에 존재하는 이식된 배아줄기세포를 검출하였다. 도 12은 이에 대한 결과이다. 착상된 수정란으로부터 키메라 형성의 확인은 마우스?l 자궁에서 성장하고 있는 배아 개체 형성을 통해 확인 할 수 있었다. 태반이 형성되어 있으며 정상적인 형태의 배아 발생이 관찰되었는데 이는 이식한 배아줄기세포의 형질이 혼합된 새로운 키메라(chimera) 개체에 해당한다. 따라서 키메라마우스의 제작 뿐만 아니라 유전자적중마우스 (hene knockout mouse) 제작에도 펩타이드를 이용한 피더프리방법이 유효함을 확인할 수 있었다. 생식소전이에 대한 좀 더 분명한 증거를 확보하기 위하여 적출된 배아의 생식소를 분리하여 생식소 내의 존재하는 배아줄기세포를 형광으로 관찰 하였으며 각 장기를 다시 적출하여 이식한 배아줄기세포만 지니는 GFP 유전자 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 생식소 내에 GFP 형광을 띄는 세포를 관찰 할 수 있었으며, 발달된 각 장기에서도 GFP의 발현이 검출되었다. 장이게서 검출된 GFP발현은 피더프리배양세포로부터 각 조직세포의 분화가 직접적으로 유도되었음을 확인하는 결과이다. 이상의 결과로부터 본원의 펩타이드를 이용한 피더프리 배양은 생식선 전이 (germline transmission)까지 가능함을 최종 확인할 수 있었다.

실시예 11. 본원에 따른 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 배아 줄기세포의 피더프리 배양

A 서열로 명명된 RQLVVKFRALPC (서열번호 17) 서열을 기준으로 치환기의 화학적 성질, 크기, 전하적 특성을 변화시킨 변형된 펩타이드에 대해서도 피더프리 세포배양에 대한 효능을 조사하였다. 이는 피더프리 (또는 제노프리) 배양의 가장 중요한 기능이 되는 다능성(pluripotency)에 미치는 영양을 실시예 5, 6 및 8 등에 기재된 바와 같이 분석하였다.

결과는 각각 도 13 및 도 14에 기재되어 있다. 상기 도면은 각 각 다능성에 대한 분석결과들로써 GFP 형광을 나타내는 세포의 수를 측적한 결과와 각 세포에서 발현되는 상대적 Oct4 유전자 발현을 측정한 결과이다.

GFP 형광을 측정한 결과 변형된 모든 펩타이드 서열로부터 양성대조군인 피더세포배양에서 검출되는 수준의 형광 값이 검출됨을 확인할 수 있었다. 또한 realtime PCR을 통한 Oct4 mRNA 발현을 조사한 결과에서도 양성대조군인 피더세포배양에서 검출되는 수준보다 좀 더 높은 발현이 측정되었다. 한편, 젤라틴의 경우 GFP형광 뿐만 아니라 Oct4 mRNA발현이 크게 못미치는 수준으로 확인되었다. 이 결과는 앞서 소개된 내용과 비슷한 맥락의 결과에 해당한다. 최종적으로 다양한 변형된 다양한 펩타이드 서열이 피더 프리배양에 사용될 수 있음을 확인 할 수 있었다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> YOON, WON JOON <120> Composition and Methtod for feeder free and xeno free culture of stem cells <130> DP201709005P <150> KR 2016-0117006 <151> 2016-09-12 <160> 79 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 1 Gln Leu Val Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 2 Gln Glu Glu Glu Lys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 3 Gln Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 4 Asn Leu Val Val Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 5 Ser Leu Val Val Lys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 6 Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 7 Phe Arg Glu Glu Pro Cys 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Leu Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 58 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ile Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 59 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Val Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 60 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Glu Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 61 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 62 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Ile Pro Cys 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 63 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Val Pro Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 64 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 65 Arg Gln Glu Glu Glu Glu Phe Glu Glu Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> any amino acids <400> 66 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Xaa Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 67 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 68 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Thr 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> any amino acids <400> 69 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Xaa 1 5 10 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 70 Gln Val Val Val Lys 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 71 Gln Ile Val Val Lys 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 72 Gln Ala Val Val Lys 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 73 Gln Leu Leu Val Lys 1 5 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 74 Gln Leu Ile Val Lys 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 75 Gln Leu Ala Val Lys 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 76 Gln Leu Val Leu Lys 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 77 Gln Leu Val Ile Lys 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 78 Gln Leu Val Ala Lys 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 79 Gln Leu Val Val Arg 1 5

Claims

하기 화학식의 펩타이드를 포함하는 피더프리 줄기세포 배양 조성물:
[X¹²]_1-15 -[X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]m- [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n_,
상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]m에서,
상기 X¹ 은 임의의 아미노산이고,
상기 X², X³ 및 X⁴ 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X², X³ 또는 X⁴ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 X⁵ 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며,
상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]n에서,
상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]은 결여될 수 있거나, 또는
상기 X⁶ 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X⁷ 는 K 또는 R의 아미노산이고,
상기 X⁸ 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X⁹ 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X¹⁰ 는 임의의 아미노산이고,
상기 X¹¹ 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X⁸ 및 X⁹ 또는 상기 X¹⁰ 및 X¹¹ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고,
상기 X¹²는 F, K 또는 R 이고,
상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체임.
제 1 항에 있어서,
상기 X¹의 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 X²- X³- X⁴ 는 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물:
QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).
제 1 항에 있어서,
상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물:
FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), FRPC (서열번호 14) 또는 FR인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 중 어느 하나의 서열로 표시되는 피더프리 줄기세포 배양 조성물:
RQLVVK (서열번호 15);
FRALPCRQLVVK (서열번호 16);
RQLVVKFRALPC (서열번호 17);
RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18);
RQLVVKFRALP(서열번호 19);
RQLVVKFRAL(서열번호 20);
KQLVVKFRALPC (서열번호 21);
RQKFRALPC (서열번호 22);
RQEEEKFRALPC (서열번호 23);
RQAAAKFRALPC (서열번호 24);
RQLVVKFRPC (서열번호 25);
RQLVVKFREEPC (서열번호 26);
RQLVVKFRVVPC (서열번호 27);
RQEEEKFREEPC (서열번호 28);
EQLVVEFEALPC (서열번호 29);
RQLVVKYRALPC (서열번호 30);
RQLVVKWRALPC (서열번호 31);
RNLVVKFRALPC (서열번호 32);
RSLVVKFRALPC (서열번호 33);
RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37);
(R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38);
(R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39);
(R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40) ;
(R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41).
RQVVVKFRALPC (서열번호 42);
RQIVVKFRALPC (서열번호 43);
RQAVVKFRALPC (서열번호 44);
RQEVVKFRALPC (서열번호 45);
RQLLVKFRALPC (서열번호 46);
RQLIVKFRALPC (서열번호 47);
RQLAVKFRALPC (서열번호 48);
RQLEVKFRALPC (서열번호 49);
RQLVLKFRALPC (서열번호 50);
RQLVIKFRALPC (서열번호 51);
RQLVAKFRALPC (서열번호 52);
RQLVEKFRALPC (서열번호 53);
RQLVVRFRALPC (서열번호 54);
RQLVVKFKALPC (서열번호 55);
RQLVVEFEALPC (서열번호 56);
RQLVVKFRLLPC (서열번호 57);
RQLVVKFRILPC (서열번호 58);
RQLVVKFRVLPC (서열번호 59);
RQLVVKFRELPC (서열번호 60);
RQLVVKFRAAPC (서열번호 61);
RQLVVKFRAIPC (서열번호 62);
RQLVVKFRAVPC (서열번호 63);
RQLVVKFRAEPC (서열번호 64);
RQEEEEFEEEPC (서열번호 65);
RQLVVKFRALXC (서열번호 66);
RQLVVKFRALPS (서열번호 67);
RQLVVKFRALPT (서열번호 68); 또는
RQLVVKFRALPX (서열번호 69).
제 1 항에 있어서,
상기 X¹ 은 극성의 Q, N, S, T, P 또는 C 이고,
상기 X², X³ 및 X⁴ 는 각각 동일 또는 상이한 소수성의 L, V, I, 또는 A 이고,
상기 X⁵ 는 양하전된 K 또는 R 이고,
상기 [X⁶- X⁷- X⁸- X⁹- X¹⁰- X¹¹]에서, X⁸ 및 X⁹ 또는 상기 X¹⁰ 및 X¹¹ 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14), 또는 FR 이고,
상기 X¹²는 양하전된 K 또는 R 이고,
상기 m 및 n은 각각 1 또는 2이고, m 또는 n 이 2인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 X²- X³- X⁴ 는 LVV, AAA, LVA, LVL, LLA, LLL, 또는 LLV 인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 [X¹- X²- X³- X⁴- X⁵] 의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물:
QLVVK (서열번호 1), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).
제 9 항에 있어서,
상기 펩타이드는 하기 서열로 표시되는 것인, 피더프리 줄기세포 배양 조성물:
RQLVVKFRALPC (서열번호 17);
RQLVVKFRALP(서열번호 19);
RQLVVKFRAL(서열번호 20);
KQLVVKFRALPC (서열번호 21);
RQAAAKFRALPC (서열번호 24);
RQLVVKFRPC (서열번호 25);
RQLVVKFREEPC (서열번호 26);
RQLVVKFRVVPC (서열번호 27);
RQLVVKYRALPC (서열번호 30);
RQLVVKWRALPC (서열번호 31);
RNLVVKFRALPC (서열번호 32);
RSLVVKFRALPC (서열번호 33);
RQLVVK-(FRALPC)₂ (서열번호 37);
(R)₂-QLVVKFRALPC (서열번호 38);
(R)₅-QLVVKFRALPC (서열번호 39);
(R)₁₀-QLVVKFRALPC (서열번호 40);
(R)₁₅-QLVVKFRALPC (서열번호 41);
RQVVVKFRALPC (서열번호 42);
RQIVVKFRALPC (서열번호 43);
RQAVVKFRALPC (서열번호 44);
RQLLVKFRALPC (서열번호 46);
RQLIVKFRALPC (서열번호 47);
RQLAVKFRALPC (서열번호 48);
RQLVLKFRALPC (서열번호 50);
RQLVIKFRALPC (서열번호 51);
RQLVAKFRALPC (서열번호 52); 또는
RQLVVRFRALPC (서열번호 54).
서열번호 15 내지 69중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하는 피더프리 줄기세포 배양 조성물.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 피더세포 없이 줄기세포를 배양하는 방법.