KR20180023859A

KR20180023859A - 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180023859A
Application number: KR1020170107747A
Authority: KR
Inventors: 허호진; 박준규; 정찬영; 하정수; 박선경; 김종민; 강진용
Original assignee: 경상대학교산학협력단; 서강유업주식회사
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2018-03-07
Also published as: KR101942959B1

Abstract

본 발명은 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다래 추출물 또는 이의 분획물은 알파-글루코시다제 억제 활성이 우수하고, 공복 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 복강 내 당부하 검사에도 유의미한 감소를 보여 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 다래 추출물은 천연물질로서 체내에 안정한 특징이 있어 기능성 건강식품의 소재로도 사용될 수 있다.

Description

다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for prevention or treatment of diabete or diabetic complications comprising an extract or fractions of Actinidia arguta as active ingredient}

본 발명은 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

현재 우리나라는 급격한 경제성장으로 인해 서구화된 식이습관과 영양분의 과잉으로 질병의 양상이 크게 변화하고 있으며 과거와는 달리 동맥경화, 고혈압, 암, 비만 및 당뇨병 등의 만성 퇴행성 질환이 주요 사망 원인으로 대두되고 있다.

특히 당뇨병과 그로 인한 합병증의 발병율이 급격히 증가하고 있는 추세이다. 당뇨병 발병율은 1970년대 인구의 1% 미만이었던 것이 1990년대 이후에는 인구 10만 명당 17.2명이 당뇨병에 의해 사망하고 있으며, 앞으로도 당뇨병의 발병율은 계속 증가할 것으로 추정되고 있다. 당뇨병은 고혈당과 그로 인한 대사 장애가 장기간 지속되어 발병하는 만성 대사 질환으로서, 췌장 Langerhan's island β세포의 기능 이상에 의한 인슐린의 절대적 결핍으로 나타나는 인슐린 의존성 당뇨병과 인슐린의 분비능력이 감소하거나 반응속도가 느려져 나타나는 인슐린 비의존성 당뇨병으로 분류된다.

당뇨병은 대표적인 만성질환으로 포도당을 비롯한 여러 대사 장애로 망막, 신장 및 신경 등의 미세혈관 합병증과 중풍, 협심증, 심근경색증 및 말초 혈관 질환 등의 대혈관 합병증을 초래하는 만성적인 질병이다. 최근 당뇨병의 치료방법이 발달됨에 따라 당뇨병 환자의 평균 수명이 연장되고 급성 대사성 합병증으로 인한 사망률이 급격하게 감소되고는 있지만 당뇨병성 만성 합병증의 발생이 증가함으로 인해 당뇨병 합병증은 당뇨병 치료 그 자체보다 더 큰 문제점으로 지적되고 있다.

당뇨의 치료법은 약물요법, 운동요법 및 식이요법이 있으며 환자의 증상에 따라 인슐린 약재와 각종 혈당제가 사용되고 있다. 그러나 당뇨병은 간에서의 당 생성 과다, 인슐린 저항성, 근육과 지방 세포 등에서 당 처리 능력 감소 등의 특징을 나타내는 복합적인 질병이므로 특정 치료법만으로는 여러 가지 부작용의 유발을 막을 수 없다. 이 중 약물요법은 인슐린 및 화학물질을 사용하고 있어 약물 복용에 따라 부작용과 환자의 내성에 끊임없는 문제가 되고 있기 때문에, 최근에는 당뇨병 치료에 있어 식이가 가능하며 부작용이 적은 천연물을 이용하여 당뇨병을 치료하기 위한 연구가 필요한 실정이다.

한국등록특허 제1126677호 한국등록특허 제1193085호

이에 본 발명자들은 당뇨 치료에 효과가 있는 천연물 유래의 물질을 찾기 위해 다양한 노력을 하던 중 국내산 토종다래(오텀센스 품종) 추출물 또는 이의 분획물에 항당뇨 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 다래 추출물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다래 추출물에 추가적으로 유기용매를 가하여 제조한 분획물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다래 추출물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다래 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 n-부탄올로 추출한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 다래 추출물에 추가적으로 유기용매를 가하여 제조한 분획물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 다래 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로 분획하여 수득한 헥산 분획물, 클로로포름 분획물 또는 에틸 아세테이트 분획물 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름 분획물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 알파-글루코시다제 저해 또는 억제활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증 또는 당뇨성 혈관합병증일 수 있다.

나아가 본 발명은 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.

본 발명에 따른 다래 추출물 또는 이의 분획물은 알파-글루코시다제 억제 활성이 우수하고, 공복 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 복강 내 당부하 검사에도 유의미한 감소를 보여 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 다래 추출물은 천연물질로서 체내에 안정한 특징이 있어 기능성 건강식품의 소재로도 사용될 수 있다.

도 1은 처리 조건을 다양하게 한 다래 추출물 또는 분획물의 α-글루코시다아제 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명 다래 클로로포름 분획물의 α-글루코시다아제 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명 다래 클로로포름 분획물의 세포독성 및 지방 축적 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명 다래 클로로포름 분획물을 식이하는 기간 동안의 공복혈당을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명 다래 클로로포름 분획물 처리에 따른 복강내 당부하 검사(IPGTT) 결과이다.
도 6은 본 발명 다래 클로로포름 분획물 처리에 따른 지질 과산화 억제 효과를 확인하기 위하여 간조직에 존재하는 MDA level을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명 다래 클로로포름 분획물 처리를 한 마우스 간 조직 내의 SOD 농도를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명 다래 클로로포름 분획물 처리를 한 마우스 간 조직 중의 oxidized GSH/total GSH 비율을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 분획물에 대한 GC/MS 비교 분석 결과이다.

본 발명은 다래 추출물의 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료의 신규 용도에 관한 것으로서, 다래 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 ‘다래(Actinidia arguta)’는 우리나라 각처의 산에서 자라는 낙엽 덩굴나무로서, 생육환경은 산지의 숲이나 등산로 반그늘진 곳에서 자라는 식물이다.

다래는 보혈, 피로회복, 불면증, 건위, 담석증, 병후 회복, 기력증진 등에 효과가 있다고 알려져 있으나, 항당뇨 효과가 있다는 내용에 대해서는 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 상기와 같은 특징을 갖는 다래 추출물 또는 이의 분획물에 α-glucosidase 억제활성이 우수하고, 공복 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 복강 내 당부하 검사에도 유의미한 감소를 보임을 확인함으로써, 이를 통해 당뇨 또는 당뇨합병증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로서 약리학적 조성물과 같은 의약품은 물론이고, 건강기능식품 등으로 활용할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 다래 클로로포름 분획물의 알파-글루코시다제 억제 활성을 살펴본 결과, 다래 클로로포름 분획물(CFAA)의 농도가 증가할수록 α-glucosidase 억제 활성이 증가하는 것으로 나타났으며, 다래 클로로포름 분획물(CFAA) 10 μg/mL의 농도에서의 억제 활성은 80.71%로 양성대조군으로 사용된 아카르보스(acarbose) 250 μg/mL의 억제 활성 60.63% 보다 약 20% 높은 억제 활성을 나타내었다. α-glucosidase 억제 활성에 대한 다래 클로로포름 분획물(CFAA)의 IC₅₀ ₍the half maximal inhibitory concentration)은 6.12 μg/mL로 나타남을 알 수 있었다(도 2 참조).

이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 다래 추출물 또는 이의 분획물에 알파-글루코시다제 억제 활성이 우수하다는 사실을 실험적으로 입증하였다.

그러므로 다래 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 당뇨 또는 당뇨합병증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 다래 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 ‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 다래로부터 추출한 것이며, 예를들어, 다래의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.

상기 다래 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 물 또는 에탄올(주정)을 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 다래의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 다래 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 다래 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 일실시예에 따른 다래 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

먼저, 본 발명의 다래 추출물은 건조된 다래 분쇄하여 분말화한 후, 상기 분말에 에탄올을 첨가하여 3회 반복하여 환류냉각추출하고 여지로 감압 여과한 다음, 이러한 여과 추출물을 진공에서 증발시켜 건조된 파우더로 제조하는 과정을 거쳐 다래 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 다래 비극성용매 가용 추출물은 상기 다래 추출물 추출과정에서 얻은 수가용성 분획물에 비극성용매를 첨가하여 다시 수가용성 분획물 및 비극성용매 가용 분획물을 얻어, 이 중 비극성용매 가용 분획물을 건조하는 과정을 통하여 다래 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수,멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 다래 추출물은 조성물에 0.1 내지 1000ug/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 다래 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 당뇨합병증으로는, 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증 및 당뇨성 혈관합병 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 당뇨병 및 당뇨 합병증의 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈당 조절용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 혈당 조절을 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 '건강기능식품'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 다래 추출물 또는 이의 분획물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 다래 추출물 또는 이의 분획물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 알파-글루코시다제 활성을 억제할 수 있기 때문에 혈당 조절에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 다래 추출물 또는 이의 분획물을 투여하는 것을 포함하는 당뇨 및 당뇨 합병증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기서 사용된 용어 ‘포유동물’은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 '치료상 유효량'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 다래 추출물 또는 이의 분획물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 1㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

실험 준비

<1-1> 재료 준비

본 발명에서 사용된 토종다래 (Actinidia arguta) 품종은 전라남도 광양에서 구입하였으며, 20℃에서 냉장 보관하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약으로는 α-글루코시다아제(α-glucosidase; EC 3.2.1.20), 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO), 타크린(tacrine), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐-테트라졸리움브로마이드(MTT) 분석 키트, 이소부틸-1-메칠잔틴(IBMX), 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 글루코즈(glucose), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), 이소프로파놀(isopropanol)은 Sigma Chemical Co. (St, Louis, MO, USA)제품을 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 LONZA (Walkersville, MD, USA)에서 구입하였으며, 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

<1-2> 통계처리

모든 실험은 반복실험을 실시하여 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 실험군 간 차이의 통계적 유의성 검증은 SAS® version 9.1(SAS institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 실시하고, Duncan’s multiple range test로 각 시료간의 유의차를 5% 수준에서 검증하였다.

<실시예 2>

토종다래 추출물 제조방법

2형 당뇨에 대한 토종다래의 최적 추출 조건을 확립하기 위하여 토종 다래 (20 g)을 분쇄한 후, 다양한 농도의 에탄올(0, 20, 40, 60, 및 80%) 100 mL에 첨가하여 40℃에서 2시간 동안 환류냉각기로 추출을 진행하였다. 이 추출물은 Whatman No. 2 filter paper (Whatman International Limited, Kent, UK)를 이용해서 여과를 한 후 진공 농축기 (N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan)로 농축 과정을 거친 뒤, 동결건조기 (Operon, Gimpo, Korea)를 이용하여 동결건조 하였다.

동결건조물은 in vitro test (α-glucosidase inhibitory activity) 상에서 40% 에탄올 추출물이 유의적으로 가장 높은 억제활성을 나타내었고, 이는 극성에 따른 물질의 분리를 실시하였다. 40% 에탄올 동결건조물을 증류수 (300 mL)에 재 용해하였고, 세 가지 용매 (n-hexane, chloroform, 및 ethyl acetate)를 이용하여 분별 깔때기에서 연속 분리하였다. 분리된 각각의 용매는 농축 및 동결건조를 실시하였고, 본 실험에 사용될 때까지 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 3>

세포배양

본 발명의 실험에 사용된 3T3-L1 지방선구세포(ATCC CL-173, American Type Culure Collection, Manassas, USA)는 10% 우아혈청(bovine calf serum)이 함유된 DMEM 을 이용하였으며, 분화 유도 및 성숙 배지로는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 함유된 DMEM을 이용하였고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

<실시예 4>

실험동물 및 식이

본 발명의 실험에 사용된 동물은 4주령의 C57BL/6 (male) 마우스를 실험동물 공급업체 (Samtako Bio Korea, Korea)로부터 공급받았으며 7일 동안 환경적응 기간을 거치게 하였고, 2마리씩 한 개의 사육케이스에 넣고 항온 (22±2℃), 항습 (55%)로 유지하며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 실험실 환경에서 사육하였다(동물실험인가번호: GNU-160531-M0026).

마우스는 일반식이 그룹 (normal control, NC)과 고지방식이 (high-fat diet, HFD) 그룹, 토종다래 클로로포름 분획물 (chloroform fraction of Actinidia arguta, CFAA) 20 및 40 mg/kg of body weight으로 임의로 구분하였고, 일반식이 그룹을 제외한 나머지 그룹의 마우스의 공복혈당이 200 mg/dL가 넘는 시점부터 추출물을 경구투여 하여 총 4주간 진행하였다.

<실시예 5>

토종다래 추출물 처리에 따른 α-glucosidase 억제 활성 확인

다래 추출물의 α-glucosidase 억제 활성은 Apostolidis and Lee (2010)의 방법을 약간 변형한 방법으로 측정하였다. 추출물 50 μL와 α-glucosidase solution (0.5 U/mL) in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.9) 50 μL 및 0.1 M phosphate buffer (pH 6.9) 50 μL를 96 웰 플레이트(well plate)에 첨가하여 혼합한 후, 10분 동안 25℃에서 방치하였다.

그 후, 5 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.9) 50 μL를 추가로 첨가하고 5분 동안 25℃에서 방치하였다. 최종 흡광도는 마이크로플레이트리더(model 680, Bio-rad, Tokyo, Japan)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다. 양성대조군(Positive control)으로는 아카르보스(acarbose)를 사용하였다.

다양한 농도로 처리한 에탄올 함유 용매(0, 20, 40, 60, 및 80%)를 이용한 토종다래 추출물의 α-글루코시다아제(glucosidase) 억제 활성을 측정한 결과는 하기 도 1(A)와 같다. 이들 추출물은 250 μg/mL에서 40 및 60% 에탄올 추출물이 각각 99.39 및 99.42%로 유의적으로 동일한 억제활성을 나타내었고, 이들 추출물의 억제 활성 차이를 평가하기 위해 저 농도에서의 α-glucosidase 억제 활성을 측정한 결과는 Fig. 1(B)와 같다.

60% 에탄올 추출물의 억제 활성은 25, 50, 및 125 μg/mL의 농도에서 각각 38.28, 78.14, 및 98.97%로 나타났으며, 40% 에탄올 추출물의 억제 활성은 43.27, 82.83, 및 99.75%로 60% 에탄올 추출물과 비교하여 유의적으로 높은 활성을 나타내었다.

이를 토대로 하여 다양한 에탄올 함유 용매 (0, 20, 40, 60, 및 80%) 추출물중에서 상대적으로 가장 우수한 활성을 나타낸 40% 에탄올 추출물은 n-헥산, 클로로포름, 에탈 아세테이트 및 증류수(distilled water)를 이용하여 극성에 따른 분리 분획이 진행되었고, 그 결과는 도 1(C) 와 같다.

각 분획물 10 μg/mL 농도에서 n-헥산, 클로로포름, 에탈 아세테이트 및 증류수(distilled water)의 α-glucosidase 억제 활성은 98.76, 96.28, 54.13, 및 77.68%로 나타났으며, n-헥산, 클로로포름, 에탈 아세테이트 및 증류수(distilled water) 분획물의 경우에는 당뇨병 치료제로 사용되고 있는 아카르보스(acarbose) 250 μg/mL (positive control) 농도에서 나타낸 62.76%보다 유의적으로 높은 억제 활성을 나타내었다.

상대적으로 가장 우수한 활성을 나타낸 n-헥산 및 클로로포름 분획물 중에서 비극성이 더 강한 n-헥산 분획물에는 유지류가 많이 추출되기 때문에, 본 실험은 클로로포름 분획물을 이용하여 진행하였다.

각 에탄올 (0, 20, 40, 60, 및 80%) 추출물의 수율은 각각 9.06, 9.10, 9.20, 10.57, 및 10.22%로 나타났으며, 용매의 극성에 따라 분리된 분획물 (n-hexane, chloroform, ethyl acetate, 및 distilled water)의 수율은 각각 0.16, 0.04, 0.13, 5.04%로 나타났다.

또한, 최적의 추출조건을 확립하는 과정에서 선별된 토종 다래 클로로포름 분획물 (CFAA)의 α-glucosidase 억제 활성을 측정한 결과는 도 2와 같다. CFAA의 농도가 증가할수록 α-glucosidase 억제 활성이 증가하는 것으로 나타났으며, CFAA 10 μg/mL의 농도에서의 억제 활성은 80.71%로 양성대조군으로 사용된 아카르보스(acarbose) 250 μg/mL의 억제 활성 60.63% 보다 약 20% 높은 억제 활성을 나타내었다. α-glucosidase 억제 활성에 대한 CFAA의 IC₅₀₍the half maximal inhibitory concentration)은 6.12 μg/mL로 나타났다.

<실시예 6>

토종다래 클로로포름 분획물 처리에 따른 지방 축적 억제 효과 확인

토종다래의 다양한 에탄올 분획물 중 본 발명에 가장 적합한 클로로포름 분획물을 사용하여 지방 축적 억제 정도를 확인하였으며, 실험방법은 하기와 같다.

지방선구세포(Preadipocyte)를 24-웰 플레이트(well plate)에 1×10⁵ cell/500 μL의 농도로 분주(seeding)한 뒤, 세포가 융합성 단계(confluent stage)에 도달하면 MDI (0.5 mM IBMX, 5 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone)를 첨가한 10% FBS DMEM을 사용하여 이틀간 분화유도 하였으며 이때 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)의 지방축적 및 분화억제력을 확인하기 위해 시료를 20~200 μg/mL의 농도로 배지에 첨가하였다. 분화 유도 후 6일 동안 인슐린만 첨가한 배지를 이용함으로써 지방세포를 성숙시켰다.

지방선구세포(Preadipocyte)의 분화 및 성숙 8일 후에 배지를 제거한 뒤 PBS를 이용하여 수차례 세척한 뒤 10% 포르말린(formalin) 용액을 이용하여 세포를 고정하고 세포내 생성된 지방방울(lipid droplet)과 특이적으로 반응하는 0.3% Oil Red O 용액을 이용하여 염색하였다. 염색된 세포는 현미경 관찰 후 이소프로판올(isopropanol)을 이용하여 용해한 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 대조군의 흡광도값에 대한 백분율로 나타내었다.

상기와 같이 3T3-L1에 대한 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)의 세포독성을 측정 결과, 모든 농도 (20, 50, 100, 및 200 μg/mL)에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(도 3A 참조).

따라서, 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)의 지방 축적 억제 효과를 평가하기 위한 처리 농도는 20, 50, 100, 및 200 μg/mL로 결정하였다.

또한, 3T3-L1 지방세포(adipocyte) 내 중성지방 생성은 Oil Red O staining에 의해 지방선구세포(preadipocyte)가 호르몬 유도에 의해 분화 및 성숙되면서 생성되는 지방을 염색한 뒤 흡광도를 측정함으로써 3T3-L1 지방세포(adipocyte)의 효과를 확인한 결과, 중성지방 생성에 대한 억제 효과는 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)을 20, 50, 100, 및 200 μg/mL 처리하였을 때 대조군과 유의적인 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(도 3B 참조).

<실시예 7>

토종다래 클로로포름 분획물 처리에 따른 몸무게, 칼로리 섭취량, 공복혈당 및 복강 내 당부하 정도 확인

High-fat diet로 유도된 제 2형 당뇨쥐에 대한 생화학적 연구를 진행하기 위하여 마우스들을 12시간 동안 공복 시킨 후, CO₂ 흡입법으로 희생시켰다. 혈액은 후대 정맥을 통해 채취하여 헤파린 튜브(heparin tube)에 저장하였다. 그런 다음, 혈액을 10분 동안 원심분리 (10,000 × g, 4℃) 한 후, 그 상등액을 본 연구에 사용하였다.

마우스의 간은 bullet blender (Nextadvance Inc., Averill Park, NY, USA)를 이용하여 각 장기의 10배에 해당하는 PBS 및 20배에 해당하는 5% 메타인산(metaphosphoric acid)을 첨가하여 균질화 시켰다. 각 단백질 농도는 브래드포드 단백질 분석(Bradford protein assay)을 이용하여 측정하였다.

또한, 공복혈당은 12시간 동안 공복 시킨 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 혈당 측정기 (ACCU-CHEK, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 측정하였고, 복강내 당부하검사 (intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)는 4시간 동안 공복 시킨 마우스에 글루코오즈(glucose)를 2 g/kg of body weight 농도로 복강 내 투여한 후, 0, 15, 30, 60, 90, 및 120 분마다 혈당측정기를 사용하여 측정하였다.

본 실험기간 동안 대조군(NC), 고지방식 처리군(HFD), 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA) 20, 및 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA) 40 groups의 체중은 각각 12.15, 29.50, 26.62, 및 26.37 g씩 증가된 것으로 확인되었으며, NC, HFD, CFAA 20, 및 CFAA 40 groups의 칼로리 섭취량은 각각 12.31, 15.02, 14.40, 및 13.30 kcal/day로 나타났다(표 1 참조).

토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)을 식이하는 기간 동안 공복혈당을 측정한 결과는 도 4와 같다.

토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)을 식이 하기 전의 HFD, CFAA 20, 및 CFAA 40 groups의 공복혈당은 210, 215, 및 216 mg/dL로 NC group (132.85 mg/dL)과 비교하여 상당하게 증가되어 있는 것으로 나타났다. 이후 4주간 식이가 종료된 시점에서의 HFD group의 공복혈당은 229 mg/dL로 NC group (135 mg/dL)보다 상당히 증가된 상태이며, CFAA 20 및 CFAA 40 groups은 각각 181 및 170 mg/dL로 HFD group과 비교하여 유의적으로 혈당이 감소된 것으로 나타났다.

또한, 복강내 당부하 검사는 0, 15, 30, 60, 90, 및 120 분마다 측정하였다. 글루코오즈(glucose)를 복강내 주입(injection)하기 전(0 분) HFD group의 공복혈당은 214 mg/dL로 NC group (130 mg/dL), CFAA 20 (184 mg/dL), 및 CFAA 40 (179 mg/dL)와 유의적인 차이를 나타냈다(도 5 참조).

NC group의 경우 15분에서 가장 높은 혈당수치를 나타냈지만, HFD group, CFAA, 20 및 CFAA 40 groups은 30분에서 가장 높은 혈당수치를 나타냈다. 최종적으로 120분에서 혈당 수치를 비교하였을 때, NC group은 132 mg/dL, HDF group은 270 mg/dL, CFAA 20 및 CFAA 40은 각각 218 및 191 mg/dL으로 나타났다.

<실시예 8>

토종다래 클로로포름 분획물 처리에 따른 혈청 분석

혈청분석은 glutamic oxalacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvate transaminase (GPT), creatine (CRE), blood urea nitrogen (BUN), tiglyceride (TG), 및 high density lipoprotein cholesterol (HDL)은 생화학 분석기(clinical chemistry analyzer; Fuji dri-chem 4000; Fujifilm Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였으며, Low density lipoprotein cholesterol (LDLC) 은 아래의 공식을 이용하여 계산하였다.

공식: LDLC (mg/dl) = total cholesterol - (HDLC + TG/5)

마우스의 혈청에 존재하는 생화학적 지표는 표 2에 나타내었다.

GOT와 GPT level은 일반적으로 간 손상지표로서 평가된다. CFAA 20 및 CFAA 40 groups에서의 GOT (113.20 U/L 및 79.60 U/L) 및 GPT (168.50 U/L 및 135.00 U/L)의 level은 모두 HFD group과 비교하여 상당하게 감소된 것으로 나타났다.

BUN과 CRE level은 일반적으로 신장의 기능장애를 평가하기 위하여 사용된다. 모든 groups에서 BUN과 CRE level의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 세포독성 평가에 사용되는 LDH level에서는 CFAA 20 및 CFAA 40 groups에서 각각 522.75 및 371.50 mg/dL로 HFD group (778.00 mg/dL)과 비교하여 상당히 감소되었다.

TCHO, TG, LDL, 및 HTR를 측정하여 혈중지질상태를 평가한 결과는 표 3에 나타내었다.

HTR은 모든 groups간에 유의적인 차이가 나타나지 않았다. HFD group (TCHO, 291.75 mg/dL; TG, 154.00 mg/dL; LDLC, 43.70 mg/dL)은 NC group (TCHO, 139.00 mg/dL; TG, 139.25 mg/dL; LDLC, 31.20 mg/dL)과 비교하여 상당하게 증가되었다. 이에 반해, CFAA 20 및 CFAA 40 groups에서는 TCHO (233.00 및 194.40 mg/dL), TG (144.00 및 132.00 mg/dL), 및 LDLC (31.00 및 26.15 mg/dL)로 나타났으며 HFD group과 비교하여 유의적으로 감소된 것으로 나타났다.

<실시예 9>

마우스 간 조직 내의 MDA 농도 확인

본 발명자들은 토종다래 클로로포름 분획물(CFAA)의 지질 과산화 억제 효과를 확인하기 위하여 간조직에 존재하는 MDA level을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

인산완충식염수(Phosphate buffered saline)를 이용하여 추출한 마우스 간 조직 균질액 160 μL에 1% 인산(phosphoric acid) 960 μL을 혼합한 후 0.67% 티오 바비투르산(thiobabituric acid) 320 μL을 넣고 95℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 5,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고, 532 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하였다. MDA 함량은 mg protein/μmole의 농도로 표시하였다.

그 결과, HFD group의 MDA level은 3.91 nmole/mg of protein로 NC group (0.56 nmole/mg of protein)과 비교하여 현저하게 증가된 것으로 나타났다. CFAA 20은 HFD group과 비교하여 MDA level이 유의적인 차이가 나타나지 않았지만, CFAA 40에서는 2.09 nmole/mg of protein으로서 지질과산화가 감소된 것으로 나타났다(도 6 참조).

<실시예 10>

마우스 간 조직 내의 SOD 농도 확인

마우스 간 조직 내의 SOD 농도를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.

적출한 마우스의 간을 10 볼륨의 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 넣고 Glass-Col homogenizer로 균질화한 후 12,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상등액을 버리고 펠렛(pellet)을 취하였다. 1X 세포 추출 버퍼(10× SOD Buffer 1 mL, 20% triton X-100 0.2 mL, 증류수 8.8 mL, 200 mM pMSF 10 μl)을 넣고 30분간 5분단위로 볼텍스(vortex) 후 1,000 rpm 에서 10분간 원심분리 한 후 상등액을 실험에 이용하였다.

모든 공정은 4℃를 유지하였으며 추출한 상등액의 단백질함량을 측정하기 위하여 Quant-iT™ protein assay kit를 이용하였다. SOD 활성을 측정하기 위하여 SOD determination kit (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하였으며 측정된 흡광도 값을 계산하여 SOD (U/mL)로 나타내었다.

그 결과, 마우스 간 조직에서는 HFD group이 0.83 U/mg of protein으로 NC group (1.24 U/mg of protein)보다 낮은 SOD level을 나타냈지만, CFAA 40에서는 NC group과 유의적으로 동일한 SOD level을 가지는 것으로 나타났다(도 7 참조).

<실시예 11>

마우스 간 조직 중의 oxidized GSH/total GSH 비율

마우스 간 조직 중의 oxidized GSH/total GSH 비율을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.

먼저, 적출한 마우스 간에 10 volume의 cold 5% 메타인산(metaphosphoric acid)을 넣고 균질화한 후 15분간 원심분리 (14,000 × g)하여 상등액을 실험에 사용하였으며 2 M 4-vinylpyridine 10 μL를 더하여 산화글루타티온(oxidized glutathione) 측정에 사용하였다.

모든 공정은 4℃를 유지하였으며 추출한 상등액의 단백질함량을 측정하기 위하여 Quant-iT™ protein assay kit을 이용하였다. 글루타티온(Glutathione)의 함량을 측정하기 위하여 glutathione assay kit (Cayman Chemical Co.)를 이용하여 측정하였으며, 측정된 총 글루타티온(total glutathione)과 산화된 glutathione(oxidized glutathione의 흡광도 값을 글루타티온 스탠다드 커브(glutathione standard curve)에 대입하여 oxidized GSH/total GSH (%)로 나타내었다.

그 결과, HFD group은 70.33%로서 NC group (44.88%)과 비교하여 oxidized GSH이 증가된 것으로 나타났으며, 이에 반해 CFAA 20 및 CFAA 40은 각각 50.80 및 45.16%로 HFD group과 비교하여 oxidized GSH/total GSH 비율이 감소되는 것으로 나타났다(도 8 참조).

따라서, 상기의 결과로 미루어 보아 본 발명의 토종다래(오텀센스 품종) 추출물, 특히 토종다래 클로로포름 분획물은 α-glucosidase 억제활성이 우수하고, 공복 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 복강 내 당부하 검사에도 유의미한 감소를 보여 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

< 실시예 12>

토종다래 분획물의 비교분석

<12-1> 실험방법

상기 실시예를 통하여 수득한 모든 분획물 시료들에 대하여 GC-MS-TQ 8030 triple quadrupole mass spectrometer(Shimadzu, Kyoto, Japan), GC/MS-QP 2010 Plus(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 성분 분석을 실시하였다. Column은 DB-5MS(5% Phenyl Methyl Siloxane, 30 m × 0.25 mm, thickness 0.25 μm)을 사용하였으며, GC/MS 분석 조건은 아래 표 4와 같다.

Condition
Mass range	45-800 m/z
Split ratio	100:1
Inlet Temp	280℃
Flow rate	1.0 mL/min
Temperature program	Initial temperature of 70℃, for 2min, then from 70 to 320℃ at a rate of 10℃/min, and held for 5 min (total analysis time : 32 min)

본 발명의 국내산 토종 다래 40% EtOH 추출물과 각 분획물의 9-Octadecenamide (Oleamide) 함량을 상대적으로 비교분석하기 위해 internal standard을 이용하였다. 수득한 모든 시료들을 Internal standard(Dicyclohexyl phthalate)를 용해한 메탄올에 녹인 뒤 이를 speed vac(Micro-Cenvac, N-BIOTEK, Korea)을 이용하여 건조하였다. Methoxyamine hydrochloride을 넣고 37℃에서 90분 동안 반응시킨 후, BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide)와 10% TMCS(trimethylchlorosilane)가 혼합된 TMS 유도체시약을 넣고 70℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이를 12000 rpm, 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 이용하였다.

<12-2> 실험 결과

클로로포름(Chloroform) 분획물에서 main peak로 분석되어진 9-Octadecenamide (Oleamide)를 각 분획물 별로 GC/MS 비교 분석한 결과는 아래 표 5 및 도 9와 같다. 검출시간은 25.84 분으로 각 분획물에 함유된 9-Octadecenamide의 함량을 internal standard로 비교하였을 때, chloroform 분획물이 n-hexane, distilled water 분획물 대비 더 많은 함량을 보였으며, 40% EtOH 추출물과 ethyl acetate 분획물에서는 검출되지 않았다.

GC/MS 분석 상대 정량 결과

추출물, 분획물 종류	area
40% EtOH 추출물	Not detected
n-hexane 분획물	14.2871
Chloroform 분획물	17.0030
Ethyl acetate 분획물	Not detected
Distilled water 분획물	13.9861

9-Octadecenamide(Oleamide)는 포도당 흡수를 증가시키고, 지방산 합성과 산화와 관련된 유전자를 조절하여 당뇨병과 비만 치료의 후보 물질로서 개발 가능성이 있는 것으로 보고되고 있다[노국환, Effects of oleic acid derivatives on glucose uptake and genes of fatty acid metabolism (Oleic acid와 그 유도체인 Oleamide의 C2C12 세포에서 포도당 흡수와 지방산 대사 조절 유전자 발현에 미치는 영향 조사). 경희대학교 대학원 학위논문 (2010)]. 또한 9-Octadecenamide(Oleamide)는 혈청 triglyceride(TG), total cholesterol(TC), low density lipoprotein cholesterol(LDLC) 및 간 TG를 감소시켜 강력한 지질 저하제로도 알려져 있다[MING-CHING CHENG, et al. Chemical Synthesis of 9(Z)-Octadecenamide and Its Hypolipidemic Effect: A Bioactive Agent Found in the Essential Oil of Mountain Celery Seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 1502-1508 (2010)].

이러한 이전의 연구 결과를 고려할 때, 9-Octadecenamide (Oleamide)가 당뇨개선 효과를 나타내는 주요 성분으로 판단되며, 상기와 같이 본 실시예에서 수행한 토종 다래 chloroform 분획물은 9-Octadecenamide (Oleamide) 함량이 높은 것으로 확인된바 이 분획물에 의한 당뇨 개선효과가 상대적으로 높은 것으로 볼 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

다래 추출물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 다래 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 n-부탄올로 추출한 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
다래 추출물에 추가적으로 유기용매를 가하여 제조한 분획물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 분획물은 다래 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로 분획하여 수득한 헥산 분획물, 클로로포름 분획물 또는 에틸 아세테이트 분획물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 분획물은 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 분획물은 알파-글루코시다제 저해 또는 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증 또는 당뇨성 혈관합병증인 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품.
제8항에 있어서,
상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증 또는 당뇨성 혈관합병증인 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품.