KR20180009443A - 한약재 알레르기 진단용 바이오칩 - Google Patents

한약재 알레르기 진단용 바이오칩 Download PDF

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KR20180009443A
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김범준
임국진
최윤아
김태형
이지은
최동섭
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Abstract

본 발명은 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하여 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩에 관한 것이다.

Description

한약재 알레르기 진단용 바이오칩{Biochip for diagnosing medicinal herbs allergy}
본 발명은 한약재 알레르기 진단용 바이오칩에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한약재와 반응하는 생체 시료 내 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하여 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩에 관한 것이다.
바이오칩(Biochip)은 무기물로 된 고체 기질에 생물에서 유래된 DNA, 단백질, 효소, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등의 물질을 결합시켜 칩 형태로 만든 기판으로서 생체분자의 고유한 생화학적 특성을 이용하여 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 질병의 진단, 단백질 분포 등의 생물학적 정보를 대규모로 분석할 수 있는 장치를 말한다.
단백질을 측정하는 바이오칩은 자가 면역 항체, 알레르기 진단시약 등에서 많이 사용되고 있다. 종래의 바이오칩 키트들은 다양한 질병 또는 생체 면역반응 원인 물질에 대한 생체 시료 내 물질 측정을 통하여 진단 검사 결과를 제공한다. 그러나 기존의 발명들은 동아시아에서 널리 사용되는 한약재는 원인 후보 물질로 고려하고 있지 않다.
혈액 내 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 측정은 알레르기 질환 및 기생충 감염과 연관되어 있으며 거의 항상 알레르기 혈액 페널 검사의 테스트로 측정된다. 어떤 사람의 경우 대부분의 사람에서 해가 없고 면역 반응 또한 유발하지 않는 이물질에 대해서 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 반응을 알레르기(또는 과민성)이라고 하며, 이 반응은 IgE 항체의 생성을 수반한다. 알레르기 반응은 약한 자극부터 생명을 위협하는 심한 반응에 이르기까지 증상이 다양하며, 이에 대한 대처는 항히스타민제나 휴대용 에피네프린 주사와 같은 약물을 사용할 수 있으나, 사전에 알레르기 반응 유발 요인을 찾아 접촉을 피하는 것이 가장 확실한 방법이다. 혈액 내 IgE 측정은 반응 유발 요인에 대한 정보를 제공한다는 점에서 중요성을 지닌다.
약사법 총칙 제2조 5항에 따르면, ?한약?이란 동물, 식물 또는 광물에서 채취된 것으로 주로 원형대로 건조, 절단 또는 정제된 생약을 말한다. 과거 한약재는 안전하고 부작용이 없다고 인식되었으나 최근 한약의 부작용에 관한 보도가 많아지면서 한약 복용의 안정성에 대한 요구가 많아지고 있다. 여러 형태의 부작용 중, 한약재로 인한 알레르기는 건칠(옻)으로 인해 발생하는 경우가 그 빈번함으로 인해 널리 알려져 있다. 하지만 다른 한약재에 의한 알레르기 반응에 대해서는 다루고 있지 못한 것이 현재의 상황이다. 다양한 한약재에 대한 알레르기 반응을 확인하기 위한 검사법이 필요한 실정이지만 이를 위한 진단 도구나 기준이 전무한 상황이다.
이에 본 발명자들은 한약재에 대한 생물학적 물질 측정도구 및 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 개별 환자가 지닌 한약재에 대한 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정함으로써, 한약재에 대한 알레르기 반응을 체외 진단하는 방법을 규명하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 한약재와 반응하는 생체 시료 내 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하여 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항의 진단용 바이오칩 마커에 생물학적 시료를 접촉시켜, 존재하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하는 한약재 알레르기 진단 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 한약재와 반응하는 생체 시료 내 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하여 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩을 제공한다.
상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 바이오칩은 하나의 반응 용기 내에 스트립(strip); 및 상기 스트립을 고정하는 용기; 를 포함하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 스트립은 라인형, 도트형, 병렬식 라인형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 스트립은 한약재 알레르겐(arllergen)을 마커로 포함하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 한약재 알레르겐(allergen)은 갈근, 감초, 건칠, 녹용, 백출, 일당귀, 지구자, 창출, 천궁, 행인, 황기, 지모, 인삼, 회향, 시호, 익모초, 생지황, 치자, 후박, 황백초, 복령, 지실, 작약, 황금, 봉독, 창이자, 구기자, 산수유, 보골지, 현삼, 목통, 도인, 연교, 속단, 마인, 저령, 고본, 백지, 산약, 석창포, 세신, 오미자, 택사, 맥문동으로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 스트립은 지지체 위에 멤브레인(membrane)을 코팅하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 진단용 바이오칩 마커에 생물학적 시료를 접촉시켜, 시료 내에 존재하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하는 한약재 알레르기 진단 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 면역글로불린은 면역글로불린 E(Immunoglobulin E, IgE) 또는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 뇌척수액, 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 한약재 알레르겐을 마커로 하여 생물학적 시료 내에 존재하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 측정 결과를 통해 한약재로 인한 알레르기 반응을 진단하기 위한 바이오칩을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오칩 마커에 생물학적 시료를 접촉시켜, 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정함으로써 한약재로 야기되는 알레르기 진단방법을 제공하고자 한다.
도 1a는 본 발명의 라인형 바이오칩의 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명의 dot형 바이오칩의 모식도를 나타낸 것이다.
도 1c는 본 발명의 병렬식 라인형 바이오칩의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 병렬식 라인형으로 제조된 한약재 스트립을 생물학적 시료와 접촉시켜 본 발명의 실시예 2에 따른 반응 과정을 거친 바이오칩이다.
도 3은 병렬식 라인형으로 제조된 한약재 스트립을 생물학적 시료와 접촉시켜 본 발명의 실시예 3에 따른 반응 과정을 거친 바이오칩이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 지금까지 질병을 진단하기 위한 바이오칩에 관한 보고가 있음에도 불구하고 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하기 위한 바이오칩에 관한 연구는 없었다.
본 발명은 한약재 알레르겐을 마커로 하여 생물학적 시료 내에 존재하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 측정 결과를 통해 한약재로 인해 야기되는 알레르기 반응 진단 바이오칩을 밝혀냄으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 한약재에 대한 알레르기 반응을 체외 진단을 통해 간접적으로 알 수 있고, 이를 위한 부작용을 사전에 방지함으로써 한약을 더욱 안전하게 복용하기 위한 정보를 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 한약재와 반응하는 생체 시료 내 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하여 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩을 제공한다.
본 발명의 바이오칩은 하나의 반응 용기 내에 스트립(strip); 및 상기 스트립을 고정하는 용기; 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 스트립(10)이 하나의 바이오칩 안에 배치되어 있고, 상기 스트립을 고정할 수 있는 용기(20)를 포함하게 되는 것이다(도 1 참조)
상기 스트립은 라인형, 도트형, 병렬식 라인형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 '라인형 스트립'은 멤브레인 위에 라인(line) 형태로 마커를 부착시켜 제조된 스트립을 의미하는 것으로, '라인을 긋는다'는 의미는 멤브레인 위에 마커를 부착시키는 것을 의미하는 것이다. 또한, 본 발명에서 '도트형 스트립'은 멤브레인 위에 도트(dot) 형태로 마커를 부착시켜 제조된 스트립을 의미하는 것으로 '도트를 찍는다'는 의미는 멤브레인 위에 마커를 부착시키는 것을 의미하는 것이다. 상기 라인형 스트립은 주로 간 멤브레인에 측정하고자 하는 마커들을 각각 라인 형태로 가로로 여러 줄을 그려놓고 세로로 잘라서 스트립 형태로 사용하기 때문에 생산 공정이 단순하고 다량 생산이 가능한 이점이 있다. 또한, 상기 도트형 스트립은 다양한 물질의 검출을 위해 사용될 수 있으며 상기 병렬식 라인형 스트립은 적은 시료만으로, 광범위한 물질을 검출할 수 있고 검출에 소모되는 시간 및 인력이 현저히 감소될 수 있으며 이를 통해 대량 생산이 가능한 이점이 있다.
본 발명에서 상기 스트립은 한약재 알레르겐을 마커로 포함하는 것일 수 있다. 알레르겐 또는 알레르기 항원은 알레르기를 유발하는 물질로서, 알레르기는 특정 외부 물질에 대한 특이 면역글로불린(항체, antibody) 항체가 체내에 생성되어 나타나는 과민성 면역반응이다. 이러한 알레르기 진단에 있어 알레르기를 일으킬 수 있는 다양한 알레르겐을 동시에 진단하는 것은 매우 중요하다. 따라서 본 발명의 바이오칩을 이용하면 다수의 한약재 알레르겐에 대하여 동시에 진단할 수 있는 효과를 가지게 되는 것이다.
상기 한약재 알레르겐은 갈근, 감초, 건칠, 녹용, 백출, 일당귀, 지구자, 창출, 천궁, 행인, 황기, 지모, 인삼, 회향, 시호, 익모초, 생지황, 치자, 후박, 황백초, 복령, 지실, 작약, 황금, 봉독, 창이자, 구기자, 산수유, 보골지, 현삼, 목통, 도인, 연교, 속단, 마인, 저령, 고본, 백지, 산약, 석창포, 세신, 오미자, 택사, 맥문동 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스트립은 지지체를 포함한다. 상기 지지체 위에는 멤브레인을 코팅하게 되며, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF), 유리, 또는 플라스틱 등 일 수 있으나, 마커를 포함할 수 있는 소재라면 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 바이오칩을 이용하는 한약재 알레르기 진단 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료 내 존재하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)는 상기 마커와의 반응을 통해 검출될 수 있고, 상기 면역글로불린 면역글로불린 E(Immunoglobulin E, IgE) 또는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)인 것일 수 있으며, 알레르기의 진단은 이를 대조군과 비교하여 검출되는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도 수준을 측정하는 것이다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 뇌척수액, 또는 뇨 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "면역 글로불린"은 혈청성분 중 기능적으로 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, x-ray crystalography 분석상 특징적인 또는 공통적인 3 차 구조를 가지는 구조적 특징, 전기영동상의 공통적인 위치로 분획화되는 물리적인 특징, 그리고 아미노산 서열 분석시 일정한 공통적인 아미노산 서열을 지니는 특징 등의 공통점으로 다른 종류의 단백질들과 명확히 구분할 수 있는 특징들을 지니는 특정 범위의 "당단백질"을 총칭하여 표현한 것이다. 면역글로불린은 기본구조는 분자량(dalton)이 약 2만 3000의 L사슬(경괘) 1쌍과 분자량 약 5만~7만의 H사슬(중쇄) 1쌍이 S-S 결합에 의해 연결되어 있으며, H 사슬의 종류인 γ, α, μ, δ, ε 에 의해 각각 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE로 분류된다. 이 중 본 발명에서는 알레르기 반응과의 관련성이 규명된 IgE 및 IgG에 관해 다루고 있다.
상기 발현되는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도 측정은 형광도, 흡광도, 자성, 전기흐름 등을 측정하는 방법이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 한약재 알레르겐 바이오칩의 제조
한약재들을 액체질소로 냉각시킨 후, 막자 사발을 이용하여 곱게 갈아주었다. 약 10 g의 한약재를 20 mM Tris(pH 8.5) 100 ml에 처리한 후 4에 밤새 교반을 통하여 한약재 알레르겐을 추출하였다. 이렇게 추출된 한약재 알레르겐 44종류를 나이트로셀룰로즈 멤브레인(NC-멤브레인)에 분주하였르며, 추출된 한약재 알레르겐의 종류를 하기 표 1에 나타냈다. 알레르겐이 고정된 NC-멤브레인은 Dry chamber에서 RT O/N건조하였다. 건조된 멤브레인을 플라스틱 지지체에 접착시키고 세로로 1.85 mm 간격으로 자른 후 직사각형의 플라스틱 반응용기에 양면 테이프를 이용하여 고정하였다. 멤브레인이 코팅된 플라스틱 반응 용기에 시료희석액(0.5% BSA, PBS) 250ul를 넣은 후 한약재 알레르기 환자의 혈청 50ul를 추가한 후 상온에서 45분동안 교반하였다. 반응 용기 안의 희석된 혈청액을 버린 후 세정액 (50mM 트리스, 0.2M NaCl, 0.05% Tween20) 400 ul를 분주하고 상온에서 5분간 교반한 후 제거한다. 이 과정을 1회 추가하였다.
번호 목록 번호 목록
1 갈근 23 작약
2 감초 24 황금
3 건칠 25 봉독
4 녹용 26 창이자
5 백출 27 구기자
6 일당귀 28 산수유
7 지구자 29 보골지
8 창출 30 현삼
9 천궁 31 목통
10 행인 32 도인
11 황기 33 연교
12 지모 34 속단
13 인삼 35 마인
14 회향 36 저령
15 시호 37 고본
16 익모초 38 백지
17 생지황 39 산약
18 치자 40 석창포
19 후박 41 세신
20 황백초 42 오미자
21 복령 43 택사
22 지실 44 맥문동
실시예 2. 혈청 내 IgE 농도 측정
Biotin 표지 마우스 항-인 IgE 항체 용액 300 ul를 반응 용기에 넣고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 항체용액을 버리고 세정액을 0.4 ml 분주하고 상온에서 5분간 교반한 후 제거하였다. Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Streptavidin-AP) (Promeg, USA) 용액 0.4ml을 넣고 30분간 교반하였다. Streptavidin-AP용액을 버리고 세정액 (50mM 트리스, 0.2M NaCl, 0.05% Tween20) 0.4ml을 분주하고 상온에서 5분간 교반한 후 제거하였으며, 이 과정을 1회 추가하였다. 0.2mg/ml의 bromochlorophenyl phosphate와 0.3mg/ml의 nitroblue tetrazolium이 포함된 발색용액 400uL를 반응 용기에 넣고 상온에서 교반시키면서 발색반응을 시켰다. 20분 후 용액을 제거하고 400ul의 증류수를 넣고 세척하고 용액을 제거한 후 건조시켰다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 실험한 혈청 내의 특이 면역글로불린E(specific immunoglobulin E, s-IgE)가 있는 한약재 알레르겐에 대하여 검정색으로 발색됨을 확인할 수 있었다. 도 2의 왼쪽 (-) 스트립은 한약재 알레르기 음성 환자의 혈청, 오른쪽의 (+) 스트립은 한약재 알레르기 양성 환자의 혈청으로 실험이 실시되었다. 대조군 S1, S2, S3, S4 마커와 표1과 동일한 목록의 44종 한약재 마커를 비교하였을 때에 양성 환자 혈청으로 실험이 실시된 바이오 칩에서 다수의 한약재 마커에 대해 발색 반응이 나타났으며, 이 때 대조군 과의 발색 정도의 비교를 통해 검체 내 한약재와 반응하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 정량화 할 수 있다.
상기 결과를 통하여, 본 발명의 한약재 알레르겐 코팅 멤브레인을 통해 생물학적 시료에 존재하는 특이 면역글로불린E(specific Immunoglobulin E, s-IgE)의 농도 측정이 가능함을 확인하였다.
실시예 3. 혈청 내 IgG 농도 측정
상기 실시예 1과 실시예 2를 따르되 실시예 2.의 'Biotin 표지 마우스 항-인 IgE 항체 용액 300 ul' 대신 'Biotin 표지 마우스 항-인 IgG 항체 용액 300 ul'를 사용하여 30분 동안 교반하였다. 상기 과정 이외의 나머지 과정을 실시예 1, 실시예 2와 동일하게 실시하였으며, 그 결과 특이 면역글로불린G(specific immunoglobulin G, s-IgG)와 반응하는 한약재 마커에서 검정색으로 발색 됨을 확인할 수 있다. 실시예 2와 마찬가지로 (-) 스트립은 음성 환자의 혈청 실험군, (+) 스트립은 양성 환자의 혈청 실험군이며, 대조군 S1, S2, S3, S4 마커와 표 1을 참고하여 특정 한약재 마커와 반응하는 특이 면역글로불린G(specific immunoglobulin G, s-IgG)의 확인 및 정량이 가능하다.
상기 결과를 통해 본 발명이 생물학적 시료 내의 특이 면역글로불린G(specific Immunoglobulin G, IgG)또한 검출 가능함을 확인하였다.
10 : 라인형 스트립
20 : 용기
30 : 마커

Claims (10)

  1. 한약재와 반응하는 생채 시료 내 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하여 한약재로 야기되는 알레르기를 진단하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 바이오칩은 하나의 반응 용기 내에 스트립(strip); 및
    상기 스트립을 고정하는 용기; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 스트립은 라인형, 도트형, 병렬식 라인형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 스트립은 한약재 알레르겐(allergen)을 마커로 포함하는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 한약재 알레르겐(allergen)은 갈근, 감초, 건칠, 녹용, 백출, 일당귀, 지구자, 창출, 천궁, 행인, 황기, 지모, 인삼, 회향, 시호, 익모초, 생지황, 치자, 후박, 황백초, 복령, 지실, 작약, 황금, 봉독, 창이자, 구기자, 산수유, 보골지, 현삼, 목통, 도인, 연교, 속단, 마인, 저령, 고본, 백지, 산약, 석창포, 세신, 오미자, 택사, 맥문동으로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 스트립은 지지체 위에 멤브레인(membrane)을 코팅하는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단용 바이오칩.
  8. 제 1항의 진단용 바이오칩 마커에 생물학적 시료를 접촉시켜, 시료 내에 존재하는 특이 면역글로불린(항체, antibody)의 농도를 측정하는 한약재 알레르기 진단 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 면역글로불린은 면역글로불린 E(Immunoglobulin E, IgE) 또는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)인 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 뇌척수액, 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 한약재 알레르기 진단 방법.
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