KR20180006879A - 새로운 자가-희생 링커를 갖는 크립토파이신-계 항체-약물 콘쥬게이트 - Google Patents

새로운 자가-희생 링커를 갖는 크립토파이신-계 항체-약물 콘쥬게이트 Download PDF

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엠. 크리스티안 스타인쿨러
엠. 파올라 갤리나리
비앙카 오스왈드
노버트 시왈드
마커스 리츠펠트
마르셀 프레제
에두아르드 피구에라스
릴라 페토
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Abstract

본 발명은 항체- 또는 펩티드-약물 콘쥬게이트 화합물에 관한 것으로, 여기서 하나 이상의 크립토파이신 유도체 (매크로시클릭 뎁시펩티드)는 자가-희생 링커에 의해 공유적으로 부착되고, 상기 자가-희생 링커는 하나 이상의 종양-관련 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합한다. 상기 링커는 디케토피페라진을 형성할 수 있는 프로테아제 및 디펩티드 단위에 대한 분열 사이트를 포함한다. 이들 화합물은 암, 다른 질병 및 질환, 예를 들여 면역 또는 감염성 질병의 진단 또는 치료 방법에 유용할 수 있다.

Description

새로운 자가-희생 링커를 갖는 크립토파이신-계 항체-약물 콘쥬게이트
본 발명은 의약화학에 관한 것으로, 특히 항암 활성을 갖는 화합물, 보다 구체적으로 화학요법적 매크로시클릭(macrocyclic) 뎁시펩티드(depsipeptide) 약물 또는 톡신과 콘쥬게이트된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환에 의해 영향받은 포유류 또는 대상의 인비트로 (in vitro), 인 사이투(in situ), 및 인비보 ( in vivo) 진단 또는 치료에 사용되는 용도의 상기 화합물에 관한 것이다.
항체 치료법은 암, 면역학적 및 맥관기원(angiogenic) 질병을 갖는 환자의 표적 치료를 위해 수립되어 왔다. 이러한 목적으로, 치료적 모노클론 항체(TMAs)가 개발되어 왔다(Firer M. A. J. Hematol . Oncol . 2012, 5, 70; Mullard, A. Nature Rev. Drug Discov . 2013, 12, 329). 그러나, 그들 자체에 사용되었을 때 임상전 연구에서 전도 유망했던 많은 TMAs는 불충분한 암 세포 독성 때문에 임상에서는 실패하였다.
모노클로날 항체 치료법은 암, 면역학적 및 맥관기원 질병을 갖는 환자의 표적 치료를 위하여 수립되어 왔다. 성공적인 항체 치료법의 예는 HERCEPTIN® (트라스투주맵)이며, 이는 인간 표피 성장 인자 수용체 2 단백질의 세포외 도메인, HER2 (ErbB2)에 대하여 높은 친화도를 가지고 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유래 인간화된 모노클로날 항체이다(US 5,821,337; US 6,054,297; US 6,407,213; US 6,639,055; Coussens L, et al (1985) Science 230:1132-9; Slamon D J, et al (1989) Science 244:707-12). HERCEPTIN은 항암치료 전에 광범위하게 받는 ErbB2-과다 발현하는 유방암 환자 치료에서 돌파구이지만, 이러한 집단에서 환자 대다수는 HERCEPTIN 치료에 대해 실패하거나 또는 좋지 못한 반응만을 나타낸다.
그러한 문제를 극복하기 위하여, 항체-약물 콘쥬게이트(ADCs) 분야에서 지수적 성장이 있어왔으며, 여기서 모노클로날 항체 (mAb, e.g. 트라스투주맵)은 높은 세포독성 약물에 연결된다. ADCs은 암 치료법에서 점점 더 중요해진다. 3개 ADCs는 US FDA에서 승인되었다:Mylotarg® (겜투주맵 오조가미신, Wyeth Pharmaceuticals), Adcetris® (브렌툭시맵 베도틴, Seattle Genetics), 및 Kadcyla® (아도-트라스투주맵 엠탄신, Roche), 반면에 35 ADCs은 현재 임상 시험 중에 있다. 종양 선택성은 mAb에 의해 나타나는 반면에 이 링커는 생리학적 조건 하에서 약물의 방출, 안정성 및 전체 용해성에 책임이 있다.
Mylotarg®은, 칼리키아마이신(calicheamicin)에 연결된 hu CD33 항체로 구성되며, 급성 골수성 백혈병의 치료를 위해 2000년에 승인되었으나, 2010년에 취소되었다. Adcetris®(브렌툭시맵 베도틴, Seattle Genetics, 이하 화학식 1)는 2011년에 승인되었고, 전통적인 호지킨 림프종 (HL) 및 전신역형성대세포림프종 (systemic anaplastic large cell lymphoma, sALCL)에서 나타나는, CD30에 대한 항체에 연결된 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)으로 구성되며, Kadcyla® (아도-트라스투주맵 엠탄신, Roche, 이하 화학식 2)는 난치성 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 양성 전이 또는 국소적으로 진행된 유방암의 치료를 위해 2013년에 승인되었고, 세포 독성제 메르탄신(DM1)에 연결된 모노클로날 항체 트라스투주맵 (Herceptin)을 포함한다.
아도-트라스투주맵 엠탄신 (Kadcyla®) 및 브렌툭시맵 베도틴 (Adcetris®)은 US FDA 및 EMA(European Medicine Agency)에 의해 현재 승인된 단 2개의 ADCs이다.
Figure pct00001
아도-트라스투주맵 엠탄신
화학식 2
크립토파이신의 놀라운 활성은 일부 환자들에게서는 늦게 인식되었다. Endocyte사는 분열가능한 디설파이드 링커를 장착한 크립토파이신 폴레이트 콘쥬게이트(화학식 3)을 특허받았다. 그러한 폴레이트 콘쥬게이트는 폴레이트 수용체를 과발현하는 암 세포를 표적으로 한다 (US2009/002993).
Figure pct00002
화학식 3
Sanofi-Aventis는 아주 최근에 크립토파이신 항체-약물 콘쥬게이트 (ADCs)에 대한 데이터를 개시하는 2개 특허를 공개하였다(US2011/001052; FR2947269). 변형된 아릴 치환기를 갖는 크립토파이신 유도체는 주로 적당한 기능성을 갖는 크립토파이신을 얻도록 선택되었다(화학식 4).
Figure pct00003
화학식 4
이들 중 다른 링커 타입, 분열가능한 디설파이드-, PEG-, 티오에테르- 및 티아졸 링커가 사용되었다. 모든 경우에, 상기 링커는 hu2H11에 연결되었고, 이는 EphA2 수용체를 표적으로 하는 모노클로날 항체이다. 2개 크립토파이신 ADCs에 대한 IC50의 값은 또한 인간 유방암 세포-주 MDA-MB-231에 대해 보고되었다. 화학식 4로 나타난 ADC는 입체적으로 가려진 티오에테르 링커를 포함하며, IC50값이 0.710nM을 나타낸다. 또 다른 ADC는 입체적으로 가려진 디설파이드 링커(IC 50: 0.150nM)를 포함한다. 치환된 크립토파이신은 약물 저항성 세포에 대해 세포독성 활성을 느슨하게 하는 것으로 보고되었다.
대조적으로, 콘쥬게이트되지 않은 크립토파이신(화학식 5)는 다중-약물 저항(MDR) 암 세포에 대하여 조차 매우 높은 세포독성을 갖는 것으로 보고된다. 크립토파이신-52은 다중-약물 저항(MDR) 종양 세포주에 대하여 매우 높은 활성을 나타낸다. 많은 MDR 종양 세포는 P 글리코단백질(P-gp)를 발현하고, 이는 유출 펌프로서 작동한다. P-gp 저항성 약물을 합리적으로 디자인하는 것은 여전히 어렵기 때문에 이러한 활성은 크립토파이신의 또 다른 귀중한 특징이다.
첫번째로 대표적인 것은 1990년에 시아노박테리아 Nostoc sp.로부터 분리되었다. 이들의 생물 작용(bioactivity)은 단백질 튜블린과 이들의 상호작용을 기초로 한다. 크립토파이신은 마이크로튜블 동력학(microtubule dynamics)의 억제로 인하여 아포프토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 크립토파이신 유사체는 잠재적 항종양제인 것으로 생각된다.
크립토파이신-52 (LY355703)은 임상 I 연구를 통과하였으나, 이어지는 임상 II 단계 연구는 인비보 효능의 결핍, 높은 신경독성 및 선택된 용량에서 용량-제한 독성 때문에 중단되었다.
Figure pct00004
화학식 5
단지 몇가지 ADCs만이 현재 암 치료법에 대해 승인되었다. 보다 높은 다양성의 ADCs가 약물 저항성과 협력하기 위해서 필요하다.
현재까지 어떠한 크립토파이신-계 ADC가 승인되지 않았고, 어떠한 크립토파이신-55-글리시네이트도 항체에 대한 콘주게이션을 설명하고 있지 않다.
모든 설명된 크립토파이신 콘쥬게이트는 긴 합성 경로에 의해서만 접근 가능하다(예를 들어 W02011/001052 참조). 그러나, Sewald 및 공동 연구자들은, 짧으면서도 효율적인 합성 경로를 설명하였다 (Nat. Prod. Rep. 2013, 30, 924-940).
질병, 특히 암, 면역학적 질병, 감염성 질병의 치료에서 안전한 사용을 위하여 약물 콘쥬게이트, 특히 항체-약물 콘쥬게이트(또한 일반적으로 ADCs라고도 함) 및 펩타이드-약물 콘쥬게이트(또한 일반적으로 PDCs라고도 함)를 제공할 강한 필요성은 여전히 남아 있다.
질병, 특히 암, 면역학적 질병, 감염성 질병의 진단에 사용하기 위하여, 약물 콘쥬게이트, 특히 항체-약물 콘쥬게이트(또한 ADCs라 함) 및 펩티드-약물 콘쥬게이트(또한 일반적으로 PDCs라 함)를 제공할 필요성이 여전히 남아있다.
다중 약물 저항성을 진전시킬 암, 면역학적 질병 및 감염성 질환의 치료에서 사용하기 위한 약물 콘쥬게이트, 특히 항체-약물 콘쥬게이트 (또한 ADCs라고 함) 및 펩티드-약물 콘쥬게이트(또한 일반적으로 PDCs라 함)을 제공할 강한 필요성이 있다.
클로로히드린 크립토파이신-55이 자가-희생적, 펩티드-유래 링커를 가로질러 모노클로날 항체 또는 펩티드에 연결되는 콘쥬게이트가 종양 세포에 대하여 매우 효율적인 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트는 하나 이상의 종양-관련 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합하여, 이들은 치료되거나 진단될 수 있는 이들 질병의 진단 또는 치료에 사용될 수 있으며, 이는 종양-관련 항원 또는 세포-표면 수용체, 단백질 또는 항원에 대한 결합 덕분이다.
본 발명의 목적은 화학식(I)의 콘쥬게이트 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
Figure pct00005
여기서 R은 -CO-CH2-X-(A)n-B이고
여기서 X는 NRa로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 Ra 는 H 및 C1-C10 알킬, 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되며;
A는 자가-희생 링커이고,
n 는 0 또는 1이며;
B는 펩티드, 폴리펩티드/단백질, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 목적은 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 비이클 및/또는 부형제와 혼합물로서 상술된 콘쥬게이트를 활성성분으로서 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제로서 사용되는 상술된 콘쥬게이트이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진단용으로 사용되는 상술된 콘쥬게이트이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적은 실시예 및 도면에 의해 또한 지금부터 상세히 설명될 것이다.
도면에서:
도 1: 패널에 표시된 화합물로 HER2-양성 SK-BR3 세포를 처리한 후 세포 생존도를 나타낸다.
도 2: 약물 링커-콘쥬게이트된 항체의 정제를 나타내며, 피크 2는 크리토파이신 55-글리시네이트-콘쥬게이트된 항체의 모노머릭 형태에 대응하고 피크 1은 올리고머릭 형태에 대응하며(도 2의 왼쪽 패널), 이는 적당한 단백질 MW 표준(도시되어 있지 않음) 및 정제된 콘쥬게이트되지 않은 항체(도 2, 오른쪽 패널)과 비교에 의해 평가되었다.
도 3: 옥트레오티드와 함께 본 발명의 콘쥬게이트로 처리한 AR42J 세포를 처리하여 얻어진 잔류 세포 생존도 플롯을 나타낸다.
도 4: 옥트레오티드와 함께 본 발명의 콘쥬게이트로 처리한 MCF7 세포를 처리한 후 얻어진 잔류 세포 생존도 플롯을 나타낸다.
도 5: 야생 타입 및 약물 저항성 H69AR 세포주에 대한 크립토파이신 또는 크립토파이신 약물 링커 세포독성을 나타낸다. 도면에서, 링커 73는 실시예 6에, 링커 76은 실시예 5에 보여진다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트는 항체, 바람직하게는 모노클로랄 항체를 갖는 약물 콘쥬게이트, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 갖는 약물 콘쥬게이트일 수 있다.
항체, 특히 모노클로날 항체는 치료법, 특히 약물과의 콘쥬게이션을 위한 치료법에서 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트는, 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체와의 약물 콘쥬게이트일 수 있으며, 여기서 이것은 또한, 간략하게 ADC라 할 수 있고, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과의 약물 콘쥬게이트일 수 있으며, 이것은 간단히 PDC라 할 수 있다.
펩티드는 특히 약물과의 콘쥬게이션을 위한 치료법에 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질는 천연 아미노산, L- 도는 D- 둘 다 구성의 천연 아미노산뿐만 아니라 인공 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 콘쥬게이트에서, 상기 항체는 모노크로날 항체 또는 나노바디(nanobody)이다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 나노바디는 단일-도메인 항체 및 낙타 항체(camelid antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 상기 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)에서, 상기 모노클로날 항체는 트라스투주맵, 겜투주맵, 브렌툭시맵, 리툭시맵, 세툭시맵, 패니투무맵(panitumumab), 오파투무맵(ofatumumab), 오비누투주맵(obinutuzumab), 페르투주맵(pertuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드 B는 소마토스타틴 수용체에 결합한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드는, 옥트레오티드, 파시레오티드(pasireotide) 또는 란레오티드(lanreotide)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시예에서, 상기 콘쥬게이트에서, 상기 자가-희생 링커 A는 화학식 (II)의 모이어티이다.
Figure pct00006
여기서 R1 는 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, R2는 선택적으로 R1와 함께, 아미노산 측쇄의 잔기이고, R3는 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, R4 는 선택적으로 R3와 함께, 아미노산 측쇄의 잔기이다.
바람직한 실시예에서, 상기 콘쥬게이트에서, 상기 자가-희생 링커 A는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00007
및
Figure pct00008
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (III)을 가지며,
Figure pct00009
여기서 R1, R2, R3 및 R4는 상기 정의된 것과 같으며, X는 NH, N-(C1-C10) 알킬, O으로 이루어진 군으로부터 선택되며; mAb는 모노클로날 항체 또는 나노바디, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (IV)를 갖는다.
Figure pct00010
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (V)를 갖는다.
Figure pct00011
여기서 R1 는 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, R4는 선택적으로 R1와 함께, 아미노산 측쇄의 잔기이고; X는 NH, N-(C1-C10) 알킬-O으로 이루어진 군으로부터 선택되며; mAb는 모노클로날 항체, 펩티드 또는 폴리펩티드을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (VI)를 갖는다.
Figure pct00012
본 발명의 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 암, 자가면역 질환 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료적 치료에 대한 용도이다.
본 발명의 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 암, 자가면역 질환 및 감염성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 진단 용도이다. 인비보외에, 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 인비트로 또는 인사이투 진단에 대해 또한 사용될 수 있다.
용어 C1-C10 알킬은 선형 또는 분지된 알킬을 의도한 것이다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 노닐, 데실 및 이들의 모든 아이소머이다.
본 발명에 따라, 약제학적으로 허용가능한 염은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으므로 특별히 개시될 필요는 없다. 통상의 기술자는 염이 본 발명의 목적에 적당할지 여부를 알고 있으며, 문헌, 매뉴얼, 핸드북 등에 대하여 폭넓게 참조, 예를 들어 다음을 참조할 수 있다: Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, 및 Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), Wiley.
본 발명의 바람직한 양상에서, 크립토파이신-55 글리시네이트 또는 크립토파이신 글리콜레이트가 사용된다. 이들은 세포독성을 나타내며, 이는 크립토파이신-55 (표 1)의 것보다 실질적으로 낮지 않으며, 추가적으로 콘쥬게이션에 적당한 기능기의 장점을 갖는다. 이 기능을 통해, 크립토파이신-55-글리시네이트 또는 크립토파이신-55-글리콜레이트는 프로테아제 분열가능한, 자가-희생 링커를 통해 모노클로날 항체에 콘쥬게이트될 수 있다(예를 들어, 트라스투주맵은 모든 유방 종양의 20-25%에서 과발현된 HER2-수용체로 향하는 높은 선택성을 나타낸다).
Figure pct00013
화학식 (IV) 크립토파이신 -55- 글리시네이트 ADC
자가-희생 링커는 약물-콘쥬게이트, 특히 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC) 및 펩티드-약물 콘쥬게이트의 디자인에서 잘 알려져 있다. 예를 들어 US 6214345 및 관련된 참조 문헌; 또는 Carl P.L. et al. (1982)을 참조. 상기 링커는, 단백질 내에 존재하는 기능기(티올, 아민, 등), 친수성 스페이서 내 존재하는 기능기(e.g. 에틸렌 글리콜 계), 프로테아제 분열 사이트 (e.g. Val-Cit), 및 크립토파이신-55, 크립토파이신-55 글리시네이트, 크립토파이신-55 글리콜레이트, 또는 다른 펩티도미메틱 크립토파이신-55 유도체을 방출할 수 있는 디펩티드 (반응식 2) 또는 트리펩티드 단위 (반응식 1)에 대해 반응적인 부착 사이트로 구성된다. 크립토파이신-55 는 크립토파이신-52으로 전환되는 것으로 추정된다.
Figure pct00014
반응식 1. 프로테아제에 의한 분열은, 디케토피페라진 및 크립토파이신-55 유도체 (e.g. 글리시네이트) (R1 = H, 알킬, R2 = 임의의 아미노산 측쇄, R3 = H, (C1-C10) 알킬, R4 = 임의의 아미노산 측쇄, X = NH, N(C1-C10) 알킬, O)을 방출한다.
Figure pct00015
반응식 2. 프로테아제에 의한 분열은, 디케토피페라진 (X = NH 또는 N-(C1-C10) 알킬) 또는 디케토모르폴린 (X =O) 및 크립토파이신-55 (R1 = H, (C1-C10) 알킬, R4 = 임의의 아미노산 측쇄, X = NH, N(C1-C10) 알킬, O)을 방출한다.
본 발명의 콘쥬게이트는, 당해 기술분야에서 잘 알려진 종래 기술에 따라 제조될 수 있다.
예를 들어, 크립토파이신-52는 다음 문헌에 공개된 경로에 따라 제조될 수 있다[Weiss C, et al (2012) Beilstein Journal of Organic Chemistry 8:2060-6 and Weiss C, et al (2013) Natural Product Reports 30:924-40].
크립토파이신-55은, 예를 들어 크립토파이신-52의 옥시란 링(oxirane)을 개방하는 것에 의하여, 크립토파이신-52로부터 출발하여 제조될 수 있다. 할로겐 원자를 도입하기 위하여 옥시란 링을 개방하는 것은 통상의 기술자의 지식에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 염화수소산이 사용될 수 있다. 반응 매질은 통상 원하는 생성물의 반응 조건 및 반응 및 분리의 작업뿐만 아니라 이러한 종류의 반응에 적당한 유기 용매이다.
크립토파이신-55-글리시네이트는, 예를 들어 대응하는 트리플루오로아세테이트를 통하여, 잘 알려진 합성 방법에 따라 또한 제조될 수 있다(see Liang J, et al (2005) Investigational New Drugs 213-224).
본 발명에 적당한 자가-희생 링커뿐만 아니라 이들의 제조는 또한 잘 알려져 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, tert-부틸-15-히드록시-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트는 Seitz O, et al (1997) Journal of Organic Chemistry 62:813-826에 공개된 방법에 따라 합성될 수 있다. tert-부틸-15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트는 다음에 따라 합성될 수 있다: Warnecke A, (2002) Dissertation. 15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노산은 다음에 따라 제조될 수 있다: Warnecke A, (2002) Dissertation.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly는 표준 Fmoc SPPS 에 따라 합성될 수 있다 [Fields G 및 Noble R L, (2009) International Journal of Peptide and Protein Research 33,3:161-214].
다른 잘 알려진 자가-희생 링커가 본 발명에 사용될 수 있다.
이후, 크립토파이신-55-글리시네이트 펩티드는 잘 알려진 말레이미드 콘쥬게이션 방법에 의해 제조될 수 있다.
크립토파이신-55-글리시네이트를 갖는 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC)는 당해 기술 분야의 일반 지식에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, TCEP (tris(2-카르복시에틸)포스핀) 방법으로 상기 항체 사슬간 디설파이드 결합의 부분적 환원 또는 2-MEA (2-메르캅토에틸아민·HCl) 방법으로 항체 사슬간 디설파이드의 부분적 환원.
임의의 다른 적당한 방법이 편리하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드-약물 콘쥬게이트 (PDC)는 종래 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 ADCs 및 PDCs는, 예를 들어, ADCs에 대해서는, 항체를 인식하거나, 또는 PDCs에 대해서는 펩티드에 의해 인식된 수용체를 제시하는 선택된 세포주에 대한 인비트로, 또는 시험실 동물 모델을 사용하는 인비보 방법에 의해 이들의 효능이 시험될 수 있다.
본 발명에 따라 크립토파이신-55-글리시네이트 ADC는 Her2-양성 유방 암종 세포주 (SK-BR3)에 대해 트라스투주맵보다 매우 높은 세포독성을 나타낸다.
크립토파이신-55 및 크립토파이신-55-글리시네이트과 다른, ADC 세포독성 효과는, MCF7에 비하여 HER2-양성 SK-BR3 세포주, 낮은 HER2 발현을 하는 유방암 세포주 또는 HCT116, 낮은 HER2-발현의 결장 암종 세포주 대하여 매우 선택적이다.
본 발명에 따라 크립토파이신-계 콘쥬게이트는 몇 가지 장점을 제공한다.
상기 크립토파이신 유도체는 나노몰 또는 서브나노몰 농도에서 이미 종양 세포에 대해 세포 독성 효과를 나타낸다.
방출된 크립토파이신 유도체는 PgP에 대한 기질이 아니므로, 크립토파이신에 대한 저항성은 낮을 수 있다.
상기 합성 경로는 크립토파이신-55-글리시네이트를 기초로 하며, 크립토파이신은 콘주게이션 전에 이들 백본에 화학적 변형을 할 필요가 없다.
HER2-과발현하는 유방 종양 세포의 선택적 지정(addressing)은 항체를 통해 가능하다.
ADC는 링커의 효소적 분열 후 디케토피페라진 유도체 또는 유사체의 형성과 함께 약물-해방의 대안적 메커니즘을 제공한다.
상기 크립토파이신 유도체는 다른 콘쥬게이트를 합성하는데 사용될 수 있어 약물 콘쥬게이트에 대해 보다 높은 다양성을 제공한다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트는 약제학적 조성물로 투여될 수 있으며, 여기서 효과적인 함량의 콘쥬게이트는 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 비이클 및/또는 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된다.
상기 조성물은 동물 또는 인간 투여에 적당하다.
본 발명의 조성물은 상기 조성물이 대상, 즉 동물이나 인간에 투여되게 하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은, 고체, 액체 또는 기체(에어로졸)의 형태일 수 있다. 투여의 전형적인 경로는, 제한 없이, 경구, 국소적, 비경구, 혀밑, 직장, 질, 눈의, 및 비강내를 포함한다. 비경구 투여는 피하 주사, 정맥, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 비경구로, 보다 바람직하게는 정맥으로 투여된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 콘쥬게이트가 투여시 생체이용가능하도록 제형화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 복용 단위의 형태를 취할 수 있다.
약제학적 조성물을 제조하는 데 사용되는 물질은 사용된 함량에서 무독성일 것이다.
약제학적 조성물에서 활성 성분의 복용량은 다양한 인자들, 예를 들어 투여되는 대상의 타입(예를 들어 인간), 본 발명의 콘쥬게이트의 특정 형태, 투여의 방법 및 사용되는 조성물에 따라 달라진다.
약제학적으로 허용가능한 담체 및 비이클은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 추가 설명이 필요하지 않다. 이들은 고체, 예를 들어 입자 형태, 또는 액체, 예를 들어 경구용 시럽 또는 주사가능한 액체일 수 있다. 게다가 담체 또는 비이클은 기체일 수 있으며 예를 들어 흡입 투여에 유용한 에어로졸 조성물을 제공할 수 있다.
경구 투여하고자 할 때, 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체이고, 여기서 반-고체, 반-액체, 현탁액 및 겔 형태는 고체 또는 액체로서 여기 고려된 형태 내에 포함된다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 상기 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 필, 캡슐, 츄잉검, 와퍼 또는 유사 형태로 제형화될 수 있다. 그러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제를 포함한다. 게다가, 하나 이상의 다음의 것들이 존재할 수 있다: 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분, 락토오스 또는 덱스트린; 붕해제, 예를 들어 알긴산, 소듐 알지네이트, 옥수수 전분 및 이와 유사한 것; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 활택제(glidant), 예를 들어 콜로이드성 실리콘 디옥시드; 감미제, 예를 들어 수크로오스 또는 사카린, 착향료, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 착향제, 및 착색제.
조성물이 캡슐 형태, 예를 들어 젤라틴 캡슐일 때, 이것은 상기 타입의 물질 외에, 액체 담체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린 또는 지방오일을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 액체, 예를 들어 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 액체는 경구 투여 또는 주사로 인한 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여하고자 할 때, 조성물은 하나 이상의 감미제, 방부제, 염료/착색제 및 향 증진제를 포함할 수 있다. 주사 투여를 위한 조성물에서 하나 이상의 계면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장제가 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 액체 조성물은, 이들이 용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태이든지 간에, 또한 하나 이상의 다음 것들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용 물, 염류 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액 등장 식염액, 고정유, 예를 들어 용매 또는 현탁화 매질로서 기능할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 시클로덱스트린, 프로필렌글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예를 들어 벤질알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 소듐 비설파이트; 킬레이트화제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성(tonicity) 조절제, 예를 들어 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. 비경구 조성물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리, 플라스틱 또는 다른 물질로 제조된 다중 용량 바이알 내에 포함될 수 있다. 생리 식염수는 바람직한 아주반트이다.
주사가능한 조성물은 바람직하게는 멸균된다.
특정 질병 또는 상태의 치료에 효과적인 본 발명의 콘쥬게이트의 함량은 질병 또는 상태의 성질에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 인비트로 또는 인비보 분석은 선택적으로 최적 복용 범위를 확인하는 것을 돕기 위하여 사용될 수 있다. 상기 조성물 내에 사용될 정확한 용량은 투여 경로, 질병 또는 상태의 심각성에 따라 달라질 것이며, 실무자의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야만 한다.
본 발명에 따른 조성물은 적당한 복용량이 얻어지도록 효과적인 함량의 본 발명의 콘쥬게이트를 포함한다.
복용량은 투여될 대상의 체중 또는 체표면에 따라 결정될 것이다.
일반적으로, 용량은 전형적으로 동물 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 약 250 mg/kg이다.
또 다른 실시예에서, 자가면역 질환의 증상 또는 종양의 사이트(또는 이전 사이트)에서 직접적 주사로 투여가 이루어질 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 소낭(vesicle), 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(다음 참조: Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.)
또 다른 실시예에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 제어된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (다음 참조: Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). 또 다른 실시예에서, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다(다음 참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press, Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); see also Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). 또 다른 실시예에서, 제어된 방출 시스템은 본 발명의 화합물 또는 조성물의 표적, 예를 들어 뇌 근처에 놓여질 수 있어서, 단지 시스템 용량의 일부분만 필요하다(다음 참조: e. g., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Langer (Science 249: 1527-1533 (1990))에 보여진 다른 제어된 방출 시스템이 사용될 수 있다.
용어 담체는 희석제, 아주반트 또는 부형제를 의미하며, 이와 함께 본 발명의 콘주게이트가 투여된다. 그러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어 땅콩 오일, 콩 오일, 미네랄 오일, 참께 오일 및 이외 같은 것들을 포함하는 액체, 예를 들어 물 및 오일일 수 있다. 상기 담체는 염류, 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아, 및 이와 같은 것들일 수 있다. 게다가, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 동물에 투여될 때, 본 발명의 화합물 또는 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균된다. 물은 본 발명의 화합물이 정맥으로 투여될 때 바람직한 담체이다. 염류 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체, 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적당한 약제학적 담체는 또한 부형제, 예를 들어 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 이외 같은 것들일 수 있다. 필요하다면 본 조성물은, 또한 습윤제 또는 에멀화제, 또는 pH 완충화제 소량을 포함할 수 있다.
본 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 필, 펠렛 및 캡슐, 액체를 포함하는 캡슐, 분말, 지효성 제형(sustained-release formulation), 좌약, 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 또는 사용에 적당한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다.
E. W. Martin 저자의 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 를 참조할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 더 설명한다.
실시예 1
TCEP ( tris(2-카르복시에틸)포스핀 ) 방법으로 항체 사슬 간 디설파이드 결합의 부분적 환원에 의한 크립토파이신-55-글리시네이트 ADC의 제조
새롭게 제조한 PBS-EDTA-완충제 pH 7.2로부터, TCEP-PBS-EDTA-용액 [100 ㎕의 PBS-EDTA-용액 중 3 mM TCEP (Sigma-Aldrich)] 및 mAb-PBS-EDTA-용액 (0.8 mL PBS-EDTA-용액 중 9 mg/mL 트라스투주맵; 62 μM 트라스투주맵)을 제조하였다. 상기 TCEP-PBS-EDTA-용액을 mAb-PBS-EDTA-용액에 첨가하고, 얻어진 용액을 60min 동안 25℃에서 배양하였다. 시약의 최종 농도는 다음과 같다: 8 mg/mL 환원된 트라스투주맵 (55 μM), 290 μM TCEP.
PBS-EDTA-완충제 pH7.2에서 사전 평형화된 HiTrap Desalting Sephadex G25-5 mL (GE Healthcare/Amersham) 컬럼 상에서 탈염이 Akta instrument을 사용하여 수행되었고, 0.25mL 부피의 분획물들이 PBS-EDTA-완충제 내에서 수집되었다. 모든 분획물은 이들의 단백질-함량에 대해 시험되었다 (2 ㎕의 각 분획물은 200㎕ Bradford-용액에 첨가되었다). 상기 단백질-함유 분획물이 모아지고, 항체 농도는 Bradford 분석으로 재결정되어, 3.3 mg/mL (22.8 μM)를 얻었으며, 이는 총 항체의 5mg의 회수(70% 회수)이다. 유리-SH의 농도는 Elmann's 시약 DTNB (5,5'-디티올비스-(2-니트로벤조산), Sigma-Aldrich/Fluka) 및 L-Cys (40-50-100-200-400-800 μM)을 사용한 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 총 -SH 농도는 3개 유리-SH/항체의 평균으로 68.24 μM이었다.
사슬 간 디설파이드 결합의 부분적 환원은 상술한 바와 같이 반복되었고, 말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly-크립토파이신-55-글리시네이트 (DMSO 중 1.5 mM; 100 ㎕) 용액을 4℃에서 2h 동안 계속 교반하면서 샘플(900μL)에 직접 적가하여, 최종 농도가 10% DMSO 중 150μM이 되게 하여, 유리-SH기에 대하여 1:1 몰비 및 항체(항체 최종 농도는 50μM이었고, 총 유리 SH의 150μM에 등가임)에 대하여 3: 1 몰비가 되게 하였다. 동시에, S-S 환원된 항체 대조군 샘플은 대조군으로서 콘쥬게이트되지 않게 두었다. 배양 시간 마지막에, 각 샘플은 즉각 HiTrap Sephadex G25 컬럼 위에 부하하였고 상술한 바와 같이 탈염을 수행했다. Bradford 및 Elmann 분석은 상술한 바와 같이 통합된 분획물에서 수행되었고 결과는 이하 요약되었다.
Figure pct00016
선택된 면역접합체(immunoconjugation) 반응 조건하에서, SH/IgG의 평균 수는 2.7 내지 0.5로 떨어졌고, 따라서 이는 약물 링커에 대한 결합이 약 2의 약물-항체 비(DAR)로 일어난다는 것을 암시한다.
이후 조제용 겔 배제 크로마토그래피는, Akta instrument을 사용하여 수행되었다. 500㎕의 크립토파이신-55-글리시네이트-콘쥬게이트된 것과, 콘쥬게이트되지 않은 mAb 샘플을, 크로마토그래픽 완충제로서 PBS-EDTA pH7.2을 사용하여 Superdex 200 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare/Amersham) 위에 부하시키고, 흐름 속도 0.5 ml/min을 적용하였다. 250 ㎕-분획물들을 수집하였다. 약물 링커-콘쥬게이트된 항체의 정제는 2개 단백질 피크를 유지하였고, 피크 2는 크립토파이신-55-글리시네이트-콘쥬게이트된 항체의 모노머릭 형태에 대응하고 피크 1은 올리고머릭 형태에 대응하며, 이는 적당한 단백질 MW 표준과 비교하여 평가하였다(도 2, 왼쪽 패널). 대조적으로, 콘쥬게이트되지 않은 mAb 샘플은 단일 피크를 나타내고, 이는 상기 항체(mAb 대조군)의 모너머릭 형태에 대응한다(도 2, 오른쪽 패널). 피크 분획물은 통합되고 Bradford 분석에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 결과는 이하에 요약되었다.
Figure pct00017
실시예 2
2-MEA (2- 메르캅토에틸아민 ·HCl) 방법을 가지고 항체 사슬 간 디설파이드 결합의 부분적 환원으로 크립토파이신-55-글리시네이트 ADC의 제조
새롭게 제조된 PBS-EDTA-완충제 (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; 10 mM EDTA; pH = 7.2)로부터, 2-MEA-PBS-EDTA-용액 (100 ㎕ PBS-EDTA-용액 중 6 mg 2-MEA) 및 mAb-PBS-EDTA-용액 (1 mL PBS-EDTA-용액 중 10 mg 트라스투주맵; 68.7 μM 트라스투주맵)을 제조하였다. 2-MEA-PBS-EDTA-용액 (300 ㎕)을 mAb-PBS-EDTA-용액 (1 mL)에 첨가하고, 얻어진 용액을 90min 동안 37℃에서 배양하였다. 시약의 최종 농도는 다음과 같다: 7.7 mg/mL 환원된 트라스투주맵 (53 μM), 13.8 mg 2-MEA (122 mM).
이후 HiTrap Desalting Sephadex G25 5 cm 컬럼 (PBS-EDTA-완충제) 상에서 탈염을 하고, 0.5mL 부피의 분획물들을 수집하였다. 모든 분획물들은 이들 단백질-함량에 대해 가시적으로 시험하였다 (2 ㎕의 각 분획물들을 200㎕ Bradford-용액에 첨가하였다). 단백질-함유 분획물은 수집되고 말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly-크립토파이신-55-글리시네이트 (DMSO 중 1.82 mM; 150 ㎕) 용액을 첨가하였다. 2h 동안 6℃에서 배양하고 1/5mL 미만의 부피까지 용액을 농축하였다. Akta Purifier (Superdex 200 highload 16/60 컬럼; PBS-EDTA-완충제)로 정제하여, 2개 분핵물을 만들고 mAb-Cry-55-링커-피크 1(1.54 ㎍/㎕) 및 mAb-Cry-55-링커-피크2 (0.32 ㎍/㎕)으로 농축하였다. 피크 1 및 2는 상술한 2개 항체 응집 상태에 대응한다.
실시예 3
세포 생존도 분석
종양 세포주 (유방 암종 세포주 SKBR-3 및 MCF7 및 결장 암종 세포주 HCT116)는 American Type Culture Collection으로부터 얻어졌고, 표준 프로토콜에 따라 성장되었다. SKBR-3 세포는 높은 Her 2 준위를 발현하는 것으로 알려져 있으므로, 트라스투주맵-민감성이며, 반면에 MCF7 및 HCT116 세포는 낮은 Her 2 발현을 보이므로, 트라스투주맵-저항성이다. 종양 세포 생존도에 대한 크립토파이신-55-글리시네이트 ADC 콘쥬게이트의 효과는, 제조자의 프로토콜에 따라서 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega)을 사용하여 평가하였다. 콘쥬게이트되지 않은 트라스투주맵 및 트라스투주맵 ADC 사이의 차이를 검출할 수 있도록, 우리는 사전에 실험 조건들(농축 범위, 배양 시간)을 사전에 확인하였고, 이 조건 하에서 트라스투주맵만이 약 30%로 SKBR-3 세포 생존도에 영향을 미친 반면에, 유리 크립토파이신 55는 모든 종양 세포주에 동등하게 효과적이다. 세포들은 검은색-벽 96-웰 플레이트 내에 플레이트하였고(SKBR-3 및 MCF7에 대해 웰 당 5000 세포; HCT116에 대하여 웰 당 2000 세포), 5% CO2의 습기 조건 내에서 37℃에서 밤새 접착시켰다. 매질을 제거하고 트라스투주맵 ADC, 콘쥬게이트되지 않은 트라스투주맵, 또는 유리 크립토파이신 유사체 (CRY-55, CRY55-Gly)의 농도를 증가시키면서 이들을 포함하는 새로운 배양 배지로 대체하였고, 세포는 5% CO2 내에서 37℃에서 96h 동안 배양하였다. 5 내지 8개의 3배 데이터포인트는 각 실험 조건에 대하여 기록하였다. 배양 말기에 발광은 Perkin Elmer Wallac 1450 MicroBeta TriLux 검출기를 사용하여 측정하였다. 화합물 세포독성은 PBS (항체) 또는 0.1 % DMSO (화합물)로 처리한 세포에 비교하여 평가되었다. CC50 값은 Kaleidagraph 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로직 식을 사용하여 생존도 데이터를 설정하여 계산하였다. 다른 화합물로 SK-BR3 세포의 처리시 얻어진 잔류 세포 생존도 플롯은 도 1에 도시되어 있다. 새로운 크립토파이신-55-글리시네이트 ADC (도 1, 하부 패널)는, 이 Her2-양성 유방 암종 세포주 상에 네이키드된(naked) 트라스투주맵(도 1, 오른쪽 상단 패널) 보다 매우 높은 세포독성 효과를 나타내며, 이는 크립토파이신-55 및 크립토파이신-55-글리시네이트 (도 1, 왼쪽 상단 및 -중간 패널, 각각)에 의해 보여진 것과 비교할만하다. 크립토파이신-55 및 크립토파이신-55-글리시네이트과 다른, 상기 ADC 세포독성 효과는 Her2-낮은 MCF7 및 HCT116 세포주에 비하여 HER2-양성 SK-BR3 세포에 대해 매우 선택적이다(표 1).

 세포주
SK-BR3 MCF7 HCT116
화합물 CC50 CC50 CC50
Cry-55
Cry-55-링커
Cry-55-Gly
트라스투주맵
트라스투주맵 환원됨
Cry-55-Gly-mAb_피크 1
Cry-55-Gly-mAb_피크 2		 0.76nM
2.6nM
0.09nM
0.15㎍/mL
0.08㎍/mL
0.01㎍/mL
0.05㎍/mL		 0.18nM
6.1nM
0.25nM
불활성
불활성
불활성
불활성		 0.1nM
4.4nM
0.19nM
불활성
불활성
불활성
불활성
실시예 4
크립토파이신 -52의 제조
Figure pct00018
M = 669.20 g·mol-1 C36H45ClN2O8
크립토파이신-52는 Weiss C, et al (2012) Beilstein Journal of Organic Chemistry 8:2060-6 및 Weiss C, et al (2013) Natural Product Reports 30:924-40에 공개된 루트에 따라 제조되었다.
크립토파이신 -55의 제조
Figure pct00019
M = 705.67 g·mol-1 C36H46Cl2N2O8
크립토파이신-52 (40 mg; 60 μmol; 1 eq)는 높은 진공 내에서 건조되고 연속해서 abs. DCM (1 mL) 내에 용해된다. 용액을 -50℃까지 냉각시키고, HCl (디옥산 중 4 M; 74.7 ㎕; 0.30 mmol; 5 eq)을 첨가하였다. 2h 동안 교반한 후, 용액을 실온(rt)까지 가온하였고, 휘발성 물질을 감압하에서 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2; PE/EtOAc 1:3) 는 무색 고체로서 크립토파이신-55 (43 mg; 60 μmol; quant.)을 얻었다.
R f (PE/EtOAc 1:3) = 0.27;
1 H-NMR (600 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 7.41 - 7.34 (m, 5H, uA-C ar H); 7.21 (m, 1H, uC-NH); 7.22 (d, 1H, J = 2.2 Hz, uB-C2'H); 7.08 (dd, 1H, J = 8.3/2.1 Hz, uB-C6'H); 6.86 (d, 1H, J = 8.4 Hz, uB-C5'H); 6.78 (ddd, 1H, J = 15.1/10.6/4.4 Hz, uA-C β H); 5.78 (dd, 1H, J = 15.1/1.8 Hz, μΑ-C α H); 5.52 (d, 1H, J = 7.9 Hz, μΒ-NH); 5.16 (ddd, 1H, J= 10.6/8.2/2.0 Hz, μA-C η H); 4.93 (dd, 1H, J= 10.2/3.5 Hz, μD-C α H); 4.75 (ddd, 1H, J = 7.9/7.7/5.2 Hz, μΒ-C α H); 4.65 (d, 1H, J= 9.6 Hz, μΑ-CηH); 4.01 (dd, 1H, J= 9.7/1.9Hz, μΑ-C ξ H); 3.88 (s, 3H, μΒ-ΟCH3); 3.38 (dd, 1H, J = 13.4/8.2 Hz, μC-CHA H BNH); 3.18 (dd, 1H, J= 13.5/3.8 Hz, μC-CHA H BNH); 3.14 (dd, 1H, J = 14.5/5.2Hz, μB-CβHA H B); 3.06 (dd, 1H, J = 14.4/7.6Hz, μB-CβHA H B); 2.70 (m, 1H, μA-Cγ H A HB); 2.49 (m, 1H, μA-CβH); 2.38 (ddd, 1H, J = 14.5/10.9/10.9 Hz, μA-CβHA H B ); 1.78 (ddd, 1H, J = 14.0/4.5/4.0 Hz, μD-CβHAHB); 1.72 (m, 1H, μD-CγH); 1.43 (ddd, 1H, J = 14.0/8.7/3.5 Hz, μD-CβHAHB); 1.23 (s, 3H, μC-C(CH3)2); 1.17 (s, 3H, μC-C(CH3)2); 1.04 (d, 3H, J = 6.9 Hz, μA-CδHCH 3); 0.93 (d, 3H, J = 1.4 Hz, μD-CδH3); 0.92 (d, 3H, J = 1.2 Hz, μD-CδH3).
크립토파이신 -55- 글리시네이트 트리플루오로아세테이트의 제조
Figure pct00020
M = 875.28 g·mol-1 C40H50Cl3F3N3O11
크립토파이신-55-글리시네이트 트리플루오로아세테이트의 제조는 Liang J, et al (2005) Investigational New Drugs 213-224 에 따라 수행된 반면에, 합성은 첫번째 반응 단계 후 정제없이 완료되었다. 추가적으로 생성물은 컬럼 크로마토그래피로 정제하지 않았으나, RP-HPLC을 하여 크립토파이신-55-글리시네이트 트리플루오로아세테이트 염을 얻었다.
1 H-NMR (500 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 7.37 - 7.32 (m, 3H, μA-C ar H); 7.29 (dd, 2H, J = 7.3/2.3 Hz, μA-C ar H); 7.22 (m, 1H, μC-NH); 7.20 (d, 1H, J = 2.2 Hz, uB-C2'H); 7.06 (dd, 1H, J　= 8.4/2.2 Hz, μB-Cδ'H); 6.84 (d, 1H, J = 8.5 Hz, μB-C5'H); 6.60 (bs, 1H, μB-NH); 6.53 (ddd, 1H, J = 15.2/10.9/4.2 Hz, μA-C β H); 5.74 (dd, 1H, J = 15.3/1.8 Hz, μA-CαH); 5.45 (dm, 1H, J = 10.1　Hz, μA-CξH); 4.94 (dd, 1H, J = 10.4/2.9 Hz, μD-CαH); 4.85 - 4.79 (m, 2H, μA-CδH/μA-CηH); 4.54 (ddd, 1H, J = 8.1/8.1/5.3 Hz, μB-CαH); 3.87 (s, 3H, μB-OCH3); 3.63 (d, 1H, J = 16.7 Hz, Gly-CHAHB); 3.30 (m, 1H, μC-CβHA); 3.20 (m, 1H, μC-CβHB); 3.16 - 3.06 (m, 2H, Gly-CHAHB/μB-CβHA); 2.91 (dd, 1H, J = 14.5/8.6 Hz, μB-CβHB); 2.64 (m, 1H, μA-CδH); 2.53 (m, 1H, μA-CγHA); 2.22 (m, 1H, μA-CγHB); 1.93 (m, 1H, μD-CβHA); 1.70 (m, 1H, μD-CγH); 1.65 (m, 1H, μD-CβHB); 1.18 (s, 3H, μC-CH3); 1.12 (s, 3H, μC-CH3); 1.00 (d, 3H, J = 7.2 Hz, μA-CβHCH 3); 0.98 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CH3); 0.93 (d, 3H, J = 6.5Hz, CH3).
자가-희생 링커의 제조
Figure pct00021
M = 322.39 g·mol-1 C15H30O7
tert-부틸-15-히드록시-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트는 Seitz O, et al (1997) Journal of Organic Chemistry 62:813-826에 공개된 방법에 따라 합성되었다.
abs. THF (125 mL) 중 테트라에틸렌글리콜 (40.61 mL; 45.64 g; 235 mmol)의 용액에, 한 조각의 소듐(1/4 cm)을 첨가하였다. 소듐이 완전하게 반응한 후, tert-부틸아크릴레이트 (11.98 mL; 10.57 g; 82.5 mmol)를 20min 동안 적가하였고, 얻어진 용액을 rt에서 밤새 교반하였다. pH를 NaOH 용액 (1N)으로 7-8로 조정하고, 용매를 진공 내에서 제거하였다. 잔사를 sat. NaCl 용액 (75 mL) 내에서 용해시키고, EtOAc (3x100 mL)으로 추출하였다. 수집된 유기층들을 MgSO4으로 건조하고, 용매 증발 후, tert-부틸-15-히드록시-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (21.87 g; 67.8 mmol; 82%, tert-부틸아크릴레이트 기반)가 무색 오일로 얻어졌다.
1 H-NMR (500 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 3.77 - 3.57 (m, 18H; OCH2); 3.01 (bs, 1H, OH); 2.51 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2COO ㅅ Bu); 1.45 (s, 9H, C(CH3)3);
13 C{ 1 H}-NMR (126 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 171.1 (COO); 80.7 (C(CH3)3); 72.6/70.8/70.7/70.6/70.5/67.0 (OCH2); 61.9 (HOCH2); 36.4 (CH2CO); 28.2 (C(CH3)3).
Figure pct00022
M = 401.45 g·mol-1 C19H31NO8
tert-부틸-15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트가 Warnecke A, (2002) Dissertation에 따라 합성되었다. Ph3P (1.09 g; 4.14 mmol; 1 eq)는 abs. THF (25 mL) 내에 용해시키고, 얻어진 용액을 -70℃까지 냉각시켰다. DIAD (0.8 mL; 4.14 mmol; 1 eq)을 1 min에 걸쳐 첨가하고 노란색 용액을 -70℃에서 5min 동안 교반하였다. 이후 tert-부틸-15-히드록시-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (2.0 g; 6.20 mmol; 1.5 eq)을 첨가하고, 용액을 추가 5min 동안 교반하고, 말레이미드 (401 mg; 4.14 mmol; 1 eq)를 첨가하였다. -70℃에서 5min 동안 추가 교반한 후, 냉각 욕조를 제거하고 혼합물을 rt까지 가온하였다. rt에서 18h 동안 계속 교반하고, 이후 진공 내에서 용매를 제거하고 오일성 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (SiO2; PE/EtOAc 1:3)로 정제하였다. tert-부틸-15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (0.61 g; 1.51 mmol; 36%)를 무색 오일로서 얻었다.
R f (PE/EtOAc 1:3) = 0.27;
R f (PE/EtOAc 1:1) = 0.19;
1 H-NMR (500 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 6.70 (s, 2H, CH=CH); 3.71 (m, 4H, CH2); 3.66 - 3.53 (m, 14H, CH2); 2.49 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2COO t Bu); 1.44 (s, 9H, C(CH3)3);
13 C{ 1 H}-NMR (126 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 171.0 (CH2 COO t Bu); 170.8 (COCH=CHCO); 134.3 (CH=CH); 80.6 (C(CH3)3); 70.8/70.73/70.70/70.65/70.5/70.2/68.0/67.1 (OCH2); 37.3 (NCH2); 36.4 (CH2COO t Bu); 28.3 (C(CH3)3).
Figure pct00023
M = 345.35 g·mol-1 C15H23NO8
15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노산은 Warnecke A, (2002) Dissertation에 따라 제조되었다. tert-부틸-15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (1.74 g; 4.33 mmol)를 abs. DCM (8 mL)에 용해시키고 TFA (8 mL)를 첨가하였다. 용액을 1h 동안 rt에서 교반하였다. 다음에, 휘발성 화합물을 진공 내에서 제거하고, 잔사를 다시 DCM (20 mL) 내에 용해시켰다. Amberlyst A-21 (6 g)를 상기 용액에 첨가하고, 모든 것을 rt에서 1h 동안 교반하였다. 다음에 고체를 여과해서 제거하고 여액을 농축 건조하였다. 15-말레이미도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노산(1.46 g; 4.23 mmol; 98%)를 어두운 노란색 오일로 얻었다.
1 H-NMR (500 MHz, 클로로포름-d, TMS) δ [ppm] = 9.38 (bs, 1H, COOH); 6.71 (s, 2H, CH=CH); 3.75 (dt, 4H, J = 21.6/5.8 Hz, NCH2/CH2); 3.68 - 3.58 (m, 14H, CH2); 2.63 (t, 2H, J = 6.1 Hz, CH 2 COOH).
Figure pct00024
M = 755.81 g·mol-1 C33H53N7O13
말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly는 표준 Fmoc SPPS [Fields G 및 Noble R L, (2009) International Journal of Peptide and Protein Research 33,3:161-214]에 따라 합성되었다.
상세한 것은 다음 표 2를 참조한다.
단계 물질 부피 질량 물질의
함량		 당량 반응시간
1


 Barlos 수지 1.0 g


3 h
Fmoc-Gly 1.43 g 4.8 mmol 3 eq
DIPEA 1.22 mL 0.93 g 7.2 mmol 4.5 eq
abs. DCM 5 mL
2



 Fmoc-l-Pro 1.18 g 3.48 mmol 3 eq



3 h
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 1.12 g 3.48 mmol 3 eq
HOBt?H2O 0.47 g 3.48 mmol 3 eq
DMF 7 mL
3



 Fmoc-l-Cit 1.38 g 3.48 mmol 3 eq



3 h
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 1.12 g 3.48 mmol 3 eq
HOBt·H2O 0.47 g 3.48 mmol 3 eq
DMF 10 mL
4



 Fmoc-l-Cit 0.92 g 2.32 mmol 2 eq



밤새
DIPEA 0.53 mL 0.41 g 3.13 mmol 2.7 eq
TBTU 0.75 g 2.32 mmol 2 eq
HOBt?H2O 0.31 g 2.32 mmol 2 eq
DMF 7 mL
5



 Fmoc-l-Val 1.18 g 3.48 mmol 3 eq



2 h
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 1.12 g 3.48 mmol 3 eq
HOBt?H2O 0.47 g 3.48 mmol 3 eq
DMF 7 mL
6



 말레이미드 기능화된PEG-링커 0.80 g 2.32 mmol 2 eq





밤새
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 0.75 g 2.32 mmol 2 eq
HOBt?H2O 0.31 g 2.32 mmol 2 eq
DMF 7 mL
수지로부터 분열 후, 잔사는 RP-HPLC으로 정제되고, 말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly (0.61 g; 0.81 mmol; 70%)는 무색의 동결 건조물로서 얻었다.
1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ [ppm] = 12.24 (bs, 1H, COOH); 8.10 (dd, 1H, J = 6.1/5.8 Hz, Gly-NH); 8.06 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Cit-NHCO); 7.81 (d, 1H, J = 8.9 Hz, Val-NHCO); 7.02 (s, 2H, CH 말레이미드); 6.02 (bm, 1H, Cit-NH); 4.43 (dd, 1H, J = 13.4/7.5 Hz, Cit-C α H); 4.31 (dd, 1H, J = 8.3/3.9 Hz, Pro-CαH); 4.20 (dd, 1H, J = 8.8/6.7 Hz, Val-CαH); 3.78 (dd, 1H, J = 17.5/6.1 Hz, Gly-CHA); 3.69 (m, 1H, Pro-CγHA); 3.68 (dd, 1H, J = 17.5/5.8 Hz, Gly-CHB); 3.62 - 3.53 (m, 5H, PEG-CH2 /Pro-CγHB); 3.53 - 3.41 (m, 16H, PEG-CH2); 3.00 - 2.90 (m, 2H, Cit-CH2NH); 2.45 (m, 1H, PEG-CH AHBCONH); 2.34 (m, 1H, PEG-CHA H B CONH); 2.01 (m, 1H, Pro-CβHA); 1.97 - 1.87 (m, 2H, Val-CβH/Pro-CδHA); 1.87 - 1.79 (m, 2H, Pro-CβHB/Pro-CγHB); 1.67 (m, 1H, Cit-CβHA); 1.49 (m, 1H, Cit-CβHB); 1.44 - 1.36 (m, 2H, Cit-CγH2); 0.81 (d, 3H, J = 6.8 Hz, Val-CH3); 0.79 (d, 3H, J = 6.8 Hz, Val-CH3);
13 C{ 1 H}-NMR (126 MHz, DMSO-d 5 ) δ [ppm] = 172.0 (Pro-CO); 171.3 (COOH); 171.0 (Val-CO); 170.9 (말레이미드-CO); 170.1 (Cit-CONH); 170.0 (PEG-CONH); 158.9 (Cit-CONH2); 134.6 (말레이미드-CH); 69.8/69.77/69.72/69.66/69.5/69.4/67.0 (PEG-CH2); 59.3 (Pro-C α ); 57.1 (Val-Cα); 50.2 (Cit-C α ); 46.8 (Pro-Cγ); 40.6 (Gly-CH2); 30.7 (Val-Cβ); 29.2 (Pro-Cβ); 28.3 (Cit-Cβ); 26.1 (Cit-Cγ); 24.4 (Pro-Cδ); 19.2 (Val-Cγ); 18.1 (Val-Cγ);
HRMS (ESI-FT-ICR):
측정됨[m·z-1] = 778.35962 [C33H53N7Ο13+Na]+
계산됨[m·z-1] = 778.35936 [C33H53N7Ο13+Na]+.
말레이미드 콘쥬게이트용 크립토파이신 -55- 글리시네이트 펩티드
Figure pct00025
M = 1500.51 g·mol-1 C71H100Cl2N10O21
크립토파이신-55-글리시네이트 트리플루오로아세테이트 (10 mg; 13.1 μmol; 1 eq) 및 말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly (29.7 mg; 39.3 μmol; 3 eq)를 abs. DMF (0.5 mL)에 용해시켰다. DIPEA (10 ㎕; 52.4 μmol; 4 eq), TBTU (12.6 mg; 39.3 μmol; 3 eq) 및 HOBt·H2O (5.3 mg; 39.3 μmol; 3 eq)이 용해된 abs. DMF (0.5 mL) 용액을 느리게 첨가하였다. rt에서 밤새 교반한 후 다시 DIPEA, TBTU 및 HOBt·H2O (상기 언급된 것과 동일한 함량)을 첨가하였다. 추가 2h 동안 다시 교반하고, 반응 용액을 직접적으로 RP-HPLC으로 정제하였다. 말레이미드-PEG-Val-Cit-Pro-Gly-크립토파이신-55-글리시네이트 (11.8 mg; 8 ?mol; 60%)는 무색의 동결건조물로 얻었다.
HRMS (ESI-FT-ICR):
측정됨 [m·z- 1] = 1521.63460 [C71H100Cl2N10O21+Na]+
계산됨 [m·z- 1] = 1521.63338 [C71H100Cl2N10O21+Na]+.
실시예 5
크립토파이신 55- 옥트레오티드 콘쥬게이트의 합성:
- 4-펜티노일-옥트레오티드 (1):
Figure pct00026
옥트레오티드의 선형 전구제는 Tailhades et al. Angew . Chem . Int . Ed. Engl. 2010, 49, 117에 의해 이전에 설명된 것처럼 제조되었다. Fmoc-D-Phe-OH 결합 후, Fmoc 기는 피페리딘/DMF (3:7, 2 + 10 min)으로 제거되고, 이어서 DMF (6 x 1 min) 및 CH2Cl2 (1 x 1 min)으로 세척하였다. 4-펜티노익산(4 eq.)은 RT에서 4h 동안 교반하면서 Oxyma (4 eq.) 및 DIC (4 eq.)의 존재 하에서 결합되었다. 다음으로, 수지는 DMF (6 x 1 min), CH2Cl2 (1 x 1 min)으로 세척되고, Et2O으로 건조되었다. 상기 수지는 RT에서 2h동안 TFA/PhOH/H2O/TIS (88:5:5:2)을 사용하여 분열(cleave)되었다. TFA 증발 및 차가운 Et2O로 침전 후, 펩티드를 H2O/CH3CN으로 용해시키고 냉동 건조하였다. 조 펩티드는 포스페이트 완충제 (pH = 7.4, 100 mM, 2 mL/ 펩티드 mg) 내에 용해되고, 혼합물은 RT에서 48h 동안 교반되었다. 펩티드는 RP-HPLC (방법 1, 이하)으로 정제되고, 동결건조되었다.
HPLC : tR = 5.02 min (방법 A, 이하)
MALDI - ToF MS: 1099.5 [M+H]+, 1121.6 [M+Na]+, 1137.5 [M+K]+
- PEG 스페이서 (2 및 3):
Figure pct00027
tert-부틸 15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트는 Osswald B., (2015) Dissertation (https ://pub. uni - bielefeld .de/publication/ 2733900)에 따라 합성되었다.
tert-부틸-15-히드록시-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트(1.50 g; 4.65 mmol; 1 eq)는 abs. THF (10 mL) 내에서 용해되고, 얻어진 용액은 0℃까지 냉각되었다. 메탄술포닐 클로라이드 (0.54 mL; 6.98 mmol; 1.5 eq) 및 트리에틸아민 (0.97 mL; 6.98 mmol; 1.5 eq)가 적가되었고 용액을 0℃에서 30min 동안 교반하고, 이후 rt에서 밤새 교반하였다. NaHCO3 (0.27 g; 3.20 mmol; 0.7 eq) 및 NaN3 (0.45 g; 6.98 mmol; 1.5 eq)을 dist. 물 (10.5 mL)과 함께 혼합물에 첨가하고, 얻어진 용액을 rt에서 20 min 동안 교반하였다. THF를 진공 내에서 제거하고, 남은 용액을 4h 동안 80℃에서 교반하였다. 냉각 후, 혼합물을 DCM (3x30 mL)으로 추출하고, 모아진 유기층을 MgSO4으로 건조하고, 용매를 증발시켰다. 노란색 오일성 잔사를 컬럼 크로마토그래피(SiO2; PE/EtOAc 1:1)으로 정제하였다. tert-부틸 15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (0.74 g; 2.12 mmol; 46%)를 무색 오일로 얻었다.
R f (PE/EtOAc 1:3) = 0.69
R f (PE/EtOAc 1:1) = 0.4
1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 1.44 (s, 9H, C(CH3)3), 2.50 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2COOtBu), 3.39 (t, 2H, J = 5.1 Hz, CH2N3), 3.57-3.74 (m, 16H).
Figure pct00028
15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노산을 Warnecke A, (2002) Dissertation에 따라 제조하였다.
tert-부틸 15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (0.22 g; 0.63 mmol)을 abs. DCM (5 mL)에 용해시키고 TFA (5 mL)을 첨가하였다. 용액을 rt에서 1.5h 동안 교반하였다. 다음에, 휘발성 화합물을 진공 내에서 제거하고, 잔사를 디에틸 에테르(10 mL)에 용해시키고, 용매를 증발시켰다(반복 2x). 용액을 농축 건조하였다. 15-아지도 4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노산(0.18 g; 0.62 mmol; 98%)을 무색 오일로 얻었다.
1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 2.63 (t, 2H, J = 6.2 Hz, CH2COOH), 3.39 (t, 2H, J = 5.1 Hz, CH2N3), 3.58-3.71 (m, 14H), 3.76 (t, 2H, J = 6.2 Hz, CH2CH2COOH).
- 자가-희생 링커 (4):
Figure pct00029
아지드-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-OH 4는 표준 Fmoc SPPS에 따라 합성되었다. 상세한 것은 다음 표 3를 참조한다.
단계 물질 부피 질량 물질의
함량		 당량 반응
시간
1


 Barlos 수지 1.0 g


3 h
Fmoc-l-Pro 1.62 g 4.8 mmol 3 eq
DIPEA 1.22 mL 0.93 g 7.2 mmol 4.5 eq
abs. DCM 5 mL
2



 Fmoc-Gly 1.03 g 3.48 mmol 3 eq



3 h
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 1.12 g 3.48 mmol 3 eq
HOBt?H2O 0.47 g 3.48 mmol 3 eq
DMF 7 mL
3



 Fmoc-l-Cit 1.38 g 3.48 mmol 3 eq



3 h
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 1.12 g 3.48 mmol 3 eq
HOBt?H2O 0.47 g 3.48 mmol 3 eq
DMF 10 mL
4



 Fmoc-l-Val 1.18 g 3.48 mmol 3 eq



2 h
DIPEA 0.79 mL 0.60 g 4.64 mmol 4 eq
TBTU 1.12 g 3.48 mmol 3 eq
HOBt?H2O 0.47 g 3.48 mmol 3 eq
DMF 7 mL
5


 아지드 기능화된 PEG-링커 0.06 g 0.21 mmol 3 eq


6 h
DIPEA 0.07 mL 0.05 g 0.42 mmol 6 eq
BOP 0.09 g 0.21 mmol 3 eq
DMF 2 mL
수지의 분열 후, 잔사를 RP-HPLC으로 정제하고, 아지드-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-OH (0.05 g; 0.07 mmol; 70%)를 무색의 동결 건조물로 얻었다.
MALDI - ToF MS: 702.3 [M+H]+, 724.3 [M+Na]+
- 아지드-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-Gly-크립토파이신-55 (5):
Figure pct00030
크립토파이신-55-글리시네이트 트리플루오로아세테이트 (5 mg; 5.7 μmol; 1 eq) 및 아지드-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-OH (16.0 mg; 22.8 μmol; 4 eq)를 abs. DMF (0.5 mL) 내에 용해시켰다. DIPEA (5.0 ㎕; 34.2 μmol; 6 eq), PyBOP (11.9 mg; 22.8 μmol; 4 eq) 및 HOBt·H2O (3.5 mg; 22.8 μmol; 4 eq)이 용해된 abs. DMF (0.5 mL)의 용액을 느리게 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 3.5h 동안 교반하고, 이후 용액을 RP-HPLC으로 직접적으로 정제하였다. 아지드-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-크립토파이신-55-글리시네이트 (6.2 mg; 4.3 μmol; 75%)을 무색의 동결 건조물로 얻었다.
HPLC : tR = 7.06 min (방법 A)
MALDI - ToF MS: 1467.6 [M+Na]+
- 크립토파이신-55-옥트레오티드 콘쥬게이트 (6):
Figure pct00031
아지드-기능화된 크립토파이신 5 (1.5 mg, 1.04 μmol, 1.0 eq) 및 4-펜티노일-옥트레오티드 1 (1.14 mg, 1.04 μmol, 1.0 eq)의 혼합물을 t BuOH/H2O (1 mL, 2:1 v/v) 내에 용해시켰다. 구리 분말 (2.0 mg)을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 48 h 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 H2O/ACN (5 mL, 1:1 v/v)으로 희석하고, Celite®를 통해 여과시켰다. 여액을 동결건조시키고 연속해서 RP-HPLC으로 정제하였다. 크립토파이신-55-옥트레오티드 콘쥬게이트 6 를 백색 고체 (0.55 mg, 16% 수율)로 얻었다.
HPLC : tR = 6.79 min (방법 A)
ESI -MS ( m/z ): 2546.6 [M+H]+, 1273.7 [M+2H]2+, 1284.7 [M+H+Na]2+, 1292.7 [M+H+K]2+, 862.1 [M+2H+K]+
HRMS : 계산됨: C121H170Cl2N22O30S2 [M+2H]2+ 1272.56304; 발견됨 1272.56468
계산됨: C121H170Cl2N22O30S2Na [M+2H+Na]3+ 856.03843; 발견됨 856.03890
분석 HPLC:
분석 HPLC은 THERMO SEPARATION PRODUCTS HPLC unit (컨트롤러 SN 4000, 펌프 P 4000, 자동 견본기 AS 100, 검출기 UV 6000 LP, UV-흡수도, λ = 274 nm에서 측정됨)에서 수행되었고, 이는 PHENOMENEX Jupiter C18 컬럼 (치수 4.6mm (ID)x 250mm, 낟알 크기 5 ㎛)가 장착되어 있다. 다음 용리제가 사용되었다:
용리제 A: H2O/CH3CN/TFA 95:5:0.1
용리제 B: H2O/CH3CN/TFA 5:95:01
방법 A:
흐름 속도: 700 ㎕/min
0 min 100 % A 0% B
10 min 0% A 100% B
11.2 min 0% A 100% B
12.7 min 100% A 0% B
14 min 100% A 0% B
조제용 HPLC:
조제용 RP-HPL-크로마토그래피가 MERCK-HITACHI unit (컨트롤러: D-7000, 펌프: L7150, 검출기: L7420, UV-흡수도 measured at l = 220 nm)에서 수행되었고, 이는 Macherey-nagel C18-컬럼 (dimensions 10mm (ID) ? 250mm, grain size 7 ?m)가 장착되어 있다.
방법 1 (용리제 A 및 B, 분석l HPLC):
흐름 속도: 4 mL/min
0 min 100% A 0% B
2 min 100% A 0% B
35 min 0% A 100% B
40 min 0% A 100% B
45 min 100% A 0% B
ESI-MS:
ESI/APCI 질량 스펙트럼은 표준 ESI/APCI source가 장착된 Esquire 3000 ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)을 사용하여 기록하였다. 샘플은 주사기 펌프로 직접 주입하여 도입되었다. 질소는 중성화 기체 및 건조 기체 모두로 작용한다. 질소는 Bruker 질소 발생기 NGM 11로 발생되었다. 여기 보여진 스펙트럼은 몇 가지 단일 스펙트럼(인용된 것처럼)의 축적 및 평균에 의해 Bruker Daltonik esquireNT 5.2 esquireControl 소프트웨어로 기록되었다.
DataAnalysis™ 소프트웨어 3.4가 스펙트럼 가공을 위하여 사용되었다.
HRMS:
Exact ESI 질량 스펙트럼은 Thermo-Fisher-Scientific Orbitrap LTQ XL로 기록되었다.
실시예 6
크립토파이신 55- 옥트레오티드 콘쥬게이트의 합성:
실시예 5는 다음 자가-희생 링커을 사용하여 반복되었다:
Figure pct00032
실시예 7
RNA 정제 및 정량적 RT- PCR
종양 세포주(랫트 췌장 종양 세포주 AR42J 및 인간 유방 암종 세포주 MCF7)는 American Type Culture Collection으로부터 얻고, 표준 프로토콜에 따라 성장되었다.
총 RNA는 DNAse I 처리 (Qiagen)를 포함하는 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD)사용하여, 제조자의 추천에 따라서 세포들로부터 추출되었다. 첫 단계 RT-PCR 반응은 96-웰 광학 플레이트 내에서 조립되었다. 정량적 RT-PCR은 다음과 같이 세번 수행되었다: 40 ㎕의 반응 혼합물은, 25 ㎕의 2X Master Mix, 0.5 ㎕의 100X RT (QuantiTect Probe RT-PCR Kit, Qiagen), 및 2.5 ㎕의 다음 qPCR 분석법 각각 (Applied Biosystems/Thermofisher): 랫트 SSTR2 (Rn01464950_g1), 인간 SSTR2 (Hs00265624_s1), 랫트 GAPDH (Rn01775763_g1), 및 인간 GAPDH (Hs04420632_g1)을 포함하여 제조되었다. 3 ng/㎕ 농도의 10 ㎕의 총 RNA를 최종 반응 부피 50μL로 첨가하고, ABI 7900 HT real time thermal cycler (Perkin Elmer)을 사용하여 정량적 RT-PCR를 수행하였다 (50℃ 30 min, 95℃ 10 min, 이어서 40 사이클: 95℃ 15 sec, 60℃ 1 min). 정략적 계산은 GAPDH-정규화된 mRNA 발현 값에서 2^(-ΔΔc-t) 방법을 사용하여 수행하였다. RT-qPCR 결과는, MCF7 세포 내에서 SSTR2 발현 준위가 AR42J 세포에서 측정된 대응하는 값(100%으로 설정됨)의 퍼센트로서 표시되는 것이다. RT-qPCR 결과는, AR42J 세포가 상대적으로 높은 준위의 SSTR2 mRNA를 발현하는 반면에, MCF7 세포 내에서 발현 준위(대략 0.6%)는 보다 많이 낮다는 것을 확인하였다
실시예 8
세포 생존도 분석법
종양 세포주 AR42J (STTR2높은) 및 MCF7 (SSTR2낮은)의 생존도에 대한 실시예 5의 크립토파이신-55-글리시네이트-옥트레오티드 콘쥬게이트의 효과는, 제조자의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega)를 사용하여 평가되었다. 세포들을 검은색-벽 96-웰 플레이트(5000 세포/웰)에 플레이트하고, 5% CO2의 습기 대기 내에서 37℃에서 밤새 부착시켰다. 매질을 이후 제거하고, 크립토파이신-55-글리시네이트-옥트레오티드 콘쥬게이트 (CRY55-Gly-Oct), 콘쥬게이트되지 않은 옥트레오티드, 또는 유리 크립토파이신-55-글리시네이트 (CRY55-Gly)을 농도 증가시키면서 포함하는 새로운 배양 배지로 대체하고, 상기 세포들을 5% CO2 내에서 37℃에서 120h 동안 배양하였다. 9개의 3배 복제품 1:3 일련의 희석액 데이터포인트는 각 실험 조건에 대해 기록되었다(CRY55-Gly 및 CRY55-Gly-Oct에 대해 0.0015 nM 내지 10 nM, 콘쥬게이트되지 않은 옥트레오티드에 대하여 0.0015 μM 내지 10 μM). 배양 말기에 발광은 Perkin Elmer Wallac 1450 MicroBeta TriLux 검출기을 사용하여 측정되었다. 화합물 세포독성은 0.1 % DMSO으로 처리한 세포에 비교하여 평가되었다. IC50 값은 Kaleidagraph 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로직 식을 가지고 생존도 데이터를 설정하여 계산되었다. 다른 화합물로 AR42J 및 MCF7 세포를 처리하여 얻어진 잔류 세포 생존도 플롯은 도 3 및 도 4에 각각 도시하였다. STTR2높은 AR42J 종양 세포주에서, 새로운 크립토파이신-55-글리시네이트-옥트레오티드 콘쥬게이트 (도 3, 왼쪽 상단 패널)은 네키드 옥트레오티드(도 3, 하부 패널) 보다 매우 많이 높은 세포독성 효과를 나타내며, IC50 값 (0.9 nM)은 크립토파이신-55-글리시네이트 화합물 (도 3, 오른쪽 상단 패널)에 의해 보여진 것과 매우 유사하다. MCF7에 대해, 콘쥬게이트되지 않은 옥트레오티드는 예상한 것처럼 완전히 효과적이지 않는다(도 4, 하부 패널). AR42J 세포 상에서 관찰된 것과는 다른, 55-글리시네이트-옥트레오티드 콘쥬게이트 (도 4, 왼쪽 상단 패널)는 MCF7 세포 생존도를 억제하며, IC50 값은 크립토파이신-55-글리시네이트 화합물(도 4, 오른쪽 상단 패널)로 측정된 것보다 매우 낮다(90배). 게다가, 크립토파이신-55-글리시네이트 화합물은 유사한 효능을 가지고 2개 세포주 생존도를 억제하는 한편(도 3 및 도 4 비교, 오른쪽 상단 패널), 상기 콘쥬게이트된 옥트레오티드 세포독성 효과는 SSTR2낮은 MCF7 세포와 비교하여 STTR2높은 AR42J 세포에 대하여 정확히 선택적이며(도 4 및 도 3 비교, 왼쪽 상단 패널), IC50 값이 각각 0.9 nM 및 27 nM이었다. 2개 시험된 세포주 상의 모든 화합물들에 대한 IC50 값은 하기 표 4에 요약되어 있다.
세포주 Oct- Cry55 - Gly
콘쥬게이트
IC 50 		Cry-55- Gly
IC 50 		옥트레오티드
IC 50
AR42J 0.9 nM 0.8 nM 30% inh. 내지 10 uM
MCF7 27 nM 0.2 nM NA
실시예 9
다중 약물 저항성 종양 세포주에 대한 크립토파이신 -55- 글리시네이트 및 크립토파이신 -55-글리시네이트 약물-링커 분자의 활성
H69 세포 및 약물-저항성 카운터파트 H69AR는 American Type Culture Collection에서 얻었고, 표준 프로토콜에 따라 성장되었다. 야생 타입 및 약물 저항성 종양 세포주의 생존도에 대한 크립토파이신 및 크립토파이신 콘쥬게이트의 효과는, 제조자의 프로토콜에 따라, CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega)을 사용하여 평가되었다. 세포들을 검은색-벽 96-웰 플레이트(5000 세포/웰) 내에 플레이트시키고, 5% CO2의 습기 대기에서 37℃에서 밤새 부착시켰다. 매질을 제거하고, 크립토파이신 유사체 또는 대조군으로서 독소루비신의 농도를 증가시키면서 이들을 포함하는 새로운 배양 배지로 교체하였다. 세포는 5% CO2 내에서 37℃에서 120h 동안 화합물로 배양하였다. 8개 3배 복제품 1:3 일련의 희석액 데이터포인트는 각 실험 조건에 대하여 기록되었다(CRY55-Gly, CRY55-Gly-링커 73 및 CRY55-Gly-링커 76에 대해 0.05 nM 내지 10 nM, 독소루비신에 대해 1.2 nM 내지 2700 nM). 배양 말기에, 발광은 Perkin Elmer Wallac 1450 MicroBeta TriLux 검출기를 사용하여 측정되었다. 화합물 세포독성은 0.1 % DMSO으로 처리한 세포에 비교하여 평가되었다.
이하 표 5 및 도 5에 보여진 것처럼, 크립토파이신 또는 크립토파이신 약물 링커는 야생 타입 및 약물 저항성 세포에 대해 유사한 세포독성을 나타냈고, 독소루비신은 대조군으로 사용되었으며, 야생 타입 세포의 생존도에 선택적으로 영향을 미치고 약물 저항성 H69AR에 대해 단지 미소한 효과만을 갖는다.
화합물 H69 세포 IC50 (nM) H69AR 세포 IC50 (nM)
Cry55 0.1 0.23
Cry55-gly 0.09 0.15
실시예 5 1.7 3.6
실시예 6 1.7 4.1
독소루비신 36.0 >2000

Claims (17)

  1. 화학식 (I)의 콘쥬게이트 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00033

    여기서 R은 -CO-CH2-X-(A)n-B이고
    여기서 X는 NRa로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 Ra는 H 및 C1-C10 알킬, 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    A는 자가-희생 링커이고,
    n 는0 또는 1이고;
    B는 펩티드, 폴리펩티드/단백질, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    여기서 상기 항체가 모노클로날 항체, 또는 나노바디(nanobody)인, 콘쥬게이트.
  3. 제2항에있어서,
    여기서 상기 나노바디는 단일-도메인 항체 및 낙타(camelid) 항체로 이루어진 군으로부터 선택된, 콘쥬게이트.
  4. 제2항에 있어서,
    여기서 상기 모노클로날 항체는 트라스투주맵, 겜투주맵, 브렌툭시맵, 리툭시맵, 세툭시맵, 패니투무맵, 오파투무맵, 오비누투주맵, 페르투주맵로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체 약물 콘쥬게이트(ADC).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드 B가 소마토스타틴 수용체에 결합하는, 콘쥬게이트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 펩티드가 옥트레오티드, 파시레오티드(pasireotide) 또는 란레오티드(laeotide)로 이루어진 군으로부터 선택된, 콘쥬게이트(PDC).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 자가-희생 링커 A는 화학식 (II)의 모이어티인 콘쥬게이트:
    Figure pct00034

    여기서 R1 은 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, R2는, 선택적으로 R1와 함께, 아미노산 측쇄의 잔기이고, R3은 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, R4은, 선택적으로 R3과 함께, 아미노산 측쇄의 잔기인, 콘쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자가-희생 링커 A는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된, 콘쥬게이트:
    Figure pct00035

    및
    Figure pct00036
  9. 제7항에 있어서,
    화학식(III)을 갖는 콘쥬게이트:
    Figure pct00037

    여기서 R1, R2, R3 및 R4는 상기 정의된 것과 같고, X는 NH, N- (C1-C10)- 알킬, O로 이루어진 군으로부터 선택되며; mAb는 모노클로날 항체 또는 나노바디, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다.
  10. 제7항에 있어서,
    화학식(IV)의 콘쥬게이트:
    Figure pct00038
  11. 제1항에 있어서,
    화학식(V)의 콘쥬게이트:
    Figure pct00039

    여기서 R1은 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, R4은, 선택적으로 R1와 함께, 아미노산 측쇄의 잔기이고; X는 NH, N- (C1-C10), 알킬 O로 이루어진 군으로부터 선택되며; mAb는 모노클로날 항체, 펩티드 또는 폴리펩티드을 나타낸다.
  12. 제6항에 있어서,
    화학식(VI)의 콘쥬게이트.
    Figure pct00040
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트를 활성 성분으로 하고, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 비이클 및/또는 부형제와의 혼합물로 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 용도인 콘쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서,
    암 또는 자가면역 질환 또는 감염성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료를 위한 용도인, 콘쥬게이트.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    진단용인 콘쥬게이트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 질병의 진단이 암 또는 자가면역 질환 또는 감염성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 진단용인 콘쥬게이트.
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