KR20180029274A - 생체공학적 동종성 판막 - Google Patents

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KR20180029274A
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vein
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blood
smooth muscle
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KR1020187007061A
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슈히트라 수미트란-뵐게르손
안토니오 로잘레스
요니 히스달
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노바헵 아브
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Abstract

본 개시는 판막-포함 정맥 내 판막의 재세포화를 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 도너의 판막-포함 정맥을 탈세포화한 후 전혈 또는 골수 줄기 세포를 이용하여 재세포화하는, 동종의 정맥 판막의 생산에 유용하다. 여기에서 개시된 방법에 의해 생산된 동종의 판막은 혈관 질환을 갖고 있는 환자에서 삽입, 이식 또는 그래프팅을 위해 유용하다.

Description

생체공학적 동종성 판막{Bioengineered allogeneic valve}
관련 출원
본 개시는 2014년 05월 27일자로 출원된 미국 가출원 제62/003,129호에 대해 우선권 및 그의 이점을 주장하고, 이들의 전체 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.
기술분야
본 개시는 판막-포함 정맥 내 판막의 재세포화(recellularization) 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 판막은 혈관 질환 환자로의 삽입(implantation), 이식(transplantation), 또는 그래프팅(grafting)에 유리하다.
정맥 판막은 그것을 통과하는 혈액의 역류를 방지하는 정맥 내 막 주름(membranous fold)이다. 사람이 서 있을 때, 혈액은 심장에 도달하기 위해 중력과 반대로 다리 정맥에서 위쪽으로 흘러야 한다. 신체는 피부 아래 지방층에 위치한 표재성 정맥(superficial vein)과, 근육 내 및 뼈를 따라 위치한 심정맥(deep vein)을 가지고 있다. 짧은 정맥(short vein), 소위 연결 정맥(connecting vein)은 표재성 정맥과 심정맥을 연결한다. 심정맥은 심장 쪽으로 혈액을 나아가게 하는데 중요한 역할을 담당하고 있다. 심정맥 내 일 방향 판막이 혈액이 역류하는 것을 방지하고, 치약 튜브를 누르면 치약이 튀어나오는 것처럼 심정맥을 둘러싸는 근육이 그들을 압박하여 혈액을 심장 쪽으로 밀고 나아가도록 한다. 강력한 종아리 근육이 단계마다 다리에서 심정맥을 강력하게 압박하는데 중요하다. 심정맥은 혈액의 90% 이상을 다리에서 심장 쪽으로 운반한다.
일방향 판막은 가장자리가 서로 만나는 두 개의 피부판(첨단 또는 엽상부)로 구성된다. 이들 판막은 정맥이 혈액을 심장으로 되돌아가게 돕는다. 혈액이 심장 쪽으로 이동할 때, 한 쌍의 일방향 자동문처럼 상기 첨단이 열리도록 민다(좌측에 도시됨). 만약 중력이 즉시 혈액을 뒤로 끌어당기거나, 혈액이 정맥 내에 정체되기 시작하면, 상기 첨단은 즉시 밀리고 닫히게 되어 역류를 방지한다(우측에 도시됨).
표재성 정맥은 심정맥과 같은 종류의 판막을 가지고 있지만, 근육에 의해 둘러싸여 있지는 않다. 따라서, 표재성 정맥 내 혈액은 근육의 압박 작용에 의해 심장 쪽으로 밀고 나아가지는 않으며, 심정맥 내 혈액보다 훨씬 천천히 흐른다. 표재성 정맥을 통해 흐르는 많은 혈액은 심정맥과 표재성 정맥 사이에서 많은 연결 정맥을 통해 심정맥으로 방향을 전환한다. 연결 정맥 내 판막은 표재성 정맥에서 심정맥으로 혈액이 흐르도록 하나 반대로는 흐르지 않는다.
만성 정맥 부전증(Chronic venous insufficiency, CVI)은 다리 정맥 내 정맥벽 및/또는 판막이 효과적으로 작동하지 않을 때 일어나는 이상으로, 다리에서 심장으로 혈액이 되돌아가기 어렵게 한다. CVI는 이들 정맥에서 혈액을 "풀링"하거나모이게 하며, 이러한 풀링을 울혈이라 부른다. 정맥은 모든 신체 기관으로부터 혈액을 심장으로 되돌린다. 심장에 도달하기 위해, 혈액은 다리에서 정맥으로부터 위쪽으로 흐를 필요가 있다. 종아리 근육과 발에 있는 근육은 정맥을 압박하기 위해 각 단계에서 수축하고, 혈액을 위쪽으로 밀어내야 한다. 혈액을 아래쪽이 아닌 위쪽으로 흐르게 하기 위해, 정맥은 일방향 판막을 포함하고 있다. 만성 정맥 부전증은 이들 판막이 손상을 입어 혈액이 뒤쪽으로 누출될 때 발생한다. 판막 손상은 노화, 계속 앉아 있거나 서있거나, 노화와 운동 부족의 조합의 결과로 발생할 것이다. 혈액이 심장으로 흐르기 어려운 지점에서 정맥과 판막이 약해질 때, 정맥 내 혈압은 장기간 동안 높은 상태로 머물러 있어 CVI를 유발한다. 미국인의 40%가 CVI를 갖고 있는 것으로 평가되었다.
표재성 수술과 더불어 압박 스타킹을 이용한 전통적인 CVI 치료는 정맥혈 동력학을 개선하는 것 같으나, 24주 후 궤양 치유 비율은 단지 65%이고, 재발율은 연간 12%에 달한다. CVI 및 다리 궤양의 재건 심정맥 수술 치료는 침습적이므로 이용하는 데는 한계가 있다.
혈액은 심장의 펌핑 작용에서 유래된 동압(dynamic pressure)으로 인해 동맥과 정맥 둘 다를 통해 이동한다. 폐쇄 순환계에서, 정맥 역류량은 심장 배출량과 같아야 한다. 대부분의 동압은 동맥 순환에서 소멸한다. 남아있는 에너지는 정맥계로 방출된다. 정상 상황에서, 모세혈관의 정맥 끝에서 압력은 12 내지 18 mmHg이고, 4 내지 7 mmHg의 동맥 압력으로 점차 떨어진다. 반듯이 누웠을 때, 중력 압력은 중립이 되고 혈액은 이러한 동압 구배를 따라 흐른다. 호흡에 의한 움직임 역시 누워있는 자세에서 정맥 역류량에 강하게 영향을 주지만, 사지가 늘어져 있을 때는 효과가 거의 없다.
정수압(hydrostatic pressure)은 우심방 아래 혈액 기둥(blood column)의 무게에서 유래한다. 혈액의 밀도 및 중력의 가속이 정수압을 결정한다. 정수압과 중력 압력은 심방 아래 cm에서 수직 거리의 상수 배(0.77 mmHg/cm)로 표현된다. 상기 압력은 똑바로 서있을 때(앉거나 서있는) 가장 높으나, 움직이지 않는 개인은 그렇지 않다. 그러나, 측정된 압력은 또한 근수축 같은 외부 요인들을 반영한다. 다른 외부 요인들 역시 접이식 정맥 도관(collapsible venous conduits)을 통과하는 흐름을 바꾼다. 호흡 동안, 횡격막 수축은 복강내 및 다리 정맥압을 높인다. 복수 및 비만은 누워있을 때조차 유사한 압력 증가를 생성한다.
늘어진 팔에서 압력은 심방과 첫 번째 늑골 간의 수직 거리를 반영한다. 똑바로 선 개체에서 심방들 위에 있는 팔 정맥은 머리와 목의 두개외 정맥처럼 급격히 쇠퇴할 것이다. 그러므로 심방 위 정맥 구조 내 압력은 0 아래로 떨어지지 않는다. 심지어 정맥 판막이 선천적으로 없을 때조차 부종 및 역류는 팔에서 드물다. 분리 중심부 정맥 혈전증(Isolated central vein thrombosis)은 보통 일시적인 근위 부종만을 생성한다.
늘어진 다리에서 심장까지 혈액의 정맥 역류는 다리 근육 펌프에 의한 혈액의 분출에 의해 유능한 정맥 판막의 도움을 받아 이루어진다. 판막은 혈액의 정수 기둥(hydrostatic column)을 분절로 나누고 역행 정맥류를 방지하는 기능을 수행한다. 슬와 안 분절(infrapopliteal segment) 내 더 많은 판막은 그들의 더 큰 기능적 중요성을 시사하나, 정수압이 대퇴부 또는 슬와 정맥의 무능을 바로잡음으로써 유의적으로 바뀔 수 있다.
정맥 판막을 관통하는 것은 심부에서 표면으로 흐르지 못하게 하며, 종아리 펌프의 압력/흐름 관계와 일치하는 개념이다. 발의 정맥을 관통하는 것은 예외적이다; 이방향성 흐름을 정상인 것으로 간주한다.
만성 정맥 부전증(CVI) 및 다리 궤양 환자들은 막대하고 직접적인 연간 비용과 함께 심각한 의학적 사회적 문제들이 있다. 정맥성 다리 궤양의 유병률은 0.1 내지 1.0%이다. 압박 스타킹과 표재성 수술을 이용한 전통적인 CVI 치료는 정맥 혈행역학을 개선하는 것 같지만, 24주 후 궤양 치유 비율은 단지 65%이고, 연간 12%의 재발율에 이른다.
또한, 수술 기술은 큰 노력을 요하므로, 재건성 심정맥 수술에 사용하는 데는 한계가 있다.
따라서, 만성 정맥 부전증(CVI)과 다리 궤양을 겪고 있는 환자들을 치료하기 위한 개선된 방법에 대해 요구가 있다. 본 개시는 이들 질환을 치료하기 위한 대체 전략을 제공한다.
요약
본 개시는 판막-포함 정맥 내 판막의 탈세포화 및 재세포화를 위한, 그 중에서도, 재료 및 방법을 특징으로 한다.
본 개시는 자극된 인 비보의 생리학적 조건 하에서 조직공학적 인간 판막-포함 정맥 분절의 판막 기능의 성공적 보존을 제공한다. 추가로 본 개시는 내피세포 단층이 형성되는 것으로부터, 단순 혈액 샘플로 탈세포화된 인간 정맥 분절 및 정맥 판막의 성공적인 재-내피세포화를 제공한다.
본 개시는 정맥 내 판막의 재세포화 방법, 즉 내피세포에 대한 간세포(progenitor cells) 및 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 혈액을 탈세포화된 정맥의 루멘으로 도입하고, 탈세포화된 정맥의 루멘에서 상기 세포들을 배양함으로써 상기 정맥 내 판막을 재세포화하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시는 판막-포함 정맥 내에서의 판막의 재세포화의 방법을 제공하며, 여기에서 재세포화된 판막은 기능적 판막이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 정맥 내 재세포화된 판막을 필요로 하는 대상체로부터 정맥의 분절을 수득하고; 판막-포함 정맥을 탈세포화하고; 상기 대상체로부터 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 혈액을 수집하고; 탈세포화된 판막-포함 정맥을 상기 수집된 혈액으로 관류시키고; 탈세포화된 판막-포함 정맥 내에서 세포를 배양함으로써 상기 정맥 내 탈세포화된 판막을 재세포화하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 본 개시는 재세포화가 재세포화된 판막의 능력(competence)과 역류 압력의 저항을 복원하는, 정맥 내 판막을 재세포화하는 방법을 포함한다.
본 개시는 정맥의 재세포화된 판막-포함 분절을 이를 필요로 하는 대상체에 도입하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 만성 정맥 부전증 (CVI), 심정맥 혈전증 (DVT), 및/또는 다리 궤양을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 판막은 동종 정맥의 판막-포함 분절을 탈세포화하고; 상기 대상체로부터 내피세포에 대한 간세포와 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 혈액을 수집하고; 상기 수집된 혈액으로 상기 탈세포화된 판막-포함 정맥을 관류시키고; 탈세포화된 판막-포함 정맥의 루멘 내에서 세포들을 배양하고; 그에 따라 상기 정맥의 탈세포화된 판막을 재세포화하고; 상기 재세포화된 판막-포함 정맥을 상기 대상체에 그래프팅하는 것을 통해 재세포화되며, 이는 상기 대상체에서 CVI 및/또는 다리 궤양을 치료하게 된다.
일 구체예에서, 혈액은 말초정맥혈 또는 전혈이다. 일 구체예에서, 말초정맥혈 또는 전혈은 주사 또는 관류에 의해 탈세포화된 정맥에 도입된다. 상기 방법은 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류에 의해 세포를 배양하는 것을 제공한다. 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류는 교대로 할 수 있다. 일 구체예에서, 재세포화된 판막은 CD31 양성, vWF 양성, 평활근 액틴 양성이고, 핵을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 재세포화된 판막은 0.8 N 또는 그 이상에서의 첫번째 피크에서 견뎌내는 힘을 갖는 기계적 물성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 재세포화된 판막은 0.5초 이하의 폐쇄 시간을 갖는다.
본 개시는 내피세포, 평활근세포, 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포의 집단 중 하나 이상을 탈세포화된 루멘에 도입함에 의한 정맥 내 판막의 재세포화의 방법을 제공한다. 세포들 및/또는 간세포들의 집단은 탈세포화된 정맥과 함께 배양되며, 그에 따라 상기 정맥 내 판막을 재세포화시킨다. 본 개시의 상기 재세포화된 판막은 그를 필요로 하는 대상체에게 그래프트된 후 정상 건강 판막과 유사하게 정상 폐쇄 시간(즉, 능력(competence))을 복원하며, 역류 압력을 견딘다. 본 개시의 특징은 내피세포, 평활근세포, 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포의 집단을 오직 탈세포화된 정맥의 루멘에만 도입하는 것을 특징으로 한다.
추가로, 본 개시는 재세포화된 판막이 기능적인, 정맥 내 판막의 재세포화 방법을 제공한다. 상기 재세포화 방법은 인간 정맥의 판막-포함 분절을 수득하고; 상기 정맥을 탈세포화하고; 탈세포화된 판막의 수혜자(recipient)로부터 혈액을 수집하고; 상기 탈세포화된 정맥을 상기 수집된 혈액으로 수시간 동안(예컨대, 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 또는 약 10 내지 20시간 동안) 관류시키고; 상기 정맥을 내피세포 배지로 1일 이상 관류시키고; 상기 정맥을 평활근세포 배지로 1일 이상 관류시키고; 그에 따라 상기 정맥의 탈세포화된 판막을 재세포화시키는 단계를 포함한다. 본 개시의 혈액을 이용한 재세포화된 판막은 그를 필요로 하는 대상체에게 그래프트된 후 정상 건강 판막과 유사하게 정상 폐쇄 시간(즉, 능력)을 복원하며, 역류 압력을 견딘다.
본 개시는 재세포화된 판막이 기능적인, 정맥 내 판막의 재세포화 방법을 제공하다. 상기 재세포화 방법은 도너로부터 수득한 정맥의 판막-포함 분절을 탈세포화하고; 치료를 필요로 하는(즉, 정맥 내 판막 재세포화를 필요로 하는 대상체로부터 수집된 혈액으로 수 시간 동안(예컨대, 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 또는 10 내지 20시간 동안) 관류시키고; 선택적으로 상기 정맥을 내피세포 배지로 1일 이상 관류시키고; 상기 정맥을 평활근세포 배지로 1일 이상 관류시키고; 그에 따라 상기 정맥의 탈세포화된 판막을 재세포화하는 단계를 포함하며, 상기 재세포화된 판막은 그를 필요로 하는 대상체에게 그래프트된 때 재세포화는 재세포화된 판막의 능력과 역류 압력에 대한 저항력을 복원한다.
판막 재세포화 방법에 있어서, 말초정맥혈 또는 전혈에 존재하거나 그로부터 유래한 세포들의 집단은 탈세포화된 정맥과 함께 배양된다. 본 개시는 상기 세포들의 집단이 동종인 것을 제공한다. 본 개시는 또한 상기 세포들의 집단이 자가유래인 것을 제공한다. 동종 및/또는 자가유래의 상기 세포들의 집단은 말초 혈액 정맥 또는 전혈로부터 수집되거나 또는 그 내에 존재한다. 본 개시는 동종의 도너로부터 수집된 말초정맥혈 또는 전혈을 제공한다. 상기 말초정맥혈 또는 전혈은 자가유래이다. 본 개시는 동종의 말초정맥혈 또는 동종의 전혈과 함께 탈세포화된 정맥을 배양하는 것을 제공한다. 본 발명은 동종의 전혈과 함께 탈세포화된 정맥을 배양하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 자가 유래 말초정맥혈 또는 동종의 전혈과 함께 탈세포화된 정맥을 배양하는 것을 제공한다.
본 개시는 탈세포화된 정맥을 제공한다. 상기 정맥은 반복된 탈세포화 단계, 즉 1회("사이클"로 정의됨) 이상 정맥을 탈세포화하는 것을 포함하는 방법으로 탈세포화된다. 상기 정맥 탈세포화는 2 내지 16 사이클을 포함한다. 예를 들어, 탈세포화 방법은 14 사이클을 포함한다.
2 내지 16 탈세포화 사이클을 포함하는 방법으로 탈세포화 후 본 개시의 판막-포함 정맥은 탈세포화되지 않은 정맥과 비교하여 감소된 숫자의 핵을 갖거나 핵을 갖고 있지 않다(면역조직학적 어세이에서 핵에 대해 염색이 덜 되거나 음성임). 2 내지 16 탈세포화 사이클 후, 상기 정맥은 HLA 클래스-I 항원을 적게 갖거나 없는 것을 특징으로 하며(면역조직학적 어세이에서 HLA 클래스-I 항원에 대해 염색이 덜 되거나 음성임), 및/또는 HLA 클래스-II 항원을 적게 갖거나 없다(면역조직학적 어세이에서 HLA 클래스-II 항원에 대해 염색이 덜 되거나 음성임). 2 내지 16 탈세포화 사이클 후, 상기 정맥은 탈세포화되지 않은 정맥과 비교하여, 감소된 콜라겐 및 설페이트화 글라이코스아미노글리칸(GAG), 및 감소된 엘라스틴을 갖는 것을 특징으로 한다. 탈세포화는 탈세포화되지 않은 정맥과 비교하여, 상기 탈세포화된 정맥에서 DNA를 감소시킨다.
본 개시는 재세포화된 판막과 정맥이 핵을 가지며 CD31 양성인, 탈세포화된 판막-포함 정맥의 판막 재세포화를 제공한다. 재세포화된 판막을 갖는 정맥은 또한 평활근세포 액틴에 대해 양성이며, 정맥의 외막에 스핀들 형상의 평활근세포를 갖는다. 재세포화된 판막 및 정맥은 또한 내피세포 마커 vWF에 대해 양성이다.
본 개시는 기능적 판막을 달성하는 방법에 의해, 탈세포화된 정맥 내 판막을 재세포화하는 것을 제공한다. 상기 기능적 판막은 정상적인 폐쇄 시간(즉, competent)을 가지며, 정상 수준의 역류 압력을 견뎌낸다. 정상 기능을 갖는 판막의 정상적인 폐쇄 시간(또한 여기에서 competency로서 언급)은 0.5초 이하이다. 정상 기능을 갖는 판막은 100 mm Hg의 정상 수준의 역류 압력을 견뎌내며, 7 내지 12 걸음을 걷는 동안 평균 약 18 mm Hg 내지 약 25 mm 까지 감소된다.
본 개시는 그를 필요로 하는 대상체에 그래프팅 후 모세혈관이 정맥 끝에서 12 내지 18 mm Hg 의 압력을 복원하는 재세포화 판막을 제공한다. 재세포화된 판막은 그것 내에서 대상체 내 정상 정수압과 중력 압력을 복원시키며, 여기서 정수압과 중력 압력은 심방 아래의 수직거리를 cm로 하여 이의 상수 배(0.77 mm Hg/cm)로서 표현된다. 재세포화된 판막은 똑바로 있을 때(앉거나 서 있을 때) 가장 높은 정상 압력인 100 mm Hg을 복원하지만, 그래프팅 후 움직임이 없는 대상체는 그렇지 않다. 본 개시는 또한 걷고 호흡하는 동안 발생하는 스트레스 하에서 심정맥 시스템 내 정맥을 통한 흐름을 모방하는 인 비트로 기능적 어세이에서 약 100 mm Hg 의 정맥 역류압을 갖는 기능적 재세포화된 판막을 제공한다.
본 개시는 능력이 있는 재세포화된 정맥 판막에 의해 도움을 받아, 하지 근육 펌프에 의해 혈액을 밀어냄으로써, 의존적인 하지로부터 심장으로 혈액의 정상적인 정맥 환류를 달성하기 위한 판막의 재세포화를 제공한다. 본 개시의 재세포화된 판막은 혈액의 정수압 컬럼(hydrostatic column)을 분절로 나누고 정맥류가 역행하는 것을 방지한다. 판막의 재세포화는 대퇴부 또는 슬와 정맥 부전을 교정함으로써 정수압 변경으로 인해 증상들을 완화시킨다. 관통 정맥 판막은 표재성 흐름을 깊이 방지하고 종아리 펌프의 정상 압력/흐름 관계를 복원시킨다.
발의 관통 정맥 내에서 재세포화된 판막은 정맥을 통한 혈액의 양방향 흐름을 복원시킨다.
본 발명은 추가로, 대상체에 정맥의 재세포화된 판막-포함 분절을 그래프팅하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체에서 만성 정맥 부전증 (CVI) 및/또는 다리 궤양의 증상을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 판막 재세포화 방법은 하나 이상의 단계를 포함한다. 상기 방법은 하기 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다: 인간 동종의 대퇴부 정맥의 판막-포함 분절의 획득; 대퇴부 정맥에서 정맥을 2 내지 16 사이클 탈세포화; 대상체로부터 혈액의 수집; 항혈액응고제로 탈세포화된 정맥을 관류; 수집된 혈액으로 탈세포화된 정맥을 수 시간 동안 관류; 혈액을 빼내고 버퍼로 정맥을 헹굼; 및 내피세포 배지로 정맥을 우선 1일 이상 관류시키고, 그런 다음 평활근세포 배지로 정맥을 1일 이상 관류; 그에 따라 탈세포화된 판막을 재세포화, 여기에서 재세포화된 판막은 대상체에 그래프팅 시 CVI 및/또는 다리 궤양을 치료하거나 완화시킨다.
본 개시는 그를 필요로 하는 대상체에서 만성 정맥 부전증 (CVI) 및/또는 다리 궤양의 증상을 치료하거나 완화시키는데 사용하기 위한 혈관의 재세포화된 판막-포함 분절(segment)을 제공한다. 혈관이 재세포화된 분절은 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다: 인간 동종 대퇴부 정맥의 판막-포함 분절의 수득; 대퇴부 정맥에서 정맥을 2 내지 16 사이클 탈세포화; 대상체로부터 혈액을 수집; 탈세포화된 정맥을 항혈액응고제로 관류; 수집된 혈액으로 탈세포화된 정맥을 수시간 동안 관류; 혈액을 빼내고 버퍼로 정맥을 헹굼; 및 평활근세포 배지로 정맥을 1일 이상 관류; 그에 따라 탈세포화된 판막을 재세포화; 여기에서 재세포화된 판막은 대상체로 그래프팅 시 CVI 및/또는 다리 궤양을 치료 또는 완화시키며; 바람직하게는 여기에서 혈관이 재세포화된 분절은 상기 언급된 모든 단계를 포함한 방법에 의해 얻어진다.
본 개시는 신체/도너로부터 수득 또는 얻어진 정맥의 분절인 판막, 및 치료될 대상체로부터 수집된 혈액 상에서 수행되는 방법을 제공하며, 여기에서 도너 및 치료될 대상체는 동일한 개체가 아니다.
본 개시의 판막 탈세포화 단계는 판막-포함 정맥을 적합한 세제(detergents)/유기인계 화합물(organophosphate compounds)로 처리하는 것을 포함하며, 이는 이에 제한되는 것은 아니나 트리톤® 및 트리-n-부틸 포스페이트 및 선택적으로 부가적으로 DNAase를 함유한다.
탈세포화된 판막은 내피세포 배지로 정맥을 2 내지 6일 동안 관류시키고, 뒤이어 평활근세포 배지로 정맥을 2 내지 6일 동안 관류시킴으로써 재세포화된다. 한 측면에서, 탈세포화된 정맥을 배양하는 것은 인 비트로에서 수행된다.
재세포화된 판막은 CD31 양성이다. 재세포화된 판막은 또한 평활근 액틴 양성, vWF 양성일 수 있고/거나 스핀들-형상의 평활근세포들의 존재에 의해 특징지워진다. 재세포화된 판막은 0.8 N 이상의 첫번째 피크에서 힘의 기계적 물성을 갖는다.
본 개시는 심한 정맥 역류 및/또는 정맥 고혈압으로 인한 재발성 다리 암을 재세포화된 판막-포함 정맥으로 치료하는 방법을 제공하다. 본 개시는 심한 정맥 역류 및/또는 정맥 고혈압으로 인한 재발성 다리 암을 치료하는데 있어서의 재세포화된 판막-포함 정맥의 용도를 제공한다.
본 개시는 여기에서 기술된 재세포화 방법들 중 어느 하나에 의해 생산되는 판막을 특징으로 하며, 상기 재세포화된 판막은 CD31 양성이다. 재세포화된 판막은 또한 평활근 액틴 양성, vWF 양성일 수 있고/거나 스핀들-형상의 평활근세포들의 존재에 의해 특징지워진다. 재세포화된 판막은 0.8 N 이상의 첫번째 피크에서 힘의 기계적 물성을 갖는다.
본 발명은 또한, 삽입(implantation) 또는 그래프팅(grafting)을 위한 여기에서 기술된 방법들 중 어느 하나에 의해 생산된 판막의 용도를 특징으로 하며, 상기 재세포화된 판막은 CD31 양성이다. 재세포화된 판막은 또한 평활근 액틴 양성, vWF 양성일 수 있고/거나 스핀들-형상의 평활근세포들의 존재에 의해 특징지워진다. 재세포화된 판막은 0.8 N 이상의 첫번째 피크에서 힘의 기계적 물성을 갖는다.
본 개시는 그를 필요로 하는 대상체에 그래프팅 시 대퇴의 무능한 판막의 증상을 치료 및/또는 완화시킨다. 한 측면에서, 상기 증상의 치료 및/또는 완화는 근육 펌프 및 정맥 판막 간의 정상적인 작동 관계를 복원시킴으로써 달성된다. 하지의 근육 펌프는 발, 종아리 및 대퇴의 근육 펌프를 포함한다. 이들 중, 종아리 펌프는 가장 효율적이고, 가장 큰 커패시턴스를 갖고 있으며, 가장 높은 압력(근수축시 200 mm 수은압)을 생성하기 때문에 가장 중요하다. 정상적인 사지는 1500 내지 3000 cc 범위의 종아리 부피, 100 내지 150 cc 범위의 정맥 부피를 가지며, 단일 수축으로 정맥 부피의 40% 내지 60% 넘게 밀어낸다.
수축 동안, 비복근 및 족저근은 슬와 및 대퇴 정맥의 넓은 공간으로 혈액을 움직인다. 본 개시의 재세포화된 판막은 뒤이은 이완 동안 역행 흐름(역류)를 방지하고, 네거티브한 압력을 생성하며 능력이 있는 관통 정맥을 통해 표재로부터 심부로 혈액을 끌어낸다. 재세포화된 판막은 동맥의 유입이 정맥의 유출과 동일해질 때까지 정맥의 압력을 점진적으로 낮춘다. 대상체에서 운동이 중단될 때, 재세포화된 판막을 갖는 정맥은 천천히 모세혈관계를 채워, 휴지 정맥압으로의 느린 복귀를 야기한다.
대퇴 정맥은 근육에 의해 둘러싸여 있긴 하나, 종아리 근육 펌프에 비해 정맥 환류에 대해 대퇴 근육 수축이 기여하는 것은 아주 적다. 플랜터(planter) 정맥 얼기(plexus)는 보행동안 압축되며 이 펌핑 작용은 종아리 펌푸가 주된 것으로 고려되고 있다. 다양한 다리 펌프는 능력이 있는(competent) 판막 기능과 함께 작동하여 원위부로부터 근위부로 정맥혈을 환류시킨다.
달리 정의하지 않는 한, 여기에서 사용된 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기에서 개시된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 개시의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있으며, 적합한 방법 및 재료는 하기 기술된다. 또한, 상기 재료, 방법 및 예들은 단지 설명을 위한 것일뿐 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 여기에서 언급된 모든 출판물, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 그들 전체로서 참고로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 제어할 것이다.
본 개시의 구체 내용은 하기 상세한 설명과 수반되는 도면들에 의해 설명된다. 본 개시의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구항으로부터 명백할 것이다.
본 개시의 구체 내용은 하기 수반되는 상세한 설명에 의해 설명된다. 여기에서 개시된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 개시의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있으며, 상기 방법 및 재료는 여기에서 기술된다. 본 개시의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구항으로부터 명백할 것이다. 명세서 및 부속된 청구항에서, 단수형은 문맥이 명백히 다르게 나타내지 않는 한 복수형을 포함한다.
편의상, 명세서, 실시예 및 청구항에서 사용된 특정 용어들을 여기에 모았다. 달리 정의하지 않는 한, 여기에서 사용된 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
정의
여기에서 사용된 "재세포화"는 세포를 탈세포화한 정맥에 도입 또는 전달하고, 세포가 증식하고/하거나 분화하여 최종적으로 정상적인 정맥 판막의 것과 같은 구축 양식, 세포 조직화 및 생물 활성을 가지는 판막으로 재생되도록 세포를 배양하는 과정을 의미한다.
여기에서 사용된 "탈세포화"는 판막으로부터 세포를 제거하는 과정을 의미한다. 유효한 탈세포화는 조직의 밀도 및 조직화, 최종 산물에 바람직한 기하적 성질 및 생물학적 성질, 및 표적화 임상적 적용 등의 인자에 의해서 규정된다. ECM의 온전성을 보존하면서 판막을 탈세포화해, 당업자가, 예를 들면, 프로세스 사이에 특정의 제제 및 기법을 선택함으로써 생물 활성을 최적화할 수 있다. 탈세포화용 제제는 세포 수, 밀도, 지질 함량 및 정맥의 두께를 포함하는 많은 요인에 의존될 수 있다. 대부분의 세포 제거 제제들 및 방법들은 ECM 조성물을 변화시키고 초미세 구조 붕괴가 일부 발생할 수 있지만, 이러한 바람직하지 않은 효과를 최소화는 것이 바람직하다.
여기에서 사용된 "치료"는 임상적 결과를 포함하여 유리하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유리하거나 원하는 임상적 결과는 감지할 수 있든 없든 하나 이상의 증상에 대한 완화 또는 경감, 질환 정도의 감소, 질병 확산을 방지하는, 질병 안정화된(즉, 악화가 아닌) 상태, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 회복(부분 또는 전체)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존에 비하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
"감소하다" 또는 "감소" 또는 "경감"과 같은 다른 형태의 용어는 이벤트 또는 특성(예를 들면, CVI 및/또는 다리 궤양)의 저하를 의미한다. 이는 몇몇 표준 또는 예상치에 관한 전형적인 것을 알 수 있으며, 다시 말해 이는 상대적이나, 표준 또는 상대치를 참조하는 것이 반드시 필요한 것은 아니다.
게다가 본 발명의 방법은 질병 또는 질병 상태를 예방하는 것을 제시해주며, 상기 용어 "예방"은 질병 상태, 예를 들면, CVI 및/또는 다리 궤양이 완전히 막아지는 것을 요구하지 않는다는 것을 알 수 있다.
상기 용어 "예방"은 본원에 개시된 재세포화된 판막들이 질병, 예를 들면, CVI 및/또는 다리 궤양의 경감된 증상 또는 진행의 척도로서 삽입/그래프트/이식될 때 일부 효과를 포함할 수 있다. 상기 효과는 일부 효과부터 효과의 정도가 다르거나, 치유된 것을 선언된 개체의 최종 효과를 포함하거나, CVI 및/또는 다리 궤양의 증상이 부족한 거까지 확대될 수 있다. 상기 용어는 질병 상태가 항상 완전히 막아지는 것을 요구하지 않는다.
여기에 사용된 바와 같이, 질병 또는 질병 상태를 "완화시키는" 것은 질병 상태의 정도 및/또는 원하지 않은 임상적 징후가 질병이 치료되지 않은 것에 비하여 감소(또는 경감)되고/되거나 진행의 시간 경로가 느려지거나 길어지게 되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제", "저해" 및 이의 다양한 명사 및 동사적 표현들은 재세포화된 판막들의 생물학적 효과를 설명하기 위해 본원에 사용된다. 이는 반드시 100% 억제를 요구하지 않는다. 일부 억제는 이러한 정의 내에 포함된다. 적절한 대조군(예, 상기 화합물이 사용되지 않을 때 관찰되는 정도)과 비교한 억제 정도는 상기 정의에 포함될 수 있다.
판막의 능력은 본원에 사용된 바와 같이, 판막 폐쇄 시간 또는 흐름이 정지할 때까지의 역류되는 시간과 관련된다. 정상 기능을 갖는 판막의 판막 폐쇄 시간은 0.5초 이하이다. 구현예에서, 본 발명의 재세포화된 판막은 0.5 초 이하의 판막 폐쇄 시간 (또는 능력)을 가질 수 있다.
여기에서 사용된 정맥 역류는 심장쪽의 혈액 흐름 방향에 대해 혈액의 역류를 말한다. 정상 기능을 갖는 판막은 약 100 mmHg과 7 내지 12걸음을 걷는 동안 평균 약 18 mmHg 내지 약 25 mmHg로 감소되는 역류 압력을 견디거나 허용할 수 있다.
정상 기능을 갖는 판막은 약 100 mmHg로 올라가고 7 내지 12걸음을 걷는 동안 평균 약 18 mmHg 내지 약 25 mmHg로 감소되는 압력에 대하여 폐쇄함으로써 역류를 방지한다.
구현예에서, 재세포화된 판막은 정상 판막에 의해 허용되는 역류 압력, 즉 100 mmHg 의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%를 견딜 수 있는 능력을 입증할 수 있다.
여기에서 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물(동물의 경우에는 보다 일반적인 포유류)을 의미한다. 하나의 양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 하나의 양태에서, 상기 대상체는 남성이다. 하나의 양태에서, 상기 대상체는 여성이다. 여기에서 사용된 "이를 필요로 하는 대상체"는 질병 또는 무능한 판막과 관련된 혈관 질환 또는 장애를 가지는 대상, 또는 혈관 그래프트 또는 이식을 필요로 하는 혈관 질환 또는 장애가 발생하는 리스크가 집단 전체와 비교해 증가하고 있는 대상이다.
본 발명의 이해를 촉진하는 목적으로, 특징 및 특정 언어로 만들어진 레퍼런스는 마찬가지로 설명하는데 사용된다. 여기에서 사용된 용어는 단지 특정한 특징을 설명하기 위해, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 단수형 "a", "an" 및 "the"는 복수 의미를 포함한다. 그러므로 예를 들면, "판막"에 대한 언급은 단일 조성물뿐만 아니라 이러한 조성물의 복수도 포함한다. 본원에서 사용되는 모든 백분율 및 비율은 달리 언급하지 않는 한, 중량 기준이다.
성분의 중량%는 특별히 달리 언급하지 않는 한, 성분이 포함된 제형 또는 조성물의 총 중량을 기준으로 한다. "약(about)"이라는 용어는 질병 또는 질환의 치료 및 제형의 제조에 있어서 제제의 효능을 변경하지 않는 제제의 농도 또는 양에 대한 임의의 최소 변화를 의미한다. 본 발명의 제제(예, 치료적/활성제)의 농도 범위에 대한 용어 "약"은 또한 유효한 양 또는 범위일 수 있는 명시된 양 또는 범위에 대한 약간의 변화를 의미한다.
범위는 본 명세서에서, "약" 하나의 특정치로부터 및/또는 "약" 또 다른 특정치까지와 같이 표현될 수 있다. 그러한 범위가 표현되면, 다른 양태는 하나의 특정치에서 및/또는 또 다른 특정치까지 포함한다. 마찬가지로, 앞서 "약"의 사용으로 인해 근사치로 표현되면, 특정치가 다른 양태를 형성하는 것을 알 수 있다. 각각의 범위에서의 종점(end point)은 다른 종점과 연관되고 다른 종점과 독립적으로, 모두에 중요하다는 것을 추가로 알 수 있다. 본원에 개시된 값은 여러 가지가 있을 수 있으며, 상기 각각의 값은 그 값 자체 뿐만 아니라 특정 값도 "약"으로 본원에 기재되어 있음을 또한 알 수 있다. 또한, 명세서 전체에 걸쳐 데이터가 다수의 상이한 포맷으로 제공되고, 이러한 데이터는 종점과 시작점을 나타내고, 상기 데이타 포인트의 임의 조합을 위한 범위임을 알 수 있다. 예를 들면, 특정 데이타 포인트로 "10"과 "15"가 개시된 경우, 10 내지 15뿐만 아니라 10 및 15와 같으며, 초과이거나, 이상이거나, 미만이거나, 이하인 것을 모두 포함하여 기재된 것으로 간주할 수 있다. 또한, 두 특정 유닛 사이의 각각의 유닛 또한 개시되어 있음을 알 수 있다. 예를 들면, 10 및 15가 개시되어 있다면 11,12,13,14 또한 개시된 것으로 본다.
정맥 혈액은 정맥계를 통해 주변 혈관으로부터 심장의 우심방으로 이동하는 탈산소화된 혈액이다. 탈산소화된 혈액은 이후 좌우 폐 각각으로 좌우 두 갈래로 나누어지는 폐동맥을 통해 폐로 우심실에 의해 펌핑된다. 혈액은 폐에서 산소화되고, 폐정맥을 통해 좌심방으로 돌아간다.
산후 혈관 생성은 내피간세포(EPCs)의 순환에 의해 성인에서 새로운 정맥이 형성되는 것을 의미하며; 혈관 신생은 기존의 내피 세포로부터 새로운 정맥이 형성되는 것을 의미한다(Ribatti D et al., 2001). 상기 두 프로세스는 정맥 분지의 형성 및 상처 치유, 허혈, 골절 치료, 종양 성장 등과 같은 병원성 상태에 관여한다 (Laschke etal, 2011).
본 개시는 정맥을 재세포화하는데 사용된 세포 집단이 동종(allogeneic)인 것을 포함한다. 여기에서 사용된 "동종"은 파생된 기관 또는 조직(즉, 관련되거나 관련되지 않은 개체)과 같은 종의 개체로부터 얻은 혈액을 의미한다.
본원에서 사용된, 자가(autologous)는 공여자와 수여자가 동일인임을 의미한다. 예를 들면, 비응급 수술 예정 환자는 수술까지 저장될 자신의 혈액을 공급함으로써 자가 공여자일 수 있다. 자가 이식은 자신에게 제공되는 이식(피부 이식과 같은)이다. 구현예에서, 본 발명의 재세포화 방법은 수여자(즉, 치료를 요하는 대상체("자가"))로부터 받은 혈액 또는 세포를 도입하는 것을 포함한다.
본 발명의 이해를 촉진하는 목적으로, 특징 및 특정 언어로 만들어진 레퍼런스는 마찬가지로 설명하는데 사용된다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 특징을 설명하기 위해, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 단수형 "a", "an" 및 "the"는 복수 의미를 포함한다. 그러므로 예를 들면, "조성물"에 대한 기재는 단일 조성물 뿐만 아니라 이러한 조성물의 복수도 포함하고, "치료제"에 대한 기재는 하나 이상의 치료적 및/또는 약제학적 제제 및 당업자에게 공지된 등가물을 나타낸다. 본원에서 사용되는 모든 백분율 및 비율은 달리 언급하지 않는 한, 중량 기준이다.
혈액은 심장의 펌핑 작용에서 유래된 동압으로 동맥과 정맥 모두를 통해 이동한다. 폐쇄 순환계에서, 정맥 역류량은 심박출량과 동일해야 한다. 대부분의 동압은 동맥 순환에서 소멸된다. 남아있는 에너지는 정맥계로 방출된다. 정상 상황에서, 모세혈관의 정맥 끝에서의 압력은 12-18 mmHg이고, 4~7 mmHg의 동맥 압력으로 점차 떨어진다. 반듯이 누웠을 때 중력 압력은 중립이 되고 혈액은 이러한 동압 구배에 따라 흐른다. 호흡에 의한 움직임 역시 누워있는 자세에서 정맥 역류량에 강하게 영향을 주지만, 사지가 늘어져 있을 때에는 효과가 거의 없다.
정수압은 우심방 아래 혈액 기둥의 무게에서 유래한다. 혈액의 밀도와 중력 가속이 정수압을 결정한다. 정수압과 중력 압력은 심방 아래 cm에서 수직 거리의 일정 배율(0.77 mmHg/㎝)로 표현된다. 압력은 똑바로 있으나(앉거나 서있음) 움직이지 않을 때 가장 높다. 그러나, 측정된 압력은 또한 근수축과 같은 외부 요인들을 반영한다. 다른 외부들 요인도 접이식 정맥 도관을 통해 흐름을 변경한다. 호흡 중에, 횡격막 수축은 복강내와 하지 정맥의 압력을 증가시킨다. 복수(ascites) 및 비만은 누워있을 때조차 유사한 압력 증가를 생성한다.
늘어진 팔에서 압력은 심방과 첫 번째 늑골 간의 수직 거리를 반영한다. 똑바로 있는 대상체 내 심방 위에 있는 팔 정맥은 머리와 목의 두개외 정맥처럼 급격히 쇠퇴할 것이다. 그러므로, 심방 위 정맥 구조 내 압력은 0 아래로 떨어지지 않는다. 정맥 판막이 선천적으로 없을 때 조차도, 부종 및 역류는 팔에서 드물다. 고립성 중심 정맥 혈전증은 보통 일시적인 근위 부종만을 생성한다.
늘어진 하지에서 심장까지 혈액의 정맥 역류는 하지 근육 펌프에 의한 혈액의 분출에 의해 유능한 정맥 판막의 도움을 받아 이루어진다. 판막은 혈액의 정수 기둥을 분절로 나누고 역행 정맥류를 방지하는 기능을 수행한다. 슬와 안 분절(infrapopliteal segment) 내 더 많은 판막은 그들의 더 큰 기능적 중요성을 시사하나, 정수압이 대퇴부 또는 슬와 정맥의 무능을 바로잡음으로써 유의적으로 바뀔 수 있다. 관통 정맥 판막은 심부에서 표면으로 흐르지 못하게 하며, 종아리 펌프의 압력/흐름 관계와 일치하는 개념이다. 발의 관통 정맥은 예외적이다; 이방향성 흐름이 정상인 것으로 간주된다.
판막 성형술, 자동 이식 및 신판막 구축과 같은 재건 심정맥 수술은 기존의 치료에 실패한 환자에 궤양 치유 속도를 향상시키고 궤양이 없는 기간을 제공하는 옵션인 것이 입증된다. 그러나, 이러한 절차의 지속성이 문제로 남아있다. Rosales A. et al., Venous valve reconstruction in patients with secondary chronic venous insufficiency, Eur. J. of Vascular and Endovascular Surgery, (2008), 36:466-72를 참조하시오. 또한, Rosales A. et al., External venous valve plasty (EVVP) in patients with primary chronic venous insufficiency ( PCVI ), Eur. J. of Vascular and Endovascular Surgery, (2006), 32:570-576; and Maleti O. & Perrin M., Reconstructive surgery for deep vein reflux in the lower limbs: techniques, results and indications. Eur. J. of Vascular and Endovascular Surgery (2011), 41:837-48을 참조하시오
본 개시는 수술 이식에 적합한 정맥 판막이 성공적으로 사망한 기증자의 정맥로부터 생체공학적으로 만들어질 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 상기 기증자의 정맥은 탈세포화되고 후에 이식 수여자로부터 자가 세포에 의해 재세포화된다. 이러한 접근법은 혈전증, 만성 심부정맥 부전증, 정맥 폐쇄 또는 정맥 역류로 인해 우회 수술 또는 혈관 정맥 션트(vascular vein shunts)를 요하는 환자에게 고려될 수 있다. 또한, 이 기술은 평생 면역억제에 대한 필요성을 배제하고, 기존 혈관 이식 솔루션 보다 낮은 리스크와 큰 이점을 가지는 유망하고 안전한 임상 접근법이다.
본 개시는 정맥을 재세포화하는 방법을 제공한다. 세포외기질(ECM)의 온전성을 유지하면서 내인성 세포의 제거를 포함하는 정맥의 탈세포화 방법이 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이 탈세포화 과정은 여러 사이클로 둘 이상의 상이한 세포 파쇄 용액의 순차 처리를 이용한다. 본 개시의 특징에 있어서, 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 검출된 바와 같이, 어떠한 핵이 남아 있지 않을 때 탈세포화를 이룰 수 있다. 상기 정맥은 기증자로부터 얻은 것일 수 있다. 본원에서, 재세포화용 정맥은 기증자로부터 얻을 수 있다; 상기 기증자는 사망자이다. 상기 기증자는 HLA 또는 조직이 일치하는 기증자일 수 있다.
본 개시는 또한 상기 탈세포화된 정맥에 세포 집단을 도입하고 상기 세포 집단을 탈세포화된 정맥 내 또는 정맥 상에서 배양하는 것을 포함하는 탈세포화된 판막의 재세포화 방법을 제공한다. 본원에 기술된 방법은 세포 및 기능성 판막을 생성하는 기능성 내피 세포 및 평활근세포로 세포 집단의 분화 및 증폭에 유용하다.
본 개시는 하지 정맥계에서 재세포화한 판막을 제공한다. 하지 정맥계는 근육 근막 아래에 있어 하지 근육을 고갈시키는 심 정맥; 심근막 위에 있어 피부 미소순환을 드레인하는 표재성 정맥; 및 근육 근막을 관통하고 표재성 정맥과 심정맥을 연결하는 관통 정맥을 포함한다. 교통 정맥은 동일 구획 내에서 정맥을 연결한다. 상기 표재성 정맥, 심정맥 및 대부분의 관통 정맥은 정상 정맥계에서 일방향 흐름을 보장하는 이첨판을 포함한다. 본 발명은 이첨판의 재세포화 및 정맥계의 일방향 흐름을 회복하는 이첨판의 용도를 제공한다.
본 개시는 대복재정맥(great saphenous veins)과 표재성 정맥의 전후부 대복재정맥(anterior and posterior accessory great saphenous veins)에서 판막의 재세포화를 제공한다. 내측 표면계의 원칙 정맥(principle veins)은 대복재정맥과 전후부 대복재정맥이다. 본 개시는 복재소반(saphenous subcompartment) 및 복재근막의 판막이 재세포화되는 것을 제공한다. 복재근막은 복재소반을 덮고, 표면 구획에서 다른 정맥에서 대복재정맥을 분리한다. 본 발명은 소복재정맥(SSV)에서 판막이 재세포화되는 것을 제공한다. 상기 소복재정맥은 다리의 가장 중요한 후표재성 정맥이다.　가장 일반적으로 무릎 주름에 바로 인접하도록 연결하면서, 상기 소복재정맥은 발의 외측부에서 비롯되서 슬와정맥으로 드레인한다. 본 개시는 복재간(intersaphenous) 정맥의 판막이 재세포화되는 것을 제공한다. 상기 복재간 정맥(구. 자코미니 정맥)은 소복재정맥과 대복재정맥을 연결한다.
본 개시는 표재성 대퇴정맥(심정맥)에서 판막의 재세포화를 제공한다. 표재성 대퇴정맥(심정맥)(또한 대퇴정맥으로도 알려짐)은 일반적인 대퇴정맥에 슬와정맥을 연결한다. 본 개시는 종아리 심정맥(전후 경골 및 비골 정맥)의 판막이 재세포화되는 것을 제공한다.
본 개시는 탈세포화된 정맥의 루멘에 내피세포 및/또는 평활근세포, 및/또는 내피 및/또는 평활근세포의 간세포의 집단을 도입함에 의한 정맥 내 판막의 재세포화 방법을 제공한다. 상기 세포 및/또는 간세포의 집단을 탈세포화된 정맥과 배양함으로써 상기 정맥에서 판막을 재세포화한다. 본 개시의 재세포화된 판막은 정상 폐쇄시간(즉, 능력)을 복원하고, 정상적인 건강한 판막과 유사한 역류 압력을 견딘다.
판막의 재세포화 방법에서, 말초정맥혈 또는 전혈에 존재하거나 그로부터 유래한 세포 집단은 탈세포화된 정맥과 배양된다. 본 개시는 세포 집단이 동종인 것을 제공한다. 본 개시는 세포 집단이 자가인 것을 제공한다. 세포 집단은 말초정맥혈 또는 전혈로부터 수집되거나 그 내에 존재한다. 본 발명은 말초 정맥혈 또는 전혈이 동종 기증자로부터 얻은 것을 제공한다. 본 발명은 말초정맥혈 또는 전혈이 자가인 것을 제공한다. 본 발명은 탈세포화된 정맥을 동종 말초정맥혈 또는 동종 전혈과 배양하는 것을 제공한다. 본 개시는 탈세포화된 정맥을 동종 전체 혈액과 배양하는 것을 제공한다. 본 개시는 탈세포화된 정맥을 자가 말초정맥혈 또는 자가 전혈에서 배양하는 것을 제공한다.
본 개시는 탈세포화된 정맥을 제공한다. 상기 정맥은 탈세포화 단계가 1회("사이클"로 정의) 이상 반복하는 방법에 의해 탈세포화된다. 본 개시는 정맥의 탈세포화가 2-16회 사이클을 포함하는 것을 제공한다. 본 개시는 정맥의 탈세포화 방법이 14회 사이클을 포함하는 것을 제공한다.
2~16회 탈세포화 사이클을 포함하는 방법으로 탈세포화한 후의 정맥은 핵이 없고(면역조직화학 분석에서 핵에 대해 음성임), HLA 클래스 I 항원이 감소되어 있거나 없으며(면역조직화학 분석에서, HLA 클래스-I 항원에 대해 덜 염색되거나 음성임), HLA 클래스 II 항원이 감소되어 있거나 없다(면역조직화학 분석에서, HLA 클래스-II 항원에 대해 덜 염색되거나 음성임). 2-16회 탈세포화 사이클 후, 정맥은 콜라겐과 황산 글리코사미노글리칸(GAG)이 감소되고, 탈세포화되지 않은 정맥에 비해 엘라스틴이 증가되는 특징을 갖는다. 탈세포화는 탈세포화되지 않은 정맥에 비해 탈세포화된 정맥에서 DNA를 감소시킨다.
본 개시는 탈세포화 정맥 내 판막 재세포화를 제공하며, 상기 재세포화된 판막은 핵을 가지며 CD31 양성이다. 재세포화된 판막이 있는 정맥은 외막에서 스핀들 형상의 평활근세포를 가지며, 내피세포 마커 vWF에 대해서는 양성이다.
본 개시는 기능성 판막을 달성하는 방법에 의해 탈세포화된 정맥에서 재세포화 판막을 제공한다. 기능성 판막은 정상 폐쇄 시간(즉, 능력)을 가지고 정상 수준의 역류 압력을 견딘다.
본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에 이식 후 보행 시 모세혈관의 정맥 말단에 12~18mmHg의 압력으로 복원하는 재세포화된 판막을 제공한다. 움직이지 않는(예, 앉아있는) 대상체에서 본 개시의 재세포화된 판막은 약 100 mmHg의 하지 정맥압(높이에 의존)을 달성한다. 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에 그래프트한 후 심방 아래 cm에서 수직 거리의 일정 배율(0.77 mmHg/㎝)로 표현되는 정수압과 중력 압력을 복원하는 재세포화된 판막을 제공한다. 그래프트 시, 재세포화된 판막은 이를 필요로 하는, 똑바로 있으나(앉거나 서 있는), 움직이지 않는 대상체에서 정상적인 가장 높은 수준의 압력을 복원한다.
본 개시는 재세포화된 판막이 인 비트로 유동 회로(flow circuit)에서 약 100 mmHg의 정상 수준 역류압을 달성하는 것을 제공한다.
하지 근육 펌프에 의한 혈액의 분출에 의해 유능한 정맥 판막의 도움을 받아 늘어진 하지에서 심장까지 혈액의 정상적인 정맥 역류가 되기 위한 판막의 재세포화를 제공한다. 본 개시의 재세포화된 판막은 혈액의 정수 기둥을 분절로 나누고 역행 정맥류를 방지하는 기능을 제공한다. 본 개시는 슬와 안 분절(infrapopliteal segment) 내 더 많은 판막 회복에 사용하기 위한 재세포화된 판막을 제공한다. 본 개시는 대퇴부 또는 슬와 정맥의 무능을 바로잡음으로써 정수압 변경으로 인한 증상 완화에 사용하기 위한 재세포화된 판막을 제공한다. 본 개시는 재세포화된 관통 정맥 판막이 심부에서 표면으로 흐르지 못하게 하며, 종아리 펌프의 압력/흐름 관계를 회복하는 것을 제공한다. 본 개시는 발의 관통 정맥에서 재세포화된 판막은 정맥을 통해 혈액의 이방향성 흐름을 회복하는 것을 제공한다.
본 개시는 재세포화된 판막이 있는 정맥 분절을 대상체에 그래프팅하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성정맥부전증(CVI) 및/또는 다리 궤양의 증상을 치료하거나 완화시키는 방법을 추가로 제공한다. 상기 재세포화 방법은 하나 이상의 단계를 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 단계를 포함한다: 인간 동종 대퇴 정맥 판막이 있는 분절을 수확하는 단계; 2-16 회 사이클에서 대퇴 정맥에서 정맥을 탈세포화하는 단계; 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계; 항응고제로 탈세포화된 정맥을 관류시키는 단계; 수집된 혈액으로 탈세포화된 정맥을 몇 시간 동안 관류시키는 단계; 혈액을 버리고 완충용액으로 정맥을 세척하는 단계; 및 처음엔 하루 이상 내피세포 배지로 정맥을 관류시키고, 그런 다음 하루 이상 평활근 배지로 정맥을 관류시키는 단계; 그리고 탈세포화된 판막을 재세포화시키고; 여기서, 재세포화된 판막은 대상체에 그래프팅 시 CVI 및/또는 다리 궤양을 치료하거나 완화시킨다.
본 개시의 판막 탈세포화 단계는 세정제 및 유기인계 화합물에서 판막이 있는 정맥을 처리하는 단계를 포함한다. 상기 판막은 트리톤 및 트리-n-부틸 포스페이트 및 DNAase에서 탈세포화된다.
2-6일 동안 내피세포 배지에서 정맥을 관류시킨 다음, 2-6일 동안 평활근 배지에서 정맥을 관류시켜 탈세포화된 판막을 재세포화하였다. 하나의 양태에서, 인 비트로에서 탈세포화된 정맥를 배양한다.
상기 재세포화된 판막은 CD31 양성이다. 상기 재세포화된 판막은 첫 번째 피크에서 0.8 N 이상 힘의 기계적 특성을 가진다.
본 개시는 심정맥 역류 및/또는 정맥성 고혈압으로 인한 다리 재발암을 재세포화된 판막이 있는 정맥을 사용하여 치료하는 방법을 포함한다. 본 개시는 심정맥 역류 및/또는 정맥성 고혈압으로 인한 다리 재발암을 치료함에 있어서 재세포화된 판막이 있는 정맥의 이용을 포함한다.
본 개시는 여기에 기술한 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 판막을 포함하며, 여기서 재세포화된 판막은 CD31 양성이다. 재세포화된 판막은 또한 평활근 액틴 양성, vWF 양성일 수 있고/있거나 스핀들 형상의 평활근세포의 존재에 의해 특성화될 수 있다. 재세포화된 판막은 첫 번째 피크에서 0.8 N 이상 힘의 기계적 특성을 가진다.
본 개시는 또한 삽입 또는 그래프팅용으로 여기에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 판막의 용도를 포함하며, 여기서 재세포화된 판막은 CD31 양성이다. 재세포화된 판막은 또한 평활근 액틴 양성, vWF 양성일 수 있고/있거나 스핀들 형상의 평활근세포의 존재에 의해 특성화될 수 있다. 재세포화된 판막은 첫 번째 피크에서 0.8 N 이상 힘의 기계적 특성을 가진다.
본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에 그래프팅 시 허벅지에서 무능한 판막의 증상을 치료 및/또는 개선하는 판막의 재세포화를 제공한다.
하나의 양태에서, 상기 증상의 치료 및/또는 개선은 근육 펌프 및 정맥성 판막 간의 정상 작동 관계를 회복함으로써 달성된다. 하지 근육 펌프는 발, 종아리 및 허벅지의 것을 포함한다. 이 중, 종아리 펌프는 가장 효율적이므로 가장 중요하며, 가장 큰 용량을 가지고 있으며, 가장 높은 압력(근육 수축 동안 수은의 200 mm)를 생성한다. 정상 사지는 1500 내지 3000 cc의 종아리 부피, 100 내지 150 cc의 정맥 부피를 가지며, 단일 수축 시 40% 내지 60%의 정맥 부피를 배출한다.
수축 동안, 비복근 및 가자미근이 혈액을 큰 용량으로 슬와 및 대퇴 정맥으로 보낸다. 본 개시의 재세포화된 판막은 부압(negative pressure)을 생성하고, 유능한 관통 정맥을 통해 표재성 정맥계에서 심정맥계로 혈액을 이동하면서 차후의 이완 동안 역행 흐름(역류)를 예방한다. 재세포화된 판막은 동맥 유입이 정맥 배출과 같아질 때까지 정맥압을 점차적으로 낮춘다. 본 개시는 대상체에서 실험이 끝날 때, 정지하고 있는 정맥압에 대해 느린 복귀를 유발하면서 재세포화된 판막이 있는 정맥이 모세혈관상을 서서히 채운다.
근육이 대퇴 정맥을 둘러싸고 있긴 하나, 정맥 복귀에 대한 대퇴 근육 수축의 기여는 종아리 근육 펌프와 비교하여 매우 적다. 이동 동안 플랜터 정맥 망(planter venous plexus)의 압축에 의한 펌핑 작용은 종아리 펌프를 준비시킨다. 다양한 다리 펌프들이 말단에서 몸쪽 끝까지 정맥혈을 복귀하기 위해 유능한 판막 기능과 함께 작동한다. 본 개시의 재세포화된 판막은 말단에서 몸쪽 끝까지 정맥혈을 복귀하기 위해 기능성 다리 펌프를 회복하는데 사용된다.
탈세포화의 방법
사체들로부터 총 12개의 표본을 수득하여 판막 폐쇄 시간 및 역류압에 대한 저항을 측정함으로써 기능을 시험하였다. 사망-수득 간의 중앙치의 시간은 3일(2-6일)이었고 사망-시험 6일 (5-7일)이었다. 스웨덴으로 샘플을 운송하기 전에, 100 mmHg의 압력에서 사체 표본 12개 중 8개에서 정상 폐쇄 시간 (≤ 0.5초)가 등록되었다. 두 개의 정맥 분절은 정상 폐쇄 시간을 나타내지 않았다. 추가로 운송된 10 개의 기능적 표본 중 2개는 탈세포화의 시작 전에 이미 판막 내 기계적 손상을 나타내었고 재세포화 후에도 불능이 남아 있었다. 정맥 표본의 중앙치의 직경은 9.8 mm (7.5-14)이었고, 재세포화 후 9.8 mm (8-14.2)이었다.
본 개시는 판막-포함 정맥 내 판막을 탈세포화하기 위한 방법 및 재료에 대해 제공한다. 여기에서 사용된, "탈세포화"는 판막으로부터 세포를 제거하는 과정을 말한다. 효과적인 탈세포화는 조직 밀도 및 조직화, 최종 산물에 대해 원하는 기하학적 그리고 생물학적 특성, 및 목적하는 임상적 적용과 같은 인자들에 의해 지시된다. ECM 온전함과 생체활성이 보전된 판막의 탈세포화는 당업자에 의해, 예를 들어, 특정 시약 및 과정 중의 테크닉을 선택함으로써, 최적화될 수 있다.
탈세포화에 가장 효과적인 시약은 세포충실성, 밀도, 지질 함량 및 정맥의 두께를 포함한 많은 인자들에 의해 결정될 것이다. 대부분의 세포 제거 시약 및 방법들은 ECM 조성을 변경할 수 있을 것이고, 어떠한 정도의 초미세구조 붕괴를 야기할 수 있으나, 이들의 원치 않는 효과는 최소화하는 것이 바람직함을 이해할 것이다. 당업자는 여기에서 기술된 바와 같은 탈세포화 과정을 쉽게 최적화하여 ECM 스캐폴드의 붕괴를 최소화할 수 있을 것이다.
하나 이상의 세포 붕괴 용액이 판막-포함 정맥을 탈세포화하는데 사용될 수 있다. 세포 붕괴 용액은 일반적으로 SDS, PEG, 또는 트리톤 X와 같은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 세포 붕괴 용액은 용액이 세포와 삼투압적으로 맞지 않는 물과 같은 것을 포함할 수 있다. 다르게는 세포 붕괴 용액은 세포와 삼투압적 적합성을 갖는 버퍼(예컨대, PBS)를 포함할 수 있다. 세포 붕괴 용액은 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 하나 이상의 콜라게나아제, 하나 이상의 디스파아제(파이브로넥틴, 콜라겐 IV, 및 콜라겐 I 제거 포스테아제), 하나 이상의 DNase, 또는 트립신과 같은 프로테아제와 같은 효소를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 세포 붕괴 용액은 또한 또는 대안적으로 하나 이상의 효소의 저해제(예컨대, 프로테아제 저해제, 뉴클레아제 저해제 및/또는 콜라게나아제 저해제)를 포함할 수 있다.
본 개시는 정맥이 둘 또는 그 이상의 상이한 세포 붕괴 용액으로 연속적으로 처리됨을 제공한다. 예를 들어, 첫번째 세포 붕괴 용액은 1% 트리톤 X-100® (x100, Sigma, Sweden)을 함유하고, 두번째 세포 붕괴 용액은 1% 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP) 28726.1, VWR, Sweden)를 함유하고, 세번째 세포 붕괴 용액은 0.004 mg/ml 데옥시리보뉴클레이즈 I (DNase I) (D7291, Sigma, Sweden)을 함유한다. 연속적 처리는 처리 순서 중에 세포 붕괴 용액 중 적어도 하나로 처리를 반복하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 정맥은 원하는 수준의 탈세포화가 달성될 때까지 동일한 순서로 하나 이상의 세포 붕괴 용액의 연속적 처리를 포함하는 탈세포화 사이클에 의해 처리될 수 있다. 본 개시는 탈세포화 사이클의 수가 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 19, 또는 적어도 20 사이클인 것을 제공한다. 원하는 탈세포화에 필요한 사이클의 수는 핵, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 항원의 존재 및 정맥 내 세포의 존재에 대한 다른 표식들을 모니터링하는 것을 통해 결정된다. 탈세포화된 정맥 상에 존재하는 핵의 부재는 정맥의 탈세포화 수준에 대한 표시자이다.
본 개시는 각 세포 붕괴 용액이 항생제(즉, 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 디소듐염 디하이드레이트(EDTA), 및/또는 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)와 같은 추가적 성분을 더 포함할 수 있음을 제공한다. 예를 들어, DNase I 를 포함하는 세포 붕괴 용액은 또한 상기 세포를 활성화시키기 위한 칼슘 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드(A12858, Life Technologies)도 포함할 수 있다.
관류 방법은 정맥의 탈세포화를 위한 세포 붕괴 용액(cellular disruption solution)으로 판막-포함 정맥을 처리하기 위해 사용될 수 있다. 관류의 방향(예컨대, 전방 및 역방)을 변경하는 것은 판막-포함 정맥을 효과적으로 탈세포화하는 것을 도울 수 있다. 여기에서 기술된 바와 같은 탈세포화는 판막-포함 정맥을 싸고 있는 세포들을 안에서부터 밖으로 필수적으로 제거하여, ECM에 대해 매우 적은 손상을 준다. 조직의 크기 및 세포 붕괴 용액 내 특정 계면활성제 및 계면활성제의 농도에 따라, 판막-포함 정맥은 세포 붕괴 배지로 조직 그램 당 일반적으로 약 2 내지 약 12시간 관류된다. 세척을 포함하여, 기관은 조직 그램 당 약 12 내지 약 72 시간까지 동안 관류될 수 있다. 관류는 일반적으로 박동성 흐름, 속도 및 압력을 포함한 생리학적 조건에 따라 조정된다. 여기에서 기술된 관류 탈세포화는 예를 들어 US6,753,181 및 6,376,244에 기술된 담지 탈세포화(immersion decellularization)과 비교될 수 있다.
본 개시는 판막-포함 정맥이 세포 붕괴 용액으로 채워지고 동시에 정맥의 탈세포화를 위해 교반되는 것을 제공한다. 상이한 세포 붕괴 용액들이 순차적 순서로 가해지고 원하는 수준의 탈세포화가 달성될 때까지 상기 순서는 다회 반복된다. 예를 들어, 정맥의 한쪽 말단은 열려 있는 것이 유지되어 있는 반면 열려 있는 나머지(즉, 마모(abrasions) 및 브랜치)는 흘림을 방지하기 위해 봉합되어 있다. 정맥은 우선 항생제(0.5% 페니실린, 0.5% 스트렙토마이신 및 0.5% 암포테리신 B)를 함유하는 PBS로 헹군다. 그런 다음, 정맥을 72시간 동안 증류수로 헹군다. 각각의 탈세포화 사이클은 바람직하게는 1% 트리톤 X로 3시간, 그 다음 1% TnBP로 3시간, 및 0.004 mg/ml DNase I로 3시간 동안 인큐베이션하는 것으로 구성된다. 마지막으로 정맥을 세포 잔해물을 제거하기 위해 증류수로 밤새 세척한다. 각각의 인큐베이션 기간 동안, 정맥은 세포 붕괴 용액으로 채워지고 클램프로 폐쇄한다. 그런 다음, 정맥을 37℃에서 교반기 상에서 부드럽게 흔들면서 인큐베이션 시간(3시간 또는 밤새) 동안 둔다. 각각의 인큐베이션 기간의 끝에서, 판막-포함 정맥의 내용물을 제거하고 정맥을 PBS로 헹군다. 교반과 함께 (트리톤 X®, TnBP, DNaseI 및 물세척의) 7 내지 9 사이클 후, 정맥을 PBS로 48시간 동안 연속적으로 세척한다(여기에서 PBS는 6시간 마다 교체되었다). 계면활성제(트리톤 X® 또는 TnBP)의 농도를 변경하는 것은 필요에 따라 또는 당업자의 재량에 따라 이용될 수 있다. DNase와 같은 효소의 농도를 변경하는 것은 필요에 따라 또는 당업자의 재량에 따라 이용될 수 있다.
본 개시는 탈세포화된 판막-포함 정맥을 재세포화 단계 이전에 멸균하는 것을 제공한다. 예를 들어, 멸균 공정은 0.1% 과산화아세트산를 포함하는 멸균 PBS 중에서 탈세포화된 정맥을 1시간 동인 인큐베이팅 후, 멸균수 및 PBS로 각 용액으로 4시간 동안 세척하는 것을 포함한다.
본 개시는 판막-포함 정맥을 적합한 계면활성제, 예컨대, 트리톤®, 및 용매/계면활성제(예컨대, 2-퍼센트 트리(n-부틸)스페이트 (TNBP))로 처리하고, 선택적으로 상기 배양의 탈세포화를 위해 DNase로 처리하는 것을 포함한다. 판막-포함 정맥은 2 내지 16 사이클로 계면활성제, 예컨대, 트리톤®, 및 용매/계면활성제(예컨대, 2-퍼센트 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)로 처리 및 선택적으로 DNase로 처리함으로써 탈세포화된다. 본 개시는 판막-포함 정맥이 계면활성제 및 용매/계면활성제로 14 사이클로 처리되는 것을 제공한다. 판막-포함 정맥의 탈세포화 방법은 탈세포화 후 정맥의 샘 또는 크기의 변경을 야기하지 않는다. 판막-포함 정맥의 탈세포화는 14 사이클 후 정맥 내 핵의 상실을 야기한다(도 2C 참조). 탈세포화의 최초 사이클들에서, 정맥은 풍부한 양의 콜라겐은 갖고 있지만 핵은 갖고 있지 않다(도 3A & B 참조).
본 개시는 탈세포화된 정맥이 HLA 클래스-I 또는 II 항원에 대해 음성인 것을 특징으로 하는, 판막-포함 탈세포화 방법을 제공한다. 본 개시는 세포외 기질(ECM)의 콜라겐 및 GAGs의 유의한 상실을 가져오되, ECM 내 엘라스틴의 수준은 증가되는 탈세포화 방법을 제공한다. 본 개시의 탈세포화된 판막 정맥은 정상(즉, 비-탈세포화된) 정맥과 비교하여, 콜라겐 및 GAGs의 유의한 상실 및 엘라스틴에서의 유의한 증가를 가져온다. 현재 개시의 탈세포화 프로토콜은 탈세포화된 정맥 내 DNA 양에서 유의한 감소를 이끈다(예컨대, 정상 정맥 내 241.95±39.44 ng/mg의 조직으로부터 탈세포화된 정맥에서 22.44±6.29 ng/mg).
동종의 판막을 효율적으로 재세포화하고 생산하기 위해, ECM의 형태(morphology)와 구조(architecture)가 탈세포화 동안 또는 후에 유지되는 것(즉, 실질적으로 온전히 남아 있는 것)이 중요할 수 있다. 여기에서 사용된 "형태(morphology)"는 기관 또는 조직의 또는 ECM의 전체적인 형태를 말하는 반면, 여기에서 언급한 "구조(architecture)"는 외부 표면, 내부 표면 및 그리고 그들 사이의 ECM을 말한다. 탈세포화 과정이 ECM 스캐폴드의 3차원적 구조 및 생체활성을 절충할 수 없는 것을 확인하기 위하여 ECM의 형태 및 구조는 눈으로 및/또는 조직학적으로 시험될 수 있다. 염색(즉, H&E, MT 또는 VVG)에 의한 조직학적 분석은 탈세포화된 정맥 구조 및 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴과 같은 ECM 성분의 보전을 가시화하는데 유용할 수 있다. 당업계에 공지된 다른 방법 및 어세이들이 글라이코스아미노글리칸 및 콜라겐과 같은 ECM 성분의 보전을 결정하기 위해 유용할 수 있다. 중요한 것은, 잔여 신생 또는 성장 인자들이 탈세포화 후 ECM 스캐폴드에 결합되어 남아 있는 것이다. 그러한 신생 또는 성장 인자의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, VEGF-A, FRF-2, PLGF, G-CSF, FGF-1, 필리스타틴, HGF, 안지오포이에틴-2, 엔도글린, BMP-9, HB-EGF, EGF, VEGF-C, VEGF-D, 엔도셀린-1, 렙틴 및 당업계에 공지된 기타 신생 또는 성장 인자들이다.
재세포화의 방법
본 개시는 정맥 내 재생된 판막을 생성시키는 물질 및 방법을 제공한다. 재생된 판막은 여기에서 기술된 바와 같이 도너로부터의 탈세포화된 정맥을 정맥 내 루멘에서 세포의 집단과 접촉시키고 탈세포화된 정맥의 루멘에서 상기 세포 집단을 배양함으로써 생산될 수 있다. 본 개시는 탈세포화된 정맥(여기에서 정맥 내 판막은 또한 탈세포화되어 있다)을 전혈 또는 말초 혈액과 함께 배양하는 것을 제공한다. 상기 전혈 또는 말초혈액은 손상되거나 기능불량인 판막으로 인한 질병 및/또는 장애를 치료 또는 완화하는 것이 필요한 대상체의 것이다.
여기에서 사용된, "재세포화"는 탈세포화된 정맥으로 세포를 도입 또는 전달하고 상기 세포가 증식 및/또는 분화하여 결국 정상적인 판막-포함 정맥과 유사한 구조, 세포 조직화 및 생체활성을 갖는 판막으로 재생시키기도록 세포를 배양하는 것을 말한다.
본 개시는 적은 양(예컨대, 10mL-30 mL)의 전혈 또는 말초정맥혈으로 정맥 내 판막을 재세포화하는 방법을 포함한다. 구체예들에서, 상기 판막은 내피세포 간세포 및 평활근 간세포를 배양 플레이트 내에서 인 비트로 배양, 증폭 및 분화함 없이 재세포화된다. 구체예들에서, 탈세포화된 판막은 혈액으로의 관류 후, 2 내지 6일 동안의 내피세포 배지로 정맥을 관류시키고, 뒤이어 수일 동안, 예컨대 2 내지 6일 동안 평활근 배지로 정맥을 관류시켜 재세포화할 수 있다. 구체예들에서, 탈세포화된 정맥의 배양은 인 비트로 또는 엑스 비보에서 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 탈세포화된 정맥의 배양은 바이오리액터 내에서 수행될 수 있다.
본 개시는 말초정맥혈이 수집되는 항혈액응고제로 코팅된 컨테이너(즉, 헤파린 코팅된 베큐테이너 튜브)에 보관되어 가능한 빨리(예컨대 약 2 시간 이내) 실험실에 운송되는 재세포화 방법을 제공한다. 필요한 혈액의 부피는 재세포화가 수행되는 바이오리액터 내에 사용되는 파이프의 길이와 정맥의 길이에 따라 달라질 것이다.
재세포화 과정은 5% CO2가 공급되는 약 37℃의 인큐베이터에서 수행되는 관류로 수행될 수 있다. 재세포화 전에, 정맥은 항혈액응고제(예컨대, 헤파린)으로 관류된다. 항혈액응고제의 세척 후, 정맥은 원하는 속도로 수시간 동안(예컨대, 약 2 ml/min로 약 48시간 동안) 관류된다. 관류는 내피세포 배지로 약 2일 이상(예컨대, 약 4일 동안), 그리고나서 평활근세포 배지로 약 2일 이상(예컨대, 약 4일 동안) 계속된다. 관류가 수행되는 일수는 세포 또는 전혈 및 세포화 효율에 따라 조정될 수 있는 선택적 특성이다.
완전한 내피세포 배지는 약 10%의 열 불활성화된 인간 AB 혈청(Life technologies, Sweden), 약 1%의 글루타민 (Lonza, Denmark), 약 1%의 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신이 보충된 MCDB131 (Life technologies, Sweden) 기초 배지, 및 아스코르브산, 하이드로코티손, 트랜스페린, 인슐린, 재조합 인간 VEGF, 인간 섬유아세포 성장 인자, 인간 내피세포 성장 인자, 헤파린 및 젠타마이신 설페이트가 함유된 EGM2 단일 쿼트 키트(Lonza, Denmark)를 이용하여 제조될 수 있다. 완전한 평활근 배지는 약 10%의 열 불활성화된 human AB 혈청, 약 1% 페니실린-스트렙토마이신 암포테리신가 보충된 약 500 ml의 Medium 231 (Life technologies, Sweden) 및 약 20 ml의 평활근 성장 서플먼트 (SMGS) (Life Technologies, Sweden)를 이용하여 제조될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는, 내피세포 및/또는 평활근세포의 성장을 위한 다른 배지들 또한 사용될 수 있다. 정맥 스캐폴드는 총 약 10일 동안 재세포화된다.
본 개시는 재세포화를 위해 사용되는 세포들의 집단이 줄기세포 또는 간세포, 예를 들어 골수 유래 줄기 또는 간세포, 또는 CD133을 발현하는 세포(CD133+ 세포)로부터 유래한 것임을 제공한다. 줄기세포 또는 간세포는 인 비트로에서 증 폭 및 당업계에 공지된 방법에 의해 내피세포 및/또는 평활근세포로 분화될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 또는 간세포들은 내피세포 및/또는 평활근세포로의 분화를 개시하는 특정 성장인자 및 서플먼트의 존재 하에서 배양될 수 있다. 일부 측면에서, 분화된 세포들은 탈세포화된 정맥으로 도입되기 이전에 최종적으로 분화된 것이 아닐 수 있으나, 적어도 하나의 내피세포 마커(즉, CD31 또는 vWF) 또는 적어도 하나의 평활근세포 마커(즉, 평활근 액틴)을 발현할 수 있다. 여기에서 기술된 줄기세포 또는 간세포로부터 유래한 내피세포 및 평활근세포는 예를 들어, 관류에 의해 탈세포화된 정맥으로 도입된다. 내피세포 및 평활근세포의 배양은 세포들과 정맥을 내피세포 배지 또는 평활근세포 배지로 교대 사이클로 원하는 재세포화가 달성될 때까지 인큐베이팅하는 것을 포함한다.
출산 후 혈관형성(vasculogenesis)은 내피간세포(EPCs)의 순환에 의해 성인에게서 새로운 정맥의 형성이고; 혈관신생(angiogenesis)은 이미-존재하고 있는 내피세포로부터 새로운 정맥의 형성이다(Ribatti D et al., 2001). 이 두 가지 과정은 정맥의 분지 형성 및 상처 치유, 허혈, 골절 치유, 종양 성장 등과 같은 발병 상태에 기여한다 (Laschke et al., 2011). 내피세포와 내피간세포는 전혈 내 순환에서 공존하고 있으며, 내피간세포는 혈관형성에 기여한다(Asahara T et al., 1997). 또한 평활근세포에 대한 간세포 또한 순환하는 전혈에 존재한다 (Simper D et al., 2002).
본 개시는 재세포화를 위해 이용되는 세포의 집단이 전혈로부터 있음을 제공한다. 탈세포화된 정맥의 재생을 위한 전혈의 사용은 골수 또는 전혈로부터 신생적 간세포들의 아집단을 분리하고 증폭시킬 필요 없이 정맥의 효율적인 재세포화를 이끌 수 있다. 전혈은 예를 들어, 관류에 의해 탈세포화된 정맥으로 도입된다.
현재 이용할 수 있는 혈관 그래프트를 위한 방법에 대한 본 개시의 많은 장점이 있다. 본 개시는 다음의 장점이 있는 자가 유래의 가공된 정맥을 제공한다: 1) 비-면역원성이므로 그래프트 거부 또는 부정적인 면역 반응(adverse immune response)에 대해 최소한의 위험을 갖는다. 2) 면역억제에 대한 요구를 미연에 방지하므로 수술 후 환자와 그들의 수명에 대한 위험을 줄인다. 3) 길이 제한이 없다. 4) 일치하는 도너 정맥 또는 자가 유래 정맥과 비교하여 훨씬 쉽게 이용할 수 있다. 5) 천연 성분들(예컨대, ECM, 내피세포 및 평활근세포)로 구성되므로 남아있는 신생혈관 생성 인자들과 신체역학적으로 온전한 상태를 보존하면서 대부분 합성 및 인공 정맥에 비해 높은 품질을 갖는다. 6) 정맥 생산은 이식(transplant)용 자가 유래 정맥을 수확하는 것에 비해 약간 침습적이다. 7) 전체 혈액 세포를 이용하므로 대상체에게 빠르고 최소한의 침습 과정을 허용한다.
여기에서 사용된 세포 집단은 세포가 제거된 판막이 있는 정맥을 재세포화하기 위해 사용된 임의의 세포들일 수 있다. 이들 세포는 전능세포(totipotent cell), 만능세포(pluripotent cell), 또는 다기능세포(multipotent cell)일 수 있고, 예정되거나(committed), 예정되지 않은(uncommitted) 상태일 수 있다. 또한, 본원에서 유용한 세포는 미분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포, 또는 전체적으로 분화된 세포일 수 있다. 본원에서 유용한 세포는 또한 간세포(progenitor cell), 전구세포(precursor cell) 및 "성체"-유래 줄기세포를 포함한다. 정맥을 재세포화하는데 이용될 수 있는 세포의 예로, 골수-유래 줄기 또는 간세포, 골수 단핵 세포, 중간엽 줄기세포, 다기능 성체 간세포, 내피 줄기세포 같은 전체-혈액 유래 줄기 또는 간세포, 내피 간세포, 평활근 간세포, 전혈(whole blood), 말초 혈액 및 전혈에서 분리될 수 있는 임의의 세포 집단을 포함하나 이에 제한하지는 않는다. 간세포는 한 가지 타입의 세포로 분화되도록 예정된 세포로 정의한다. 예컨대, 내피 간세포는 내피세포로 분화되도록 예정된 세포를 의미한다; 평활근 간세포는 평활근세포로 분화되도록 예정된 세포를 의미한다. 본 개시는 세포가 제거된 판막이 있는 정맥을 세포화하는데 사용하기 위해 만능세포 또는 전능세포 같은 예정되지 않거나 예정된 세포의 집단을 포함하는 전혈 또는 말초 혈액 내 간세포를 제공한다. 본 개시의 특징은 전혈을 사용하여 세포가 제거된 판막이 있는 정맥을 세포화하는 것이다.
본 개시는 정맥을 재세포화하는데 사용된 동종의 세포 집단을 제공한다. 여기에서 사용된 "동종"은 파생된 기관 또는 조직(즉, 자기 또는 관련된 또는 관련이 없는 개체)과 같은 종에서 얻은 세포를 의미한다. 본 개시는 치료를 요하는 수여자 또는 대상체로부터 유래한 세포 또는 전혈을 제공한다(즉, "자가 유래").
세포 집단은 세포의 이종 집단일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전혈 세포, 또는 전혈에서 유래한 것일 수 있다. 이들 세포는 적혈구 세포, 백혈구 세포, 혈소판, 내피세포, 내피 간세포, 및 평활근 간세포를 포함한다. 순환하는 내피세포, 내피 간세포, 및 평활근세포를 위한 간세포는 혈관형성 및 신생혈관형성에 기여할 수 있는 것으로 종래기술로 알려져 있다. 그리하여, 전체 혈액 세포의 적용은 정맥 재생을 위해 내피세포 및 평활근세포로 확장 및 분화할 수 있는 세포를 세포가 제거된 정맥에 쉽게 제공할 수 있게 한다.
재세포화에 이용된 세포 집단은 세포의 이종 집단에서 분리될 수 있다. 본 개시는 골수에서 분리된 줄기 또는 간세포인 세포 집단을 제공한다. 본 개시는 전혈에서 분리된 내피세포 또는 내피 간세포(즉, 예정된 세포)일 수 있는 세포 집단을 제공한다. 이종 집단에서 특정 세포 집단을 분리하는 방법은 종래 기술로 알려져 있다. 그러한 방법으로, 림포트랩(lymphotrap), 밀도 구배, 차등 원심분리, 친화성 크로마토그래피 및 FACS 플로우 사이토메트리를 포함한다. 관심 있는 특정 세포 집단을 동정하기 위해 종래 기술로 알려진 마커들을 이종 집단에서 세포를 분리하는데 사용할 것이다. 예컨대, CD133은 골수에서 유래된 줄기세포 또는 줄기-유사 세포의 표면에서 발현되는 것으로 알려져 있다. CD133+ 세포의 선별은 MAC 비드 및 CD133을 인식하는 특이 항체를 사용하여 얻을 수 있다. 또한, 관심 있는 세포 집단을 정제하기 위해 내피 간세포 또는 평활근세포 간세포에 대한 특이 마커가 이용될 수 있다.
임의의 양태에서, 세포 집단은 세포가 제거된 정맥에 도입하기 전 인 비트로에서 배양될 것이다. 인 비트로에서 배양하는 목적은 세포 수를 확장하고, 관심 있는 특정 세포 계통으로 세포를 분화하는 것을 포함한다. 본 개시는 인 비트로에서 배양하기 전 이종 집단에서 최초로 분리될 세포 집단을 제공한다. 본 개시는 골수-유래 줄기세포 또는 간세포(즉, CD133+ 세포) 및 세포가 제거된 정맥에 도입하기 전 인비트로에서 분화될 세포 집단을 제공한다. 다양한 분화 프로토콜이 종래 기술로 알려져 있으며, 예를 들어, 내피세포 또는 평활근세포로 분화를 유도하는 인자, 시약, 분자 또는 화합물이 첨가된 성장 배지에서 세포를 성장시키는 것을 포함한다.
정맥을 생성하기 위해 세포가 제거된 정맥에 도입되는 세포 수는 정맥의 크기(즉, 길이, 직경 또는 두께) 및 재세포화에 사용된 세포의 종류(즉, 줄기세포 대 더 분화된 세포, 예컨대, 전혈)에 달려있을 것이다. 세포의 종류에 따라 이들 세포가 도달할 집단 밀도는 다른 양상을 가질 것이다. 예를 들어, 세포가 제거된 기관 또는 조직은 적어도 약 1000개(즉, 적어도 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 또는 100,000,000)의 세포로 "씨딩"할 수 있다; 또는 그것에 부착된 조직 1mg(습중량, 즉, 세포 제거 전 습중량) 당 약 1000개 내지 약 10,000,000개의 세포를 가질 수 있다.
세포 집단을 하나 이상의 위치에 주사하여 세포가 제거된 정맥에 도입("씨딩")할 수 있다. 또한, 하나 이상의 세포(즉, 내피세포 또는 평활근세포)를 세포가 제거된 정맥에 도입할 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 세포가 제거된 정맥의 루멘에 도입된 내피세포 및 평활근세포 둘 다를 제공한다. 선택적으로, 또는 주사뿐만 아니라, 관류를 통해 캐뉼러가 삽입된(cannulated) 세포가 제거된 정맥에 세포 집단을 도입할 수 있다. 예를 들어, 관류를 통해 세포가 제거된 정맥에 세포 집단을 도입할 수 있다. 세포의 관류 후, 확장 및/또는 분화 배지는 정맥을 통해 관류되어 씨딩된 세포의 성장 및/또는 분화를 유도할 것이다. 본 개시는 세포 집단을 도입하기 전 및/또는 동시에 투여될 헤파린 같은 항-응고제를 제공한다.
본원에서 사용된 것처럼, 확장 및 분화 배지는 내피세포 또는 평활근세포의 증식 및 내피세포 또는 평활근세포로의 분화에 필요한 첨가물 및 인자들을 포함하는 세포 성장 배지를 포함한다. 본 개시는 내피세포를 위한 성장/증식 배지와 같은 내피세포를 위한 분화 배지를 제공한다. 예를 들어, 내피 성장 또는 분화 배지에 존재하는 추가 인자들 또는 첨가물로, 아스코르브산, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 인슐린, 재조합 사람 VEGF, 사람 섬유아세포 성장 인자, 사람 내피 성장 인자, 헤파린 및 젠타마이신 설페이트를 포함하나, 이에 제한하는 것은 아니다. 본 개시는 평활근세포를 위한 성장/증식 배지와 같은 평활근세포를 위한 분화 배지를 제공한다. 예를 들어, 내피 성장 또는 분화 배지에 존재하는 추가 인자들 또는 첨가물로 평활근 성장 첨가물, 평활근 분화 첨가물, MesenPro 및 transforming growth factor β1를 포함하나, 이에 제한하는 것은 아니다. 최소한, 성장 및 분화 배지는 기본 배지(즉, MCDB131, M231, 또는 DMEM), 열처리로 불활성화된 혈청(예를 들어, 10%), 글루타민 및 항생제(즉, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신)을 포함한다.
본 개시는 고안된 재세포화를 달성할 때까지 교대로 내피세포배지 및 평활근세포배지와 씨딩된 정맥을 인큐베이션하거나 관류하는 것을 제공한다. 본 개시는 내피세포배지 및 평활근세포배지의 관류를 수회 및 교대로, 예를 들어, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 11회, 적어도 12회, 적어도 13회, 적어도 14회, 또는 적어도 15회 반복하는 것을 제공한다. 본 개시는 평활근세포배지의 관류 지속 시간과 동일한 내피세포배지의 관류 지속 시간을 제공한다. 선택적으로, 내피세포배지의 관류 지속 시간은 평활근세포배지의 관류 지속 시간과 다를 것이다. 분화 또는 성장 배지 중 어느 하나의 관류 지속 시간은 세포가 제거된 정맥에 씨딩된 세포 집단의 특성에 달려있을 수 있다. 분화 및 성장 배지의 관류 지속 시간은 당업자에 의해 결정될 것이다.
재세포화 동안, 세포가 제거된 정맥은 적어도 임의의 씨딩된 세포가 제거된 정맥 내 및 위에서 증식 및/또는 분화할 수 있는 조건에서 유지될 것이다. 이들 조건은, 적당한 온도 및/또는 압력, 전기 및/또는 기계적 활성, 포스, 적당한 O2 및/또는 CO2, 함량, 적당한 습도량, 및 멸균 또는 멸균에 가까운 조건을 포함하나, 이에 제한하지는 않는다. 재세포화 동안, 세포가 제거된 정맥 및 그것에 부착된 세포는 적당한 환경에서 유지된다. 예를 들어, 세포는 영양 첨가물(즉, 영양분 및/또는 글루코스 같은 탄소원), 외재성 호르몬 또는 성장인자들, 및/또는 특정 pH를 필요로 한다.
본 개시는 또한 여기에 기재된 대로 적당한 조건하에서 정맥을 재세포화하기 위한 생물반응기를 제공한다. 특히, 생물반응기는 정맥이 재세포화되도록 맞추기에 충분한 크기를 가진 완전히 폐쇄된 챔버, 살균될 수 있고, 펌핑 메카니즘(즉, 연동 펌프)에 연결된 세포 및/또는 배지를 공급하는 튜브, 및 정맥의 한 끝이 2개의 주입구 및 2개의 배출구에 연결된 구조를 포함한다. 정맥 및 펌프에 연결된 튜브의 셋-업은 세포 또는 배지가 정맥의 루멘을 통해 흐르도록 하고, 정맥의 주변을 흐르고, 정맥의 외부를 젖게 한다.
한 예로, 여기에 기재된 방법에 의해 생성된 정맥은 환자에 이식되는 것이다. 이 경우, 세포가 제거된 정맥을 재세포화하기 위해 사용된 세포는 재생 세포가 환자에게 "자가"이도록 환자에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 공지의 방법으로 환자에게서 얻은 세포는 다른 연령대(즉, 태아, 신생아 또는 주생기, 청소년기 동안, 또는 성인)의 혈액, 골수, 조직, 또는 기관에서 얻을 수 있다. 선택적으로, 세포가 제거된 기관 또는 조직을 재세포화하는데 사용된 세포는 환자에 대해 동계(즉, 동일한 쌍둥이로부터 얻은)일 수 있고, 상기 세포는 예를 들어, 환자의 친족 또는 환자와 관련이 없는 HLA-일치된 개체 유래의 사람 림프구 항원(human lymphocyte antigen (HLA))-일치된 세포일 수 있거나, 상기 세포는 예를 들어, HLA-일치하지 않은 도너로부터 환자에 대해 동종일 수 있다.
씨딩된 세포의 진행은 재세포화 동안 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, 세포가 제거된 정맥 또는 조직에서 또는 내에서 세포 수는 재세포화 동안 하나 이상의 시간 시점에서 생검을 얻어 평가할 수 있다. 또한, 다양한 마커들이 세포 또는 세포 집단에 존재하는지를 측정하여 세포가 겪는 분화량을 모니터링할 수 있다. 세포 종류별 및 이들 세포 종류의 분화 시기별로 연관된 마커들이 잘 알려져 있고, 항체 및 표준 면역분석, 면역형광, 면역조직화학 또는 조직학 기술을 사용하여 쉽게 검출할 수 있다. 예를 들어, 내피세포, 또는 내피 계통에서 분화된 세포의 존재를 확인하기 위해, 종래에 알려진 임의의 내피 마커들을 분석할 수 있다. 내피 마커들은 CD31, vWF, VE-카드헤린 및 AcLDL를 포함하나, 이에 제한하지는 않는다. 예를 들어, 평활근세포 또는 평활근세포 계통에서 분화된 세포의 존재를 확인하기 위해, 종래에 알려져 있는 임의의 평활근세포 마커들을 분석할 수 있다. 평활근세포 마커들은 평활근 액틴 및 비멘틴을 포함하나, 이에 제한하지는 않는다.
본 개시는 가공된 정맥의 인장 강도 실험을 제공한다. 인장 강도 실험은 종래 기술로 알려져 있다. 예를 들어, 가공된 정맥은 옆으로 잘라 고리 분절(ring segment)이 되게 하고, 방사상 변형에 의해 실험될 것이다. 인장 강도를 측정하기 위해 샘플을 완전히 깨뜨리는데 사용된 전체 포스(Total force) 및 50%의 전체 포스에서 신장을 계산할 수 있다. 본 개시는 세포가 제거된 정맥과 비교할 때 증가된 인장 강도를 나타내는 재세포화된 정맥을 제공한다. 예를 들어, 본 개시의 가공된 정맥은 세포가 제거된 정맥과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 전체 포스를 버티어 낼 수 있는 능력을 나타낼 것이다. 본 개시의 특징에서, 재세포화된 정맥은 정상 정맥과 유사하거나 같은 인장 강도를 나타낸다.
본 개시는 해부용 시체에서 회수한 사람 동종의 대퇴정맥의 판막이 있는 분절을 제공한다. 상기 분절은 세포 제거 및 재세포화 기술을 이용하여 조직-가공된다. 세포 제거 및 재세포화된 정맥(DV/RV) 분절은 생화학적, 면역-조직화학적 및 신체역학적으로 특성이 규명된다. 판막 닫힘 시간(100 mmHg) 및 역류압(reflux pressure)에 대한 저항은 인 비트로 모델에서 측정한다. DV의 DNA 정량화를 통해 세포 성분들이 만족할 만하게 제거되었음을 확인하였다. 최종 DV는 임의의 세포외 기질 단백질 및 신체적으로 온전함(mechanical integrity)을 보유하고 있었다. 판막 기계 매개변수는 세포 제거 및 재세포화 조차 네이티브 조직과 유사하다. 판막을 포함하는 스캐폴드의 루멘은 생물반응기에서 내피 및 평활근세포로 성공적으로 재씨딩된다.
(재세포화된 판막의 특성 규명)
본 개시의 세포 제거 프로토콜은 판막의 기능적 특성들을 성공적으로 보존하고 있다. 판막이 있는 조직-가공된 정맥은 향후 임상전 연구 및 궁극적으로는 임상 적용을 위한 유효한 템플레이트를 제공한다. 본 개시는 대상체에서 재세포화된 판막을 그래프팅할 때 또는 그래프팅 후, 정상 또는 거의 정상 판막으로서 기능을 발휘할 수 있는 재세포화된 기능성 판막을 제공한다. 여기에 기재된 방법들은 병에 걸린 무능한 심정맥의 교체 및 정맥 역류의 원인을 치료하는 것일 수 있다. 세포 제거 및 재세포화된 판막이 있는 정맥(DV/RV) 분절은 성공적인 임상 적용을 위해 재세포화된 판막이 있는 정맥의 기능성을 확인하기 위해 여기에서 기재된 대로 생화학적, 면역조직화학적 및 신체역학적으로 특성 규명된다.
재세포화된 판막은 내피 및 평활근세포의 존재에 대해 특성 규명된다. 내피 및 평활근세포의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 당업자에게 잘 알려진 면역조직화학 및 면역형광 기술을 사용한다. 내피세포의 존재를 시각화하기 위해, CD31 (1:200)(Abcam, Germany) 및 vWF (1:100)(Santa Cruz, Germany)에 대한 항체들을 선택하고, 재세포화된 판막의 염색에 사용하였다. 재세포화된 정맥에서 CD31 및/또는 vWF 양성 세포의 존재는 면역조직화학 및 면역형광에 의해 검출된다(도 4D, 4E, 5A 및 5B 참조). 재세포화된 판막을 염색하기 위해 평활근 액틴에 대한 항체(1:50) (Abcam, Germany)를 사용하여 평활근세포를 시각화한다. 평활근 액틴 양성 세포의 존재는 면역조직화학 분석에 의해 측정된다(도 4F 참조). 평활근세포는 또한 스핀들-형태의 근육 세포의 존재에 대해 재세포화된 판막이 있는 정맥의 세포 계통(cells lining)의 형태에 대한 면역조직화학 및 면역형광 분석을 통해 동정될 수 있다.
재세포화된 판막 및 정맥은 또한 핵의 존재에 의해 특성 규명된다. 재세포화된 판막이 있는 정맥은 DAPI에 의해 염색되며, 염색은 면역형광을 통해 시각화되어 핵의 존재를 검출한다(도 11D 참조). 재세포화된 판막 및 정맥에 대한 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 또는 메이슨 트리크롬(MT) 염색 같은 면역조직화학적 염색이 또한 핵의 검출에 적당하다(도 4A 및 4C 참조).
판막 기능 실험을 위한 다양한 방법들이 종래 기술로 알려져 있다. 용액(즉, PBS 같은 생리적으로 완충된 용액)을 정맥에 내보내어 재세포화된 판막이 있는 정맥 및 재세포화된 정맥의 누출을 실험한다. 예를 들어, 용액을 채운 주사기를 재세포화된 정맥 또는 판막의 한 끝에 삽입한다. 상기 용액을 바람직하게는 판막 또는 정맥에 지속적인 속도로 내보내고, 재세포화된 판막 또는 정맥에서 유출 또는 홀에 의한 용액의 임의의 축적을 판막 또는 정맥의 표면에서 관찰한다. 본 개시의 바람직한 특징으로, 재세포화된 판막이 있는 정맥은 실험 시 어떠한 누출도 나타내지 않는다.
본 개시는 또한, 재세포화된 판막이 있는 정맥의 기능을 인 비트로 실험, 즉, 생리적인 흐름 및 펌프 작용을 모방한 유압 류 시스템(hydraulic flow system)(생물반응기)에 의해 평가하는 것을 제공한다. 재세포화된 판막의 기능성(즉, 반응능 및 역류압 저항)을 평가하기 위해 본 연구에서 사용된 인 비트로 실험 셋업은 Geselschap JH, van Zuiden JM, Toonder IM, and Wittens, CHA. In vitro evaluation of a new autologous valve- stent for deep venous incompetence, Journal of Endovascular Therapy: An Official Journal fo the International Society of Endovascular Specialists. (2006), 13:762-769에 의해 사용된 것을 변형한 것이다. 이 모델은 일정 압력에서 정맥 판막 기능을 평가하도록 한다. 스트레스 하에서 심정맥 시스템에서 정맥을 통과하는 흐름을 모방하기 위해, 상업적인 연동 펌프를 사용하여 일정한 선행 흐름을 유지하고, 일정 압력 수준에서 서킷으로 간헐적인 흐름을 전달한다. 반응능(즉, 정상 판막 닫힘 시간) 측정을 위해 초음파용 조영제 Sonovue ™를 추가하여 흐름, 판엽상부(valve leaflet) 및 판막 닫힘의 이중 이미징이 가능하다. 예시적인 생물반응기 셋업은 도 1에 도시되어 있다.
판막이 있는 정맥은 세포 제거 및/또는 재세포화 전 또는 후에 실험한다. 정맥은 플로우 서킷(flow circuit)에서 세로로 탑재되고, 실온 식염수로 관류시킨다. 정맥은 원뿔형 커넥트에 의해 상기 플로우 서킷에 연결되고, 양끝에서 봉합된다. 기계 판막은 연동 펌프에서 배출 동안 서킷을 통과하는 흐름 방향을 조절하는데 사용된다. 초음파 도플러 기술은 정맥 판막 부위에서 잠재적 역류를 검출하는데 사용된다.
여기에서 사용된 대로 판막 반응능은 판막 닫힘 시간, 또는 흐름의 정지 때까지 흐름 역전 시간을 의미한다. 정상 기능을 수행하는 판막의 판막 닫힘 시간은 0.5초와 같거나 작다. 따라서, 본 개시의 바람직한 특징으로, 본 개시의 재세포화된 판막은 0.5초와 같거나 작은 판막 닫힘 시간(또는 반응능)을 갖는다.
여기에서 사용된 대로, 정맥 역류는 심장 쪽으로의 혈류 방향에 대해 반대 방향 혈류를 의미한다. 정상 기능을 수행하는 판막은 약 100 mmHg의 역류압을 견뎌내거나 저항할 수 있고, 7 내지 12 걸음을 걷는 동안 평균 약 18 mmHg 내지 약 25 mmHg로 감소될 수 있다. 다른 말로, 정상 기능을 수행하는 판막은 닫힌 채로 남아있어 100 mmHg 까지의 압력에 대해 역류를 방지하고, 7 내지 12 걸음을 걷는 동안 평균 약 18 mmHg 내지 약 25 mmHg로 감소된다. 재세포화된 판막은 정상 판막에 의해 저항되는 역류압, 즉 100 mmHg의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%로 견뎌내는 능력을 나타낸다.
정상 판막으로 기능을 수행하는 재세포화된 판막의 능력은 또한 판막의 신체역학적 특성들을 실험하기 위한 다양한 분석들을 사용하여 실험할 수 있다. 강도 또는 전단 응력을 실험하는 인스트론 기계, 또는 다른 기계가 재세포화된 판막의 기계적 특성들을 측정하는데 적당하다.
본 개시는 가로 방향에서 판막을 찢어 정맥 판막의 기계적 특성들을 평가하는 것을 제공한다. 선택적으로, 기계에 의한 평가를 촉진하기 위해 봉합이 사용될 수 있다. 특히, 폴리프로필렌에 의해 제조된 4-0 비흡수성 단섬유 봉합사는 실험 판막에 부착되어 인스트론 기계로의 로딩을 촉진한다(도 9 참조). 이미 예정된 프리-로드(pre-load)는 0.1N 같이 실험을 위한 시작점으로 사용된다. 실험 판막을 가로로 찢기 위해 20 mm/분의 실험 속도를 사용한다. 실험 판막을 시간별로 늘리고(기계적으로), 연장 거리(즉, mm)의 함수로 포스를 측정한다. 1차 찢기 때까지 실험 정맥에 의해 견딘 포스를 첫 번째 피크로 정한다. 정상 기능을 수행하는 정상 정맥은 첫 번째 피크에서 약 0.8N 포스를 견딜 수 있다.
판막을 포함하는 정맥은 여기에 기재된 방법을 사용하여 세포가 제거되고, 재세포화되며, 정상 정맥과 비교하여 그것의 신체역학적 특성들을 실험하였다. 판막의 기계적 분석은 재세포화된 판막이 있는 정맥의 4/6과 실험된 정상 판막이 있는 정맥의 1/4이 기능을 수행하고 있음을 보여주었다(도 6 참조). 각 정맥에서 한 쌍의 판막이 존재하며, 각 쌍의 판막에 대해 첫 번째 피크에서 포스를 측정하였다. 기능을 수행하는 정맥과 그렇지 않은 정맥 간의 차이를 발견하기 위해 첫 번째 피크에서 포스를 분석하였다. 얻은 결과를 기반으로 하여, 쌍으로 있는 판막 중 심지어 하나만 실패하여도 정맥의 기능성에 영향을 주기에 충분하다. 바람직하게는, 여기에 기재된 방법들에 의해 얻은 재세포화된 판막은 정상 판막에 의해 견뎌내는 첫 번째 피크에서 포스, 즉 0.8 N의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%를 견뎌낼 수 있다. 선택적으로, 재세포화된 판막은 첫번째 피크에서 0.8 N 이상의 포스를 견뎌낸다.
여기에 기재된 대로, 말초 전혈의 관류는 재세포화된 판막이 있는 정맥의 배지에서 명백한 내피세포 단일층 형성과 평활근세포의 존재를 유도한다. 기능과 강도는 인 비트로 반응능 및 역류압 저항 실험 모델 및 신체역학적 인열 시험을 이용하여 측정된 것으로, 재세포화된 정맥 판막에서 보존된다. 정맥 분절을 재세포화하는데 단순히 말초 혈액 샘플을 사용하는 것은 골수 또는 말초 혈액으로부터 성숙 세포/줄기 세포의 분리 및 확장과 같은 더 지루한 접근에서 명백한 장점이 있다. 또한, 이들 결과는 자가 유래 말초 전혈을 이용하여 조직-공학적 정맥의 두 소아 환자들에게의 성공적인 이식에 의해 지지된다.
(치료 방법 또는 이용)
정맥 분절을 포함하는 조직-공학적 판막은 심정맥 역류 및 정맥성 고혈압이 주요 병태생리여서 다리 궤양이 재발된 선별된 환자들에서 치료적 대안일 수 있다. 본 개시는 본 개시의 재세포화된 판막 및 재세포화된 판막이 있는 정맥을 그것을 필요로 하는 대상체에 도입하거나 그래프팅하여 정맥성 장애, 즉, 심정맥 혈전증(deep vein thrombosis, DVT), 만성 정맥 부전증(chronic venous insufficiency, CVI)(또한 정맥염후 증후군(postphlebitic syndrome)이라 부름), 및/또는 정맥류성 정맥(varicose vein)을 치료 및/또는 완화하는 방법을 포함한다.
본 개시는 만성 정맥 부전증 및 다리 궤양의 치료를 위해 도너 판막이 있는 정맥에 대해 세포를 제거하고 재세포화하는 방법을 제공한다. 여기에 기재된 방법에 따라 생산된 재세포화된 판막은 CVI 및/또는 정맥성 다리 궤양을 겪고 있거나 위험이 있는 환자에 삽입(implantation), 이식(transplantation), 또는 그래프팅(grafting)될 수 있다.
본 개시는 추가로, 대상체에 정맥의 재세포화된 판막이 있는 정맥 분절을 그래프팅하는 것을 포함하여 그것을 필요로 하는 대상체에서 만성 정맥 부전증 및/또는 다리 궤양의 증상을 치료하거나 개선하는 방법을 제공한다. 재세포화 방법은 하나 이상의 단계를 포함한다. 치료, 개선 또는 완화된 증상은, 다리의 묵중한 통증(dull aching), 압박감 또는 경련, 가려움 및 저림(tingling), 서있을 때 심해지는 고통, 다리를 올렸을 때 더 얻게 되는 고통, 다리의 부종, 다리와 발목의 붉은 발진, 발목 주변의 피부색 변화, 표면(표재성)의 정맥류성 정맥, 다리와 종아리 피부의 비대 및 경화(지방피부경화증, lipodermatosclerosis), 다리와 종아리의 궤양, 및 다리 또는 종아리에서 서서히 치유되는 창상을 포함할 것이다.
상기 방법은 사람 대퇴 정맥의 판막이 있는 분절을 수확하고; 대퇴 정맥에서 정맥을 2-16회 사이클로 세포를 제거하고; 대상체로부터 혈액을 수집하고; 세포가 제거된 정맥을 항응고제로 관류시키고; 수집된 혈액으로 세포가 제거된 정맥을 몇 시간 관류시키고; 혈액을 버리고, 완충용액으로 정맥을 세척하고; 및 하루 이상 동안 내피세포 배지로 정맥을 일차 관류시키고 나서, 하루 이상 동안 평활근 배지로 정맥을 관류시키고; 및 세포가 제거된 판막을 재세포화시키고; 여기서, 재세포화된 판막은 대상체에 그래프팅 시 CVI 및/또는 다리 궤양을 치료 또는 개선하는 것을 포함한다.
본 개시는 심정맥 역류 및/또는 정맥성 고혈압으로 인한 다리 재발암을 재세포화된 판막이 있는 정맥을 사용하여 치료하는 방법을 포함한다. 본 개시는 심정맥 역류 및/또는 정맥성 고혈압으로 인한 다리 재발암을 치료함에 있어서 재세포화된 판막이 있는 정맥의 이용을 포함한다.
본 개시는 그것을 필요로 하는 대상체에서 그래프팅 시 대상체의 허벅지에서 무능한 판막의 증상을 치료 및/또는 개선하는 판막의 재세포화를 포함한다. 구체예에서, 상기 증상의 치료 및/또는 개선은 근육 펌프 및 정맥성 판막 간의 정상 작동 관계를 회복함으로써 달성될 것이다. 하지의 근육 펌프는 발, 종아리 및 허벅지의 것을 포함한다. 정상 종아리 펌프는 가장 큰 전기용량을 가지며, 가장 높은 압력을 생성한다(근육 수축 동안 수은의 200 mm). 정상 사지는 1500 내지 3000 cc의 종아리 부피, 100 내지 150 cc의 정맥 부피를 가지며, 단일 수축 시 40% 내지 60%의 정맥 부피를 배출한다.
수축 동안, 비복근 및 가자미근이 혈액을 큰 용량으로 슬와 및 대퇴 정맥으로 보낸다. 본 개시의 재세포화된 판막은 부압(negative pressure)을 생성하고, 유능한 관통 정맥을 통해 표재성 정맥계에서 심정맥계로 혈액을 이동하면서 차후의 이완 동안 역행 흐름(역류)를 예방한다. 재세포화된 판막은 동맥 유입이 정맥 배출과 같아질 때까지 정맥압을 점차적으로 낮춘다. 본 개시는 대상체에서 실험이 끝날 때, 정지하고 있는 정맥압에 대해 느린 복귀를 유발하면서 재세포화된 판막이 있는 정맥이 모세혈관상을 서서히 채운다.
근육이 대퇴 정맥을 둘러싸고 있긴 하나, 정맥 복귀에 대한 대퇴 근육 수축의 기여는 종아리 근육 펌프와 비교하여 매우 적다. 이동 동안 플랜터 정맥 망(planter venous plexus)의 압축에 의한 펌핑 작용은 종아리 펌프를 준비시킨다. 다양한 다리 펌프들이 말단에서 몸쪽 끝까지 정맥혈을 복귀하기 위해 유능한 판막 기능과 함께 작동한다. 본 개시의 재세포화된 판막은 말단에서 몸쪽 끝까지 정맥혈을 복귀하기 위해 기능성 다리 펌프를 회복하는데 사용된다.
본 개시는 만성 정맥 부전증 및/또는 다리 궤양의 치료를 위해 도너 판막이 있는 정맥에 대해 세포를 제거하고 재세포화하는 방법을 포함한다. 여기에 기재된 방법에 의해 생산된 재세포화된 판막은 CVI 및/또는 정맥성 다리 궤양을 겪거나 위험이 있는 환자에 삽입(implantation), 이식(transplantation), 또는 그래프팅(grafting)될 수 있다.
만성 정맥 부전증은 운동으로 정맥압을 감소시키지 못하는 것으로 정의된 활동성 정맥 고혈압(ambulatory venous hypertension)으로 인한 정맥 질환의 징후로 정의한다. 정상 상황에서, 하지의 정맥 판막과 근육 펌프는 다리 정맥에서 혈액의 축적을 제한한다. 배출 방해, 근육-근막 약화(musculo-fascial weakness), 관절운동의 손실, 또는 심장 판막의 실패로 인한 다리 근육 펌프의 실패는 말초 정맥 부전증과 연관되어 있다.
정맥성 궤양은 보통 다리의 정맥 판막의 부당한 기능 수행으로 인한 상처이다(즉, 정맥성 다리 궤양). 판막이 기능과 정맥에서 혈액의 풀링 및 정맥과 모세혈관에서 증가된 압력의 원인이 되는 혈액의 역류를 감소시킬 때 정맥성 궤양이 생긴다. 이는 다른 관련된 문제들, 예컨대 부종, 염증, 조직 경화, 피부의 영양실조, 및 정맥성 습진을 유발한다. 정맥성 궤양은 적혈구 세포에서 철을 포함하는 색소의 조직으로의 누수로 인해 크고, 얕고 변색되어 있으며, 방류할 것이다. 궤양은 안팎의 복사뼈 주변에 주로 빈번하게 위치하고 있다.
본 개시는 정맥 질환 또는 장애의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 정맥 내 재세포화된 판막의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시는 만성 정맥 부전증 또는 다리 궤양을 치료 또는 개선하는 방법에서 재세포화된 판막이 있는 정맥의 용도를 제공한다. 본 개시의 정맥 내 재세포화된 판막은 정상 다리 정맥압을 회복한다. 예를 들어, 걸을 때 다리 정맥압은 7 내지 12 걸음 내에 대략 100 mmHg(키 의존적)에서 평균 18 mmHg 내지 약 25 mmHg로 감소된다. 서있는 발목 굴곡(planter flexion) 또는 들린 발뒷꿈치(heel raising), 앞발에 무게를 싣는 경우(발끝으로 살금살금 걷는 것)에서 유사한 압력 변화가 관찰된다. 발등 정맥에서 보통 초당 1의 속도로 10개의 발끝 이동에 대한 반응을 측정하기 위해 21-게이지 주사바늘을 사용하여 보행형 정맥압(Ambulatory venous pressure, AVP)을 측정할 수 있다. 정해진 서있는 위치를 재개할 때, 정수압은 평균 31초 후에 회복된다. 궤양 발생은 30 mmHg 이상의 AVP에서 증가와 직선 관계를 갖는다. 증가된 AVP는 또한 20초 미만의 90% 정맥 리필 시간과 연관이 있다. AVP와는 대조적으로, 부피 변화는 혈량측정법을 사용하여 비침습적으로 측정될 수 있다. 빠른 역류(즉, 7mL/sec 이상의 정맥 충진) 및 종아리 펌프 기능 장애는 궤양의 높은 발생과 연관이 있다. 그래프팅 시 정맥 내 재세포화된 판막은 정상 AVP, 정상적인 빠른 역류 및/또는 정상 종아리 펌프 기능장애를 회복한다. 바람직하게는, 그래프팅 시 정맥 내 재세포화된 판막은 약 100 mmHg의 역류압의 정상적 저항을 회복하며, 7 내지 12 걸음을 걷는 동안 평균 약 18 mmHg 내지 약 25 mmHg로 감소된다.
도 1은 정맥의 기능 실험을 위한 셋-업 및 인 비트로 모델의 사진도를 도시한 것이다. 시스템은 도플러 신호의 강화를 위한 초음파용 조영제(ultrasound contrast)를 포함하는 실온 식염수가 순환되고 있다. 전체 서킷을 통해 식염수를 펌핑하는 연동 펌프(a), 상기 펌프에서 배출 동안 정맥(c)을 통해 흐를 수 있게 하는 기계 판막(b). 초음파 프로브(d)는 정맥(e)의 시각화 및 정맥 판막을 통과하는 흐름을 평가하기 위해 사용된다. 판막 부위에서 역류압은 정맥 위 저장소(f)의 높이에 따라 조정된다. 기계 판막은 흐름의 방향을 조절할 수 있고, 판막 기능을 실험할 수 있게 한다. 판막이 있는 정맥 분절은 서킷에 배치되고, 초음파에 의한 시각화를 촉진하기 위해 식염수가 충진된 컨테이너 내에 위치시킨다; 판막 닫힘 시간 평가; 판막 부위에서 역류압은 정맥 위 저장소의 높이에 따라 조정된다.
도 2는 세포가 제거된 판막을 포함하는 정맥 분절의 전체 형태 및 현미경 사진도를 도시한 것이다(A-D). 정상 정맥(A)과 14회 사이클 후 세포가 제거된 정맥(B)의 전체 형태. 14회 사이클 후 세포가 제거된 정맥의 HE 염색은 보존된 조직 구조 및 파란색-검은색 핵의 부재를 보여주며(C), 정상 정맥은 핵의 존재를 보여준다(D).
도 3은 세포가 제거된 정맥에서 세포외 매트릭스를 도시한 것이다(A-D). 정상 정맥의 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome, MT) 염색은 핵(검은색), 세포질(적색/분홍색) 및 콜라겐(파란색)의 존재를 보여준다(A). 세포가 제거된 정맥(DV)에서, 핵이 발견되지 않아 내피세포 및 평활근세포가 없음을 시사하나, 콜라겐 염색은 콜라겐이 여전히 존재함을 보여준다(B). 막대그래프는 14회 세포 제거 사이클 후 콜라겐 & GAGs의 함량이 각각 유의적으로 감소함을 보여준다(p값은 각각 0.03 및 0.005)(C). 막대그래프는 세포 제거 후 DNA의 함량에서의 유의적인 감소를 보여준다(p값은 0.0001)(D). 3A-3B에서, 스케일 바는 50㎛임.
도 4는 재세포화된 판막을 포함하는 정맥 분절의 특성 규명을 도시한 것이다(A-F). (A) 및 (B)는 각각 낮은 배율 및 높은 배율에서 재세포화된 정맥 및 판막의 헤모톡실린 및 에오신(HE) 염색된 현미경 이미지를 보여준다. 사진은 정맥 및 판막(화살표) 둘 다의 내피 내막에서 무한증식성 세포(continuous cell)의 존재를 보여준다. 정상 및 재세포화된 판막의 HE 및 메이슨 트리크롬(MT) 염색은 정맥의 모든 면에서 핵의 존재를 나타낸다(C). 재세포화된 정맥의 CD31 염색은 무한증식성 내피 내막을 나타낸다(D). 판막의 평활근 액틴의 염색은 판막에서 평활근세포의 존재를 보여준다(E). 알파 평활근 액틴의 염색은 재세포화된 정맥의 중막에서 평활근세포를 보여준다(F).
도 5는 자가 유래 전체 말초 혈액을 사용한 생체공학적 정맥 그래프트의 이미지를 도시한 것이다(A-E). (A)는 조직-공학적 정맥의 면역형광 염색 결과이다. 배율은 100×이다. (B)는 루멘에서 내피세포(녹색)의 존재를 위해 항-CD31 항체를 이용하여 염색된 생체공학적 판막의 면역형광 이미지이다. 배율은 200×이다. (C)는 항-CD31 항체 염색을 위한 음성 대조군을 보여준다. 배율은 200×이다. 항-평활근 액틴으로 조직-공학적 정맥의 면역조직화학 염색은 외막층에서 평활근세포(화살표)의 명백한 존재를 보여준다. (D)는 판막을 보여주는 전체 재세포화된 정맥의 사진도이다. (E)는 기능성 판막이 있는 정맥 사진도이다. 도시된 판막은 비대해져 있어 새롭게 수확하고, 세포를 제거하고 재세포화된 정맥에서 주사기를 이용하여 용액이 주입될 때 액체의 보존을 시사한다.
도 6은 재세포화된 판막의 기계적 분석을 도시한 것이다(A-C). (A)는 정상 및 재세포화된(RC) 정맥 판막에 대한 변형 거동의 대표 도형이다. 판막은 점차 가로로 분열되어 일련의 피크를 생성한다. (B)는 같은 정맥으로부터 판막의 각 쌍에 대한 첫 번째 피크에서의 포스(force)를 나타낸다. 정상 동맥 판막은 사각형으로 표시하고, RC 판막은 구형 형태로 표시된다. 녹색은 기능성 정맥을 표시하고, 적색은 기능이 없음을 표시한다. 파란선은 정맥이 기능을 갖기 위해 첫 번째 피크에서 얼마나 높은 포스가 필요한지에 대한 컷 오프를 나타낸다(0.8N). (C)는 정상 판막과 재세포화된 판막 간에는 유의적인 차이가 없음을 시사하는 작동 판막의 중간 포스의 박스-플롯이다.
도 7은 조직-공학적 판막을 포함하는 정맥의 기능성 실험 단계를 보여주는 일련의 초음파 이미지을 도시한 것이다. 패널 (a) - (f)는 정맥 분절의 세로 방향의 2차원 초음파 영상을 보여준다. 닫힌 판막(a), 및 판막의 역행 흐름(retrograde flow)(e) 및 (f)과 함께 선행 흐름(antegrade flow)(b-d) 닫힘 동안 판막의 점진적 열림.
도 8은 조직-공학적 판막을 포함하는 정맥의 기능성 실험을 도시한 것이다. 이미지 (a)-(c)의 하단에서 노란색 도플러 스케일은 판막 닫힘 시간을 초 단위로 보여준다.
도 9는 신체역학 실험을 보여주는 일련의 사진을 도시한 것이다(A-B). (A)는 인스트론 테스터(instron tester)로 실험하는 한편, 판막의 인열 시험(tear test) 및 신장을 수행하기 위해 세로로 커팅한 후 정맥을 보여주는 사진이다. (B)는 자른 정맥에 대한 인열 시험을 수행하는 인스트론 테스터를 보여주는 사진이다.
도 10은 세포가 제거된 정맥의 면역조직화학 분석을 도시한 것이다(A-B). (A)는 몇 개의 핵을 보여주는 정상 정맥의 DAPI 염색이나, 세포가 제거된 정맥은 DAPI-염색된 핵을 보여주지 않는다(B). 배율은 50×(A), 100×(B)이다.
도 11은 재세포화된 정맥을 도시한 것이다(A-D). (A)는 분홍색을 띠는 정상 정맥(A)과 재세포화된 정맥(B)의 전체 형태이다. DAPI 염색은 정상 정맥(C) 및 말초 전혈을 이용하여 재세포화된 정맥(D)에서 풍부한 핵을 보여준다. 배율은 100×에서이다.
도 12A는 사람 다리에서 심정맥의 스케치 도형이고, 도 12B는 정맥에서 열리거나 닫혔을 때 일방향 판막에 대한 도형이다.
본 개시의 방법 및 조성물에 대해 하기 실시예들을 보여주나, 이에 제한하지는 않는다. 본 개시의 다른 특성 및 장점은 다른 실시예로부터 분명하게 드러난다. 제공된 실시예는 본원을 실행하는데 유용한 다른 성분과 방법론을 보여준다. 실시예들은 청구된 요지를 제한하지는 않는다. 본원을 기반으로 하여, 당업자는 본원을 실행하는데 유용한 다른 성분들과 방법론을 확인하거나 사용할 수 있다.
<실시예>
(판막이 있는 정맥의 수확)
일반적인 대퇴 정맥, 심부혈관 대퇴 정맥 및 대퇴 정맥을 포함하는 정맥 분절은 혈관 수술 기술을 이용하여 성인 사체에서 수확하고, 모든 곁가지를 주의 깊게 잇는다. 판막을 확인하고, 판막의 각 끝에서 3-4cm의 폭으로 12개의 분절로 자른다. 정맥 분절은 0.5% 페니실린, 0.5% 스트렙토마이신, 0.5% 암포테리신 B을 포함하는 인산염 완충용액(PBS)에서 완전히 세척하고 4℃에서 보존하였다. 샘플은 얼음 위에서 위치시키고, 1주일 이내에 실험실로 옮겼다.
(세포 제거 및 특성 규명)
세포 제거는 1% 트리톤, 1% 트리-n-부틸 포스페이트(Tri-n-butyl phosphate (TNBP)) 및 4mg/L DNAse를 이용하여 수행하였다. 다양한 ECM 단백질의 비세포성(acellularity) 및 정량화를 위한 표준 과정을 사용하여 세포가 제거된 정맥 분절에서 남아있는 헤마톡실린 및 에오신(HE) 및 메이슨 트리크롬(MT)로 염색하여 DNA 함량에 대해 평가하였다. 표준 과정에 따라 HLA 클래스 I 및 II 항원의 검출을 위한 면역조직화학을 수행하였다.
(DNA 정량화)
DNA는 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 정상 및 DC 정맥에서 추출하였다. 7개의 정상 및 9개의 세포가 제거된 정맥 샘플 20mg을 세포 제거 전 및 후에 정맥 별로 수집하고, 키트(69506, Qiagen, Sweden)에 포함된 DNeasy® Blood & Tissue Handbook에서 DNA 추출을 수행하였다. 추출된 DNA는 nanodrop. (ND-1000, Saveen Werner, USA)를 사용하여 260 nm 파장에서 정량화하였다.
(ECM 염색 및 정량화)
간단히 말해, 콜라겐 및 연결 조직을 확인하기 위해, 포르말린으로 고정한 정맥 조직 섹션을 Bouin 고정액에 이어서 메이슨 트리크롬 염색 키트(cat No. 25088-1, Polysciences Inc., USA)을 사용하여 실온에서 오버나이트 동안 다시 고정하였다. 염색 과정 동안 사용된 염료는 콜라겐 섬유를 파란색으로, 핵은 검은색으로, 세포질과 근섬유는 적색으로 염색하였다.
(산-/펩신-용해성 콜라겐 정량화)
Sircol 용해성 콜라겐 분석 키트(Biocolor)를 사용하여 세포가 제거된 ECM에서 산-/펩신-용해성 콜라겐 함량을 측정하였다. 산-/펩신-용해성 콜라겐을 추출하기 위해, ECM 표본을 1% (w/v) 펩신(P7012; Sigma)를 포함하는 0.5M 아세트산으로 4℃에서 48시간 동안 소화시켰다. 용해성 콜라겐은 1mL의 Sircol 염색 시약과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 콜라겐-염료 복합체는 10,000g로 10분 동안 원심분리하여 침전시키고, 상등액을 버렸다. 펠렛은 1mL의 알칼리 시약에서 녹이고, 마이크로플레이트 리더(PowerWave XS, Bio-Tek Instruments)를 사용하여 555 nm에서 96-웰 플레이트에서 상대 흡광도를 측정하였다.
(황산화 GAG 정량화)
Blyscan 황산화 GAG 분석 키트(Biocolor)를 사용하여 세포가 제거된 ECM에서 황산화 GAG 함량을 측정하였다. 황산화 GAG를 추출하기 위해, ECM은 125㎍/mL의 파페인(Sigma), 10mM 시스테인 하이드로클로라이드(Sigma) 및 2mM EDTA(Sigma)를 포함한 0.1M 인산염 완충용액(pH 6.8)에서 65℃에서 4-6시간 동안 소화시켰다(조직이 완전히 녹을 때까지). 현탁액을 10,000g로 10분 동안 원심분리하였다. 추출된 황산화 GAG(100㎕)를 1mL의 Blyscan 염료와 혼합하고, 30분 동안 흔들었다. 침전물을 10분 동안 원심분리하여 수집하고 나서, 0.5mL의 분리용 시약에서 녹였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 656 nm에서 96-웰 플레이트에서 측정하였다.
(용해성 엘라스틴 정량화)
페스틴 엘라스틴 분석 키트(Biocolor)를 사용하여 세포가 제거된 ECM에서 용해성 엘라스틴 함량을 측정하였다. 용해성 엘라스틴을 추출하기 위해, ECM을 0.25M 옥살산(Sigma)으로 100℃에서 4-5시간 동안 가수분해하였다(조직이 완전히 녹을때까지). 불용성 잔류물은 원심분리하여 분리하였다. 상등액을 수집하고, 침전물에 대해 같은 조건에서 추가 추출을 수행하였다. 추출된 용해성 엘라스틴을 1mL의 ㅍ페스틴 염료와 혼합하고 90분 동안 흔들었다. 침전물은 10분 동안 원심분리하여 수집하고 나서, 250㎕의 분리용 시약에서 녹였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 513 nm에서 96-웰 플레이트에서 측정하였다.
(무균 제어 실험)
세포 제거 동안 배양 이틀마다 수집된 관류된 내피 및 평활근 배지 1mL을 수집하여 무균을 평가하여 미생물 오염원에 대해 실험하였다. 약 500㎕의 수집된 배지에 fluid Thioglycollate broth를 첨가하고, 트립톤 소야 아가 플레이트에 도포하고 37℃에서 14일 동안 인큐베이션 하였다. 바깥쪽 공기에 노출된 배지를 양성 대조군으로 사용하였으며, 단지 배지만을 음성 대조군으로 사용하였다. 곰팡이, 호기 및 혐기성 세균의 성장을 관찰하고, 스펙트로포토미터에서 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 차이를 기록하였다.
(정맥의 재세포화)
재세포화 시, 건강한 도너(25-35세)로부터 멸균 헤파린이 코팅된 진공 채혈 튜브에서 20-25mL의 말초 정맥혈을 수집하고, 가능한 한 곧 실험실로 옮겼다(2시간 이내). 필요한 혈액양은 정맥 및 생물반응기에 사용된 파이프의 길이에 따라 결정된다.
전체 재세포화 과정은 멸균 조건에서 수행되었고, 모든 관류는 37℃에서 5% CO2가 공급되는 인큐베이터에서 수행되었다. 재세포화 전에, 정맥은 50 IU/mL의 PBS의 농도에서 헤파린(Leopharma, Sweden)으로 2시간 동안 관류되었다. 헤파린을 빼고, 전혈은 2mL/min 속도에서 48시간 동안 즉시 관류시켰다. 그리고 나서, 혈액을 버리고, 혈액이 완전히 제거될 때까지 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신이 포함된 PBS로 정맥을 세척하였다. 그 다음, 4일 동안 내피 배지로 정맥을 관류하고, 4일 동안은 평활근 배지로 관류시켰다. 완전 내피 배지는 10%의 열처리 불활성화 사람 AB 혈청(Life technologies, Sweden), 1% 글루타민(Lonza, Denmark), 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신, 및 아스코르브산, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 인슐린, 재조합 사람 VEGF, 사람 섬유아세포 성장 인자, 사람 내피 성장 인자, ㅎ헤파린 및 젠타마이신 설페이트가 포함된 EGM2 single quote kit(Lonza, Denmark)이 첨가된 MCDB131(Life technologies, Sweden) 기본 배지로 제조하였다. 완전 평활근 배지는 10%의 열처리 불활성화 사람 AB 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 및 20ml의 평활근 성장 첨가물(SMGS)(Life Technologies, Sweden)이 첨가된 500mL의 Medium 231(Life technologies, Sweden)로 제조하였다. 정맥 스캐폴드는 전체 10일 동안 재세포화되었다.
(재세포화된 정맥의 특성 규명)
내피세포의 존재를 시각화하기 위해, CD31에 대한 항체(1:200)(Abcam, Germany) 및 vWF(1:100)(Santa Cruz, Germany)를 선택하여 면역조직화학 및 면역형광에 의해 염색하는 한편, 평활근 액틴(1:50)(Abcam, Germany)은 평활근세포를 시각화하기 위해 면역조직화학에 의해 염색되었다.
(신체역학적 분석)
정맥 판막의 기계적 특성들은 가로 방향으로 판막을 찢고 봉합하여(폴리프로필렌으로 제조한 4-O 비흡수성 단섬유 봉합사를 사용) 평가하였다. 수술용 가위로 정맥을 잘라 열고, 봉합사를 위치시켜 Instron 5566(Instron, Norwood USA)의 그립에 부착시켰다(도 S1). 0.1N의 프리-로드 및 20 mm/minute의 실험 속도를 사용하였고, 이는 가로로 균열된 판막을 형성한다. ISO 7500-1:2004 및 ISO 9513:1999에 따라 규칙적으로 수행된 보정에 근거하면 인장 시험기의 정확도는 포스에서 0.5 %, 및 신장에서 0.5 %였다. 첫 번째 피크에서 포스를 측정하고, 각 샘플에 대해 중간 포스를 계산하였다. 총 6개의 재세포화된 정맥(12개의 판막) 및 4개의 정상 정맥(8개의 판막)에서 실험하였다.
(판막이 있는 정맥의 인 비트로 기능 실험)
재세포화 전과 후에 정맥의 기능성을 평가하기 위해 맞춤형 실험 셋업을 사용하였다(도 1). 정맥은 인 비트로 플로우 서킷에서 세로로 배치되고, 실온 식염수로 관류되었다. 정맥은 원추형 커넥터에 의해 플로우 서킷에 연결되고, 양끝이 봉합되었다. 걷거나 호흡하는 동안 일어나는 스트레스 하에서 심정맥계 내 정맥을 통과하는 흐름을 모방하기 위해, 상업용 연동 펌프(Baxter, Model no. 700044, Healthcare Corp., USA)는 간헐적인 흐름을 서킷에 전달하였다.
기계 판막은 펌프에서 배출되는 동안 서킷을 통과하는 흐름 방향을 조절하는데 사용되며, 같은 판막이 열림 위치로 전환될 때, 판막이 닫힐 때까지 정맥에서 역류를 달성한다. 정맥에서 역류압은 판막 위 용액 컬럼의 높이에 따라 조정하였다. 초음파 도플러 기술은 정맥 판막의 부위에서 잠재적 역류를 검출하는데 사용되었다(9 MHz linear probe, Vivid E9, GE). 초음파로 시각화하는 것을 최적화하기 위해, 정맥 분절을 식염수로 채워진 플라스틱 컨테이너 내에 침지시켰다. 에코발생도를 향상시키고, 정맥 판막을 통해 서킷에서 흐름 및 흐름 방향을 기록하기 위해 식염수에 조영제(SonoVue, Bracco ™)를 투여하였다. 역류에서 흐름이 중지될 때까지의 시간이 판막 닫힘 시간 측정에 사용되었다. 또한, 정맥 직경은 100 mmHg의 역류압에서 엽상부(leaflet) 부위에서 측정하였다.
(통계)
결과는 중간값과 범위로 표현하였다. 판막에서 세포 제거 및 재세포화의 효과를 비교하기 위해 Mann-Whitney U 실험을 수행되었다. ECM 및 DNA의 정량화를 위해 Paired two-tailed student T 실험을 사용하였다. P <0.05를 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

Claims (27)

  1. 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 혈액을 탈세포화된 정맥의 루멘에 도입하고; 상기 탈세포화된 정맥의 루멘에서 상기 세포들을 배양함으로써 상기 정맥 내 판막을 재세포화하는 것을 포함하는 정맥 내 판막의 재세포화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액은 말초정맥혈 또는 전혈인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 말초정맥혈 또는 전혈은 주사 또는 관류에 의해 탈세포화된 정맥으로 도입되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 방법은 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류에 의해 세포들을 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류는 교대로 하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 CD31 양성, vWF 양성, 평활근 액틴 양성이고, 핵을 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 0.8N 또는 그 이상에서 첫번째 피크에서 견디는 힘을 갖는 기계적 물성을 갖는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 0.5 초 이하의 폐쇄 시간을 갖는 것인 방법.
  9. a) 대상체에 동종인 정맥의 판막-포함 분절을 탈세포화시키고;
    b) 상기 대상체로부터 수집되고 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 혈액으로 상기 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절을 관류시키고;
    c) 상기 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절의 루멘에서 상기 세포들을 배양하고; 그에 따라 상기 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절을 재세포화하는 것을 포함하는 방법에 의해 재세포화되는, 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절로서,
    상기 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절은 대상체에 이식되는 것을 특징으로 하며, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 정맥 부전증 (CVI), 심정맥 혈전증 (DVT),및/또는 다리 궤양을 치료하기 위한 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  10. 제9항에 있어서, 상기 다리 궤양은 재발성이고 심정맥 역류 및/또는 정맥 고혈압에 의한 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈액은 말초정맥혈 또는 전혈인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  12. 제11항에 있어서, 상기 말초정맥혈 또는 전혈은 주사 또는 관류에 의해 탈세포화된 정맥으로 도입되는 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류에 의해 세포들을 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  14. 제13항에 있어서, 상기 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류는 교대로 하는 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 CD31 양성, vWF 양성, 평활근 액틴 양성이고, 핵을 갖는 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  16. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 0.8N 또는 그 이상에서 첫번째 피크에서 견디는 힘을 갖는 기계적 물성을 갖는 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  17. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 0.5 초 이하의 폐쇄 시간을 갖는 것인 재세포화된 정맥의 판막-포함 분절.
  18. a) 인체로부터 수득한 정맥의 판막-포함 분절을 탈세포화하고;
    b) 재세포화된 정맥 내 판막을 필요로 하는 대상체로부터 수집되고, 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 혈액으로 상기 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절을 관류시키고;
    c) 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절 내에서 세포를 배양함으로써 상기 정맥 내 탈세포화된 판막을 재세포화시키는 것을 포함하는
    재세포화된 판막이 기능적 판막인, 판막-포함 정맥 내의 판막의 재세포화 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 재세포화는 재세포화된 판막의 능력과 역류 압력에 대한 저항성을 복원시켜주는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 혈액은 말초정맥혈 또는 전혈인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 말초정맥혈 또는 전혈은 주사 또는 관류에 의해 탈세포화된 정맥으로 도입되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 방법은 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류에 의해 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 내피세포 배지 및 평활근세포 배지의 관류는 교대로 하는 것인 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재세포화된 판막은 CD31 양성, vWF 양성, 평활근 액틴 양성이고, 핵을 갖는 것인 방법.
  25. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 0.8 N 또는 그 이상에서 첫번째 피크에서 견디는 힘을 갖는 기계적 물성을 갖는 것인 방법.
  26. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재세포화된 판막은 0.5초 이하의 폐쇄 시간을 갖는 것인 방법.
  27. a) 대상체에 동종인 정맥의 판막-포함 분절을 탈세포화시켜 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절을 제조하고;
    b) 내피세포에 대한 간세포 및 평활근세포에 대한 간세포를 포함하는 대상체의 혈액으로 상기 탈세포화된 정맥의 판막-포함 분절을 관류시키고; 및
    c) 상기 탈세포화된 정맥 분절의 루멘에서 상기 세포들을 배양함으로써 상기 탈세포화된 정맥 분절을 재세포화하여 정맥의 재세포화된 기능적 판막-포함 분절 형성시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되는 정맥의 재세포화된 기능적 판막-포함 분절을 포함하는, 만성 정맥 부전증 (CVI), 심정맥 혈전증 (DVT), 및/또는 다리 궤양의 치료를 위한 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CA3191775A1 (en) * 2020-09-04 2022-03-10 Narendra R. Vyavahare Systems and methods for processing tissue

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6376244B1 (en) 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
WO2002015914A1 (en) * 2000-08-21 2002-02-28 Bernard O'brien Institute Of Microsurgery Vascularised tissue graft
US8454678B2 (en) * 2005-03-19 2013-06-04 Cook Biotech Incorporated Prosthetic implants including ECM composite material
EP1901680B1 (en) * 2005-06-21 2015-04-15 Shire Regenerative Medicine, Inc. Crypreservation of biocompatible material
MX350338B (es) * 2005-08-26 2017-09-04 Univ Minnesota Descelularizacion y recelularizacion de organos y tejidos.
US7815923B2 (en) * 2005-12-29 2010-10-19 Cook Biotech Incorporated Implantable graft material
CN101073678B (zh) * 2007-06-26 2010-11-10 中国人民解放军第二军医大学 组织工程化静脉瓣及其制备方法
US20120183944A1 (en) * 2009-03-31 2012-07-19 Regents Of The Univeristy Of Minnesota Decellularization and recellularization of organs and tissues
US9561094B2 (en) * 2010-07-23 2017-02-07 Nfinium Vascular Technologies, Llc Devices and methods for treating venous diseases
PT2782995T (pt) * 2012-03-16 2017-02-14 Novahep Ab Vaso sanguíneo alogénico obtido mediante bioengenharia

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