KR20180025738A - 단백질 제제의 면역원성 측정 방법 - Google Patents

단백질 제제의 면역원성 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180025738A
KR20180025738A KR1020160112817A KR20160112817A KR20180025738A KR 20180025738 A KR20180025738 A KR 20180025738A KR 1020160112817 A KR1020160112817 A KR 1020160112817A KR 20160112817 A KR20160112817 A KR 20160112817A KR 20180025738 A KR20180025738 A KR 20180025738A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
blood mononuclear
cell
peripheral blood
immunogenicity
Prior art date
Application number
KR1020160112817A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101848641B1 (ko
Inventor
임옥재
신덕향
Original Assignee
재단법인 목암생명과학연구소
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 목암생명과학연구소 filed Critical 재단법인 목암생명과학연구소
Priority to KR1020160112817A priority Critical patent/KR101848641B1/ko
Priority to PCT/KR2017/009522 priority patent/WO2018044086A2/ko
Priority to US16/329,403 priority patent/US20190194618A1/en
Publication of KR20180025738A publication Critical patent/KR20180025738A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101848641B1 publication Critical patent/KR101848641B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C12N5/064—Immunosuppressive dendritic cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70514—CD4
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 단백질 제제의 면역원성 측정 방법에 관한 것으로서, 다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리 구축 단계, 유전형별로 말초혈액단핵구의 CD14+ 단핵구 유래의 미성숙 수지상 세포를 측정 대상 단백질 및 GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포를 제조하는 단계, 유전형별로 말초혈액단핵구에서 CD8+ T세포를 제거하여 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 제조하는 단계, 상기 성숙 수지상세포와 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 1:5 내지 1:20의 세포수로 공배양하는 단계 및 상기 공배양으로 증식된 유전형별 CD4+ T세포의 수를 정량하는 단계를 포함함으로써, 개발중인 단백질 제제의 면역원성을 임상 단계 진입 이전에 높은 정확도로 예측하여 단백질 제제 개발 효율을 증대시킬 수 있는 단백질의 면역원성 측정 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 제제의 면역원성 측정 방법 {Method for evaluating immunogenicity of protein drug}
본 발명은 단백질 제제의 면역원성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
다양한 질환을 치료하기 위한 목적으로 여러 가지 형태의 단백질 제제가 연구 개발되어 사용되고 있으며, 특히 치료용 항체의 경우 임상에서의 효과가 매우 성공적인 사례가 다수 존재한다. 치료용 항체의 대표적인 예로서 류마토이드 관절염 등과 같은 염증질환을 대상으로 하는 adalimumab (Humira®), etanercept (Enbrel®) 등과 림프종을 대상으로 하는 rituximab (Mabthera®), 유방암을 대상으로 하는 trastuzumab (Herceptin®) 등을 들 수 있다.
항체 치료제를 임상에 적용한 사례에서 의도하지 않았던 면역반응이 유발되는 경우가 다수 보고된 바 있다. 1세대 항체 치료제의 경우에는 마우스에서 유래된 항체로서 인간항체와의 염기서열의 차이에 의해 투약해준 치료용 항체에 대한 면역반응인 ADA(anti-drug antibody) 반응이 발생하였다. 이를 극복하기 위해 불변영역(constant region)을 인간항체로 치환한 chimeric 항체의 경우 면역반응 발생 정도가 상당부분 개선되었고, 여기에서 더 나아가 가변영역(variable region)까지 인간화(humanized)하는 기술이 발전됨에 따라 염기서열의 차이에 의한 면역원성 유발 가능성은 매우 낮아졌다. 그러나, 실제로 완전히 인간 항체로 개발된 adalimumab (Humira®)의 경우에도 임상 적용 결과 투약 환자의 26%까지 면역반응이 유도된 것으로 확인된 바 있다.
일반적으로 약물의 효과는 혈중 농도에 비례하는데, 치료목적으로 투약한 항체에 대하여 면역반응이 유발될 경우 약물의 반감기가 감소함에 따라 약효가 줄어들게 된다. 게다가 약물에 대하여 유도되는 면역반응에 의해 발열반응이나 염증반응 등의 부작용이 발생할 수도 있다.
단백질 약물(항체 치료제 포함)에 대한 면역원성의 평가는 최근까지도 환자의 말초혈을 채혈하여 ADA가 생성되었는지 여부로 확인하는 방법이 사용되었으나, 이러한 시험법은 해당 단백질 약물을 임상에 적용하는 단계에서야 비로소 면역원성의 평가가 가능하므로, 약물의 개발단계에서 면역원성을 미리 예측할 수 없다는 단점을 갖는다. 약물의 개발에 있어서 임상 단계에 진입하기 까지 엄청난 비용과 시간이 투입되는 점을 감안할 때에, 임상 단계에서야 면역원성을 측정할 수 있다는 점은 단백질 약물 개발에서 큰 걸림돌이다.
따라서, 단백질 제제가 유발할 수 있는 면역원성 (immunogenicity)의 정도를 약물 개발단계에서 미리 예측하여, 면역원성이 낮은 단백질을 사전에 선별하기 위한 면역원성 측정 방법의 개발이 절실한 실정이다. 이러한 면역원성 측정 방법은 약효의 지속력이 높으면서 부작용은 적은 단백질을 사전에 선별하는 데에 기여하여 단백질 제제의 개발 효율을 크게 증대시킨다.
등록특허공보 제 10-1047207 호 (2011.06.30)
본 발명은 단백질 제제가 유발할 수 있는 면역원성 (immunogenicity)의 정도를 약물 개발단계에서 미리 예측하여, 면역원성이 낮은 단백질을 사전에 선별하기 위한 면역원성 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리 구축 단계; 유전형별로 말초혈액단핵구의 CD14+ 단핵구 유래의 미성숙 수지상 세포를 측정 대상 단백질 및 GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포를 제조하는 단계; 유전형별로 말초혈액단핵구에서 CD8+ T세포를 제거하여 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 제조하는 단계; 상기 성숙 수지상세포와 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 1:5 내지 1:20의 세포수로 배지에서 공배양하는 단계; 및 상기 공배양으로 증식된 유전형별 CD4+ T세포의 수를 정량하는 단계를 포함하는 상기 단백질의 면역원성 측정 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 말초혈액단핵구 라이브러리는 인간 HLA-DRB1 유전다형의 70% 이상을 포함하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 말초혈액단핵구는 백혈구 감소 여과기 (Leukoreduction system chambers, LRSC)로부터 수집된 혈액으로부터 추출된 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 상기 CD14+ 단핵구를 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 배지에서 배양하여 제조된 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 공배양을 위해 제공된 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구는 형광 염료로 염색된 것이고, 상기 정량은 상기 공배양 후 형광 신호 강도가 감소한 CD4+ T세포의 수를 정량하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
6. 위 1에 있어서, 상기 공배양하는 단계에서의 배지는 L-글루타민, 인간혈청알부민, 황산스트렙토마이신 및 황산겐타마이신을 더 포함하는 무혈청 배지인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 황산스트렙토마이신은 50 ㎍/ml로 포함되고 상기 황산겐타마이신은 10 ㎍/ml로 포함된 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
8. 위 1에 있어서, 상기 성숙 수지상세포를 제조하는 단계에서의 배지는 Ca(NO3)2·4H2O, KCl, MgSO4(anhydrous), NaCl, Na2HPO4(anhydrous), D-Glucose, Glutathione(reduced), Phenol Red, L-Arginine, L-Asparagine(free base), L-Aspartic Acid, L-Cystine·2HCl, L-Glutamic Acid, L-Glutamine, Glycine, L-Histidine(free base), L-Hydroxyproline, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine·HCl, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine·2Na·2H2O, L-Valine,Biotin, D-Ca pantothenate, Choline Chloride, Folic Acid, i-Inositol, Para-aminobenzoic Acid, Niacinamide, Pyridoxine·HCl, Riboflavin, Thiamine·HCl, 및 Vitamine B12를 더 포함하고, 10 % (vol/vol) FBS를 더 포함하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
9. 위 4에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포를 제조함에 있어서 상기 배지는 Ca(NO3)2·4H2O, KCl, MgSO4(anhydrous), NaCl, Na2HPO4(anhydrous), D-Glucose, Glutathione(reduced), Phenol Red, L-Arginine, L-Asparagine(free base), L-Aspartic Acid, L-Cystine·2HCl, L-Glutamic Acid, L-Glutamine, Glycine, L-Histidine(free base), L-Hydroxyproline, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine·HCl, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine·2Na·2H2O, L-Valine,Biotin, D-Ca pantothenate, Choline Chloride, Folic Acid, i-Inositol, Para-aminobenzoic Acid, Niacinamide, Pyridoxine·HCl, Riboflavin, Thiamine·HCl 및 Vitamine B12를 더 포함하고, 10 % (vol/vol)의 FBS를 더 포함하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
10. 인간 HLA-DRB1 유전다형의 70 % 이상을 포함하는 말초혈액단핵구 라이브러리를 포함하는 단백질의 면역원성 측정 키트.
본 발명의 면역원성 측정 방법에 따르면, 개발 중인 단백질 제제 후보물질의 상대적인 면역원성을 임상 단계 진입 이전에 높은 정확도로 예측할 수 있다.
본 발명의 면역원성 측정 방법에 따르면, 개발 중인 단백질 제제 후보물질의 상대적인 면역원성을 생체 외 (ex vivo) 실험을 통하여 예측할 수 있다.
본 발명의 면역원성 측정 방법에 따르면, 단백질 제제 개발 효율을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 면역원성 측정 방법은 저비용으로 수행될 수 있다.
도 1은 본 발명의 말초혈액단핵구 라이브러리의 HLA-DRB1 유전형을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 측정 방법에 의해 도출된 증식지수 (Proliferation Index, PI)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 측정 방법에 의해 도출된 반응지수 (Response Index, RI)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 측정 방법에 의해 도출된 반응지수와 임상에서 보고된 ADA 생성 정도의 상관관계를 나타낸다.
본 발명은 단백질 제제의 면역원성 측정 방법에 관한 것으로서, 다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리 구축 단계, 유전형별로 말초혈액단핵구의 CD14+ 단핵구 유래의 미성숙 수지상 세포를 측정 대상 단백질 및 GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포를 제조하는 단계, 유전형별로 말초혈액단핵구에서 CD8+ T세포를 제거하여 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 제조하는 단계, 상기 성숙 수지상세포와 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 1:5 내지 1:20의 세포수로 배지에서 공배양하는 단계 및 상기 공배양으로 증식된 유전형별 CD4+ T세포의 수를 정량하는 단계를 포함함으로써, 개발중인 단백질 제제 후보물질의 상대적인 면역원성을 임상 단계 진입 이전에 높은 정확도로 예측하여 단백질 제제 개발 효율을 증대시킬 수 있는 단백질의 면역원성 측정 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 단백질의 면역원성 측정 방법은
다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리 구축 단계;
유전형별로 말초혈액단핵구의 CD14+ 단핵구 유래의 미성숙 수지상 세포를 측정 대상 단백질 및 GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포를 제조하는 단계;
유전형별로 말초혈액단핵구에서 CD8+ T세포를 제거하여 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 제조하는 단계;
상기 성숙 수지상세포와 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 1:5 내지 1:20의 세포수로 배지에서 공배양하는 단계; 및
상기 공배양으로 증식된 유전형별 CD4+ T세포의 수를 정량하는 단계;
를 포함한다.
본 발명의 단백질의 면역원성 측정 방법은 다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리 구축 단계를 포함한다.
말초혈액단핵구 (Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 혈액에서 발견되고 하나의 둥근 핵 (nucleus)을 갖는 세포이다. 말초혈액단핵구는 T세포, B세포, NK세포 등의 림프구 (lymphocyte) 및 단핵구 (monocyte)를 포함한다. 단핵구 (monocyte)는 수지상세포 (dendritic cell) 및 대식세포 (macrophage) 등으로 분화할 수 있는 세포이다.
HLA-DRB1 유전자는 HLA 클래스 II 조직적합성 항원인 DRB1 (HLA class II histocompatibility antigen) 단백질을 코딩하는 유전자이다. HLA-DRB1 유전자는 항원 제시 세포 (antigen presenting cells, APC)에서 주로 발현되며, 세포 외 단백질 (extracellular protein)을 항원 제시 세포의 표면에 제시하여 T세포를 활성화하는데 중요한 역할을 한다. HLA-DRB1 유전자는 매우 많은 유전다형 (polymorphism)으로 존재하는데, HLA-DRB1의 유전형에 따라서, 특정 단백질 제제에 대한 ADA(anti-drug antibody) 생성 여부 및 생성 정도가 달라질 수 있다.
특정 단백질 제제의 면역원성을 정확히 측정하기 위해서는, 다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리를 사용하여 면역원성 측정을 수행하는 것이 바람직하다. 일 실시예에 따르면, 각각의 유전자형별로 대상 단백질의 면역원성을 측정하고, 다양한 유전자형에 대해 동일한 면역원성 측정을 반복 수행 한 후, 각각의 측정으로부터 수득된 면역원성 측정값을 취합하여 해당 단백질의 면역원성 측정값을 도출할 수 있으며, 이때 측정값으로부터 실제 임상에서의 면역원성을 예측함에 있어서 특정 HLA-DRB1 유전형의 출현 빈도가 고려될 수 있다. 예컨대, 특정 인종 및 국가 등에서의 특정 HLA-DRB1 유전형의 출현 빈도에 따른 가중치 등을 적용하여, 인종 및 국가 맞춤형으로 정확도가 향상된 면역원성 측정값을 도출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 말초혈액단핵구 라이브러리는 인간 HLA-DRB1 유전다형의 50% 이상의 말초혈액단핵구를 포함할 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 인간 HLA-DRB1 유전다형의 70 % 이상 (예컨대 75 % 이상, 79 % 이상 또는 80 % 이상)의 말초혈액단핵구를 포함할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 말초혈액단핵구 라이브러리는, HLA-DRB1 allele의 frequency distribution을 기준으로 전 세계 인구 (global population)의 50 % 이상 (예컨대 70 % 이상, 75 % 이상, 79 % 이상 또는 80 % 이상)을 커버할 수 있는 공여자의 PBMC를 선별하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 단백질의 면역원성 측정 방법은 유전형별로 선택된 공여자의 말초혈액단핵구의 CD14+ 단핵구 유래의 미성숙 수지상 세포를 측정 대상 단백질 및 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), IL-4 (Interleukin 4), TNF-α (Tumor necrosis factor alpha), IL-1β (Interleukin 1β), IL-6 (Interleukin 6) 및 PGE2 (Prostaglandin E2)를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포를 제조하는 단계를 포함한다.
CD14+ 단핵구는 말초혈액단핵구 중에서 CD14을 발현하는 단핵구를 선택적으로 추출하여 수득될 수 있다. CD14 발현 단핵구의 선택적 추출에는 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 예컨대 자석활성 세포분류장치 (Magnetic-activated cell sorting, MACS)가 사용될 수 있다.
미성숙 수지상세포 (immature dendritic cells, immature DC)는 말초혈액단핵구 (Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)가 성숙 수지상세포 (mature dendritic cells, mature DC)로 성숙되는 중간 과정에 있는 세포이다. 미성숙 수지상세포는 항원을 탐식 (uptake) 하며, 탐식된 항원은 세포내에서 처리된 후 HLA class II에 탑재되어 성숙 수지상세포의 표면에 제시 (presenting) 된다. 항원을 표면에 제시 (presenting)하는 성숙 수지상세포는 T세포를 자극하여, 해당 항원에 대응하는 항체를 생성 및 분비하는 B세포를 자극할 수 있는 CD4+ T세포의 증식을 유도한다.
대상 단백질은 면역원성 측정 대상이 되는 단백질을 의미하며, 항체 제제 등의 다양한 단백질 제제를 포함한다.
본 발명의 단백질의 면역원성 측정 방법은 유전형별로 선택된 공여자의 말초혈액단핵구에서 CD8+ T세포를 제거하여 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 제조하는 단계를 포함한다.
CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구는, 말초혈액단핵구 중에서 CD8을 발현하는 T세포를 선택적으로 제거하여 수득될 수 있다. CD8+ T세포를 선택적으로 제거하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 예컨대 자석활성 세포분류장치 (Magnetic-activated cell sorting, MACS)가 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질의 면역원성 측정 방법은 상기 성숙 수지상세포 및 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 1:5 내지 1:20 (예컨대 1:10)의 세포수로 배지에서 공배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 따르면, 상기 성숙 수지상세포의 수는 2×104 내지 1×105 cells/100㎕/well이고, 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구의 수는 2×105 내지 1×106 cells/100㎕/well일 수 있다. 예컨대, 상기 성숙 수지상세포의 수는 5×104 cells/100㎕/well이고, 상기 CD8+ T세포가 제거된 말초혈액단핵구의 수는 5×105 cells/100㎕/well일 수 있다.
위와 같은 공배양을 통해 성숙 수지상세포에 제시 (presenting)된 항원을 인식하는 CD4+ T세포의 증식을 유도할 수 있다. 이때, 성숙 수지상세포와 공배양되는 세포로서 CD8+ T세포가 제거된 말초혈액단핵구를 사용하지 않는 경우 (예컨대, 전체 말초혈액 단핵구를 사용하거나 CD4+ T세포만을 추출하여 사용하였을 경우), 비특이적 반응 등에 의해 면역원성 측정 정확도가 저하될 수 있다.
본 발명의 면역원성 측정 방법은 위의 공배양으로부터 증식된 CD4+ T세포의 수를 정량하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 대상 단백질을 제시 (presenting)하는 성숙 수지상세포에 의한 CD4+ T세포의 증식 정도, 즉 증식된 CD4+ T세포의 수는, 해당 단백질이 체내에 투여되었을 때 그 단백질에 대한 ADA (anti-drug antibody)가 생성되는 정도와 높은 상관관계를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 말초혈액단핵구는 혈액으로부터 추출된 것일 수 있다. 혈액은 다양한 경로로 수득된 것일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 혈액은 백혈구 감소 여과기 (Leukoreduction system chambers, LRSC)로부터 수집된 것일 수 있다. 백혈구 감소 여과기 (Leukoreduction system chambers, LRSC)를 혈액의 공급원 (source)로 사용하는 경우, 혈액의 수급이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 미성숙 수지상세포는 말초혈액단핵구로부터 분리한 CD14+ 단핵구로부터 제조될 수 있다. 예컨대, 말초혈액단핵구로부터 분리한 CD14+ 단핵구를 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및 IL-4 (Interleukin 4)와 접촉시켜 미성숙 수지상세포를 제조할 수 있다.
성숙 수지상세포와의 공배양에 사용되는 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구는 형광염료로 염색된 것일 수 있다. 형광염료는, 예컨대, 세포내 구성물과 공유결합하여 형광 신호를 발생하는 것일 수 있다. 이러한 형광염료로 염색된 세포가 증식하였을 경우에, 증식된 각각의 세포의 형광 신호는 증식 전보다 절반씩 감소하게 된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 형광 신호가 감소한 CD4+ T세포의 수를 정량함으로써 증식된 CD4+ T세포의 수를 정량할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명에서의 공배양하는 단계에서의 배지는 L-글루타민 (L-glutamine), 인간혈청알부민 (Human Serum Albumin, HSA), 황산스트렙토마이신 (streptomycin sulfate) 및 황산겐타마이신 (gentamicin sulfate)을 더 포함하는 무혈청 배지일 수 있다. 구체적인 일 실시예에 따르면, 배지는 황산스트렙토마이신 (streptomycin sulfate) 및 황산겐타마이신 (gentamicin sulfate)은 각각 50 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따르면, T세포와 수지상세포를 공배양하는 단계에서 이러한 배지를 사용할 경우 background noise는 낮고 항원 특이적인 증식이 촉진되어 면역원성 측정의 정확도가 향상될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 미성숙 수지상세포를 제조하는 단계 및 성숙 수지상세포를 제조하는 단계에서의 배지는 Ca(NO3)2·4H2O, KCl, MgSO4(anhydrous), NaCl, Na2HPO4(anhydrous), D-Glucose, Glutathione(reduced), Phenol Red, L-Arginine, L-Asparagine(free base), L-Aspartic Acid, L-Cystine·2HCl, L-Glutamic Acid, L-Glutamine, Glycine, L-Histidine(free base), L-Hydroxyproline, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine·HCl, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine·2Na·2H2O, L-Valine,Biotin, D-Ca pantothenate, Choline Chloride, Folic Acid, i-Inositol, Para-aminobenzoic Acid, Niacinamide, Pyridoxine·HCl, Riboflavin, Thiamine·HCl 및 Vitamine B12를 더 포함하고, 10 % (vol/vol)의 FBS를 더 포함하는 것일 수 있다. 미성숙 수지상세포를 제조하는 단계 및 성숙 수지상세포를 제조하는 단계에서 위와 같은 배지를 사용함으로써 수지상세포가 적절히 분화되는 효율이 향상될 수 있고 면역원성 측정 정확도가 향상될 수 있다.
본 발명의 단백질의 면역원성 측정 키트는 인간 HLA-DRB1 유전다형의 50 % 이상 (예컨대, 70 % 이상, 75 % 이상, 79 % 이상 또는 80 % 이상)을 포함하는 말초혈액단핵구 라이브러리를 포함한다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 면역원성 측정 키트는, HLA-DRB1 allele의 frequency distribution을 기준으로 전 세계 인구 (global population)의 50 % 이상 (예컨대 70 % 이상, 75 % 이상, 79 % 이상 또는 80 % 이상)을 커버할 수 있는 공여자의 PBMC를 선별하여 제조된 라이브러리를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1: 인간 말초혈액단핵구 (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs) 준비 방법
1. PBMC preparation
LRSC(leukoreduction system chamber, 백혈구 여과제거 필터)의 겉면을 alcohol swab으로 소독하여 준비함. 50mL tube에 elution buffer(PBS supplemented with 0.6%(vol/vol) ACD) 20mL을 넣어 준비함. LRSC에 연결된 inlet 및 outlet line tube를 소독한 가위로 잘라주고, elution buffer가 들어있는 tube에 혈액을 모아줌. Elution buffer 30mL을 추가하여 남아있는 혈액을 washing해서 모아줌.
새로운 50mL tube에 15mL Ficoll-PaqueTM 넣고, buffer로 희석된 혈액을 30mL씩 천천히 overlay 해줌. 18000rpm에서 20분간 원심분리한 뒤, PBMC가 포함된 층을 모아서 washing buffer(PBS supplemented with 0.6%(vol/vol) ACD and 2%(vol/vol) FBS)를 넣고 1500rpm에서 10분간 원심분리함. 상층액을 제거하고 50mL의 washing buffer에 현탁하여 1350rpm에서 10분간 원심분리함. 다시 상층액을 제거하고 50mL의 washing buffer에 현탁하여 세포수 및 세포 생존률을 측정함.
1200rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 4x107 cell/mL이 되도록 FBS에 현탁함. 동일 부피의 20%(vol/vol) DMSO를 섞어주어 최종 10% DMSO에 현탁되도록 준비함. 2mL cryogenic vial에 현탁액을 1.5mL씩 분주하여 CRF(controlled-rate freezer)를 이용해 냉동시킨 후 액체질소 탱크에 보관함.
실시예 1-2: DC:T cell assay
1. Dendritic cell 준비 방법
1.1. PBMC 해동
Cryopreserved PBMC를 37℃ water bath에서 신속하게 녹인 후 50 mL conical tube로 옮김. Tube를 whirling하면서 thawing media(RPMI supplemented with 10%(vol/vol) FBS)를 한 방울씩 점적하여 잘 섞어 줌 (15 mL/vial). 1200 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 30mL MACS buffer(PBS supplemented with 0.5%(vol/vol) FBS and 2mM EDTA)에 현탁함. 세포수 및 세포 생존률을 측정한 후 1200rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거함.
1.2. Monocyte 분리
해동한 PBMC에 CD14 Microbeads(Miltenyi Biotech)를 넣고 ice에서 15분간 염색함. MACS buffer 30mL을 넣고 1350rpm에서 8분간 원심분리한 후, 상층액을 제거함. 500 μL MACS buffer에 현탁 후, LS column(Miltenyi Biotech)으로 CD14+ cell을 분리함. 세포수 및 세포 생존률을 측정하고, 1350rpm에서 8분간 원심분리하여 준비함.
1.3. DC 분화 방법
분리한 CD14+ cell을 6 x 105 cells/mL이 되도록 RPMI(supplemented with 10%(vol/vol) FBS) 배지에 현탁하여 1 mL씩 24-well plate에 넣어 줌. 1000 U/mL GM-CSF(R&D systems) 및 1000 U/mL IL-4 (R&D systems)를 넣어주고 37 CO2 incubator에서 5일간 배양함.
배양 5일째에 각 24-well에서 상층액 700 μL를 pipet으로 제거하고 각 cytokine 포함한 media를 1 mL씩 추가함. 이때 각 cytokine의 농도는 1000 U/mL GM-CSF(R&D systems), 1000 U/mL IL-4(R&D systems), 10 ng/mL TNF-α(R&D systems), 10 ng/mL IL-1β(R&D systems), 10 ng/mL IL-6(R&D systems), 1 ㎍/mL PGE2(Prostaglandin E2, Sigma)가 되도록 함. 각 24-well에 면역원성을 평가하고자 하는 단백질 제제를 0.1 내지 1.0 μM (예컨데 0.3 μM)의 적절한 농도로 넣어줌. 37 CO2 incubator에서 2일간 배양함.
1.4. DC 평가
각 24-well에서 7일간 배양한 DC를 pipetting하여 5 mL tube에 옮겨줌. 회수한 DC의 일부는 분화의 적절성 여부를 flow cytometry로 평가함. Monocyte에서 DC로 분화하면서 CD14의 발현이 사라지고, CD209의 발현이 증가 함을 확인함. 또한, HLA-DR, CD80, CD83, CD86 등의 발현이 증가하였는지를 통해 mature DC로의 분화를 평가함.
회수한 DC는 세포수 및 세포 생존률을 측정하고, AIM-V 배지 3 mL를 추가하여 1200rpm에서 5분간 원심분리함. 상층액을 제거한 후, AIM-V 배지를 추가하여 5x105 cells/mL로 현탁함. 2000cGy로 γ-irradiation 수행하여 DC:T cell assay를 위해 DC를 준비함.
2. T cell 준비 방법
2.1. PBMC 해동
Cryopreserved PBMC를 37℃ water bath에서 신속하게 녹인 후 50mL conical tube로 옮김. Tube를 whirling하면서 thawing media를 한 방울씩 점적하여 잘 섞어 줌 (15 mL/vial). 1200rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 30mL MACS buffer에 현탁함. 세포수 및 세포 생존률을 측정한 후 1200rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거함.
2.2. Depletion of CD8+ T cells
해동한 PBMC에 CD8 Microbeads(Miltenyi Biotech)를 넣고 ice에서 15분간 염색함. MACS buffer 30mL을 넣고 1350rpm에서 8분간 원심분리한 후, 상층액을 제거함. 500 μL MACS buffer에 현탁 후, LS column(Miltenyi Biotech)으로 CD8+ cell을 제거함. 획득한 CD8- cell의 세포수 및 세포 생존률을 측정하고, 1350rpm에서 8분간 원심분리하여 준비함.
2.3. VPD450 staining of CD8- cells
상층액을 제거한 CD8- cell을 1x D-PBS에 현탁하여 2x107 cells/mL이 되도록 준비함. 1x D-PBS와 동일한 volume의 VPD450 solution(1 μM VPD450 in 1x DPBS)를 넣고 섞어준 현탁액을 37℃ CO2 incubator에서 15분간 배양함. thawing media 10 mL을 추가하여 1200rpm에서 10분간 원심분리함. 상층액을 제거한 후 AIM-V 배지 12 mL에 현탁하여 세포수 및 세포 생존률을 측정함. 1200rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 AIM-V 배지를 추가하여 5x106 cells/mL이 되도록 현탁함.
3. T cell proliferation assay
3.1. DC:T cell plating
1.4 및 2.3에서 준비한 DC 및 T cell을 각각 96-well plate에 100 μL씩 stimulant 조건 당 triplicate로 plating함. 37℃ CO2 incubator에서 7일간 배양함.
3.2. Flow cytometric analysis
7일간 배양한 세포를 다음 표 1에 나타난 바와 같이, 형광표지된 항체로 염색하여 CD4+ T cell의 증식 반응을 선별적으로 측정함.
Antibody mixture
Flurochrome FITC PE PerCP APC
Antibody CD3 CD8 7-AAD CD4
구체적으로, 배양된 세포를 antibody mixture와 함께, ice에서 30분간 배양함. 2000rpm에서 3분간 원심분리한 후 상층액을 제거함. 200 μL의 FACS buffer(FACS Sheath solution(BD) supplemented with 1%(vol/vol) FBS)를 넣고 washing하는 과정을 2회 반복함. 200 μL의 BD CytoFixTM에 현탁하여 1.1mL tubes (Axygen)에 옮겨줌. LSR Fortessa(BD)로 CD4+ T cell의 증식 반응을 분석함.
실시예 2: 면역원성 측정 방법 검정
본 발명에 의한 면역원성 측정 방법의 검정을 위하여, HLA-DRB1 allotype 기준으로 world population 분포와 비교하여 약 80%의 coverage에 상응하는 다양한 donor 40명 이상의 PBMC를 대상으로 하였으며(도 1), ADA 생성 정도가 임상에서 확인된 6가지 단백질 제제 (표 2)를 본 발명에 의한 면역원성 측정 방법에 의하여 분석하였다. FDA 승인된 항체 치료제의 보고된 면역원성을 아래 표 2와 같이 정리하였으며, 본 발명에 의한 면역원성 분석 결과를 도 2 및 도 3에 정리하였다.
Antibody name Company Type Target Indication(s) Reported
Immunogenicity *
Muromanab (OKT3) Ortho Biotech Murine CD3 Allograft rejection 47% (50)
Adalimumab (Humira) Abbott Human TNFα RA/Crohn/PsA/JIA/Ankylosing spondylitis/plaque psoriasis 2.6%~26%
Trastuzumab (Herceptin) Genentech (Roche) Humanized Her2/neu Breast cancer <1%
Bevacizumab (Avastin) Genentech (Roche) Humanized VEGF Colorectal, brease, renal and NSCL cancer 0% (~500)
Rituximab (Rituxan) Genentech (Roche)/Biogen Idec Chimeric CD20 Non-Hodgkin lymphoma 11% (2578)
Infliximab (Remcicade) Centocor (Johnson&Johnson) Chimeric TNFα RA/Crohn 25% (99)
*Frequency (size of patient group)
도 2는 본 발명의 측정 방법에 의해 도출된 증식지수(Proliferation Index, PI)을 나타낸 것이다. 분석에 이용한 40명의 donor PBMC에 대하여 각 단백질 제제에 의한 증식반응에서 background 증식반응을 제거한 값을 의미한다.
도 3은 본 발명의 측정 방법에 의해 도출된 반응지수(Response Index, RI)을 나타낸 것이다. RI는 전체 donor 중 각 단백질 제제에 양성으로 반응한 donor의 %와 각 단백질 제제에 대한 증식지수(PI)를 곱한 값이다. 반응지수(RI) 값이 클수록 단백질 제제의 면역원성이 높음을 의미한다. 또한, 각 donor PBMC의 background 증식반응의 2 X SEM 값을 넘는 PI 값에 대하여 ANOVA analysis를 수행한 결과, RI 값이 높은 단백질 제제의 경우 음성대조군과 비교해 통계적으로 유의하게 확인된 반면, RI 값이 낮은 단백질 제제의 경우 음성대조군과 비교해 통계적 유의성이 확인되지 않았다.
도 4는 본 발명의 측정 방법에 의해 도출된 반응지수(Y 축)와 임상에서 보고된 ADA 생성 정도(X 축)의 상관관계를 나타낸 것이며, p value<0.05, R2>0.9 이상의 통계적 유의성이 있는 것으로 나타나 본 발명의 면역원성 측정 방법이 임상에서 보고된 ADA 생성 정도와 높은 상관관계를 보임을 알 수 있다. 이는 특정 단백질 제제의 면역원성을 생체 외에서(ex vivo) 측정하는 본 발명의 면역원성 측정 방법이, 해당 단백질 제제가 향후 임상에 적용 시, 체내에서 ADA를 어느 정도 생성할지(즉, 어느 정도의 면역원성을 나타낼지)를 높은 정확도로 예측할 수 있음을 의미한다.

Claims (10)

  1. 다양한 HLA-DRB1 유전형을 갖는 말초혈액단핵구 라이브러리 구축 단계;
    유전형별로 말초혈액단핵구의 CD14+ 단핵구 유래의 미성숙 수지상 세포를 측정 대상 단백질 및 GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포를 제조하는 단계;
    유전형별로 말초혈액단핵구에서 CD8+ T세포를 제거하여 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 제조하는 단계;
    상기 성숙 수지상세포와 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구를 1:5 내지 1:20의 세포수로 배지에서 공배양하는 단계; 및
    상기 공배양으로 증식된 유전형별 CD4+ T세포의 수를 정량하는 단계;
    를 포함하는 상기 단백질의 면역원성 측정 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 말초혈액단핵구 라이브러리는 인간 HLA-DRB1 유전다형의 70% 이상을 포함하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 말초혈액단핵구는 백혈구 감소 여과기 (Leukoreduction system chambers, LRSC)로부터 수집된 혈액으로부터 추출된 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 상기 CD14+ 단핵구를 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 배지에서 배양하여 제조된 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 공배양을 위해 제공된 상기 CD8+ T세포-제거된 말초혈액단핵구는 형광 염료로 염색된 것이고, 상기 정량은 상기 공배양 후 형광 신호 강도가 감소한 CD4+ T세포의 수를 정량하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 공배양하는 단계에서의 배지는 L-글루타민, 인간혈청알부민, 황산스트렙토마이신 및 황산겐타마이신을 더 포함하는 무혈청 배지인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 황산스트렙토마이신은 50 ㎍/ml로 포함되고 상기 황산겐타마이신은 10 ㎍/ml로 포함된 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 성숙 수지상세포를 제조하는 단계에서의 배지는 Ca(NO3)2·4H2O, KCl, MgSO4(anhydrous), NaCl, Na2HPO4(anhydrous), D-Glucose, Glutathione(reduced), Phenol Red, L-Arginine, L-Asparagine(free base), L-Aspartic Acid, L-Cystine·2HCl, L-Glutamic Acid, L-Glutamine, Glycine, L-Histidine(free base), L-Hydroxyproline, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine·HCl, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine·2Na·2H2O, L-Valine,Biotin, D-Ca pantothenate, Choline Chloride, Folic Acid, i-Inositol, Para-aminobenzoic Acid, Niacinamide, Pyridoxine·HCl, Riboflavin, Thiamine·HCl, 및 Vitamine B12를 더 포함하고, 10 % (vol/vol) FBS를 더 포함하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포를 제조함에 있어서 상기 배지는 Ca(NO3)2·4H2O, KCl, MgSO4(anhydrous), NaCl, Na2HPO4(anhydrous), D-Glucose, Glutathione(reduced), Phenol Red, L-Arginine, L-Asparagine(free base), L-Aspartic Acid, L-Cystine·2HCl, L-Glutamic Acid, L-Glutamine, Glycine, L-Histidine(free base), L-Hydroxyproline, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine·HCl, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine·2Na·2H2O, L-Valine,Biotin, D-Ca pantothenate, Choline Chloride, Folic Acid, i-Inositol, Para-aminobenzoic Acid, Niacinamide, Pyridoxine·HCl, Riboflavin, Thiamine·HCl 및 Vitamine B12를 더 포함하고, 10 % (vol/vol)의 FBS를 더 포함하는 것인, 단백질의 면역원성 측정 방법.
  10. 인간 HLA-DRB1 유전다형의 70 % 이상을 포함하는 말초혈액단핵구 라이브러리를 포함하는 단백질의 면역원성 측정 키트.
KR1020160112817A 2016-09-01 2016-09-01 단백질 제제의 면역원성 측정 방법 KR101848641B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160112817A KR101848641B1 (ko) 2016-09-01 2016-09-01 단백질 제제의 면역원성 측정 방법
PCT/KR2017/009522 WO2018044086A2 (ko) 2016-09-01 2017-08-31 단백질 제제의 면역원성 측정 방법
US16/329,403 US20190194618A1 (en) 2016-09-01 2017-08-31 Method for measuring immunogenicity of protein agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160112817A KR101848641B1 (ko) 2016-09-01 2016-09-01 단백질 제제의 면역원성 측정 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180025738A true KR20180025738A (ko) 2018-03-09
KR101848641B1 KR101848641B1 (ko) 2018-04-13

Family

ID=61305293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160112817A KR101848641B1 (ko) 2016-09-01 2016-09-01 단백질 제제의 면역원성 측정 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20190194618A1 (ko)
KR (1) KR101848641B1 (ko)
WO (1) WO2018044086A2 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109001332A (zh) * 2018-09-06 2018-12-14 河南工业大学 一种食用油脂中tbhq原始添加量的测定方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100490308B1 (ko) * 2002-02-25 2005-05-17 크레아젠 주식회사 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법
EP2155861B1 (en) * 2007-04-06 2018-09-05 International Stem Cell Corporation Patient-specific stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocysts

Also Published As

Publication number Publication date
KR101848641B1 (ko) 2018-04-13
WO2018044086A2 (ko) 2018-03-08
US20190194618A1 (en) 2019-06-27
WO2018044086A3 (ko) 2018-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4714767B2 (ja) ヒト血液由来のｃｄ４＋ｃｄ２５＋調節ｔ細胞
JP3160600B2 (ja) ヒト造血幹細胞
US11060059B2 (en) Methods of producing T cell populations enriched for stable regulatory T-cells
Sioud et al. TLR agonists induce the differentiation of human bone marrow CD34+ progenitors into CD11c+ CD80/86+ DC capable of inducing a Th1‐type response
US11590167B2 (en) Methods and compositions for use of therapeutic T cells in combination with kinase inhibitors
Nguyen et al. Flow cytometric analysis of T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction with dendritic cells
US20220155321A1 (en) Selection of t cell receptors
US20220135944A1 (en) Methods for producing autologous t cells useful to treat cancers and compositions thereof
EP2923208B1 (en) Methods for determining the risk of acute graft versus host disease
Bruger et al. Protocol to assess the suppression of T-cell proliferation by human MDSC
Goncharov et al. Pinpointing the tumor-specific T cells via TCR clusters
Kim et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes
Bonifacius et al. Rapid manufacturing of highly cytotoxic clinical-grade SARS-CoV-2-specific T cell products covering SARS-CoV-2 and its variants for adoptive T cell therapy
Summers et al. Dendritic cells in synovial fluid of chronic inflammatory arthritis lack CD80 surface expression
US20050112762A1 (en) Method for culturing dendritic cells
KR101848641B1 (ko) 단백질 제제의 면역원성 측정 방법
Rodríguez-Bayona et al. Differential expression of SLAMS and other modulatory molecules by human plasma cells during normal maturation
JP6811724B2 (ja) 細胞療法に対する臨床応答を決定するためのバイオマーカー
US20220282211A1 (en) Antibody producing microfluidic devices
Lonial et al. Regulation of alloimmune responses by dendritic cell subsets
Levine et al. Single-cell metabolic analysis by mass cytometry reveals distinct transitional states of CD8 T cell differentiation
van der Heijden et al. In vitro expansion of Wilms’ tumor protein 1 epitope-specific primary T cells from healthy human peripheral blood mononuclear cells
Levine et al. Single-cell metabolic dynamics of early activated CD8 T cells during the primary immune response to infection
Hsueh et al. Purification and characterization of mouse splenic B lymphocytes
EP3342855B1 (en) Cell composition depleted from tcrab and cd45ra positive cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant