KR20180016177A - 펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법 - Google Patents
펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180016177A KR20180016177A KR1020160100280A KR20160100280A KR20180016177A KR 20180016177 A KR20180016177 A KR 20180016177A KR 1020160100280 A KR1020160100280 A KR 1020160100280A KR 20160100280 A KR20160100280 A KR 20160100280A KR 20180016177 A KR20180016177 A KR 20180016177A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- peptide
- carbon nanotube
- rgd
- swnt
- ligand
- Prior art date
Links
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 title claims abstract description 183
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 182
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title abstract description 77
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 189
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 182
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 136
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 43
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims abstract description 33
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 33
- 239000002109 single walled nanotube Substances 0.000 claims description 146
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 32
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 20
- 102100024175 Centriole, cilia and spindle-associated protein Human genes 0.000 claims description 13
- 101000980796 Homo sapiens Centriole, cilia and spindle-associated protein Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 8
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 claims description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 claims description 2
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102100021118 Microtubule-associated protein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 91
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 45
- 102100033962 GTP-binding protein RAD Human genes 0.000 description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 20
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 19
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 16
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 16
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 16
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 13
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 9
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 8
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 7
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 7
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 7
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 7
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 7
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 7
- BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KLXQWABNAWDRAY-ACRUOGEOSA-N Phe-Lys-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KLXQWABNAWDRAY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 6
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 5
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- ZIYGTCDTJJCDDP-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZIYGTCDTJJCDDP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 4
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N tetrodotoxin Chemical compound O([C@@]([C@H]1O)(O)O[C@H]2[C@@]3(O)CO)[C@H]3[C@@H](O)[C@]11[C@H]2[C@@H](O)N=C(N)N1 CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N 0.000 description 4
- 229950010357 tetrodotoxin Drugs 0.000 description 4
- CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N tetrodotoxin Natural products C12C(O)NC(=N)NC2(C2O)C(O)C3C(CO)(O)C1OC2(O)O3 CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- OYQBFWWQSVIHBN-FHWLQOOXSA-N Phe-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O OYQBFWWQSVIHBN-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 3
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010089975 arginyl-glycyl-aspartyl-serine Proteins 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 108010034892 glycyl-arginyl-glycyl-aspartyl-serine Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- -1 1H-benzotriazole- -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate Chemical compound 0.000 description 2
- JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[[4-[2-[bis(4-methylphenyl)methylamino]-2-oxoethoxy]phenyl]-(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(=O)NC(C=2C=CC(C)=CC=2)C=2C=CC(C)=CC=2)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- ZJSZPXISKMDJKQ-JYJNAYRXSA-N Lys-Phe-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZJSZPXISKMDJKQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000001553 co-assembly Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000004736 wide-angle X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- BMJRTKDVFXYEFS-XIFFEERXSA-N (2s)-2,6-bis(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(=O)O)CCCCNC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 BMJRTKDVFXYEFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- RGNVSYKVCGAEHK-GUBZILKMSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RGNVSYKVCGAEHK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(CO)(CO)NCC(O)=O CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 101100491149 Caenorhabditis elegans lem-3 gene Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical class C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001066129 Homo sapiens Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005803 Oligodendrocyte Transcription Factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010019644 Oligodendrocyte Transcription Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 1
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 102000047486 human GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000012402 patch clamp technique Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002049 peptide nanotube Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000235 small-angle X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001587 telencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
- C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
- C01B32/15—Nano-sized carbon materials
- C01B32/182—Graphene
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
- C01B2202/00—Structure or properties of carbon nanotubes
- C01B2202/02—Single-walled nanotubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
- C01B2202/00—Structure or properties of carbon nanotubes
- C01B2202/20—Nanotubes characterized by their properties
- C01B2202/36—Diameter
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 광열 변환 감응적외선 감응형 자기조립 펩타이드-탄소나노튜브의 복합체로, 이는 탄소나노튜브의 표면에 리간드 펩타이드와 덴드리머 펩타이드를 결합시킴으로써, 적외선 조사에 따라 변화하는 새로운 형태의 구조를 제안하고 있다.
구체적으로 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 적외선 조사를 통해 원격으로 유체역학적 구조를 제어할 수 있어, 매우 효율적으로 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화를 조정할 수 있다는 장점을 갖는다.
구체적으로 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 적외선 조사를 통해 원격으로 유체역학적 구조를 제어할 수 있어, 매우 효율적으로 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화를 조정할 수 있다는 장점을 갖는다.
Description
본 발명은 펩타이드-탄소나노튜브 복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 적외선 조사를 통해 원격으로 유체역학적 구조를 제어할 수 있는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법에 관한 것이다.
단일 상호작용의 단점을 보완할 수 있는 새로운 방식으로 다가 상호작용(multivalenct interaction)이 발견되었다. 이러한 다가 상호작용은 약한 단일 상호작용의 단순한 합이 아닌 그 이상의 강한 결합 에너지를 보여주는 현상으로서, 주로 생물학 시스템 내에서 관찰되어져 왔다. 상기 다가 상호작용은 각각의 상호작용 대상들에 대해 단일 상호작용일 경우보다 보통은 매우 약한 작용을 보여주나, 생물학 시스템 내에서 인식, 흡착 및 신호전달 과정에서 결정적 역할을 담당하는 매우 중요한 결합 방식이다.
이들 원리는 관련 생물학적 시스템의 연구를 위해 특정 저해제의 디자인과 합성에 이용되어 왔고 의약품 연구에도 응용될 여지를 보여주고 있다. 이외에도 신물질이나 분야에서도 다가 상호작용의 연구가 이루어지고 있다. 이러한 다가 물질로는 고분자, 덴드리머 및 자기조립화된 물질들이 존재하는데, 이들은 대부분 수동형 구조체이라는 점에서 한계점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하기 위하여, 원격으로 구조 및 기능의 제어가 가능한 새로운 형태의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 개발하고자 노력한 바, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 적외선 감응형 자기조립 펩타이드를 탄소나노튜브 표면에 결합시켜 형성된 펩타이드-탄소나노튜브의 복합체를 제공하는 것이다.
또한 발명의 다른 목적은 펩타이드-탄소나노튜브의 복합체를 이용하여 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, (a) 덴드리머 펩타이드; 적어도 하나의 (b) 리간드 펩타이드; 및 (c) 탄소나노튜브를 포함하고, 상기 탄소나노튜브 표면에 상기 (a) 덴드리머 펩타이드와 (b) 리간드 펩타이드가 공동으로 조립(co-assemble)되고, 결합되어 형성된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 제공한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, Ⅰ) 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 배지에 첨가하는 단계; 및
Ⅱ) 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체가 첨가된 배지에 적외선을 조사하여, 상기 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화를 유도 및 촉진하는 단계;를 포함하는 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화 방법을 제공한다.
본 발명은 광열 변환 감응적외선 감응형 자기조립 펩타이드-탄소나노튜브의 복합체로, 이는 탄소나노튜브의 표면에 리간드 펩타이드와 덴드리머 펩타이드를 결합시킴으로써, 적외선 조사에 따라 변화하는 새로운 형태의 구조를 제안하고 있다.
구체적으로 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 적외선 조사를 통해 원격으로 유체역학적 구조를 제어할 수 있어, 매우 효율적으로 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화를 조정할 수 있다는 장점을 갖는다.
도 1은 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 구성하는 의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체의 작동원리를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 제조예 3 내지 7로부터 제조된 리간드 펩타이드와 형광 라벨링된 리간드 펩타이드의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 제조예 1, 2로부터 제조된 덴드리머 펩타이드의 MALDI-ROF MS 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 TEM 사진이다. 이때 스케일 바는 100 ㎛였다.
도 6은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 농도별 SDS-PAGE 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 CD 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 CD 스펙트럼이다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에 따라 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD/SWNT)의 FRET 측정 결과 그래프이다. 이때 청색은 실시예 3에 따라 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD/SWNT)의 발광(emission) 스펙트럼이고, 적색은 실시예 4에 따라 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RAD/SWNT)의 발광 스펙트럼이며, 보라색은 실시예 8로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD;RAD, 50%)/SWNT)의 발광 스펙트럼이다. l ex = 490 nm.
도 10은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT) 또는 실시예 4로부터 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RGD/SWNT)를 처리한 후, 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다. 이때, 적색은 실시예 4로부터 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RGD/SWNT)에서 형광단이 TAMRA이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 hfNSC 세포 표면에 존재하는 베타1 인테그린이다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
도 11은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 6 일 동안 배양한 다음 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다.
도 12는 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 6 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 각 유전자(tuj1, MAP2, GFAP, olig2)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 다양한 농도로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리하였을 때, 상기 세포에서의 Tuj1/GAPDH 발현량을 나타낸 그래프이다. Tuj1은 대표적인 뉴런 세포의 마커이다.
도 14는 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 다양한 농도로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리하였을 때, 상기 세포에서의 MAP2/GAPDH 발현량을 나타낸 그래프이다. MAP2는 대표적인 뉴런 세포의 마커이다.
도 15는 본 발명에 따른 두 개의 리간드 펩타이드 혼합비율을 달리하여 탄소나노튜브 상에 공동 조립을 통해 결합시켰을 때, 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 16은 도 15에서와 같이 두 개의 리간드 펩타이드의 혼합비율을 달리하여 탄소나노튜브 상에 공동 조립을 통해 결합시켜 제조된 실시예 1, 2 6-11의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)를 hfNSCs에 처리하여 측정된 tuj1/GAPDH의 발현량을 나타낸 그래프이다. n=3, *; p<0.05, **; p<0.01
도 17은 피브로넥틴(FN)-폴리-L-라이신(PLL)-코팅된 기판 상에서, hfNSCs에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 3 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 tuj1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 18은 피브로넥틴(FN)-폴리-L-라이신(PLL)-코팅된 기판 상에서, hfNSCs에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 3 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 MAP2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 19는 β-1 인테그린 항체의 첨가에 따라, hfNSCs에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 처리한 후, 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 Tuj1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 20은 β-1 인테그린 항체의 첨가에 따라, hfNSCs에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 처리한 후, 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 MAP2의 발현량을 나타낸 그래프이다.(**; p < 0.01 vs β-1 인테그린 항체를 처리하지 않은 시료, +; p < 0.05 vs β-1 인테그린 항체를 포함하지 않은 mock 시료).
도 21은 hNSCs(n=3)의 미토콘트리아(mitochondrial) 메타볼릭 활성을 MTT로 측정하여, 세포 생존률을 나타낸 결과 그래프이다. 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)로 처리하고 하루 배양한 후 바로 측정하였다.(*; p < 0.05, **; p < 0.01 vs. mock group).
도 22는 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 6일 후, 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다. 이때, 적색은 MAP2 마커이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 Tuj1 마커이다. 스케일 바는 100 ㎜이다.
도 23 및 도 24는 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 6일 후, 이를 qRT-PCR을 이용하여 Tuj1/GAPDH 발현량(도 23), MAP2/GAPDH 발현량(도 24)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 25 및 도 26은 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포에 대해 전기물리학적 특성 분석을 실시한 결과 그래프이다. 이때 도 25는 소듐 채널-매개의 전류를 측정하기 위한 것이고, 도 26은 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포의 활성 전위(potential) 스파이크(spike)를 기록한 것이다.
도 27은 온도에 따라 제조예 1. 2로부터 제조된 광열변환이 가능한 덴드리머 펩타이드의 평균 직경의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28은 실시예 12로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(dendri(PEO)10-CSAP/SWNT)의 온도에 따른 평균 직경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 L은 25 ℃ 온도를 의미하고, H는 55 ℃ 온도를 의미한다.
도 29는 단일벽 탄소나노튜브 0 ㎎, 5 ㎎ 및 10 ㎎ 포함하는 용액에 근적외선(NIR) 조사에 의해 광열 가열할 경우, 시간에 따른 온도변화량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 30은 근적외선 조사 유무(on/off) 따른 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)의 형광세기 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 31, 도 32는 hfNSC에 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)을 처리하고 6 일 후, 이를 qRT-PCR을 이용하여 Tuj1/GAPDH 발현량(도 31), MAP2/GAPDH 발현량(도 32)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체의 작동원리를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 제조예 3 내지 7로부터 제조된 리간드 펩타이드와 형광 라벨링된 리간드 펩타이드의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 제조예 1, 2로부터 제조된 덴드리머 펩타이드의 MALDI-ROF MS 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 TEM 사진이다. 이때 스케일 바는 100 ㎛였다.
도 6은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 농도별 SDS-PAGE 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 CD 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 CD 스펙트럼이다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에 따라 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD/SWNT)의 FRET 측정 결과 그래프이다. 이때 청색은 실시예 3에 따라 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD/SWNT)의 발광(emission) 스펙트럼이고, 적색은 실시예 4에 따라 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RAD/SWNT)의 발광 스펙트럼이며, 보라색은 실시예 8로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD;RAD, 50%)/SWNT)의 발광 스펙트럼이다. l ex = 490 nm.
도 10은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT) 또는 실시예 4로부터 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RGD/SWNT)를 처리한 후, 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다. 이때, 적색은 실시예 4로부터 제조된 형광 라벨링된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RGD/SWNT)에서 형광단이 TAMRA이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 hfNSC 세포 표면에 존재하는 베타1 인테그린이다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
도 11은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 6 일 동안 배양한 다음 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다.
도 12는 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 6 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 각 유전자(tuj1, MAP2, GFAP, olig2)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 다양한 농도로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리하였을 때, 상기 세포에서의 Tuj1/GAPDH 발현량을 나타낸 그래프이다. Tuj1은 대표적인 뉴런 세포의 마커이다.
도 14는 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 다양한 농도로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리하였을 때, 상기 세포에서의 MAP2/GAPDH 발현량을 나타낸 그래프이다. MAP2는 대표적인 뉴런 세포의 마커이다.
도 15는 본 발명에 따른 두 개의 리간드 펩타이드 혼합비율을 달리하여 탄소나노튜브 상에 공동 조립을 통해 결합시켰을 때, 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 16은 도 15에서와 같이 두 개의 리간드 펩타이드의 혼합비율을 달리하여 탄소나노튜브 상에 공동 조립을 통해 결합시켜 제조된 실시예 1, 2 6-11의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)를 hfNSCs에 처리하여 측정된 tuj1/GAPDH의 발현량을 나타낸 그래프이다. n=3, *; p<0.05, **; p<0.01
도 17은 피브로넥틴(FN)-폴리-L-라이신(PLL)-코팅된 기판 상에서, hfNSCs에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 3 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 tuj1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 18은 피브로넥틴(FN)-폴리-L-라이신(PLL)-코팅된 기판 상에서, hfNSCs에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 3 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 MAP2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 19는 β-1 인테그린 항체의 첨가에 따라, hfNSCs에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 처리한 후, 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 Tuj1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 20은 β-1 인테그린 항체의 첨가에 따라, hfNSCs에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 처리한 후, 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 MAP2의 발현량을 나타낸 그래프이다.(**; p < 0.01 vs β-1 인테그린 항체를 처리하지 않은 시료, +; p < 0.05 vs β-1 인테그린 항체를 포함하지 않은 mock 시료).
도 21은 hNSCs(n=3)의 미토콘트리아(mitochondrial) 메타볼릭 활성을 MTT로 측정하여, 세포 생존률을 나타낸 결과 그래프이다. 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)로 처리하고 하루 배양한 후 바로 측정하였다.(*; p < 0.05, **; p < 0.01 vs. mock group).
도 22는 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 6일 후, 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다. 이때, 적색은 MAP2 마커이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 Tuj1 마커이다. 스케일 바는 100 ㎜이다.
도 23 및 도 24는 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 6일 후, 이를 qRT-PCR을 이용하여 Tuj1/GAPDH 발현량(도 23), MAP2/GAPDH 발현량(도 24)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 25 및 도 26은 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포에 대해 전기물리학적 특성 분석을 실시한 결과 그래프이다. 이때 도 25는 소듐 채널-매개의 전류를 측정하기 위한 것이고, 도 26은 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포의 활성 전위(potential) 스파이크(spike)를 기록한 것이다.
도 27은 온도에 따라 제조예 1. 2로부터 제조된 광열변환이 가능한 덴드리머 펩타이드의 평균 직경의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28은 실시예 12로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(dendri(PEO)10-CSAP/SWNT)의 온도에 따른 평균 직경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 L은 25 ℃ 온도를 의미하고, H는 55 ℃ 온도를 의미한다.
도 29는 단일벽 탄소나노튜브 0 ㎎, 5 ㎎ 및 10 ㎎ 포함하는 용액에 근적외선(NIR) 조사에 의해 광열 가열할 경우, 시간에 따른 온도변화량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 30은 근적외선 조사 유무(on/off) 따른 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)의 형광세기 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 31, 도 32는 hfNSC에 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)을 처리하고 6 일 후, 이를 qRT-PCR을 이용하여 Tuj1/GAPDH 발현량(도 31), MAP2/GAPDH 발현량(도 32)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 (a) 덴드리머 펩타이드;
(b) 리간드 펩타이드; 및
(c) 탄소나노튜브를 포함하고,
상기 탄소나노튜브 표면에 상기 (a), (b) 펩타이드가 공동 조립(co-assemble)되어 형성된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체에 관한 것이다.
본 발명자들은 줄기세포로부터 효율적으로 신경세포로 분화를 유도함에 있어서, 원격으로 이러한 과정을 제어할 수 있는 새로운 구조의 분화유도물질을 제조하고자 노력하였으며, 그 결과 적외선 조사에 따라 줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 제어할 수 있음과 동시에 줄기세포로부터 분화된 세포들에서 다른 계열의 세포 및 미분화세포 혼재가능성을 최소화할 수 있는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 개발하게 되었다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포 분화 유도"란 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우 뿐만 아니라, 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 신경전구체의 형성도 포함한다.
본 발명의 줄기세포 분화 유도과정은 줄기세포가 특정세포로 완전 분화되는 것을 효과적으로 달성되도록 할 뿐만 아니라 줄기세포에서 신경전구체를 형성하거나, 신경전구체에서 특정세포로 완전 분화하는 것에 대해서도 매우 큰 효율성을 갖는다.
본 명세서에서 용어 "신경세포"란 신경(Neuron)세포를 의미하는 것이다.
본 발명은 (a) 덴드리머 펩타이드; (b) 리간드 펩타이드; 및 (c) 탄소나노튜브를 포함하고, 상기 탄소나노튜브 표면에 상기 (a), (b) 펩타이드가 공동 조립(채-assemble)되어 형성된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체로, 이의 구조와 작동원리를 도 2에 구체적으로 나타내었다.
도 1에는 (a) 덴드리머 펩타이드와 (b) 리간드 펩타이드의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1을 참조하면 우선 상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 선형 폴리(에틸렌옥사이드), 제1 링커 및 제1 펩타이드를 포함하는 덴드리머형 펩타이드이다. (a) 덴드리머 펩타이드는 제1 펩타이드의 C 말단에 제1 링커에 의해 복수 개의 선형 폴리(에틸렌옥사이드)가 결합되어 있는 형태이다.
상기 제1 펩타이드는 5 내지 10 아미노산 잔기로 이루어진 것일 수 있다.
상기 제1 링커는 상기 제1 펩타이드의 C 말단에 결합된 제1 라이신 잔기; 및 상기 제1 라이신 잔기의 주쇄 아민기와 측쇄 아민기에 각각 결합된 제2, 3 라이신 잔기를 포함하는 것이다.
앞서 설명한 바와 같이 상기 제1 링커 제2, 3 라이신 잔기의 주쇄 아민기와 측쇄 아민기에 상기 선형 폴리(에틸렌옥사이드)가 결합되어, 상기 선형 폴리(에틸렌옥사이드)와 상기 제1 펩타이드가 결합되어 있는 형태이다.
상기 제1 펩타이드와 제1 링커, 상기 제1 링커와 폴리(에틸렌옥사이드)는 아미노산 합성시 사용되는 합성 원리를 이용하여 결합되는 것으로, 제1 펩타이드의 말단, 제1 링커에서의 제1, 2, 3 라이신 잔기의 일부 말단이 아세틸화되어 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 폴리(에틸렌옥사이드)는 아래 화학식 1로 표시할 수 있다.
[화학식 1]
R-[-CH2CH2O-]n-
상기 화학식 1에서, 상기 n은 1 내지 20이고, 상기 R은 수소 또는 아세틸기일 수 있다.
상기 화학식 1에서 상기 n은 7 내지 10인 것이 가장 바람직한데, 왜냐하면 하기 후술하는 실험예에서 상기 n이 6 이하인 폴리(에틸렌옥사이드)를 포함하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 LSCT가 과도하게 높아 온도 변화에 따라 구조적 변화가 야기되지 않는 단점이 존재한다.
상기 폴리(에틸렌옥사이드)는 LSCT 이상의 온도에서는 팽창하고, LSCT 미만의 온도에서는 수축하는 효과를 가지고 있으므로, 이를 이용하여 (a) 덴드리머 펩타이드가 온도에 따라 구조적 변화를 가지도록 하는 역할을 수행한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 도 1에서와 같이 제1 펩타이드 하나를 기준으로 4 개의 선형 폴리(에틸렌옥사이드)를 포함하는 구조일 수 있다.
상기 제1 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 5 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 제1 펩타이드는 탄소나노튜브와 우수한 상호작용을 형성하여, 상기 (a) 덴드리머 펩타이드를 상기 탄소나노튜브에 결합시키는 역할을 수행한다.
가장 바람직하게 상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 하기 구조식 1 내지 2로 표시될 수 있다.
[구조식 1] dendri(PEO)6-CSAP
[구조식 2] dendri(PEO)10-CSAP
상술한 구조를 갖는 상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 LSCT 이상의 온도에서 팽창하고, LSCT 미만의 온도에서 수축하여 응집체를 형성하는 특성을 가지고 있다. 즉, 변환된 광열에 따라 구조가 변하게 된다.
다만, 상기 구조식 1의 덴드리머 펩타이드는 LSCT 온도가 매우 높기 때문에 구조식 2의 덴드리머 펩타이드를 이용하는 것이 생리적인 조건에서 효율적으로 원격 제어를 할 수 있다.
상기 (b) 리간드 펩타이드는 제1 펩타이드; 제2 링커 및 제2 펩타이드를 갖는다. 상기 제1 펩타이드는 베타 시트를 형성하는 아미노산 서열로, 하기 서열번호 1 내지 5 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이는 상기 탄소나노튜브와 우수한 상호작용을 형성하여, 상기 (b) 리간드 펩타이드를 상기 탄소나노튜브에 결합시키는 역할을 수행한다.
상기 제2 링커는 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Ser, Gly-Ser-Gly 및 Gly-Ser-Gly-Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 이는 상기 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 연결함과 동시에 상기 (b) 리간드 펩타이드에 유연성을 주기위한 역할을 수행한다.
상기 제2 펩타이드는 하기 서열번호 6 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 상기 제2 펩타이드는 줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 유도하는 효과를 갖는 것으로 구체적으로 세포막 표면에 존재하는 β-1 인테그린에 결합하여 β-1 인테그린의 응집 및 발현을 유도하는 역할을 수행한다.
상기 (b) 리간드 펩타이드는 하기 구조식 3 또는 구조식 4로 표시되는 것일 수 있는데, 가장 바람직하게는 구조식 3으로 표시되는 것일 수 있다. 왜냐하면 구조식 4는 구조식 3의 돌연변이형 펩타이드로, 활성이 다소 낮기 때문에 구조식 3으로 표시되는 (b) 리간드 펩타이드가 가장 바람직하다.
[구조식 3] RGD-CSAP
[구조식 4] RAD-CSAP
상기 구조식 3, 4에서
상기 R은 수소 또는 아세틸기이다.
상기 탄소나노튜브는 적외선 또는 근적외선을 조사하였을 때, 가장 광열 변환이 우수한 단일벽 탄소나노튜브를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체에서 상기 탄소나노튜브 표면에 공동 조립되어 결합된 총 펩타이드 중에서 상기 (b) 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 65 내지 75%인 것이 바람직한데, 상기 (b) 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 60% 이하이거나 80%를 이상일 경우 하기 후술하는 실험예에서와 같이 Tuj1 발현량(Tuj1/GAPDH)이 1.5 이하인데 반해, 상기 (b) 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 65 내지 75%일 때는 이보다 1이 더 우수한 약 2.5 Tuj1 발현량(Tuj1/GAPDH)을 보이고 있다.
이러한 Tuj1 발현량(Tuj1/GAPDH) 비교에 있어서 0.1이라도 증가한 것은 매우 유의한 의미를 가지고 있는 것이기 때문에, 본 발명에서와 같이 1이 증가한 것은 매우 현저한 효과적 의미를 가지고 있다고 볼 수 있다.
상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 1 내지 45 ℃에서 평균 직경이 5 내지 30 ㎚이고, 50 내지 100 ℃에서는 평균 직경이 100 내지 2500 ㎚인 것을 특징으로 한다.
상술한 구조를 갖는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 도 2에서와 같이 하나의 탄소나노튜브 표면에 복수 개의 리간드 펩타이드와 복수 개의 덴드리머 펩타이드를 공동 조립함으로써, 적외선 조사를 통해 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체의 구조적 및 기능적 특성을 원격으로 조절할 수 있는 매우 이질적이고 현저한 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면은 아래 단계를 포함하는 신경줄기세포로부터 신경세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
Ⅰ) 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 배지에 첨가하는 단계;
Ⅱ) 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체가 첨가된 배지에 적외선을 조사하여, 상기 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화를 유도 및 촉진하는 단계;를 포함한다.
이하 본 발명에 따른 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화 방법을 구체적으로 설명하기로 한다.
우선 Ⅰ) 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 배지에 첨가한다.
본 발명에 의해 분화될 수 있는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 본 발명이 적용될 수 있는 세포이다. 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포 및 배아종양세포를 포함하며, 바람직하게는 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포이다. 용어 '유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)'는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능중기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일한 것으로 당업계에서 판단되고 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전구세포(progenitor cell)"라는 용어는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하기 위하여 수임된 세포를 의미한다.
본 발명의 장점 중 하나는 하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 등 모든 줄기세포뿐만 아니라 전구세포까지 적용 가능한 만능 분화 프로토콜을 제공한다는 것이다.
상기 배지는 줄기세포 또는 전구세포를 배양할 수 있는 통상의 배지이면 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지일 수 있다.
본 발명의 분화시키는 방법은 상기 새로운 구조의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 첨가함으로써, 상기 배지에 별도의 분열 촉진 인자, 성장인자등을 포함하지 않아도 효율적으로 신경세포로의 분화를 유도하는 장점을 갖는다.
상기 Ⅰ) 단계에서 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체의 처리는 1 내지 10일 동안 한번 또는 여러번에 걸쳐 지속적으로 투여할 수 있다.
상기 배지는 세포가 부착될 수 있는 배양디쉬, 멀티웰 플레이트 또는 폴리-L-라이신 코팅 유리커버슬립을 사용할 수 있다.
Ⅱ) 단계에서 적외선은 5 내지 20분 동안 조사되는 것이 바람직하고, 한번 또는 여러번에 나누어 조사할 수 있다.
본 발명에 따르면 다양한 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포)를 비슷한 수준의 신경세포로 분화시켜 얻을 수 있다. 본 발명에 의해 수득한 신경세포는 특히 신경 퇴행성 질환, 예컨대 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증에 적용되어 이들 질환을 치료에 사용될 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
시약
Fmoc-아미노산은 Novabiochem으로부터 구매하였다.
탄소나노튜브(CNT)는 Raymor industreies(canada)로부터 구매하였다.
Fmon-33-amino-4,7,10,13,16,19,23,25,28,31-decaoxatritricontanoic acid(fnoc-NH-PEO10-Proionic acid)와 Fmoc-21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxaheneicosanoic acid(Fmoc-NH-PEO6-propionic acid)를 AAPPTec(KY, USA)로부터 구매하였다.
분석 방법
1) CD 스펙트럼.
상기 CD 스펙트럼은 Peltier 온도 제어장치를 갖는 ChirascanTM Circular Dichroism 스펙트로미터를 사용하여 측정하였다(Applieed Photophysics., Ltd, Surrey, UK). 이때, 150 mM NaCl 용액(300 ㎕)에 펩타이드 60 μM을 갖는 분산된 CNT 1 ㎍의 상기 CD 스펙트럼은 190 내지 260 ㎚에서 기록하였다. 측정시 2 ㎜ 통과길이를 갖는 큐벳을 사용한다.
2)
TEM
30 배로 희석한 시료의 1 ㎕를 탄소 코팅된 구리 그리드 상에 도포하고, 완전히 건조시켰다.
이후 염 결정화를 평가하기 위하여 1 분동안 증류수 1 ㎕를 첨가하고, 필터페이퍼를 사용하여 불순물을 제거하여 견본을 얻었다. 상기 견본은 120 kV에서 경조(high contrast) TEM(JOEL-2010, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, 얻은 데이터는 Digital MicrographTM 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
3)
WAXS
상기 X-ray 산란 실험은 상기 Pohang Accelerator Laboratory(PAL)의 상기 4C SAXS Ⅱ 빔라인(BL)에서 수행하였다. Pohang Light Source Ⅱ storage ring의 In-vacuum Undulator 20(IVU 20:1.4 m 길이, 20 ㎜ period)로부터 광 소스를 수직적(vertical) 포커싱 도넛형 거울을 사용하였다.
4) 시료의 정량화(Quantification).
시료를 16110 X g, 4 ℃에서 1 시간동안 원심분리하고, 펠렛을 버리고, 남은 상충액(supernatants)(7.5 ㎕)을 10 % SDS(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석을 수행하였다. 이때 100 V의 Tris-Tricine 완충액 시스템을 사용하였다. 다양한 농도에서 상기 자유 펩타이드(free peptide)를 정량화를 위한 레퍼런스(referencs)로서, 상기 시료와 동시에 전기영동하였다. 상기 겔은 Brilliant Blue G(Sigma, St Louis, USA)로 염색하였고, adobe photoshop software를 사용하여 펩타이드 밴드 밀도의 농도(densitometric) 분석하였다.
5) FRET
상기 형광 스펙트럼은 LS-55 형광 스펙트로포토미터(Perkin Elmer, CT, USA)를 사용하여 측정하였다. 이때 1 ㎝ 통과 거리를 갖는 쿼츠(quartz) 큐벳(Hellma UK Ltd., Essex, UK)를 사용하였다.
6) DLS
Zetasizer Nano ZS instrument(Malvern Instruments Ltd. Worcestershire, UK)를 사용하여 측정하였다.
7) 줄기세포 및 전구세포 배양
인간 태아 신경 줄기세포(Human fetal neural stem cells; hfNSCs)는 telencephalon(HFT13)로부터 유래된 것을 사용하였다.
hfNSCs는 연세대학교 의대에 계시는 prof. kook in park 으로부터 제공받아 사용하였다. hfNSCs는 Dulbecco's modified Eagle's medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12) 배지(햐ㅠ채, Gaithersburg, MD, USA)에서 6.0 X 105/㎖ 밀도로 접종하여 배양하였고, 이는 분열촉진 물질(mitogenic factor)을 포함하고 있다(basic fibroblast growth factor(bFGF, 20 ng/㎖, Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)와 leukemia inhibitory factor(LIF, 10 ng/㎖, Sigma)]. 또한 N-2 supplement(Gibco)를 포함하고 37 ℃에서 5% CO2를 갖는 습한 공기하에서 배양한다. 상기 hfNSCs는 이러한 조건 하에서 신경구(neurospheres)로 성장하게 된다. 단일 세포는 신경구로부터 분열하므로, 배양을 위해서는 3.0 X 105 cells/㎖ 밀도로 배양 접시에 접종한다. 자발적인 분화를 유도하기 우해서는 상기 hfNSCs가 DMEM/F12 배지에서 분열촉진제를 포함하는 첨가제 없이 유지되어야 한다. 인간 유래 다능성 줄기세포(hiPSCs)는 연세대학교 의대 prof. Dong-Wook Kim으로부터 제공받은 것을 사용하였고, 이전 연구에서와 같이 유지하였다. 상기 세포는 hiPSC 배지(DMEM/F12)에서 배양하였고, 상기 배지는 20% 녹아웃-세럼 대체제(knockout-serum replacement(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen), 비필수 아미노산(non-essential amino acids)(Invitrogen), 0.1 mM β-mercaptoethanol(Sigma) 및 10 ng/㎖ bEGF(Peprotech)가 첨가되었다. 상기 비분화된 hiPSCs는 영양세포층(feeder cell layer)(STO fibroblasts, American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, VA, USA)에서 유지시켰다. 이는 마이토마이신 C 처리(10 ㎍/㎖, Sigma)로 비활성화 하였다. hiPSC 분화를 위해, bFGF가 없는 hiPSC 배지를 사용하여 페트리 접시에 부유(non-adherent)하여 4 일동안 배양함으로써 embryoid 항체(EB)를 hiPSCs에 의해 처음 생성하였다. 신경세포의 전구세포(hiPSC-유도된 신경 전구 세포; hiPSC-NPCs)에서 hiPSCs의 분화를 유도하기 위하여, 5 μM dorsomorphin(DM)(Sigma)와 5 μM SB431542(Sigma)를 EB 형성하는 동안 hiPSC 배지에 첨가하였다. 상기 EB는 Matrigel(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 갖는 코팅된 배양 접시 상에 부착되었고, 이를 신경세포 유도 배지(induction midium)[1 ㅧ N2 supplement(Invitrogen)와 1 ㅧ 비필수 아미노산(Invitrogen)이 첨가된 DMEM/F12 medium(Invitrogen)]에서 배양하였다. 4-5 배양일일이 지난 후, 신경세포 로젯(rosette)이 EB의 중앙에서 나타나기 시작했다. 신경능선세포(neural crest cell)가 부착된 EB의 덴드리머 외곽을 구성하는 부분(peripheries)에 유용하게 위치하였다. 신경세포 로젯은 8-well 챔버 슬라이드에서 전송되었고, 상기 펩타이드/SWNT(0.5 μM)은 hfNSC와 hiPSC-NPCs의 신경세포 분화를 제공하기 위해 매 이틀마다 첨가되었다. 배양 6일이 지난 후, 상기 hfNSCs와 hiPSC-NPCs의 분화는 immunocytochemical 염색과 qRT-PCR을 사용하여 분석하였다.
8)
qRT
-
PCR
qRT-PCR을 통한 총 RNA는 RNeasy Mini kit(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 준비하였다. 각각의 시료(n = 3 per group)는 상기 manufacturer's instructions에 따라 준비하였다.
상기 RNA 농도는 스펙트로포토미터를 사용하여 260 ㎚에서 상기 시료의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 각 RNA 시료로부터 cDNA를 준비하기 위한 역전사(Reverse transcription)는 TaKaRa PrimeScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하여 수해하였다. qRT-PCR은 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 반응을 위해 사용하였다. 상기 세포의 상기 유전자 발현 프로필은 TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystems)를 사용하여 정량화하였다. 이때 각 타겟은 [neuronal class III beta-tubulin (Tuj1): Hs00801390_s1, microtubule-associated protein 2 (MAP2): Hs00258900_m1, glial fibrillary acidic protein (GFAP): Hs00909238_g1, and oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2): Hs00300164_s1]을 사용하였다. 상기 각각 타겟 유전자의 상관 발현 수준은 endogenous reference transcript (human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): Hs02758991_g1)의 것을 기준으로 정량화한 발현의 것을 상대적인 Ct 방법으로 결정하였다.
9) 면역세포화학(
Immunocytochemistry
)
분화된 hfNSCs와 hiPSC-NPCs의 면역세포화학 염색은 통상의 면역세포화학 염색법을 참조하여 수행하였다. 상기 세포는 4%(w/v) paraformaldehyde(Sigma) 용액을 사용하여 15 분 간 고정하고, 0.1%(v/v) Triton X-100(Sigma)로 5 분 간 처리하였다. 이후 2%(v/v) goat serum(sigma)으로 45 분 동안 블로킹(blocking)한 다음 상기 세포를 4 ℃에서 밤새 1차 항체로 배양하였다. 다음 1차 항체(primary antibodies)를 다음과 같이 염색하였다. 마우스 모노클로날 anti-Tuj1(mouse monoclonal anti-Tuj1)(1:100; Millipore, Temecula, CA, USA), 토끼 폴리클로날 anti-MAP2(rabbit polyclonal anti-MAP2(rabbit polyclonal anti-MAP2)(1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 마우스 모노클로날 anti-GFAP(mouse monoclonal anti-GFAP)(1:200; Millipore), 토끼 폴리클로날 anti-NeuN(rabbit polyclonal anti-NeuN)(1:200; Millipore) 및 마우스 모노콜로날 anti-integrin b1(mouse monoclonal anti-integrin b1)(1:200; Millipore)을 사용한다. 이를 PBS 완충액으로 세척하고, 상기 2차 항체[Alexa Fluor-488 goat anti-mouse IgG (1:500) and Alexa Fluor-594 donkey anti-rabbit IgG (1:500); Invitrogen]를 첨가하여 상기 세포를 45 분 동안 배양하였다. 상기 세포 핵산(nuclei)은 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma)로 대비염색(counterstaine)하였다. 상기 염색으로부터의 형광 신호는 confocal microscope(LSM 700, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 관찰하였다.
15) 전기생리학적 분석
hiPSC-NPCs로부터 분화된 상기 신경세포 유사 세포의 전기생리학적 분석은 정규화된 프로토콜에 따른 patch clamp technique를 사용하여 수행하였다. 상기 분화된 세포의 상기 전기생리학적 기록을 위해, 상기 배양된 세포를 갖는 커버 슬립을 recording chamber(Warner Instrument, Hamden, CT, USA)에 운반해 놓고, 연속적으로 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid)(aCSF)[124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.3 mM MgSO4, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 2.4 mM CaCl2-2H2O 및 10 mM glucose]을 가해주는 동안 microscope(Olympus, Japan)에 옮겨 두었다.
상기 용액에 연속적으로 O2 95%/CO2 5% 혼합된 가스를 상온에서 가해주었다. 전체 셀 패치(Whole-cell patch) 클램핑(clamping)은 유리 모세관 피펫 팁을 이용하여 수행하였다, 이때, 상기 피펫 풀러(pipette puller)(P-97, Sutter Instrument, Novato, CA, USA)로 제조하였다. 상기 유리 모세관 피펫을 세포 표면 상에 조심스럽게 두고, 세포막과 유리 피펫 사이에 gigaseal을 형성할 수 있게 조심스럽게 음의 압력을 가했다. 부착된 세포막을 상기 전체 세포 형태를 형성하기 위해서 파괴하였다. 상기 내부의 피펫용액은 115 mM K-gluconate, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 5 mM Mg-ATP 및 0.5 mM Na2+-GTP를 포함하고, pH 7.3 및 280-285 mOsm이였다. 상기 전압-클램프 모드에서 상기 전압-활성화된 전류를 이끌기 위하여 상기 고정 전위는 - 60 ㎷이고, 전압 스텝 범위는 - 60 ㎷에서 +20 ㎷(단계당 + 10 ㎷)을 상기 세포에 적용하였다.
상기 활동 전위의 생성을 실험하기 위해 상기 전압-클램프 모드를 사용하였고, 상기 세포는 전압을 15 단계로 나누어 인가하였다(초기에는 0 ㎀여고, 단계 당 △0-20 ㎀로 증가하였다.). 상기 세포의 막 용량(capacity)에 따라 상기 수치를 조정하였다. 전류와 스파크가 Na+ 채널에서 특이적임을 확인하기 위하여, 0.5 μM TTX(Sigma)를 배쓰(bath)로 5 내지 10분 동안 처리하였다.
제조예
1, 2.
덴드리머
펩타이드의
합성(
dendri
(
PEO
)
6
-
CSAP
,
dendri
(
PEO
)
10
-
CSAP
).
하기 서열번호 1의 펩타이드를 TributeTM 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Inc.)의 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하여 Rink Amide MBHA 레진 LL(Novabiochem)으로 합성하였고, 결합체로 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)를 사용하였다. 표준 아미노산 보호기를 사용하여 합성하였다.
상기 합성된 서열번호 1펩타이드의 N 말단에 PEO 덴드리머를 합성하기 위해, Fmoc-Lys(fmoc)-OH를 dendritic 가지로 수용하였고, 여기에 Fmoc-NH-PEO6-propuonic acid(제조예 1) 또는 Fmoc-NH-PEO10-propionic acid(제조예 2)을 상기 아미노산과 커플링 원리와 유사한 원리를 이용하여 결합시켜 하기 구조식 1, 2의 덴드리머 펩타이드를 합성하였다.
상기 합성된 펩타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여, 상기 레진을 cleavage 칵테일(TFA:1,2-ethanedithiol:thioanisole; 95:2.5:2.5)로 3 시간동안 처리하였다. 그리고 tert-butyl methyl ether(TBME)와 함께 분쇄하였다. 상기 펩타이드를 역상 HPLC(water-acetonitrile with 0.1% TFA)로 정제하였고, 상기 분자량을 MALDI-TOF mass 스펙트럼으로 확인하였다.
HPLC 분석을 통해 확인한 결과, 상기 펩타이드의 정제율은 95% 이상이였다. 상기 펩타이드 농도는 257.5 ㎚에서 페닐알라닌(195 M-1㎝-1)의 몰랄 extinction 계수를 사용하여 물/아세토나이트릴(1:1) 우레아에서 분광광도적으로 확인하였다.
[구조식 1] dendri(PEO)6-CSAP
[구조식 2] dendri(PEO)10-CSAP
제조예
3, 4.
리간드
펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP)의
합성.
하기 구조식 3, 4의 펩타이드를 각각 TributeTM 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Inc.)의 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하여 Rink Amide MBHA 레진 LL(Novabiochem)으로 합성하였고, 결합체로 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)를 사용하였다. 표준 아미노산 보호기를 사용하여 합성하였다.
상기 합성된 펩타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여, 상기 레진을 cleavage 칵테일(TFA:1,2-ethanedithiol:thioanisole; 95:2.5:2.5)로 3 시간동안 처리하였다. 그리고 tert-butyl methyl ether(TBME)와 함께 분쇄하였다. 상기 펩타이드를 역상 HPLC(water-acetonitrile with 0.1% TFA)로 정제하였고, 상기 분자량을 MALDI-TOF mass 스펙트럼으로 확인하였다.
HPLC 분석을 통해 확인한 결과, 상기 펩타이드의 정제율은 95% 이상이였다.
상기 펩타이드 농도는 257.5 ㎚에서 페닐알라닌(195 M-1㎝-1)의 몰랄 extinction 계수를 사용하여 물/아세토나이트릴(1:1) 우레아에서 분광광도적으로 확인하였다.
[구조식 3] RGD-CSAP
[구조식 4] RAD-CSAP
상기 구조식 3, 4에서
상기 R은 수소 또는 아세틸기일 수 있는데, 본 제조예에서는 아세틸기이다.
제조예
5 내지 7. 형광
라벨링된
리간드
펩타이드(FAM-
RGD
-
CSAP
,
TAMRA
-
RGD
-CSAP 및
TAMRA
-RAD-
CSAP
)의 합성.
상기 제조예 3, 4에서 제조된 리간드 펩타이드의 N 말단에 형광단을 처리하여 결합시켰다.
다시 말해, RGD-CSAP, RGD-CSAP의 N 말단에 형광단을 결합시키기 위해, 각각의 리간드 펩타이드에 상기 5(6)-carboxyfluorescein과 5(6)-carboxytetrametylrhodamine의 컨쥬게이션은 앞선 아미노산 커플링 방법의 원리를 이용하여 수행하였다.
이후 합성된 형광으로 라벨링된 리간드 펩타이드의 최종 탈보호와 분리를 위하여 상기 레진을 cleavage 칵테일(TFA:1,2-ethanedithiol:thioanisole; 95:2.5:2.5)로 3 시간동안 처리하였다. 그리고 tert-butyl methyl ether(TBME)과 함께 분쇄하였다. 상기 펩타이드를 역상 HPLC(water-acetonitrile with 0.1% TFA)로 정제하였고, 상기 분자량을 MALDI-TOF mass 스펙트럼으로 확인하였다.
HPLC 분석을 통해 확인한 결과, 상기 펩타이드의 정제율은 95% 이상이였다. 상기 펩타이드 농도는 257.5 ㎚에서 페닐알라닌(195 M-1㎝-1)의 몰랄 extinction 계수를 사용하여 물/아세토나이트릴(1:1) 우레아에서 분광광도적으로 확인하였다.
실시예
1.
리간드
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체(
RGD
/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 1의 RGD-CSAP(300 μM, 30 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
2.
리간드
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체(RAD/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 2의 RAD-CSAP(300 μM, 30 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
3. 형광
라벨링된
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체(FAM-
RGD
/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 3의 FAM-RGD-CSAP(300 μM, 30 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
4. 형광
라벨링된
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체(
TAMRA
-RAD/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 4의 TAMRA-RAD-CSAP(300 μM, 30 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
5. 복합
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체((
RGD
:RAD)/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 1의 RGD-CSAP(150 μM, 15 ㎕) 그리고 RAD-CSAP(150 μM, 15 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
6 내지 11. 형광
라벨링된
복합
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체((FAM-RGD:TAMRA-RAD, 20-80%)/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 1의 FAM-RGD-CSAP(150 μM, 15 ㎕) 그리고 TAMRA-RAD-CSAP(150 μM, 15 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
12.
덴드리머
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체(
dendri
(
PEO
)
10
-
CSAP
)/
SWNT
)
상기 SWNT를 100 ㎍/㎖의 THF에 분산하고, 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣는다. THF를 증발시킨 후, 여기에 물에 용해된 dendri(PEO)10-CSAP 용액(300 μM, 21 ㎕)를 첨가하였다. 상기 혼합액을 30 분간 초음파로 처리하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실시예
13.
덴드리머
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체(FAM-
RGD
:
dendri
(
PEO
)
10
-CSAP, 70%)/
SWNT
)
상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)를 100 ㎍/㎖ tetrahydrofuran(THF)에 분산하여 분산액을 제조하고, 상기 분산액 5 ㎕(0.5 ㎍)을 마이크로 원심분리용 튜브에 넣었다. 이를 원심분리 증발기를 이용하여 THF를 증발시키고, 물에 용해된 제조예 1의 FAM-RGD-CSAP(105 μM, 10.5 ㎕), dendri(PEO)10-CSAP(105 μM, 10.5 ㎕), 그리고 RAD-CSAP(70 μM, 7 ㎕)를 첨가한 후, 30 분 동안 초음파를 이용하여 혼합하였다. 다음 상기 혼합액에 NaCl을 최종농도에서 150 mM이 되도록 첨가하고, 상기 용액을 초음파로 혼합하여 자기조립을 통해 제조하였다.
실험예
1.
MALDI
-MS
도 3은 본 발명의 제조예 3 내지 7로부터 제조된 리간드 펩타이드와 형광 라벨링된 리간드 펩타이드의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이고, 도 4는 본 발명의 제조예 1, 2로부터 제조된 덴드리머 펩타이드의 MALDI-ROF MS 스펙트럼이다.
도 3, 4를 살펴본 결과, 제조예 1 내지 7로부터 제조된 펩타이드가 모두 제대로 형성되었음을 확인할 수 있다.
실험예
2.
TEM
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 TEM 사진이다. 이때 스케일 바는 100 ㎛였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)가 1 차원 형태로 제조되어 있음을 확인하였다.
상기 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)는 평균 직경이 5 내지 8 ㎚인 것을 확인하였다. 상기 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)의 평균 직경이 0.9-1.5 ㎚인 점을 고려한다면, 상기 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 평균 직경은 상기 탄소나노튜브 표면 상에 상기 펩타이드가 결합된 복합체 형태임을 명백히 할 수 있다.
실험예
3. SDS-PAGE
도 6은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 농도별 SDS-PAGE 결과이다.
이때 lane 1은 단백질 마커이고, lane 2-8은 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)이다. 도 6의 하단에 표기된 M은 혼합된 펩타이드(RGD-CSAP)의 농도(μM)를 의미하는 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 화살표로 표시된 위치에 존재하는 밴드는 RGD-CSAP 펩타이드를 나타내고, 이러한 밴드가 없어진 lane 5의 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)에서 완전히 서로 결합되고 있음을 알 수 있다.
다시 말해 300 μM RGD-CSAP 펩타이드를 사용할 때, SWNT와 완전히 결합되어, 용액 상에 결합되지 않는 RGD-CSAP 펩타이드가 잔류하지 않게 된다.
실험예
4. CD 스펙트럼
도 7은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 CD 스펙트럼이다.
도 7은 탄소나노튜브와 펩타이드의 결합관계를 명백히 확인하기 위한 것으로, 이를 살펴보면 시트 구조를 나타내는 215 ㎚에서 음의 피크가 관찰되었음을 통해, 탄소나노튜브와 펩타이드(특히, 제1 펩타이드)는 우수하게 결하되어 있음을 확인할 수 있다.
실험예
5. 광각 X선 산란(
WAXS
) 측정
도 8은 본 발명에 따른 실시예 1에 따라 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 CD 스펙트럼이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 3.1 Å와 4.7 Å에서 d-spacing이 관찰되었고, 이는 β-시트 구조의 가닥(strand) 사이의 거리와 페닐알라닌 잔기 사이의 파이-파이 스태킹(stacking)을 나타내는 수치이다.
따라서, 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)는 β-시트 간의 수소 결합 상호작용과 펩타이드(RGD-CSAP) 중에서 제1 펩타이드와 탄소나노튜브 간에 소수성 상호작용 및 파이-파이 스태킹 상호작용을 포함하고 있음을 알 수 있다.
실험예
6. 광각 X선 산란(
WAXS
) 측정
본 발명의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체에서 비공유 상호작용 중에서 다른 타입의 펩타이드가 존재하게 된다면 RGD-CSAP와 탄소나노튜브의 결합은 더 강해질 것임을 예상하였고, 이를 확인하기 위하여, RGD-CSAP 펩타이드와 제1 펩타이드 및 제2 링커는 동일하지만, 상기 제2 펩타이드의 돌연변이를 사용한 제2 리간드 펩타이드를 설계하였다.
상기 제2 리간드 펩타이드는 제1 리간드 펩타이드에서 RGD 펩타이드의 돌연변이인 RAD 펩타이드를 사용하였다. 이러한 돌연번이 펩타이드는 세포의 표면에 존재하는 인테그린 단백질과의 결합 친화력이 약하다.
이러한 두 개의 리간드 펩타이드를 다양한 몰랄 비율로 혼합하여 탄소나노튜브 표면에 공동 조립(co-assembly)을 통해 결합시킨 실시예 6 내지 11의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)를 제조하였고, 이때 사용된 두 개의 리간드 펩타이드는 실험 상의 편의에 있어서 형광단으로 라벨링된 것을 사용하였다.
우선 상기 실시예 8의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD. 50%/SWNT)의 결합유무를 관찰하고자 하였다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에 따라 제조된 형광 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD/SWNT)의 FRET 측정 결과 그래프이다. 이때 청색은 실시예 3에 따라 제조된 형광 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD/SWNT)의 발광(emission) 스펙트럼이고, 적색은 실시예 4에 따라 제조된 형광 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RAD/SWNT)의 발광 스펙트럼이며, 보라색은 실시예 8로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD;RAD, 50%)/SWNT)의 발광 스펙트럼이다. l ex = 490 nm.
도 9에 나타난 바와 같이, 두 리간드 펩타이드에 결합한 각각의 형광단 사이에서 강한 FRET가 관찰되었다. 이는 상기 두 리간드 펩타이드가 FRET 쌍(55 Å)의 형광 거리 내에서 비규칙적으로 혼합되어 있음을 나타낸다.
실험예
7. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-1
이후, 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체가 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 처리하여 뉴런 분화를 향상시킬 수 있음을 조사하였다.
도 10은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT) 또는 실시예 4로부터 제조된 형광 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RGD/SWNT)를 처리한 후, 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다. 이때, 적색은 실시예 4로부터 제조된 형광 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(TAMRA-RGD/SWNT)에서 형광단이 TAMRA이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 hfNSC 세포 표면에 존재하는 베타1 인테그린이다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
도 10에 나타난 바와 같이, hNSC는 β-1 인테그린 클러스터링과 다중 상호작용을 통해 파생된 것으로, 상기 세포 표면에 존재하는 β-1 인테그린에 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)가 효율적으로 결합되어 있음을 확인하였다.
또한 상기 세포에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리한 두 번째 사진을 통해, 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)가 상기 세포의 β-1 인테그린에 효과적으로 결합함으로써, β-1 인테그린의 클러스터링을 효율적으로 유도하고 있음을 확인할 수 있다.
실험예
7. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-2
실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리함으로써, 자발적인 분화 조건 하에서 β-1 인테그린의 다중 클러스팅에 의한 hfNSC 뉴런 분화를 유도할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
도 11은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 6 일 동안 배양한 다음 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다.
이때, a) 이미지에서 적색은 GFAP(astrocyte) 뉴런 마커이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 Tuj1 뉴런 마커이다. 또한 b) 이미지에서 적색은 MAP2 뉴런 마커이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 Tuj1 뉴런 마커이다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
도 11에서 언급한 자발적 분화 조건은 염기성 섬유 아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor (bFGF))와 leukemia inhibitory factor(LIF) 등의 분열 촉진 인자(mitogenic)는 공급되지 않는 조건을 의미한다.
도 11에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)로 처리한 경우가 가장 우수한 hfNSC의 뉴런 분화가 발생하였음을 확인할 수 있었다.
실험예
8. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-3
도 12는 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 6 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 각 유전자(tuj1, MAP2, GFAP, olig2)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
이때, 도 12에 'mock'는 아무것도 처리하지 않은 hfNSC 세포이고, 'NGF'는 ???를 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-CSAP(0.1)'은 제조예 3으로부터 제조된 제1 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-CSAP(0.5)'은 제조예 3으로부터 제조된 제1 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(0.1)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(0.5)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD-CSAP(0.1)'은 제조예 4로부터 제조된 제2 리간드 펩타이드(RAD-CSAP)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD-CSAP(0.5)'은 제조예 4로부터 제조된 제2 리간드 펩타이드(RAD-CSAP)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD/SWNT(0.1)'은 실시예 2로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RAD/SWNT)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD/SWNT(0.5)'은 실시예 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RAD/SWNT)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이다.
도 12에 나타난 바와 같이, 0.5 μM 처리된 RGD/SWNT가 첨가되었을 때 뉴런 마커가 가장 크게 향상되었음을 확인하였다. 이에 반해 신경아교세포 마커(glial marker)인 GFAP(glial fibrillary acidic protein), Olig2(oligodendrocyte transcription factor)는 각 시료들 사이에서 크게 변화 관찰되지 않았다.
즉, hfNSC로부터 뉴런 세포로의 분화를 향상시키는데 가장 큰 영향을 미치고 있는 것는 것을 RGD/SWNT(실시예 1)임을 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브의 가장 바람직한 투여량은 0.5 μM 씩, 6일 동안 배양하여야 하는 것을 알 수 있다.
실험예
9. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-4
도 13은 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 다양한 농도로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리하였을 때, 상기 세포에서의 Tuj1/GAPDH 발현량을 나타낸 그래프이다. Tuj1은 대표적인 뉴런 세포의 마커이다.
도 14는 인간 태아 뇌에서 유래된 인간 태아 신경줄기세포(human fetal NSC, hfNSCs)에 다양한 농도로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)을 처리하였을 때, 상기 세포에서의 MAP2/GAPDH 발현량을 나타낸 그래프이다. MAP2는 대표적인 뉴런 세포의 마커이다.
도 13, 14에 나타난 바와 같이, 0.5 μM로 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)가 처리되었을 때, 가장 발현량이 높은 것을 확인하였다. 앞선 실험을 통해 확인하였던 바를 다시 한번 명확히 하였다.
실험예
10. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-5
도 15는 본 발명에 따른 두 개의 리간드 펩타이드 혼합비율을 달리하여 탄소나노튜브 상에 공동 조립을 통해 결합시켰을 때, 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 16은 도 15에서와 같이 두 개의 리간드 펩타이드의 혼합비율을 달리하여 탄소나노튜브 상에 공동 조립을 통해 결합시켜 제조된 실시예 1, 2 6-11의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD/SWNT)를 hfNSCs에 처리하여 측정된 tuj1/GAPDH의 발현량을 나타낸 그래프이다. n=3, *; p<0.05, **; p<0.01
도 15에 나타난 바와 같이, 탄소나노튜브 표면 상에 두 개의 리간드 펩타이드가 공동 조립되는 과정에 있어서, 제1 리간드 펩타이드의 혼합비율이 증가함에 따라, 탄소나노튜브 표면 상에 결합된 총 리간드 펩타이드 중에서 제1 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 증가하게 되면서, 상기 제1 리간드 펩타이드의 간격이 점차 가까워지게 되는 것을 알 수 있다.
반대로 제2 리간드 펩타이드의 혼합비율이 증가하면, 상기 탄소나노튜브 표면 상에 결합된 총 리간드 펩타이드 중에서 제1 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 낮아지게 되면서, 상기 제1 리간드 펩타이드의 간격이 점차 멀어지게 되는 것을 알 수 있다.
도 15에서는 두 개의 리간드 펩타이드의 혼합비율을 조절함으로써, 탄소나노튜브에 결합되는 제1 리간드 펩타이드 비율(%)을 달리한 다양한 구조를 제시하였고, 상기 탄소나노튜브의 표면에 결합한 제1 리간드 펩타이드 비율(%)이 hfNSC로부터 신경 세포로의 분화에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 도 16과 같은 실험을 진행하였다.
도 16을 살펴보면 상기 탄소나노튜브 표면 상에 결합한 전체 리간드 펩타이드들 중에서 제1 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)의 비율(%)이 증가할수록 hfNSC로부터 신경 세포 마커인 Tuj1의 발현이 점차 증가하고 있음을 확인하였다.
즉 도 16에서 표기한 (%)는 상기 탄소나노튜브 표면 상에 결합한 총 리간드 펩타이드들 중에서 제1 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)을 나타낸 것이다.
구체적으로 상기 탄소나노튜브 표면 상에 결합한 총 리간드 펩타이드들 중에서 제1 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 70%인 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)가 가장 신경세포 마커 발현이 최고임을 확인하였다.
결국, 제1 리간드 펩타이드 사이의 간격이 분화에 영향을 미치고 있음을 확인하였다. 상기 실시예 10의 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)이 상기 hfNSC 세포 표면에 존재하는 인테그린과 가장 우수한 다중 상호작용을 형성할 수 있는 구조임을 확인할 수 있다.
실험예
11. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-6
도 17은 피브로넥틴(FN)-폴리-L-라이신(PLL)-코팅된 기판 상에서, hfNSCs에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 3 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 tuj1의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 18은 피브로넥틴(FN)-폴리-L-라이신(PLL)-코팅된 기판 상에서, hfNSCs에 제조예 3, 4로부터 제조된 제1, 제2 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)(RAD-CSAP), 실시예 1, 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)(RAD/SWNT)를 처리한 후, 3 일 동안 배양한 다음 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 MAP2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
이때, 도 17, 18에 'mock'는 아무것도 처리하지 않은 hfNSC 세포이고, 'NGF'는 양성 대조군이며, 'RGD-CSAP(0.1)'은 제조예 3으로부터 제조된 제1 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-CSAP(0.5)'은 제조예 3으로부터 제조된 제1 리간드 펩타이드(RGD-CSAP)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(0.1)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(0.5)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD-CSAP(0.1)'은 제조예 4로부터 제조된 제2 리간드 펩타이드(RAD-CSAP)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD-CSAP(0.5)'은 제조예 4로부터 제조된 제2 리간드 펩타이드(RAD-CSAP)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD/SWNT(0.1)'은 실시예 2로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RAD/SWNT)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RAD/SWNT(0.5)'은 실시예 2로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RAD/SWNT)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이다.
이때. 상기 배지 접시의 표면에 hfNSCs 흡착을 위해 폴리-L-라이신(PLL, sigma) 20 ng/ml가 코팅되었다.
도 17, 18에 나타난 바와 같이, 피브로넥틴(FN, fibronectin)을 표면에 코팅한 것을 사용할 경우, 각 시료들 간에 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이를 통해 FN의 코팅이 hfNSC 분화과정에 영향을 미치고 있음을 알 수 있다. 이는 상기 FN이 다중 RGD 시퀀스를 포함하고 있기 때문이라 여겨진다.
실험예
12. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-7
도 19는 β-1 인테그린 항체의 첨가에 따라, hfNSCs에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 처리한 후, 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 Tuj1의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 20은 β-1 인테그린 항체의 첨가에 따라, hfNSCs에 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 처리한 후, 이를 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 MAP2의 발현량을 나타낸 그래프이다.(**; p < 0.01 vs β-1 인테그린 항체를 처리하지 않은 시료, +; p < 0.05 vs β-1 인테그린 항체를 포함하지 않은 mock 시료).
도 19, 20에서 β-1 인테그린 항체를 첨가한 것은 회색 막대 그래프이고, β-1 인테그린 항체를 첨가하지 않은 것은 흑색 막대 그래프이다.
도 19 및 20에 나타난 바와 같이 β-1 인테그린 항체의 첨가는 줄기세포 표면 상에 존재하는 β-1 인테그린과 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체의 결합을 방해하고 억제하였다. 그 결과 hfNSCs의 분화가 저해되는 문제가 발생하는 것을 확인하였다.
실험예
13. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-8
도 21은 hNSCs(n=3)의 미토콘트리아(mitochondrial) 메타볼릭 활성을 MTT로 측정하여, 세포 생존률을 나타낸 결과 그래프이다. 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)로 처리하고 하루 배양한 후 바로 측정하였다.(*; p < 0.05, **; p < 0.01 vs. mock group).
세포 생존율은 마이크로플레이트 리더(Infinite M200 Pro, Tecan, Maennedorf, Switzerland)를 사용하여 각 시료의 595 ㎚에서의 최적 흡광도를 측정하여 확인하였다.
이때, 도 21에 'mock'는 아무것도 처리하지 않은 hfNSC 세포이고, 'RGD-SWNT(0.1)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 0.1 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(0.5)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 0.5 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(1.0)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 1.0 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(5.0)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 5.0 μM 처리한 hfNSC 세포이며, 'RGD-SWNT(10.0)'은 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)를 10.0 μM 처리한 hfNSC 세포이다.
도 21에 나타난 바와 같이 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 농도 증가가 hfNSCs의 생존률(viability)을 감소시키고 있음을 확인하였다. 그런데, 0.5 μM의 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)에서는 세포 독성이 관찰되지 않았다.
이를 통해 세포의 분화는 최대한 촉진하고, 세포 독성은 나타내지 않는 가장 바람직한 실시예 1로부터 제조된 리간드 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD/SWNT)의 농도는 0.5 μM임을 알 수 있다.
실험예
14. 줄기세포로부터 신경세포로의 분화조절-9
인간 유도 다기능성 줄기세포-유래된 신경 전구세포(human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells; hiPSC-NPCs)에 대해서도 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체가 분화 촉진 활성을 나타낼지 여부를 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 진행하였다.
도 22는 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 6일 후, 면역 형광 염색법을 통해 확인한 결과이미지이다. 이때, 적색은 MAP2 마커이고, 청색은 DAPI로 염색된 hfNSC 세포의 핵이며, 초록색은 Tuj1 마커이다. 스케일 바는 100 ㎜이다.
도 23 및 도 24는 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 6일 후, 이를 qRT-PCR을 이용하여 Tuj1/GAPDH 발현량(도 23), MAP2/GAPDH 발현량(도 24)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 22 내지 도 24에 나타난 바와 같이, hiPSC-NPCs 세포에서도 Tuj1, MAP2의 발현이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 구체적으로 'Mock'로 표기된 아무것도 처리하지 않은 hiPSC-NPCs 세포에서는 거의 발현되지 않았으나, 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하고 나서 신경세포 마커인 Tuj1, MAP2가 2배, 최대 3 배 이상 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다.
즉, 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 두 개의 리간드 펩타이드를 포함하고 있는, 다중 상호작용 기능을 갖는 것이 가장 바람직한 것을 알 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체는 인간 유도 다기능성 줄기세포(hiPSC)의 자가치료를 가능하게 하는 나노물질 플랫폼 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진하여 치료를 위한 개선된 치료제와 같은 의학 분야에도 응용될 수 있음을 확인하였다.
실험예
15. 인간 만능줄기세포로부터 분화된 신경세포의 전기생리학적 특성평가
도 25 및 도 26은 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포에 대해 전기물리학적 특성 분석을 실시한 결과 그래프이다. 이때 도 25는 소듐 채널-매개의 전류를 측정하기 위한 것이고, 도 26은 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포의 활성 전위(potential) 스파이크(spike)를 기록한 것이다.
도 25는 전압-클램프 모드에서 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포로부터 전압 활성화 전류가 관찰되었다.
도 26에서 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포에서 활성화된 전위(potential)이 관찰되었다.
이후 상기 도 25, 26에서 관찰된 결과들이 전압-활성화된 Na+ 채널인지 여부를 확인하기 위하여, Na+ 전류를 tetrodotoxin(TTX) 처리를 통해 차단하였다. 상기 TTX를 처리하고 난 후, 상기 Na+ 채널에 의한 전류가 블록되어도, 전위가 활성화되었다.
그러므로 hiPSC-NPCs에 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리하여 분화시킨 6일 후의 신경 유사세포에는 Na+ 채널이 존재하고 있음을 알 수 있다.
또한 본 발명에 따른 실시예 10으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(RGD:RAD, 70%/SWNT)를 처리함으로써 hiPSC-NPCs가 전기적 흥분성 세포로 분화되었음을 확인할 수 있다.
실험예
16. 온도 변화에 따른 유체역학적
직경
변화.
도 27은 온도에 따라 제조예 1. 2로부터 제조된 광열변환이 가능한 덴드리머 펩타이드의 평균 직경의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 27에 나타난 바와 같이 상온에서 제조예 1의 dendri(PEO)6-CSAP와 제조예 2의 dendri(PEO)10-CSAP는 모두 약 10 내지 20 ㎚의 작은 응집체로 존재하였다. 허나 제조예 1의 dendri(PEO)6-CSAP는 DLS 측정과정에서 온도를 85 ℃까지 상승하여도 평균 직경의 변화가 거의 관찰되지 않았다.
이에 반해, 제조예 2의 dendri(PEO)10-CSAP는 45 ℃부터 열에 따라 극적(약 50-200배)으로 크기가 상승하는 것을 확인할 수 있는데, 이러한 행동은 제조예 2의 dendri(PEO)10-CSAP의 LCST(~45 ℃)하에서 PEO 시그먼트의 수축이 발생함에 의해 야기된 현상이라 여겨진다.
도 28은 실시예 12로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(dendri(PEO)10-CSAP/SWNT)의 온도에 따른 평균 직경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 L은 25 ℃ 온도를 의미하고, H는 55 ℃ 온도를 의미한다.
도 28에 나타낸 바와 같이 실시예 12로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(dendri(PEO)10-CSAP/SWNT)의 평균 직경이 반복적인 L(25 ℃)과 H(55 ℃)의 온도 변화에 따라 변화하고 있음을 확인하였다. 게다가 반복적인 온도 변화에도 불구하고 평균 직경이 가역적으로 변화하고 있음도 확인하였다.
실험예
17.
SWNT
의
광열
변환 효과 분석
도 29는 단일벽 탄소나노튜브 0 ㎎, 5 ㎎ 및 10 ㎎ 포함하는 용액에 근적외선(NIR) 조사에 의해 광열 가열할 경우, 시간에 따른 온도변화량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 29에 나타난 바와 같이 탄소나노튜브의 함량이 증가함에 따라 온도변화량이 증가하는 것을 확인하였고, 이를 통해 탄소나노튜브(바람직하게는 단일벽 탄소나노튜브)에서 근적외선으로부터 열로 광열 변환이 발생함을 알 수 있다.
실험예
18.
근적외선
조사에 따른
실시예
3의
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체의 특성 분석
시료를 Chamlide 챔버(Live Cell Instrument, Korea) 내부에 위치시켰고, 상기 램프와 상기 시료 사이의 거리를 최적화하였다. IR 조사는 8 분동안 적용되었고, 상기 램프는 30 초 마다 꺼짐과 켜짐을 반복했다. 디지털 온도계(thermometer)(Summit, SDT25, Seoul, Korea)는 IR 조사 동안 온도를 측정하기 위해 사용되었다. IR 조사에 의해 유도된 온도 차이는 하기 식 1과 같이 계산할 수 있다.
[식 1]
상기 식 1에서,
Tn은 측정된 시간에서의 온도이고,
T0은 초기 온도이다.
도 30은 근적외선 조사 유무(on/off) 따른 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)의 형광세기 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 30에 나타난 바와 같이 반복적인 NIR 조사에 따라 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)의 형광 발광이 감소하거나, 증가하였다. 이는 FAM-RGD의 퀀칭과 디퀀칭에 의한 것이라 보여진다.
구체적으로 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)에 NIR이 조사되면 우선 SWNT의 광열변환에 따른 온도 증가가 발생하게 되고, 이러한 온도 변화에 의해 dendri(PEO)10-CSAP가 수축되거나 팽창하게 되며, 이후 이러한 dendri(PEO)10-CSAP의 팽창, 수축에 따라 FAM-RGD-CSAP가 노출되거나 노출되지 않거나 하게됨으로써, 형광세기가 변화하게 되는 것이다.
다시 말해 근적외선(NIR)이 조사됨에 의해, 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)에서 FAM-RGD-CSAP의 노출정도를 제어할 수 있다.
실험예
18.
근적외선
조사에 따른
실시예
3의
펩타이드
-탄소나노튜브 복합체의 분화 특성 분석
도 31, 도 32는 hfNSC에 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)을 처리하고 6 일 후, 이를 qRT-PCR을 이용하여 Tuj1/GAPDH 발현량(도 31), MAP2/GAPDH 발현량(도 32)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
대조군으로 'mock' 아무것도 처리하지 않은 것과, 'RGD hybrid' 실시예 1의 RGD/SWNTs로 처리한 것을 사용하였다.
이때, IR 조사 조건을 달리하였는데 'without IR'은 IR을 처리하지 않은 것이고, 'IR, 5 min'은 IR을 5 분 조사한 것이며, 'IR, 15 min'은 IR을 15 분 동안 조사한 것이며, 'IR, 15 min X 3'은 IR을 15 분간 3번에 나누어 조사한 것이다.
도 31 및 도 32에 나타난 바와 같이 실시예 1의 RGD/SWNTs와 달리, 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)는 광열 변환에 따라 RGD-CSAP의 노출정도를 제어할 수 있다는 특성을 갖는다.
이러한 특성 차이를 통해 실시예 13으로부터 제조된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체(FAM-RGD:dendri(PEO)10/SWNT;FAM-RGD 비율 70%)는 탄소나노튜브 표면에 결합되어 있는 RGD-CSAP 리간드 펩타이드의 활성 유무를 적외선 조사를 통해 제어할 수 있고, hfNSC로부터 신경세포로의 우수한 분화를 야기하는 매우 우수한 효과를 갖는다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
<120> peptide-carbon nanotube hybrid and method for the differentiating
of stem cell or progenitor cell to neuro cell
<130> HPC6678
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sheet segment
<400> 1
Phe Lys Phe Phe Lys Phe Glu Phe
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sheet segment
<400> 2
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sheet segment
<400> 3
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sheet segment
<400> 4
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sheet segment
<400> 5
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD peptide
<400> 6
Arg Gly Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD peptide
<400> 7
Arg Ala Asp Ser Gly Arg Ala Asp Ser
1 5
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD peptide
<400> 8
Arg Gly Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD peptide
<400> 9
Arg Ala Asp Ser Gly Arg Ala Asp Ser Gly Arg Ala Asp Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD peptide
<400> 10
Arg Gly Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Gly Arg
1 5 10 15
Gly Asp Ser
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD peptide
<400> 11
Arg Ala Asp Ser Gly Arg Ala Asp Ser Gly Arg Ala Asp Ser Gly Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ser
Claims (16)
- (a) 덴드리머 펩타이드;
적어도 하나의 (b) 리간드 펩타이드; 및
(c) 탄소나노튜브를 포함하고,
상기 탄소나노튜브 표면에 상기 (a) 덴드리머 펩타이드와 (b) 리간드 펩타이드가 공동으로 조립(co-assemble)되고, 결합되어 형성된 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 선형 폴리(에틸렌옥사이드), 제1 링커 및 제1 펩타이드를 포함하고,
상기 제1 펩타이드는 5 내지 10 아미노산 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하고,
상기 제1 링커는 상기 제1 펩타이드의 C 말단에 결합된 제1 라이신 잔기; 및 상기 제1 라이신 잔기의 주쇄 아민기와 측쇄 아민기에 각각 결합된 제2, 3 라이신 잔기를 포함하고,
상기 제1 링커 제2, 3 라이신 잔기의 주쇄 아민기와 측쇄 아민기에 상기 선형 폴리(에틸렌옥사이드)가 결합되어, 상기 선형 폴리(에틸렌옥사이드)와 상기 제1 펩타이드를 연결하는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 제1 펩타이드 하나를 기준으로 4 개의 선형 폴리(에틸렌옥사이드)를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제3항에 있어서,
상기 선형 폴리(에틸렌옥사이드)는 아래 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체.
[화학식 1]
R-[-CH2CH2O-]n-
상기 화학식 1에서,
상기 n은 1 내지 20이고,
상기 R은 수소 또는 아세틸기일 수 있다. - 제3항에 있어서,
상기 제1 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 5 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 하기 구조식 1 내지 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체.
[구조식 1] dendri(PEO)6-CSAP
[구조식 2] dendri(PEO)10-CSAP
- 제1항에 있어서
상기 (b) 리간드 펩타이드는 제1 펩타이드; 제2 링커 및 제2 펩타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제7항에 있어서,
상기 제1 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 5 중에서 선택되는 어느 하나이고,
상기 제2 링커는 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Ser, Gly-Ser-Gly 및 Gly-Ser-Gly-Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
상기 제2 펩타이드는 하기 서열번호 6 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 (b) 리간드 펩타이드는 하기 구조식 3 또는 구조식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체.
[구조식 3] RGD-CSAP
[구조식 4] GAD-CSAP
상기 구조식 3, 4에서
상기 R은 수소 또는 아세틸기이다. - 제1항에 있어서,
상기 탄소나노튜브는 단일벽 탄소나노튜브인 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 탄소나노튜브의 평균 직경은 0.1 내지 5 ㎚인 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체에서 상기 탄소나노튜브 표면에 공동 조립되어 결합된 총 펩타이드 중에서 상기 (b) 리간드 펩타이드가 차지하는 비율(%)이 60 내지 80%인 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체에서 상기 (a) 덴드리머 펩타이드는 1 내지 45 ℃에서 평균 직경이 10 내지 30 ㎚이고, 50 내지 100 ℃에서는 평균 직경이 100 내지 2500 ㎚로 응집되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-탄소나노튜브 복합체. - Ⅰ) 제1항에 따른 펩타이드-탄소나노튜브 복합체를 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 배지에 첨가하는 단계;
Ⅱ) 상기 펩타이드-탄소나노튜브 복합체가 첨가된 배지에 적외선을 조사하여, 상기 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화를 유도 및 촉진하는 단계;를 포함하는 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화 방법. - 제14항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 신경줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화 방법. - 제14항에 있어서,
상기 신경세포는 Tuj1, MAP2의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160100280A KR101911472B1 (ko) | 2016-08-05 | 2016-08-05 | 펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160100280A KR101911472B1 (ko) | 2016-08-05 | 2016-08-05 | 펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180016177A true KR20180016177A (ko) | 2018-02-14 |
| KR101911472B1 KR101911472B1 (ko) | 2018-10-24 |
Family
ID=61229865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160100280A KR101911472B1 (ko) | 2016-08-05 | 2016-08-05 | 펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101911472B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115236231A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-10-25 | 成都普康生物科技有限公司 | 一种Fmoc-NH-PEGn-丙酸同系物的分离方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101566345B1 (ko) | 2014-03-21 | 2015-11-23 | 한국생명공학연구원 | 다가성 리간드의 내부 표면작용기와 암 표적 리간드 단위의 비율을 조절하여 암 진단 효율을 향상시키는 방법 |
-
2016
- 2016-08-05 KR KR1020160100280A patent/KR101911472B1/ko active IP Right Grant
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115236231A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-10-25 | 成都普康生物科技有限公司 | 一种Fmoc-NH-PEGn-丙酸同系物的分离方法 |
| CN115236231B (zh) * | 2022-07-21 | 2024-01-05 | 成都普康生物科技有限公司 | 一种Fmoc-NH-PEGn-丙酸同系物的分离方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101911472B1 (ko) | 2018-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11660355B2 (en) | Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery | |
| Hack et al. | Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6 | |
| von Bohlen Und Halbach | Immunohistological markers for staging neurogenesis in adult hippocampus | |
| Polak et al. | Nanometric agents in the service of neuroscience: manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles | |
| Pruss et al. | Mitogens for glial cells: a comparison of the response of cultured astrocytes, oligodendrocytes and Schwann cells | |
| Arsenijevic et al. | Isolation of multipotent neural precursors residing in the cortex of the adult human brain | |
| Rutka et al. | Effects of antisense glial fibrillary acidic protein complementary DNA on the growth, invasion, and adhesion of human astrocytoma cells | |
| Kunzelmann et al. | Coexpression of connexin45 and-32 in oligodendrocytes of rat brain | |
| Chen et al. | Porphyra polysaccharide-derived carbon dots for non-viral co-delivery of different gene combinations and neuronal differentiation of ectodermal mesenchymal stem cells | |
| Sahab Negah et al. | Enhancement of neural stem cell survival, proliferation, migration, and differentiation in a novel self-assembly peptide nanofibber scaffold | |
| WO2011013698A1 (ja) | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 | |
| Malchenko et al. | Onset of rosette formation during spontaneous neural differentiation of hESC and hiPSC colonies | |
| AU676847B2 (en) | Dorsal tissue affecting factor and compositions | |
| Zhao et al. | Expression of Ski and its role in astrocyte proliferation and migration | |
| KR101911472B1 (ko) | 펩타이드-탄소나노튜브 복합체 및 이를 이용한 줄기세포 또는 전구세포로부터 신경세포로의 분화방법 | |
| CN113789373B (zh) | 一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用 | |
| CN111732660B (zh) | 骨髓间充质干细胞和单克隆抗体联合治疗癌症 | |
| Marchal-Victorion et al. | The human NTERA2 neural cell line generates neurons on growth under neural stem cell conditions and exhibits characteristics of radial glial cells | |
| EP1090105A1 (en) | Ependymal neural stem cells and method for their isolation | |
| Park et al. | Non-viral, direct neuronal reprogramming from human fibroblast using a polymer-functionalized nanodot | |
| NO329028B1 (no) | Anvendelse av IL6RIL6 kimaer for fremstillingen av et medikament til behandlingen og/eller forhindringen av nevrologiske sykdommer | |
| Donaldson et al. | Purified mouse dopamine neurons thrive and function after transplantation into brain but require novel glial factors for survival in culture | |
| AU2022308704A1 (en) | Inhibitors and uses thereof | |
| Ye et al. | HIF-1-modified BMSCs improve migration and reduce neuronal apoptosis after stroke in rats | |
| Shin et al. | Peptide-mediated targeted delivery of SOX9 nanoparticles into astrocytes ameliorates ischemic brain injury |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |