KR20180029711A - 혈관평활근세포 사멸, 증식과 이주의 동시 측정을 이용한 신약스크리닝 기법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동맥경화치료제를 개발하는 과정에서 혈관평활근세포의 이상적인 사멸, 증식과 이주에 동시에 기인하는 질환에 대한 신약후보물질의 효능을 평가하는 방법을 개발한 것으로, 보다 상세하게는 Live/Dead kit로 형광염색된 혈관평활근세포의 형태학적 변화를 형광현미경을 이용하여 이미지화함과 동시에 이미지 데이터의 정성적 및 정량적 변화를 측정하여 후보약물에 대한 유효성 여부를 신속하게 판단할 수 있는 세포기반 scratch wound-healing과 바이오이미징 분석기법의 병용한 신약스크리닝 기법에 관한 것이다. 따라서, 동맥경화에 중요한 단계인 혈관평활근세포의 사멸, 이주 및 증식을 동시에 판단할 수 있는 좋은 방법이며 3가지 실험을 동시에 완료함으로서 시간과 경비를 절약할 수 있다.

Description

혈관평활근세포 사멸, 증식과 이주의 동시 측정을 이용한 신약스크리닝 기법 {Screening system for drug candidates using simultaneous measurement of wound-healing and bioimaging in vascular smooth muscle cell apoptosis-, proliferation- and migration}
본 발명은 혈관평활근세포의 특정물질에 대한 이주성 평가 및 세포의 증식과 사멸을 형광표지방법과 형광현미경을 이용하여 형광이미지화함과 동시에 얻어진 이미지 데이타를 통해 평가수치 및 세포의 형태학적 변화를 분석하는 방법적 기술로써 특정물질의 혈관평활근세포 사멸, 증식 및 이주성에 대한 활성정도를 측정할 수 있는 신약물질 스크리닝 기법에 관한 것이다.
동맥경화의 진행과정에서 혈관조직의 변화는 혈관조직의 내벽에 존재하는 내피세포의 손상을 초래한 것으로부터 시작된다. 내피세포의 부재는 혈관평활근세포의 과다증식과 과다 이주성을 유발하여 혈관 내의 혈류의 이주성 방해를 발생시키는 병증으로 발전된다. 한편, 이러한 동맥경화의 치료를 위한 스텐트시술, 혈관풍선성형술, 관동맥우회술 및 동정맥문합술 등의 혈관 손상을 동반하는 시술 후 혈관평활근세포의 과다증식 및 과다이주성이 유도될 수 있다. 대표적인 예로 동맥경화 치료 예후에서는 60% 이상의 혈관 재협착을 유발하는 현상이 나타나며, 이러한 과정 내에서도 혈관평활근 세포의 사멸, 과다증식 및 과다 이주성이 발견된다. 이러한 학술적 보고에 따르면, 동맥경화 발병 시 환자의 혈중에 분비된 사이토카인과 혈소판응집효소와 같은 물질이 혈관평활근세포의 과형성 현상을 유도한다. 반면, 환자의 혈중 지질 함량은 동맥경화진행 단계에서 동맥경화 병반 취약성을 결정하는 결정적인 역할을 한다. 병변이 진행된 죽상 중심부(atheromatous core)에는 콜레스테롤 외 다양한 지방산을 포함하고 있어, 재 동맥경화 치료는 외과적 처치 및 스타틴 계열의 약물을 치료제로 사용하고 있지만, 혈관평활근세포의 이주성을 억제하거나 과형성을 제어하는 데는 그 사용되고 있는 약물은 효능이 미약하거나 아직 완전히 역할을 못하고 있다. 이와 같이 동맥경화의 외과적 처치 후 발생하는 혈관 재협착 등의 혈관평활근세포의 이상 이주성/이상 증식을 억제하거나 제어를 통해 관련 질환의 예방 및 치료에 일조하기 위한 보다 효능이 있는 약물의 개발은 계속 연구가 필요한 실정이다. 따라서 후보 약물의 유효성여부를 판단할 수 있는 신속하고도 정확한 신약스크리능 기법의 개발은 중요할 것이다.
한편, 일반적으로 세포를 이용한 신약후보물질의 스크리닝 방법으로는 질병과의 상관성이 입증된 특정 유전자에 작용하는 화합물을 발굴하는 표적 기반 에세이(target-based assay) 방법과 물질을 처리한 후에 표현되는 세포의 형질(phenotype)의 변화를 알아보는 표현형 기반 에세이(phenotype-based assay)이 사용된다. 그러므로 여러 종류의 형광체 분자와 세포의 결합을 통해 대략적 분포를 측정하는 정적인 스냅샷 이미징인 기존의 세포이미징 기술보다 형광현미경을 이용한 실시간 세포 이주성 관찰은 표본 고정 없이 생체 내 약물의 효능을 추적하여 세포의 형태를 이미징화하여 약물효능을 스크리닝하는데 실용적인 수단으로 대두되고 있는 실정이다. 특히, 실시간으로 이를 해석하는 기법은 약효차이가 일어나는 시간적 차이에 따른 이미지의 실시간 수집이 가능하다. 살아있는 세포의 고감도 형광 이미지 검출, 분석 기술을 통합하여, 세포 내에서 일어나는 다양한 시간적, 공간적 현상에 대한 정보를 제공할 수 있는 기법을 이용하여 분석기술 플랫폼을 바탕으로 빠른 속도로 기술의 성장이 가능하며, 그 시장성 또한 증가되는 추세이다.
따라서, 본 발명은 신약개발과정에서 특정질병을 정확히 해석하고, 세포기반 바이오 이미징기법을 개발하여 다원화된 정보를 획득함으로써, 고속화된 신약스크린 기술의 개발을 통한 새로운 신약개발 시장 개척에 공헌할 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 혈관평활근세포를 배양하고 스크래치 상처-회복 분석(scratch wound-healing assay)을 수행하면서, 세포를 Live/Dead viability/cytotoxicity 키트로 형광표지하여 이동 및 증식 효과를 확인하는 방법을 통해, 세포 이주성 분석 중에 세포의 사멸, 이주성 및 증식성을 동시에 실시간으로 분석할 수 있는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명자들은 형광현미경과 세포기반 바이오이미징 분석을 동시에 이용하여, 혈관평활근세포 내 표지화 이미지와 비표지화 이미지를 비교함과 동시에 형광표지 scratch wound-healing assay를 통해 이주성의 변화를 분석하여 혈관재협착 유효성 분석법을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명은 혈관평활근세포를 이용한 병리적 세포변화법, 이를 이용한 신약스크리닝 방법을 제공하는데 목적이 있다.
따라서, 본 발명은 1) 혈관평활근세포를 배양하고 scratch wound-healing 분석을 위한 세포상처 유발 단계;
2) 상처를 낸 평활근세포에 신약후보물질 및/또는 과잉증식 유도물질을 처리하는 단계;
3) 처리한 평활근세포를 Live/Dead viability/cytotoxicity kit로 형광표지하는 단계; 및
4) 형광표지된 세포의 이동 및 증식 효과를 확인하는 단계;를 포함하는 동맥경화 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 Live/Dead viability/cytotoxicity kit 형광표지를 이용하여 세포생존 시 녹색의 형광을 표시하고, 세포사멸 시 붉은색의 형광을 나타내어 기존의 scratch wound-healing 방법이 가지는 문제점인 약물독성에 의해 저해되는 wound-healing을 해결할 수 있다. 또한, 본 발명은 세포 이주성을 이미지한 데이터 정량화 분석기법을 포함하고 있다.
본 발명은 혈관평활근세포를 platelet-derived growth factor(PDGF)-BB를 처리하여 세포 과증식 및 과이주(over-migration)를 문헌고찰과 동일한지 확인하였다.
본 발병의 주된 바이오-이미징 기법은 확인된 과증식 및 과이주성을 나타내는 혈관평활근세포를 대상으로 신약후보물질이 이를 억제하는 시스템에 관한 것으로서, 형광이미지와 비형광이미지를 데이터화하여 상기 검출된 세포기반 바이오이미지로 부터 효능평가의 객관성을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 신약스크리닝 시스템에 관한 것으로서, 상기 세포의 변화를 바이오이미지화하여 이용하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명의 분석 방법은 혈관평활근세포를 Live/Dead viability/cytotoxicity kit로 형광표지하여 세포사멸뿐만 아니라 세포이주와 증식의 억제까지 명확히 구분하였다. 처리된 신약후보물질의 독성에 의해 혈관평활근세포가 사멸되는 되는 것이 아니라 사멸, 이주 또는 증식이 억제되는 것은 신약의 유효성 측정에서 중요하다. 본 발명의 분석 방법을 통해, Scratched wound에서의 세포의 존재 유무로 세포 이주성이 억제됨을 알 수 있고 scratch wound 이외의 부분에서 세포가 감소하는 것은 세포의 증식을 억제하는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 분석 방법은 동맥경화에 중요한 단계인 사멸, 이주와 증식을 동시에 판단할 수 있는 좋은 방법이며 3가지 실험을 동시에 완료할 수 있으므로, 분석 시간과 경비를 절약할 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광표지기법을 도시한 것이다. 도 1의 A는 용매투여군으로 대조군을 표시하고 있으며, PDGF-BB만을 처리한 반응군 (양성대조군)과 PDGF-BB와 약물(억제제)을 동시에 처리한 실험군 1, 2로 나누어 독성 유무를 광학현미경하에서 획득한 결과이다. 도 1의 B는 동일한 조건하에서 Live/Dead viability/cytotoxicity kit(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)의 형광표지를 이용하여 형광현미경 하에서 형광이미지를 획득한 결과이다. 대조군, PDGF-BB 처리군 및 실험군 1에서 보여 주는 녹색 형광의 감도가 변화하는 것은 살아있는 세포의 수를 표시하는 것이며 세포사멸 반응이 없음을 나타내는 것이다. 반면, 실험군 2에서 보여주는 붉은색의 형광은 세포사멸 반응을 나타내고 있으며 억제제에 의한 독성 효과가 있음을 표지하고 있다.
도 2는 본 발명의 세포기반 형광표지 scratch wound-healing 기법 및 바이오이미징기법을 병행하여 얻은 이미지 및 이미징 스크리닝 분석 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계로 구성되는, 세포의 사멸, 이주성 및 증식성 동시 추적 방법을 제공한다.
1) 세포를 배양하고 scratch wound-healing 분석을 위한 세포상처 유발 단계;
2) 상처를 낸 세포에 신약후보물질 및/또는 과잉증식 유도물질을 처리하는 단계;
3) 처리한 세포를 형광표지하는 단계; 및
4) 형광 표지된 세포의 이동 및 증식 억제 효과를 확인하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 세포는 암세포, 피부 세포 또는 혈관평활근세포 중 어느 하나일 수 있으며, 질병과 관련하여 이주능을 가지는 것으로 알려진 세포는 어떠한 것을 적용하여도 무방하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 3)의 형광 표지는 Live/Dead viability/cytotoxicity kit를 사용할 수 있다. 상기 Live/Dead viability/cytotoxicity kit는 생존 세포와 사멸 세포를 각각 상이한 색으로 형광 표지할 수 있는 것으로 당업계에서 상업적으로 사용되고 있는 것이라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 동맥경화 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
1) 혈관평활근세포를 배양하고 scratch wound-healing 분석을 위한 세포상처 유발 단계;
2) 상처를 낸 평활근세포에 신약후보물질 및/또는 과잉증식 유도물질을 처리하는 단계;
3) 처리한 평활근세포를 Live/Dead viability/cytotoxicity kit로 형광표지하는 단계; 및
4) 형광표지된 세포의 이동 및 증식 효과를 확인하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 3)의 형광 표지는 Live/Dead viability/cytotoxicity kit를 사용할 수 있다. 상기 Live/Dead viability/cytotoxicity kit는 생존 세포와 사멸 세포를 각각 상이한 색으로 형광 표지할 수 있는 것으로 당업계에서 상업적으로 사용되고 있는 것이라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다.
혈관재협착성 동맥경화 치료제 신약스크리닝 기법으로서의 본 발명을 세포기반 scratch wound-healing법과 바이오이미징 분석기법을 병용 하여 실시한 예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 및 시료준비
혈관평활근세포주 20,000개를 6 well plate에 넣어 24시간 배양하고, 24시간 무혈청 배양을 통해서 세포 안정화한다. 이후 10 ng/mL의 PDGF-BB로 세포과잉증식을 유도하여 실험군 1에는 무독성 물질 1, 실험군 2에는 독성물질 1을 각각 투여하였다. 24시간 동안 광학현미경과 형광현미경 하에서 관찰하여 이미지를 기록하고, 변화 유무를 판단하는 기준점을 확인하였다.
실시예 2: 세포기반 scratch wound- healing법과 바이오이미징 분석기법 병용에 의한 평가
혈관평활근세포주 20,000개를 6 well plate에 넣어 24시간 배양하고, 세포의 안정화를 위해 24시간 무혈청 배양을 실시한다. Yellow tip을 이용하여 수직으로 scratch를 만들고, PBS로 세척하여 scratch내에 세포를 완전히 제거한다. 이후 10 ng/mL의 세포과잉증식을 유도하는 동시에 무독성 억제 물질 1을 투여하였다. 투여 후에 형광이미지를 0 시간으로 하여 최초시간의 이미지로 기록하고 배양시간별로 세포사멸의 유무를 판단하였다. 약물효능의 최종시점을 24시간으로 하여 광학현미경과 형광현미경하에서 이미지관찰을 기록하였다. 기록된 이미지는 최초시간의 이미지와 최종시점의 이미지를 분석하여 세포의 이주성을 수치화하여 기록하고 도 2의 그래프로 작성하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 혈관평활근세포의 사멸, 이주성 및 증식성 동시 추적 방법은 형광표지를 포함한 이미징 분석기법으로 혈관재협착성 항동맥경화 치료약물을 신속히 개발하기 위한 효과적인 신약스크리닝 기법을 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 활용은 급성동맥경화의 진단 키트 및 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

  1. i) 상처-회복 분석(wound-healing) 분석을 위해, 혈관평활근세포를 배양하고 상처를 유발하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 상처를 유발한 혈관평활근세포에 세포과잉증식 유도 물질 및 후보물질을 처리하는 단계;
    iii) 상기 단계 ii)에서 후보물질을 처리한 세포 중, 생존 세포와 사멸 세포를 구분하기 위해 형광 표지하는 단계;
    iv) 상기 단계 iii)에서 형광 표지한 세포의 사멸, 이동 및 증식 수준 변화를 확인하는 단계;를 포함하는, 동맥경화 치료용 약물 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 세포과잉증식 유도 물질은 플래틀렛-유도의 성장인자-BB(platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)인 것을 특징으로 하는, 동맥경화 치료용 약물 스크리닝 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 형광표지는 생존 세포 및 사멸 세포 간의 발색을 구분하여 형광 표지할 수 있는 키트(Live/Dead viability/cytotoxicity kit)를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 동맥경화 치료용 약물 스크리닝 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 하기 단계 v)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 동맥경화 치료용 약물 스크리닝 방법:
    v) 상기 단계 iv)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 세포의 이동 및 증식 수준이 억제되고, 세포 사멸이 증가하는 효과를 모두 나타내는 후보물질을, 동맥경화 치료용 약물로서 선별하는 단계.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 대조군은 하기 a) 또는 b) 중 어느 하나 또는 둘 다 인 것을 특징으로 하는, 동맥경화 치료용 약물 스크리닝 방법:
    a) 세포과잉증식 유도물질을 처리하고 후보물질을 처리하지 않은, 양성 대조군; 및
    b) 세포과잉증식 유도물질 및 후보물질을 모두 처리하지 않은, 음성 대조군.
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