KR20180019963A - 주름 개선 및 미백 효과를 가지는 펩타이드, 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 주름 개선용 펩타이드에 관한 것으로, 특정 서열로 구성된 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

주름 개선 및 미백 효과를 가지는 펩타이드, 및 이의 용도{PEPTIDE FOR IMPROVING SKIN WRINKLE AND WHITENING EFFECT, AND USES THEREOF}

본 발명은 주름 개선 효과가 우수한 신규 펩타이드에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도 및 습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다.

피부는 인체의 다른 장기와 마찬가지로 나이가 들어감에 따라 노화가 진행되고, 피부 탄력손실, 각질화, 주름 생성, 피부 위축 등의 변화가 수반된다.

피부 노화 현상의 원인은 크게 두 가지로 세포의 유전자 변이, 조직 변화 등 내적 요인과 자외선, 습도 등 외적 요인으로 분류될 수 있다.

특히 자외선에 의한 노화 현상을 광노화라고 한다. 자외선에 의해 세포 내부에 활성 산소 라디칼이 생성되고, 활성 산소는 염증성 반응을 일으키는 신호전달 체계를 통하여 진피층의 탄력 섬유인 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질 분해 효소(MMP-1, MMP-3, MMP-9, etc.)의 합성을 촉진하며(Fisher G.J. etal., Nature, Vol. 379, 335~339), 진피층의 탄력을 감소시킴으로써 피부 주름이 유발한다.

피부 노화 현상을 방지하고, 탄력있는 피부를 유지하고자 주름 개선 효과가 있는 생리활성물질에 대한 연구가 이루어지고 있다.

노화된 피부 개선용 치료제로 트레티노인(trans-retinoic acid)이 미국 FDA 허가를 받았으며, 부작용이 적은 레티놀이 1990년대 중, 후반부터 화장품 원료에 사용되기 시작하면서 본격적으로 주름 개선 화장품이 출시되기 시작하였다. 이후 여성 호르몬 유사 물질, 각종 식물에서 추출한 항산화제 등이 주름 개선 원료로서 화장품에 도입되었다.

그러나, 최근까지 개발된 화장품 원료들은 효능이 미흡하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다. 또한 효능이 우수한 경우라도 현재의 화장품 원료들은 피부에 작용하는 범위가 제한적이고, 대부분 콜라겐 합성 촉진, 콜라겐 분해 억제, 활성산소 제거와 같이 피부에 미치는 효능이 유사하여 근본적인 주름 개선을 원하는 고객들의 요구를 충분히 만족시킬 수 없었다.

따라서, 최신 피부 과학 이론에 기반하여 새로운 피부 노화 메커니즘을 규명하고 이를 차단하거나 지연시킬 수 있는 원료와 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 생체안정성 및 항노화 활성이 우수한 신규의 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 피부 상태 개선용 펩타이드가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 섬유아세포의 성장을 촉진하고, 피부 조직의 콜라겐 생합성을 유도할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라닌의 생성 및 티로시나아제의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 항산화, 피부 미백, 피부보습 개선, 또는 피부재생용일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 상기 펩타이드는 크기가 작으므로 피부 침투율이 우수하고 주름 개선 효과가 뛰어나 기존의 항주름제를 대체할 수 있다.

상기 펩타이드는 주름 개선 및 항노화를 위한 의학적 용도뿐만 아니라, 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 등 피부 미용 목적의 제품에 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 피부 상태 개선용 펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드(peptide)는 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 하나 이상의 아미노산으로 구성된 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 펩타이드는 주름 개선, 피부 탄력 개선 효과를 나타내는 펩타이드 또는 이의 단편을 의미할 수 있다.

상기 펩타이드를 명명하는 일반적인 규칙은 구체적으로 지시된 예외사항이 없는 경우 3문자 또는1문자 아미노산 코드를 기초로 할 수 있다. 예컨대, 아미노산 구조의 중심부를 3문자 코드(예컨대, Ala, Lys)로 표시하며, 3문자 코드의 앞에 "D-"를 적음으로써 D-입체형태(예컨대, D-Ala, D-Lys)를 구체적으로 지시하지 않은 경우라면L-입체형태로 가정할 수 있다. 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연아미노산 잔기일 수 있다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 가지는 펩타이드를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 상기 펩타이드의 우수한 피부 개선 효과, 특히 피부 주름 개선 효과를 규명하였다.

상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 상기 아미노산 서열을 일부로서 포함할 수도 있다.

피부 속 각질형성세포와 섬유아세포는 정신적 스트레스, 외부의 유해 요인, 내인성 노화 등 다양한 원인에 의해 손상을 받아 퇴화하고 밀도가 감소할 수 있다. 특히, 내외적 스트레스에 의한 각질형성세포 및 섬유아세포의 손상은 피부세포의 밀도를 저하시키고 콜라겐(collagen)의 합성을 방해하므로 피부 주름의 형성을 심화시킬 수 있다.

상기 콜라겐은 결합 조직의 주성분이며 뼈와 피부에 주로 분포하는 성분으로, 피부의 구조와 형태를 유지하고 단단한 강도와 탄력을 제공하는 경단백질이다. 피부가 노화되거나 자외선, 열 등에 노출이 되면 콜라겐 합성능력이 저하되고 콜라겐 양이 현저히 감소할 수 있다. 상기 콜라겐 양이 감소하면 근육의 형태를 유지하지 못하므로 피부 주름(wrinkle)이 생성될 수 있다.

상기 펩타이드는 인체 내 성장인자를 구성하는 펩타이드에서 유래한 것으로 작은 분자량과 크기로 인해 피부 투과율이 높고, 그로 인한 피부 생장 촉진 효과가 우수하다. 상기 펩타이드는 섬유아세포의 증식 및 콜라겐 합성을 촉진하므로, 피부의 각질층, 상피층, 진피층을 성장시키므로 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 피부 재생 등의 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드가 국소적으로 피부에 적용될 때 피부상태가 효과적으로 개선될 수 있다.

한편, 상기 펩타이드는 생체 내의 단백질을 추출한 후 단백질 분해효소로 처리하여 저분자량화하거나, 유전자 재조합 및 단백질 발현시스템을 이용하여 생물학적으로 제조할 수 있고, 또는 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학 합성 방법으로 제조할 수 있다.

예컨대, 유전자 조작을 통하여 융합파트너 및 상기 펩타이드로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하고, 상기 유전자로 숙주 미생물을 형질 전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킬 수 있다.

상기 융합 단백질은 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 절단 및 분리할 수 있고, 상기 펩타이드가 수득될 수 있다. 구체적으로, Factor Xa 또는 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 상기 융합파트너 및 상기 펩타이드의 유전자 사이에 삽입할 수 있다.

상기 펩타이드의 N 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)가 결합될 수 있다. 상기 펩타이드는 상기 변형에 의해 안정성이 현저히 개선될 수 있다. 상기 안정성은 in vivo 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성도 포함하는 개념이다. 상기 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호할 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 40% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 상기 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.

상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 상기 펩타이드의 구조적, 기능적 상동성으로 인한 항염 활성 등 피부 상태 개선 활성을 의미한다. 상기 서열 상동성은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 대비하여 결정되며, 비교 영역에서의 일부 핵산 서열이 추가 또는 삭제될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.

상기 조성물은 주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 항산화, 피부 미백, 피부보습 개선, 또는 피부재생용일 수 있다. 상기 피부 상태 개선 효과는 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부 보호, 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등 피부에 유익한 효과를 모두 포괄할 수 있다.

상기 "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하며 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다.

상기 "주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화되는 현상을 의미한다.

상기 "피부 탄력"은 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 구현되는 탄성을 의미하며, 상기 탄력섬유는 고무와 같이 낮은 탄성계수를 가지고 있으므로 외력에 의해 쉽게 변형되고, 외력이 제거되었을 때는 쉽게 원상태로 복원될 수 있다.

상기 탄력섬유는 엘라스틴이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있으며, 상기 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine) 및 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 톡특한 아미노산으로 구성된 단백질이다. 상기 데스모신 및 아이소데스모신은 긴 펩타이드사슬안에서 가교(cross-links)를 형성하며, 상기 구조가 엘라스틴에 고무 유사 성질을 부여할 수 있다.

상기 "피부 탄력 개선"은 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐과 함께 존재하며, 상기 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지 또는 향상되는 현상을 의미한다.

상기 "피부 미백"은 피부색에 영향을 미치는 멜라닌, 산화-환원 헤모글로빈, 카로틴, 멜라노이드 등 다양한 생체 분자의 생성을 억제함으로써 잡티, 주근깨, 기미 등의 피부 색소 침착 현상을 완화시키고, 피부 누런기, 붉은기를 완화시켜 피부 밝기 및 균일도를 향상시키는 효과를 의미한다.

상기 “유효 성분으로 포함하는”은 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 주름 개선효능과 관련된 콜라겐 합성, 탄력 개선 또는 항산화 활성 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

상기 펩타이드는 상기 피부 상태 개선 활성으로 인해 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 등 다양한 용도로 활용될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항노화 또는 주름 개선의 용도일 수 있다.

상기 조성물은 피부 생장 촉진 효과가 우수한 펩타이드를 함유하므로 콜라겐의 생성을 촉진하고 피부의 노화에 의해 발생하는 콜라겐의 감소 현상을 완화시킴으로써 항노화 효과를 제공할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산 일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 펩타이드는 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 화합물이 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 상기 펩타이드와 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.　

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

한편, 상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제는 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제는 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제는 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제는 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 : 펩타이드의 제조

9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하는 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 이용하여 펩타이드를 합성하였다. N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N,N-디아이소프로필카보 디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다[참고문헌 : Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc-solid phase peptide synthesis', Oxford].

합성된 펩타이드를 C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters Associates, USA)를 이용하여 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 μm, Waters Co, USA)을 이용하였다.

상기 방법에 따라 합성된 펩타이드는 하기 표 1과 같다

구분	서열	비고
실시예	YCAEKWHSLCN	서열번호 1

실험예 1 : 인간진피섬유아세포의 생장 촉진 효과 시험

피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포 생장이 펩타이드에 의해 촉진되는지 확인하였다.

인간진피섬유아세포(normal Human Dermal Fibroblasts, nHDF)는 Lonza (Switzerland)에서 구득하였다.

세포배양액은 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco), 10% penicillin(100 unit/mL)과 streptomycin(100 g/mL)를 첨가하여 사용하였다. 배양조건은 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 3 내지 10세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다.

인간 진피섬유아세포인 nHDF 세포에 펩타이드를 처리하였을 때, 세포독성이 어느 정도 발생되는지 확인하기 위하여 펩타이드를 1, 10, 50 mg/L 농도로 처리 후에 24시간 동안 세포를 배양하였고, 세포의 MTT을 이용하여 viability를 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 2와 같다.

구분		24시간 경과	48시간 경과	72시간 경과
실시예	1 mg/L	101.2	104.8	107.1
	10 mg/L	102.8	111.5	120.6
	50 mg/L	105.2	126.1	139.2

[nHDF cell viability(% of control)]

상기 실시예의 펩타이드 처리에 따라, 펩타이드 농도에 의존적으로 세포 성장이 촉진되었다. 특히, 약 24시간 경과 후에는 세포 생존율에 큰 차이가 없었으나 시간이 점차 경과함에 따라 세포 생장은 현저하게 촉진되었다.

즉, 상기 결과는 상기 펩타이드가 피부 또는 인체에 대해 안정성이 우수할 뿐만 아니라 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 생장을 효과적으로 촉진하는 바 피부 미용, 특히 피부 주름 개선의 용도로서 활용 가능함을 시사한다.

실험예 2 : 콜라겐 생합성 유도 시험

섬유아세포의 생장에 따라 콜라겐의 합성이 촉진되는지 확인하였다.

1.0×10⁴세포/mL농도로 인간진피섬유아세포를 96 웰 플레이트에 100μL씩 분주하고, 37℃, 5% C0₂, 가습 조건하에서 3일간 배양하였다.

Medium 106S(쿠라시키보세키 가부시키가이샤 제조)에 LSGS(Low Serum Growth Supplement, 쿠라시키보세키 가부시키가이샤 제조)를 10 중량%로 함유한 배지를 웰 당 100μL씩 사용하였다.

상기 배지를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma社 제조)으로 교환하고, 상기 실시예의 펩타이드를 50 mg/L 농도로 처리한 후 배양하였다. 상기 펩타이드를 처리하지 않고 정제수를 첨가한 것을 대조군으로 사용하였다.

상기 세포를 7일간 배양한 후 배양액을 채취하고, 효소 결합 면역 측정법(Procollagen type I c-peptide EIA Kit; 타카라바이오 가부시키가이샤 제조)을 통해 배양액 중 분비된 타입 I 콜라겐 농도를 정량하였다.

대조군의 타입 I 콜라겐 양을 기준(100%)으로 하여 각 시험 샘플 배양액 중의 콜라겐 양을 산출하였으며, 측정 결과는 하기 표 3과 같다.

구분	콜라겐 생산량(%)
실시예	198.2

[% of control]

실험예 3 : COL1A1 및 MMP1의 발현 측정 시험

인간진피섬유아세포가 발현하는 대표적인 콜라겐(collagen) 중 하나인 COL1A1, 탄력단백질(elastin) 중 하나인 ELN 및 콜라겐 분해효소인 MMP1의 발현 변화를 측정하였다.

펩타이드에 의한 콜라겐의 발현 변화 정도를 확인하고자 인간 진피섬유아세포에 펩타이드를 50 mg/L 농도로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다.

유전자 발현 변화는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 증폭되는 DNA 산물에 형광물질을 결합하고 형광물질을 지속적으로 검출하는 qRT-PCR(quantitative real time PCR)로 측정하였다.

COL1A1 및 MMP1 유전자 발현의 변화를 정량하고자 SYBR green Ⅰ(Invitrogen)을 통해 PCR 산물이 발산하는 형광값을 측정하였다. PCR tube에 0.2μM 프라이머, 50 mM KCl, 20 mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8 mM dNTP, 0.5U Extaq DNA polymerase, 3 mM MgCl₂, 1×SYBR green을 혼합하여 반응액을 제조하였다.

Linegene K(BioER, China)를 이용하여 94℃에서 3분 동안 예비적 변성(primary denaturation) 시킨 후 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 중합(polymerization)을 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40 cycle을 수행하였고, 매 cycle 이 종료된 후 형광강도를 측정하였다.

PCR 결과는 각 결과별 melting curve로 검증하였다. 각 유전자의 threshold cycle(Ct)값을 β-actin의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다.

Ct값은 PCR 산물에 의해 발생하는 형광의 양(증폭된 PCR 산물의 수)이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달했을 때의 cycle 수로서 Ct값을 통하여 유전자 발현량을 확인할 수 있다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.

Gene	정방향 프라이머	역방향 프라이머
β-actin	5'-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3'	5'-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3'
COL1A1	5'-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3'	5'-AGATCACGTCATCGCACAACA-3'
MMP1	5'-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3'	5'-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3'

상기 펩타이드의 처리에 따른 발현량 측정 결과는 하기 표 5와 같다. 즉, COL1A1 mRNA의 발현량은 농도 의존적으로 증가한 반면, MMP1 mRNA 발현량은 농도 의존적으로 감소하였다.

상기 결과는 상기 펩타이드가 콜라겐의 생성을 촉진하고 이를 통해 피부 탄력 및 주름을 개선할 수 있는 바 피부 미용의 용도로서 활용 가능함을 시사한다.

구분		COL1A1 발현량	MMP1 발현량
실시예	0 mg/L	1.00	1.00
	1 mg/L	1.21	0.96
	10 mg/L	1.89	0.77
	50 mg/L	2.77	0.35

[Fold, β-actin normalized]

실험예 4 : 멜라닌 생성량 시험(melanin contents assay)

melanin contents assay를 통해 상기 펩타이드에 의한 멜라닌형성(melanogenesis) 저해능을 평가하였다(Eisinger M et al, 1982; Siegrist W and Eberle AN, 1986).

60 mm culture dish에 B16F10 세포를 1.5x10⁵ cells/well의 농도로 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 멜라닌 형성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 상기 펩타이드를 농도별로 배지에 투입하였다(Virador VM et al, 1999).

48시간 경과 후, 세포를 수확하여 PBS로 1회 세척한 후, 1N NaOH lysis buffer 120 μL를 넣고 95℃에서 10분간 가열하여 세포를 용해하였다. microplate reader를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로 100μg/mL 농도의 알부틴(arbutin)을 사용하였다.

하기 수학식에 따라 멜라닌 생성 억제율을 산출하였으며, 평과 결과는 하기 표 6과 같다.

[수학식]

멜라닌 생성 억제율(%) = 100 x (1 - (각 시험물질의 흡광도 / 대조군의 흡광도))

구분		멜라닌 생성 억제율(%)
실시예 1	0 mg/L	0
	1 mg/L	23.9
	10 mg/L	37.9
	50 mg/L	48.2
양성대조군		32.8

상기 실시예의 펩타이드는 멜라닌의 생성을 효과적으로 억제하였으며, 미백 효과가 널리 알려진 알부틴과 비교하여 멜라닌 생성을 더욱 높은 수준으로 저해하였다.

실험예 5 : 활성산소 분해 효과

자유라디칼인 DPPH(1, 1-diphenyl -2-picryl hydrazyl)를 이용한 자유라디칼 소거활성 측정방법을 이용하여 활성산소 분해 효과를 확인하였다.

시험관에 4mL 메탄올을 넣고 상기 펩타이드를 농도별로 첨가하였다. 0.15mM DPPH 용액 1mL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

기질과 DPPH가 없는 Initial(Ai)과 blank(Ab)를 측정하였으며, 양성대조군으로 α-tocopherol 및 BHT를 사용하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

구분	0 mg/L	1 mg/L	10 mg/L	50 mg/L
실시예	0	48.2	69.6	88.4
α-tocopherol	0	45.0	63.9	79.6
BHT	0	38.3	53.4	66.9

[DPPH 소거율%]

상기 실시예의 펩타이드는 당업계에 널리 알려진 α-tocopherol 및 BHT보다 자유라디칼 소거활성이 높은 것으로 평가되었다. 상기 결과는 상기 펩타이드가 활성산소의 분해를 효과적으로 촉진할 수 있으며, 항산화 활성에 의한 피부 노화 방지 및 피부 상태 개선 효과가 우수함을 시사한다.

실험예 6 : 세포 내의 활성산소종 측정시험(DCF-DA assay)

펩타이드를 처리한 후 실리카(silica)로 자극한 세포 내에서 생성되는 활성산소종의 양을 음성대조군과 비교하여 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 제거능을 평가하였다(Cho et al., 1999; Kim et al., 2002).

Raw 264.7 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96 웰 플레이트에 접종하여 배양하였다. 배지를 새로운 배지로 교환한 후 일정농도의 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 세포를 배양하였다.

각 well에 WST-1용액(EZ-CYTOX, DOGEN, Korea)을 10.0 μL씩 넣고 1시간 동안 세포를 배양한 후 ELISA reader(Bio-Rad)로 measurement wavelength 450 nm, reference wavelength 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.

펩타이드는 최종농도 기준으로 최대 20μM이 되도록 dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)로 희석하였으며 DMSO를 공시험액(음성대조군)으로 사용하였다. 신뢰도를 확보하고자 실험을 3회 반복하였다.

상기 실험은 세포활성 측정시험인 WST-1 assay와 동일한 세포주 및 동일한 세포배양조건 하에서 실시되었다. 배양한 Raw 264.7 세포를 Phosphate Buffered Saline(PBS; sodium chloride 137 mM, phosphate buffer 10 mM, potassium chloride 2.7 mM, all from Biopure, Canada) 용액으로 1회 세척한 후 Raw 264.7 세포를 수확하였다. 15 mL PBS 용액으로 현탁하였으며 20 mM 2', 7'-Dichlorofluorescein diacetate 15 μL를 첨가하고 1시간 동안 배양하였다.

1200 rpm으로 2분간 원심분리한 후 PBS 용액으로 1회 세척하여 1×10⁵ cells/mL로 희석한 후, 대조물질 및 펩타이드를 처리하고 10분간 배양하였다. 20 mg/mL의 실리카를 50 μL 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 6000 rpm으로 5분간 원심분리하여 수득한 세포 펠릿(pellet)을 200 μL PBS 용액으로 분산시킨 후 96 웰 플레이트에 접종하였다.

fluorescence microplate reader를 이용하여 485 nm excitation / 535 nm emission에서 형광도를 측청하여 활성산소종 양을 평가하였다.

검액 농도에 대한 활성산소종 측정시험에 처리한 펩타이드는 세포활성 측정을 통해 설정한 검액 농도로 사용하였다.

음성대조군으로는 시료물질 대신 DMSO를 사용하였으며, 양성대조군으로는 아스코르빈산(Sigma-Aldrich)을 DMSO에 100 mg/mL로 희석하여 100 μg/mL의 농도로 사용하였다.

상기 결과를 기반으로 동일 농도에 대한 활성산소종 측정시험을 수행하였으며, 처리한 펩타이드는 펩타이드는 50 mg/L의 농도로 사용하였다. 신뢰도를 확보하고자 실험을 4회 반복하였다. 측정 결과는 하기 표 8과 같다.

구분	측정값
실시예	82.7
아스코르빈산	75.2

[ROS 생성억제율(% of control)]

상기 실시예의 펩타이드는 당업계에 널리 알려진 아스코르빈산 보다 자유라디칼 소거활성이 동등한 수준으로 평가되었다.

즉, 상기 결과는 상기 펩타이드가 활성산소종 제거능이 우수하며, 자유라디칼 소거활성으로 인한 항산화 효과가 뛰어남을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의해 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> AHN, INSOOK <120> PEPTIDE FOR IMPROVING SKIN WRINKLE AND WHITENING EFFECT, AND USES THEREOF <130> 16PP11165 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID:NO 1 <400> 1 Tyr Cys Ala Glu Lys Trp His Ser Leu Cys Asn 1 5 10

Claims (6)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 피부 상태 개선용 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   섬유아세포의 성장을 촉진하고, 피부 조직의 콜라겐 생합성을 유도하는 펩타이드.
3. 제1항에 있어서,
   멜라닌의 생성 및 티로시나아제의 활성을 억제하는 펩타이드.
4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 항산화, 피부 미백, 피부보습 개선, 또는 피부재생용인 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물.