KR20180027516A - 암 치료 및 진단 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은, 일반적으로, 인간 대상체에서 암을 치료하기 위한 치료제를 선택하고 후속하여 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 암을 가지는 인간 대상체로부터 암 세포를 단리하는 단계, 세포에서 STING 또는 cGAS의 기능적 활성을 결정하는 단계, 및 세포에서 STING 또는 cGAS의 기능적 활성에 기초하여 암에 대한 치료제를 선택하는 단계를 포함한다. STING 및/또는 cGAS의 기능적 활성이 세포에서 결함 있는 것으로 결정된 경우, 선택된 치료제가 STING 결핍 및/또는 cGAS 결핍 암 세포를 사멸하는 데 있어서 효과적인 것으로서 또한 제공되고, 예를 들어 치료는 종양세포붕괴성 바이러스를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

암 치료 및 진단

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2015년 6월 11일에 제출된 미국 가특허 출원 제62/174,374호(본 명세서에서 전문이 참고로 포함됨)의 우선권 이익을 주장한다

연방정부 지원된 조사에 대한 성명

이용 가능하지 않음.

전자로 제출된 자료의 참고로의 포함

본원은, 본 개시내용의 별개의 부분으로서, 참고로 전문이 포함되고 하기와 같이 확인된 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록을 함유한다: 파일명: 49720_Seqlisting.txt; 크기: 2,313바이트, 생성일: 2016년 6월 13일.

기술분야

본 개시내용은 일반적으로 분자 생물학, 면역학, 생화학, 암 및 의학의 분야에 관한 것이다. 더 특히, 본 개시내용은 세포 단백질의 사용을 통한 암의 진단 및 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

암은 아메리카 합중국 및 그 외에서 사망의 주요 원인이다. 새로운 치료 및 진단이 결과를 개선하도록 필요하다.

대장결장암(colorectal cancer: CRC)은 매년 진단되는 대략 150,000건의 새로운 사례에 의해 미국에서 약 120만 명의 사람에게 영향을 미친다. 실제로, CRC는 폐암 및 유방암 다음으로 세계적으로 암의 3번째로 가장 흔한 원인이고, 성인에서의 제2의 암 사망의 주요 원인이다(DeSantis et al., 2014). 장 연관된 악성 질환은 흔히 세포 성장의 조절에 관여된 중요한 유전자에서의 유전적 변경을 축적하는 대장 상피 세포로부터 발생한다. 다단계 게놈 손상 악화된 변경은 발암물질을 포함하는 환경 인자 또는 헬리코박터 파일로리를 포함하는 유전자독성 미생물 병원균으로부터 획득될 수 있다(Arthur et al., 2014; Kim and Chang, 2014; Louis et al., 2014). 이러한 유전적 변경은 흔히 k-ras의 돌연변이를 통해, 및 중요한 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene: TSG), 예컨대 p53 및 선종성 결장 용종증(adenomatous polyposis coli: APC)의 돌연변이 또는 후성적 침묵화를 통해 세포 성장 신호전달의 활성화를 수반한다. 돌연변이된 TSG, 예컨대 APC는 또한 유전될 수 있어서, CRC의 위험을 상당히 증가시킨다(Fearon, 2011).

경구로 투여된 발암물질, 예컨대 DNA-부가물 형성 아족시메탄(adduct forming azoxymethane: AOM)은 위장 상피 세포에서 게놈 변화를 유도하고, 이 사건은 DNA 손상 반응(DNA damage response: DDR) 경로의 활성화를 촉발할 수 있다. 이 반응이 DNA 파괴의 복원 및 염기 불일치의 제거를 수반하지만, 이들은 또한 전염증성 사이토카인의 생성을 활성화하는 것을 포함할 수 있고, 이는 손상된 부위에 대한 면역 감시 시스템을 알려주고 상처 회복을 수월하게 한다. 예를 들어, 쥣과 모델을 이용하여, AOM, 이어서 염증성 약물 황산덱스트란 나트륨(DSS)의 투여가 상피 세포가 IL-1β 및 IL-18을 생성하도록 할 수 있고, 이것은 분비를 위해 염증조절복합체(inflammasome), NLRP3 및 NLRP6과 같은 뉴클레오타이드-결합 올리고화-도메인 단백질 유사 수용체(NLR)를 포함하는 다단백질 복합체, 및 아폽토시스 얼룩 단백질 함유 CARD(ASC/PYCARD) 및 카스파제-1에 의해 프로세싱이 된다는 것이 입증되었다(Arthur et al., 2012; Elinav et al., 2011). IL-18은 예를 들어 성장 저해 IL-22 결합 단백질(IL-22BP)의 생성을 막도록 대장 수지상 세포에 결합하고 MyD88을 통해 신호전달할 수 있고, 이것은 비제한된 IL-22가 조직 회복을 자극하게 한다(Huber et al., 2012; Salcedo et al., 2010). 따라서, 중요한 염증조절복합체 연관된 분자, 예컨대 ASC 또는 카스파제-1에서 결함 있는 마우스는 발암물질 유도된 대장염 연관된 암(CAC)에 걸리기 쉽다. 유사하게, IL1-R 신호전달에 필요한 MyD88과 같은 중요한 어댑터 분자의 소실은 AOM/DSS 유도된 CAC에 걸리기 쉽다. 그럴듯하게, 회복되지 않는 병변은 고조된 유전자독성 소질로 미생물의 침윤이 가능하게 하고, 이것은 염증성 과정 및 DNA를 손상시키는 라디칼 산소 종(radical oxygen species: ROS)의 생성을 만성적으로 악화시킬 수 있다.

염증조절복합체가 전염증성 사이토카인, 예컨대 IL1β 및 IL-18을 프로세싱하는 데 중요한 것으로 밝혀졌지만, 이러한 상처입은 회복 단백질이 실제 게놈 손상에 반응하여 전사적으로 활성화되는지에 대해 완전히 분명해 져야 하게끔 있다. 그러나, 선천성 면역 조절인자 STING(인터페론 유전자의 자극인자)이 결여된 마우스가 AOM/DSS 유도된 CAC에 또한 감수성인 것으로 최근에 밝혀졌다(Ahn et al., 2015). STING은 조혈 세포의 소포체(ER), 및 내피 및 상피 세포에 있고, 세포내 박테리아로부터 생성된 사이클릭-다이-AMP(c-다이-AMP)와 같은 사이클릭 다이뉴클레오타이드(CDN)의 검출에 반응하여 다수의 숙주 방어 유전자, 예컨대 I형 IFN, 및 전염증성 유전자, 예컨대 IL1-β의 유도를 조절한다(Ishikawa and Barber, 2008; Woodward et al., 2010). STING은 또한 cGAS라 칭해지는 세포 뉴클레오티딜전환효소(사이클릭 GMP-AMP 생성효소, 또한 Mab-21 도메인 함유 단백질 및 C6orf150이라 칭함)로부터 생성된 CDN에 대한 센서이다(Sun et al., 2013). 침입 병원균, 예컨대 HSV-1, 또는 그럴듯하게 핵으로부터 누출된 자가-DNA의 게놈을 구성할 수 있는 시토졸 DNA 종은 cGAS에 결합하여 하나의 2'-5' 포스포다이에스터 연결 및 정규 3-5' 연결을 함유하는 비정규 cGAMP(c[G(2',5')pA(3',5')p])를 생성할 수 있다. STING 경로는 장 손상에 대한 초기 반응 동안 손상된 DNA를 인식할 수 있고, IL1β 및 IL-18을 수반하는 조직 회복 경로를 활성화하는 데 필수적일 수 있다(Ahn et al., 2015). STING은 또한 죽어가는 종양 세포의 수지상 세포 인식 및 항종양 세포독성 T 세포(cytotoxic T-cell: CTL) 반응의 프라이밍에서 필수적 역할을 하는 것으로 최근에 보고되었다(Corrales et al., 2015; Woo et al., 2014). 따라서, STING의 소실이 상처 회복의 예방을 통해 그리고 종양 특이적 CTL의 생성을 예방함으로써 종양형성을 수월하게 할 수 있지만, 인간 종양에서의 STING 신호전달의 유효성은 공지되지 않은 채 있다.

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STING 매개된 선천성 면역 신호전달이 인간 대장암, 및 많은 다른 유형의 인간 암에서 주로 손상된다고 본 명세서에 기록되어 있다. 많은 경우에, 이것은 후성적 과메틸화 과정을 통해 STING 및/또는 생성효소 cGAS 발현의 침묵화를 통해 달성된다. 발견은 STING 경로가 대장 종양형성을 억제하는 데 있어서 주요 기능을 가질 수 있다는 것 및 이 경로에서의 STING 기능의 저해가 암 발생 동안 선택적으로 억제될 수 있다는 것을 제안한다. 추가로, STING 신호전달에서의 결함이 암 세포가 종양세포붕괴성 바이러스 감염에 더 걸리기 쉽게 한다는 것이 발견되었다. 따라서, 암에서의 STING 활성의 조사가 검정의 개발을 발생시킬 수 있고, 이것이 선택 암 치료제의 결과를 비출 것이다.

DNA 손상 물질 또는 DNA 바이러스에 의해 생성된 세포질 DNA에 대한 선천성 면역 반응을 조절하는, 세포 단백질 STING이 매우 다양한 암 세포에서 결함 있다는 것이 발견되었다. STING 신호전달에서의 결함은 종양 세포가 면역계에 의한 축출을 회피하고 종양형성의 공통 기전을 구성하는 것을 도울 수 있다. 종양에서의 STING 발현의 조사는 질환 결과를 예측하게 허용하고, 선택 항종양 치료제에 대한 반응을 예측하는 데 있어서 중요한 예후적 마커를 제공한다. STING(STING 넉아웃 또는 SKO)이 결핍된 마우스가 DNA 손상 및 염증성 물질에 의해 유도된 대장염 관련된 암(CAC)에 걸리기 쉽다는 것을 보여주는 실험이 본 명세서에 개시되어 있다. 종양을 보유하는 SKO 마우스는, 정상 마우스와 비교하여, 대장 관련 종양형성을 예방하는 데 중요한 사이토카인인, 종양 억제적 IL22 결합 단백질(IL22-BP)의 낮은 수준을 나타냈다. 인간 대장암 세포 및 다양한 다른 암 세포, 예컨대 흑색종의 분석은 STING 신호전달에서의 널리 퍼진 결함을 나타냈고, 이것은 흔히, STING 활성화 사이클릭 다이뉴클레오타이드(CDN)를 생성하는 생성효소인, STING 및/또는 사이클릭 GMP-AMP 생성효소(cGAS)의 완전한 소실을 수반한다. 이러한 종양 세포는 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 매우 걸리기 쉽다.

포유류(예를 들어, 인간) 대상체에서 암을 치료하기 위한 치료를 선택하고, 선택된 치료에 의해 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 이러한 일 방법은 암을 가지는 인간 대상체로부터 샘플을 단리하는 단계; 샘플에서 STING 및/또는 cGAS의 기능적 활성을 결정하는 단계; 샘플에서 STING 및/또는 cGAS의 기능적 활성에 기초하여 암에 대한 치료를 선택하는 단계, 및 선택된 치료에 의해 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. IL-22BP에 의한 IL-22의 억제의 수준, 및 IL-1β, IL-18 및 IL-22의 세포 수준의 측정이 또한 고려된다. IL-1β, IL-18, IL-22 및 IL-22BP의 수준의 감소는 결함 있는 STING 또는 cGAS 신호전달을 나타낼 수 있다.

다양한 실시형태에서, 샘플은 체액, 세포, 조직 샘플, 생검, 조직 프린트(tissue print), 피부, 모발, 세포 제제의 가용성 분획 또는 세포가 성장하는 배지이다. 체액은 혈액, 뇨, 혈장, 타액 또는 뇌척수액인 것으로 고려된다.

STING 및/또는 cGAS의 기능적 활성이 샘플에서 결함 있는 것으로 결정된 경우, 선택된 치료는 STING 결핍 및/또는 cGAS 결핍 암 세포를 사멸하는 데 있어서 효과적인 것이다(예를 들어, 치료는 종양세포붕괴성 바이러스, 예컨대 dsDNA 게놈을 가지는 것, 예컨대 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV), 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus: VV)를 대상체에게 투여하는 것을 포함함). dsDNA 게놈을 가지는 예시적인 바이러스 패밀리는 알로헤르페스비리다에(Alloherpesviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 말라코헤르페스비리다에(Malacoherpesviridae), 리포트릭스비리다에(Lipothrixviridae), 루디비리다에(Rudiviridae), 아데노비리다에(Adenoviridae), 암풀라비리다에(Ampullaviridae), 아스코비리다에(Ascoviridae), 아스파르비리다에(Asfarviridae), 바쿨로비리다에(Baculoviridae), 비카우다비리다에(Bicaudaviridae), 클라바비리다에(Clavaviridae), 코르티코비리다에(Corticoviridae), 푸셀로비리다에(Fuselloviridae), 글로불로비리다에(Globuloviridae), 구타비리다에(Guttaviridae), 하이트로사비리다에(Hytrosaviridae), 이리도비리다에(Iridoviridae), 마르세일레비리다에(Marseilleviridae), 미미비리다에(Mimiviridae), 누디비리다에(Nudiviridae), 니마비리다에(Nimaviridae), 판도라비리다에(Pandoraviridae), 파필로마비리다에(Papillomaviridae), 피코드나비리다에(Phycodnaviridae), 플라스마비리다에(Plasmaviridae), 폴리드나바이러스, 폴리오마비리다에(Polyomaviridae), 폭스비리다에(Poxviridae), 스파에로리포비리다에(Sphaerolipoviridae), 테크티비라다에(Tectiviridae) 및 투리비리다에(Turriviridae)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다양한 실시형태에서, STING-신호전달의 조사는 HSV1 또는 다른 바이러스 기반 항암 치료제가 악성 질환의 치료에 효과적인지에 대한 유용한 예후적 마커이다.

본 명세서에 기재된 방법에서, 대상체는 적어도 하나의 화학치료 섭생에 실패한 대상체일 수 있고(예를 들어, DNA 돌연변이를 야기하는 물질을 대상체에게 투여하는 것을 포함), 세포에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계는 세포에서 cGAS의 양을 분석하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 선택된 치료제, 예를 들어 종양세포붕괴성 바이러스는 제2 치료제, 예컨대 화학치료제와 함께 투여되는 것으로 고려된다. 예시적인 화학치료제는 상세한 설명에서 하기 기재되어 있다.

암을 구성하는 세포에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계; 및 세포가 결함 있는 STING 활성을 갖지 않는 경우, 암 치료제를 DNA 돌연변이를 발생시키지 않는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류(예를 들어, 인간) 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있다.

암을 가지는 인간 대상체로부터 샘플을 단리하는 단계; 시험관내 종양세포붕괴성 바이러스에 의해 사멸되는 암의 감수성을 결정하는 단계; 및 암이 이러한 방식으로 사멸되는 것에 감수성인 경우, 종양세포붕괴성 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류(예를 들어, 인간) 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 추가로 개시되어 있다. 다양한 실시형태에서, 샘플에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계는 세포에서 cGAS의 양을 분석하는 단계를 포함한다. IL-22BP에 의한 IL-22의 억제의 수준, 및 IL-1β, IL-18 및 IL-22의 세포 수준의 측정이 또한 고려된다. IL-1β, IL-18, IL-22 및 IL-22BP의 수준의 감소는 결함 있는 STING 또는 cGAS 신호전달을 나타낼 수 있다.

다양한 실시형태에서, 암은 대장결장암, 대장염 연관된 암 또는 흑색종이다. 본 명세서에서 치료에 고려되는 추가적인 예시적인 암은 상세한 설명에 기재되어 있다.

다양한 실시형태에서, STING/cGAS 발현의 존재 또는 부재의 측정은 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 대한 소정의 암을 가지는 환자의 반응을 예측한다. 다양한 실시형태에서, 반응의 측정은, cGAS 또는 STING의 존재 또는 부재에 따라 종양세포붕괴성 바이러스 치료에 대한 결과를 예측하도록, 형광 인시츄 혼성화, 및 STING 및/또는 cGAS 단백질 또는 RNA 발현의 분석을 사용하여 수행될 수 있다.

바이러스 종양세포붕괴성 치료제를 대상체에게 투여하는 단계, 대상체에서의 STING 또는 cGAS의 수준을 결정하는 단계(여기서, STING 또는 cGAS 활성의 감소는 종양세포붕괴성 치료의 긍정적인 결과를 예측함), 및 바이러스 종양세포붕괴성 치료의 결과를 개선하도록, i) 대상체에서의 STING 또는 cGAS의 수준이 낮은 경우, 종양세포붕괴성 치료를 계속하는 단계; 또는 ii) STING 또는 cGAS 수준이 정상 또는 부분적으로 활성인 경우, 바이러스 종양세포붕괴성 치료를 중단하는 단계 및/또는 대상체에서의 STING 수준을 증가시킬 수 있는 제2 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

다양한 실시형태에서, 바이러스 종양세포붕괴성 치료는 헤르페스바이러스, VZV 또는 백시니아 바이러스를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 결정하는 단계는 대상체로부터의 샘플을 얻는 단계 및 샘플에서 STING, cGAS, 또는 본 명세서에서 고려되는 다른 바이오마커(예를 들어, IL-18, IL-22, IL-22BP, IL-1β, IFNβ, I형 IFN)의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 샘플이 체액, 예컨대 혈액, 뇨, 혈장, 타액 또는 뇌척수액; 세포; 조직; 조직 프린트; 지문, 피부 또는 모발; 등; 세포 제제의 가용성 분획, 또는 세포가 성장하는 배지; 세포로부터 단리되거나 추출된 염색체, 세포소기관 또는 막; 용액 중의 또는 기질에 결합된, 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드인 것으로 고려된다.

다양한 실시형태에서, STING 활성 또는 cGAS 활성이 결여된 암에서의 면역 반응은 종양세포붕괴성 바이러스의 투여에 의해 증대된다. 일 실시형태에서, 면역 반응은 T 세포 활성의 조절, 수지상 세포 활성의 조절 또는 면역 사이토카인의 조절을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 치료는 대상체에서 증가된 종양 세포사 및/또는 지체된 종양 성장을 발생시킨다.

본 명세서에 기재된 각각의 특징 또는 실시형태, 또는 조합이 본 발명의 임의의 양태의 비제한적인 예시적인 예이고, 그러므로, 본 명세서에 기재된 임의의 다른 특징 또는 실시형태, 또는 조합과 조합될 수 있는 것으로 의도된다고 이해된다. 예를 들어, 특징이 "일 실시형태", "몇몇 실시형태", "소정의 실시형태", "추가의 실시형태", "구체적인 예시적인 실시형태", 및/또는 "또 다른 실시형태"와 같은 언어에 의해 기재된 경우, 실시형태의 이들 유형의 각각은, 모든 가능한 조합을 열거하지 않으면서, 본 명세서에 기재된 임의의 다른 특징, 또는 특징의 조합과 조합되도록 의도되는 특징의 비제한적인 예이다. 이러한 특징 또는 특징의 조합은 본 발명의 임의의 양태에 적용된다. 범위 내에 해당하는 값의 예가 개시된 경우, 임의의 이들 예는 범위의 가능한 종점으로 고려되고, 이러한 종점 사이의 임의의 및 모든 숫자 값이 고려되고, 상부 종점 및 하부 종점의 임의의 및 모든 조합이 고안된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 하기 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 참고로 포함된다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우세할 것이다. 또한, 하기 기재된 특정한 실시형태는 오직 예시적이고, 제한인 것으로 의도되지 않는다.

도 1a-1e. 아족시메탄(AOM)에 의한 STING 의존적 유전자의 활성화(도 1a) 8시간 동안 0.14mM의 AOM(왼쪽) 및 8시간 동안 1mM의 1,2-다이메틸하이드라진(DMH)(오른쪽)에 의해 처리된 야생형(WT) 및 STING 결핍(SKO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 유전자 어레이 분석. 최고의 가변 유전자가 도시되어 있다. 열은 개별 유전자를 나타내고; 행은 개별 샘플을 나타낸다. 그레이스케일은 평균 미만, 동일 또는 초과의 전사 수준을 나타낸다. 스케일은 유전자 발현의 강도를 나타낸다(-2.4 내지 2.4의 log2 스케일 범위). (도 1b) 도 1a에서와 동일한 AOM 및 DMH에 의해 처리된 MEF에서의 Cxcl10 및 Ifit3의 qPCR 분석. (도 1c) 24시간 동안 1mM에서 AOM 및 DMH에 의해 처리된 인간 상피 세포(FHC)에서의 Cxcl10의 qPCR 분석. (도 1d) FHC 세포를 72시간 동안 STING 또는 대조군 siRNA에 의해 형질감염시킨 후, 도 1c와 동일한 AOM 및 DMH 처리를 하였고, 이후 Cxcl0 mRNA 발현으로 처리하였다(왼쪽). siRNA 처리 후의 STING 발현 수준을 qPCR에 의해 결정하였다(오른쪽). 데이터는 적어도 2개의 독립 실험을 대표한다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. *; p<0.05, 스튜던트 t-시험. (도 1e) WT 및 SKO 마우스(왼쪽) 및 인간으로부터의 대장 조직의 STING 면역조직화학 염색. 모든 이미지는 200X인 원래 배율로 도시되어 있다.
도 2a-2e. STING의 손실은 마우스가 CAC에 걸리기 쉽게 한다: (도 2a) AOM/DSS 유도된 대장염 모델의 도식적 표시. WT(n=7) 및 SKO(n=7) 마우스에 1일에 AOM에 의해 정맥내 주사한 후, 4회의 DSS 사이클 동안 식수 중의 황산덱스트란 나트륨(DSS)을 7일 투여하였다. 정상 식수는 대조군에 사용되었다. (도 2b) AOM/DSS 처리된 또는 일반 물 처리된 WT(n=7) 및 SKO(n=7) 마우스의 거시적-내시경 대장 종양(왼쪽) 및 H&E 염색(오른쪽)의 대표적인 사진. 도 2b로부터의 다수의 용종(도 2C) 및 염증 점수(도 2d, 0: 정상 내지 3: 가장 중증). (도 2e) 도 2a와 동일하게 처리된 WT 및 SKO 마우스로부터의 대장 조직의 유전자 어레이 분석. 최고 가변 유전자 목록이 도시되어 있다(오른쪽 표). 열은 개별 유전자를 나타내고; 행은 개별 샘플을 나타낸다. 그레이스케일은 평균 미만, 동일(검정색) 또는 초과의 전사 수준을 나타낸다. 스케일은 유전자 발현의 강도를 나타낸다(-2.4 내지 2.4의 log2 스케일 범위).
도 3a-3c. STING 결핍 마우스에서의 IL22BP 발현의 억제: (도 3a) 8시간 동안 4㎍/㎖의 dsDNA90 및 IFNβ에 의해 투여된 WT 및 SKO MEF에서의 Il18의 유전자 어레이 분석으로부터의 배수 변화(왼쪽). 8시간 동안 4㎍/㎖의 dsDNA90 및 사이클릭-다이-GMP-AMP(cGAMP)에 의해 형질감염된 WT 및 SKO MEF에서의 Il18의 qPCR 분석(중간). WT 및 SKO 마우스로부터의 골수 유래한 수지상 세포(BMDC)에서의 Il18의 qPCR 분석. BMDC를 8시간 동안 1mM의 AOM 및 1mM의 DMH에 의해 처리하였다(오른쪽). (도 3b) 5일 동안 DSS 투여의 1회 사이클, 이어서 일반 물의 2일 동안 WT 및 SKO 대장으로부터의 IL18, IL22bp 및 IL22의 도식적 도해, 체중 및 qPCR 분석. (도 3c) 도 2로부터의 WT 및 SKO 대장 조직에서의 IL18, IL22bp 및 IL22의 qPCR 분석. 데이터는 적어도 2개의 독립 실험의 대표이다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다 *; p<0.05, 스튜던트 t-시험.
도 4a-4f. 시토졸 DNA 유도된 선천성 면역 신호전달은 인간 대장암 세포에서 대부분 결함이 있었다: (도 4a) 다양한 유형의 일련의 인간 대장암 세포주에서의 STING의 면역블롯. hTERT 및 정상 인간 대장 상피 세포주, FHC는 양성 대조군으로서 포함되었다. 레인마다 20㎍의 전체 단백질을 로딩하고, 토끼 항 STING 다중클론 항체에 의해 분석하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 사용하였다. (도 4b) 16시간 동안 3㎍/㎖에서의 폴리I:C 또는 dsDNA90 형질감염 후 (도 4a)에서와 동일한, 세포의 배지에서의 인간 인터페론 β 생성의 ELISA 분석. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 단독은 모의 형질감염으로서 사용되었다. (도 4c) A에서와 동일한, 세포는 3시간 동안 모의 형질감염되거나 3㎍/㎖에서의 폴리I: C 또는 dsDNA90에 의해 형질감염되었다. 전체 RNA를 추출하고 IFNB 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. (도 4d) 도 4c에서와 동일한, RNA를 CXCL10 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. (도 4G) 도 4c에서와 동일한, RNA를 IL1B 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. (도 4e) 3시간 동안 모의 형질감염되거나 3㎍/㎖의 dsDNA90에 의해 형질감염된, 정상 또는 대장암 세포의 유전자 어레이 분석. 가장 높은 가변 유전자가 도시되어 있다. 열은 개별 유전자를 나타내고; 행은 개별 샘플을 나타낸다. 그레이스케일 범례는 평균 미만, 동일 또는 초과의 전사 수준을 나타낸다. 스케일은 유전자 발현의 강도를 나타낸다(-3 내지 3의 log10 스케일 범위). (도 4f) dsDNA90 자극 후 도 4e에 도시된 가장 높은 가변 유전자의 목록, 및 이의 유도 값 배수. 데이터는 적어도 2개의 독립 실험을 대표한다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다.
도 5a-5f. 대장암 세포에서의 STING 활성화 및 시토졸 DNA 경로는 대부분 결함이 있었다: 일련의 대장암 세포, 및 정상 세포 대조군은 3시간 동안 모의 형질감염되거나 3㎍/㎖에서 dsDNA90에 의해 형질감염되었고, STING 전좌(도 5a), IRF3 전좌(도 5b) 및 p65 전좌(도 5c)에 대해 면역형광 분광법에 의해 분석되었다. (도 5d) 상기와 동일한, 세포는 표시된 시간 기간 동안 모의 형질감염되거나 3㎍/㎖에서 dsDNA90에 의해 형질감염된 후, STING 인산화, 및 TBK1, IRF3 및 p65의 인산화에 대해 면역블롯 분석되었다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 사용하였다. (도 5e) 상기와 동일한, 세포를 cGAS 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. (도 5f) E에서 검출 불가능한 수준의 cGAS를 가지는 세포를 7일 동안 1μM 5-아자사이티딘에 의해 처리한 후, cGAS 발현에 대해 qPCR 분석하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립 실험을 대표한다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다.
도 6a-6d. HSV1 바이러스 생성은 결함 있는 STING 선천성 면역 경로를 가지는 대장암 세포에서 더 효과적이다. (도 6a) 일련의 대장암 세포, 및 정상 세포 대조군을 24시간 동안 M.O.I. 1 또는 5에서 HSV-luc에 의해 감염시켰다. 이후, 세포를 용해시키고 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립 실험을 대표한다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. (도 6b) 도 6a에서와 동일한, 세포를 6시간 동안 M.O.I. 10에서 HSV-luc에 의해 감염시켰다. 이후, 전체 RNA를 추출한 후, IFNB 생성을 qPCR 분석하였다. (도 6c) 도 6b로부터의 동일한 RNA를 CXCL10 생성에 대해 qPCR 분석에 의해 분석하였다. (도 6d) 도 6a에서와 동일한, 세포를 6시간 동안 M.O.I. 1에서 HSV1γ34.5 결실 돌연변이체에 의해 감염시킨 후, IFNB 생성을 qPCR 분석하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립 실험을 대표한다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다.
도 7a-7b. 도 1a에 도시된 Illumina 어레이의 유전자 발현 배수 변화.
도 8a-8c. 3mM의 AOM 또는 3mM의 DMH에 의해 처리된 WT 및 SKO MEF에서의 DAPI 염색의 (도 1과 관련된) 형광 분광법 분석(도 8a) 및 48시간 동안 3mM의 AOM 또는 3mM의 DMH에 의해 처리된 인간 정상 대장 상피 세포(FHC)에서의 핵으로의 세포질의 항-dsDNA 염색 및 양(도 8b). (도 8c) p65 또는 IRF3 항체를 사용한 48시간 동안 도 8a에서의 AOM 및 DMH 세인(sane)에 의해 처리된 FHC의 면역형광 분광법 분석. 160x인 원래 배율로 도시된 이미지.
도 9a-9b. 도 9a는 용종의 수를 보여주고, 도 9b는 도 2a-2e로부터의 염증 점수를 보여준다.
도 10a-10b. STING 및/또는 p53이 결여된 원발성 MEF 세포는 인간 H- Ras 12V 또는 인간 c- Myc를 코딩하는 레트로바이러스에 의해 형전유도된다. 퓨로마이신 및 하이그로마이신에 의한 약물 선택 후, 세포를 부드러운 한천에서 배양하였다. 14일 후, 콜로니를 사진 찍고(도 10a), 일 웰에서의 콜로니 수(n=3)를 계수하였다(도 10b). 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 11. IL18 프로모터 구역은 다수의 선천성 면역 유전자 전사 인자에 대한 결합 자리를 함유한다. IL18 유전자 프로모터에서의 추정상 전사 인자 결합 자리는 열거되고 강조된다.
도 12. 대장암 세포주에서 STING 신호전달 경로의 요약이 도시되어 있다.
도 13a-13d. 인간 대장암 세포(SW480 및 HT116) 및 hTERT 세포를 7일 동안 1μM의 5아자사이티딘에 의해 처리한 후, 3시간 동안 3㎍/㎖에서 dsDNA90 형질감염시켰다. 전체 RNA를 추출하고 cGAs(도 13a) 및 IFNB(도 13b) 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. (도 13c) cGAS 생성은 많은 대장암에서 하향조절된다. 다양한 병기의 5개의 정상 인간 대장 조직 및 43개의 인간 대장암으로부터의 cDNA를 cGAS 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. (도 13d) 상기와 동일한 정상 및 인간 대장암 세포에서의 cGAS 발현의 면역블롯(상부) 및 qPCR 분석(하부).
도 14a-14c. 도 14a, 다양한 형질전환된 또는 암 유래한 인간 세포주에서의 STING의 면역블롯. HUVEC는 양성 대조군이었다. 도 14b, 도 14a에서처럼 세포주에서의 STING mRNA 발현의 노던 블롯 분석. HUVEC는 양성 대조군이었다. 도 14c, 16시간 동안 3㎍/㎖의 폴리I:C 또는 dsDNA90에 의해 형질감염되거나 모의 형질감염된 세포의 배지에서의 IFNB 생성의 ELISA 분석. PASMC, NHDF-ad 및 hTERT는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 15a-15f. cGAS 발현은 많은 인간 대장암 세포주에서 억제되고, DNA 탈 메틸화를 통해 부분적으로 발생반복될 수 있다. 도 15a, 상기와 동일한 정상 및 인간 대장암 세포에서의 cGAS 발현의 면역블롯(상부) 및 qPCR 분석(하부). 도 15b, 5일 동안 모의 처리되거나 1μM의 5-아자사이티딘(5AZADC)에 의해 처리된 cGAS 음성 대장 세포주에서의 cGAS 발현의 qPCR 분석. 도 15c, 5일 동안 모의 처리되거나 1μM의 5-아자사이티딘(5AZADC)에 의해 처리된 (도 15b로부터 선택된) 세포에서의 STING 신호 활성화, 이어서 표시된 시간 기간 동안 3㎍/㎖에서의 dsDNA90 형질감염의 면역블롯 분석. 도 15d, 상기와 동일한 5AZADC에 의해 처리된 SW480 및 HT116 세포에서의 IRF3 전좌, 이어서 3시간 동안 3㎍/㎖의 dsDNA90에서의 dsDNA 형질감염의 면역형광 분광법 분석. 원래의 배율, 1260X. 도 15e, 상기와 동일한 5AZADC에 의한 처리, 이어서 3시간 동안 3㎍/㎖의 dsDNA90에서의 dsDNA 형질감염의 (도 15c에서와 동일한) 세포의 IFNB qPCR 분석. 도 15f, 도 15e와 동일한 세포의 IL1B qPCR 분석. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; 스튜던트 t-시험.
도 16a-16f. STING 신호 결함은 대장암 세포가 DNA 바이러스 감염에 더 걸리기 쉽게 한다. 도 16a, (도 4a-4f에서와 동일한) 세포를 1시간 동안 M.O.I. 5에서 HSV1γ34.5에 의해 감염시키고, 인간 IFNB 유도를 감염 후 3시간에 qPCR에 의해 분석하였다. 도 16b, 정상 인간 hTERT 세포 및 선택된 인간 대장암 세포주(cGAS 양성: SW1116, HT29; cGAS 음성: SW480, HT116)를 1시간 동안 표시된 M.O.I.에서 HSV1γ34.5에 의해 감염시키고, HSV1γ34.5의 적정을 24시간 후 Vero 세포에서 표준 플라크 검정에 의해 분석하였다. 도 16c, (도 16b에서와 동일한) 세포를 1시간 동안 M.O.I. 1에서 HSV1γ34.5에 의해 감염시키고, 세포 생존능력을 24시간 및 48시간 후 트립판 블루 염색에 의해 분석하였다. 도 16d, (도 16a에서와 동일한) 세포를 1시간 동안 표시된 M.O.I.에서 HSV1-Luc에 의해 감염시키고, 루시퍼라제 활성을 24시간 후 분석하였다. 도 16e, 대장암 세포를 M.O.I. 100에서 백시니아 바이러스에 의해 감염시키고, 감염 후 3시간에 IFNB 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. 도 16f, 도 16e와 동일한 세포를 CXCL10 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다.
도 17a-17h. 인간 대장암 세포주 및 대장암 조직 마이크로어레이에서의 STING 및 cGAS의 RNA 인시츄 혼성화 분석. 도 17a, 정상 및 인간 대장암 세포주에서의 STING 및 cGAS 발현의 RNA 형광 인시츄 혼성화(RNA FISH) 분석. 이미지는 1260X로 도시되어 있다. 도 17b, 5일 동안 모의 처리되거나 1μM의 5 AZADC에 의해 처리된 SW480 및 HT116에서의 STING 및 cGAS 발현의 RNA FISH 분석. 이미지는 1260X로 도시되어 있다. 도 17c, 도 17a에서의 STING 및 cGAS RNA 카피수의 정량화. 도 17d, 도 17b에서의 cGAS RNA 카피수의 정량화. 도 17e, 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 정상 및 인간 대장암 세포주에서의 STING 및 cGAS 발현을 색소생산성 RNA 인시츄 혼성화(RNA CISH)에 의해 분석하였다. STING 및 cGAS RNA 카피수의 정량화는 막대 그래프에 도시되어 있다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 도 17f, STING 및 cGAS RNA CISH 분석의 대표적인 이미지는 600X로 도시되어 있다. 도 17g, FFPE 인간 대장암 조직 마이크로어레이에서의 STING 및 cGAS 발현의 RNA CISH 분석. 12개의 정상 조직 및 80개의 암 조직의 전체를 분석하고, STING 및/또는 cGAS에 의해 검출된 다수의 조직은 표에 요약되어 있다. 도 17h, 도 17g에서의 RNA CISH의 대표적인 이미지는 400X로 도시되어 있다.
도 18a-18e. 증가한 HSV1γ34 .5 종양세포붕괴성 효과는 생체내 손상된 STING 신호를 가지는 대장암 세포에서 관찰되었다. 도 18a, 누드 마우스에서의 이종이식편 종양에 대한 HSV1γ34.5 치료의 반응식. 표시된 이종이식편 종양(SW116, 도 18b; HT29, 도 18c; SW480, 도 18d; HT116, 도 18e)은 누드 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에서 생성되었다. 종양이 대략 0.5㎝ 직경에 도달할 때, 종양을 50㎕의 PBS 중의 1E7 PFU HSV1γ34.5(N=7) 또는 오직 50㎕의 PBS(N=3)에 의해 전체 3회(화살표) 격일로 주사하고, 종양 성장을 격일로 측정하였다. 통계 분석은 비대칭 스튜던트 t-시험을 이용하여 마지막 시점에서 2개의 치료 그룹을 비교함으로써 수행되었다. P 값은 표시된 바와 같다.
도 19는 형광성 분광법 하에 리포펙타민 2000 형질감염 후 3시간에 FITC-dsDNA90에 의해 모니터링된 대장암 세포주로의 dsDNA90 형질감염 효율을 보여준다.
도 20a-20d. 정상 세포 및 대장암 세포를 3일 동안 비특이적 siRNA(si-NT) 또는 STING siRNA(si-STING)에 의해 처리한 후, 3시간 동안 3㎍/㎖에서 dsDNA90 형질감염시켰다. 이후, 세포를 STING siRNA 효율에 대해 면역블롯(도 20a)에 의해 그리고 IFNB 발현(도 20b) 및 CXCL10 발현(도 20c)에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. 도 20d, 세포를 상기처럼 siRNA에 의해 유사하게 처리한 후, 3시간 동안 MOI 5에서 HSVγ34.5 감염시켰다. 이후, 세포를 IFNB 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다.
도 21a-21c. 도 21a, cGAS의 근위 프로모터 구역에 위치한 CpG 섬의 도식적 표시. 도 21b, cGAS 프로모터 구역의 바이설파이트 서열분석. 각각의 박스는 바닥에서 위치 마커에 의해 표시된 프로모터 구역 내에 위치한 하나의 CpG 다이뉴클레오타이드를 나타낸다. 그레이스케일은 메틸화, 탈메틸화 및 비서열분석을 비교한다. 도 21c, 대장암 세포를 5일 동안 1μM에서 5AZADC(DNA 메틸전환효소 저해제), SAHA(히스톤 탈아세틸라제 저해제) 및 BIX01294(히스톤-라이신 메틸전환효소 저해제)에 의해 처리하였다. 이후, cGAS 발현을 qPCR에 의해 조사하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다.
도 22. 정상 세포 및 대장암 세포를 20시간 동안 15mM에서 AOM 또는 DMH에 의해 처리하였다. IFNB 유도를 qPCR에 의해 분석하였다. STING, IRF3 및 NF-kB 전좌를 조사하였다: +, 전좌; -, 전좌 무.
도 23a-23c. 도 23a, 다양한 형질전환된 또는 암 유래한 인간 세포주에서의 STING의 면역블롯. HUVEC를 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 23b, 세포주에서의 STING mRNA 발현의 노던 블롯 분석. 도 23c, 16시간 동안 3㎍/㎖의 폴리I:C 또는 dsDNA90에 의해 형질감염되거나 모의 형질감염된 세포의 배지에서의 IFNB 생성의 ELISA 분석. PASMC, NHDF-ad 및 hTERT를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 24는 대장암 세포주에서의 STING의 서열분석을 보여준다.
도 25는 대장암 세포주에서의 cGAS의 서열분석을 보여준다.
도 26a-26d. STING 발현은 억제되고, dsDNA 유도된 선천성 면역 활성화는 대부분의 인간 흑색종 세포주에서 손상된다. 도 26a, hTERT 섬유아세포, 정상 인간 상피 멜라닌세포(HEMa) 및 일련의 인간 흑색종 세포주를 STING 발현에 대해 면역블롯(상부)에 의해 및 cGAS 발현에 대해 qPCR(하부)에 의해 분석하였다. 도 26b, 16시간 동안 3㎍/㎖의 폴리I:C 또는 dsDNA90에 의해 형질감염되거나 모의 형질감염된 (A와 동일한) 세포의 배지에서의 인간 인터페론 β 생성의 ELISA 분석. 3시간 동안 3㎍/㎖의 dsDNA90에 의해 형질감염되거나 모의 형질감염된 (도 26a와 동일한) 세포에서의 인간 CXCL10(도 26c) 및 IFNB(도 26d) 유도의 qPCR 분석.
도 27a-27d. dsDNA 유도된 STING 신호전달 경로는 대부분의 인간 흑색종 세포주에서 결함이 있었다. 3시간 동안 3㎍/㎖의 dsDNA90에 의해 형질감염되거나 모의 형질감염된 정상 및 인간 흑색종 세포주에서의 STING 전좌(도 27a), IRF3 전좌(도 27b) 및 p65 전좌(도 27c)의 면역형광 분광법 분석. 원래의 배율, 1260X. 막대 크기, 1㎛. 도 27d, 표시된 시간 기간 동안 3㎍/㎖의 dsDNA90에 의해 형질감염된 (상기와 동일한) 세포에서의 STING 신호 활성화의 면역블롯 분석.
도 28a-28c. 인간 흑색종 세포주에서의 STING 및 cGAS의 RNA 인시츄 혼성화 및 면역조직화학 분석. 도 28a, 정상 및 인간 흑색종 세포주에서의 STING 및 cGAS 발현의 RNA 형광 인시츄 혼성화(RNA FISH) 분석. 대표적인 이미지는 1260X로 도시되어 있다. 막대 크기, 500㎚. STING 및 cGAS RNA 카피수의 정량화는 막대 그래프에 도시되어 있다. 도 28b, 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 정상 및 인간 흑색종 세포주에서의 STING 및 cGAS 발현의 색소생산성 RNA 인시츄 혼성화(RNA CISH) 분석. 대표적인 이미지는 600X로 도시되어 있다. 막대 크기, 1㎛. STING 및 cGAS RNA 카피수의 정량화는 막대 그래프에 도시되어 있다. 도 28c, 흑색종 세포에서의 STING 및 cGAS 발현의 면역조직화학 분석. 이미지는 400X로 도시되어 있다. 막대 크기, 20㎛.
도 29. STING 및 cGAS 발현은 인간 흑색종의 높은 백분율에서 억제되었다. 정상 인간 상피 및 인간 흑색종 조직을 함유하는 인간 흑색종 조직 마이크로어레이에서의 STING 및 cGAS의 면역조직화학 분석. STING 및 cGAS에 대해 염색된 정상 인간 상피 및 인간 흑색종 조직의 대표적인 이미지. 이미지는 400X로 도시되어 있다. 막대 크기, 50㎛. STING 및 cGAS 발현 상태는 요약되고 바닥 패널에 도시되어 있다.
도 30a-30g. DNA 탈메틸화는 인간 흑색종 세포주에서 STING 및 cGAS 발현을 부분적으로 발생반복시켰다. 도 30a, 5일 동안 모의 처리되거나 1μM의 5-아자사이티딘(5AZADC)에 의해 처리된 표시된 인간 흑색종 세포에서의 cGAS 발현의 qPCR 분석. 도 30b, 상기와 동일하게 처리된 표시된 인간 흑색종 세포에서의 STING의 면역블롯 분석. 도 30c, 상기와 동일하게 5AZADC에 의해 처리된 (상기와 동일한) 세포에서의 STING 및 cGAS의 RNA FISH 분석. 대표적인 이미지는 1260X로 도시되어 있다. 막대 크기, 400㎚. 5AZADC에 의해 처리된 후, 3시간 동안 3㎍/㎖의 dsDNA90에서 dsDNA 형질감염된 (상기와 동일한) 세포에서의 IFNB(도 30d) 및 CXCL10(도 30e)의 qPCR 분석. 도 30d에서와 동일하게 처리된 표시된 세포에서의 IRF3 전좌(도 30f) 및 STING 전좌(도 30g)의 면역형광 분광법 분석. 대표적인 이미지는 1260X로 도시되어 있다. 막대 크기, 500㎚.
도 31a-31d. STING 신호 결함은 흑색종 세포가 HSV1 감염에 더 걸리기 쉽게 한다. (도 1에서와 동일한) 세포를 1시간 동안 M.O.I. 5에서 HSV1γ34.5에 의해 감염시키고, 인간 IFNB(도 31a) 및 CXCL10(도 31B) 유도를 감염 후 3시간에 qPCR에 의해 분석하였다. 도 31c, 정상 인간 hTERT 세포 및 선택된 인간 흑색종 세포주를 1시간 동안 표시된 M.O.I. 또는 M.O.I. 10에서 HSV1γ34.5에 의해 감염시키고, HSV1γ34.5의 적정을 24시간 후 vero 세포에서 표준 플라크 검정에 의해 분석하였다. 도 31d, (도 31c에서와 동일한) 세포를 1시간 동안 M.O.I. 10에서 HSV1γ34.5에 의해 감염시키고, 세포 생존능력을 24시간 및 48시간 후 트립판 블루 염색에 의해 분석하였다.
도 32a-32d. 증가한 HSV1γ3 4 .5 종양세포붕괴성 효과는 생체내 손상된 STING 신호를 가지는 흑색종 이종이식편에서 관찰되었다. 도 32a, A375; 도 32b, SK-MEL-5; 도 32c, RPMI7951; 및 도 32d, SK-MEL-3 흑색종 이종이식편을 누드 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에서 생성하였다. 종양이 대략 0.5㎝ 직경에 도달할 때, 종양에 50㎕의 PBS 중의 1E7 PFU HSV1γ34.5 또는 오직 50㎕의 PBS에 의해 전체 3회(화살표) 격일로 주사하고, 종양 성장을 격일로 측정하였다. 비대칭 스튜던트 t-시험을 이용하여 마지막 시점에 2개의 치료 그룹을 비교하는 통계 분석을 수행하였다.

본 개시내용은 STING 활성에 대해 암의 세포를 평가하는 것 및 표시된 치료에 의해 암을 치료하는 것을 수반하는 암 치료 치료제를 선택하는 방법을 제공한다. 하기 기재된 실시형태는 이들 방법의 대표적인 예를 예시한다. 그럼에도 불구하고, 이 실시형태의 설명으로부터, 하기 제공된 설명에 기초하여 본 발명의 다른 양태가 만들어지고/만들어지거나 실행될 수 있다.

일반적인 방법

종래의 면역학적 및 분자 생물학적 기법을 수반하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 면역학적 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 방법론 논문에 기재되어 있고, 예컨대 문헌[Current Protocols in Immunology, Coligan et al., ed., John Wiley & Sons, New York. Techniques of molecular biology are described in detail in treatises such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에 자세히 기재되어 있다. 의학 치료의 일반적인 방법은 문헌[McPhee and Papadakis, Current Medical Diagnosis and Treatment 2010, 49th Edition, McGraw-Hill Medical, 2010; and Fauci et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, McGraw-Hill Professional, 2008]에 기재되어 있다.

대장암 세포의 STING의 기능의 분석은 수행되었고, STING이 흔히 발현되지만, STING 기능이 분석된 세포의 대략 86%에서 제거되었다(n=12)는 것을 발견하였다. 그러나, cGAS는 분석된 세포의 30% 내지 50%에서 검출 가능하지 않았다. cGAS가 결여된 대장암 세포에서, STING 기능은 완전히 제거되었다. 검출 가능한 cGAS를 가지는 암 대장 세포에서, STING 기능은 극적으로 감소하였다. STING 및 cGAS가 흑색종을 포함하는 다양한 다른 암에서 없어진다는 것이 또한 주목되었다.

선천성 면역계는, 종양형성을 제어할 수 있는 경로에 또한 영향을 미칠 수 있긴 하지만, 병원균 감염에 대한 제1선의 방어를 제공한다. 예를 들어, 선천성 면역 반응에서 톨 유사 수용체(TLR) 및 IL-1 수용체(IL-1R) 신호전달 경로를 수월하게 하는 세포 어댑터 MyD88(골수성 분화 원발성 반응 유전자 88)이 NF-κB 활성화, 사이토카인 분비 및 염증성 반응의 제어를 통해 종양형성을 조절할 수 있다는 것이 공지되어 있다. MyD88이 결여된 마우스는 약물 아족시메탄(AOM) 및 황산덱스트란 나트륨(DSS)에 의해 유도된 대장염 관련된 발암물질생성(CAC)에 걸리기 쉽다. 이 상황에서, MyD88은, IL-22 결합 단백질(IL-22-BP)의 수지상 세포 생성을 하향조절하는, 상피 세포에서, IL-18의 생성을 수월하게 함으로써 부분적으로 보호 효과를 발휘한다. IL-22-BP는, 세포/조직 손상에 반응하여 선천성 림프구성 세포로부터 생성되고, 장 상피 세포의 증식을 강력하게 자극하는, IL-22의 기능을 억제한다.

아족시메탄(AOM)은 1,2-다이메틸하이드라진(DMH)의 대사물질이고, DNA 손상 반응을 촉발하도록 O-메틸-구아닌 형성을 매개하는 메틸아족시메탄올(MAM)로 전환된다. 마우스로의 AOM의 단일 주사, 이어서 식수를 통한 염증성 물질 황산덱스트란 나트륨(DSS)의 투여는 거의 100% 대장암을 유도한다. 세포 단백질 STING(세포 유전자의 자극인자)이, 톨-수용체 9 또는 DNA 센서 AIM II에 독립적인, 시토졸 DNA 촉발된 선천성 면역 신호전달 경로를 수월하게 한다는 것이 이전에 입증되었다. 인간에서, STING은, 바이러스, 예컨대 단순 포진 바이러스 1(HSV1) 및 심지어 박테리아에 의한 감염에 반응하여 선천성 면역 신호전달 경로를 촉발하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진, 조혈 계통의 세포, 및 상피 세포에서 주로 발현된 348개 아미노산 소포체(ER) 연관된 분자이다. STING은 또한 혈관 및 폐 증후군, 자가-DNA-유도된 염증성 질환, 예컨대 아이카디-구티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres syndrome: AGS)(아마도 중증 전신 홍반 루푸스(SLE)의 형태)을 촉발하는 데 책임 있는 것으로 밝혀졌다. STING은 직접적으로 dsDNA-종과 연관될 수 있고, 소정의 박테리아 또는 시토졸 dsDNA에 의해 생성된 사이클릭 다이뉴클레오타이드(CDN)에 의해 매우 활성화되어서, cGAS(사이클릭 GMP-AMP 생성효소, C6orf150, Mab-21 도메인 함유 단백질)라 불리는, 생성효소의 활성화를 촉발한다.

STING이 다양한 염증 추진 사건을 제어하는 데 있어서 중추적 역할을 하는 것으로 보이다는 것을 고려하면, 본 명세서에 기재된 방법은 염증 악화된 암에서 STING의 역할을 해결한다. MyD88과 유사한 관찰인 AOM/DSS 모델을 이용하여, STING 결핍 마우스(SKO)는 CAC에 감수성이어서, 종양형성에서 STING에 대한 보호 역할을 제시한다. 후속하는 분석은 STING 신호전달 및 사이토카인 생성이 분석된 많은 대장암 세포에서 제거된다는 것을 나타낸다. 데이터는 STING이 손상된 장 상피 세포의 제거를 촉진하는 중요한 센서일 수 있다는 것을 나타낸다. STING 신호전달의 소실은, 이러한 세포가 면역계로부터의 감시를 회피하게 할 수 있는 사건인, 대장 연관된 암에서 흔한 사건일 수 있다.

정의

용어 "약" 또는 "대략"은 어떻게 값이 측정되거나 결정되는지에 따라 달라지는, 당해 분야의 숙련자에 의해 결정되는 바와 같은, 특정한 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내, 즉 측정 시스템의 한계를 의미한다. 예를 들어, "약"은 당해 분야의 실행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더 바람직하게는 5% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 그 값의 규모의 차수 내, 바람직하게는 5배 내, 더 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 출원 및 청구항에 기재될 때, 달리 기재되지 않는 한 특정한 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.

용어 "면역 반응을 유도한다 또는 증대시킨다"는 치료제가 투여되지 않은 대조군 샘플에 비해 통계학적으로 측정 가능한 면역 반응의 유도 또는 증가를 발생시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 면역 반응의 유도 또는 증대는 대상체에서 예방학적 또는 치료학적 반응을 발생시킨다. 면역 반응의 예는 I형 IFN의 생성의 증가, 바이러스에 대한 내성의 증가 및 대안적인 병원균에 의한 다른 유형의 감염이다. 종양에 대한 면역 반응(항종양 반응)의 증대 또는 종양을 예방하거나 기존의 종양을 제거하기 위한 백신의 개발.

용어 "STING"은, 제한 없이, 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드 가닥, 상보성 서열, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 상동성 및/또는 이종상동성 STING 분자, 동형단백질, 전구체, 돌연변이체, 변이체, 유도체, 스플라이스 변이체, 대립유전자, 상이한 종, 및 이들의 활성 단편을 포함하도록 의도된다. STING 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 미국 특허 공보 20130039933 및 20110262485에 기재되어 있다.

용어 "기능적 STING 유전자가 결여된다"는 형질전환 동물이 STING을 코딩하는 유전자가 결여되거나, STING의 발현에 필요한 다른 유전적 성분(예를 들어, 프로모터)이 결여된다는 것을 의미한다.

달리 표시되지 않는 한, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 본 명세서에서 상호교환되어 사용되지만, 통상적으로 이들은 다양한 크기의 펩타이드 서열을 의미한다.

용어 "변이체"는, 폴리뉴클레오타이드 서열의 맥락에서 사용될 때, 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포괄할 수 있다. 이 정의는 또한 예를 들어 "대립형질", "스플라이스", "종", 또는 "다형" 변이체를 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 기준 분자에 대한 상당한 식별을 가질 수 있지만, mRNA 프로세싱 동안 엑손의 교대하는 스플라이싱으로 인해 일반적으로 더 많거나 더 적은 다수의 폴리뉴클레오타이드를 가질 것이다. 상응하는 폴리펩타이드는 추가적인 기능적 도메인 또는 도메인의 부재를 보유할 수 있다. 종 변이체는 종마다 변하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 야생형 유전자 생성물의 변이체가 본 발명에서 특히 유용하다. 변이체는 핵산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이로부터 생길 수 있고, 구조 또는 기능이 변경되거나 변경되지 않을 수 있는 폴리펩타이드 또는 변경된 mRNA를 발생시킬 수 있다. 임의의 소정의 천연 또는 재조합 유전자는 무의, 1개의 또는 많은 대립형질 형태를 가질 수 있다. 변이체를 생성시키는 흔한 돌연변이 변화는 일반적으로 뉴클레오타이드의 천연 결실, 부가 또는 치환 때문이다. 변화의 이들 유형의 각각은 단독으로, 또는 다른 것과 조합되어, 소정의 서열에서 1회 이상 발생할 수 있다.

생성된 폴리펩타이드는 일반적으로 서로에 대해 상당한 아미노산 식별을 가질 것이다. 다형 변이체는 소정의 종의 개체 사이에 특정한 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열의 변동이다. 다형 변이체는 또한 폴리뉴클레오타이드 서열이 일 염기만큼 변하는 "단일 뉴클레오타이드 다형"(single nucleotide polymorphism: SNP) 또는 단일 염기 돌연변이를 포함할 수 있다. SNP의 존재는 예를 들어, 내성에 대해 감수성인, 질환 상태에 대한 소인을 가지는 소정의 집단을 나타낼 수 있다.

유도체 폴리뉴클레오타이드는 화학 변형, 예를 들어 알킬, 아실 또는 아미노기에 의한 수소의 대체로 처리되는 핵산을 포함한다. 유도체, 예를 들어 유도체 올리고뉴클레오타이드는 천연 비발생 부분, 예컨대 변경된 당 모이어티 또는 당간 연결을 포함할 수 있다. 이들 중에서 당해 분야에 공지된 포스포로티오에이트 및 다른 황 함유 종이 예시적이다. 유도체 핵산은 또한 라벨, 예컨대 라디오뉴클레오타이드, 효소, 형광성 물질, 화학발광 물질, 색소생산성 물질, 기질, 보조인자, 저해제, 자기 입자 등을 함유할 수 있다.

"유도체" 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 예를 들어 글라이코실화, 페길화, 인산화, 황화, 환원/알킬화, 아실화, 화학 커플링 또는 온화한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 방사선동위원소, 형광성 및 효소 라벨(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 직접적이든 또는 간접적이든, 검출 가능한 라벨을 함유하도록 또한 변형될 수 있다.

용어 "면역조절"은 면역원성(즉, 면역 반응을 자극하거나 증가시킴) 또는 면역억제성(즉, 면역 반응을 감소시키거나 억제함)인 화합물, 조성물 또는 물질을 의미한다.

"항원 제시 세포"(antigen presenting cell: APC)는 T 세포를 활성화할 수 있는 세포이고, 단핵구/대식세포, B 세포 및 수지상 세포(DC)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 용어 "수지상 세포" 또는 "DC"는 림프구성 또는 비림프구성 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 구성원을 의미한다. 이들 세포는 이의 구별되는 형태, 높은 수준의 표면 MHC-II 종류 발현에 의해 규명된다. DC는 다수의 조직 소스로부터 단리될 수 있다. DC는 MHC 제한된 T 세포를 감작화하는 높은 역량을 가지고, 인시츄로 T 세포에 항원을 제시하는 데 있어서 매우 효과적이다. 항원은 T 세포 발육 및 관용성 동안 발현된 자가 항원, 및 정상 면역 과정 동안 존재하는 외래 항원일 수 있다.

용어 "발현 벡터"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 몇몇 경우에, RNA 분자는 이후 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 다른 경우에, 이 서열은 예를 들어 안티센스 분자, siRNA, 리보자임 등의 생성에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정한 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 의미하는 다양한 조절 서열을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 지배하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능을 하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.

특정한 핵산과 관련하여, "코딩하는" 또는 "코딩된", "코팅한다"란, 특정한 단백질로의 번역을 위한 정보를 포함한다는 것을 의미한다. 단백질을 코딩하는 핵산은 핵산의 번역된 구역 내의 비번역된 서열(예를 들어, 인트론)을 포함할 수 있거나, (예를 들어, cDNA에서처럼) 이러한 개재하는 비번역된 서열이 결여될 수 있다. 단백질이 코딩되는 정보는 코돈의 사용에 의해 규정된다. 통상적으로, 아미노산 서열은 "보편적" 유전적 코드를 이용하여 핵산에 의해 코딩된다.

본 명세서에 사용된 바대로, 핵산과 관련하여 "비상동성"은 외래 종으로부터 기원하거나, 동일한 종 기원인 경우, 의도적인 인간 중재에 의해 조성 및/또는 게놈 유전좌위에서 이의 네이티브 형태로부터 실질적으로 변형된 핵산이다. 예를 들어, 비상동성 구조 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 구조 유전자가 유래한 것과 다른 종으로부터 유래하거나, 동일한 종 기원인 경우, 하나 또는 둘 다는 이의 원래의 형태로부터 실질적으로 변형된다. 비상동성 단백질은 외래 종으로부터 기원할 수 있거나, 동일한 종 기원인 경우, 의도적인 인간 중재에 의해 이의 원래 형태로부터 실질적으로 변형된다.

"샘플"은 이의 광의로 본 명세서에서 사용된다. 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체 등을 포함하는 샘플은 체액; 세포 제제의 가용성 분획 또는 세포가 성장하는 배지; 세포로부터 단리되거나 추출된 염색체, 세포소기관 또는 막; 용액 중의 또는 기질에 결합된, 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드; 세포; 조직; 조직 프린트; 지문, 피부 또는 모발; 등을 포함할 수 있다.

용어 "환자", "대상체" 또는 "개체"는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되고, 치료되는 포유류 대상체를 의미하고, 인간 환자가 바람직하다. 몇몇 경우에, 본 개시내용의 방법은 실험 동물에서, 수의 분야에서, 및 설치류, 예컨대 마우스, 랫트 및 햄스터; 영장류, 개 및 고양이(이들로 제한되지는 않음)를 포함하여 질환을 위한 동물 모델의 개발에서 용도가 발견된다.

"진단학적" 또는 "진단된"은 병리학적 병태의 존재 또는 성질을 식별하는 것을 의미한다. 진단학적 방법은 이의 감수성 및 특이성이 다르다. 진단학적 검정의 "감수성"은 양성으로 시험된 이환된 개인의 백분율("참 긍정"의 백분율)이다. 검정에 의해 검출되지 않은 이환된 개체는 "거짓 부정"이다. 이환되지 않은, 검정에서 음성으로 시험된 대상체는 "참 부정"이라 칭해진다. 진단학적 검정의 "특이성"은 1 - 거짓 긍정률이고, 여기서 "거짓 긍정률"은 양성으로 시험된 질환이 없는 사람의 비율로 정의된다. 특정한 진단학적 방법이 병태의 확정적인 진단을 제공하지 않을 수 있지만, 상기 방법이 진단을 돕는 긍정적인 표시를 제공하는 경우 이것은 충분하다.

본 명세서에서 방법과 관련하여 사용되는 바와 같은, 용어 "치료한다", "치료된", "치료하는" 및 "치료"는 사건, 질환 또는 병태의 임상 증상, 증상발현 또는 진행을, 일시적으로 또는 영구적으로, 부분적으로 또는 완전히, 제거하거나, 감소시키거나, 억제하거나, 경감시키는 것을 의미한다. 이러한 치료는 유용하다는 것이 절대적일 필요는 없다. 치료를 요하는 사람은 장애를 이미 가진 사람, 및 장애가 예방되는 사람을 포함한다. 종양(예를 들어, 암) 치료에서, 치료제는 종양 세포의 병리학을 직접적으로 감소시키거나, 종양 세포가 다른 치료제, 예를 들어 방사선 및/또는 화학치료제에 의한 치료에 더 감수성이게 할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바대로, "경감된" 또는 "치료"는 정규화된 값(예를 들어, 건강한 환자 또는 개체에서 얻은 값)에 근접한, 예를 들어 일상적 통계 시험을 이용하여 결정된 바대로, 정규화된 값과 50% 미만 다른, 바람직하게는 정규화된 값과 약 25% 미만 다른, 더 바람직하게는, 정규화된 값과 10% 미만 다른, 훨씬 더 바람직하게는, 정규화된 값과 상당히 다르지 않은, 증상을 의미한다. 예를 들어, 종양 세포와 관련하여 용어 "치료한다" 또는 "치료하는"은 상기 세포의 진행을 중단시키는 것, 성장을 느리게 하는 것, 상기 세포의 존재와 연관된 증상의 회귀 또는 경감을 유도하는 것을 의미한다. 감염성 질환 유기체로 고통받는 개체의 치료는 개체로부터의 질환 유기체의 감소 및 제거를 의미한다. 예를 들어, 플라크 형성 단위 또는 다른 자동화된 진단학적 방법, 예컨대 ELISA 등에 의해 측정된 바와 같은, 바이러스 입자의 감소.

"암의 치료"는, (1) 어느 정도의, (i) 느려짐 및 (ii) 완전한 성장 정지를 포함하는 종양 성장의 저해; (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 유지; (4) 종양 크기의 감소; (5) 말초 장기로의 종양 세포 침윤의 (i) 감소, (ii) 느려짐 또는 (iii) 완전한 예방을 포함하는 저해; (6) 전이의 (i) 감소, (ii) 느려짐 또는 (iii) 완전한 예방을 포함하는 저해; (7) (i) 종양 크기의 유지, (ii) 종양 크기의 감소, (iii) 종양의 성장의 느려짐, (iv) 침입의 감소, 느려짐 또는 예방을 발생시킬 수 있는 항종양 면역 반응의 증대 및/또는 (8) 어느 정도의, 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 중증도 또는 수의 경감의 효과 중 하나 이상을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "안전하고 유효한 양"은 과도한 부작용 효과(예컨대, 독성, 자극 또는 알레르기 반응) 없이 원하는 치료학적 반응을 생성하기에 충분하거나, 본 발명의 방식으로 사용될 때 합당한 이익/위험에 알맞은, 성분의 분량을 의미한다. "치료학적 유효량"이란 원하는 치료학적 반응을 생성시키기에 효과적인 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 예를 들어, 암의 성장 또는 암을 발생시키는 것을 지연시키거나, 암을 수축시키거나, 전이를 예방하기에 효과적인 양. 특정한 안전하고 유효한 양 또는 치료학적 유효량은 치료되는 특정한 병태, 환자의 신체 상태, 치료되는 포유류 또는 동물의 유형, 치료의 기간, (있다면) 공존 치료의 성질 및 이용된 특정한 제형 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 인자에 의해 변할 것이다.

"면역계의 세포" 또는 "면역 세포"는 평가될 수 있는 면역계의 임의의 세포, 예컨대 B 세포라고도 불리는 B 림프구, T 세포라고도 불리는 T 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NK) 세포, 림포카인 활성화 살해(LAK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 과립구, 비만 세포, 혈소판, 랑게르한스 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 종양 침윤(TIL) 세포, 유전자 변형된 면역 세포, 예컨대 하이브리도마, 약물 변형된 면역 세포, 및 상기 세포 유형의 유도체, 전구체 또는 선조물질(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 것으로 의도된다.

"면역 이펙터 세포"는 항원에 결합할 수 있고 항원에 선택적인 면역 반응을 매개하는 세포를 의미한다. 이들 세포는 T 세포(T 림프구), B 세포(B 림프구), 단핵구, 대식세포, 천연 살해(NK) 세포 및 세포독성 T 림프구(CTL), 예를 들어 CTL 세포주, CTL 클론 및 종양으로부터의 CTL, 염증성, 또는 다른 침윤물질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

"면역 관련 분자"는, 휴지 상태("non-stimulated") 또는 활성화 상태든, 임의의 면역 세포에서 확인된 임의의 분자를 의미하고, 임의의 수용체, 리간드, 세포 표면 분자, 핵산 분자, 폴리펩타이드, 변이체 및 이의 단편을 포함한다.

"T 세포" 또는 "T 림프구"는 흉선에서 기원하고, CD3 복합체의 단백질과 연관된 이종이합체성 수용체(예를 들어, 재배열된 T 세포 수용체, 세포의 항원/MHC 특이성을 책임지는 T 세포 표면 상의 이종이합체성 단백질)를 가지는 림프구의 하위집단이다. T 세포 반응은 다른 세포(예를 들어, 표적 세포 사멸, 다른 면역 세포, 예컨대 B 세포의 활성화)에서의 이의 효과 또는 이들이 생성하는 사이토카인에 대한 검정에 의해 검출될 수 있다.

구절 "T 세포 반응"은 T 세포를 수반하는 면역학적 반응을 의미한다. "활성화된" T 세포는 항원 특이적 기억 T 세포 또는 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생성하도록 분할된다. 세포독성 T 세포는 항원을 함유하는 것으로 인식된 세포에 결합하고 이를 파괴한다. 기억 T 세포는 항원에 의해 활성화되고, 이로써 이미 조우한 항원에 대한 반응을 제공한다. 항원에 대한 이 전체 반응은 항원 특이적, 예를 들어 종양 특이적 T 세포 반응이다.

"2차 면역 반응" 또는 "적응성 면역 반응"은 활성 또는 수동일 수 있고, 동물의 삶 동안 확립된 체액(항체 기반) 또는 세포일 수 있고, 항원을 유도하는 데 특이적이고, 상기 항원에 의한 반복 조우에 대해 증대된 면역 반응에 의해 현저하다. 적응성 면역계의 T 림프구의 중요한 특징은 세포 표면 상의 MHC 분자에 의해 제시된 병원균 유래한 펩타이드의 극미한 농도를 검출하는 이의 능력이다.

본 명세서에 사용된 바대로, "약제학적 조성물"은 인간 및 포유류를 포함하는 대상체 동물에 대한 투여에 적합한 조성물을 의미한다. 약제학적 조성물은 약물학적 유효량의 본 발명의 바이러스성 또는 항원성 조성물을 포함하고, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은 활성 성분(들), 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 만드는 불활성 성분(들)을 포함하는 조성물, 및 임의의 2개 이상의 성분의 배합, 복합체화 또는 응집으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생긴, 임의의 생성물을 포괄한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물 또는 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 혼합함으로써 제조된 임의의 조성물을 포괄한다.

본 명세서에 사용된 바대로, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 배지, 코팅, 항세균성 및 진균성 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 및 부형제, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 덱스트로스 또는 만니톨의 5% 수성 용액, 및 에멀션, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 애쥬반트를 포함한다. 적합한 약제학적 담체 및 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기재되어 있다. 조성물에 유용한 약제학적 담체는 활성 물질의 의도된 투여 방식에 따라 달라진다. 통상적인 투여 방식은 장용(예를 들어, 경구) 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사; 또는 국소, 경피 또는 점막경유 투여)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "약학적으로 허용 가능한 염"은, 예를 들어 금속염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는, 약제학적 용도를 위한 화합물 또는 접합체로 제제화될 수 있는 염이다.

본 명세서에 사용된 바대로, "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약물학적으로 허용 가능한"은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 재료를 의미하고, 즉 재료는 임의의 원치않는 생물학적 효과를 발생시키거나 이것이 함유된 조성물의 임의의 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서, 또는 하기 기재된 바대로 당해 분야에 널리 공지된 경로를 이용할 때 개체에게 투여될 수 있다.

"검출 가능한 모이어티" 또는 "라벨"은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학 수단에 의해 검출 가능한 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 라벨은 32P, 35S, 형광성 염료, 전자 밀도 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 흔히 사용되는 바대로), 바이오틴-스트렙타바딘, 다이옥시게닌, 항혈청 또는 단일클론 항체가 이용 가능한 합텐 및 단백질, 또는 표적에 서열 상보성을 가지는 핵산 분자를 포함한다. 검출 가능한 모이어티는 대개 샘플에서 결합된 검출 가능한 모이어티의 양을 정량화하기 위해 사용될 수 있는 측정 가능한 신호, 예컨대 방사능, 색소생산성, 또는 형광성 신호를 생성한다.

라벨

몇몇 실시형태에서, STING, cGAS 또는 다른 분자는 이의 검출을 용이하게 하도록 표지된다. "라벨" 또는 "검출 가능한 모이어티"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출 가능한 조성물이다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적합한 라벨은 방사능 라벨(예를 들어, ³²P), 형광단(예를 들어, 플루오레세인), 전자 밀도 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 흔히 사용되는 바대로), 바이오틴, 다이옥시게닌 또는 합텐, 및 예를 들어 합텐 또는 펩타이드로 방사성 동위원소를 혼입함으로써 검출 가능해지거나, 합텐 또는 펩타이드와 특이적으로 반응성인 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있는, 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 라벨의 예는 형광성 염료(예를 들어, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성 동위원소(예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³²P), 효소(예를 들어, 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타제 및 ELISA에서 흔히 사용되는 기타), 및 비색 라벨. 예컨대 콜로이드성 골드, 유색 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

라벨은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 원하는 성분으로 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 일 실시형태에서 라벨은 본 발명에 따라 활성 물질의 접합을 위해 아이소사이아네이트 시약을 이용하여 분자에 공유 결합된다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 이기능적 아이소사이아네이트 시약은, 이에 부착된 활성 물질 없이, 라벨 표적 분자 접합체를 형성하기 위해 표적 분자에 라벨을 접합시키도록 사용될 수 있다. 라벨 표적 분자 접합체는 본 발명에 따라 표지된 접합체의 합성을 위한 중간체로서 사용될 수 있거나, 표적 분자 접합체를 검출하도록 사용될 수 있다. 상기 표시된 바대로, 매우 다양한 라벨은 필요한 감수성, 원하는 성분과의 접합의 용이성, 안정성 요건, 이용 가능한 기기장치 및 폐기 규정에 따라, 라벨의 선택에 의해, 사용될 수 있다. 비방사능 라벨은 간접 수단에 의해 대개 달성된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어, 바이오틴)는 표적 분자에 공유 결합된다. 이후, 리간드는 본래 검출 가능하거나 신호 시스템, 예컨대 검출 가능한 효소, 형광성 화합물, 또는 화학발광 화합물에 공유로 결합된 또 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합한다.

상기 방법에서 사용에 대해 본 명세서에서 고려되는 STING, cGAS 또는 다른 분자는 예를 들어 효소 또는 형광단과의 접합에 의해 신호 생성 화합물에 직접적으로 또한 접합될 수 있다. 라벨로서 사용하기에 적합한 효소는 가수분해효소, 특히 포스파타제, 에스터라제 및 글라이코시다제 또는 옥시도타제, 특히 퍼옥시다제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 형광성 화합물, 즉 라벨로서 사용하기에 적합한 형광단은 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 형광단의 추가의 예는 에오신, TRITC-아민, 퀴닌, 플루오레세인 W, 아크리딘 옐로우, 리사민 로다민, B 설포닐 클로라이드 에리쓰로세인, 루테늄(트리스, 비피리디늄), 텍사스 레드, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 라벨로서 사용하기에 적합한 화학발광 화합물은 루시페린 및 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 예를 들어 루미놀을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다양한 표지화 또는 신호 생성 시스템의 검토를 위해, 미국 특허 제4,391,904호를 참조한다.

라벨을 검출하는 수단은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 라벨이 방사능일 때, 검출을 위한 수단은 방사능사진촬영술에서처럼 섬광 카운터 또는 사진 필름을 포함한다. 라벨이 형광성 라벨일 때, 이것은 형광색소를 적절한 광 파장에 의해 여기시키고 생성된 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 전자 검출기, 예컨대 전하 커플링 장치(charge coupled device: CCD) 또는 광전자증배관 등의 사용에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소 라벨은 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 비색 또는 화학발광 라벨은 단순히 라벨과 연관된 색상을 관찰함으로써 검출될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 다른 표지화 및 검출 시스템은 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명확할 것이다. 이러한 표지된 조절제 및 리간드는 질환 또는 건강한 병태의 진단에서 사용될 수 있다.

약제학적 조성물의 형성

인간 또는 시험 동물에게 본 개시내용의 조성물을 투여하기 위해, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물 중에 활성 물질을 제제화하는 것이 바람직하다. 구절 "약학적으로 또는 약물학적으로 허용 가능한"은 하기 기재된 바와 같은 당해 분야에 널리 공지된 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 다른 부작용을 생성하지 않는 분자 집합체 및 조성물을 의미한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 배지, 코팅, 항세균성 및 진균성 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

또한, 화합물은 물 또는 흔한 유기 용매와 용매화물을 형성할 수 있다. 이러한 용매화물가 또한 고려된다.

상기 조성물은 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및 비강내, 및, 원하는 경우 국소 치료를 위해, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 점적주사는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 바람직하게는, 투약은 부분적으로 투여가 잠깐 또는 만성이든지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 주어진다. 예를 들어 원하는 위치로 놓인 카테터를 통한, 국소, 특히 경피, 경점막, 직장, 경구 또는 국소 투여를 포함하는 다른 투여 방법이 고려된다.

본 명세서에 기재된 활성 물질을 함유하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 투여의 경로에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 담체 또는 첨가제의 예는 물, 약제학적 허용 가능한 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카복시비닐 중합체, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴릭 나트륨, 나트륨 알기네이트, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 잔탄 검, 아라비아 검, 카제인, 젤라틴, 한천, 다이글라이세린, 글라이세린, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스, 약학적으로 허용 가능한 계면활성제 등을 포함한다. 사용된 첨가제는 본 개시내용의 제형에 따라, 적절한 바대로, 상기 또는 이들의 조합으로부터 선택되지만, 이들로 제한되지는 않는다.

약제학적 조성물의 제제는 선택된 투여 경로(예를 들어, 용액, 에멀션)에 따라 변할 것이다. 투여되는 조성물을 포함하는 적절한 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체 중에 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀션을 위해, 적합한 담체는 예를 들어 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 예컨대 식염수 및 완충 배지를 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정유를 포함할 수 있다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 보존제, 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다.

다양한 수성 담체, 예를 들어 무균 인산염 완충 식염수 용액, 정균 물, 물, 완충 물, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신 등은, 온화한 화학 변형 등으로 처리되는, 증대된 안정성을 위한 다른 단백질, 예컨대 알부민, 지단백, 글로불린 등을 포함할 수 있다.

치료학적 제제는 원하는 정도의 순도를 가지는 활성 물질을 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장에 준비된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투약량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN(상표명), PLURONICS(상표명) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함한다.

본 명세서에서 제제는 치료되는 특정한 적응증, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 가지는 것에 필요한 바대로 하나 초과의 활성 화합물을 또한 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합으로 적합하게 존재한다.

활성 성분은, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 중에 또는 마크로에멀션 중에, 각각, 예를 들어 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 또한 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 무균이어야 한다. 이것은 무균 여과 막을 통해 여과에 의해 용이하게 달성된다.

수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 습윤제는 천연 발생 포스파타이드, 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래한 부분 에스터의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래한 부분 에스터의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 또한 함유할 수 있다.

본 명세서에 기재된 활성 물질은 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 면역글로불린과 효과적인 것으로 밝혀졌다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기법이 이용될 수 있다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 소실을 발생시킬 수 있고, 사용 수준이 보상하도록 조정될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다.

물의 첨가에 의해 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성 화합물을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 상기 이미 언급된 것에 의해 예시된다.

이 제제 내의 활성 물질의 농도는 예를 들어 약 0.5중량% 미만, 보통 적어도 약 1중량%로부터 많이는 15 또는 20중량%로 광범위하게 변할 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식에 따라 주로 유체 용적, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다. 따라서, 비경구 주사에 통상적인 약제학적 조성물은 1㎖의 무균 완충 물, 및 50㎎의 활성 물질을 함유하도록 이루어질 수 있다. 정맥내 점적주사에 통상적인 조성물은 250㎖의 무균 링거 용액, 및 150㎎의 항체를 함유하도록 이루어질 수 있다. 비경구로 투여 가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 명확할 것이고, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)]에 더 자세히 기재되어 있다. 활성 물질의 효과적인 투약량은 투여당 1㎏의 체중당 0.01㎎ 내지 1000㎎의 범위 내이다.

약제학적 조성물은 무균 주사용 수성, 유질 현탁액, 분산액 또는 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말의 형태일 수 있다. 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 분야에 따라 제제화될 수 있다. 무균 주사용 제제는 또한 비독성의 비경구로 허용 가능한 희석제 또는 용매 중의, 예를 들어 1,3-뷰탄 다이올 중의 용액으로서 무균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 적합한 이들의 혼합물, 식물성 오일, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 또한, 무균, 고정유는 용매 또는 현탁 배지로서 종래에 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노글라이세라이드 또는 다이글라이세라이드를 포함하는 임의의 블란드 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산은 주사용의 제제에서 용도가 발견된다.

모든 경우에, 형태는 무균이어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항세균제 및 진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발생할 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 발생할 수 있다.

투여에 유용한 조성물은 이의 효율을 증가시키도록 유입 또는 흡수 인핸서에 의해 제제화될 수 있다. 이러한 인핸서는 예를 들어 살리실레이트, 글라이코콜레이트/리놀레에이트, 글라이콜레이트, 아프로티닌, 바시트라신, SDS, 카프로에이트 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285 (1996)) 및 Oliyai and Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544 (1993))]을 참조한다.

또한, 본 개시내용에서 사용에 고려되는 조성물의 친수화도 및 소수화도의 특성은 잘 균형을 이루어서, 시험관내 및 특히 생체내 사용 둘 다에 이의 유용성을 증대시키는 한편, 이러한 균형이 결여된 다른 조성물은 실질적으로 유용성이 덜하다. 구체적으로, 본 개시내용에서 사용에 고려되는 조성물은, 화합물이 추정상 작용 부위로 세포막을 횡단하게 하는, 지질 중의 용해도를 또한 가지면서, 신체 내에 흡수 및 생체이용률을 허용하는 수성 배지 중의 적절한 정도의 용해도를 가진다. 따라서, 고려되는 항체 조성물은 이것이 표적 항원 활성의 부위로 전달될 수 있을 때 최대로 효과적이다.

투여 및 투약

일 양태에서, 본 개시내용의 방법은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 무균 조성물이다.

본 개시내용의 방법은 주사, 경구 섭취, 비강내, 국소, 경피, 비경구, 흡입 스프레이, 질내 또는 직장 투여(이들로 제한되지는 않음)를 비롯하여 포유류 대상체에게 직접적으로 또는 간접적으로 치료제를 도입하기 위한 임의의 의학적으로 허용된 수단을 이용하여 수행된다. 용어 비경구는, 본 명세서에 사용된 바대로, 피하, 정맥내, 근육내 및 낭내 주사, 및 카테터 또는 점적주사 기법을 포함한다. 피내, 유방내, 복강내, 척추강내, 연수후부, 폐내 주사에 의한 투여 및 또는 특정한 부위에서의 수술 이식이 또한 고려된다.

일 실시형태에서, 투여는 부위로의 직접 주사에 의해 또는 내부로 제제를 전달할 수 있는 지속된 전달 또는 지속된 방출 기전을 통해 치료를 요하는 암 또는 이환된 조직의 부위에서 수행된다. 예를 들어, 조성물(예를 들어, 가용성 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)을 지속적으로 전달할 수 있는 생분해성 마이크로구 또는 캡슐 또는 다른 생분해성 중합체 구성은 암의 부위에서 또는 그 근처에서 이식된 본 개시내용의 제제에 포함될 수 있다.

치료학적 조성물은 다수의 부위에서 환자에게 또한 전달될 수 있다. 다수의 투여는 동시에 주어질 수 있거나, 시간 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 소정의 경우에, 치료학적 조성물의 연속 흐름을 제공하는 것이 유리하다. 추가적인 치료는 기간 기준으로, 예를 들어 시간마다, 일마다, 격일로, 주마다 2회, 주마다 3회, 주마다, 2주마다, 3주마다, 달마다, 또는 더 긴 간격으로 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 물질, 예컨대 화학치료제(이것으로 제한되지는 않음)와 조합된 복수의 물질, 예컨대 활성 물질 조성물의 투여가 본 개시내용에서 또한 고려된다. 적합한 화학치료제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신(상기 Rowland et al., (1986)) 및 하기 표에 기재된 것을 포함한다.

소정의 투약량의 활성 물질 조성물의 양은 치료제가 투여되는 개체의 몸집, 및 치료되는 장애의 특징에 따라 변할 수 있다. 예시적인 치료에서, 약 1㎎/일, 5㎎/일, 10㎎/일, 20㎎/일, 50㎎/일, 75㎎/일, 100㎎/일, 150㎎/일, 200㎎/일, 250㎎/일, 500㎎/일 또는 1000㎎/일을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 이 농도는 단일 제형 또는 다수의 용량으로 투여될 수 있다. 처음에 동물 모델에서 및 이후 임상 시험에서, 표준 용량-반응 연구는 특정한 질환 상태 및 환자 집단에 대한 최적 투약량을 밝혀냈다.

소정의 투약량에서의 활성 물질의 양이 치료제가 투여되는 개체의 몸집, 및 치료되는 장애의 특징에 따라 변할 수 있다고 또한 고려된다. 전통적인 치료제가 본 개시내용의 치료제와 조합되어 투여되는 경우 투약이 변형될 수 있다는 것이 또한 명확할 것이다.

본 방법을 이용하여 치료될 수 있는 예시적인 병태 또는 장애는 암, 예컨대 식도암, 췌장암, 전이성 췌장암, 전이성 췌장 선암, 방광암, 위암, 섬유증 암, 신경교종, 악성 신경교종, 산재성 내재성 뇌교 신경교종, 재발성 유아 뇌 신생물 신장 세포 암종, 투명 세포 전이성 신장 세포 암종, 신장암, 전립선암, 전이성 거세 저항성 전립선암, IV 병기 전립선암, 전이성 흑색종, 흑색종, 악성 흑색종, 피부의 재발성 흑색종, 흑색종 뇌 전이, IIIA 병기 피부 흑색종; IIIB 병기 피부 흑색종, IIIC 병기 피부 흑색종; IV 병기 피부 흑색종, 두경부의 악성 흑색종, 폐암, 비소세포 폐암(non small cell lung cancer: NSCLC), 편평 세포 비소세포 폐암, 유방암, 재발성 전이성 유방암, 간세포 암종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종, 비호지킨 림프종, 진행된 B 세포 NHL, HL, 예컨대 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL), 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 관해 중인 성인 급성 골수성 백혈병; Inv(16)(p13.1q22)를 동반한 성인 급성 골수성 백혈병; CBFB-MYH11; t(16;16)(p13.1;q22)를 동반한 성인 급성 골수성 백혈병; CBFB-MYH11; t(8;21)(q22;q22)를 동반한 성인 급성 골수성 백혈병; RUNX1-RUNX1T1; t(9;11)(p22;q23)을 동반한 성인 급성 골수성 백혈병; MLLT3-MLL; t(15;17)(q22;q12)를 동반한 성인 급성 전골수구 백혈병; PML-RARA; 알킬화제 관련 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군; 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 성인 교모세포종; 성인 신경교육종, 재발성 교모세포종, 재발성 소아 횡문근육종, 재발성 유잉 육종/말초 원시 신경외배엽 종양, 재발성 신경아세포종; 재발성 골육종, 대장결장암, MSI 양성 대장결장암; MSI 음성 대장결장암, 비강인두 비각화성 암종; 재발성 비강인두 미분화 암종, 자궁경부 선암; 자궁경부 선편평 암종; 자궁경부 편평 세포 암종; 재발성 자궁경부암종; IVA 병기 자궁경부암; IVB 병기 자궁경부암, 항문관 편평 세포 암종; 전이성 항문관 암종; 재발성 항문관 암종, 재발성 두경부암; 암종, 두경부의 편평 세포, 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma: HNSCC), 난소 암종, 대장암, 위암, 진행된 GI 암, 위 선암; 위식도 접합부 선암, 골 신생물, 연조직 육종; 골육종, 흉선 암종, 요로 암종, 재발성 머켈 세포 암종; III 병기 머켈 세포 암종; IV 병기 머켈 세포 암종 및 골수형성이상 증후군을 포함한다.

실시예 1

AOM에 의한 STING 의존적 유전자의 활성화.

만성 염증이 대장암을 악화시키는 것으로 공지되어 있고, STING이 특히 시토졸 자체 또는 병원균 관련된 DNA에 의해 유발된, 염증성 반응에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다는 것을 고려하면, 염증성 대장염 연관된 발암물질생성(CAC)의 제어에서의 STING의 역할을 조사하였다. 이 목적을 향해, 상기 기재된 바와 같은, AOM/DSS 모델을 이용하고 STING 신호전달 시 AOM 및 전구체 DMH의 효과를 분석하였다. 원칙적으로, 야생형(WT) 또는 STING 결핍(SKO) 쥣과 배아 섬유아세포(MEF)를 8시간 동안 DMH 또는 대사물질 AOM에 의해 시험관내 처리하고, 유전자 발현으로 인한 결과를 분석하도록 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 이 연구는 AOM이, IFIT3 및 Cxcl2를 포함하는, WT 세포에서의 매우 다양한 선천성 면역 관련 유전자의 mRNA 생성을 활성화한다는 것을 나타낸다(도 1a; 도 7). 그러나, STING이 결여된 세포(SKO)에서의 동일한 유전자의 생성의 현저한 감소가 있어서, AOM이 실제로 STING 경로를 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다(도 1a, 왼쪽 패널). DMH에 의한 세포의 처리 후 유사한 효과가 관찰되었다(도 1a, 오른쪽 패널). 관찰된 STING 의존적 유전자 발현은 선택 mRNA, 예컨대 Cxcl10 및 IFIT3의 RT-PCR 분석 후 확인되었다(도 1b). 유사하게, 정상 인간 대장 상피 세포(FHC)를 AOM에 의해 처리하고, 선천성 면역 유전자의 유사한 유도가 관찰되었고, Cxcl10을 포함하는 STING에 의해 제어되었다(도 1c). AOM에 의한 Cxcl10의 생성은 STING에 대해 RNAi에 의해 처리된 FHC에서 유사하게 감소하였다(도 1d). 따라서, DNA 손상물질 DMH/AOM은 STING 의존적 신호전달을 유발할 수 있다.

DMH/AOM-유도된 STING 활성에 기초하는 기전을 결정하는 것을 시작하기 위해, MEF 또는 FHC 세포는 이 약물에 의해 처리었고, 2개의 상이한 접근법, 항-dsDNA 항체를 이용한 DAPI 염색 및 면역형광(IF), 세포기질로의 DNA의 누수에 의해 관찰되었다(도 8a 및 도 8b). 시토졸 DNA는 STING을 활성화하고, 사이토카인 생성을 촉발하는 전사 인자 IRF3 및 NF-κB를 보유하는 엔도솜 구역으로의 자가소화작용을 통한 STING/TBK1 통행을 자극한다. 따라서, 이 중요한 전사 인자를 활성화하는 STING의 능력에 대한 DMH/AOM 처리의 결과를 결정하기 위해, 이 약물에 의해 처리된 FHC에서의 IF 분석을 수행하였다. 이 연구는 DMH/AOM이 처리된 세포에서 IRF3/NF-κB의 전좌를 부추길 수 있다는 것을 나타낸다(도 8c). 따라서, DMH/AOM은 생각건대 세포기질로의 DNA의 누수를 통해 STING 의존적 신호전달을 유도한다(도 1a; 도 8a 및 도 8b).

STING의 소실은 마우스가 CAC에 걸리기 쉽게 한다: 데이터는 DMH/AOM이 시험관내 STING를 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다. 생체내 이의 결과를 조사하기 위해, 마우스를 AOM에 의해 1회 및 후속하여 DSS의 4회 치료에 의해 경구로 치료하였다. 이것 전에, 장에서의 STING 발현을 IHC에 의해 분석하였다. 이 연구는 STING이 프로프리아층 세포, 및 위장관의 내피 및 상피 세포에서 발현된다는 것을 밝혀냈다(도 1e). 13주 후, 마우스를 대장에서의 종양 발생에 대해 분석하였다. 놀랍게도, STING이 결여된 마우스(SKO)는 야생형 마우스(WT)와 비교하여 훨씬 더 높은 빈도로 대장 종양을 발생시켰다(도 2a-c; 도 9a). 실제로, 7개 중 4개의 WT 마우스는 동일한 시간 기간 내에 7개 중 7개의 SKO와 비교하여 종양 형성을 나타냈다(도 2a 및 도 2b; 도 9a), 헤마톡실린 및 에오신(HE) 분석은 AOM/DSS 처리된 SKO 마우스가 WT 마우스와 비교하여 대장에서의 유의미한 염증성 세포 침윤 및 선암의 발생을 나타냈다는 것을 확인시켜주었다(도 2b; 도 9b). 그러나, 마이크로어레이 분석은 WT 마우스로부터의 종양이, SKO 마우스로부터 인출된 종양과 비교하여, 아마도 STING의 소실이 면역조절 전사 사건을 억제하므로, Cxcl13 및 Ccr6과 같은 선택 유전자 발현의 더 높은 수준을 나타냈다는 것을 나타낸다(도 2e). STING이 손상된 DNA를 인식하고, 이러한 세포를 없애도록, 생각건대 조직 회복을 촉진하거나 면역계를 자극할 수 있는, 사이토카인의 생성을 활성화할 수 있다고 추정된다. 따라서, STING의 소실은 손상된 세포가 면역 감시 과정을 회피하고 종양으로 더 용이하게 진행하도록 할 수 있다.

만성 STING 활성화는 염증성 장 질환에 책임이 있다. 세포 손상물질, 예컨대 AOM 및 덱스트란 설페이트(DSS)에 반응한 일시적 STING 활성화는 상처 치유를 수월하게 한다. 따라서, STING의 소실은 대장 회복의 결여 및 STING 독립적 염증성 반응을 악화시키는 유전자독성 미소생물상의 침윤을 발생시킬 수 있다. 그러나, DSS와 같은 물질에 의한 야생형 마우스에서의 STING의 만성 자극은 염증성 장 질환(IBD)을 발생시킬 수 있다. 따라서, 저해제/약물/화합물에 의한 STING 활성의 억제는 IBD, 예컨대 크론병 및 궤양성 대장염을 감소시킬 수 있다.

STING 결핍 마우스에서의 IL22BP 발현의 억제. STING의 소실이 대장암 발생을 촉진한다는 것을 입증하는 데 있어서, STING 활성과 연관된 종양 억제 기전은 명확해져야 하게끔 있다. STING이 종양 억제인자 p53과 유사한 직접 종양 억제, 성장 저해 또는 아폽토시스촉진 특성을 발휘할 수 있다는 것이 타당하게 있다. 추가로, AOM 처리는 빈번한 Ras 돌연변이를 유발하는 것으로 공지되어 있고, 이는 STING의 소실의 맥락에서 세포 형질전환을 촉진할 수 있다. p53 기능이 소실된 환경에서의 종양형성의 발현은 정상 세포에 소프트 한천에서 병소를 형성하는 능력을 주고, 종양형성성이 되게 한다. 이 가능성을 평가하기 위해, WT, SKO, 또는 p53-결핍 MEF를 Myc 또는 활성화된 Ras에 의해 양성 대조군으로서 형질감염시키고, 세포 형질전환을 모니터링하였다. MEF의 p53의 결여는 Myc 또는 활성화된 Ras의 도입에 의해 용이하게 형질전환되는 것으로 발견되었다. 그러나, MEF의 STING의 결여는 Myc, 또는 활성화된 Ras의 과발현에 의해 형질전환에 눈에 띄게 감수성인 것으로 보이지 않았다. 따라서, STING의 부재는 적어도 시험관내 또는 세포 형질전환 과정에서 Myc 또는 Ras와 협력하기 위해 종양형성 자극을 발휘하는 것으로 보이지 않았다.

그러나, 소정의 사이토카인, 예컨대 IL-18, IL-22 또는 선천성 면역 어댑터 MyD88이 결여된 마우스는 AOM/DSS 유도된 CAC에 유사하게 감수성인 것으로 입증되었다. 이 상황에서, MyD88은 IL-18R을 통해 IL-18의 생성을 촉진함으로써 보호 효과를 발휘하고, 이 IL-18R은 IL-22BP를 저해하는 데 필요하다. IL-22BP는 IL-22 기능을 억제하는 데 필요하고, 이는 발암물질 또는 염증성 물질에 의한 손상 후 장 상피 세포의 증식을 촉진할 수 있다. IL-18 또는 IL-22BP가 결여된 마우스는 STING 결핍 마우스와 유사하게 CAC에 매우 감수성이었다. 마이크로어레이 분석으로부터 STING 활성화 dsDNA(dsDNA90 염기쌍)에 의해 처리된 SKO MEF에서 IL-18 수준이 감소한다는 것에 주목한다(도 3a). 따라서, IL-18/IL-22BP 축의 가능한 조절에 대한 STING의 관여의 조사가 이루어졌다. 첫째로, 이 사이토카인의 프로모터가 선천성 면역 유전자 활성화 전사 인자, 예컨대 STAT1, NF-κB, IRF1 및 IRF7에 의해 인식된 많은 부위를 보유하는 것으로 공지되었다는 것이 추가로 주목되므로, IL-18 발현에 대한 STING의 영향의 확인이 이루어졌다. 분석은 매우 다양한 세포 유형에서 발현된 IL-18이, dsDNA 또는 STING 활성화 CDN(cGAMP)에 의한 MEF 세포의 처리 후 결정된 바대로, STING 유도성 유전자라는 것을 나타낸다(도 3a). 유사한 연구는 DMH/AOM이 STING 의존적 방식으로 수지상 세포에서의 IL-18의 생성을 또한 촉발할 수 있다는 것을 나타내고, 이는 IL-18이 STING 경로를 통해 실제로 유도될 수 있다는 것을 확인시켜 준다.

확인 이후, DSS 처리가 생체내 IL-18 및 IL-22BP 발현에 영향을 미칠 수 있는지의 조사가 이루어졌다. DSS 처리의 7일 후, 대장을 WT 또는 SKO 마우스로부터 인출하고, IL-18, IL-22BP 또는 IL-22 발현을 RT-PCR에 의해 분석하였다. 이 연구는 IL-18 발현이 2일 처리 후 STING이 결여된 마우스(SKO)에서 감소하다는 것을 나타낸다(도 3b). 그러나, CD11c⁺ 수지상 세포로부터 주로 발현된 단백질인 IL-22BP 발현에서의 훨씬 더 뚜렷한 감소가 WT 마우스와 비교하여 SKO 마우스에서 관찰되었다(도 3b). 반대로, IL-22의 발현은 비교적 영향을 받지 않았다. IL-22BP 수준이, IL-18 수준이 또한 비교적 낮다고 관찰된, STING의 부재 하에 억제될 수 있다는 것이 주목된다는 것이 놀랍다. 그러나, IL22-BP의 하향조절이 심지어 IL-18의 부재 하에도 발생할 수 있다고 보고되어서, 이는 다른 STING 의존적 인자가 IL-22BP의 조절에 또한 기여할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 연구를 보완하기 위해, AOM/DSS 섭생을 가지는 SKO 마우스 또는 대조군을 처리하고, 13주 후 처리된 마우스로부터 취한 정상 또는 종양 조직에서의 IL-22BP 발현 수준을 다시 분석하였다. DSS 처리 단독과 유사하게, 관찰은 WT 마우스와 비교하여 SKO 마우스의 종양에서 IL-22BP의 발현을 크게 감소시켰다는 것에 주목한다(도 3c). 그러나, IL-18 및 IL-22 수준은 덜 극적으로 영향을 받는 것으로 보인다. 종합하면, (예를 들어, DSS에 의한) 장 손상 후 대장 조직을 침입할 수 있는 미생물 리간드의 감지 또는 DNA 손상이 STING 활성을 촉발하여서 IL-18을 생성시킬 수 있다는 것이 고안 가능하다. 이 사건은 IL-22BP 생성을 억제하고, IL-22가 조직 회복을 촉진하게 할 수 있게 한다. 그러나, 장기간에 STING 기능의 소실은 또한 IL-22BP 생성에 영향을 미치는 것으로 보이고, 이는 IL-22의 성장 자극인자 특성을 제어하는 데 중요하다. 이 사건은 미생물에 의해 매개될 수 있어서, IL-22BP 생성을 제어하는 STING 의존적 선천성 면역 경로를 촉발한다. 따라서, 데이터는, MyD88, IL-18 또는 IL-22BP가 결여된 마우스와 유사하게, STING 결핍 마우스가 AOM/DSS에 의해 유도된 CAC의 경향이 또한 있다는 것을 나타낸다.

STING 활성은 대장 종양 세포에서 억제된다. 데이터는 STING이, 염증 주도의 CAC를 촉진하는, 발암물질 및 아마도 미생물을 보호하는 데 필요하다는 것을 나타낸다. STING은 생각건대 DNA 손상을 감지하고, 항종양 면역감시 세포에 대한 사건을 신호전달한다. 수지상 세포(DC), 예컨대 CD8 알파 DC는 종양 세포 또는 괴사 종양 세포 부스러기를 둘러싸고, 둘러싸인 세포 또는 부스러기로부터의 DNA는 외부적으로 DC에서 STING을 활성화한다. 이것은 항종양 T 세포 반응에 필수적인 사이토카인을 생성시킨다. 이를 고려하면, STING 기능의 결함이 손상된 세포가 면역계를 침입하게 할 수 있다는 것이 실현 가능하기 때문에, 인간 대장 세포에서의 STING 신호전달을 분석하였다. 따라서, 인간 대장 암 세포에서의 STING 신호전달을 평가하기 위해서, 대조군으로서의 hTERT 및 (FHC) 장 상피 세포에서의 STING 발현을 조사하였다. STING은 이 세포에서 발현되고, 형질감염된 시토졸 DNA(dsDNA 90 염기쌍)에 반응하여, I형 IFN을 생성하는 것으로 밝혀졌고, 이는 STING 의존적 사건인 것으로 공지되어 있다(도 4a-c). dsDNA에 의한 유사한 유도성 효과는 또한 매우 dsDNA 유도성인, STING 조절된 유전자인 Cxcl10에 의한 측정 후 주목되었다(도 4d). 다음에, 대장암의 다양한 병기로부터 단리된 다양한 종양 세포에서의 STING의 발현을 조사하였고, 11개 중 10개의 세포주가 STING을 발현한다는 것이 밝혀졌다(도 4a; 도 12). 그러나, STING 경로는 분석된 대부분의 세포에서 결함 있고(80% 초과), 이러한 세포는 시토졸 dsDNA에 반응하여 I형 IFN을 효율적으로 생성할 수 없었다(도 4a-c). 분석된 11개 중 오직 2개의 세포주(SW116 및 LS123)는 시토졸 DNA 자극에 반응하여 I형 IFN을 오직 약간 생성할 수 있는 것으로 보였다. 반대로, 형질감염된 합성 dsRNA(폴리I:C)는 암 세포의 3개가 아니라 모두에서 비교적 훌륭히 I형 IFN의 생성을 자극할 수 있고, 아마도 이는 RIGI/MDA5 경로가 기능적이라는 것을 나타낸다. 이 분석을 확인하기 위해, 형질감염된 시토졸 DNA를 사용한 STING 경로의 자극 후 대장암 세포에서의 DNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 이 데이터는 I형 IFN을 포함하는 분석된 대장암 세포, 및 다른 중요한 선천성 면역 조절 유전자, 예컨대 CXCL10, CXCL11 및 CCl5의 숙주에서 STING 의존적 원발성 선천성 면역 유전자 활성화의 유의미한 억제를 나타냈다(도 4e 및 도 4f). LoVo 세포는 시토졸 DNA 유도된 세포를 유도하는 약간의 능력을 보유하는 것으로 관찰된 한편, HT116 세포는 STING 의존적 신호전달에서 유의미하게 결함인 것으로 보였다. 데이터는 STING 의존적 선천성 면역 경로가 대장 종양 세포주에서 우선적으로 하향조절되는 것으로 보인다는 것을 나타낸다.

STING 불활화의 기전을 더 분석하기 위해, 정상 또는 대장 종양 세포에서 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하였다. 시토졸 DNA의 존재 하에, STING이 활성화되고, 전사 인자 NF-κB 및 IRF3(인터페론 조절 인자 3)의 활성화에 필요한 비정규 자가소화작용 연관된 과정을 통해 전좌한다는 것이 이전에 밝혀졌다. 따라서, 브레펠딘(Brefeldin) A의 사용을 통한 또는 중요한 자가소화작용 조절제 VPS34의 억제를 통한 STING 전좌의 봉쇄는 STING 신호전달 기능을 저해한다. 따라서, 정상 또는 인간 대장암 세포를 STING을 활성화시키도록 dsDNA에 의해 형질감염시키고, 11개 중 오직 4개의 세포주(LS123, SW480, LoVo 및 HT29)가 STING 통횡의 증거를 나타낸다는 것이 관찰되었다(도 5a). 이후, 이 연구는 IHC 기법을 이용하여 유사하게 처리된 세포에서 전사 인자 NF-κB 및 IRF3의 전좌를 분석함으로써 완료되었다. IRF3이, SW480을 제외하고, STING 통횡을 촉진하는 세포에서 전좌할 수 있다는 것이 관찰되었다(도 5b). 이것은, 부분적으로, LoVo와 같은 마이크로어레이에 의해 분석된 세포 중 몇몇에서 선천성 면역 유전자의 부분 자극을 설명할 수 있다. 그러나, 오직 2개의 세포(LS1116, LS123)는 NF-κB 하위단위 p65의 전좌를 나타냈다(도 5c). IRF3 및 NF-κB 둘 다가 I형 IFN의 최적 전사에 필요하므로, 이것은 LS1116 및 LS123이 시토졸 DNA에 의한 처리 후 I형 IFN 생성을 부분적으로 자극할 수 있는 한편, 나머지는 그렇지 않은지를 설명할 수 있다(도 4b 및 도 4c). 그러나, 시토졸 DNA 의존적 STING 제어된 신호전달이 기재된 바대로 조사된 모든 대장암 유형에서 심각하게 결합 있었다(도 4).

이 발견을 더 확장하기 위해, 정상 또는 대장 종양 세포에서 면역블롯 분석을 수행하였다. 시토졸 DNA의 존재 하에, STING은 인산화를 겪고, 이후, 아마도 IRF3을 인산화하기 위한 TBK1의 방출을 통해, 이의 활성을 촉진하는 경우에 분해되었다. 첫째로, 활성화 후 STING 인산화/분해는 분석된 많은 세포주에서 지연되고, 이는 STING 기능(예를 들어, LS123, SW480, SW1417, HT116)에 영향을 미칠 수 있다(도 5d). 몇몇 STING 통횡을 나타낸 종양 세포(LS1116, LS123, LoVo 및 HT29)에서, IRF3 키나제 활성인자 탱크 결합 키나제 1(Tank binding kinase 1: TBK1)이 시토졸 DNA의 존재 하에 인산화를 겪었다는 확인이 이루어졌다(도 5d). 따라서, 활성 TBK1을 가지는 세포에서 포스포-IRF3 활성의 관찰(도 5d)이 이루어졌다. SW480, SW1417, SW48 및 HT116과 같은 종양 세포의 나머지는, 아마도 STING이 자가소화작용을 겪을 수 없음으로 인해, 또는 STING 발현이 SW48의 경우에서처럼 완전히 부재하므로, 포스포-TBK1 활성 또는 IRF3 전좌를 나타내지 않았다(도 5d). 놀랍게도, 관찰은 매우 대부분의 세포가 p65 전좌가 결여되고, p65의 인산화가 명확하다는 것을 나타냈다(예를 들어, LoVo, HT29, SW480 및 SW1417). 이것은 NF-κB 신호전달이 p65 전좌의 수준에서 결함 있을 수 있다는 것을 제안할 수 있다. 종합하면, 연구는 STING-신호전달이 조사된 매우 다양한 대장암 세포에서 결함 있다는 것을 명확히 나타낸다.

사이클릭 다이뉴클레오타이드(CDN)는 STING을 활성화하는 것으로 밝혀졌다. CDN은 시토졸 dsDNA 종을 통해 생성되어서, cGAS(사이클릭 GMP-AMP 생성효소, C6orf150, Mab-21 도메인 함유 단백질)라 칭해지는, 생성효소의 활성화를 촉발하는 것으로 밝혀졌다. cGAS의 소실은 STING 신호전달에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 상기 연구를 보완하기 위해, 대장암 세포주에서의 cGAS의 발현을 조사하였다. 이 분석은 11개 중 5개의 대장암 세포가, STING 전좌 및 TBK1/IRF3 활성의 소실과 상관되더라도, 검출 불가능한 수준의 cGAS 발현을 가진다는 것을 나타낸다(파선 또는 박스에 의해 강조된 도 5d 및 5e). 흥미롭게도, cGAS 발현의 소실이 탈메틸화 물질 라인(SW480, HT116)을 사용하여 구제될 수 있고, 이는 몇몇 세포가 억제된 cGAS 프로모터 활성을 나타냈다는 것을 나타낸다(도 5f). 그러나, cGAS 발현의 구제는 결정된 바대로 STING 활성을 튼튼하게 구제하지 않았고(도 13a 및 도 13b), 이는 STING 신호전달에서의 추가의 결함이 이 세포에서 존재할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 발견을 고려하면, 종양형성의 다양한 병기에서의 47개의 인간 대장암에서의 cGAS의 발현의 조사를 분석하였다(도 13c). cGAS의 발현은 분석된 세포의 대략 30%로 낮거나 검출 불가능하다. 따라서, cGAS 또는 STING 발현, 또는 신호전달의 결함은 많은 다수의 종양 대장암 세포주에서 결함인 것으로 나타났고, 종양형성의 주요 원인을 구성할 수 있었다. 그러나, 유사하게 결함 있는 STING-신호전달이 조사된 매우 다양한 다른 종양 세포에서 발견되었다는 것에 주목해야 하고, 이는 STING 기능의 결함이 대장의 세포 이외의 세포에서 흔하다는 것을 나타낸다(도 14).

결함 있는 STING 신호전달을 가지는 암 세포는 바이러스 종양용해에 감수성이었다. 많은 암 세포는 항바이러스 반응에서 결함 있는 것으로 밝혀졌지만, 기전은 완전히 결정되어야 하게끔 있다. 실제로, 다양한 바이러스는 dsDNA 게놈을 보유하는 단순 포진 1(HSV1)을 포함하는 항종양 치료제로서의 이의 효율을 결정하기 위해 클리닉에서 이제 사용된다. HSV1은 STING의 활성화를 통해 선천성 면역 반응을 강력하게 촉발하는 것으로 밝혀졌다. STING 신호전달에서의 마우스 결핍은 치사 HSV1 감염에 극도로 민감한데, 왜냐하면 이들이 I형 IFN의 생성을 비롯하여 적절한 선천성 면역 반응을 시작하는 능력이 결여되기 때문이다. STING 신호전달이 많은 다수의 암 세포에서 결함 있다는 발견을 고려하면, HSV1 감염에 대한 이의 감수성을 조사하였다. 첫째로, 루시퍼라제를 발현하는 재조합 HSV1(HSV1-Luc)에 대한 반응의 분석이 이루어졌다. 이 분석은 결함 있는 STING 신호전달을 나타내는 대장암 세포가 높은 수준의 HSV1-Luc 발현이 가능하게 한다는 것을 나타낸다(도 6a). 그러나, 부분 STING 의존적 선천성 면역 반응을 나타낸 2개의 암 세포주(SW116 및 LS123)(도 4b-d), 및 대조군 hTERT 및 FHC는 튼튼한 HSV-Luc 유전자 발현을 촉진하지 않았다(도 6a). 이것은, dsDNA에 대한 이의 반응과 유사하게, CXCL10을 생성함으로써 감염에 반응하는 정상 세포 및 SW116 및 LS123와 일치하였다(도 6b 및 도 6c; 도 4c). 심각하게 결함 있는 STING 기능을 보유하는 종양 세포는 감염 후 I형 IFN을 튼튼하게 생성하지 않았다. 이 연구를 확장하기 위해, 부분적으로 숙주 세포 번역 셧오프(shut-off)의 예방을 통해 숙주 방어를 저해하는 것으로 보고된, 바이러스 단백질을 코딩하는, γ34.5 유전자가 결여된 HSV 작제물(HSV1 γ34.5)을 사용하였다. γ34.5가 결여된 유사한 바이러스는 항암제로서 클리닉에서 조사되고 있다. STING-신호전달에서 결함 있는 대장암 세포는 HSV1 γ34.5에 의한 감염 후 효율적인 I형 IFN 반응을 시작할 수 없다는 것이 관찰되었다(도 6d). 따라서, STING-신호전달의 조사는 HSV1 또는 다른 바이러스 기반 항암 치료제가 악성 질환의 치료에 효율적인지에 대한 유용한 예후적 마커일 수 있다.

실험 절차

마우스: STING 넉아웃 마우스(SKO, Sting ^-/- )를 마이애미 대학교 실험실에서 생성하였다(Ishikawa 2008). 야생형 마우스(WT)를 대조군으로서 사용하였다. 마우스 관리 및 연구를 마이애미 대학교의 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)로부터 승인 하에 수행하였다.

급성 DSS 대장염. 6-8주령의 WT 및 SKO 마우스를 실험 그룹 및 대조군으로 나눴다. 실험 그룹에서의 마우스는 5일 동안 3% 황산덱스트란 나트륨(DSS, MP 160110; MW 36000-5000), 이어서 2일 동안 정규 식수를 받았다. 증류수를 대조군 마우스에 투여하였다.

AOM /DSS는 대장염 연관된 종양 유도를 유도하였다: WT 및 SKO 마우스에 10mg/㎏의 용량으로 아족시메탄(AOM; MP 180139; MW 74.08)을 복강내 주사하였다. 5%의 DSS는 3주마다 7일 동안 식수로 투여되었다. DSS 사이클을 4회 반복하였다. 91일에서, 다수의 용종을 계수하기 위해 맹검 방식으로 미세 내시경 절차를 수행하였다. 마우스를 121일에 희생시키고, 대장을 절제하고, PBS에 의해 수세처리하고, 조직학을 위해 포르말린 중에 고정시키고, RNA 발현 분석을 위해 동결시켰다.

1차 세포 배양: 마우스 배아 섬유아세포(MEF)는 기재된 바와 같은 표준 절차에 의해 e15 배아로부터 얻어졌다. 골수 유래한 수지상 세포는 8-10주령 마우스의 뒷다리 대퇴골로부터 단리되었다. 간단하게, 골수 세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Invitrogen)에 의해 골로부터 수세처리하고, 10% 열은 23 게이지 침에 의해 소 태아 혈청(FCS, Invitrogen)을 불활화시키고, 4시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 부유 세포를 수확한 후, 대략 2X10⁷개의 세포를 CD11c 양성 수지상 세포에 대해 10ng/㎖의 재조합 마우스 GM-CSF(GM-CSF, BioLegend)를 포함하는 완전 DMEM을 가지는 10㎝ 접시에서 시딩하였다. 1주 후, 골수 유래한 수지상 세포를 얻었다. 정상 인간 대장 상피 세포 및 대장암 세포주를 ATCC로부터 구입하고, ATCC 지시에 따라 이의 적절한 성장 배지 중에 배양하였다. 배지 및 보충제는 Invitrogen으로부터 얻어졌다. hTERT-BJ1 텔로머라제 섬유아세포(hTERT)를 원래 Clontech로부터 구입하였고, 5% CO₂ 습윤 분위기에서 37℃에서 10% FBS, 4mM L-글루타민 및 1mM 피류브산나트륨을 가지는 4:1 비율의 DMEM:배지 199 보충제 중에 배양하였다.

유전자 어레이 분석: 전체 RNA를 RNeasy Mini 키트(74104, Qiagen(캘리포니아주 발렌시아))에 의해 세포 또는 조직으로부터 단리하였다. RNA 품질을 Bionalyzer RNA 6000 나노(Agilent Technologies(캘리포니아주 산타 클라라))에 의해 분석하였다. 유전자 어레이 분석을 마이애미 대학교의 Oncogenomics Core Facility에서 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 버전 2)((캘리포니아주 산타 클라라))에 의해 조사하였다. Illumina 어레이로부터의 원래 강도 값을 Agilent로부터의 GeneSpring(상표명) 소프트웨어에서 업로딩하였다. 값을 사분위수 정규화하고, 모든 샘플의 중앙치로 log2 변환시켰다. 유의미한 차등 발현된 유전자를 스튜던트 t-시험을 이용하여 컴퓨팅하고, P-값 ≤ 0.05의 쓰레스홀드를 이용하여 선택하였다. 선택된 차등 발현된 유전자의 계층적 클러스터링 및 시각화는 피어슨 상관관계 거리 방법을 이용하여 수행되고, 연결은 Ward 방법을 이용하여 컴퓨팅되었다. 유전자 발현 프로필을 프로세싱하고, 통계 분석을 마이애미 대학교의 Sylvester Comprehensive Cancer Center Bioinformatics Core Facility에서 수행하였다.

조직병리학. 마우스를 희생시키고, 대장 조직을 48시간 동안 10% 포르말린 중에 고정하였다. 파라핀 블록 및 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E)에 대한 모든 과정을 마이애미 대학교에서의 병리학 조사 자원 조직학 실험실(pathology research resources histology laboratory)에서 수행하였다.

통계 분석: 모든 통계 분석을, 달리 기재되지 않는 한, 스튜턴트 t 시험에 의해 수행하였다. 데이터는 P < 0.05일 때 유의미하게 다른 것으로 생각된다.

보충적 정보

정량적 실시간 PCR ( qPCR ): 전체 RNA를 M-MLV 역전사효소(Promega)를 사용하여 역전사시켰다. 선천성 면역 유전자 및 염증성 사이토카인(Cxcl10 : Mm00445235, Ifit3: Mm0170846)에 대해 Taqman 유전자 발현 검정(Applied Biosystems)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.

면역블롯 분석: 동일한 양의 단백질을 황산도데실 나트륨(SDS) - 폴리아크릴아미드 겔에서 해상하고, 이후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Millipore)으로 옮겼다. 5% 차단 시약에 의해 차단한 후, 막을 다양한 1차 항체(및 적절한 2차 항체)와 항온처리하였다. 이미지를 증대된 화학발광 시스템 ECL(Thermo Scientific)을 사용하여 해상하고, 방사능사진촬영술에 의해 검출하였다. 항체: STING에 대한 토끼 다중클론 항체를 실험실에서 개발하였고; 다른 항체는 하기 소스로부터 얻었다: β-액틴(Sigma Aldrich), p-IRF3(Cell Signaling), IRF3(Santa Cruz Biotechnology), p-TBK1, TBK1, p-p65, p65.

인터페론 β Elisa 분석: 인터페론 β(IFNB, IFNβ) Elisa를 제조사의 프로토콜에 따라 Invitrogen으로부터의 IFNβ 인간 ELISA 키트 또는 PBL Interferon Source로부터의 인간 IFNβ ELISA 키트를 사용하여 수행하였다.

면역형광 분광법: 세포를 배양하고, Lab-Tek II 챔버 슬라이드에서 이의 적절한 배지 중에 처리하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 4% 파라폼알데하이드에 의해 고정시키고, 실온에서 5분 동안 0.05% 트리톤(Triton) X-100에 의해 투과시켰다. 면역염색을 토끼-항-STING 다중클론, 이어서 형광 접합된 2차 항체(FITC-염소-항-토끼)(Invitrogen)에 의해 수행하였다. 마이애미 대학교의 Image Core Facility에서 Leica SP5 공초점 현미경에 의해 영상을 찍었다.

노던 블롯 분석: NorthernMax(등록상표)-Gly 키트(Ambion)를 사용하여 노던 블롯을 5㎍의 폴리A RNA에 의해 수행하였다. 간단하게, RNA를 1% 글라이옥살 겔 중에 해상하고, BrightStar(등록상표)-Plus 나일론으로 옮겼다.

토의

AOM/DSS 발암물질 치료에 의해 유도된 CAC의 예방에서의 STING에 대한 보호 역할이 여기서 입증되었다. 데이터는 이 사건이 IL-22BP의 생성을 제어하는 STINGS 능력을 통해 큰 부분으로 발생할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, DSS에 의한 조직 손상 후, IL-22가 유도되고, 조직 재생을 포함하는 보호성 상처 치유 효과를 나타낸다. 그러나, 제어되지 않은 채 두면, IL-22는 종양 발육을 또한 지지할 수 있다. 따라서, IL-22는 분비된 IL-22BP에 의해 단단히 조절되고, 이는 CD11c⁺ 수지상 세포에 의해 발현된다. IL-22를 제어하는 데 있어서의 IL-22BP의 중요성은, IL-22BP-결핍 마우스가 STING 결핍 마우스와 유사하게 AOM/DSS 유도된 CAC에 또한 감수성이라는 관찰을 통해 강조되었다. 그럼에도 불구하고, 그럴싸하게 IL-22의 완전한 소실이 장 회복에 지연을 야기하여서, 결국 염증성 과정을 실제로 악화시킬 수 있으므로, IL-22가 결여된 마우스가, DSS에 의해 반복적으로 치료될 때, 증대된 염증성 반응을 나타낸다고 또한 보고되었으므로, IL-22는 이중 기능을 가질 수 있다. IL-22 BP의 생성은, DSS 유도된 장 손상 후 초기에 유도되는 것으로 공지된, IL-18에 의해 억제될 수 있다. 따라서, IL-18-결핍 마우스는 아마도 비조절된 IL-22BP에 의해 IL-22 활성의 만성 억제를 통해 대장암에 또한 감수성이고, 이 IL-22BP는 IL-22-결핍 마우스에 의해 관찰된 상황을 모방할 수 있다. 그럼에도 불구하고, IL-22BP의 하향조절이 또한 IL-18의 부재시에 발생하는 것으로 보고되었으므로, IL-22BP의 제어는 완전히 명확해져야 하게끔 있다. 또한, TLR 및 IL-1R/IL-18R 어댑터 MyD88의 소실이, 부분적으로 IL-18R 신호전달의 소실로 인해, 마우스가 CAC에 또한 감수성이게 한다는 것이 공지되어 있다. 마지막으로, 아마도 상피 세포 또는 수지상 세포에 의해 생성된 Pro-IL-18가 활성 형태로의 분비 전에 절단을 요하므로, AOM/DDS 유도된 CAC의 감수성이 카스파제-1, 어댑터 PYCARD(아폽토시스 연관된 스펙 유사 단백질 함유 CARD; ASC) 또는 뉴클레오타이드 결합 도메인, 류신 농후 반복부 및 피린 도메인 함유 단백질 3 및 6(NLRP3/6)이 결여된 마우스에서 증대되는 것으로 밝혀졌다.

여기서 데이터는 IL-18이 STING 의존적 방식으로 dsDNA, 또는 CDN에 의해, 또는 AOM/DMH에 의해 유도 가능하다는 것을 나타낸다. IL-22에 의한 상황과 유사하게, 장 손상이 (DNA 손상의 결과로서 또는 심지어 미생물 리간드, 예컨대 CDN 또는 DNA로부터) STING 활성을 촉발한다고 제안되어 있다. 이것은 IL-18의 상향조절 및 IL-22BP의 하향조절을 발생시키고, 이는 IL-22가 조직 회복을 촉진하게 할 것이다. 그러나, IL-22에 의한 상황과 유사하게, STING의 장기간 소실이 상처 회복을 지연시키고, 미생물 침입을 촉진하고, 염증을 촉발할 수 있고, 이는 실제로 종양형성을 악화시킬 것이다. 아마도 이 사이토카인의 발현이 다른 경로에 의해 유도될 수 있으므로, IL-18 발현이 SKO 마우스로부터 종양에서 완전히 제거되지 않는다는 것에 주목하였다. 이것에도 불구하고, IL-22BP 수준은 SKO 마우스에서 낮게 있어서, 이는 IL-22BP 조절에서의 STING의 중요성을 입증한다. 종합적으로, 데이터는 STING이 IL-22의 IL-22BP 억제의 조절을 통해 장 조직 손상 및 CAC을 제어하는 데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

적어도 부분적으로 조직 회복을 일시적으로 촉진하거나 사이토카인의 분비를 통해 면역계에 DNA 손상 사건을 신호전달할 수 없음을 통해, STING의 소실이 종양형성촉진 상태를 유발한다는 것을 고려하면, 정상 및 암 관련 대장 세포에서의 STING의 발현 및 기능을 조사하였다. 연구는 STING이 분석된 대부분의 대장암 세포에서 발현된다는 것을 나타낸다. 그러나, STING 기능이 조사된 세포의 80% 초과에서 거의 완벽하게 결함 있다는 것이 관찰되었다. STING 신호전달의 결함은 연구된 매우 다양한 다른 종양 세포에서 또한 관찰되었다(도 14). STING은 핵산과 연관될 수 있는 한편, CDN은 STING 활성의 강력한 자극인자이다. 세포질 DNA는 생성효소 cGAS에 결합하고 CDN을 생성할 수 있고, 이것은 이후 STING에 결합하고 이를 활성화한다. 이 사건은 비정규 자가소화작용 과정을 통해 전사 인자 IRF3 및 NF-κB를 보유하는 엔도솜 구역으로 TBK1에 의한 STING 통행을 촉발하여서, 사이토카인 활성화를 발생시킨다. 데이터는 STING이 형질감염된 DNA에 반응하지 않고, 많은 경우에 전좌할 수 없다는 것을 나타낸다. 이 상황에서, IRF3 활성 및 전좌의 결여가 관찰되었다. 흥미롭게도, 아마도 CDN이 STING 기능을 촉진하도록 이용 가능하지 않으므로, STING 통횡의 소실은 (사례의 30% 초과에서) cGAS 발현의 소실과 일치하였다. 다른 상황에서, NF-κB 활성에서의 결함이 관찰되었다. NF-κB 및 IRF3 활성 둘 다가 I형 IFN 및 다른 사이토카인의 최적 생성에 필요하므로, 이들 경로 중 어느 하나 또는 둘 다의 소실은 효율적인 항종양 T 세포 반응에 필요한, IL-18 또는 I형 IFN과 같은 숙주 방어 유전자의 전사를 자극하는 STING의 능력에 해로운 효과를 가질 것이다. STING 신호전달의 소실이 DNA 손상된 세포가 면역 감시를 회피하도록 하고, 침입하는 미생물에 취약할 수 있는 손상된 장 벽을 회복할 수 없음으로 인해, 심지어 염증성 사건을 촉진할 수 있다고 제안된다.

마지막으로, STING이 DNA 바이러스 감염에 대해 보호하는 데 있어서 중요한 역할을 한다고 이전에 밝혀졌다. STING 기능이 지금까지 조사된 거의 모든 종양 세포주에서 제거될 수 있다는 것이 관찰되었으므로, HSV1 및 백시니아 바이러스(VV) 감염에 대한 이들 세포의 감수성을 조사하였다. 연구는 STING 기능에서의 결함을 보유하는 대장암 세포가 HSV1 및 백시니아 바이러스 감염에 매우 감수성이라는 것을 나타낸다. HSV1을 포함하는 다수의 종양세포붕괴성 바이러스는 항종양 치료제로서 클리닉에서 생각되지만, 작용 기전의 이해는 완전히 결정되어야 하게끔 있다. 여기서 데이터는 장 종양형성의 원인에 대한 정보를 제공하고, 종양세포붕괴성 바이러스 치료의 성공, 및 심지어 화학치료학적 치료에 대한 반응을 포함하여 질환 결과를 기술하기 위한 예후적 정보를 제공할 수 있다.

실시예 2

대장결장 선암에서의 STING 기능

대장결장 선암 세포에서의 결함 있는 STING 신호전달: STING 결핍 마우스는 AOM/DSS 연관된 CAC에 걸리기 쉽다고 보고되었다. 그러나, STING 기능이 인간 대장결장 선암(CA)에서 임의의 정도로 하향조절되는지가 공지되어 있지 않다. 이를 평가하는 것을 시작하기 위해, 듀크 시스템(Duke's system)에 의해 기재된 바대로 다양한 병기로 진단된 암으로부터 생성된, 다양한 CA 세포에서 면역블롯에 의해 STING 발현을 조사하였다. 결과는 STING이, 다양한 수준이지만, 조사된 11개 중 10개의 세포주에서 발현된다는 것을 나타낸다(도 4a). 발현 수준을 STING 기능과 상관시키도록, 세포를 STING 신호전달을 활성화하도록 dsDNA에 의해, 또는 RIG-I 유사 경로를 활성화하도록 dsRNA(폴리I:C)에 의해 형질감염시켰다. I형 IFN 발현을 ELISA에 의해 측정하고, 이것은 STING 유도성인 것으로 공지되어 있다. 모든 11개의 CA 세포가 dsDNA 촉발된 I형 IFN 생성에 불량하게 반응한다는 것에 주목하였다(도 4b). FITC 표지된 dsDNA 활성인자 및 면역형광 분석을 이용하여 모든 세포가 적절히 형질감염된다는 것이 확인되었다(도 18). 이것은 대조군 hTERT 세포 또는 정상 대장 상피 세포(FHC)와 반대이고, 이들은 dsDNA에 의해 형질감염될 때 IFNβ를 발현했다. 반대로, 11개 중 8개의 CA 세포는 dsRNA에 반응하여 다양한 양으로 I형 IFN을 생성할 수 있었고, 이는 RIG-I-유사 경로가 조사된 대부분의 경우에 기능을 보유한다는 것을 나타낸다(도 4b). 유사한 발견이 RT-PCR에 의한 CXCL10 mRNA 생성의 조사시 주목되었지만, 몇몇 CXCL10은 STING 의존적 dsDNA 형질감염에 반응하여 LoVo 및 HT29에서 낮은 수준이지만 검출되었다(도 4d). 이 발견을 더 확장하기 위해, 발암물질 촉발된 DNA 손상이 STING-신호전달을 통해 IL-1β를 유도할 수 있다는 것이 이전에 주목되었으므로, CA 세포에서 IL-1β 생성을 측정하였다. IL-1β의 소실은 손상되는 상처 치유 반응으로 인해 마우스가 CAC에 감수성이게 한다고 밝혀졌다. 이 연구는 IL-1β가 dsDNA에 의해 정상 hTERT 및 FHC 세포에서 생성된다는 것을 나타내고, 이는 이 과정에서의 STING-활성의 중요성을 나타낸다. 그러나, 11개 중 오직 3개의 CA 세포가 dsDNA 처리에 반응하여 IL-1β를 생성할 수 있다고 보이고, 이는 STING 기능이 조사된 대부분의 CA 세포에서 결함 있다는 것을 다시 제안한다(도 4G). STING 발현이 결여된, SW48은 임의의 역량으로 dsDNA 형질감염에 반응성인 것으로 보이지 않았다. RNAi 처리는 이 사이토카인의 상향조절이 STING 의존적이라는 것을 확인시켜 주었다(도 19a-c). 이 데이터를 고려하면, CA 세포에서의 dsDNA 의존적 STING 신호전달의 더 자세한 분석은 마이크로어레이 분석에 의해 수행되었다. CA 세포는 약간의 STING 기능을 나타내거나 나타내지 않는 이의 능력에 기초하여 선택되었다. 예를 들어, 도 4d로부터의 데이터는 HT29 및 LoVo 세포가 dsDNA에 반응하여 CXCL10을 부분적으로 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. 반대로, SW480 및 HT116은 임의의 유의미한 수준으로 CXCL10을 생성할 수 없다는 것이 주목되었다. 마이크로어레이 분석은 조사된 모든 CA 세포가 대조군 FHC 세포만큼 효율적으로 dsDNA 신호전달에 반응하지 않다고 것을 밝혀냈고, RT-PCR 분석을 확인시켜 주었다(도 4e, 도 4f). 예를 들어, CXCL10의 수준은 분석된 CA 세포와 비교하여 대조군 FHC 세포에서 유의미하게 더 높았다. 그러나, HT29 세포는 특히 SW480 또는 HT116과 비교될 때, 조사된 임의의 다른 CA 세포보다 더 시토졸 dsDNA에 약간의 반응을 보유할 수 있다고 보였다(도 4e, 도 4f). HT29가 마이크로어레이 분석에 의해 결정된 바대로 IFNβ를 보통으로 생성할 수 있지만, IFNβ 단백질 생성은 아마도 낮은 수준 발현으로 인해 ELISA에 의해 용이하게 명확하지 않고, 이는 심지어 FHC 대조군에서 유사하게 관찰되었다(도 4b). 그럼에도 불구하고, 종합하면, 데이터는 대부분의 CA 세포가 오직 낮은 수준 활성을 나타내는 오직 SW1116, LS123, LoVo 및 HT29에 의해 결함 있는 STING 의존적 신호전달을 나타낸다는 것을 나타낸다.

CA 세포에서의 IRF3 기능의 소실: CA 세포에서의 결함 있는 STING 신호전달의 정도를 조사하기 위해, NF-κB 및 IRF3 기능을 평가하도록 면역형광 및 면역블롯 분석을 수행하였다. dsDNA의 존재 하에, STING은 자가소화작용을 닮은 과정에서 NF-kB 및 IRF3을 함유하는 핵 주위 연관된 엔도솜 구역으로, TBK1을 따라 ER로부터의 통횡을 신속히 겪는다(Ishikawa and Barber, 2008; Konno et al., 2013). 이 사건은, 아마도 염증을 나타낼 수 있는 지속적인 STING 활성화된 사이토카인 생성을 회피하기 위해, STING 인산화 및 저하를 수반한다. 이 접근법은 STING이 통횡하고, dsDNA에 의한 처리 후 대조군 hTERT 및 FHC 세포에서 인산화 및 저하를 겪는다는 것을 확인하였다(도 5a 및 도 5d, 왼쪽 패널). 이 세포에서, TBK1, 및 NF-κB의 이의 동족 표적 IRF3 및 p65 하위단위는 인산화되었다(도 5d, 왼쪽 패널). IRF3 및 p65는, 예상된 바대로, 핵으로 전좌한다는 것이 또한 주목되었다(도 5b, 도 5c). 필적하는 효과는 보통의 dsDNA 의존적 IL-1β 유도를 나타내는 SW1116 및 LS123 CA 세포를 사용하여 관찰되었고, 이는 STING 경로가 이들 2개의 세포에서 약간의 기능을 보유한다는 것을 확인시켜 주었다(도 5a-d 및 도 4c, 도 4d). 유사하게, HT29 및 LoVo는 유사한 IRF3 전좌를 나타내지만, p65 전좌가 결여되었다. 이는 dsDNA 매개된 선천성 면역 유전자 유도에서의 결함이 STING이 p65 전좌를 촉발하지 못한다는 것에 있다는 것을 설명할 것이다(도 5a-d 및 도 4e, 도 4f). 그러나, SW480, SW1417, SW48 및 HT116과 같은 다른 CA 세포가 매우 적은 STING 활성 또는 통횡을 나타낸다는 것이 주목되었다. 유사하게, TBK1 또는 IRF3 인산화/전좌의 적은 증거가 주목되었다. p65 인산화의 몇몇 표시가 예를 들어 SW480에서 밝혀졌지만, 이 전사 인자의 전좌는 임의의 이들 세포에서 명확하지 않았다. STING 발현은 이전에 기재된 바대로 SW48 세포에서 관찰되지 않았다(도 4a, 도 5a, 도 5d). 이 데이터는 dsDNA-신호전달이 STING 경로의 다양한 점에서 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 예를 들어, STING은 HT29 또는 LoVo 세포에서처럼 TBK1을 IRF3으로 통횡시키고 에스코트하는 능력 및 약간의 활성을 보유하지만, NF-kB 신호전달은 영향을 받는다. 반대로, STING은 SW480, SW1417, SW48 또는 HT116 세포에서 임의의 인산화 또는 통횡을 겪는 것으로 보이지 않아서, 이는 STING 기능이 IRF3/NF-kB 상호작용의 하류에서 지연된다는 것을 나타낸다.

CA 세포는 결함 있는 cGAS 발현을 나타낸다: SW480, SW1417, SW48 또는 HT116 세포에서의 STING 통횡의 소실은, 아마도 STING이 CDN과 상호작용할 수 없게 만드는 돌연변이를 수반하는, ER에서 STING 기능에 의한 문제를 나타낼 수 있었다. 반대로, STING-신호전달의 파괴는 상류에서 발생하고 생성효소 cGAS를 수반하고, 이것은 dsDNA와의 회합 후 CDN을 생성하여서, STING 기능을 증대시킨다. 이를 평가하기 위해, 모든 11개의 CA 세포 내의 전체 STING 게놈을 서열분석하였다(인트론 및 엑손은 염색체 5q31.2에서 대략 7.2kb를 포함한다). 서열 분석은 11개 중 2개의 CA 세포(LoVo 및 SW480)가 이전에 보고된 HAQ STING 변이체를 나타낸다(Jin et al., 2011; Yi et al., 2013)는 것을 나타내고, 이는 집단의 대략 20%에서 발생하고, 293T 세포에서 과발현될 때 부분적으로 결함 있는 것으로 보고되었지만, CDN의 존재 하에 정상으로 기능할 수 있다(도 23). 분석된 STING 유전자의 나머지는 R272 코딩된 생성물을 나타내고, 이는 기능에서의 임의의 결함을 발휘하는 것으로 보고되지 않았고, 집단의 대략 85%를 나타낸다. 종합적으로, 이 발견은 STING 유전자에서의 주요 돌연변이의 존재가 CA 세포 내에 함유된다는 것을 제안하지 않고, 예를 들어 cGAS의 수준에서 STING의 상류에서 결함이 그럴싸하게 우세하다는 것을 제안한다. 본 발명자들은 따라서 CA 세포에서 cGAS의 발현 및 활성을 조사하는 것을 시작하였다. RT-PCR 검정은 개발되고 원칙적으로 cGAS mRNA 수준을 측정하였다. 결과는 조사된 11개의 CA 세포 중에 cGAS 발현이 이들 중 5개(55%)(LS174T, SW480, SW1417, SW48 및 HT116)에서 부재한다는 것을 나타낸다(도 13a). 이 데이터는 cGAS에 대한 항체를 사용하여 면역블롯 및 면역조직화학 분석을 통해 확인되었다(도 13a, 도 13c). 48개의 인간 대장 선암 샘플의 qPCR 조사는 48개 중 15개의 샘플(31%)에서 낮거나 검출 불가능한 수준의 cGAS을 유사하게 나타냈다(보충 도 13b). 본 발명자들의 발견은 cGAS 유전자의 소실을 통해 설명될 수 있었다. 그러나, 서열분석은 cGAS 유전자를 코딩하는 게놈 내에 주요 돌연변이 또는 결실이 존재하지 않는다는 것을 유사하게 나타냈다(도 24). 이의 관점에서, cGAS 발현이 후성적 현상에 의해, 예컨대 cGAS 프로모터 구역의 과메틸화에 의해 억제되는지를 조사하였다(Lao and Grady, 2011; Mitchell et al., 2014). 실제로, 데이터은행 분석은 cGAS 프로모터 구역 내에 상당한 CpG 섬의 존재를 나타냈다(도 20a). 대조군 hTERT, 또는 cGAS-결함 있는 LS174T, SW480, SW1417, SW48 또는 HT116 세포는 5일 동안 탈메틸화제 5-아자-2'-데옥시사이티딘(5AZADC)에 의해 이로써 처리되었고, cGAS mRNA 수준을 다시 평가하였다. 연구는 cGAS 발현이 조사된 5개 중 2개의 세포(SW480 및 HT116)에서 구제된다는 것을 나타낸다(도 13b). 정상 및 CA 세포로부터 인출된 중아황산염 전환된 게놈 DNA의 서열분석은 cGAS 발현이 억제되는 CA 세포의 cGAS 프로모터 구역 내에 유의미한 과메틸화를 확인시켜 주었다(도 20b). CA 세포의 나머지(LS174T, SW1417, SW48)에서 cGAS의 발현 수준이 왜 낮은지는 아직 명확하지 않지만, 억제는 다른 후성적 변형, 예컨대 히스톤 변형을 투기적으로 수반할 수 있었다(Jin and Robertson, 2013). 따라서, 히스톤 탈아세틸라제 또는 히스톤-라이신 메틸전환효소 저해제에 의한 이들 세포의 처리는 조사된 CA 세포에서 cGAS mRNA 발현을 부분적으로 구제하였다(도 20c). cGAS 억제의 교대 기전, 예컨대 miRNA를 수반하는 것이 존재한다는 것이 또한 명확할 수 있다. cGAS 발현의 재구성이 STING 의존적 dsDNA 신호전달을 구제하는지를 결정하기 위해, 대조군 hTERT 또는 SW480, HT116(5AZADC에 의해 구제된 cGAS) 또는 LS174T(5AZADC에 의해 구제되지 않은 cGAS) CA 세포를 조사하였다. LS174T 세포가 아니라 5AZADC 처리된 cGAS 구제된 SW480, HT116 CA 세포가 병존하는 포스포-IRF3 전좌에 의해 TBK1 및 IRF3의 인산화를 다시 얻었다는 것이 관찰되었다(도 15c, 도 15d). 이 효과는 5AZADC 처리된 SW480 및 HT116 CA 세포에서 I형 IFN 및 IL-1β의 보통의 발현에서 반영되었다(도 15e, 도 15f). 따라서, 탈메틸화제는 선택 CA에서 STING 의존적 선천성 면역 유전자 유도를 부분적으로 구제할 수 있다.

STING-신호전달 경로가 대장 선암에서 저해될 수 있는지에 대한 의문이 생긴다. 최근에, STING 결핍 세포 및 마우스가 AOM 유도된 DNA 손상에 감수성인 것으로 밝혀졌다. 이 상황에서, STING 경로는, 조직 회복 또는 손상된 세포 제거를 촉진하는 사이토카인의 생성을 유도하도록, DNA-손상 반응 경로에서 역할을 할 수 있다(Chatzinikolaou et al., 2014; Kidane et al., 2014; Lord and Ashworth, 2012). 그러므로, DNA 손상물질에 반응한 CA 세포의 선천성 면역 유도를 조사하였다. 도 21에 도시된 바대로, 발암물질 AOM 및 DMH는 정상 대장 상피(CCD841) 및 LS123(부분 STING 활성을 나타냄; 도 4c 및 4d)에서 I형 IFN의 생성을 유도할 수 있었다. 그러나, 결함 있는 STING 활성화된 IRF3 또는 NF-kB 활성을 나타낸 CA 세포는 AOM 또는 DMH에 반응하여 I형 IFN을 생성할 수 없었다. 따라서, STING 경로의 저해는 돌연변이를 보유하는 DNA 손상된 세포가, 종양형성 상태로 진행하도록, DNA 손상 반응 및 면역 감시 기계의 부분을 피하게끔 할 수 있다.

결함 있는 STING-신호전달을 가지는 종양은 바이러스 종양용해에 감수성이다: 본 발명자들은 시험관내 또는 생체내 STING 신호전달의 소실이 각각 세포 또는 마우스가 단순 포진 바이러스(HSV) 감염에 극도로 감수성이게 한다는 것을 밝혀냈다. 375kb의 dsDNA 게놈을 함유하는 HSV는 암의 치료를 위한 치료제로서 임상 실험에서 현재 평가되고 있다(Kolodkin-Gal et al., 2009). 그러나, 종양용해의 기전은 완전히 결정되어야 하게끔 있고, HSV 항종양 치료의 효율을 결정하는 것에 대한 평가가 현재 없다. STING 신호전달이 HSV 감염에 대한 숙주 방어 반응에서 중요한 역할을 하고, STING 활성이 많은 CA 세포에서 결함 있다는 것이 이전에 밝혀졌다는 것을 고려하면, 신호전달하는 STING의 능력이 HSV 처리에 대한 결과에 영향을 미칠 수 있다고 상정된다. 이것을 해결하는 것을 시작하기 위해, CA 세포 또는 대조군 hTERT 및 FHC를 대장암, 및 흑색종에 대한 것을 비롯한 종양세포붕괴성 물질로서 현재 평가된 γ34.5 코딩 생성물이 결여된 HSV1에 의해 감염시켰다. γ34.5 바이러스 단백질은 숙주 방어 반응을 억제하는 것으로 제안되었지만, 기전은 완전히 명확해져야 하게끔 있다. 따라서, HSV1γ34.5는 선천성 면역 신호전달 사건을 튼튼하게 억제하지 않고, I형 IFN을 포함하는 STING 의존적 선천성 면역 유전자 유도를 강력하게 촉발한다. 이 분석은, 본 발명자들의 dsDNA 형질감염 결과와 유사하게, HSV1γ34.5가 대조군 hTERT 및 FHC 세포, 및 SW1116 및 LS123 CA 세포에서 유의미하게 IFNβ mRNA의 생성을 유도한다는 것을 나타낸다(도 16a). 그러나, cGAS 발현이 결핍된, SW480 및 HT116을 포함하는, CA 세포의 나머지에서 아주 적은 I형 IFN이 유도되었다. I형 IFN을 유도하는 능력은 유도된 항-바이러스 효과로 인해 HSV1γ34.5 복제와 역상관되었다(도 16b). 더욱이, SW480 및 HT116과 같은 세포는, 아마도 튼튼한 바이러스 복제로 인해, 신속한 세포사를 겪는 한편, 대조군 세포 및 부분 STING 기능을 가지는 세포(SW1116 및 HT29)는 유의미하게 더 불응성이었다(도 15c). γ34.5를 함유하는 루시퍼라제 유전자(HSV-Luc)를 발현하는 HSV에 의해 CA 세포를 감염시킴으로써 실험은 추적관찰되었다. 이 데이터는 SW480 및 HT116과 같은 결함 있는 STING-신호전달을 나타내는 CA 세포가 바이러스 유도된 루시퍼라제 발현이 더 가능하게 한다고 확인시켜 주었다(도 16d). siRNA 처리는 정상 및 STING 기능적 CA 세포에서 HSV1γ34.5에 의해 유도된 IFNβ 반응이 STING 의존적이라는 것을 추가로 확인시켜 주었다(도 19d). HSV1이 암을 치료하기 위해 종양세포붕괴성 치료제로서 생각되는 유일한 DNA 바이러스가 아니라는 것이 중요하다. 대장암에 대한 치료제를 포함하여 고려 중인 다른 후보자 바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제하는 190kb 게놈을 가지는 dsDNA 바이러스인 백시니아 바이러스(VV)를 포함한다. VV가 기능적 STING 신호전달의 부재 하에 숙주 선천성 면역 반응을 촉발할 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 부분 STING 신호전달 역랑을 가지거나(SW116 및 HT29), 완전히 결함 있는 STING 신호전달을 가지는(SW480, HT116) CA 세포를 VV에 의해 감염시켰다. HSV1γ34.5를 사용하는 상황과 유사하게, VV는 STING 기능의 소실을 가지는 세포(SW480 및 HT116)에서가 아니라 오직 대조군 세포 또는 부분 STING 신호전달 능력을 가지는 CA 세포에서 I형 IFN 및 CXCL10 생성을 촉발하였다(도 16e, 도 16f). 본 명세서에서 데이터는 결함 있는 STING-신호전달을 가지는 CA 세포가 HSV1 및 VV 종양세포붕괴성 활성에 매우 감수성이라는 것을 나타낸다. 따라서, STING/cGAS 발현의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다는 것은 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 대한 소정의 암을 가지는 환자의 반응을 예측하는 것을 도울 수 있다는 것이 타당하다.

바이러스 종양세포붕괴성 치료에 대한 결과의 예측. 본 데이터는 HSV1과 같은 DNA 기반 바이러스를 수반하는 종양세포붕괴성 바이로테라피(virotherapy)의 결과가 STING/cGAS 발현의 존재 또는 부재에 의해 예측될 수 있다는 것을 나타낸다. STING 경로가 자연히 기능하는 STING 및 cGAS의 존재를 요하고, STING 및/또는 cGAS가 대장암의 30-55%에서 부재할 수 있다는 것이 관찰되었으므로, 이들 2개의 유전자 생성물의 존재를 측정할 수 있다는 것은 따라서 DNA-바이러스 종양치료의 유효성을 나타낼 수 있다. 이것은 RT-PCR 방법론을 이용하여 달성될 수 있지만, 생검된 조직은 정상 STING/cGAS 발현을 함유하는 침윤 조혈 세포를 함유할 수 있다. 따라서, 암 세포 자체 내의 STING 및/또는 cGAS 단백질 또는 RNA 발현의 분석은 STING 기능의 상태로 더 정확한 정보를 제공할 것이다. cGAS 단백질을 검출하는 효과적인 항체가 확인되지 않았으므로, RNA 인시츄 혼성화 검정은 개별 세포 내에 mRNA의 단일 수준 카피를 검출할 수 있는 RNA스코프 기법을 이용하여 설계되었다. STING 프로브 그린(FITC), 및 cGAS 프로브 레드(Cy5)를 표지함으로써, 프로브 둘 다는 동일한 검정에서 검출 가능하였고, 동일한 세포 내의 STING 및 cGAS의 mRNA 수준은 효과적으로 정량화될 수 있었다. 검정을 시험하기 위해, 대조군 세포 또는 cGAS 양성(SW1116 또는 HT29) 또는 음성(SW480 및 HT116) CA 세포를 cGAS(적색) 또는 STING(녹색) mRNA를 인식하는 RNA 프로브와 항온처리하였다. 이 연구는 STING 및 cGAS 발현이 RNA스코프를 사용하여 대조군(hTERT 및 FHC) 및 STING/cGAS 양성(SW1116 또는 HT29) CA 세포에서 검출되고 정량화될 수 있다는 것을 나타낸다(도 17a, 도 17c). 그러나, cGAS 음성(SW480 및 HT116) CA 세포에서 STING이 오직 관찰되었다(도 17a, 도 17c). STING은 이 검정을 이용하여, 예상된 바대로, SW48 세포에서 검출 가능하지 않았다(도 5a 및 도 17a, 도 17c). 이 데이터는 또한 RT-PCR에 의해 이 세포에서 본 발명자들의 cGAS의 이전의 발현 분석과 상관되었다(도 13a). 게다가, cGAS mRNA 생성이 5AZADC에 의한 처리 후 구제되는 이 CA 세포에서 cGAS 발현은 RNA스코프에 의해 관찰되었다(SW480 및 HT116); 도 17b, 도 17d). 따라서, 형광 인시츄 혼성화 분석은, cGAS 또는 STING의 존재 또는 부재에 따라, 종양세포붕괴성 바이러스 치료에 대한 결과를 예측할 수 있다.

이 검정을 더 추적관찰하기 위해, 정상 hTERT, 또는 cGAS 양성(SW1116 또는 HT29) 또는 음성(SW480 및 HT116) CA 세포, 및 cGAS 및 STING 발현 미싱 둘 다를 가지는 SW48을 파라핀 포매하였다. 이 상황은 생검되고 파라핀 포매된 환자 유래한 재료가 분석을 요하는 상황을 모방할 수 있다. 실험은 RNA 프로브를 사용하여 전에처럼 대조군, SW1116 및 HT29 세포에서 STING 및 cGAS 발현 둘 다, 및 cGAS 음성 SW480 및 HT116 CA 세포에서 오직 STING을 다시 용이하게 검출할 수 있었다(도 17e, 도 17f). cGAS도 STING도 이중 음성 SW48 세포주에서 관찰되지 않았다(도 4a 및 도 17e, 도 17f). 이 검정은 파라핀 포매된 조직 마이크로어레이(TMA)에서 12개의 정상 및 80개의 CA 샘플에서 추가로 시험되었고, STING이 CA 샘플의 14%에서 소실되고, cGAS가 CA 샘플의 15%에서 소실된다는 것이 관찰되었다. STING 및 cGAS 둘 다는 CA 샘플의 9%에서 소실되었다(도 17g, 도 17h). 그러나, STING 발현 및/또는 기능이 다양한 다른 종양에서 부재한다는 것이 주목되었고, 이는 이 경로의 억제가 인간 암에서 널리 퍼질 수 있다는 것을 나타낸다(도 23). 따라서, 파라핀 포매된 조직으로부터의 STING/cGAS 이중 발현의 RNA스코프 분석은, 다음에 결정된 바대로, 생체내 선택 바이러스 종양세포붕괴성 치료의 결과를 예측하는 것을 도울 수 있다.

HSV1γ3 4 .5 치료에 대한 결함 있는 STING 신호전달을 가지는 CA 세포의 생체내 분석. 생체내 HSV1 γ34.5의 시험관내 종양세포붕괴성 효과를 상관시키기 위해, 누드 마우스에 부분(SW1116 또는 HT29) 또는 결함 있는(SW480 및 HT116) STING 신호전달을 보유하는 CA 세포에 의해 피하로 접종하였다. 이후, HSV1γ34.5를 종양내 투여하였다(도 18a). 부분 STING-신호전달을 나타내는 종양(SW1116 및 HT29)이 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 불응성이라는 것이 관찰되었다(도 18b, 도 18c). 그러나, 결함 있는 STING-신호전달을 가지는 CA 세포로부터 유래한 종양은 바이러스 치료에 극도로 감수성인 것인 주목되었다(도 18d, 18e). 이 데이터는 STING 경로의 활성이 대장, 및 다른 암에 대한 HSV 관련 종양세포붕괴성 치료의 결과를 예측할 수 있다는 것을 나타낸다.

토의

STING 제어된 신호전달 경로는 시토졸 DNA 종의 인식에 반응하여 선천성 면역 유전자 전사를 촉진하는 데 필수적이다. STING 활성은 세포내 박테리아, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스로부터 생성된 사이클릭-다이-AMP 또는 사이클릭-다이-GMP와 같은 CDN에 의해 또는 시토졸 dsDNA 종과의 회합 후 생성효소 cGAS에 의해 생성된 사이클릭-다이-GMP-AMP(cGAMP)에 의해 촉발될 수 있다(Sun et al., 2013; Woodward et al., 2010). 이러한 DNA는 DNA 병원균, 예컨대 HSV-1 또는 박테리아, 예컨대 마이코박테리아 결핵의 게놈, 및 DNA 손상된 세포의 핵으로부터 누수된 자가 DNA를 나타낼 수 있다. STING 결핍 마우스는, 생존 가능하면서, 다양한 병원균에 의한 치사 감염에 극도로 감수성이다. 그러나, 만성 STING 활성은 전염증성 사이토카인의 과생성을 통해 자가염증성 질환의 다양성을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 실제로, STING의 부적절한 과자극은 염증 추진된 피부암을 악화시키는 것으로 심지어 밝혀졌다(Ahn et al., 2014). 그러나, 일시적 STING 활성은 항종양 T 세포 반응의 생성을 매개하는 데 필수적인 것으로 밝혀졌다. 데이터는 프로페셔널 항원 제시 세포(CD8+ 수지상 세포)에서 STING이, 상호제시 및 CTL 프라이밍을 촉진하는, I형 IFN과 같은 사이토카인을 촉발시키는, 둘러싸인 죽어가는 종양 세포의 DNA에 의해 외인성으로 활성화된다는 것을 제안한다. 상응하게, 종양내 CDN의 치료학적 투여는, 아마도 DC 의존적 CTL 생성을 촉진함으로써, 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Corrales et al., 2015; Woo et al., 2014). 기전이 결정되어야 하게끔 있지만, STING은 또한 PD1과 같은 관문 저해제의 항종양 효과에 영향을 미치는 데 역할을 할 수 있다.

본 발명자들은 STING 결핍 마우스가 발암물질 악화된 CAC에 감수성이라는 것을 또한 최근에 입증하였다(Ahn et al., 2015). 이 상황에서, 증거는 손상된 DNA가, 아마도 핵의 누수에 의해 또는 명확해져야 하게끔 있는 다른 기전을 통해, STING 내인성 활성을 촉발할 수 있다는 것을 나타낸다. 아마도, 이 사건은 손상된 세포(들)에 면역계를 유인하는 사이토카인 생성을 증대시킬 것이다. 이러한 세포의 박멸, 및 사이토카인의 자극 및 성장 인자 의존적 조직 회복이 뒤따를 수 있다. 데이터는 STING이 IL-1β와 같은 장에서 상처 회복을 촉진하는 사이토카인의 생성을 촉발할 수 있다는 것을 제안한다. 이러한 사이토카인은 IL-1β 및 IL-18을 프로세싱하도록 염증조절복합체 연관된 ASC 및 카스파제-1과 상호작용하는, NLRP3 및 NLRP6과 같은, 뉴클레오타이드 결합 올리고머화-도메인 단백질 유사 수용체(NLR)에 의해 프로세싱된다. 이들 전염증성 사이토카인은 분비되고 수용체에 결합하여, 신호전달에 대해 MyD88을 주로 요한다. IL-18 생성은 IL-22BP를 억제할 수 있고, 이것은 IL-22의 상처 회복 활성을 저해하는 것을 담당한다. ASC, 카스파제-I, MyD88 또는 IL22BP의 소실은, STING의 소실과 유사하게, 대장염 연관된 대장암 모델에서 종양형성을 증가시킬 수 있다(Elinav et al., 2011; Huber et al., 2012; Salcedo et al., 2010). STING은 따라서 염증조절복합체 프로세싱과 조합하여 작동할 수 있다.

따라서, STING의 소실은 조직 치유를 억제하고, 손상된 점막 내벽은 STING 의존적 염증성 반응을 악화시키는 증대된 유전자독성 능력을 가지는 박테리아의 침윤 및 증식이 가능하게 할 수 있다. 과활성의, 침윤하는 면역 세포에 의한 ROS의 생성은 DNA 손상 과정을 증대시키고, TSG의 돌연변이 불활화 또는 성장 자극인자 단백질, 예컨대 k-ras의 돌연변이 활성화를 촉진할 수 있다. 따라서, 내인성 STING-신호전달은 DNA 손상에 대한 반응 및 면역 감시 기계의 변경을 통해 암의 발육을 예방하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, DC에서의 외인성 STING 활성은 항종양 CTL의 생성에 또한 필요하다. 이것은 STING를 숙주 항암 방어 아스널에서 중추적 역활에 위치시킨다.

이를 고려하면, 대장암에서의 STING 신호전달의 발현 및 조절은 분석되고, STING 활성의 빈번한 억제를 발견하였다. 이 사건은 DNA-손상 의존적 사이토카인 생성의 생성을 저해하고, 이는 손상된 세포가 면역 감시 시스템이 주의를 피하게 할 수 있다. 이러한 세포는 박멸을 피할 수 있고, 추가의 유전적 돌연변이 사건은 종양형성 과정을 증대시키도록 누적될 수 있다. STING 신호전달의 저해는 STING 발현, 또는 생성효소 cGAS의 억제를 주로 수반하는 것으로 관찰되었다. STING 또는 cGAS 유전자를 수반하는 유의미한 돌연변이 또는 결실 사건은 관찰되지 않았고, 오히려 프로모터 구역의 과메틸화를 수반하는 빈번한 전사 억제가 관찰되었다. 시토졸 DNA 신호전달은 다른 CA 세포가 아니라 약간으로 cGAS 발현을 다시 얻은 탈메틸화제를 사용하여 부분적으로 구제되었다. 그러나, 암 세포에서의 STING 신호전달의 구제가 항암제에 대한 더 양호한 반응을 제공할 수 있는지에 대해 명확하지 않은 채 있다. 추가로, 탈메틸화제에 구제되지 않은 cGAS 및 몇몇 경우에 STING 발현은 추가적인 규명을 요하는 후성적 침묵화의 다른 형태를 나타낼 수 있다. 다른 CA 유형에서, 전사 인자 NF-κB 또는 IRF3을 활성화하는 STING의 능력이, 또한 결정되어야 하게끔 있는, 분자 기전에 의해 손상될 수 있다는 것이 관찰되었다. DNA 회복에 관여된 다수의 다른 유전자, 예컨대 미스매치 회복 단백질 MHS2 및 MLH1이 대장암에서 흔히 침묵화된다고 또한 보고되었다는 것이 가치 있다(Chatzinikolaou et al., 2014; Lord and Ashworth, 2012). 따라서, DNA 회복 기계를 표적화하는 것은 암 발육에서 흔한 요건일 수 있다. 종합적으로, STING 의존적 신호전달이 조사된 대장 관련 종양의 대략 80% 이상에서 결함 있다고 관찰되었다. 이것은 STING 기능의 억제가 종양형성 과정에 대한 또한 중요한 의무라는 것을 나타낼 수 있다.

STING의 소실이 종양에서 흔할 수 있고 심지어 항암 치료에 대한 결과를 예측할 수 있으므로, 본 발명자들은 STING 및 cGAS 둘 다의 발현 수준을 평가하도록 검정을 개발하였다. 이들 2개의 단백질 중 어느 하나의 소실이 시토졸 DNA 매개된 선천성 면역 신호전달을 억제하는 것으로 보인다. 인시츄로 STING 및 cGAS mRNA 발현을 측정하는 본 능력, 및 항체를 사용한 STING 단백질 발현은 본 발명자들이 CAC의 40% 초과에서 이들 단백질의 하나 또는 다른 것의 소실을 나타내는 스크린을 개발하게 하였다. 이러한 검정은 치료학적 중재를 선택하기 위해 암의 효과적인 반응률을 예측하는 데 유용할 수 있다. 추가로, 신규한 항종양 유전자 치료 접근법을 통한 종양에서의 발생반복 STING 신호전달은 이러한 세포가 숙주 항종양 면역을 재활성화하도록 할 수 있다.

따라서, CA 세포에서의 STING 신호전달의 소실이 DNA 기반 바이러스, 예컨대 HSV1의 튼튼한 복제가 가능하게 한다는 것이 주목되었다. 바이러스, 예컨대 HSV1 및 백시니아 바이러스는 암의 치료를 위한 종양세포붕괴성 물질로서 현재 사용된다. 이러한 바이러스는 용해에 의해 종양 세포를 직접적으로 파괴할 뿐만 아니라, CTL의 생성을 위한 APC에 의한 포함을 위한 종양 항원 소스를 생성할 수 있다. 데이터는 STING이 이들 과정 둘 다에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 그러나, 성공적인 종양바이러스 치료의 효율은 명쾌하지 않은 이유로 낮다. 주로, 치료 결과를 예측하는 것을 도울 수 있는 분자 통찰력에 기초한 검정은 개발되지 않았다. 이는 정상 세포보다는 암 세포에서 종양용해를 설명하는 분자 기전이 완전히 평가되지 않은 채 있기 때문이다. 증거는 항바이러스 활성을 발휘하는 선천성 면역 신호전달 경로가 암 세포에서 결함 있을 수 있다는 것을 제안한다. 여기서 제시된 본 발명자들의 데이터는 선천성 신호전달 경로의 소실이 종양바이러스 치료에 대한 결과를 예측할 수 있다는 처음의 명쾌한 표시 중에 있다. 따라서, 여기에 나타난 것과 유사한 분자 바이오마커 검정의 유용성은 암의 치료를 위한 미생물의 사용에 대한 더 예측적인 반응이 가능하게 할 수 있다. 이러한 검정은 CDN에 기초한 다른 STING 의존적 항종양 치료, 또는 심지어 화학치료 섭생에 기초한 DNA-부가물이 작업하는지 아는지에 대한 통찰력을 또한 없앨 수 있다(Mansour, 2014; Rowe and Cen, 2014). 이런 관점에서, 본 발명자들은 화학치료제, 예컨대 시스플라틴 및 에토포사이드를 사용하는 것의 면역학적 이익이 STING-신호전달 경로를 유의미하게 수반한다는 것을 최근에 기재한다. 따라서, 암에서의 STING의 조절 및 기능에 대한 추가의 연구는 종양형성의 분자 기전으로 감각을 제공할 뿐만 아니라, 암의 치료를 도울 수 있는 치료학적 표적을 제공할 수 있다.

실험 절차

재료. 모든 시약은, 달리 기재되지 않는 한, Invitrogen, ThermoScientific 또는 Sigma로부터 얻어졌다.

세포 배양. 정상 인간 세포 및 인간 암 세포주를 각각 Lozna 및 ATCC로부터 구입하고, 지시에 따라 이의 적절한 성장 배지 중에 배양하였다. 배지 및 보충물은 Invitrogen으로부터 얻어졌다. hTERT-BJ1 텔로머라제 섬유아세포(hTERT)를 원래 Clontech로부터 구입하고, 5% CO2 습윤 분위기에서 37℃에서 10% FBS, 4mM L-글루타민 및 1mM 피류브산나트륨을 가지는 4:1 비율의 DMEM:배지 199 보충제 중에 배양하였다.

면역블롯 분석. 동일한 양의 단백질을 황산도데실 나트륨(SDS) - 폴리아크릴아미드 겔에서 해상하고, 이후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Millipore)으로 옮겼다. 5% 차단 시약에 의해 차단한 후, 막을 다양한 1차 항체(및 적절한 2차 항체)와 항온처리하였다. 이미지를 증대된 화학발광 시스템 ECL(Thermo Scientific)을 사용하여 해상하고, 방사능사진촬영술에 의해 검출하였다. 항체: STING에 대한 토끼 다중클론 항체를 문헌[Ishikawa et al, 2008]에 이전에 기재된 바대로 본 발명자들의 실험실에서 개발하였고; 다른 항체는 하기 소스로부터 얻었다: β-액틴(Sigma Aldrich), p-IRF3(Cell Signaling), IRF3(Santa Cruz Biotechnology), p-p65(Cell Signaling), p65(Cell Signaling), p-TBK1(Cell Signaling), TBK1(Abcam), cGAS(Cell Signaling).

인터페론 β Elisa 분석. 인터페론 β Elisa를 제조사의 프로토콜에 따라 Invitrogen으로부터의 IFNβ 인간 ELISA 키트 또는 PBL Interferon Source로부터의 인간 IFNβ ELISA 키트를 사용하여 수행하였다.

면역형광 분광법. 세포를 배양하고, Lab-Tek II 챔버 슬라이드에서 이의 적절한 배지 중에 처리하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 4% 파라폼알데하이드에 의해 고정시키고, 실온에서 5분 동안 0.05% 트리톤 X-100에 의해 투과시켰다. 면역염색을 토끼-항-STING 다중클론, 토끼-항-IRF3(Santa Cruz Biotechnology) 또는 토끼-항-p65(Cell Signaling), 이어서 형광 접합된 2차 항체(FITC-염소-항-토끼)(Invitrogen)에 의해 수행하였다. 마이애미 대학교의 Image Core Facility에서 Leica SP5 공초점 현미경에 의해 영상을 찍었다.

마이크로어레이 분석. 전체 RNA를 RNeasy Mini 키트(Qiagen)에 의해 세포 또는 조직으로부터 단리하였다. RNA 품질을 Bionalyzer RNA 6000 Nano(Agilent Technologies(캘리포니아주 산타 클라라))에 의해 분석하였다. 유전자 어레이 분석을 마이애미 대학교의 Oncogenomics Core Facility에서 Illumina Sentrix BeadChip Array(Mouse WG6 버전 2)((캘리포니아주 산타 클라라))에 의해 조사하였다. 유전자 발현 프로필을 프로세싱하고, 마이애미 대학교의 Bioinformatics Core Facility에서 통계 분석을 수행하였다. 간단하게, Illumina 어레이로부터의 원래 강도 값을 Agilent로부터의 GeneSpring(상표명) 소프트웨어에서 업로딩하였다. 값을 사분위수 정규화하고, 모든 샘플의 중앙치로 log2 변환시켰다. 2개 종류 비교로부터의 유의미한 차등 발현된 유전자를 스튜던트 t-시험을 이용하여 컴퓨팅하고, P-값 ≤ 0.05의 쓰레스홀드를 이용하여 선택하였다. 선택된 차등 발현된 유전자의 계층적 클러스터링 및 시각화는 피어슨 상관관계 거리 방법을 이용하여 수행되고, 연결은 Ward 방법을 이용하여 컴퓨팅되었다. 배수 변화 분석을 2개의 그룹 사이에 수행하고, 차등 발현된 유전자를 배수 변화의 쓰레스홀드에 기초하여 선택하였다.

정량적 실시간 PCR ( qPCR ). 전체 RNA를 QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen)를 사용하여 역전사시켰다. TaqMan 유전자 발현 검정(Applied Biosystems)에 의해 실시간 PCR을 수행하였다.

면역조직화학 및 조직학적 분석. 조직 마이크로어레이를 Origene로부터 구입하였다. 표준 프로토콜 후 토끼-항-cGAS 항체에 의해 면역조직화학 염색을 수행하였다.

HSV1γ34 .5 증폭, 정제, 적정 및 감염. HSV1γ34.5를 표준 프로토콜에 따라 Vero 세포 중에 증폭시키고 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 연속 희석된 바이러스를 사용한 플라그 검정을 표준 프로토콜에 따라 Vero 세포에서 수행하였다. 세포를 1시간 동안 특정한 M.O.I.에서 바이러스에 의해 감염시키고, 세척하고, 이후 특정한 검정 조사를 위해 지정된 기간 동안 항온처리하였다.

RNA 인시츄 혼성화. 프로빙된 STING 및 cGAS RNA를 ACD에 의해 주문 설계하고, 배양된 세포에 대한 RNA스코프(등록상표) Multiplex Fluorescent Reagent Kit 및 FFPE 세포 및 조직에 대한 2-plex RNA스코프(등록상표) Reagent Kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 RNA 인시츄 혼성화를 수행하였다.

마우스 치료. Balb/C nu/nu 마우스를 Charles River로부터 구입하였다. 종양 세포를 적절한 종양 세포의 2E106의 피하 주사에 의해 Balb/c 누드 마우스의 옆구리에서 도입하고, 종양은 대략 0.5㎝의 평균 직경으로 발육하게 허용되었다. 이후, HSV1γ34.5를 적절한 투약량(즉, 1E7에서 50㎕)으로 전체 3회 동안 격일로 종양에 주사하였다. PBS는 비히클 대조군으로서 사용되었다. 종양 성장에 대한 효과를 모니터링하였다. 종양 직경이 10㎜를 초과할 때 마우스를 안락사시켰다

바이설파이트 서열분석. Zymo Research로부터의 EZDNA Methylation Kit를 사용하여 게놈 DNA의 바이설파이트 전환을 수행한 후, PCR 증폭시켰다. 이후, PCR 생성물을 겔 정제하고 서열분석하였다.

통계 분석. 모든 통계 분석을, 기재되지 않는 한, 스튜턴트 t 시험에 의해 수행하였다. 데이터는 P < 0.05일 때 유의미하게 다른 것으로 생각된다.

실시예 3

흑색종에서의 STING 기능

상기 발견을 고려하면, 연구는 흑색종에서 STING 기능을 평가하는 것으로 연장되었는데, 왜냐하면 부분적으로 이러한 암이 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 감수성인 것으로 보이기 때문이고, 이는 선천성 면역 경로에서의 결함을 제안한다. STING 매개된 선천성 면역 신호전달이 인간 흑색종 유래한 세포 및 1차 환자 흑색종 유래한 조직 둘 다에서 크게 손상된다는 것이 여기 보고되었다. 흑색종에서의 STING 및/또는 cGAS 발현의 소실은, 주로 후성적 과메틸화 침묵화를 통해, 재발성으로 발견되었다. 이 발견은 STING 신호전달의 억제가 종양 발육의 중요한 부분일 수 있다는 것을 제안한다. 게다가, STING 기능의 소실은 흑색종 세포가 HSV1 및 백시니아 바이러스 매개된 종양용해에 더 감수성이게 한다. 따라서, STING 또는 cGAS 발현의 측정이 가능하게 하는 예후적 검정의 개발은 바이러스 종양세포붕괴성 치료의 효율의 더 양호한 표시를 발생시킬 수 있다.

인간 흑색종 유래한 세포주에서의 STING 신호전달의 재발성 소실. STING 제어된 선천성 면역 경로는 종양형성을 촉진시킬 수 있는 사건인 인간 대장암에서 크게 손상되는 것으로 보고되었다(Xia T, Konno H, Ahn J, Barber GN. Deregulation of STING Signaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates With Tumorigenesis. Cell reports. 2016;14:282-97). 이 중요한 경로가 암 STING 발현의 다른 유형에서 유사하게 결함 있는지를 평가하기 위해 일련의 인간 악성 흑색종에서 면역블롯에 의해 추가로 조사되었다. 이 결과는 STING 발현이 조사된 11개 중 3개의 세포주(G361, MeWo 및 SK-MEL-5)에서 검출 불가능하고, STING 발현 수준이 추가의 3개의 세포주(SK-MEL-2, SK-MEL-28 및 WM115)에서 극적으로 억제된다는 것을 보여주었다(도 26a). 생성효소 cGAS는 STING의 상류에 있고, STING 기능을 촉발할 수 있는 CDN을 생성한다. 다음에, 면역블롯에 의한 cGAS의 발현을 조사하였고, 이 생성효소가 조사된 11개 중 4개의 세포주(A375, G361, SK-MEL-5 및 SK-MEL-24)에서 부재한 것으로 밝혀졌다(도 26a). cGAS 프로브를 사용한 실시간 PCR 분석은 cGAS가 A375 및 SK-MEL-5에서 검출 불가능하지만, 낮은 수준의 cGAS가 G361 및 SK-MEL-24에서 검출된다는 것을 확인시켜 주었다(도 26a). STING/cGAS 발현 분석을 기능적 STING 신호전달과 상관시키도록, 세포를 STING 의존적 사이토카인 생성을 활성화하도록 dsDNA에 의해 형질감염시키거나, STING 독립적 RIG-I 유사 신호전달 경로를 활성화하도록 dsRNA(폴리I:C)에 의해 형질감염시키고, ELISA에 의해 I형 IFN 발현을 측정하였다(Ishikawa et al., 2008). 이 연구는 모든 11개의 흑색종 세포가 STING 의존적, dsDNA 촉발된 I형 IFN 생성에 불량하게 반응한다는 것을 나타낸다. 형광 분광법 분석을 이용하여, 모든 세포가 FITC 표지된 dsDNA 활성인자에 의해 실제로 형질감염되는 것으로 확인되었다. 그러나, 대조군 hTERT 세포 및 정상 인간 멜라닌세포(HEMa)는, dsDNA에 의해 형질감염될 때, 높은 수준의 IFNβ를 발현할 수 있고, 이는 STING 매개된 I형 인터페론 반응이 흑색종 세포에서 특이적으로 억제된다는 것을 제안한다(도 26b). 이 발견은 실시간 PCR 분석에 의해 추가로 지원되고, 여기서 dsDNA 자극된 IFNB 및 CXCL10 유도는 조사된 대부분의 흑색종 세포에 의해 억제되었지만, 약한 활성은 SK-MEL-24 및 SK-MEL-31 세포에서 검출되었다(도 26c-d). 반대로, 11개 중 6개의 흑색종 세포는 dsRNA에 반응하여, 다양한 수준이지만, I형 IFN 및 CXCL10을 생성할 수 있었고, 이는 RIG-I-유사 RNA 신호 경로가 조사된 대부분의 흑색종 세포에서 주로 온전하다는 것을 나타낸다(도 26c-d). 부분 STING 활성을 보유하는 것으로 보인 2개의 흑색종 세포주(SK-MEL-24, SK-MEL31) 및 정상 세포에서의 STING 발현을 넉다운하기 위한 siRNA 치료를 이용하여, 이 dsDNA 유도된 사이토카인의 상향조절이 STING 의존적이라는 것이 확인되었다. 종합하면, 본 발명의 데이터는 STING 의존적 신호전달이 오직 약한 STING 활성을 나타내는 SK-MEL-24 및 SK-MEL-31에 의해 대부분의 흑색종 세포에서 주로 손상된다는 것을 나타낸다.

흑색종 세포에서의 STING 의존적 TBK1 - IRF3 활성화의 소실. 흑색종 세포에서의 STING 신호전달 결함의 정도를 조하사기 위해, IRF3 및 NF-κB 활성화를 면역형광 분광법 및 면역블롯 분석에 의해 평가하였다. dsDNA에 의해 자극할 때, STING은 자가소화작용과 유사한 절차에서 NF-kB 및 IRF3을 함유하는 핵 주위 연관된 엔도솜 구역으로, TBK1을 따라 ER로부터의 전좌를 신속히 겪는다(Ishikawa et al., 2008, Konno et al., 2013). 이 사건은, 만성 염증을 유발하는 것으로 현재 공지된, 연장된 STING 유도된 사이토카인 생성을 피하도록, 거의 확실히, STING 인산화 및 저하를 수반한다. 본 발명자들의 결과는, 정상 hTERT 세포에서의 dsDNA 처리 후 STING은 핵 주위 구역으로 전좌하고, 인산화 및 저하 사건을 겪는다고 확인하였다(도 27a 및 도 27d, 왼쪽 패널). 이 과정 동안, TBK1은 hTERT 세포, 및 NF-κB의 이의 동족 표적 IRF3 및 p65 하위단위에서 인산화되었다(도 27d). 핵으로의 IRF3 및 p65 전좌가 또한 관찰되었고, 이는 정상 활성화를 나타낸다(도 27b, 도 27c 및 도 27d). 유사한 효과는 부분 dsDNA 의존적 사이토카인 생성을 나타낸 SK-MEL-24 및 SK-MEL-31 세포에서 관찰되었고, 이는 이들 2개의 세포주가 약간의 STING 기능을 보유한다는 것을 확인시켜 주었다(도 27a-d 및 도 26b-d). 그러나, RPMI7951 및 SK-MEL-3이 STING/cGAS 발현을 보유하고 dsDNA 처리시 유사한 IRF3 활성화를 나타내지만, 이들 세포는 p65 전좌가 결여되었다. 이 관찰은 dsDNA가 이의 전사 활성화에 IRF3 및 NF-kB 둘 다를 요하는 I형 IFN 생성을 촉발하지 못하는지를 설명할 것이다(도 27a-d 및 도 26b-d). 또한, STING 및/또는 cGAS 발현이 검출되지 않은 세포(예컨대, A375, G361, MeWo 및 SK-MEL-5)에서, TBK1 또는 IRF3 인산화/전좌의 증거가 dsDNA 처리 후 이 세포에서 검출되지 않았다(박스로 강조됨)(도 27b, 도 27d). 인산화된 p65가 관찰되지만, 핵으로의 이 전사 인자의 전좌는 임의의 RPMI7951, SK-MEL-3, A375, G361, MeWo 또는 SK-MEL-5 세포에서 명확하지 않았다(도 27c-d). 이 결과는 dsDNA 유도된 STING 신호전달이 조사된 많은 흑색종 세포주에서 경로를 따라 다양한 지점에서 하향조절된다는 것을 나타낸다. 예를 들어, STING이 RPMI7951 및 SK-MEL-3 세포에서처럼 약간의 신호전달 활성 및 IRF3의 전좌를 유도하는 능력을 보유하지만, NF-kB 신호전달은 영향받는 것으로 관찰되었다. 반대로, STING은 A375, G361, MeWo 또는 SK-MEL-5 세포에서 임의의 인산화 또는 전좌를 겪는 것으로 보이지 않았고, 이는 STING 기능이 아마도 STING 및/또는 cGAS 발현의 소실로 인해 IRF3/NF-kB 활성화의 상류에서 영향을 받는다는 것을 제안한다.

STING/ cGAS 발현의 RNA스코프 및 IHC 분석. STING 경로가 STING 및 cGAS의 존재를 요하고, STING 및/또는 cGAS 발현이 조사된 약 40%의 흑색종 세포에서 부재한 것으로 관찰되었으므로, STING 및 cGAS의 존재를 측정할 수 있다는 것은 흑색종에서 기능적 STING 신호전달을 예측하는 데 있어서 유용할 수 있다. 면역블롯 및 RT-PCR 방법론이 배양된 세포주에서 STING/cGAS 발현을 조사하는 데 효과적이지만, 생검된 조직은 대개 종양 세포뿐만 아니라 정상 STING/cGAS 발현을 보유할 수 있는 침윤 면역 세포를 포함하는 다른 세포 유형을 함유한다(Ishikawa et al., 2009). 따라서, 암 세포 자체 내의 STING 및/또는 cGAS 단백질 또는 RNA 발현의 분석은 이 생성물의 존재로 정확한 평가에 필요하다. 상기 기재된 바대로, RNA스코프 기술을 이용한 RNA 인시츄 혼성화 검정은 개별 세포 내에 STING/cGAS mRNA 카피를 효율적으로 검출할 수 있다. FITC 표지된 STING 프로브(녹색) 및 Cy5 표지된 cGAS 프로브(적색)를 사용함으로써, RNA 형광성 인시츄 혼성화(RNA FISH)를 이용하여 흑색종 세포를 조사하였다. 결과는 동일한 검정 내에 조합된 프로브 둘 다가 대조군 HEMa 세포에서 STING 및 cGAS mRNA를 효과적으로 검출한다는 것을 보여준다. STING mRNA는 G361, MeWo 또는 SK-MEL-5 세포가 아니라 A375, SK-MEL-24 및 SK-MEL-31 세포에서 또한 검출되는 한편, cGAS mRNA는 A375 또는 SK-MEL-5 세포에서 검출되지 않았다(도 28a). mRNA 카피수는 정량화되었고, 결과는 본 발명자들의 발현 분석을 이용하여 얻은 본 발명자들의 이전의 결과와 일치하였다(도 26a, 도 28a). 따라서, RNA 형광 인시츄 혼성화 분석은 단일 세포에서 STING/cGAS 발현을 동시에 효과적으로 정량화할 수 있다.

파라핀 포매된 흑색종 세포의 색소생산성 인시츄 혼성화(RNA CISH)에 의한 mRNA 발현을 또한 평가하였다. 이 상황은 생검되고 파라핀 포매된 환자 유래한 재료가 바이오마커 분석에 일반적으로 사용되는 상황을 모방할 수 있다. 이 연구는 전에처럼 SK-MEL-24 및 SK-MEL-31 세포에서 STING 및 cGAS mRNA 발현 둘 다를 검출하고 정량화할 수 있다. A375 세포에서, 오직 STING이 검출된 한편, cGAS는 부재하였다. STING은 G361 또는 MeWo 세포에서 검출되지 않았다. STING 및 cGAS 둘 다는 SK-MEL-5 세포에서 부재하였다(도 28b). 전체 RNA CISH 분석은 RNA FISH 평가에 유사한 결과를 생성하였다.

cGAS 및 STING에 대한 항체를 사용하여, 파라핀 포매된 세포에서의 면역조직화학(IHC) 분석을 또한 수행하였고, 이는 본 발명자들의 면역블롯 및 RNA스코프 연구에 따라 cGAS 및 STING 단백질 발현 상태를 확인시켜 주었다(도 28c).

흑색종 TMA에서의 STING/ cGAS 발현의 IHC 분석. 환자 유래한 흑색종 샘플에서의 STING/cGAS 발현을 평가하기 위해, 본 발명자들은 8개의 정상 피부 조직, 8개의 양성 신경 조직, 56개의 악성 흑색종 조직 및 24개의 전이성 흑색종 조직을 함유하는 IHC 분석 파라핀 포매된 흑색종 조직 마이크로어레이(TMA, MEL961, Pantomics)에 의해 후속하여 조사하였다. 모든 정상 조직이 STING 및 cGAS 둘 다를 발현한다는 것이 관찰되었다. cGAS는 2개의 양성 신경 조직에서 검출되지 않은 한편, STING은 모든 8개의 반점에서 존재한다는 것이 주목되었다. 악성 흑색종 조직에서, 흑색종 샘플의 23.2%는 STING 발현을 소실한 한편, 흑색종 샘플의 16.1%는 cGAS를 발현하지 않았고, STING 및 cGAS 둘 다는 흑색종 조직의 14.3%에서 부재하였다. 더 진행된 전이성 흑색종 조직에서, STING 및 cGAS 둘 다의 소실은 더 뚜렷하였다(41.7%)(도 29). 이 데이터를 고려하면, STING 또는 cGAS 발현의 억제는 인간 흑색종 및 그럴싸하게 다른 인간 암에서 흔히 발생할 수 있다(Xia et al, 2016). 요약하면, 본 발명자들의 IHC 절차는 FFPE 보존된 임상 종양 샘플에서 cGAS 및 STING 발현의 분석에 유용할 수 있다.

STING/ cGAS 발현은 흑색종 세포에서 DNA 과메틸화를 통해 억제될 수 있다. STING/cGAS 발현의 소실은 유전적 변경 또는 돌연변이를 통해 발생할 수 있었다. 흑색종 세포에서의 STING 및 cGAS의 유전자 상태를 평가하기 위해, 본 발명자들은 모든 11개의 흑색종 세포 내에 STING 및 cGAS 유전자를 서열분석하였다. 전체 STING 유전자의 서열 분석(인트론 및 엑손은 염색체 5q31.2에서 대략 7.2kb를 포함함)은 11개 중 7개의 흑색종 세포가 HAQ STING 변이체를 나타낸다는 것을 나타내고(Jin et al., 2011, Yi et al., PloS One, 2013), 이는 집단의 대략 20%에서 발생하는 것으로 이전에 보고되었다. 모든 흑색종 세포, 및 정상 HEMa 세포에서의 STING 유전자는 R272 다형을 함유하고, 이는 집단의 대략 85%를 나타내는 것으로 보고되었지만, STING 기능에서 어떠한 결함도 발휘하지 않았다. 종합적으로, 서열 분석은 흑색종 세포 내에 STING 유전자에서의 임의의 주요 유전적 결함을 밝혀내지 않았다. cGAS 엑손에서 유사한 서열 분석을 또한 수행하였다. 그러나, 주요 돌연변이 또는 결실이 주목되지 않았다. 종합하면, 유전적 돌연변이 또는 결실은 흑색종 세포에서 STING/cGAS 결함 있는 발현에 수반되는 것으로 보이지 않았다.

이의 관점에서, STING 또는 cGAS 발현이 후성적 과정에 의해, 예컨대 프로모터 구역의 과메틸화에 의해 억제되는지가 조사되었다(20, 21). 실제로, 데이터은행 분석은 STING 및 cGAS 프로모터 구역 내에 상당한 CpG 섬의 존재를 나타냈다. 그러므로, STING 또는 cGAS 발현이 결여된 흑색종 세포를 5일 동안 탈메틸화제 5-아자-2'-데옥시사이티딘(5AZADC)에 의해 처리하고, STING 또는 cGAS 발현의 발생반복을 평가하였다. 실시간 PCR 분석은 cGAS 발현이 더 낮은 정도이더라도 A375 세포, 및 SK-MEL-5 세포에서 회복된다는 것을 보여준다. SK-MEL-24가 RT-PCR에 의해 낮은 cGAS 발현을 나타내지만, 5AZADC 처리는 유의미하게 SK-MEL-24 세포의 cGAS 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다(도 30a). 이 결과는 면역블롯 및 RNA FISH 분석 둘 다에 의해 다시 확인되었고, 여기서 cGAS 발현은 5AZADC 탈메틸화 후 A375 및 SK-MEL-5 세포에서 명확히 발생반복되었다(도 30b-c). MeWo 세포에서, STING 발현은, 면역블롯 및 RNA FISH 분석 둘 다에 의해 보여진 것처럼, 5AZADC 처리에 의해 복원되었다. 그러나, STING은 유사하게 처리된 G361 세포, 및 SK-MEL-5 세포에서 부재하였지만, cGAS 발현은 동일한 처리된 SK-MEL-5 세포에서 부분적으로 복원되었다(도 30a-c). 따라서 DNA 과메틸화는 몇몇 흑색종 세포(A375 및 MeWo)에서 STING 또는 cGAS 발현을 침묵화하는 데 관여된다. 그러나, STING의 발현 수준이 나머지 흑색종 세포(G361, SK-MEL-5)에서 완화되는지가 아직 명확하지 않다. 다른 후성적 변형, 예컨대 히스톤 변형 또는 다른 전사 조절물질 인자, 예컨대 miRNA는 STING 및/또는 cGAS 발현을 억제하는 데 관여될 수 있었다(Jin et al., 2013, Yarbrough et al., 2014). STING/cGAS 발현의 재구성이 STING 의존적 dsDNA 신호전달을 구제하는지를 결정하기 위해, dsDNA 자극 후 5AZADC 치료된 흑색종 세포에서 IFNB 및 CXCL10 유도를 조사하였다. IFNB 및 CXCL10 생성 둘 다의 유도는 cGAS 구제된 A375 세포에서, 및 IRF3 및 STING 전좌에 수반되는, STING 유도된 MeWo 세포에서의 IFNB의 보통의 발현에서 관찰되었다(도 30d-g). STING 기능이 5AZADC 처리 후 G361 또는 SK-MEL-5 세포에서 관찰되지 않은 한편, STING 및 cGAS 둘 다가 dsDNA 자극된 사이토카인 생성에 필요하다는 것을 확인시켜 주었다(도 30d-e). 따라서, 탈메틸화제는 선택 흑색종 세포에서 STING 의존적 선천성 면역 유전자 유도를 부분적으로 구제할 수 있다.

STING 신호에서의 결함은 흑색종 세포가 DNA 바이러스 감염에 감수성이게 한다. STING 선천성 면역 신호전달은 DNA 바이러스에 대한 숙주 방어 반응에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, STING이 결여된 마우스는 단순 포진 바이러스(HSV) 감염에 극도로 감수성이다(Ishikawa et al., 2008, Ishikawa et al., 2009). 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec)(OncoVex, T-VEC)이라 칭하는, γ34.5 유전자가 결여된 HSV1의 균주는 흑색종을 포함하는 암의 치료에 대한 치료제로서 임상 실험에서 현재 평가되고 있다(Andtbacka et al., 2015; Lawler et al., 2015; Kolodkin-Gal et al., 2009). 그러나, 종양용해의 기전은 완전히 결정되어야 하게끔 있고, HSV 기반 항종양 치료의 그럴싸한 효율을 결정하기 위한 평가가 현재 없다. STING 활성이, 세포가 HSV1을 포함하는 DNA 바이러스 감염에 감수성이게 하는, 많은 대장암 세포에서 결함 있다는 것이 이전에 밝혀졌다. 본 발명자들은 흑색종 세포에서의 STING 기능의 결여가 DNA 바이러스 감염 및 복제에 증가한 감수성과 상관될 수 있다는 것이 상정되었다. 그럴싸하게, 효과적으로 신호전달하는 STING의 능력은 HSV 기반 종양바이러스 치료에 대한 결과에 영향을 미칠 수 있다. 이것을 해결하는 것을 시작하기 위해, 본 발명자들은, 인간 흑색종에 대한 종양세포붕괴성 물질로서 현재 조사되는, 균주와 유사한 γ34.5 유전자가 결여된 HSV1에 의해 흑색종 세포 또는 대조군 hTERT 및 HEMa를 감염시켰다. γ34.5 바이러스 단백질은 숙주 방어 반응을 억제하는 것으로 제안되었지만, 기전은 완전히 명확해질 필요가 있다. 따라서, 숙주 선천성 면역 신호전달의 튼튼한 억제 없이, HSV1γ34.5는 I형 IFN 생성을 포함하는 STING 의존적 선천성 면역 활성화를 강력하게 촉발할 수 있다(Ishikawa et al., 2009). dsDNA 처리와 유사하게, HSV1γ34.5는 대조군 hTERT 및 HEMa 세포, 및 부분 STING 신호전달을 보유하는 SK-MEL-24 및 SK-MEL-31 세포에서 IFNB 및 CXCl10 mRNA의 튼튼한 생성을 유도하였다(도 31a-b). 그러나, 흑색종 세포의 나머지에서 I형 IFN 생성이 거의 관찰되지 않았다. I형 IFN을 유도하는 능력의 결여는, 아마도 특히 STING/cGAS 발현이 결여된 흑색종 세포(A375, G361, MeWo 및 SK-MEL-5)에서 손상된 항바이러스 효과로 인해, 증가한 HSV1γ34.5 복제와 상관되었다(도 31c). 더욱이, 결함 있는 STING 신호를 가지는 세포는 아마도 튼튼한 바이러스 복제로 인해 신속한 세포사를 겪는 한편, 대조군 세포 및 부분 STING 기능을 가지는 세포(SK-MEL-24 및 SK-MEL-31)는 유의미하게 더 내성이었다(도 31d). 이 데이터는 결함 있는 STING-신호전달을 나타내는 흑색종 세포가 더 HSV1 복제 및 용해가 가능하게 한다는 것을 확인시켜 주었다.

흑색종 세포에서 STING 기능의 부재 하에 숙주 선천성 면역 신호전달을 활성화하는 백시니아 바이러스(VV)의 능력을 또한 조사하였다. 감염된 세포의 세포질에서 복제하는 190kb 게놈을 가지는 dsDNA 바이러스인 VV는, 암을 치료하기 위한 종양세포붕괴성 치료제로서 현재 평가 중인, 또 다른 후보자 DNA 바이러스이다(Rowe et al., 2014). HSV1γ34.5를 사용한 본 발명자들의 관찰과 유사하게, VV는, STING/cGAS 발현의 결여를 가지는 세포(A375, G361, MeWo 및 SK-MEL-5)에서가 아니라, 대조군 세포 및 부분 STING 기능을 가지는 흑색종 세포에서 오직 I형 IFN 및 CXCL10 생성을 촉발하였다. 본 발명자들의 결과는 결함 있는 STING-신호전달을 가지는 흑색종 세포는 HSV1 및 VV 감염에 매우 감수성이라는 것을 나타낸다. 따라서, STING/cGAS 발현이 결여된 흑색종이 DNA 바이러스 종양세포붕괴성 활성에 더 감수성이고, 흑색종 조직에서 STING/cGAS 발현을 측정할 수 있다는 것은 선택된 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 대한 환자의 반응을 예측하는 것을 도울 수 있다는 것이 타당하다.

HSV1γ34 .5 치료에 대한 흑색종 세포의 생체내 분석. 본 발명자들의 시험관내 분석은 STING 신호전달의 소실이 선택 종양바이러스 치료의 결과에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다(도 31a-d). 이 가능성을 더 평가하기 위해, 생체내, 누드 마우스에 부분(RPMI7951 및 SK-MEL-3) 또는 결함 있는(A375, MeWo 및 SK-MEL-5) STING 신호전달을 보유하는 흑색종 세포를 피하로 접종함으로써 흑색종 이종이식편을 생성하였다. 이후, HSV1γ34.5를 종양내 투여하고, 종양 성장을 모니터링하였다(도 32). 결과는 결함 있는 STING-신호전달을 가지는 흑색종 세포로부터 유래한 종양이 HSV1γ34.5 치료에 극도로 감수성이라는 것을 보여준다(도 32a-b). 종양 크기는 HSV1γ34.5 치료 후 신속히 감소하였다. 6개 중 4개의 A375 종양 및 5개 중 3개의 SK-MEL-5 종양은 처리 후 2-3주에 감소하였다(도 32a-b). 반대로, 부분 STING 신호전달을 나타낸 흑색종 세포(RPMI7951 및 SK-MEL-3)로부터 유래한 종양은 바이러스 종양세포붕괴성 치료에 불응성이었다(도 32c-d). 이들 종양이 생체내 천천히 성장하지만, 대부분의 마우스는 결코 HSV1γ34.5 치료에 반응하지 않았고, 동물은 종양 부담이 유의미해진 후 탈락되었다. 따라서, 본 발명자들의 발견은 본 발명자들의 이전의 연구를 보완하고, 흑색종에서 STING 기능을 측정하는 능력은 인간 흑색종 및 아마도 다른 유형의 암에 대한 DNA 바이러스 관련 종양세포붕괴성 치료의 결과를 예측할 수 있다는 것을 나타낸다.

토의

상기 보고된 바대로, STING 신호전달은 인간 대장암에서 흔히 억제된다. 언급된 바대로, 내인성 STING 신호의 결여는 DNA 손상에 반응하지 못함을 통해 암을 예방하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있고, 면역 감시 기계를 경계할 수 있다(Chatzinikolaou et al., 2014, Kondo et al., 2013). 이 연구를 확장시키기 위해, 흑색종에서의 STING 신호전달의 발현 및 조절을 분석하였고, STING 의존적 사이토카인 생성이 인간 흑색종에서 흔히 억제된다는 것이 유사하게 발견되었다. STING 또는 cGAS 유전자를 수반하는 유의미한 돌연변이 또는 결실 사건이 관찰되지만, STING 신호전달의 저해는 STING 및 또는 cGAS 발현의 후성적 억제를 통해 주로 발생하는 것으로 발견되었다. 시토졸 DNA 매개된 STING 신호전달은 몇몇 STING-결함 있는 흑색종 세포에서 탈메틸화제(5AZADC) 처리에 의해 부분적으로 구제되었고, 이는 DNA 과메틸화가 STING/cGAS 억제에 대한 기전 중 하나라는 것을 제안한다. 그러나, 다른 STING-결함 있는 흑색종 세포에서, 탈메틸화는 STING 발현을 복원할 수 있다는 것에서 효과적이지 않았다. STING 및/또는 cGAS는 암 발육의 다양한 병기에서 선택적으로 억제에 표적이 될 수 있고, 이들 중 어느 하나의 억제는 STING 기능을 지연시키기에 충분하다. 몇몇 흑색종 세포에서, STING/cGAS 둘 다가 발현되지만, 전사 인자 NF-κB 또는 IRF3을 효과적으로 활성화하는 STING의 능력은, 결정되어야 하게끔 있는, 분자 기전에 의해 손상된다는 것에 또한 주목한다. 따라서, STING 기능은 신호전달 경로를 따라 상이한 단계에서 손상될 수 있지만, STING/cGAS 발현 중 어느 하나의 후성적 억제는 흔한 것으로 보인다. 종합적으로, STING 의존적 신호전달이 많은 흑색종에서 결함 있는 것으로 관찰되었고, 이는 STING 기능의 억제가 흑색종의 발육에 중요한 의무일 수 있어서, 그럴싸하게 이러한 세포가 면역계를 회피하게 한다는 것을 나타낸다.

STING의 소실은 종양에서 흔할 수 있고, 심지어 항암 치료에 대한 결과를 예측할 수 있다. 따라서, 검정은 STING 및 cGAS 둘 다의 발현 수준을 평가하기 위해 본 명세서에서 개발되었고, 이들 중 어느 하나의 소실은 STING 기능에 영향을 미칠 것이다. 이들 검정은 흑색종에서 검증되었고, RNAish 기반 및 IHC 기반 검정 둘 다가 흑색종 세포에서 STING 및 cGAS mRNA 또는 단백질 발현을 정확하게 및 민감하게 예측할 수 있다는 것을 보여주었다. IHC를 이용하여, 50% 초과의 악성 및 60% 초과의 전이성 흑색종에서 STING 또는 cGAS 중 어느 하나의 소실을 나타낸, 흑색종 TMA를 스크리닝하였다. STING 기능의 소실은 중요한 종양 발병 인자가 아닐 수 있다. 그러나, STING은 DNA 손상에 반응하여 사이토카인의 생성에서 중요한 것으로 보인다(Ahn et al., 2015, Xia et al., 2016, Ahn et al., 2014). STING 기능의 소실은 거의 확실히, 종양 전이에서 특히 유리한, 면역감시 및 숙주 항종양 면역을 회피하도록, 암 발육의 차후 병기에서 중요하다. 기재된 검정은 치료학적 중재를 선택하기 위해 암의 효과적인 반응률을 예측하는 데 있어서 유용할 수 있다. 더욱이, 신규한 항종양 유전자 치료 접근법을 통한, 종양에서의 STING 신호의 발생반복은 회피된 종양 세포에 대한 숙주 항종양 면역을 재활성화할 수 있다.

따라서, 흑색종 세포에서의 STING 기능의 소실이 DNA-바이러스 매개된 종양세포붕괴성 효과(예컨대, HSV1)에 세포가 매우 감수성이게 한다는 것에 주목한다. 종양세포붕괴성 HSV1은 임상 분야에서 하나의 바이러스 치료제이다. 예를 들어, 탈리모겐 라허파렙벡(T-VEC)(Amgen)은 면역 인식을 증가시키기 위해 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 발현하도록 조작된 단순 포진 바이러스 1형(HSV-1) 기반 OV이다. T-VEC가 진행된 흑색종에 대한 전통적인 면역 치료제에 비해 개선된 효과를 보여주었지만, 전체 반응률은 여전히 제한된다. 이 현상은 흑색종 사례 중에서 잠재적으로 다양한 STING/cGAS 발현 상태로 인할 수 있다. 종양세포붕괴성 바이러스는 용해에 의해 종양 세포를 직접적으로 파괴할 뿐만 아니라, 항종양 면역 반응의 활성화를 위한 종양 항원 소스를 생성할 수 있다(Woo et al., 2015). STING은 이들 과정의 둘 다에서 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 분자 바이오마커로서의 STING/cGAS의 이용은 암의 치료를 위한 미생물의 사용에 대해 더 예측적인 반응이 가능하게 할 수 있다. 이러한 검정은 CDN에 기초한 다른 STING 의존적 항종양 치료, 또는 심지어 DNA 부가물 기반 화학치료학적 섭생의 효율로의 통찰력을 또한 없앨 수 있다(Zitvogel et al., 2013). 추가로, STING/cGAS 상태의 변형을 수반하는 유전자 치료는, 전통적인 항종양 치료와 조합되어, 항종양 효과를 촉진하기 위한 숙주 선천성 및 적응성 방어 기전을 이용하는 것의 이익을 제공할 수 있다. 따라서, 암 발육에서의 STING 신호에 대한 추가의 연구는 인간 발암물질생성의 분자 기전으로의 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 신규한 항종양 치료학적 접근법을 제공한다.

실험 절차

재료. 모든 시약은, 달리 기재되지 않는 한, ThermoFisher Scientific 또는 Sigma로부터 얻었다.

세포 배양. 정상 인간 멜라닌세포(HEMa) 및 인간 흑색종 세포주를 각각 ThermoFisher Scientific 및 ATCC로부터 구입하고, 지시에 따라 이의 적절한 성장 배지 중에 배양하였다. hTERT-BJ1 텔로머라제 섬유아세포(hTERT)를 원래 Clontech로부터 구입하고, 5% CO2 습윤 분위기에서 37℃에서 10% FBS, 4mM L-글루타민 및 1mM 피류브산나트륨을 가지는 4:1 비율의 DMEM:배지 199 보충제 중에 배양하였다.

면역블롯 분석. 동일한 양의 단백질을 황산도데실 나트륨(SDS) - 폴리아크릴아미드 겔에서 해상하고, 이후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Millipore)으로 옮겼다. 5% 차단 시약에 의해 차단한 후, 막을 다양한 1차 항체(및 적절한 2차 항체)와 항온처리하였다. 이미지를 증대된 화학발광 시스템 ECL(Thermo Scientific)을 사용하여 해상하고, 방사능사진촬영술에 의해 검출하였다. 항체: STING에 대한 토끼 다중클론 항체를 Ishikawa et al, 2008에 이전에 기재된 바대로 본 발명자들의 실험실에서 개발하였고; 다른 항체는 하기 소스로부터 얻었다: β-액틴(Sigma Aldrich), p-IRF3(Cell Signaling), IRF3(Santa Cruz Biotechnology), p-p65(Cell Signaling), p65(Cell Signaling), p-TBK1(Cell Signaling), TBK1(Abcam), cGAS(Cell Signaling).

인터페론 β Elisa 분석. 인터페론 β Elisa를 상기대로 수행하였다.

면역형광 분광법. 세포를 배양하고, Lab-Tek II 챔버 슬라이드에서 이의 적절한 배지에서 처리하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 4% 파라폼알데하이드에 의해 고정시키고, 실온에서 5분 동안 0.05% 트리톤 X-100에 의해 투과시켰다. 면역염색을 토끼-항-STING 다중클론, 토끼-항-IRF3(Santa Cruz Biotechnology) 또는 토끼-항-p65(Cell Signaling), 이어서 형광 접합된 2차 항체(FITC-염소-항-토끼)에 의해 수행하였다. 마이애미 대학교의 Image Core Facility에서 Leica SP5 공초점 현미경에 의해 영상을 찍었다.

정량적 실시간 PCR ( qPCR ). QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 역전사시켰다. TaqMan 유전자 발현 검정(Applied Biosystems)에 의해 실시간 PCR을 수행하였다.

면역조직화학 및 조직학적 분석. 조직 마이크로어레이를 Pantomics로부터 구입하였다. 표준 프로토콜 후 토끼-항-cGAS 항체 또는 토끼-항-STING 항체에 의해 면역조직화학 염색을 수행하였다.

바이러스 증폭, 정제, 적정 및 감염. HSV-1 γ34.5는 친절하게도 Bernard Roizman에 의해 제공되었다. 백시니아 바이러스(vTF7-3)는 친절하게도 John Rose에 의해 제공되었다. 바이러스를 표준 프로토콜에 따라 Vero 세포에 의해 증폭시키고 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 연속 희석된 바이러스를 사용한 플라그 검정을 표준 프로토콜에 따라 Vero 세포에서 수행하였다. 세포를 1시간 동안 특정한 M.O.I.에서 바이러스에 의해 감염시키고, 세척하고, 이후 특정한 검정 조사를 위해 지정된 기간 동안 항온처리하였다.

RNA 인시츄 혼성화. 프로빙된 STING 및 cGAS RNA를 ACD에 의해 주문 설계하고, 배양된 세포에 대한 RNA스코프(등록상표) Multiplex Fluorescent Reagent Kit 및 FFPE 세포 및 조직에 대한 2-plex RNA스코프(등록상표) Reagent Kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 RNA 인시츄 혼성화를 수행하였다

마우스 치료. Balb/C nu/nu 마우스를 Charles River로부터 구입하고, 수의학 자원부 위원회(Division of Veterinary Resources: DVR)에서 유지시켰다. 모든 실험을 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 허가에 의해 IACUC 가이드라인에 따라 수행하였다. 종양 세포를 적절한 종양 세포의 2E106의 피하 주사에 의해 Balb/c 누드 마우스의 옆구리에서 도입하고, 종양은 대략 0.5㎝의 평균 직경으로 발육하게 허용되었다. 이후, HSV1γ34.5를 1E7PFU에서 전체 3회 동안 격일로 종양에 주사하였다. PBS는 비히클 대조군으로서 사용되었다. 종양 성장에 대한 효과를 모니터링하였다. 종양 직경이 10㎜를 초과할 때 마우스를 안락사시켰다.

게놈 DNA 서열분석. 게놈 DNA를 Qiagen DNeasy Kit를 사용하여 흑색종 세포, 및 정상 세포로부터 추출하고, 특이적 유전좌위를 다형 DNA Technologies에 의해 서열분석하였다.

통계 분석. 모든 통계 분석을, 기재되지 않는 한, 스튜턴트 t 시험에 의해 수행하였다. 데이터는 P < 0.05일 때 유의미하게 다른 것으로 생각된다.

본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되어 있지만, 상기 설명이 본 발명을 예시하고 이의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 하고, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정된다. 다른 양태, 이익 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Miami <120> CANCER TREATMENT AND DIAGNOSIS <130> 32286/49720 PC <150> US 62/174,374 <151> 2015-06-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IRF-1 Position 112025721 <400> 1 taaagtaaag cgtattgtca ataaatttca ttgccacaaa g 41 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IRF-1 Position 112030068 <400> 2 gaaactctgt caacaccacc accaccacca agaacaaaag a 41 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IRF-1 Position 112034210 <400> 3 gaggctacat tctgtgcaat attgcaatag tctgaatgca a 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> NF-KB Position 112038354 <400> 4 cgcgttgaga agagggagaa gactagaagg agacagctgc a 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> NF-KB Position 112039068 <400> 5 ccgaatttat ggaaaagtaa aagtaaaatt tgaagctact t 41 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> STAT1 Position 112046243 <400> 6 gagggacagt ccaggcagtt ctgtgcgtgt tcactgttta g 41 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IRF-7 Position 112027291 <400> 7 tctcccatct tagcctggga ctcccatctg ggaccacaga t 41 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IRF-7 Position 112036090 <400> 8 gataagaata catacgtgac tcaagttgaa atagtaagtt t 41

Claims (19)

1. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
   암을 가지는 인간 대상체로부터 샘플을 단리하는 단계;
   상기 샘플에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계;
   상기 샘플에서 상기 STING의 기능적 활성에 기초하여 상기 암에 대한 치료를 선택하는 단계; 및
   상기 선택된 치료에 의해 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 STING의 기능적 활성은 상기 세포에서 결함 있는 것으로 결정되고, 상기 선택된 치료는 STING 결핍 암 세포를 사멸하는 데 있어서 효과적인 것인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 적어도 하나의 화학치료 섭생에 실패한, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 화학치료 섭생은 DNA 돌연변이를 발생시키는 물질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 선택된 치료는 종양세포붕괴성 바이러스(oncolytic virus)를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster virus)로부터 유래한, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 샘플에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계는 상기 세포에서 cGAS의 양을 분석하는 단계를 포함하는, 방법.
8. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
   샘플에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계; 및
   상기 샘플이 결함 있는 STING 활성을 가지는 경우, 종양세포붕괴성 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 샘플에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계는 상기 세포에서 cGAS의 양을 분석하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 암을 가지는 상기 대상체로부터 샘플에서 STING의 기능적 활성을 결정하는 단계; 및
    상기 샘플이 결함 있는 STING 활성을 갖지 않는 경우, DNA 돌연변이를 발생시키지 않는 암 치료를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    암을 가지는 인간 대상체로부터 샘플을 단리하는 단계;
    상기 샘플에서 cGAS의 기능적 활성을 결정하는 단계;
    상기 샘플에서 상기 cGAS의 기능적 활성에 기초하여 상기 암에 대한 치료를 선택하는 단계, 및
    상기 선택된 치료를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법
12. 암을 치료하는 방법으로서,
    a) 바이러스 종양세포붕괴성 치료를 대상체에게 투여하는 단계,
    b) 상기 대상체로부터 샘플에서 STING 또는 cGAS의 수준을 결정하는 단계이되, STING 또는 cGAS 활성의 감소는 종양세포붕괴성 치료의 긍정적인 결과를 예측하는, 상기 결정하는 단계, 및
    c) i) 상기 대상체에서의 STING의 수준이 낮은 경우, 종양세포붕괴성 치료를 계속하는 단계; 또는
    ii) STING 또는 cGAS 수준이 정상 또는 부분적으로 활성인 경우, 상기 바이러스 종양세포붕괴성 치료의 결과를 개선하기 위해, 바이러스 종양세포붕괴성 치료를 중단하고/하거나, 상기 대상체에서 STING 수준을 증가시킬 수 있는 제2 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 종양세포붕괴성 치료는 헤르페스바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스 또는 백시니아 바이러스를 포함하는, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장결장암, 대장염 연관된 암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 체액, 세포, 조직 샘플, 생검, 조직 프린트(tissue print), 피부, 모발, 세포 제제의 가용성 분획 또는 세포가 성장한 배지인, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 체액은 혈액, 뇨, 혈장, 타액 또는 뇌척수액인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, STING 활성 또는 cGAS 활성이 결여된 상기 암에서의 면역 반응은 종양세포붕괴성 바이러스의 투여에 의해 증대되는, 방법.
18. 제18항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 세포 활성의 조절, 수지상 세포 활성의 조절 또는 면역 사이토카인의 조절을 포함하는, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 증가한 종양 세포사 및/또는 지체된 종양 성장을 발생시키는, 방법.
    

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