KR20180015613A - 거핵구를 포함하는 배양물의 제조 방법 및 이를 사용한 혈소판의 제조 방법 - Google Patents
거핵구를 포함하는 배양물의 제조 방법 및 이를 사용한 혈소판의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈소판 산생능이 증대된 거핵구의 제조 방법이며, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 거핵구를 포함하는 배양물의 제조 방법 및 이를 사용한 혈소판의 제조 방법에 관한 것이다.
혈액 관련 질환을 치료하는 경우, 혹은 외과적인 치료를 행하는 경우, 치료에 제공되는 혈구계 세포가 필요해진다. 혈구계 세포 중에서도, 혈액 응고(지혈)를 위하여 필수 세포인 혈소판, 혈소판 전구체(proplatelet), 나아가 혈소판을 산생하는 세포인 거핵구 세포는 특별히 요구가 높은 세포이다. 특히 혈소판은, 백혈병, 골수 이식, 항암 치료 등에 있어서의 수요가 많아，안정 공급의 필요성은 높다.
ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포는, 혈소판 등의 혈구계 세포를 인공적으로 제조하기 위한 소스로서 이용되고 있다. 근년에는, iPS 세포의 수립에 의해, 재생 의료에 있어서의 세포 요법의 중요한 소스로서 다능성 줄기 세포의 유용성이 한층 주목을 받아 왔다. 지금까지, 예를 들어 타카야마(Takayama) 등이, 인간 ES 세포로부터 거핵구 세포 및 혈소판을 분화 유도하는 데 성공하고 있다 (Takayama N. et al., Blood, 111, pp.5298-5306, 2008).
Takayama N. et al., Blood, 111, pp.5298-5306, 2008
트롬보포이에틴(TPO) 등의 사이토카인은, 조혈 전구 세포를 거핵구 세포로 특이적으로 분화 유도할 수 있다(Takayama N. et al., Blood(상기 문헌)). 그러나, 종래의 분화 유도 방법으로 산생된 거핵구 세포는 분화 형질(CD41a 양성, CD42a 양성, 또는 CD42b 양성)을 장기간 유지하는 것이 곤란했다.
본 발명자들은, 거핵구 특이적인 세포 표면 마커를 발현하지 않는 세포만이 치사하는 조건 하에서 거핵구 세포로의 분화 유도를 행한바, 놀랍게도 얻어진 거핵구 세포는 분화 형질을 장기간 안정되게 유지할 수 있고, 또한 세포당 혈소판 산생능(production capacity)이 매우 높음을 알아내고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본원은 이하의 발명을 포함한다.
[1] 거핵구 또는 거핵구 전구 세포의 배양물의 제조 방법이며, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군을 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
[2] 상기 세포군이, 세포 독성을 나타내는 약제에 대한 내성 유전자로 형질 전환되어 있으며, 해당 약제 내성 유전자가, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 배치되어 있고, 상기 배양 공정에서 상기 약제가 첨가되는, [1]에 기재된 방법.
[3] 상기 세포군이, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포를 치사시키는 유전자로 형질 전환되어 있으며, 해당 유전자가, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포에서 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 배치되어 있는, [1]에 기재된 방법.
[4] 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자가, 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커를 코드하는 유전자인, [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 방법.
[5] 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커가 CD41a, CD42a 및/또는 CD42b인, [4]에 기재된 방법.
[6] 상기 거핵구로의 분화능을 갖는 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, CD34 양성 세포 및 거핵구 전구 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 방법.
[7] 상기 배양 공정이 혈청 및/또는 피더 세포의 부재 하에서 실시되는, [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 방법.
[8] 제조되는 배양물 중의 거핵구가 분화 형질을 유지하고 있으며, 또한 그 혈소판 산생능이 증대되어 있는, [1] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 방법.
[9] 상기 세포군이 상기 프로모터와 상기 약제 내성 유전자 또는 치사 유전자를 작용 가능하게 연결한 벡터로 형질 전환되어 있는, [2] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 방법.
[10] 상기 약제 내성 유전자가 퓨로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 블라스티시딘 S 내성 유전자 및 히스티디놀 내성 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, [2], [4] 내지 [9] 중 어느 것에 기재된 방법.
[11] 상기 치사 유전자가 HSV-TK 유전자, 시토크롬 C 유전자 및 Mule/ARF-BP-1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, [3] 내지 [9] 중 어느 것에 기재된 방법.
[12] 상기 배양 공정이 TPO 및 SCF를 함유하는 배양액 중에서 실시되는, [1] 내지 [11] 중 어느 것에 기재된 방법.
[13] 상기 세포군이, 조혈 전구 세포에 c-MYC, BMI1 및 BCL-xL을 도입하여 제조되는 세포를 포함하는, 청구항 1에 기재된 방법.
[14] 혈소판의 제조 방법이며, [1] 내지 [10] 중 어느 것에 기재된 방법으로 제조된 거핵구를 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[15] 거핵구 또는 거핵구 전구 세포의 확대 배양 방법이며, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군을 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
[16] 상기 세포군이, 세포 독성을 나타내는 약제에 대한 내성 유전자로 형질 전환되어 있으며, 해당 약제 내성 유전자가, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 배치되어 있고, 상기 배양 공정에서 상기 약제가 첨가되는, [15]에 기재된 방법.
[17] 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자가, 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커를 코드하는 유전자인, [15] 또는 [16]에 기재된 방법.
[18] 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커가 CD41a, CD42a 및/또는 CD42b인, [17]에 기재된 방법.
[19] 상기 거핵구로의 분화능을 갖는 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, CD34 양성 세포 및 거핵구 전구 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, [15] 내지 [18] 중 어느 것에 기재된 방법.
[20] 상기 배양 공정이 혈청 및/또는 피더 세포의 부재 하에서 실시되는, [15] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 방법.
[21] 확대 배양 후의 거핵구가 분화 형질을 유지하고 있으며, 또한 그 혈소판 산생능이 증대되어 있는, [15] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 방법.
[22] 상기 세포군이 상기 프로모터와 상기 약제 내성 유전자를 작용 가능하게 연결한 벡터로 형질 전환되어 있는, [15] 내지 [21] 중 어느 것에 기재된 방법.
[23] 상기 약제 내성 유전자가 퓨로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 블라스티시딘 S 내성 유전자 및 히스티디놀 내성 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, [15] 내지 [22] 중 어느 것에 기재된 방법.
[24] 상기 배양 공정이 TPO 및 SCF를 함유하는 배양액 중에서 실시되는, [15] 내지 [23] 중 어느 것에 기재된 방법.
[25] 상기 세포군이, 조혈 전구 세포에 c-MYC, BMI1 및 BCL-xL을 도입하여 제조되는 세포를 포함하는, [15] 내지 [24] 중 어느 것에 기재된 방법.
[26] 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군을 배양함으로써 제조되는 배양물.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 장기간 분화 형질의 유지가 가능한 거핵구 세포가 제조된다. 제조 과정에서 다른 세포계로 분화되는 세포가 배제되는 것에 의한, 세포 집단당 혈소판 생산량의 증대뿐만 아니라, 본 발명에 의해 얻어지는 거핵구는, 세포당 혈소판 산생능이 증대된 점에서 매우 놀라운 것이다. 이들 관점에서, 본원 발명의 제조 방법은 종래 기술과 비교하여 매우 유리한 것이라고 할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조 방법은 자기 증식능을 갖는 거핵구 세포주의 수립 효율을 향상시킬 수도 있다. 또한, 본 발명의 제조 방법은, 혈청 및 피더 세포 없이 거핵구 세포주를 대량으로 증식시킬 수도 있기 때문에, 얻어진 혈소판을 임상적으로 사용하는 경우에 면역원성의 문제가 발생하기 어렵다는 이점도 있다. 피더 세포를 사용하지 않고 세포 배양 또는 혈소판 생산을 할 수 있으면, 플라스크 등에서의 부유 배양이 가능해져, 그 결과, 제조 비용을 억제할 수 있음과 함께, 혈소판의 대량 생산이 가능해진다.
도 1은 CD41a 프로모터-퓨로마이신 렌티바이러스 벡터.
도 2는 유세포 분석기(flow cytometer)에 의한 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 도입 후의 거핵구 세포의 분화 형질의 확인.
도 3은 유세포 분석기에 의한 피더 세포 존재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 CD41a 양성 형질의 확인.
도 4는 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 도입 후의 배양 경과 시의 세포수의 변화.
도 5는 유세포 분석기에 의한, 피더 세포 부재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 CD41a 양성 형질의 확인.
도 6a는 유세포 분석기에 의한, 피더 세포 존재 하 및 부재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 CD41a 양성 형질의 비교.
도 6b는 피더 세포의 존재 하 및 부재 하에서의 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 도입 후의 배양 경과 시의 세포수의 변화의 비교.
도 7은 진탕 배양(플라스크)에서의 배양 경과 시의 세포수의 변화.
도 8은 진탕 배양(백)에서의 배양 경과 시의 세포수의 변화.
도 9는 피더 세포 존재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 혈소판 산생수.
도 10은 피더 세포 부재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 혈소판 산생수.
도 2는 유세포 분석기(flow cytometer)에 의한 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 도입 후의 거핵구 세포의 분화 형질의 확인.
도 3은 유세포 분석기에 의한 피더 세포 존재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 CD41a 양성 형질의 확인.
도 4는 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 도입 후의 배양 경과 시의 세포수의 변화.
도 5는 유세포 분석기에 의한, 피더 세포 부재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 CD41a 양성 형질의 확인.
도 6a는 유세포 분석기에 의한, 피더 세포 존재 하 및 부재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 CD41a 양성 형질의 비교.
도 6b는 피더 세포의 존재 하 및 부재 하에서의 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 도입 후의 배양 경과 시의 세포수의 변화의 비교.
도 7은 진탕 배양(플라스크)에서의 배양 경과 시의 세포수의 변화.
도 8은 진탕 배양(백)에서의 배양 경과 시의 세포수의 변화.
도 9는 피더 세포 존재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 혈소판 산생수.
도 10은 피더 세포 부재 하에서 얻어진 거핵구 세포의 혈소판 산생수.
(거핵구 세포의 제조 방법)
본 발명에 관한 거핵구의 제조 방법은, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군을 배양하는 공정을 포함한다. 거핵구 세포에 특이적으로 발현하는 유전자로서, 예를 들어 CD41a, CD42a, CD42b, CD9, CD61, CD62P 등의 세포 표면 마커나, 거핵구 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 GATA1, NF-E2, β-튜불린(beta-tubulin), 혈소판 인자 4 등이 예시된다. 거핵구 세포 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포의 치사 조건은, 거핵구 이외의 세포 또는 거핵구로 분화되지 않는 세포에 대해서만 치사 작용을 나타내고, 거핵구로 분화되는 세포, 거핵구 전구 세포, 거핵구 세포, 또는 성숙한 거핵구 세포 등에 치사 작용을 나타내지 않는다는 조건이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 거핵구 세포, 거핵구 전구 세포 등에만 약제 내성을 부여한 후, 대응하는 약제로 원하지 않는 세포를 사멸시키는 계나, 원하지 않는 세포에 있어서만 치사성의 유전자가 발현되는 계가 상정된다.
즉, 본 발명의 제1 형태에 있어서는, 거핵구 세포 특이적으로 활성화되는 프로모터에 의해 약제 내성 유전자가 구동되는 배양계에 있어서, 대응하는 약제의 존재 하에서, 거핵구 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포 또는 거핵구 세포를 포함하는 세포군을 배양함으로써 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포만을 사멸시킬 수 있다. 이러한 배양계는, 예를 들어 약제 내성 유전자를 거핵구 세포 특이적인 발현을 하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 둠으로써 구축할 수 있다. 그 결과, 거핵구 특이적인 세포 표면 마커를 발현하는 세포에만 약제 내성을 부여할 수 있다. 바람직한 형태에 있어서, 약제 내성의 부여는, 프로모터와, 그 하류에 배치된 약제 내성 유전자가 작용 가능하게 연결되어 있는 벡터를 배양 전의 세포에 도입함으로써 행하여진다.
거핵구 세포 특이적으로 활성화되는 프로모터로서, 인테그린 αIIBβ3(CD41a) 유전자의 프로모터 영역을 들 수 있다(Wilcox D.A., et al., Blood(2000), Fang J., et al., Blood(2005)). 기타, 거핵구 세포 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커인 CD42a 유전자, CD42b 유전자 등의 프로모터 또는 거핵구 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 GATA1, NF-E2, β-튜불린, 혈소판 인자 4 등을 코드하는 유전자의 프로모터를 본 발명에 있어서 사용해도 된다.
약제 내성 유전자의 예로서, 퓨로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 블라스티시딘 S 내성 유전자 및 히스티디놀 내성 유전자 등을 들 수 있다. 각 유전자에 대응하는 약제는, 배양 전의 세포가 상기 유전자로 형질 전환된 후에 배지 중에 첨가된다.
본 발명의 제2 형태에 있어서는, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포에 특이적인 프로모터에 의해 치사 유전자가 구동되는 배양계에 있어서, 거핵구 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포 또는 거핵구 세포를 배양함으로써, 당해 프로모터가 기능하는 세포만을 사멸시켜, 결과적으로 거핵구 세포를 농축할 수 있다. 이러한 프로모터로서, 거핵구 특이적인 세포 표면 마커를 발현하지 않는 세포에 특이적인 세포 표면 마커(예를 들어 적혈구의 경우, CD235 등)의 프로모터 등을 들 수 있다. 이러한 프로모터의 제어 하에 치사 유전자, 예를 들어 HSV-TK 유전자, 시토크롬 C 유전자, Mule/ARF-BP-1 유전자를 배치하여 구동시킴으로써 거핵구 세포로 분화되지 않는 세포를 배제할 수 있다.
약제 내성 유전자나 치사 유전자의 발현은, 유전자 발현 유도 시스템, 예를 들어 텟-온(Tet-on)(등록 상표) 또는 텟-오프(Tet-off)(등록 상표) 시스템 등으로 조절할 수 있다.
상기 형태에 있어서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군은 목적의 유전자에 의해 형질 전환된다. 본 발명의 배양 공정에 있어서 목적 유전자를 세포 내에서 강제 발현시키는 경우, 당업자에게 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스나 레트로바이러스 등에 의한 유전자 도입 시스템을 이용하여, 목적의 유전자를 세포 내에 도입하여 발현시켜도 된다. 바이러스 유전자 도입 벡터에 의해 유전자 발현을 행하는 경우, 벡터는 적당한 프로모터의 하류에 작용 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함할 수 있다. 여기서, 「작용 가능」에 연결한다란, 해당 프로모터에 의해 목적 유전자가 시스에 지배되고, 목적 유전자의 원하는 발현이 실현되도록 프로모터와 목적 유전자를 연결함을 의미한다. 본 발명의 실시에 있어서는, 예를 들어 CMV 프로모터, EF1 프로모터 등을 사용하여 항상적으로 목적 유전자를 발현해도 되고, 혹은 테트라사이클린 등의 약제 응답 엘리먼트 등의 트랜스 인자에 의해 활성 제어되는 엘리먼트의 지배 하에, 적당한 프로모터(유도형의 프로모터)를 배치하는데, 예를 들어 약제 첨가 등의 제어에 의해 목적 유전자를 유도적으로 발현시킬 수도 있다. 원하는 목적 유전자의 발현 제어를 실현하는 것을 의도하는 당업자라면 수많이 존재하고 있는 유전자 발현 시스템 중에서 적당한 시스템을 용이하게 선택할 수 있다. 시판되고 있는 키트 등을 사용해도 된다. 또한, 발현 제어의 목적 유전자인 약제 내성 유전자 또는 치사 유전자와, 후술하는 암 유전자 등을 각각 별도의 벡터에 삽입해도 되고, 동일한 벡터에 삽입해도 된다.
또한, 거핵구 세포 내에 있어서의 유전자의 발현 억제는, 예를 들어 전술한 유도적인 발현 시스템에 의한 발현의 유도를, 약제 등의 제거에 의해 해제함으로써 달성해도 된다. 혹은, 도입한 암 유전자 등을 Cre/lox 시스템 등을 사용하여 제거하고, 이들 유전자의 발현을 억제적으로 제어해도 된다. 유전자의 발현을 억제적으로 조절하기 위하여, 시판되고 있는 키트 등을 적절히 사용할 수도 있다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 「거핵구로의 분화능을 갖는 세포」란, 조혈 줄기 세포에서 유래하는 세포이며, 분화 유도 조건에 따라서는 거핵구로 분화될 수 있는 세포를 의미하고, 예로서 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, CD34 양성 세포, 거핵구 세포·적아구 전구 세포(MEP), 거핵구 전구 세포 등을 들 수 있다. 거핵구로의 분화능을 갖는 세포는 공지의 방법으로 얻을 수 있고, 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈 등으로부터 단리되는 것 이외에도, ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도할 수도 있다. 거핵구로의 분화능을 갖는 세포로서 조혈 전구 세포를 사용하는 경우, 본 발명의 배양 공정 전에 미리 c-MYC, BMI1 및 BCL-xL을 세포에 도입해도 된다.
거핵구 세포에 특이적인 세포 표면 마커를 발현하지 않는 세포는, 최종적으로 거핵구로 분화되지 않는, CD41 음성/CD42 음성 세포, 예를 들어 적혈구 또는 그 전구 세포를 포함하는데, 반드시 조혈 줄기 세포 유래의 세포에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 약제 내성 유전자를 사용하는 형태에 있어서는, 거핵구로의 분화능을 갖는 세포에만 약제 내성이 부여되기 때문에, 당해 세포 이외의 모든 세포를 배제할 수 있다.
본 발명에 의해 제조되는 배양물 중의 거핵구는, 거핵구 세포뿐만 아니라, 성숙 전의 혈소판 산생능이 불충분한 거핵구 전구 세포나, 다핵화가 진행된 거핵구 세포 등을 포함하는 세포 집단으로서 존재할 수 있다. 배양물에 포함되는 전체 세포 중 거핵구 또는 거핵구 전구 세포, 특히 거핵구가 차지하는 비율은 50％ 이상, 예를 들어 60％, 70％, 80％, 90％ 이상인 것이 바람직하다. 얻어진 거핵구는, 거핵구 세포에 특이적인 세포 표면 마커를 발현하지 않는 세포를 배제하지 않는 종래의 방법에 의해 얻어지는 거핵구와 비교하여, 세포당 혈소판 산생능이 유의미하게 높다. 혈소판 산생능의 증대 레벨은 배양 조건에 의해 변동되기는 하나, 산생능은 종래의 방법의 비교에서 몇배, 예를 들어 5배 이상 증대할 수 있다. 혈소판 산생능의 증대는, 파종 세포당 CD41 양성 세포, 바람직하게는 CD41a 양성이며 또한 CD42b 양성의 세포가 산생하는 혈소판량을 비교함으로써 산출된다. 또한, 얻어진 혈소판이 기능성을 갖는지 여부는, 공지의 방법, 예를 들어 활성화한 혈소판막 상의 인간 인테그린 αIIBβ3에만 결합하는 항체인 PAC-1을 사용하여 활성화 혈소판량을 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에 의해 얻어지는 거핵구는, 종래의 방법으로 유도된 거핵구에 비교하여 분화 형질을 장기간 안정되게 유지할 수 있다. 분화 형질의 유지는, 예를 들어 거핵구 마커를 발현하는 세포의 비율로 평가할 수 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 거핵구는, 종래의 방법으로 유도된 거핵구에 비교하여 일정 기간 경과 후에, 거핵구 마커(CD41a, CD42a, CD42b 등) 양성 세포의 비율이 높다. 또한, 예를 들어 종래의 방법으로 유도된 거핵구에 비하여, 본 발명에 의해 제조되는 거핵구는, 보다 안정된 분화 형질을 90일 이상 유지할 수도 있다. 본 발명은 자기 증식능을 갖는 거핵구 세포주의 수립 효율을 향상시킬 수도 있다.
본 발명에서 사용하는 배양 공정은, 피더 세포의 존재 하 또는 부재 하에서 실시할 수 있다. 피더 세포로서는, 거핵구 또는 거핵구 전구 세포를 유도할 수 있는 세포라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 C3H10T1/2(Katagiri T, et al., Biochem Biophys Res Commun. 172, 295-299(1990))를 들 수 있다. 일반적으로, 거핵구 전구 세포는, 피더 세포를 사용하면 혈소판 산생능이 향상되는데, 본 발명에 의해 제조되는 거핵구는, 피더 세포의 사용의 유무와 관계없이 세포당 동일 정도의 혈소판을 산생할 수 있는 점에서 유리하다.
본 발명에 있어서 사용하는 배지는, 특별히 한정되지 않지만, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 제조할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, 미디움(Medium) 199 배지, 이글 미니멈 에센셜 미디움(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM) 배지, αMEM 배지, 둘베코 개질된 이글 미디움(Dulbe㏄o's modified Eagle's Medium)(DMEM) 배지, 햄(Ham's) F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔(Fischer's) 배지, 뉴로바살 미디움(Neurobasal Medium)(라이프 테크놀로지스) 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지에는, 혈청이 함유되어 있어도 되고, 혹은 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 배지는, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티올글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 사이토카인 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 사이토카인이란, 혈구계 분화를 촉진하는 단백질이며, 예를 들어 VEGF, TPO, SCF 등이 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 배지는, 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 세린, 티올글리세롤, 아스코르브산, TPO를 포함하는 IMDM 배지이다. 보다 바람직하게는, SCF를 더 포함한다. 또한, 텟-온(등록 상표) 또는 텟-오프(등록 상표) 시스템과 같은 약제 응답성의 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 사용한 경우, 강제 발현하는 공정에 있어서는, 대응하는 약제, 예를 들어 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 배지에 함유시키는 것이 바람직하다.
배양 조건은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 TPO(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50 내지 100ng/mL 정도)의 존재 하에서, TPO(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50 내지 100ng/mL 정도) 및 SCF(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL 정도)의 존재 하에서, 또는 TPO(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50 내지 100ng/mL 정도) 및 SCF(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL 정도) 및 헤파린(Heparin)(10 내지 100U/mL, 바람직하게는 25U/ml 정도)의 존재 하에서, 세포를 배양해도 된다. 배양 온도에 대해서는, 35.0℃ 이상의 온도에서 배양함으로써, 거핵구 또는 거핵구 전구 세포의 분화가 촉진됨이 확인되고 있다. 배양 온도는 세포에 대미지를 끼치지 않을 정도의 온도, 예를 들어 35.0℃ 내지 42.0℃가 바람직하고, 36.0℃ 내지 40.0℃가 더욱 바람직하고, 37.0℃ 내지 39.0℃가 보다 더욱 바람직하다.
배양 기간에 대해서는, 당업자라면 거핵구 또는 거핵구 전구 세포의 수 등을 모니터하면서 적절히 결정하는 것이 가능하다. 예를 들어, 배양물 중에서 차지하는 거핵구 세포의 비율은, 유세포 분석을 사용하여 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커를 해석함으로써 결정할 수 있는데, 예를 들어 배양물에 포함되는 전체 세포 중 거핵구 또는 거핵구 전구 세포, 특히 거핵구가 차지하는 비율이 50％ 이상, 예를 들어 60％, 70％, 80％, 90％ 이상이 되도록 배양해도 된다. 원하는 거핵구 전구 세포가 얻어지는 한, 일수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 3일 이상이 바람직하고, 6일 이상이 보다 바람직하고, 9일 이상이 보다 더욱 바람직하다. 그러나, 배양 기간이 긴 것은 문제가 되지 않으므로, 12일 이상, 18일 이상, 24일 이상, 30일 이상, 42일 이상, 48일 이상, 54일 이상, 60일 이상이어도 된다. 또한, 배양 기간 중은, 적절히 계대를 행하는 것이 바람직하다.
약제 내성 유전자로 세포를 형질 전환하는 경우, 사용할 수 있는 약제는, 퓨로마이신, 네오마이신, 카나마이신, 클로람페니콜, 에리스로마이신, 테트라사이클린, 하이그로마이신, 암피실린, 제오신, 블라스티시딘 S, 또는 히스티디놀 등을 들 수 있다.
본 발명의 효과를 손상시키지 않는 한, 거핵구의 제조에 관하여 당업자에게 공지의 기술을 본 발명의 제조 방법에 적용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 거핵구의 제조 방법의 일 형태는, 또한, (a) p53 유전자 산물의 발현 또는 기능을 저해하는 물질, (b) 액토미오신 복합체 기능 저해제, (c) ROCK 저해제 및 (d) HDAC 저해제를 배지에 더 포함해도 된다. 이들 방법은, 예를 들어 WO2012/157586에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
또한, WO2011/034073에 기재되어 있는 바와 같은, c-MYC 유전자 등의 암 유전자나 폴리콤 유전자 등의 외래성 유전자를 강제 발현시켜 거핵구 세포의 생산량을 증대시킬 수도 있다. 이러한 형태에 있어서, 본원 발명의 제조 방법은, 거핵구 또는 거핵구 전구 세포에 대하여, 강제 발현을 정지하여 배양하는 공정을 더 포함해도 된다. 강제 발현을 정지하는 방법으로서, 예를 들어 약제 응답성 벡터를 사용하여 강제 발현을 하고 있는 경우에는, 대응하는 약제와 당해 세포와 접촉시키지 않음으로써 달성시켜도 된다. 이 밖에도, 상기한 LoxP를 포함하는 벡터를 사용한 경우는, Cre 리콤비나아제를 당해 세포에 도입함으로써 달성시켜도 된다. 또한, 일과성 발현 벡터 및 RNA 또는 단백질 도입을 사용한 경우는, 당해 벡터 등과의 접촉을 멈춤으로써 달성시켜도 된다. 본 공정에 있어서 사용되는 배지는, 상기와 동일한 배지를 사용하여 행할 수 있다.
강제 발현을 정지하여 배양할 때의 조건은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 35.0℃ 내지 42.0℃가 바람직하고, 36.0℃ 내지 40.0℃가 더욱 바람직하고, 37.0℃ 내지 39.0℃가 보다 더욱 바람직하다.
또한, 강제 발현을 정지한 후의 배양 기간에 대해서는, 세포수, 특히 거핵구 세포수 등을 모니터하면서, 적절히 결정하는 것이 가능한데, 강제 발현을 정지하고 나서 적어도 2일 이상인 것이 바람직하고, 예를 들어 2일간 내지 14일간이다. 배양 기간은 3일간 내지 12일간이 보다 바람직하고, 4일간 내지 10일간이 보다 더욱 바람직하다. 배양 기간 중에는, 적절히, 배지 교환 또는 계대를 행하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해 얻어지는 거핵구는, 충분히 성숙시킴으로써 기능적인 혈소판을 효율적으로 산생할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 거핵구의 성숙이란, 거핵구가 충분히 다핵화되어, 기능적인 혈소판을 산생할 수 있음을 의미한다. 거핵구의 성숙은, 예를 들어 GATA1, p45 NF-E2, β1-튜불린 등의 거핵구 성숙 관련 유전자군의 발현 상승, 혈소판 전구체의 형성, 세포 내의 다핵화에 의해서도 확인할 수 있다. 당해 혈소판은, 이미 생체 내 및 생체 외에 있어서, 높은 혈전 형성능을 갖고 있음이 확인되고 있다.
또한, 거핵구 및/또는 거핵구 전구 세포는, 동결 보존 후, 융해해도 기능적인 혈소판을 산생할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 제작된 거핵구 세포주는, 동결 보존한 상태에서 유통시킬 수 있다.
(혈소판의 제조 방법)
본 발명에 관한 혈소판의 제조 방법은, 상기 제조 방법으로 제조된 배양물을 사용하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적인 형태에 있어서, 본 발명에 관한 혈소판의 제조 방법은, 상술한 방법으로 얻어진 거핵구, 거핵구 전구 세포 및/또는 거핵구 세포주를 배양하고, 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정을 포함한다.
배양 조건은, 한정은 하지 않지만, 예를 들어 TPO(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50 내지 100ng/mL 정도)의 존재 하에서, 혹은, TPO(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50 내지 100ng/mL 정도), SCF(10 내지 200ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL 정도) 및 헤파린(10 내지 100U/mL, 바람직하게는 25U/ml 정도)의 존재 하에서, 배양해도 된다.
배양 기간은, 적어도 3일 이상인 것이 바람직하지만, 제조되는 혈소판의 기능이 유지되고 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 배양 기간은 3일간 내지 14일간이다. 배양 기간은 4일간 내지 12일간이 바람직하고, 5일간 내지 10일간이 보다 바람직하다.
배양 온도는, 특별히 한정되지 않고 예를 들어 35.0℃ 내지 42.0℃이다. 배양 온도는 36.0℃ 내지 40℃가 바람직하고, 37.0℃ 내지 39.0℃가 보다 바람직하다.
본 발명에 관한 제조 방법에서는, 거핵구의 배양 공정을, 혈청 프리 및/또는 피더 세포 프리의 조건에서 행해도 된다. 바람직하게는, TPO를 함유하는 배지에서 본 발명의 방법에 따라 제조된 거핵구를 배양함으로써 행하는 방법이다. 또한, 피더 세포를 사용하지 않는 경우, 일 형태로서, 컨디션된 배지(conditioned medium)를 사용해도 된다. 컨디션된 배지는, 특별히 한정되지 않고 당업자가 공지의 방법 등에 따라 제작할 수 있지만, 예를 들어 피더 세포를 적절히 배양하고, 배양물로부터 피더 세포를 필터로 제거함으로써 얻을 수 있다.
본 발명에 관한 혈소판의 제조 방법의 일 형태에서는, 배지에 ROCK 저해제 및/또는 액토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가한다. ROCK 저해제 및 액토미오신 복합체 기능 저해제로서는, 상술한 다핵화 거핵구의 제조 방법에서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. ROCK 저해제로서는, 예를 들어 Y27632, 파수딜염산염, H1152 중염산염(Dihydrochloride) 등을 들 수 있다. 액토미오신 복합체 기능 저해제로서는, 예를 들어 미오신 ATPase 활성 저해제 또는 미오신 경쇄 키나제 저해제이다. 블레비스타틴, ML-7, ML-9를 들 수 있다. ROCK 저해제 또는 액토미오신 복합체 기능 저해제를 단독으로 첨가해도 되고, ROCK 저해제와 액토미오신 복합체 기능 저해제를 조합하여 첨가해도 된다.
ROCK 저해제 및/또는 액토미오신 복합체 기능 저해제는, 예를 들어 0.1μM 내지 30.0μM으로 첨가해도 된다. 저해제의 농도는 0.5μM 내지 25.0μM이 바람직하고, 1.0μM 내지 20.0μM이 보다 바람직하고, 5.0μM 내지 15.0μM이 보다 더욱 바람직하다.
ROCK 저해제 및/또는 액토미오신 복합체 기능 저해제를 첨가한 경우의 배양 기간은, 예를 들어 1일 내지 15일로 할 수 있다. 배양 기간은 3일 내지 13일이 바람직하고, 5일 내지 11일이 보다 바람직하고, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일이 보다 더욱 바람직하다. ROCK 저해제 및/또는 액토미오신 복합체 기능 저해제를 가함으로써, CD42b 양성 혈소판의 비율을 더욱 증가시키는 것이 가능하다.
혈소판은, 당업자에게 공지의 방법으로 배지로부터 단리할 수 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 혈소판은, 외래 유전자를 발현하지 않는 안전성이 높은 혈소판이다. 본 발명에서 얻어지는 거핵구는, 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 외래성의 아포토시스 억제 유전자 및 암 유전자가 발현되어 있어도 된다. 이 경우, 혈소판 생산 공정에서는, 당해 외래성의 유전자의 발현이 억제된 상태가 된다.
본 발명에서 얻어진 혈소판은, 제제로서 환자에게 투여할 수 있다. 투여에 있어서는, 본 발명의 방법으로 얻어지는 혈소판은, 예를 들어 인간 혈장, 수액제, 시트르산 함유 생리 식염액, 포도당가 아세테이트 링거액을 주제로 한 액, PAS(혈소판 첨가제 용액(platelet additive solution))(Gulliksson, H. et al., Transfusion, 32:435-440, (1992)) 등에서 보존, 제제화해도 된다. 보존 기간은, 제제화 직후부터 14일간 정도이다. 바람직하게는 10일간, 보다 바람직하게는 8일간이다. 보존 조건으로서, 실온(20-24℃)에서 진탕 교반하여 보존하는 것이 바람직하다.
이하에 실시예를 기재하고 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. iPS 세포로부터의 조혈 전구 세포의 제조
인간 iPS 세포(692D2, 1108A2: Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66, 2012에 기재된 에피소말 벡터를 사용하여 수립된 인간 말초혈 단핵구 유래 iPS 세포, TKDN SeV2: 센다이 바이러스를 사용하여 수립된 인간 태아 피부 섬유아세포 유래 iPS 세포)로부터, 문헌[Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830(2010)]에 기재된 방법에 따라, 혈구 세포에 대한 분화 배양을 실시했다. 즉, 인간 ES/iPS 세포 콜로니를 20ng/mL VEGF(R&D SYSTEMS) 존재 하에서 C3H10T1/2 피더 세포와 14일간 공배양하여 조혈 전구 세포(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))를 제작했다. 배양 조건은 20％ O2, 5％ CO2로 실시했다(특별히 기재가 없는 한, 이하 동일한 조건).
2. 조혈 전구 세포에 대한 c-MYC 및 BMI1 바이러스 감염
미리 C3H10T1/2 피더 세포를 파종한 6웰 평판 위에 상기한 방법으로 얻어진 HPC를 5×104세포/웰씩 파종하고, 렌티바이러스법으로 c-MYC 및 BMI1을 강제 발현시켰다. 이때, 세포주 1종류에 대하여 6웰씩 사용했다. 즉, 각각 MOI 20이 되도록 배지 중에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃ 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다. 본 조작은, 12시간 간격으로 2회 실시했다. 이때, 기본 배지(15％ 소 태아 혈청 (Fetal Bovine Serum)(GIBCO), 1％ 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(Penicillin-Streptomycin-Glutamine)(GIBCO), 1％ 인슐린 트렌스페린 셀레늄 솔루션(Insulin, Transferrin, Selenium Solution)(ITS-G)(GIBCO), 0.45mM 1-티오글리세롤(1-Thioglycerol)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 50㎍/mL L-아스코르브산(L-Ascorbic Acid)(시그마-알드리치)를 함유하는 IMDM(이스코브 개질된 둘베코 미디움(Iscove's Modified Dulbe㏄o's Medium))(시그마-알드리치))에 50ng/mL 인간 트롬보포이에틴(TPO)(R&D SYSTEMS), 50ng/ml 인간 줄기 세포 인자(SCF)(R&D SYSTEMS) 및 2㎍/mL 독시사이클린(Dox)을 함유한 배지(이하, 분화 배지)에, 또한, 프로타민을 최종 농도 10ug/mL 첨가한 것을 사용했다. 또한, 렌티바이러스 벡터는, 테트라사이클린 제어성의 유도성 벡터이며, LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi, T., et al. Cell 142, 787-799(2010))의 mOKS 카세트를 c-MYC, BMI1, BCL-xL로 재조합함으로써 제작되었다(각각, LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G 및 LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G). 감염에 사용한 바이러스 입자는, 293T 세포에 상기 렌티바이러스 벡터를 발현시켜 제작되었다.
3. 거핵구 자기 증식주의 제작 및 유지 배양
상기한 방법으로 cMYC 및 BMI1 바이러스 감염을 실시한 날을 감염 0일째로 하여, 이하와 같이 cMYC 및 BMI1 유전자 도입형 거핵구 세포를 배양함으로써, 692D2 및 1108A2 유래의 거핵구 자기 증식주를 각각 제작했다.
·감염 2일째 내지 감염 11일째
피펫팅으로 상기한 방법으로 얻어진 바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 행하여 상청을 제거한 후, 새로운 분화 배지에서 현탁하여 새로운 C3H10T1/2 피더 세포 상에 파종했다(6웰 평판). 감염 9일째에 마찬가지의 조작을 함으로써 계대를 실시했다. 세포수를 계측 후 1×105세포/2mL/웰로 C3H10T1/2 피더 세포 상에 파종했다(6웰 평판).
·감염 12일째 내지 감염 13일째
감염 2일째와 마찬가지의 조작을 실시했다. 세포수를 계측 후 3×105세포/10mL/100㎜ 디쉬로 C3H10T1/2 피더 세포 상에 파종했다(100㎜ 디쉬).
·감염 14일째
바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 세포 1.0×105개당, 항인간 CD41a-APC 항체(바이오레젠드(BioLegend)), 항인간 CD42b-PE 항체(이바이오사이언스(eBioscience)), 항인간 CD235ab-pacific blue(바이오레젠드) 항체를 각각 2μL, 1μL, 1μL씩을 사용하여 항체 반응했다. 반응 후에, FACS Verse(BD)를 사용하여 해석했다. 감염 14일째에 있어서, CD41a 양성률이 50％ 이상인 경우, 거핵구 자기 증식주의 작성으로 했다.
4. 거핵구 자기 증식주에 대한 BCL-xL 바이러스 감염
상기 배양 14일째의 바이러스 감염 완료 혈구 세포에, 렌티바이러스법으로 BCL-XL을 유전자 도입했다. MOI 10이 되도록 배지 중에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃ 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다.
5. 거핵구 불사화주의 작성 및 유지 배양
·감염 14일째 내지 감염 18일째
전술한 방법으로 얻어진 바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 행했다. 원심 후, 침전한 세포를 새로운 분화 배지에서 현탁한 후, 새로운 C3H10T1/2 피더 세포 상에 2×105세포/2mL/웰로 파종했다(6웰 평판).
·감염 18일째: 계대
세포수를 계측 후, 3×105세포/10mL/100㎜ 디쉬로 파종했다.
·감염 24일째: 계대
세포수를 계측 후, 1×105세포/10mL/100㎜ 디쉬로 파종했다. 이후, 4 내지 7일마다 계대를 행하고, 유지 배양을 행했다.
감염 24일째에 혈구 세포를 회수하고, 세포 1.0×105개당, 항인간 CD41a-APC 항체(바이오레젠드), 항인간 CD42b-PE 항체(이바이오사이언스), 항인간 CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB; 바이오레젠드) 항체를 각각 2μL, 1μL, 1μL씩을 사용하여 면역 염색한 후에 FACS Verse(BD)를 사용하여 해석하고, 감염 24일째에 있어서도, CD41a 양성률이 50％ 이상인 주를 거핵구 불사화주로 했다.
상기 BCL-xL 렌티바이러스 감염 완료의 세포를 유지 배양한 결과, iPS 세포(692D2, 1108A2) 유래의 세포는, 감염 후 24일 이상 증식할 수 있었다. 이들 세포를, 거핵구 불사화주라고 했다(비교예 1 및 2). 마찬가지의 방법에 의해, TKDN SeV2에 대해서도 거핵구 자기 불사화주를 작성했다(비교예 3).
상기한 비교예 1 내지 3의 어느 거핵구 불사화주는, 적어도 40일간은 계대할 수 있음이 확인되었다. 한편, 배양 경과에 수반하여, 접착 세포로 형질 전환하는 세포가 많아짐이 확인되었다.
6. 거핵구 특이적 유전자 발현 프로모터에 의한 약제 내성 유전자 발현 벡터의 제조
그 후, LV-텟온 벡터(클론테크(Clonetech)), KhES3 세포(교토 대학 수립)로부터 클로닝한 CD41a 프로모터 서열(서열 번호 1) 및 pENTR-DMD-Donor04_EF1a-Puro로부터 서브 클로닝한 퓨로마이신 내성 유전자 서열을, 제한 효소 EcoRI, XhoI로 절단 완료된 CS-CDF-UG-PRE로 재조합했다. 이때, 인-퓨젼 어드밴스 PCR 클로닝 키트(In-Fusion Advance PCR cloning kit)(클론테크)를 사용하여 재조합했다. 그 결과, CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스 벡터(도 1)를 제조할 수 있었다.
7. CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스에 의한 유전자 도입
상기 CD41a 프로모터-퓨로마이신 렌티바이러스 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스 벡터를, HEK293T 세포에 유전자 도입했다. 그 후, 유전자 도입 완료된 HEK293T 세포의 배양 상청으로부터, CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스를 농축 제조했다. 계속해서, 2×106세포/10ml/디쉬로, 10㎝-디쉬의 C3H10T1/2 세포(피더 세포) 상에 파종된 상기 거핵구 불사화 세포주에 대하여, MOI10로 CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스를 감염시켰다. 감염 후의 거핵구 불사화 세포주는, 기본 배지(15％ 소 태아 혈청(GIBCO), 1％ 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(GIBCO), 1％ 인슐린 트렌스페린 셀레늄 솔루션(ITS-G)(GIBCO), 0.45mM 1-티오글리세롤(시그마-알드리치), 50㎍/mL L-아스코르브산(시그마-알드리치)를 함유하는 IMDM(이스코브 개질된 둘베코 미디움)(시그마-알드리치))에 50ng/mL 인간 트롬보포이에틴(TPO)(R&D SYSTEMS), 50ng/ml 인간 줄기 세포 인자(SCF)(R&D SYSTEMS) 및 2㎍/mL 독시사이클린(Dox)을 함유한 배지(분화 배지)에, 2㎍/mL의 퓨로마이신을 함유시킨 배지(퓨로마이신 함유 분화 배지)를 사용하여, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 정치 배양했다.
CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스에 의한 유전자 도입이 행하여진 세포주를 실시예 1(692D2 유래), 실시예 2(1108A2 유래), 실시예 3(TKDN SeV2 유래)으로 했다.
8. 거핵구 마커의 해석(피더 세포 있음)
세포를 CD41a 항체(Anti-CD41-APC; 바이오레젠드), CD42b 항체(Anti-CD42b; 이바이오사이언스) CD235ab 항체(Anti-CD235ab-PB; 바이오레젠드)를 사용하여 염색하고, 유세포 분석기 BD FACSVerse로 해석했다. 그 결과, CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스를 도입한 세포군(실시예 1)은 도입하지 않은 세포군(비교예 1)과 비교하여 CD41a 양성률이 높아졌다(도 2). 그 후의 배양 경과 시에 있어서도, 실시예 1의 세포군을 배양하여 얻어진 배양물은, 비교예 1에 비하여 높은 CD41a 양성률을 나타냈다(도 3). 실시예 1의 CD41a 양성 세포는 그 수도 계속하여 증가했다(도 4).
9. 거핵구 마커의 해석(피더 세포 없음)
배양 시에 피더 세포를 사용하지 않은 점을 제외하고, 실시예 1과 마찬가지의 조건에서, CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스에 의한 유전자 도입이 행하여진 1108A2 유래 세포주를 제조했다(실시예 2). 유전자 도입되지 않은 1108A2 유래의 세포주를 비교예 2로 했다. 피더 세포를 사용하지 않고 배양한 경우에도, 실시예 2의 세포군을 배양하여 얻어진 배양물은, 비교예 2의 것에 비하여 높은 CD41a 양성률을 나타낼 수 있었다(도 5).
10. 피더 세포 있음/없음의 경우의 비교
692D2 유래의 실시예 1에 대하여, 세포주의 배지에 포함되는 퓨로마이신의 농도를 각각 배양 14일째에 5㎍/mL로, 배양 28일째에 10㎍/mL로 증대시켰을 때에도, 피더 세포 있음/없음의 어느 조건에 있어서든 높은 CD41a 양성률이 보였다(도 6a). 또한, 각각의 경시적인 세포수의 변화를 측정했다. 세포수는, 배양 세포를 0.1％(v/v) 트리판 블루 용액으로 희석하고, 혈구 계산반(와켄 비테크)을 사용하여 측정했다. 그 결과, 피더 세포의 유무에 관계없이, 동일 정도의 속도로 세포가 경시적으로 증식하는 것이 명확해졌다(도 6b).
11. 세포 증식 측정(진탕 배양)
배양 방법을 플라스크 배양 및 백 배양으로 한 점을 제외하고, 실시예 1과 마찬가지의 조건에서, CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 갖는 렌티바이러스에 의한 유전자 도입이 행하여진 692D2 유래 세포주를 제조했다(플라스크 배양: 실시예 4; 백 배양: 실시예 5). 그 결과, 실시예 4 및 실시예 5의 세포군을 배양하여 얻어진 배양물에 있어서는, CD41a 양성 세포율이 현저하게 향상되었다(도 7(실시예 4), 도 8(실시예 5)).
12. 혈소판수의 측정(정치 배양, 피더 세포 있음)
배양 상청 중에 포함되는 혈소판을 CD41a 항체(Anti-CD41-APC; 바이오레젠드), CD42a 항체(Anti-CD42a; 이바이오사이언스) 및 CD42b 항체(Anti-CD42b; 이바이오사이언스)를 사용하여 염색하고, 유세포 분석기 BD FACSVerse로 해석했다. 그 결과, CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 도입한 세포군(실시예 1)은 도입하지 않은 세포군(비교예 1)과 비교하여 CD41a 양성 CD42b 양성 혈소판 생산율(파종 세포당 혈소판 생산수)이 2배 이상 높았다(표 1, 도 9).
13. 혈소판수의 측정(정치 배양, 피더 세포 없음)
피더 세포를 사용하지 않고 혈소판을 생산시킨 경우에도 CD41a 양성 CD42b 양성 혈소판 생산율(파종 세포당 혈소판 생산수)의 항진이 확인되었다. CD41a 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자를 도입한 세포군(실시예 2)은 도입하지 않은 세포군(비교예 2)과 비교하여 혈소판 생산율이 약 5배 높았다(표 2, 도 10).
SEQUENCE LISTING
<110> Megakaryon Corporation
<120> Method for producing cell culture comprising megakaryocytes and platelets with the
cell culture
<130> K1019AGP01
<150> JP2015-046281
<151> 2015-03-09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tgtgaacgga ccaagagtaa acagtgtgct caatgctgtg cctacgtgtg ttagcccacg 60
cggccagcct gaggagtcag ggaaggctcc cctaggcaaa gcccccaacc agaatcaagt 120
cttaatggtt aaagagctcc atcacccaaa aaggattgag ggcctacctt caactgaaca 180
gctaatgcat aatctcagaa actgtgagtc aaaattccct ggaataactc cactttatcc 240
ccaatctcct tgccacctag accaaggtcc attcaccacc ctgtccccag cactgactgc 300
actgctgtgg ccacactaaa gcttggctca agacggagga ggagtgagga agctgctgca 360
ccaatatggc tggttgaggc cgcccaaggt cctagaagga ggaagtgggt aaatgccata 420
tccaaaaaga tacagaagcc tcaggtttta tcgggggcag cagcttcctt ctccttcccc 480
gacctgtggc caagtcacaa agcaccacag ctgtacagcc agatggggga agggaggaga 540
ttagaactgt aggctagagt agacaagtat ggaccagttc acaatcacgc tatcccaagc 600
agaaagtgat ggtggcttgg actagcacgg tggtagtaga gatggggtaa agattcaaga 660
gacatcattg ataggcagaa ccaataggac atggtaataa actattctca ggaaagggga 720
ggagtcatgg ctttcagcca tgagcatcca ccctctgggt ggcctcaccc acttcctggc 780
aattctagcc accatgagtc caggggctat agccctttgc tctgcccgtt gctcagcaag 840
ttacttgggg ttccagtttg ataagaaaag acttcctgtg gaggaatctg aagggaagga 900
ggaggagctg gcccattcct gcctgggagg ttgtggaaga aggaagat 948
Claims (14)
- 거핵구 또는 거핵구 전구 세포를 포함하는 배양물의 제조 방법이며, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군을 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포군이, 세포 독성을 나타내는 약제에 대한 내성 유전자로 형질 전환되어 있으며, 해당 약제 내성 유전자가, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 배치되어 있고, 상기 배양 공정에서 상기 약제가 첨가되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포군이, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포를 치사시키는 유전자로 형질 전환되어 있으며, 해당 유전자가, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포로 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 배치되어 있는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자가, 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커를 코드하는 유전자인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커가 CD41a, CD42a 및/또는 CD42b인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거핵구로의 분화능을 갖는 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, CD34 양성 세포 및 거핵구 전구 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 공정이 혈청 및/또는 피더 세포의 부재 하에서 실시되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제조되는 배양물 중의 거핵구가 분화 형질을 유지하고 있으며, 또한 혈소판 산생능이 증대되어 있는, 방법.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포군이 상기 프로모터와 상기 약제 내성 유전자 또는 치사 유전자를 작용 가능하게 연결한 벡터로 형질 전환되어 있는, 방법.
- 제2항, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제 내성 유전자가, 퓨로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 블라스티시딘 S 내성 유전자 및 히스티디놀 내성 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인, 방법.
- 혈소판의 제조 방법이며, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 거핵구를 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 거핵구 또는 거핵구 전구 세포의 확대 배양 방법이며, 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자를 발현하지 않는 세포가 치사하는 조건 하에서, 거핵구 또는 거핵구로의 분화능을 갖는 세포를 포함하는 세포군을 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 세포군이, 세포 독성을 나타내는 약제에 대한 내성 유전자로 형질 전환되어 있으며, 해당 약제 내성 유전자가, 상기 거핵구 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터의 제어 하에 배치되어 있고, 상기 배양 공정에서 상기 약제가 첨가되는, 방법.
- 상기 제1항 내지 제10항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, 거핵구 또는 거핵구 전구 세포를 포함하는, 배양물.
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