KR20180003677A - Pharmaceutical compositions comprising mutant proteins of human growth hormone or transferrin fusion proteins thereof - Google Patents

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KR20180003677A
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장병하
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정인혜
박경수
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Abstract

Human growth hormone modified proteins of the present invention having an amino acid sequence in which serines at positions 85^th and 144^th in a human growth hormone protein are substituted with hydrophobic amino acids or transferrin fusion proteins thereof, have significantly improved specific activity and stability in blood, and increased half-life, compared to pre-existing human growth hormone proteins, and thus may be beneficially used in the treatment of growth failure or growth retardation.

Description

인간 성장호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions comprising mutant proteins of human growth hormone or transferrin fusion proteins thereof}A pharmaceutical composition comprising a human growth hormone mutant protein or a transferrin fusion protein thereof as an active ingredient,

본 발명은 인간 성장호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a human growth hormone mutation protein, a transferrin fusion protein thereof, or a pharmaceutical composition comprising the protein as an active ingredient.

인간성장호르몬(human growth hormone, hGH, 이하 “hGH”로 표기)은 뇌하수체에서 분비되는 191개의 아미노산으로 표시된 분자량 약 22,000 Da의 폴리펩타이드 호르몬으로 성장기 어린이에게는 뼈 끝 성장판의 연골세포 분화를 자극하여 성장을 촉진시키고, 성인에게는 대사 작용에 영향을 주며 단백질 합성과 축적을 증가시키는 역할을 하여 대사를 조절한다. 성장호르몬에 결핍이 일어나면 근육, 지방, 뼈 등 신체구성 성분의 변화에 많은 영향이 일어나며 골다공증, 관절염, 비만 등의 질환을 초래하게 된다. 또한, 성장호르몬의 자연적인 감소에 의한 결핍증상은 당뇨병이나 고혈압이 유발되는 경우가 있으며 이러한 경우 성장호르몬의 보충 요법이 필요하다.
Human growth hormone (hGH) (hGH) is a polypeptide hormone with a molecular weight of about 22,000 Da, which is expressed by 191 amino acids secreted from the pituitary gland. It stimulates chondrocyte differentiation of the bone growth plate And affects metabolism in adults, and plays a role in increasing protein synthesis and accumulation, thus regulating metabolism. When growth hormone deficiency occurs, many changes in body composition such as muscles, fat, and bones are caused, leading to diseases such as osteoporosis, arthritis, and obesity. In addition, deficiency symptoms due to natural reduction of growth hormone may cause diabetes or hypertension, and supplementation therapy of growth hormone is needed in such cases.

2010년 인간성장호르몬의 시장 현황을 살펴보면 시중에 판매되고 있는 hGH 약품에는 norditropin(Novo Nordisk)이 30%, genotropin(Pfizer)이 29%, Nutropin(Roche)이 15%, humatrope(Eli Lilly)이 14% 등으로 판매되었으며, 국내에서도 성장호르몬 매출이 2011년과 2012년을 비교하였을 때 4% 이상 증가하여 지속적으로 성장될 것이라고 예측하고 있다. 그러나, 성장호르몬 치료가 널리 사용되고 있음에도 불구하고 안정성 및 편의성의 문제로 환자에게 육체적 및 심리적 부담을 야기한다. hGH와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 분자량이 작고 안정성이 낮아 변성이 쉽고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장 및 간을 통해 쉽게 제거되어 인간 성장호르몬의 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 이러한 문제점은 환자에게 육체적 및 심리적 고통을 야기하게 되며 이를 해결하기 위해 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 지속하여 약효를 유지할 수 있는 노력이 계속되어 왔다.
The market for human growth hormone in 2010 is 30% for norditropin (Novo Nordisk), 29% for genotropin (Pfizer), 15% for nutropin (Roche) and 15% for humatrope (Eli Lilly) %. In Korea, growth hormone sales are forecast to increase by more than 4% in 2011 and 2012, and will continue to grow. However, although growth hormone therapy is widely used, it causes physical and psychological burden on patients due to stability and convenience. Polypeptides such as hGH generally have low molecular weight and low stability. They are easy to metabolize. They are easily degraded by protein hydrolytic enzymes in the blood and are easily removed through the kidneys and liver. In order to maintain the human growth hormone concentration and activity, It needs to be administered frequently. These problems cause physical and psychological distress to the patient. To solve this problem, efforts have been made to increase the blood stability of the protein drug and to maintain the drug effect by maintaining the drug concentration in the blood.

최근에 안정성 증가 및 활성 저하를 최소화할 수 있는 단백질 약물 제제로, 생체 내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체(대한민국 등록특허 제 10-0567902호), 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-0725315호), 지속형 인간 성장 호르몬 제제(대한민국 등록특허 제10-1535681호)등의 면역글로불린 Fc 방법과 폴레에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도(대한민국 등록특허 제 10-1104574호) 및 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-1504824호)등의 당화를 이용한 방법 등이 보고되었다.
Recently, a protein drug preparation capable of minimizing the increase of stability and degradation of activity has been proposed as a physiologically active polypeptide conjugate having increased persistence in vivo (Korean Patent Registration No. 10-0567902), a protein conjugate using immunoglobulin fragment and a method for producing the same (Korean Patent No. 10-0725315), an immunoglobulin Fc method such as a persistent human growth hormone preparation (Korean Patent No. 10-1535681), a human growth hormone chemically modified with polyethylene glycol, a method for producing the same, (Korean Patent No. 10-1104574) and a method using saccharification such as a hyperglycosylated sustained-type human growth hormone protein and a method for producing the same (Korean Patent No. 10-1504824) have been reported.

트랜스페린(transferrin)은 혈장 단백질 중에서 세 번째로 많은 양으로 존재하며, 혈액에 존재하는 철 이온을 다양한 조직으로 운반하는 역할을 한다. 알부민 (Albumin)이나 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)보다는 짧지만 8일의 비교적 긴 반감기를 가지며, 세포 표면의 트랜스페린 수용체를 통해 세포 내부에 유입되어 철 이온을 공급한 후, 수용체와 결합한 상태로 세포 외부로 유리되어 순환하는 특징이 있다. 이러한 특징을 이용하여, 종래의 반감기가 짧은 단백질을 결합하여 순환 반감기를 증가시키기 위한 융합 파트너로 사용되고 있다.
Transferrin is the third most abundant plasma protein and is responsible for the transport of iron ions in the blood to various tissues. It is shorter than albumin or immunoglobulin G (IgG), but has a relatively long half-life of 8 days. It enters the cell through the transferrin receptor on the cell surface to supply iron ions and binds to the receptor There is a characteristic of being circulated outside the cell. Using these features, they are used as fusion partners to increase the circulating half-life by combining proteins with short half-lives of the prior art.

본 발명은 인간성장호르몬의 85번째와 144번째의 아미노산인 세린(serine)을 시스테인으로 치환하여 helix와 C-term의 loop 사이에 황화결합을 할 수 있도록 유도하였다. 이러한 황화 결합은 단백질의 구조를 안정화하여 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성을 갖도록 하였다. 본 발명의 명칭을 GHC3-P00-Th라 한다.
In the present invention, serine, which is the 85th and 144th amino acids of human growth hormone, is substituted with cysteine and induced to make sulfide bond between helix and C-term loop. These sulphide bonds stabilize the structure of the protein and have resistance to proteolytic degradation. The name of the present invention is called GHC3-P00-Th.

이를 뇌하수체를 적출한 Sprague-Dawley Rat 모델에 주입하여 인간성장호르몬 융합체의 효력시험을 실시한 결과, 대조군에 비해 체중이 증가하였고, 혈청 중 IGF-1 level을 확인한 결과 양성대조군에 비하여 높은 수준을 유지하였다.
Injection of this into the pituitary-derived Sprague-Dawley Rat model resulted in an increase in body weight compared to the control group, and the level of IGF-1 in the serum was higher than that of the control group .

본 발명자들은 인간성장호르몬의 85번과 114번 아미노산을 시스테인으로 치환한 변이체를 트랜스페린과 융합하여, 비 융합된 원형 인간 성장호르몬에 비해 비활성도(specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The inventors of the present invention have found that the specific activity and the stability in blood are remarkably increased as compared with the non-fused circular human growth hormone by fusing a mutant in which amino acids 85 and 114 of human growth hormone are substituted with cysteine with transferrin Thereby completing the invention.

본 발명의 목적은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질 말단에 트랜스페린이 결합된 융합 단백질 또는 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a human growth hormone mutation protein comprising an amino acid sequence in which the 85th and 144th serines in the amino acid sequence of a human growth hormone protein are respectively substituted with hydrophobic amino acids, Or a pharmaceutical composition containing the fusion protein or the protein as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, In order to achieve the above object,

본 발명은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.The present invention relates to a human growth hormone mutation protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serines in the amino acid sequence of human growth hormone protein are respectively substituted with a hydrophobic amino acid, An expression vector containing the gene, and a transformant into which the expression vector has been introduced into a host cell.

또한, 본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 N-말단에 트랜스페린(transferrin)이 결합된 인간 성장 호르몬 변이 단백질과 트랜스페린의 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다. The present invention also relates to a fusion protein of a human growth hormone mutation protein and a transferrin in which a transferrin is bound to the N-terminal of the human growth hormone mutation protein, a gene encoding the protein, an expression vector containing the gene, Wherein the expression vector is introduced into the host cell.

또한, 본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 각각의 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 각각의 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 각각의 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a method for producing a human growth hormone mutant protein comprising the human growth hormone mutation protein, the fusion protein, the expression vector comprising the respective genes encoding the protein, or the respective transformants into which the respective expression vectors are introduced into the host cell, A pharmaceutical composition for the treatment of growth failure or growth retardation.

아울러, 본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 각각의 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 각각의 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 유년기 개시형 결핍증 또는 성인기 개시형 결핍증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
In addition, the present invention relates to a human growth hormone mutant protein, a fusion protein, an expression vector comprising each gene coding for the protein, or a childhood organism containing as an active ingredient a transformant into which the respective expression vector is introduced into a host cell The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of starvation deficiency or adult onset type deficiency.

본 발명의 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린(transferrin) 융합 단백질은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
The human growth hormone mutant protein comprising the amino acid sequence in which the 85th and 144th serines of the human growth hormone protein of the present invention are substituted with hydrophobic amino acids, respectively, or a transferrin fusion protein thereof Specific activity and blood stability of the human growth hormone protein compared to the conventional human growth hormone protein and has an effect of increasing the half life of the conventional human growth hormone protein and thereby being useful for the treatment of growth failure or growth retardation .

도 1은 pcDNA3.1(+)/preTf 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 2는 pcDNA3.1(+)/preTf(B) 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 3은 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 4는 pcDNA3.1(+)/GHC3-P00-Th 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 5 (5a, 5b)는 GHC3-P00-Th 플라스미드로 형질전환된 Expi293F 세포주의 G GHC3-P00-Th 발현양을 나타내는 도이다.
도 6은 인간성장호르몬 융합단백질의 정제 과정 중 Q-세파로즈 크로마토그래피를 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Q-세파로즈 정제 후, 인간성장호르몬에 융합된 트랜스페린을 철이 결합된 형태로 만들어 Urea-page로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 GHC3-P00-Th 단백질의 철이온 결합 후, 남아있는 자유 철이온을 제거하고 완충액을 갈아주기 위하여 size exclusion 크로마토그래피를 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 size exclusion 크로마토그래피 과정 중, 타겟 단백질 용출구간에 대하여 reverse phase-HPLC를 이용하여 순도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 최종 정제한 단백질에 대하여 SDS-PAGE와 SEC-HPLC, 그리고 RP-HPLC를 이용하여 단백질의 타겟 밴드와 순도 및 불순물을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 단백질 내 Free 시스테인 잔기 유무를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 동물 세포주에서 발현한 GHC3-P00-Th의 세포 내 활성분석을 Nb2-11 세포 증식실험을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 hGH, GHC3-P00-Th 단백질의 단백질분해효소에 의한 분해 저항성 비교를 나타내는 도이다.
도 14는 hGH와 GHC3-P00-Th 단백질들의 생체 내 혈장 반감기의 비교를 나타내는 도이다.
도 15는 뇌하수체가 제거된 랫트에 hGH, GHC3-P00-Th를 투여하여 생체 내 활성 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 hGH 및 GHC3-P00-Th를 SC 주사한 후 뇌하수체 적출된 랫트에서 IGF-1 혈청 농도를 나타내는 도이다.
도 17은 뇌하수체가 제거된 랫트에 hGH, GHC3-P00-Ta, GHC3-P00-Th를 투여하여 무게 증가 결과를 나타낸 도이다:
GHC3-P00-Ta: 철이온이 결합되지 않은 형태;
GHC3-P00-Th: 철이온이 결합된 형태, 자유 철이온 함께 존재; 및
GHC3-P00-Th(free-iron free) : 자유 철이온이 제거된 형태의 재조합 단백질.
1 is a diagram showing a cleavage map of a pcDNA3.1 (+) / preTf vector.
2 is a diagram showing a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / preTf (B) vector.
3 is a diagram showing a cleavage map of a pcDNA3.1 (+) / Tf (B) vector.
4 is a diagram showing a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / GHC3-P00-Th vector.
5 (5a, 5b) is a graph showing the expression amount of GGHC3-P00-Th in the Expi293F cell line transformed with the GHC3-P00-Th plasmid.
FIG. 6 shows the results of Q-Sepharose chromatography in the purification process of the human growth hormone fusion protein. FIG.
FIG. 7 is a graph showing the results of Urea-page determination of transferrin fused to human growth hormone after binding to Q-Sepharose. FIG.
FIG. 8 is a graph showing the results of size exclusion chromatography to remove remaining free iron ions and to change buffers after iron-ion binding of GHC3-P00-Th protein.
FIG. 9 is a graph showing the result of measurement of purity using reverse phase-HPLC for a target protein elution interval during a size exclusion chromatography process.
FIG. 10 is a graph showing the results of measurement of protein target band, purity and impurity using SDS-PAGE, SEC-HPLC, and RP-HPLC for the final purified protein.
Fig. 11 shows the results of confirming the presence or absence of free cysteine residues in proteins. Fig.
12 is a diagram showing the results of confirming intracellular activity of GHC3-P00-Th expressed in an animal cell line through Nb2-11 cell proliferation experiments.
Fig. 13 is a diagram showing a comparison of degradation resistance of hGH and GHC3-P00-Th proteins by proteolytic enzymes.
14 shows a comparison of in vivo plasma half-life of hGH and GHC3-P00-Th proteins.
15 is a graph showing the results of in vivo activity analysis by administering hGH and GHC3-P00-Th to pituitary-removed rats.
FIG. 16 is a graph showing IGF-1 serum concentration in pituitary-extracted rats after SC injection of hGH and GHC3-P00-Th.
FIG. 17 shows the results of weight gain by administering hGH, GHC3-P00-Ta, and GHC3-P00-Th to pituitary-removed rats:
GHC3-P00-Ta: unconjugated form of iron ion;
GHC3-P00-Th: Iron ion-bound form, free iron ion present together; And
GHC3-P00-Th (free-iron free): Recombinant protein in the form of free iron ion removed.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

본 발명은 인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다. The present invention relates to a human growth hormone mutation protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serines in the amino acid sequence of human growth hormone protein are respectively substituted with a hydrophobic amino acid, An expression vector containing the gene, and a transformant into which the expression vector has been introduced into a host cell.

본 발명에 사용된 용어 인간 성장 호르몬(hGH)은 인간 성장 호르몬 및 또한 천연적으로 발생한 폴리펩티드와 동일한 기능을 갖는 hGH의 유사체(analog), 분절(fragment), 동족체(homolog), 유도체 또는 대립 변종(allelic variant)을 포함한다. 본 발명에 따른 성장 호르몬은 인간 또는 동물 근원으로부터 정제될 수 있고, 화학적으로 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. hGH 제제는 상업적으로 입수가능하다. The term human growth hormone (hGH), as used herein, refers to human growth hormone and also analogs, fragments, homologs, derivatives or allelic variants of hGH having the same function as a naturally occurring polypeptide allelic variant. The growth hormone according to the present invention can be purified from human or animal sources, and can be produced chemically or recombinantly. hGH preparations are commercially available.

상기 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된 것이 바람직하나 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 인간 성장 호르몬 단백질을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다.The amino acid sequence of the human growth hormone is preferably represented by SEQ ID NO: 1, but it is preferable that the amino acid sequence of the human growth hormone is the same as the protein or that the gene coding for the human growth hormone protein on the chromosome is at the same position, Deleted, or substituted.

상기 인간 성장 호르몬 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.The human growth hormone protein comprises at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, most particularly at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: But it is not limited thereto.

상기 소수성 아미노산은 황화결합이 가능한 아미노산인 것이 바람직하며, 상기 소수성 아미노산은 시스테인(Cysteine)인 것이 바람직하다.
The hydrophobic amino acid is preferably an amino acid capable of sulfidation bonding, and the hydrophobic amino acid is preferably cysteine.

본 발명은 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 말단에 트랜스페린(transferrin)이 결합된 인간 성장 호르몬 변이 단백질과 트랜스페린의 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다. The present invention relates to a fusion protein of a human growth hormone mutation protein and transferrin in which a transferrin is bound to the end of the human growth hormone mutant protein, a gene encoding the protein, an expression vector comprising the gene, Thereby providing a transformant introduced into the cell.

상기 트랜스페린이 연결되는 말단은 아미노 말단(5-말단, N-말단) 또는 카복시 말단(3-말단, C-말단) 중 어느 것이라도 가능하다. The terminal to which the transferrin is connected may be either an amino terminal (5-terminal, N-terminal) or a carboxy terminal (3-terminal, C-terminal).

상기 트랜스페린은 서열번호 2의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.The transferrin is a protein represented by the sequence of SEQ ID NO: 2, or a protein having the same activity as the protein or having a gene position encoding the transferrin on the chromosome is equal to or more than that of one or several amino acids of the protein, Base sequence.

상기 트랜스페린 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.The transferrin protein has at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, most specifically at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: But it is not limited thereto.

상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질은 서열번호 3의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 인간 성장 호르몬 변이 단백질을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.The human growth hormone mutant protein is a protein represented by the sequence of SEQ ID NO: 3 or a protein having the same activity as the protein or a gene position encoding the human growth hormone mutant protein on a chromosome, Amino acid may be added, deleted, or substituted.

상기 융합 단백질은 서열번호 4로 표시된 것이 바람직하나 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.The fusion protein is preferably represented by SEQ ID NO: 4, but it is preferable that the fusion protein has the same activity as the protein or that the gene position encoding the fusion protein on the chromosome is the same, Sequence.

본 발명에 사용된 인간 성장 호르몬 단백질 또는 트랜스페린은 동물, 식물, 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 인간 유래 성장 호르몬 단백질 또는 트랜스페린인 것이 바람직하나, 인간 유래 성장 호르몬 단백질 또는 트랜스페린과 동등한 활성을 가지는 이종 유래 단백질일 수 있다.The human growth hormone protein or transferrin used in the present invention may be derived from an animal, a plant, or a microorganism and is preferably a human-derived growth hormone protein or transferrin, but is preferably derived from a human-derived growth hormone protein or a heterologous Protein.

상기 단백질에는 추가적으로 인산화, 아세틸화, 메틸화, 당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며, 다른 단백질과 결합할 수 있으나, 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다.Such proteins may additionally be modified such as phosphorylation, acetylation, methylation, glycosylation, etc., and may bind to other proteins, but they may be the same as the proteins before modification as long as they do not change to such an extent that the function of the protein is lost .

상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 염기서열로 치환한 것일 수 있고, 유전자 말단 부위의 일부가 제거, 치환, 또는 첨가되어 제한 효소 인식 부위가 삽입된 것일 수 있다. 예를 들어, 단백질 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The gene encoding the protein may be obtained by substituting the base sequence of the restriction enzyme recognition site in the gene with another base sequence encoding the same amino acid as the amino acid encoding the base sequence, Or may be added with a restriction enzyme recognition site inserted. For example, the protein may be a protein obtained by replacing the Thymine of the BamH I restriction enzyme recognition site (GGATCC) in the protein gene with cytosine.

상기 제한 효소의 종류에는 EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, XhoⅠ, FokⅠ, Alw26Ⅰ, BbvⅠ, BsrⅠ, EarⅠ, HphⅠ, MboⅠ, SfaNⅠ, Tth111Ⅰ, NaeⅠ, NheI, NgoMⅣ, NheI, Eco57Ⅰ, BcgⅠ, BpⅠ, Bsp24Ⅰ, BaeⅠ, CjeⅠ, EcoPⅠ, HintⅢ, StyLTⅠ 등이 있으며, 사용하고자 하는 유전자, 발현 벡터 또는 유전자 조작 환경에 따라 당업계에서 사용되는 모든 제한 효소가 제한 없이 이용될 수 있다.The type of the restriction enzyme is EcoR I, BamH I, Hind Ⅲ , kpn Ⅰ, Not Ⅰ, Pst Ⅰ, Sma Ⅰ, Xho Ⅰ, Fok Ⅰ, Alw26 Ⅰ, Bbv Ⅰ, Bsr Ⅰ, Ear Ⅰ, Hph Ⅰ, Mbo Ⅰ used, and the like SfaN ⅰ, Tth111 ⅰ, Nae ⅰ, Nhe I, NgoM ⅳ, Nhe I, Eco57 ⅰ, Bcg ⅰ, Bp ⅰ, Bsp24 ⅰ, Bae ⅰ, Cje ⅰ, EcoP ⅰ, Hint ⅲ, StyLT ⅰ, Any restriction enzyme used in the art may be used without limitation, depending on the gene, expression vector or genetic engineering environment in question.

상기 발현벡터는 도 1, 2, 3, 4로부터 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개열지도로 표시되는 벡터로부터 제조된 것일 수 있다. The expression vector may be prepared from a vector represented by any one of the cleavage maps selected from the group consisting of FIGS. 1, 2, 3 and 4.

본 발명의 '발현 벡터'란 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 수단으로서, 플라스미드, 코스미드, BAC, 바이러스 핵산 등의 여러 형태를 포함한다. 상기 벡터에는 목적 유전자가 성공적으로 숙주세포에 도입되었음을 확인할 수 있는 항생제 내성 유전자 등의 선택적 마커를 포함하고 있는 것이 일반적이며, 목적 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열, 인핸서, 코작 서열, 샤인-달가노 서열 등을 목적에 따라 다양하게 포함할 수 있다. 복제 가능한 발현벡터의 경우 복제 기원을 포함한다.The expression vector of the present invention includes various forms of plasmid, cosmid, BAC, viral nucleic acid and the like as a means for introducing a nucleic acid sequence encoding a target protein into a host cell. The vector generally includes an optional marker such as an antibiotic resistance gene that can confirm that the target gene has been successfully introduced into the host cell. The vector includes a promoter, an operator, an initiation codon, a termination codon, A denylated sequence, an enhancer, a Kozak sequence, a Shine-Dalgano sequence, and the like. For replicable expression vectors, it includes the origin of replication.

상기 숙주세포는 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포, 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에서 재조합 단백질 생산에 사용되는 모든 숙주세포가 이용 가능하다.
The host cell may be any one selected from the group consisting of E. coli, yeast, fungi, plant cells, and animal cells, and is not limited thereto. Any host cell used in the art for producing recombinant proteins may be used.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 경우 천연형 성장 호르몬(GH)의 아미노산 서열상 85번째 세린과 144번째 세린을 시스테인으로 치환하여 서로 이황화 결합을 이루도록 유도하였다. Free 시스테인 유무를 확인하여 간접적으로 85번과 144번 시스테인의 이황화 결합을 확인하였다. In a specific embodiment of the present invention, the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) of the present invention is substituted with cysteine at the 85th serine and the 144th serine in the amino acid sequence of the native growth hormone (GH) Lt; / RTI > Free cysteine was confirmed and the disulfide bonds of cysteines 85 and 144 were confirmed indirectly.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 인간 성장호르몬(hGH)과 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 세포 내 활성 분석결과, GHC3-P00-Th는 hGH 에 비하여 낮은 세포 증식 활성도를 보였다. 상기 결과를 바탕으로 EC50의 값을 산출하였다. 각각 계산된 EC50 값의 경우 hGH 0.07 ng/ml, GHC3-P00-Th 0.47 ng/ml 임을 확인하였다(도 12 참조). GHC3-P00-Th의 경우 분자량이 증가하여도 hGH-도메인의 생물학적 효능은 보존되는 것으로 확인되었다. The present inventors also found that GHC3-P00-Th had lower cell proliferation activity than hGH as a result of intracellular activity analysis of human growth hormone (hGH) and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) of the present invention. Based on the above results, the value of EC 50 was calculated. The calculated EC 50 values were 0.07 ng / ml of hGH and 0.47 ng / ml of GHC3-P00-Th, respectively (see FIG. 12). In the case of GHC3-P00-Th, it was confirmed that the biological efficacy of the hGH-domain was preserved even with increasing molecular weight.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 GHC3-P00-Th 단백질의 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성 정도를 측정하기 위하여, 단백질을 인간 혈청(Serum)과 반응 후, 정해진 시간에 혈청 내 잔존하는 GH의 양을 측정하였다. 천연형 GH의 경우 혈청과 반응시간이 증가함에 따라 잔존 양이 감소하며 15시간에서 30%인 것을 확인할 수 있으나, GHC3-P00-Th 단백질의 경우 15시간까지 단백질의 양에 큰 변화 없는 것을 확인할 수 있다(도 13 참조). 시스테인 85와 144 간의 이황화 결합 형성이 단백질의 단백질분해효소에 대한 저항성 증대에 도움을 주는 것을 확인하였다. In order to measure the degree of degradation resistance of the GHC3-P00-Th protein of the present invention to the proteolytic enzyme in blood, the inventors of the present invention found that the GHC3-P00- The amount was measured. In the case of natural type GH, the amount of residual GHC3-P00-Th protein was found to be 30% at 15 hours, as the reaction time with serum increased. (See Fig. 13). It was confirmed that disulfide bond formation between cysteine 85 and 144 helps increase the resistance of protein to protease.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 단백질의 생체 반감기를 결정하기 위하여 생쥐에서 단백질을 투여 후 혈청 내에 존재하는 Growth Hormone의 양을 측정하였다. 그 결과, GHC3-P00-Th 융합 단백질은 천연형 인간 Growth Hormone보다 높은 혈중 반감기를 보였다(표 1 참조). 이는 Growth Hormone보다 상대적으로 큰 단백질 반경을 갖고 있기 때문에, 신장에서의 여과 속도가 느림을 보여 주는 결과이다. 또한 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성이 증대된 Growth Hormone 변이 단백질을 트랜스페린에 융합시킴으로서, 신장 여과 속도의 감소와 혈중 안정성이 모두 개선됨으로서 생체에서의 혈중 반감기가 극대화되어 나타난 결과이다(도 14 참조). In addition, when the GHC3-P00-Th fusion protein of the present invention was administered to a living body, the present inventors measured the amount of growth hormone present in the serum after administration of the protein in mice to determine the biological half-life of the protein. As a result, the GHC3-P00-Th fusion protein showed a higher blood half-life than the native human Growth Hormone (see Table 1). This is a result of slower filtration rate in the kidney, as it has a relatively larger protein radius than Growth Hormone. In addition, fusion of Growth Hormone mutant protein with increased resistance to serum protease in transferrin resulted in a decrease in renal filtration rate and improvement in blood stability, resulting in maximization of blood half-life in the living body (see FIG. 14).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질의 생체 내 활성 실험을 위해 실험동물로 뇌하수체가 제거된 5주령의 수컷 랫트(hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC사, 일본)를 사용하였으며, 뇌하수체가 제거된 랫트의 무게 증가 분석 결과, 용매 대조군을 투여한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 체중 증가가 거의 일어나지 않았으나, 인간 성장호르몬(hGH)와 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 하루에 1회씩 10일간 투여하였을 경우에는 투여 후 10일 차까지 지속적으로 체중이 증가하였고, 10일 차에서는 인간 성장호르몬(hGH)보다 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 체중 증가율이 3.53% 정도 더 높은 것으로 나타났다(도 15 참조). 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단회 투여하였을 경우에는 투여 후 3일까지는 지속적으로 체중이 증가하였으며, 7일 차까지는 인간 성장호르몬(hGH)을 투여한 군보다 우수한 활성을 유지하였다. 인간 성장호르몬(GHC3-P00-Th)을 단회 투여할 경우에는 효력이 월등하게 높았으며, 하루에 1회 투여하였을 경우에도 인간 성장호르몬(hGH)과 동등 이상의 효력을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 체중 증강 속도에 있어서 인간 성장호르몬(hGH)을 매일 주사 받은 랫트에 비해 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단회 투여 받은 랫트에서 초기 3일에 걸쳐 확연히 더욱 빠른 속도록 체중이 증가되었다. 따라서, 본 발명의 GHC3-P00-Th 은 hGH 와 비교하여 우수한 지속적인 활성을 가지며, 매일 주사를 맞아야 하는 인간 성장호르몬의 한계를 해결할 수 있을 것으로 기대된다. For the in vivo activity test of the GHC3-P00-Th fusion protein of the present invention, a 5-week-old male rat (hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC, Japan) in which pituitary gland was removed was used as an experimental animal. (HGH) and human growth hormone mutation protein (GHC3-P00-Th) in the day after the administration of the human control hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) was higher than that of human growth hormone (hGH) at the 10th day after the administration for 10 days. The body weight gain of the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) % (See Fig. 15). When the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) was administered once, body weight was continuously increased until the third day after administration, and up to day 7, the activity was superior to that of human growth hormone (hGH) . When human growth hormone (GHC3-P00-Th) was administered in a single dose, the efficacy was remarkably high, and even when administered once a day, it was found to have an efficacy equal to or higher than that of human growth hormone (hGH). In addition, in rats that received a single dose of human growth hormone mutation protein (GHC3-P00-Th) compared with rats injected daily with human growth hormone (hGH) at a rate of weight gain, Respectively. Therefore, the GHC3-P00-Th of the present invention is expected to be able to solve the limitation of human growth hormone which has an excellent continuous activity as compared with hGH and has to be injected every day.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 Growth Hormone의 트랜스페린 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 혈청 내에 존재하는 IGF-1 단백질의 양을 측정하였다. ELISA 분석 결과, 시험물질 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)와 hGH 30 ug/rat(Daily)은 vehicle보다 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.01). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 vehicle에 비하여 5일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.05). 또한 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)은 10일 차까지 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 3일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001)(도 16 참조).In addition, the present inventors measured the amount of IGF-1 protein present in the serum when the transferrin fusion protein of Growth hormone of the present invention was administered to a living body. As a result of ELISA analysis, test substance GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) and hGH 30 ug / rat (Daily) were significantly higher than vehicle (p <0.001 or p <0.01). GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher up to day 5 than vehicle (p <0.001 or p <0.05). In addition, the GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) was significantly higher than the hGH 30 ug / rat (Daily) until the 10th day (p <0.001). GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher up to day 3 than hGH 30 ug / rat (Daily) (p <0.001) (see FIG. 16).

따라서, 본 발명의 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 트랜스페인 융합 단백질(GHC3-P00-Th)은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Accordingly, the transspan fusion protein (GHC3-P00-Th) of the human growth hormone mutation protein of the present invention has a marked increase in specific activity and blood stability as compared with the conventional human growth hormone protein, And may be useful for the treatment of growth failure or growth retardation.

또한, 본 발명은 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention relates to a method for inhibiting growth of a human growth hormone mutant protein, its transferrin fusion protein, an expression vector comprising a gene encoding said protein, or a transformant into which said expression vector has been introduced into a host cell, failure or growth retardation in a mammal.

상기 성장부전 또는 성장지연은 뇌하수체 성장호르몬 분비장애, 만성 신장 질환(chronic renal disease), 터너증후군(Turner's syndrome), 악액질(cachexia) 또는 AIDS 소모(AIDS wasting)에 기인한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
The growth failure or growth retardation may be caused by, but not limited to, pituitary gland growth hormone secretion disorder, chronic renal disease, Turner's syndrome, cachexia or AIDS wasting .

또한, 본 발명은 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 이의 트랜스페린 융합 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 유년기 개시형 결핍증 또는 성인기 개시형 결핍증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
The present invention also relates to a method for the treatment and / or prevention of childhood-onset deficiency syndrome, which comprises as an active ingredient a human growth hormone mutation protein, a transferrin fusion protein thereof, an expression vector comprising a gene encoding said protein, or a transformant into which said expression vector has been introduced into a host cell Or a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of adult onset type deficiency.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a commonly used filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant or a surfactant may be used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose lactose, or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives may be included. have. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally according to the intended method and may be administered orally, parenterally, rectally, intravenously, muscularly, subcutaneously, intracavitally, It is preferable to select it.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease, But is not limited to. The individual dosages will specifically contain amounts in which the active drug is administered in one go.

일회 투여량은 단백질의 양을 기준으로 1 내지 100 밀리그램이고, 바람직하게는 3 내지 50 밀리그램이고, 더욱 바람직하게는 6 내지 30밀리그램이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있으며, 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.A single dose is 1 to 100 milligrams, preferably 3 to 50 milligrams, more preferably 6 to 30 milligrams, based on the amount of protein, and may be administered once or several times a day, . &Lt; / RTI &gt;

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.

따라서, 본 발명의 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 트랜스페인 융합 단백질(GHC3-P00-Th)은 기존의 인간 성장 호르몬 단백질에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 증가한 효과를 나타냄으로써 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Accordingly, the transspan fusion protein (GHC3-P00-Th) of the human growth hormone mutation protein of the present invention has a marked increase in specific activity and blood stability as compared with the conventional human growth hormone protein, And may be useful for the treatment of growth failure or growth retardation.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

<< 실시예Example 1> 플라스미드 제작 1> Plasmid production

<1-1> <1-1> 트랜스페린Transferrin 발현 플라스미드 제작  Production of expression plasmids

트랜스페린 단백질을 얻기 위해, 인간 간암 세포인 HepG2을 이용하였다. HepG2 세포를 10% 태아 혈청(fetal bovine serum, WelGNE)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 포함된 DMEM(HyClone)을 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 항온기에서 계대배양하였다. 계대배양 후 이틀간 배양한 HepG2 세포의 배지를 제거하고 인산완충액(HyClone)을 이용하여 세척 후, 세포 펠렛을 수거하여 원심분리하여 배지를 제거 후 -70℃에 보관하여 사용하였다. -70℃에 보관되어 있던 세포를 꺼내 해동한 후 RNA 추출 키트(LeGene)을 사용하여 지침서에서 제시한 표준 조건으로 수행하여 총 mRNA를 얻었다. 얻어진 총 mRNA를 cDNA 합성 시스템(LeGene)으로 oligo(dT)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.HepG2, a human liver cancer cell, was used to obtain transferrin protein. HepG2 cells were subcultured in DMEM (HyClone) containing 10% fetal bovine serum (WelGNE) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco) at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. After the subculture, the medium for HepG2 cells cultured for two days was removed, washed with phosphate buffer (HyClone), and the cell pellet was collected, centrifuged, and the medium was removed and stored at -70 ° C. Cells stored at -70 ° C were thawed and thawed, followed by RNA extraction kit (LeGene) using standard conditions as described in the guidelines to obtain total mRNA. The total mRNA was synthesized by using oligo (dT) as a cDNA synthesis system (LeGene).

만들어진 cDNA를 주형으로 DNA 중합효소(Phusion)를 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. 반응에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문제작하여 사용하였으며 트랜스페린 유전자의 5’말단에 Nhe I 제한효소 부위, '코작(Kozak) 서열을 위치시키고 3'말단에 Xho I 제한 효소 부위, Stop 코돈(TAA)이 위치하도록 제작하였다. 센스프라이머(5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3', 서열번호 10)및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', 서열번호 11)를 10 pmol로 사용하였고 cDNA 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μl로 하였다. PCR 기기를 이용하여 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃에서 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 원하는 부분의 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다.Polymerase chain reaction (PCR) was performed using DNA polymerase (Phusion) as a template. The primers used for the reaction were custom-made in Cosmos Tech. The Nhe I restriction site, the Kozak sequence, the Xho I restriction site, and the Stop codon TAA). 10 pmol of the sense primer (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3 ', SEQ ID NO: 10) and the antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 11) were used. Distilled water was added to the DNA polymerase and buffer together with the cDNA template The total volume was 50 μl. The reaction was carried out at 98 ° C for 30 seconds using a PCR instrument. The circulation program was repeated 30 times at 98 ° C for 10 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, at 72 ° C for 1 minute, and finally at 72 ° C for 10 minutes. The amplified transferrin gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm its size. The desired portion of the agarose gel was cut and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN).

정제를 통해 얻어진 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+)플라스미드(Invitrogen)를 각각 NheI(Enzynomics)과 XhoI(Enzynomics) 제한효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액(10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA)를 넣고 37℃에서 2 ~ 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 벡터를 T4 DNA 접합효소(Takara)와 함께 16℃에서 16시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환 하였고 엠피실린 항생제가 포함된 한천(Agar) 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다.The Nhe I (Enzynomics) and Xho I (Enzynomics) restriction enzymes were treated with the transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid (Invitrogen) obtained through purification. 10 units of restriction enzyme and buffer solution (10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 μg / ml BSA) were added and reacted at 37 ° C for 2 to 3 hours. After the reaction was completed, the size was confirmed by electrophoresis on a 1% agarose gel, the agarose gel was cut out, and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN). The purified transferrin gene and pcDNA3.1 (+) vector were reacted with T4 DNA-binding enzyme (Takara) at 16 ° C for 16 hours. After the reaction, E. coli DH10B was transformed and applied to an agar plate containing ampicillin antibiotics, followed by culturing at 37 DEG C for 16 hours to select E. coli colonies.

pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위해서 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 확인하였다. 대장균 콜로니를 증류수에 희석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머(5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3', 서열번호 10) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3, 서열번호 11)를 이용하였으며 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소 연쇄반응(PCR)이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 16시간 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 추출 키트(GeneAll)을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드의 염기서열 분석은 코스모진텍사에서 진행하여 확인하였다. 이렇게 만들어진 트랜스페린 발현 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/preTf(서열번호 5)로 명명한다(도 1).To confirm the successful insertion of the transferrin gene into the pcDNA3.1 (+) plasmid, DNA polymerase was used to confirm the polymerase chain reaction (PCR). (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3 ', SEQ ID NO: 10) and an antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3, SEQ ID NO: 11) used for the amplification of transferrin gene were used as a template and the E. coli colonies were diluted in distilled water The reaction was carried out at 98 ° C for 30 seconds. The cycle was repeated 30 times at 98 ° C for 10 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute, and finally at 72 ° C for 10 minutes. After PCR, the genes were confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel. The colonies were inoculated into LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) And cultured in a 37 ° C shaking incubator. The cultured Escherichia coli was centrifuged and separated into supernatant and cell pellet. The cell pellet was purified with plasmid extraction kit (GeneAll). Sequence analysis of the purified plasmid was carried out in Cosmos TEX. The thus constructed transferrin expression plasmid is referred to as pcDNA3.1 (+) / preTf (SEQ ID NO: 5) in this specification (Fig. 1).

플라스미드 제작 시 제한효소 BamHI 부위를 이용하기 위해 트랜스페린 유전자에 존재는 BamHI 부위를 위치선택적 돌연변이(site-direct mutagenesis)를 실시하여 BamHI 제한 효소 부위를 제거하는 작업을 하였다. 트랜스페린 유전자에 존재하는 BamHI 제한 효소 부위를 제거하기 위해 핵산을 타이민(Thymine, T)에서 사이토신(cytosine, C)로 치환하였으나 아미노산 서열은 아스파트산(Aspartic acid)으로 유지된다. BamHI 제한 효소 부위, GGATCC를 GGACCC로 핵산을 치환하기 위해 센스 프라이머(5'-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3', 서열번호 12) 및 안티센스 프라이머(5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3', 서열번호 13)를 코스모진텍사에서 주문 제작하여 사용하였다. 기 제작된 pcDNA3.1(+)/preTf 플라스미드를 주형으로 사용하였으며 위치선택적 돌연변이 키트(iNtRON)을 이용하여 제조사에서 제공하는 지침서대로 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 엠피실린 항생제가 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 추출 키트(GeneAll)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였고, 염기서열 분석을 통해 트랜스페린 유전자에 존재하는 BamHI 제한효소 부위의 핵산이 치환된 것을 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는pcDNA3.1(+)/preTf(B)(서열번호 6)로 명명한다(도 2).
Transferrin present in the gene in order to use the restriction enzymes BamH I site when plasmid was produced by the process of the BamH I site subjected to regioselective mutation (site-direct mutagenesis) removing the BamH I restriction site. To remove the BamH I restriction site present in the transferrin gene, the nucleic acid was replaced with cytosine (C) in thymine (T), but the amino acid sequence was maintained as aspartic acid. (5'-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3 ', SEQ ID NO: 12) and an antisense primer (5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGGCCCATAG-3', SEQ ID NO: 13) to replace the BamH I restriction enzyme site, GGATCC with GGACCC, . The prepared pcDNA3.1 (+) / preTf plasmid was used as a template, and a site-directed mutagenesis kit (iNtRON) was used according to the manufacturer's instructions. After completion of the polymerase chain reaction, the gene was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel. The identified E. coli colonies were inoculated into LB liquid medium containing ampicillin antibiotics and cultured for 16 hours in a shaking incubator at 37 ° C. The cultured Escherichia coli was centrifuged, and the supernatant and cell pellet were separated. The cell pellet was purified by plasmid extraction kit (GeneAll), and the plasmid DNA was purified from the BamH I restriction site It was confirmed that the nucleic acid was substituted. The thus constructed plasmid is referred to as pcDNA3.1 (+) / preTf (B) (SEQ ID NO: 6) in this specification (FIG.

트랜스페린은 분비 단백질로서 N-말단에 합성된 단백질이 세포막으로 전달되도록 도와주는 신호 펩타이드(Signal peptide)를 포함하고 있으며, 아미노산 서열은 MRLAVGALLVCAVLGLCLA(서열번호 14)이다. 인간 성장 호르몬 유전자를 트랜스페린 유전자의 5' 말단에 삽입하기 위하여 트랜스페린에 존재하는 신호 펩타이드를 제거하고 5' 말단에 제한효소 BamHI을 위치시킨 플라스미드를 제조하였다. 3' 말단에는 Xho I과 Stop 코돈(TAA)을 위치시켰다. pcDNA3.1(+)/preTf(B)를 주형으로 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 반응에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문 제작하여 사용하였다. 센스프라이머(5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3', 서열번호 15) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', 서열번호 11)를 10 pmol로 사용하였고 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충용액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μl로 하였다. PCR 기기를 이용하여 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드를 각각 BamHI(Enzynomics)와 XhoI(Enzynomics) 제한 효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액 2 μl(10 mM Tris-HCL pH 7.9,50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA)를 넣고 37℃에서 2 ~ 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 DNA 정제 키트(iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 벡터를 다시 1% 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 DNA를 정량하였고, 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드를 T4 DNA 접합효소(Takara)를 첨가하여 16℃에서 16 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린이 포함된 한천 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지는 중합효소 연쇄반응을 통해 실행하였다. 대장균 콜로니를 물에 희석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머(5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3', 서열번호 15) 및 안티센스 프라이머(5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', 서열번호 11)를 이용하였으며 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였고 유전자삽입이 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 16시간 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 정제 키트(GeneAll)를 이용하여 정제하였다. 정제한 플라스미드는 염기서열분석을 통해 신호 펩타이드가 제거된 트랜스페린 유전자가 성공적으로 pcDNA3.1(+)에 삽입되었는지를 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/Tf(B)(서열번호 7)로 명명하였다(도 3).
Transferrin is a secreted protein that contains a signal peptide that helps the protein synthesized at the N-terminus to be delivered to the cell membrane, and the amino acid sequence is MRLAVGALLVCAVLGLCLA (SEQ ID NO: 14). To insert the human growth hormone gene into the 5 'end of the transferrin gene, a signal peptide present in the transferrin was removed and a plasmid in which the restriction enzyme Bam HI was located at the 5' end was prepared. Xho I and Stop codon (TAA) were located at the 3 'end. The polymerase chain reaction was performed using pcDNA3.1 (+) / preTf (B) as a template and DNA polymerase. The primers used for the reaction were custom-made in Cosmos Tech. 10 pmol of a sense primer (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3 ', SEQ ID NO: 15) and an antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 11) was used. Distilled water was added to the DNA polymerase and buffer solution together with the template The total volume was 50 μl. The reaction was carried out at 98 ° C for 30 seconds using a PCR instrument. The circulation program was repeated 30 times at 98 ° C for 10 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, at 72 ° C for 1 minute, and finally at 72 ° C for 10 minutes. The amplified transferrin gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm its size, and the agarose gel was cut and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN). The purified transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid were treated with Bam HI (Enzynomics) and Xho I (Enzynomics) restriction enzymes, respectively. 10 units of restriction enzyme and 2 μl of buffer solution (10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 μg / ml BSA) were added and reacted at 37 ° C for 2 to 3 hours. After the reaction, electrophoresis was carried out on 1% agarose gel, and the size was confirmed. The agarose gel was cut and the DNA was purified using a DNA purification kit (iNtRoN). The purified transferrin gene and pcDNA3.1 (+) vector were electrophoresed on 1% agarose gel and DNA was quantified. The transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid were added with T4 DNA joining enzyme (Takara) And reacted at 16 DEG C for 16 hours. After the reaction, E. coli DH10B was transformed, applied to an agar plate containing ampicillin, and cultured at 37 DEG C for 16 hours to select E. coli colonies. Successful insertion of the transferrin gene into the pcDNA3.1 (+) plasmid was performed by polymerase chain reaction. Escherichia coli colonies were diluted in water and used as a template. Using the sense primer (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3 ', SEQ ID NO: 15) and antisense primer (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 11) The reaction was carried out at 98 ° C for 30 seconds. The circulation program was repeated 30 times at 98 ° C for 10 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, at 72 ° C for 1 minute, and finally at 72 ° C for 10 minutes. After completion of the polymerase chain reaction, the cells were electrophoresed on 1% agarose gel to confirm the insertion of the gene, and E. coli colonies with gene insertion were inoculated into LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) And cultured in a 37 ° C shaking incubator for 16 hours. The cultured Escherichia coli was centrifuged and separated into supernatant and cell pellet. The cell pellet was purified using a plasmid purification kit (GeneAll). Sequence analysis of the purified plasmid confirmed the successful insertion of the signal peptide-deleted transferrin gene into pcDNA3.1 (+). The resulting plasmid was named pcDNA3.1 (+) / Tf (B) (SEQ ID NO: 7) in this specification (Fig. 3).

<1-2> <1-2> GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 발현 플라스미드 제조 Production of expression plasmids

GH1(untagged)-Human growth hormone 1(GH1), transcript variant 1, NM_000515.3(OriGene, SC300088)을 구매하여 pCMV6-XL5 vector에 들어있는 인간 성장 호르몬을 주형으로 사용하였다. 주형과 함께 센스 프라이머(5'-ATAGCTAGCTCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3', 서열번호 16)와 안티센스 프라이머 (5'-TATGGATCCGAAGCCACAGCTGCCCTCCA-3', 서열번호 17)를 DNA 중합효소(Phusion)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자에는 N-말단에 합성된 단백질이 세포막으로 전달되도록 도와주는 신호 펩타이드가 포함되어 있으며, 아미노산 서열은 MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(서열번호 18)이다. 증폭된 유전자의 5' 말단에는 NheI 제한효소 부위와 코작(Kozak) 서열을, 그리고 3' 말단에는 BamHI 제한효소를 갖도록 유전자 절편을 조작하였다. 증폭된 Human growth hormone 유전자와 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 플라스미드를 각각 NheI과 BamHI 제한효소를 20 unit 넣고 37℃에서 3시간 반응시킨 후, 1% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 유전자를 분리한 후 DNA Clean up 키트(COSMO)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 T4 DNA 접합효소(Takara)를 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린이 포함된 한천 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 플레이트에서 대장균 콜로니를 선택하여 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 진탕배양하였다. 배양된 대장균을 원심 분리하여 상층액과 세포 펠렛으로 분리한 후 세포 펠렛을 ExprepTMPlasmidSV, mini(GeneAll)를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드는 코스모진텍사에서 염기서열분석을 통해 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/GHW-P00-Th(서열번호 8)로 명명하였다. GH1 (untagged) -Human growth hormone 1 (GH1), transcript variant 1, NM_000515.3 (OriGene, SC300088) was purchased and human growth hormone contained in pCMV6-XL5 vector was used as a template. (5'-ATAGCTAGCTCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGACCTACAGGCTCCCGGAC-3 ', SEQ ID NO: 16) and an antisense primer (5'-TATGGATCCGAAGCCACAGCTGCCCTCCA-3', SEQ ID NO: 17) were amplified by polymerase chain reaction using a DNA polymerase The gene was amplified. The amplified gene includes a signal peptide that helps the protein synthesized at the N-terminus to be delivered to the cell membrane, and the amino acid sequence is MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 18). The gene fragment was manipulated to have the NheI restriction site and the Kozak sequence at the 5 'end of the amplified gene and the BamHI restriction enzyme at the 3' end. Twenty units of Nhe I and Bam HI restriction enzymes were added to each of the amplified human growth hormone gene and pcDNA3.1 (+) / Tf (B) plasmid, and reacted at 37 ° C for 3 hours. Then, electrophoresis was performed on 1% agarose gel After DNA was isolated, DNA was purified using a DNA clean up kit (COSMO). The purified DNA was reacted with T4 DNA joining enzyme (Takara) at 16 ° C for 16 hours. After the reaction, E. coli DH10B was transformed and applied to an agar plate containing ampicillin and cultured at 37 ° C for 16 hours. E. coli colonies were selected on the plate, inoculated into LB liquid medium, and cultured with shaking at 37 DEG C for 16 hours. The cultured Escherichia coli was centrifuged and separated into supernatant and cell pellet. The cell pellet was purified using Exprep PlasmidSV, mini (GeneAll). The purified plasmids were identified by sequencing in Cosmogyne Tex. This plasmid was named pcDNA3.1 (+) / GHW-P00-Th (SEQ ID NO: 8) in the present specification.

인간성장호르몬의 85번 아미노산 세린을 시스테인으로 치환하기 위해서 pcDNA3.1(+)/GHW-P00-Th를 주형으로 사용하여 위치선택적 돌연변이를 실시하였다. 센스 프라이머(5'-GCTGCTCATCCAGTGTTGGCTGGAGCCCG-3', 서열번호 19)와 안티센스 프라이머(5'-CGGGCTCCAGCCAACACTGGATGAGCAGC-3', 서열번호 20) 각각과 상기 주형과 및 DNA 중합효소를 넣고 연쇄중합반응 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 DpnI(Enzynomics)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거하였다. 반응이 끝난 후 5 μl를 DH10B에 넣어 형질전환하였고 엠피실린이 들어있는 플레이트에 도포하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 대장균 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지에서 다시 16시간 배양한 후 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛으로 분리한 후 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 염기서열 분석을 통해 확인하였다. Positive mutation was performed using pcDNA3.1 (+) / GHW-P00-Th as a template to substitute 85 amino acid serine of human growth hormone with cysteine. The gene was amplified through chain polymerization by inserting the sense primer (5'-GCTGCTCATCCAGTGTTGGCTGGAGCCCG-3 ', SEQ ID NO: 19) and the antisense primer (5'-CGGGCTCCAGCCAACACTGGATGAGCAGC-3', SEQ ID NO: 20) . The amplified DNA was reacted with Dpn I (Enzynomics) at 37 ° C for 1 hour to remove the DNA used as a template. After the reaction, 5 μl was transformed into DH10B, applied to a plate containing ampicillin, and cultured at 37 ° C for 16 hours. E. coli colonies were selected and cultured again in LB liquid medium for 16 hours. After centrifugation, the cells were separated into supernatant and cell pellet, and the plasmid DNA was purified. The purified DNA was identified by sequencing.

85번 세린을 시스테인으로 치환한 DNA를 다시 주형으로 사용하여 144번 아미노산인 세린을 시스테인으로 치환하기 위한 추가적인 위치선택적 돌연변이를 실시하였다. 센스 프라이머(5'-TCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGACACACCC-3', 서열번호 21)와 안티센스 프라이머(5'-GTTTGTGTCGAACTTGCAGTAGGTCTGCTTGA-3', 서열번호 22)를 사용하여 유전자를 증폭하였다. 증폭된DNA를 DpnI(Enzynomics)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거하였다. 반응이 끝난 후 5 μl를 DH10B에 넣어 형질전환하였고 엠피실린이 들어있는 플레이트에 도포하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 대장균 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지에서 다시 16시간 배양한 후 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛으로 분리한 후 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/GHC3-P00-Th(서열번호 9)로 명명하였다(도 4).
Additional positional selective mutagenesis was performed to replace the 144 amino acid serine with cysteine, using the DNA in which the 85th serine was replaced with cysteine as a template. The gene was amplified using a sense primer (5'-TCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGACACACCC-3 ', SEQ ID NO: 21) and an antisense primer (5'-GTTTGTGTCGAACTTGCAGTAGGTCTGCTTGA-3', SEQ ID NO: 22). The amplified DNA was reacted with Dpn I (Enzynomics) at 37 ° C for 1 hour to remove the DNA used as a template. After the reaction, 5 μl was transformed into DH10B, applied to a plate containing ampicillin, and cultured at 37 ° C for 16 hours. E. coli colonies were selected and cultured again in LB liquid medium for 16 hours. After centrifugation, the cells were separated into supernatant and cell pellet, and the plasmid DNA was purified. The purified DNA was identified by sequencing. The thus constructed plasmid was named pcDNA3.1 (+) / GHC3-P00-Th (SEQ ID NO: 9) in this specification (FIG.

<< 실시예Example 2> 일시적 형질 전환을 통한  2> through transient transduction GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 단백질의 발현  Expression of protein

본 발명에 사용되는 단백질들은 부유배양을 위해 변형된 인간 배아 신장암 세포주인 Expi293FTM 세포(Gibco)를 이용하여 세포 밖으로 단백질들을 분비하여 발현하였다. Expi293FTMExpression system kit(Gibco)에 포함되어 있는 Expi293FTM 세포를 해동 후, 30 ml 현탁배양용 무혈청 배지(Serum-free media for animal cell culture, Gioco)가 담긴 멸균 125 ml 플라스크(Corning)에 접종하여 37℃, 5% 이산화탄소 항온 배양기에서 125 rpm의 교반 속도로 진탕배양하였다. The proteins used in the present invention were expressed by expressing proteins outside the cells using Expi293F TM cells (Gibco), a modified human embryonic kidney cancer cell line, for suspension culture. Inoculate Expi293F TM Expression system kit (Gibco) after the Expi293F TM cells contained in the extract, 30 ml suspension culture a serum-free medium (Serum-free media for animal cell culture, Gioco) is filled with a sterile 125 ml flask (Corning) for And incubated at 37 DEG C in a 5% carbon dioxide incubator at a stirring speed of 125 rpm.

Expi293FTM 세포주를 3~5 x 106 cells/ml의 세포 밀도로 유지하며 3~4일마다 계대 배양하여 세포를 안정화시킨 후 형질전환을 위해 2 x 106 cells/ml의 세포 밀도로 무혈청 배지에 접종하여 24시간 진탕배양하였다. 형질 전환 직전에 세포의 밀도를 다시 2 x 106 cells/ml로 맞추고 세포의 생존능력이 96% 이상인지 확인하고 실험에 사용하였다. Maintain Expi293F TM cell lines in cell density of 3 ~ 5 x 10 6 cells / ml and serum-free medium to a cell density of 2 x 10 6 cells / ml for transfection was subcultured to stabilize the cells every 3-4 days And cultured with shaking for 24 hours. The cell density was again adjusted to 2 x 10 6 cells / ml just before transfection and cell viability was determined to be 96% or more.

플라스미드 대량 정제를 통해 준비된 pcDNA3.1(+)/GHC3-P00-Th DNA를 22.5 ug을 준비하여 Opti-MEM(Gibco)으로 희석하여 준비하고 ExpiFectaminTM 293Reagent 45 uL역시 Opti-MEM® 배지로 희석하여 실온에서 5분간 방치하였다. 플라스미드와 ExpiFectaminTM293Reagent 혼합물을 잘 섞어준 후 실온에서 20분간 방치하고 준비된 세포에 골고루 넣어 주었다. 형질전환 후 16~18시간 사이에 단백질 발현을 증가시키기 위해, 첨가물 Enhancer 1, 2(Gibco)를 넣고 다시 78시간을 상기 진탕배양 조건에서 배양하였다. 세포배양액을 4℃ 온도 조건에서 2,000 x g에서 10분간 원심 분리하여 상층액과 세포 펠렛을 분리하였다. 분리된 상층액에 단백질분해효소 저해제(Roche)와 80% sucrose를 5%가 되도록 첨가하여 -70℃에 보관하였다. Prepared via bulk purified plasmid pcDNA3.1 (+) / GHC3-P00 -Th DNA to prepare the 22.5 ug prepared and diluted with Opti-MEM (Gibco) and ExpiFectamin TM 45 uL of 293 Reagent was also diluted with Opti-MEM® medium and left at room temperature for 5 minutes. Plasmid and ExpiFectamin TM 293Reagent mixture were mixed well, allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and placed evenly in the prepared cells. To increase protein expression between 16 and 18 hours after the transformation, the additives Enhancer 1, 2 (Gibco) were added and cultured for another 78 hours in the shaking culture conditions. The cell culture was centrifuged at 2,000 xg for 10 minutes at 4 ° C to separate the supernatant and cell pellet. Protease inhibitor (Roche) and 80% sucrose were added to the separated supernatant to 5%, and stored at -70 ° C.

단백질 발현을 확인하기 위해, 상층액에 5 x loading dye(Biosesang)와 혼합하여 95℃에서 20분간 반응시키고 10% SDS PAGE 겔에 점적하여 160 V에서 1시간 동안 전기영동하였다. Gel을 분리하여 정제된 증류수로 세척한 후 단백질 염색시약(PageBlue protein staining Solution, Thermo)에 1시간 동안 반응하여 발색시킨다. 트랜스페린의 경우 약 75 kDa이며 인간 성장호르몬 변이 단백질과 융합한 GHC3-P00-Th의 분자량은 97 kDa으로 단백질이 정상적으로 발현되었음을 확인하였다(도 5a).To confirm protein expression, the supernatant was mixed with 5 × loading dye (Biosesang), reacted at 95 ° C for 20 minutes, and loaded on a 10% SDS PAGE gel and electrophoresed at 160 V for 1 hour. Gel is separated, washed with purified distilled water and reacted with protein staining solution (Thermo) for 1 hour to develop color. The transferrin was about 75 kDa and the molecular weight of GHC3-P00-Th fused with the human growth hormone mutant protein was 97 kDa, indicating that the protein was normally expressed (FIG. 5A).

Western blot 방법으로 단백질 발현을 추가 확인하기 위하여 시료를 10% SDS PAGE 겔에 점적하여 전기영동한 후 Gel을 분리하여 PVDF 재질의 Immobilon-P-Transfer Membrane(Milipore)위에 올리고 단백질이 Membrane으로 이동하게 하였다. 인산완충용세척액(0.05% Tween20을 포함하는 인산완충용액)에 5% Skim milk를 혼합하여 준비한 후 Membrane을 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 인산완충 세척액으로 3회 세척한 후 인간 성장호르몬 항체(Santa Cruz)를 2,000배 인산완충 세척액에 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 다시 인산완충 세척액으로 3회 세척한 후 Horseradish perixidase가 결합된 이차 항체(Santa Crux)를 10,000배로 인산완충 세척액에 희석한 후 상온에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 다시 인산완충 세척액으로 3회 세척 후 기질(SuperSignal®WestPicoChemiluminescentSubstrate, Thermo)를 이용하여 발색시켜 단백질을 확인한다. GH와 GHC3-P00-Th를 인간 성장 호르몬 항체를 통해 확인하였다(도 5b). To further confirm the protein expression by Western blotting, the sample was loaded on a 10% SDS PAGE gel, electrophoresed, and the gel was separated and loaded on a PVDF Immobilon-P-Transfer Membrane (Milipore) . 5% Skim milk was mixed with a phosphate buffer solution (phosphate buffer solution containing 0.05% Tween 20), and Membrane was added thereto, followed by reaction at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the cells were washed three times with phosphate buffered saline, and human growth hormone antibody (Santa Cruz) was diluted in 2,000-fold phosphate buffered saline and reacted at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the cells were washed three times with phosphate-buffered saline, diluted with phosphate buffered saline (10,000 ×), and reacted at room temperature for 1 hour with a secondary antibody (Santa Crux) conjugated with Horseradish perixidase. After completion of the reaction, the protein is washed three times with phosphate-buffered saline and developed using SuperSignal®WestPicoChemiluminescentSubstrate (Thermo). GH and GHC3-P00-Th were confirmed by human growth hormone antibody (Fig. 5B).

<< 실시예Example 3> 단백질 정제  3> protein purification

<3-1> <3-1> GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 단백질 Q- Protein Q- 세파로즈Sepharose 크로마토그래피  Chromatography

GHC3-P00-Th 배양액을 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 용액에 투석(dialysis) 하였다(투석진행시간: 4℃에서 16시간 이상 수행). AKTA prime plus FPLC에 hitrap Q HP, 5mL column을 장착한 후, 유속 3 mL/min으로 20 mM K2HPO4, pH7.5 buffer로 흘려주었다. Column을 평형화 시킨 후, 투석한 배양액을 주입하였다. 이후, NaCl 농도구배(step gradient)를 이용하여 레진에 흡착된 target 단백질을 용출하였다(도 6).
The GHC3-P00-Th culture was dialyzed in 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 solution (dialysis time: at least 16 hours at 4 ° C). AKTA prime plus FPLC was loaded with Hitrap Q HP, 5 mL column, and then flowed into 20 mM K 2 HPO 4 , pH 7.5 buffer at a flow rate of 3 mL / min. The column was equilibrated and the dialyzed culture fluid was injected. Then, a target protein adsorbed to the resin was eluted using a NaCl concentration gradient (Fig. 6).

<3-2> 철(<3-2> Iron FeFe 33 ++ )이 )this 결합된Combined 형태 제조  Form manufacturing

본 발명의 GHC3-P00-Th의 holo 형태 제조는 문헌[Zhang et al. BMC Biotechnology 2012, 12:92]에 기초하였다. 정제된 GHC3-P00-Th 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 대략적인 농도를 확인한 후, 단백질의 2배가 되는 구연산 철 암모늄을 처리하여 4℃에서 16시간 이상 반응시키고 Urea-PAGE를 통해 결합 형태를 확인하였다(도 7).
The holo-form production of the GHC3-P00-Th of the present invention is described in Zhang et al. BMC Biotechnology 2012, 12: 92]. The purified GHC3-P00-Th protein was subjected to SDS-PAGE to determine the approximate concentration, and then treated with iron ammonium citrate, which was twice the amount of protein, and reacted at 4 ° C for 16 hours or more. (Fig. 7).

<3-3> <3-3> GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 단백질  protein sizeyou exclusionexclusion 크로마토그래피  Chromatography

남아 있는 자유 철 이온을 제거하기 위하여 size exclusion 크로마토그래피를 수행하였다. Hi-load 16/60 sepharcryl 120 mL column에 20 mM Tris, 75 mL NaCl, pH 8.0 완충액을 유속 1 ml/min으로 column 평형화를 한 후, 철 결합이 끝난 단백질을 5 mL loading 하여 저장용액 교환 및 남은 자유 철이온을 제거하였다(도 8). 철이온을 제거하는 도중 타겟 피크에 대해 구간별 reverse phase-HPLC(RP-HPLC)로 순도를 확인하였다. Waters alliance HPLC 장비에 ZORBAX 300SB-C18(4.6 X 50 mm)의 RP-HPLC column을 장착하고 0.1% TFA/Water로 평형화하였다. 평형화가 끝난 column에 GHC3-P00-Th 단백질이 용출된 구간을 40 mL 주입하고 0.1% TFA/acetonitrile의 농도를 점차 높여주며 50 분까지 측정한 결과, 각 구간별마다 27분대에 주 피크 외에 28분대에 불순물로 추정되는 피크가 포함되어 있는 구간도 발견되어 28분대 피크가 나오는 구간을 배제하고 단백질을 수득하였다(도 9).
Size exclusion chromatography was performed to remove the remaining free iron ions. The column was equilibrated with 20 mM Tris, 75 mL NaCl, pH 8.0 buffer at a flow rate of 1 ml / min in a 120 mL column of Hi-load 16/60 sepharcryl, and 5 mL of the iron-bound protein was loaded. Free iron ions were removed (Fig. 8). Purity was determined by reverse phase-HPLC (RP-HPLC) for the target peak during iron ion removal. The Waters alliance HPLC instrument was equipped with an RP-HPLC column of ZORBAX 300SB-C18 (4.6 X 50 mm) and equilibrated with 0.1% TFA / Water. The concentration of 0.1% TFA / acetonitrile was gradually increased to 50 minutes, and the concentration of GHC3-P00-Th protein in equilibrated column was 40 mL. (Fig. 9). In addition, a region containing a peak estimated as an impurity was also found, and a region where the 28th peak was excluded was excluded and a protein was obtained (Fig. 9).

<3-4> <3-4> GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 단백질 정량 Protein quantification

정제된 GHC3-P00-Th 단백질은 SDS-PAGE를 이용해 정량하였다. ELISA로 정량한 인간성장호르몬 단백질을 이용하여 표준 정량 곡선용으로 well에 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 μg 을 주입하고, 정제한 시료를 희석하여 5 mL, 10 mL 처리하여 시료의 미지의 양을 표준 정량 곡선과 비교하여 단백질을 정량하였다.
Purified GHC3-P00-Th protein was quantitated by SDS-PAGE. 0.1, 0.2, 0.4, and 0.6 μg were injected into the wells for standard quantification curves using human growth hormone protein quantified by ELISA. The purified samples were diluted and treated with 5 mL and 10 mL, Protein was quantified by comparison with quantitative curve.

<3-5> <3-5> GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 단백질 순도 확인 Check protein purity

정제된 GHC3-P00-Th의 단백질에 대한 reverse phase-HPLC 및 size exclusion 크로마토그래피-HPLC로 불순물 및 순도 측정을 확인하였다. Waters alliance HPLC 장비를 이용하여 측정하였으며, SEC-HPLC column은 ZORBAX GF-250(4.6 X 250 mm)를 사용하였고, RP-HPLC column은 ZORBAX 300SB-C18(4.6 X 50 mm)를 사용하였다. Waters HPLC 장비에 SEC-HPLC column을 장착하고 20 mM tris + 75 mM NaCl, pH 8.0으로 평형화해준 후 GHC3-P00-Th 단백질을 50 mL 주입하여 20 min 동안 측정하였다. 측정한 결과, 4.3분대에서 타겟 피크가 용출되었으며 완충액의 기본 피크를 제거하면, 순도가 99.9%으로 측정되었다. 또한, Waters HPLC 장비에 reverse phase-HPLC column을 장착하고 0.1% TFA/Water로 평형화해준 후 GHC3-P00-Th 단백질을 50 mL 주입하고 0.1% TFA/acetonitrile의 농도를 점차 높여주며 50 분까지 확인한 결과에서는 27분대에서 타겟 피크가 용출되었으며 완충액의 기본 피크를 제거하면, 순도가 96.8%으로 측정되었다(도 10).
Reverse phase-HPLC and size exclusion chromatography-HPLC of purified GHC3-P00-Th proteins confirmed impurity and purity measurements. ZORBAX GF-250 (4.6 X 250 mm) was used for the SEC-HPLC column and ZORBAX 300SB-C18 (4.6 X 50 mm) was used for the RP-HPLC column. Waters HPLC instrument was equipped with SEC-HPLC column, equilibrated with 20 mM tris + 75 mM NaCl, pH 8.0, and 50 mL of GHC3-P00-Th protein was injected for 20 min. As a result of measurement, the target peak eluted at 4.3 minutes, and when the basic peak of the buffer was removed, the purity was measured to be 99.9%. In addition, a reverse phase-HPLC column was mounted on a Waters HPLC instrument and equilibrated with 0.1% TFA / Water. Then, 50 mL of GHC3-P00-Th protein was injected and the concentration of 0.1% TFA / acetonitrile was gradually increased. , The target peak eluted at 27 minutes and when the basic peak of the buffer was removed, the purity was measured to be 96.8% (FIG. 10).

<< 실시예Example 4> 단백질 내  4> Protein FreeFree 시스테인  Cysteine 잔기Residue 유무 확인  Check whether

GHC3-P00-Th 단백질의 경우 천연형 GH의 아미노산 서열상 85번째 세린과 144번째 세린을 시스테인으로 치환하여 서로 이황화 결합을 이루도록 유도하였다. 천연형 GH의 경우 53번째 아미노산과 165번, 182번과 189번 시스테인이 결합을 이루어 총 2개의 이황화 결합이 존재하며 결합하지 않은 시스테인(free 시스테인)은 존재하지 않는다. 그러므로 85번, 144번 아미노산을 시스테인으로 치환한 GHC3-P00-Th 단백질의 Free 시스테인 유무를 확인하여 간접적으로 85번과 144번 시스테인의 이황화 결합을 확인하였다. In the case of GHC3-P00-Th protein, the 85th serine and 144th serine in the amino acid sequence of native GH were substituted with cysteine and induced to form disulfide bonds with each other. In the case of wild type GH, the 53rd amino acid is combined with 165, 182 and 189 cysteines, resulting in a total of two disulfide bonds and no free cysteine (free cysteine). Therefore, the presence of free cysteine of the GHC3-P00-Th protein substituted with cysteine at positions 85 and 144 was confirmed to indirectly confirm the disulfide bond of cysteines 85 and 144.

시중에 판매되고 있는 Free 시스테인 또는 Free Thiol기의 유무를 확인할 수 있는 제품(Cayman Chemical)을 구매하여 확인하였다. GHC3-P00-Th, BSA 500 nM을 Thiol Fluorometric detector와 반응시킨 후 형광을 측정하였다. BSA의 경우 66 kDa 크기의 단백질로 하나의 Free 시스테인 잔기를 보유하고 있다. 형광측정은 385 nm에서 광원을 주고 515 nm에서 나오는 형광의 세기를 측정하였다. A commercially available product (Cayman Chemical) was purchased and confirmed for free cysteine or free thiol. GHC3-P00-Th, and BSA 500 nM were reacted with a thiol fluorometric detector and fluorescence was measured. BSA is a 66 kDa protein with a single free cysteine residue. Fluorescence measurements were performed at 385 nm and the fluorescence intensity at 515 nm was measured.

각각의 단백질이 형광 Detector와 반응한 결과를 도 11에 나타내었다. Free 시스테인 잔기가 하나 존재하는 BSA와 비교하였을 때 낮은 형광 세기를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. GHC3-P00-Th 단백질 내의 Free 시스테인이 거의 없다는 것을 의미한다.
The results of reaction of each protein with a fluorescent detector are shown in Fig. Free cysteine residues were found to be lower than those of BSA containing one free cysteine residue. It means that there is little free cysteine in the GHC3-P00-Th protein.

<< 실시예Example 5> 인간 성장호르몬 변이 단백질의 생물학적 활성 측정 5> Measurement of biological activity of human growth hormone mutant protein

정제된 인간 성장호르몬 변이 단백질의 세포 내 활성을 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to compare the intracellular activity of the purified human growth hormone mutant protein, the following experiment was conducted.

구체적으로, 인간 성장호르몬 의존성 유사 분열을 하는 세포인 랫트 결절 림포종(rat node lymphoma) 세포주인 Nb2-11 세포(European Collection of Cell Cultures (ECACC) #97041101)를 이용하여 세포 내 활성을 비교 분석하였다. Specifically, intracellular activity was comparatively analyzed using Nb2-11 cells (European Collection of Cell Cultures (ECACC) # 97041101), which is a rat node lymphoma cell line that is a human growth hormone-dependent mitotic dividing cell .

Nb2-11 세포는 피셔 배양액(Fischer's medium)에 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 0.075% NaCO3, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 2 mM 글루타민 및 10% 말 혈청(HS, lactogen-deficient horse serum)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였으며, 2일-3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다. 세포는 부착 의존성이지 않다. Nb2-11 cells were cultured in Fischer's medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 0.075% NaCO 3 , 50 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamine and 10% -deficient horse serum) at 37 ° C under 5% carbon dioxide, and replaced with fresh medium at 2-day-3-day intervals. Cells are not adhesion-dependent.

분석을 위해서 Nb2-11 세포는 10% FBS에서 1% FBS 배양액을 사용하여 약 2.5 x 105 세포/ml 이 되도록 조정한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후Nb2-11 세포주를 원심분리하여 수확하고 10% FBS를 제외한 동일한 배지로 세척한 다음, 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 μl 씩 넣어 웰 당 약 2 x104 세포가 되도록 분주하였다. 대조군으로 사용되는 인간 성장호르몬(hGH, GenScript), 시험물질인 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 각각 희석하여 Nb2-11 세포가 들어있는 각 웰에 농도별로 첨가한 후 72시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 시험물질의 세포 증식 활성도는 인간 성장호르몬(hGH) 동량으로 농도를 나타내었다. 시험물질 투여에 의한 세포의 증식 정도를 알아보기 위해 세포배양액에 10 ㎕의 alamarBlue (ThermoFisher SCIENTIFIC)시약을 첨가한 후 플레이트를 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 증가한 세포주의 숫자를 측정하고 분석하였다. alamarBlue 분석법으로 얻어진 흡광도 값으로 50%의 세포가 살아남도록 한 시료의 농도를 EC50(50% effective concentration)로 결정하였다.
For analysis, Nb2-11 cells were adjusted to about 2.5 x 10 5 cells / ml using 1% FBS culture in 10% FBS, and then cultured for 24 hours. After 24 hours of incubation, the Nb2-11 cell line was harvested by centrifugation, washed with the same medium except for 10% FBS, and 100 μl was added to each well of the 96-well plate to give about 2 x 10 4 cells per well. Human growth hormone (hGH, GenScript) used as a control and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) as a test substance were respectively diluted and added to each well containing Nb2-11 cells by concentration. After 72 hours And cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. The cell proliferation activity of the test substance was the same as that of human growth hormone (hGH). 10 μl of alamarBlue (ThermoFisher SCIENTIFIC) reagent was added to the cell culture and the plate was incubated in the incubator for 4 hours. Plates were gently shaken to evenly react cells in each well, and the absorbance at 570 nm was measured to determine the number of increased cell lines and analyzed. The concentration of the sample that allowed 50% of the cells to survive with the absorbance value obtained by the alamarBlue assay was determined as EC 50 (50% effective concentration).

본 발명의 인간 성장호르몬(hGH)과 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 세포 내 활성 분석결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, GHC3-P00-Th는 hGH 에 비하여 낮은 세포 증식 활성도를 보였다. 상기 결과를 바탕으로 EC50의 값을 산출하였다. 각각 계산된 EC50 값의 경우 hGH 0.07 ng/ml, GHC3-P00-Th 0.47 ng/ml 임을 확인하였다. GHC3-P00-Th의 경우 분자량이 증가하여도 hGH-도메인의 생물학적 효능은 보존되는 것으로 확인되었다.
The results of the intracellular activity analysis of human growth hormone (hGH) and human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) of the present invention are shown in Fig. As shown in FIG. 12, GHC3-P00-Th showed lower cell proliferation activity than hGH. Based on the above results, the value of EC 50 was calculated. For each calculated EC 50 value, it was confirmed that hGH was 0.07 ng / ml and GHC3-P00-Th was 0.47 ng / ml. In the case of GHC3-P00-Th, it was confirmed that the biological efficacy of the hGH-domain was preserved even with increasing molecular weight.

<< 실시예Example 6> 혈액 내 단백질 분해효소들에 대한 분해 저항성 측정 6> Measurement of degradation resistance to proteolytic enzymes in blood

본 발명의 GHC3-P00-Th 단백질의 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성 정도를 측정하기 위하여, 단백질을 인간 혈청(Serum)과 반응 후, 정해진 시간에 혈청 내 잔존하는 GH의 양을 측정하였다. In order to measure the degree of degradation resistance of the GHC3-P00-Th protein of the present invention to the proteolytic enzyme in blood, the amount of GH remaining in the serum was measured at a predetermined time after the protein was reacted with human serum (Serum).

구체적으로, 인간 혈청(SIGMA)을 56℃에서 약 30분간 불활성화시킨 후 2.8 μg/ml의 단백질 시료를 혈청과 24 :1 (v/v) 비율로 37℃ 조건에서 반응시켰다. 반응 시간은 0, 3, 6, 9, 12, 15 시간이며, 각 시간대마다 시료에 각각 Complete protease inhibitor cocktail(Roche)을 처리한 후 -70℃에 보관하여 반응을 종료시켰다. 잔존 단백질의 양을 확인하기 위하여 GH ELISA(RnDSystems)를 수행하였다. 수행 방법은 제조사의 매뉴얼을 참조하여 진행하였다. Specifically, human serum (SIGMA) was inactivated at 56 ° C for about 30 minutes, and a 2.8 μg / ml protein sample was reacted with serum at a ratio of 24: 1 (v / v) at 37 ° C. The reaction time was 0, 3, 6, 9, 12, and 15 hours. The samples were treated with complete protease inhibitor cocktail (Roche) at each time point and stored at -70 ° C to terminate the reaction. GH ELISA (RnDSystems) was performed to determine the amount of residual protein. The procedure was performed with reference to the manufacturer's manual.

흡광도에 따른 농도 환산은 표준액에 대한 단백질 농도-흡광도의 검량선에 기준하여 계산하였다. 표준곡선은 엑셀 프로그램을 이용하여 작성하였다. 각 GH, GHC3-P00-Th 단백질 표준액에 해당하는 흡광도의 평균값과 완충액만을 처리한 웰의 흡광도의 차이 값을 이용하였다. 잔존 GH 단백질 양(% GH)은 반응시간이 0 시간 일 때의 GH의 단백질 농도(pm/ml)를 100%로 기준으로 하여 표기하였다. The concentration conversion according to the absorbance was calculated based on the calibration curve of the protein concentration-absorbance for the standard solution. The standard curve was created using an Excel program. The average value of the absorbance corresponding to each GH and GHC3-P00-Th protein standard solution and the difference value of the absorbance of the well treated only with the buffer were used. The amount of residual GH protein (% GH) was expressed based on 100% of the protein concentration (pm / ml) of GH when the reaction time was 0 hour.

GH, GHC3-P00-Th 단백질의 시간대별 잔존 GH양(%)을 도 13에 나타내었다. 천연형 GH의 경우 혈청과 반응시간이 증가함에 따라 잔존 양이 감소하며 15시간에서 30%인 것을 확인할 수 있으나, GHC3-P00-Th 단백질의 경우 15시간까지 단백질의 양에 큰 변화 없는 것을 확인할 수 있다. 시스테인 85와 144간의 이황화 결합 형성이 단백질의 단백질분해효소에 대한 저항성 증대에 도움을 주는 것을 확인하였다.
GH, and GHC3-P00-Th proteins of the present invention are shown in FIG. In the case of natural type GH, the amount of residual GHC3-P00-Th protein was found to be 30% at 15 hours, as the reaction time with serum increased. have. It was confirmed that disulfide bond formation between cysteine 85 and 144 helps increase the resistance of protein to protease.

<< 실시예Example 7>  7> hGHhGH 변이 단백질의 생체 내 반감기 측정 In vivo half-life measurement of mutant proteins

본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 단백질의 생체 반감기를 결정하기 위하여 생쥐에서 단백질을 투여 후 혈청 내에 존재하는 Growth Hormone의 양을 측정하였다. 상기 기술된 "생체 내 반감기"는 "혈장 내 단백질의 반감기" 즉, Growth Hormone 단백질이 혈장 내에서 순환하면서 초기 농도에서 약 50% 남아있는 시간대를 수치화하여 나타낸다. 약물동역학적 계산은 R 프로그램을 사용하여 수행하였다.
When the GHC3-P00-Th fusion protein of the present invention was administered to a living body, the amount of Growth Hormone present in the serum was measured after administration of the protein in mice to determine the biological half-life of the protein. The above-described "in vivo half-life time" is expressed as a "half-life of protein in plasma &quot;, i.e., a time period during which growth hormone protein circulates in plasma and remains at about 50% at initial concentration. The pharmacokinetic calculation was performed using the R program.

<7-1> <7-1> GrowthGrowth HormoneHormone 변이 단백질의 동물 투여 시험 Animal administration test of mutant protein

본 발명의 GHC3-P00-Th 융합 단백질이 체내에 남아있는 기간을 측정하기 위해 동물실험을 실시하였다. 실험동물의 구입, 사육, 투여 및 혈액 채취 등의 전 과정을 한국의과학연구소에 의뢰하여 수행하였다. Animal experiments were conducted to determine the duration of the GHC3-P00-Th fusion protein of the present invention in the body. The entire process of purchasing, breeding, administering and collecting blood samples was conducted by the Korean Institute of Science and Technology.

실험동물은 6 주령의 Sprague-Dawley, 특정병원체 부재동물 (SPF) 수컷 생쥐 (mouse)를 오리엔트바이오로터 구입하여 사용하였다. 최소 7일 간의 순응기간을 거쳐 검역 및 순화기간 종료일에 개체 별 체중을 측정하였으며, 이때의 체중을 기초로 하여 체중증가 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동물을 선발하여 각 군의 평균 체중이 가능한 한 균등하도록 (동물 당 200g ± 20 %이내) 무작위로 배치하여 각 시험군당 8마리씩 구성하였다. Male Sprague-Dawley (SPF) male mice (6 weeks old) were purchased from Orient BioRotor. After a minimum of 7 days of acclimation, individuals were weighed at the end of the quarantine and refinement period, and healthy animals were selected for weight gain and general symptoms based on the weight at that time. (Within 200g ± 20% per animal) were randomly assigned to each test group.

시험물질 투여 당일에 투여 직전 측정한 체중에 근거하여 개체 별 투여액량을 환산(5 mL/kg)한 후, 체중(kg) 당 50 ㎍ Growth Hormone 변이체 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 1회용 주사기(1 mL, 26 G needle)를 이용하여 피하 투여하였다. 투여일을 시험 1 일차(Day 1)로 정의하였다.On the day of administration of the test substance, 50 μg of growth hormone mutant or its transferrin fusion protein per kg of body weight (1 mL / kg) was weighed (5 mL / kg) , 26 G needle). The day of administration was defined as day 1 of the test.

채혈은 경정맥을 이용하여 각 point 별(0, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h)로 채혈하며, 시험물질 투여 후 각 군당 4 수, 0.5 mL씩 교차 채혈하였다. 채혈 후 헤파린 튜브에 담아 3.000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후, 상층액인 혈장만을 분리하여 분주하였다. 검체는 -70 ℃ 이하로 설정되어 있는 Deep freezer에 보관하였다.
Blood samples were collected at each point (0, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h) using the jugular vein. mL. The blood was collected and centrifuged at 3.000 rpm for 10 minutes in a heparin tube. The samples were stored in a deep freezer set at -70 ° C or lower.

<7-2> <7-2> GrowthGrowth HormoneHormone 변이 단백질의 생체 내 혈장 반감기의 측정 Measurement of in vivo plasma half-life of mutant proteins

혈장 내 활성 Growth Hormone의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 ELISA를 통해 수치화하였다. ELISA를 통한 혈장 내 Growth Hormone의 정량은 R&D Human Growth Hormone ELISA Kit(R&D, Cat. DGH00)을 구입하여 수행하였으며, 실험방법은 해당 시약의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 표준액에 대한 단백질 농도에 따른 흡광도의 검량선을 작성하여 회귀분석을 통해 검액 중의 Growth Hormone 변이 단백질들의 함량을 결정하였다.The amount of active growth hormone in the plasma was quantified by ELISA after thawing the sample from ice. The quantification of plasma growth hormone by ELISA was performed by purchasing the R & D Human Growth Hormone ELISA Kit (R & D, Cat. DGH00) and the procedure was carried out according to the manual of the reagent. Calibration curve of absorbance according to protein concentration in standard solution was prepared and regression analysis was performed to determine the content of proteins of Growth Hormone mutation in the test solution.

각 시험 화합물의 평균 농도-시간 프로파일로부터 비구획 약동학 분석을 R 프로그램에 non-compartment analysis input을 적용하여 수행하였다. 약동학 파라미터는 말단 반감기(t1 /2)를 평가하였다.Non-compartment pharmacokinetic analysis from the mean concentration-time profile of each test compound was performed by applying a non-compartment analysis input to the R program. Pharmacokinetic parameters were evaluated for terminal half-life (t 1/2).

Growth Hormone의 변이 단백질의 혈장 내 단백질의 반감기를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서 보는 바와 같이 GHC3-P00-Th 융합 단백질은 천연형 인간 Growth Hormone보다 높은 혈중 반감기를 보였다. 이는 Growth Hormone보다 상대적으로 큰 단백질 반경을 갖고 있기 때문에, 신장에서의 여과 속도가 느림을 보여 주는 결과이다. 또한 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성이 증대된 Growth Hormone 변이 단백질을 트랜스페린에 융합시킴으로서, 신장 여과 속도의 감소와 혈중 안정성이 모두 개선됨으로서 생체에서의 혈중 반감기가 극대화되어 나타난 결과이다(도 14). The half-life of proteins in plasma of mutant proteins of Growth Hormone is shown in Table 1 below. As shown in Table 1, the GHC3-P00-Th fusion protein showed a higher blood half-life than the native human growth hormone. This is a result of slower filtration rate in the kidney, as it has a relatively larger protein radius than Growth Hormone. In addition, fusion of Growth Hormone mutant protein with increased resistance to blood proteolytic enzymes to transferrin resulted in a decrease in renal filtration rate and improvement in blood stability, thus maximizing blood half-life in the living body (FIG. 14).

혈장 내 단백질 반감기Protein half-life in plasma 파라미터(H)The parameter (H) Growth HormoneGrowth Hormone GHC3-P00-ThGHC3-P00-Th t1 /2 t 1/2 1.621.62 12.1612.16

<< 실시예Example 8> 본 발명에 따른  8 > GHC3GHC3 -- P00P00 -- ThTh 에 대한 생체 내 활성 실험In vivo activity test

실험동물로 뇌하수체가 제거된 5주령의 수컷 랫트(hypophysectomized Sprague Dawley rat, SLC사, 일본)를 사용하였으며, 실험군을 4개 군으로 나누어 각 군당 다 5마리씩 이용하여 몸무게 증가 시험을 수행하였다. 군 분리는 15일간의 순화기간 동안 건강하다고 판정된 동물들의 체중을 측정하고 순위화한 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하였다. 각 군의 뇌하수체가 제거된 수컷 랫트에 인간 성장호르몬(hGH)를 랫트당 30 ㎍, 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)를 랫트당 30 ㎍, 용매 대조군(vehicle)을 1회/일, 10일간 반복 투여하였으며, 인간 성장호르몬 변이 단백질 (GHC3-P00-Th)을 랫트당 200 ㎍으로 투여하는 경우는 단회 투여하였다. 아래의 표 2와 같은 투여 용량 및 방법으로 피하 주사하였고, 주사 후 랫트의 체중은 매일 측정하였다. Five-week-old male rats (hypophysectomized Sprague Dawley rats, SLC, Japan) in which the pituitary gland was removed were used as experimental animals. The experimental group was divided into four groups and each group was subjected to weight gain test using 5 mice per group. Mice were separated by a randomized method so that the weight of the animals determined to be healthy during the 15 day purification period was measured and weighted according to the weighted average weight distribution of each group as uniform as possible. Human gonadotropin (hGH), 30 ㎍ per rat, human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th), 30 ㎍ per rat, and vehicle control were administered once / day in male rats from which pituitary- (GHC3-P00-Th) was administered at a dose of 200 μg per rat. The dose and method as shown in Table 2 below were subcutaneously injected and the body weight of the rats after injection was measured daily.

본 발명의 GHC3-P00-Th의 뇌하수체가 제거된 랫트의 무게 증가 분석 결과는 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 용매 대조군을 투여한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 체중 증가가 거의 일어나지 않았으나, 인간 성장호르몬(hGH)와 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 하루에 1회씩 10일간 투여하였을 경우에는 투여 후 10일 차까지 지속적으로 체중이 증가하였고, 10일 차에서는 인간 성장호르몬(hGH)보다 인간 성장호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)의 체중 증가율이 3.53% 정도 더 높은 것으로 나타났다. 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단회 투여하였을 경우에는 투여 후 3일까지는 지속적으로 체중이 증가하였으며, 7일 차까지는 인간 성장호르몬(hGH)을 투여한 군보다 우수한 활성을 유지하였다. 인간 성장호르몬(GHC3-P00-Th)을 단회 투여할 경우에는 효력이 월등하게 높았으며, 하루에 1회 투여하였을 경우에도 인간 성장호르몬(hGH)과 동등 이상의 효력을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 체중 증강 속도에 있어서 인간 성장호르몬(hGH)을 매일 주사 받은 랫트에 비해 인간 성장 호르몬 변이 단백질(GHC3-P00-Th)을 단 회 투여받은 랫트에서 초기 3일에 걸쳐 확연히 더욱 빠른 속도록 체중이 증가되었다(도 15). The results of the weight gain analysis of the rat pituitary gland of GHC3-P00-Th of the present invention are shown in FIG. As shown in FIG. 15, in the case of a rat in which a pituitary gland was removed from which a solvent control was administered, weight gain hardly occurred, but human growth hormone (hGH) and human growth hormone mutation protein (GHC3-P00-Th) (GHC3-P00-Th) increased by 3.53% more than human growth hormone (hGH) at 10 days after the administration for 10 days. Respectively. When the human growth hormone mutant protein (GHC3-P00-Th) was administered once, body weight was continuously increased until the third day after administration, and up to day 7, the activity was superior to that of human growth hormone (hGH) . When human growth hormone (GHC3-P00-Th) was administered in a single dose, the efficacy was remarkably high, and even when administered once a day, it was found to have an efficacy equal to or higher than that of human growth hormone (hGH). In addition, in rats that received a single dose of human growth hormone mutation protein (GHC3-P00-Th) in comparison with rats injected daily with human growth hormone (hGH) at a weight gain rate, (Fig. 15).

또한, 도 17에 나타낸 바와 같이 유리된 철 이온을 제거한 GHC3-P00-Th의 경우에도 단 회 투여한 경우 초기 3일에 걸쳐 빠른 속도로 체중이 증가하는 것을 확인하였다(도 17). In addition, as shown in Fig. 17, in the case of GHC3-P00-Th in which free iron ions were removed, it was also confirmed that the body weight was rapidly increased over the first 3 days in case of single administration (Fig. 17).

따라서, 본 발명의 GHC3-P00-Th 은 hGH 와 비교하여 우수한 지속적인 활성을 가지며, 매일 주사를 맞아야 하는 인간 성장호르몬의 한계를 해결할 수 있을 것으로 기대된다. Therefore, the GHC3-P00-Th of the present invention is expected to be able to solve the limitation of human growth hormone which has an excellent continuous activity as compared with hGH and has to be injected every day.

번호 number 시험물질Test substance NN 경로Route 투여량 (ug/head)Dose (ug / head) 투여액량 (mL/head)Amount of solution (mL / head) 투여방법Method of administration 1One VehicleVehicle 55 s.c.s.c. 1회/일, 10일간 반복투여1 time / day, repeated administration for 10 days 22 hGH(GenScript)hGH (GenScript) 55 s.c.s.c. 3030 77 1회/일, 10일간 반복투여1 time / day, repeated administration for 10 days 33 GHC3-P00-ThGHC3-P00-Th 55 s.c.s.c. 3030 77 1회/일, 10일간 반복투여1 time / day, repeated administration for 10 days 44 GHC3-P00-ThGHC3-P00-Th 55 s.c.s.c. 200200 77 1회 투여Single administration

<< 실시예Example 9>  9> IGFIGF -1 단백질의 생체 내 혈장 농도 측정-1 protein in vivo

본 발명의 Growth Hormone의 트랜스페린 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 혈청 내에 존재하는 IGF-1 단백질의 양을 측정하였다. 실험동물의 구입, 사육, 투여 및 혈액 채취, IGF-1 농도 분석 등의 전 과정을 한국의과학연구소에 의뢰하여 수행하였다. When the transferrin fusion protein of Growth hormone of the present invention was administered to a living body, the amount of IGF-1 protein present in the serum was measured. The entire process of purchasing, breeding, administering and collecting blood samples, analyzing IGF-1 concentration, etc., was performed by Korean scientific research institute.

시험물질 투여 전 및 투여 개시 후 10 일 동안 1 회/일 경정맥에서 주사기를 이용하여 채혈을 실시하였다. 혈액은 Clot activator가 들어 있는 vacutainer tube에 주입하고 약 15 분간 실온에 방치하여 응고시킨 후 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 ELISA kit를 사용하여 IGF-1을 정량하였다. Blood samples were taken from the jugular vein using a syringe once per day before and 10 days after dosing. Blood was injected into a vacutainer tube containing a clot activator, allowed to stand at room temperature for about 15 minutes, and then coagulated. The serum was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and IGF-1 was quantified using an ELISA kit.

ELISA 분석 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 시험물질 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)와 hGH 30 ug/rat(Daily)은 vehicle보다 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.01). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 vehicle에 비하여 5일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001 또는 p<0.05). 또한 GHC3-P00-Th 30 ug/rat(Daily)은 10일 차까지 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 유의하게 높았다(p<0.001). GHC3-P00-Th 200 ug/rat(Single)은 hGH 30 ug/rat(Daily)에 비하여 3일 차까지 유의하게 높았다(p<0.001)(도 16).As shown in FIG. 16, the test substance GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) and hGH 30 ug / rat (Daily) were significantly higher than vehicle (p <0.001 or p <0.01). GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher up to day 5 than vehicle (p <0.001 or p <0.05). In addition, the GHC3-P00-Th 30 ug / rat (Daily) was significantly higher than the hGH 30 ug / rat (Daily) until the 10th day (p <0.001). GHC3-P00-Th 200 ug / rat (Single) was significantly higher up to day 3 than hGH 30 ug / rat (Daily) (p <0.001) (Fig.

<110> EQUIS&ZAROO <120> Pharmaceutical compositions comprising mutant proteins of human growth hormone or transferrin fusion proteins thereof <130> 2015P-10-034 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human growth hormone <400> 1 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 2 <211> 679 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transferrin protein <400> 2 Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala 1 5 10 15 Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser 20 25 30 Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys 35 40 45 Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala 50 55 60 Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val 65 70 75 80 Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr 85 90 95 Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu 100 105 110 Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp 115 120 125 Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys 130 135 140 Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly 165 170 175 Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe 180 185 190 Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser 195 200 205 Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu 210 215 220 Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met 245 250 255 Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu 260 265 270 His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro 275 280 285 His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys 290 295 300 Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val 305 310 315 320 Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr 325 330 335 Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg 340 345 350 Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys 355 360 365 Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly 370 375 380 Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly 385 390 395 400 Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp 405 410 415 Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val 420 425 430 Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys 435 440 445 Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met 450 455 460 Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe 465 470 475 480 Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys 485 490 495 Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu 500 505 510 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly 515 520 525 Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly 530 535 540 Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn 565 570 575 Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp 580 585 590 Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe 595 600 605 Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser 610 615 620 Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys 625 630 635 640 Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val 645 650 655 Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu 660 665 670 Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro 675 <210> 3 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GH variation protein <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Cys Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Cys 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 4 <211> 872 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-Th <400> 4 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Cys Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Cys 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly 180 185 190 Ser Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu 195 200 205 Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro 210 215 220 Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp 225 230 235 240 Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 245 250 255 Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro 260 265 270 Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr 275 280 285 Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln 290 295 300 Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly 305 310 315 320 Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg 325 330 335 Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala 340 345 350 Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro 355 360 365 Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala 370 375 380 Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His 385 390 395 400 Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr 405 410 415 Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys 420 425 430 Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser 435 440 445 Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln 450 455 460 Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser 465 470 475 480 Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu 485 490 495 Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr 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cttacctgag 1080 ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt 1140 gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc 1200 cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat 1260 gtggcctttg tcaagcactc gactatattt gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac 1320 cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc cggaagccgg tagatgaata caaggactgc 1380 cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac 1440 ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa 1500 ttccaactat tcagctctcc tcatgggaag gacctgctgt ttaaggactc tgcccacggg 1560 tttttaaaag tcccccccag gatggatgcc aagatgtacc tgggctatga gtatgtcact 1620 gccatccgga atctacggga aggcacatgc ccagaagccc caacagatga atgcaagcct 1680 gtgaagtggt gtgcgctgag ccaccacgag aggctcaagt gtgatgagtg gagtgttaac 1740 agtgtaggga aaatagagtg tgtatcagca gagaccaccg aagactgcat cgccaagatc 1800 atgaatggag aagctgatgc catgagcttg gatggagggt ttgtctacat agcgggcaag 1860 tgtggtctgg tgcctgtctt ggcagaaaac tacaataaga gcgataattg tgaggataca 1920 ccagaggcag ggtattttgc tgtagcagtg gtgaagaaat cagcttctga cctcacctgg 1980 gacaatctga aaggcaagaa gtcctgccat acggcagttg gcagaaccgc tggctggaac 2040 atccccatgg gcctgctcta caataagatc aaccactgca gatttgatga atttttcagt 2100 gaaggttgtg cccctgggtc taagaaagac tccagtctct gtaagctgtg tatgggctca 2160 ggcctaaacc tgtgtgaacc caacaacaaa gagggatact acggctacac aggcgctttc 2220 aggtgtctgg ttgagaaggg agatgtggcc tttgtgaaac accagactgt cccacagaac 2280 actgggggaa aaaaccctga tccatgggct aagaatctga atgaaaaaga ctatgagttg 2340 ctgtgccttg atggtaccag gaaacctgtg gaggagtatg cgaactgcca cctggccaga 2400 gccccgaatc acgctgtggt cacacggaaa gataaggaag cttgcgtcca caagatatta 2460 cgtcaacagc agcacctatt tggaagcaac gtaactgact gctcgggcaa cttttgtttg 2520 ttccggtcgg aaaccaagga ccttctgttc agagatgaca cagtatgttt ggccaaactt 2580 catgacagaa acacatatga aaaatactta ggagaagaat atgtcaaggc tgttggtaac 2640 ctgagaaaat gctccacctc atcactcctg gaagcctgca ctttccgtag accttaa 2697 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf-F primer <400> 10 catgctagct ccaccatgag gctcgccgtg ggagcc 36 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf-R primer <400> 11 agactcgagt taaggtctac ggaaagtgca g 31 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf(B)-F primer <400> 12 ctatgggtca aaagaggacc cacagacttt ctatt 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf(B)-R primer <400> 13 aatagaaagt ctgtgggtcc tcttttgacc catag 35 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tranferrin signal peptide <400> 14 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preTf(B) primer <400> 15 ctcggatccg tccctgataa aactgtgaga tg 32 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-Th F primer <400> 16 atagctagct ccaccatggc tacaggctcc cggac 35 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-Th R primer <400> 17 tatggatccg aagccacagc tgccctcca 29 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH signal peptide <400> 18 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala 20 25 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHW-P00-T F primer <400> 19 gctgctcatc cagtgttggc tggagcccg 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHW-P00-T R primer <400> 20 cgggctccag ccaacactgg atgagcagc 29 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-T F primer <400> 21 tcaagcagac ctactgcaag ttcgacacac cc 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-T R primer <400> 22 gtttgtgtcg aacttgcagt aggtctgctt ga 32 <110> EQUIS & ZAROO <120> Pharmaceutical compositions comprising mutant proteins of human          growth hormone or transferrin fusion proteins thereof <130> 2015P-10-034 <160> 22 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human growth hormone <400> 1 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg   1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu              20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro          35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg      50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu  65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val                  85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp             100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu         115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser     130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe                 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe             180 185 190 <210> 2 <211> 679 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transferrin protein <400> 2 Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala   1 5 10 15 Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser              20 25 30 Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys          35 40 45 Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala      50 55 60 Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val  65 70 75 80 Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr                  85 90 95 Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu             100 105 110 Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp         115 120 125 Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys     130 135 140 Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro 145 150 155 160 Cys 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            340 345 350 Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys         355 360 365 Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly     370 375 380 Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly 385 390 395 400 Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp                 405 410 415 Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val             420 425 430 Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys         435 440 445 Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met     450 455 460 Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe 465 470 475 480 Ser Glu Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys                 485 490 495 Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu             500 505 510 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly         515 520 525 Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Gln Asn 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             20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro          35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg      50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu  65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Cys Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val                  85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp             100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu         115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Cys     130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe                 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe             180 185 190 <210> 4 <211> 872 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-Th <400> 4 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg   1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu              20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro          35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg      50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu  65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Cys Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val                  85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp             100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu         115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Cys     130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe                 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly             180 185 190 Ser Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu 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Ala Phe Val Lys His 385 390 395 400 Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr                 405 410 415 Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys             420 425 430 Asp Cys His Leu Ala Gln Val Ser Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser         435 440 445 Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln     450 455 460 Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser 465 470 475 480 Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu                 485 490 495 Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr             500 505 510 Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro         515 520 525 Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu     530 535 540 Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu 545 550 555 560 Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn                 565 570 575 Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala             580 585 590 Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser         595 600 605 Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val     610 615 620 Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys 625 630 635 640 Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro                 645 650 655 Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe             660 665 670 Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys         675 680 685 Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys     690 695 700 Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys 705 710 715 720 Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Gln Asn Thr Gly                 725 730 735 Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr             740 745 750 Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala         755 760 765 Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys     770 775 780 Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu 785 790 795 800 Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg                 805 810 815 Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala             820 825 830 Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr         835 840 845 Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu     850 855 860 Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro 865 870 <210> 5 <211> 2097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preTf <400> 5 atgaggctcg ccgtgggagc cctgctggtc tgcgccgtcc tggggctgtg tctggctgtc 60 cctgataaaa ctgtgagatg gtgtgcagtg tcggagcatg aggccactaa gtgccagagt 120 ttccgcgacc atatgaaaag cgtcattcca tccgatggtc ccagtgttgc ttgtgtgaag 180 aaagcctcct accttgattg catcagggcc attgcggcaa acgaagcgga tgctgtgaca 240 ctggatgcag gtttggtgta tgatgcttac ctggctccca ataacctgaa gcctgtggtg 300 gcagagttct atgggtcaaa agaggatcca cagactttct attatgctgt tgctgtggtg 360 aagaaggata gtggcttcca gatgaaccag cttcgaggca agaagtcctg ccacacgggt 420 ctaggcaggt ccgctgggtg gaacatcccc ataggcttac tttactgtga cttacctgag 480 ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt 540 gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc 600 cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat 660 gtggcctttg tcaagcactc gactatattt gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac 720 cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc cggaagccgg tagatgaata caaggactgc 780 cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac 840 ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa 900 ttccaactat tcagctctcc tcatgggaag gacctgctgt ttaaggactc tgcccacggg 960 tttttaaaag tcccccccag gatggatgcc aagatgtacc tgggctatga gtatgtcact 1020 gccatccgga atctacggga aggcacatgc ccagaagccc caacagatga atgcaagcct 1080 gtgaagtggt gtgcgctgag ccaccacgag aggctcaagt gtgatgagtg gagtgttaac 1140 agtgtaggga aaatagagtg tgtatcagca gagaccaccg aagactgcat cgccaagatc 1200 atgaatggag aagctgatgc catgagcttg gatggagggt ttgtctacat agcgggcaag 1260 tgtggtctgg tgcctgtctt ggcagaaaac tacaataaga gcgataattg tgaggataca 1320 ccagaggcag ggtattttgc tgtagcagtg gtgaagaaat cagcttctga cctcacctgg 1380 gacaatctga aaggcaagaa gtcctgccat acggcagttg gcagaaccgc tggctggaac 1440 atccccatgg gcctgctcta caataagatc aaccactgca gatttgatga atttttcagt 1500 gaaggttgtg cccctgggtc taagaaagac tccagtctct gtaagctgtg tatgggctca 1560 ggcctaaacc tgtgtgaacc caacaacaaa gagggatact acggctacac aggcgctttc 1620 aggtgtctgg ttgagaaggg agatgtggcc tttgtgaaac accagactgt cccacagaac 1680 actgggggaa aaaaccctga tccatgggct aagaatctga atgaaaaaga ctatgagttg 1740 ctgtgccttg atggtaccag gaaacctgtg gaggagtatg cgaactgcca cctggccaga 1800 gccccgaatc acgctgtggt cacacggaaa gataaggaag cttgcgtcca caagatatta 1860 cgtcaacagc agcacctatt tggaagcaac gtaactgact gctcgggcaa cttttgtttg 1920 ttccggtcgg aaaccaagga ccttctgttc agagatgaca cagtatgttt ggccaaactt 1980 catgacagaa acacatatga aaaatactta ggagaagaat atgtcaaggc tgttggtaac 2040 ctgagaaaat gctccacctc atcactcctg gaagcctgca ctttccgtag accttaa 2097 <210> 6 <211> 2097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > preTf (B) <400> 6 atgaggctcg ccgtgggagc cctgctggtc tgcgccgtcc tggggctgtg tctggctgtc 60 cctgataaaa ctgtgagatg gtgtgcagtg tcggagcatg aggccactaa gtgccagagt 120 ttccgcgacc atatgaaaag cgtcattcca tccgatggtc ccagtgttgc ttgtgtgaag 180 aaagcctcct accttgattg catcagggcc attgcggcaa acgaagcgga tgctgtgaca 240 ctggatgcag gtttggtgta tgatgcttac ctggctccca ataacctgaa gcctgtggtg 300 gcagagttct atgggtcaaa agaggaccca cagactttct attatgctgt tgctgtggtg 360 aagaaggata gtggcttcca gatgaaccag cttcgaggca agaagtcctg ccacacgggt 420 ctaggcaggt ccgctgggtg gaacatcccc ataggcttac tttactgtga cttacctgag 480 ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt 540 gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc 600 cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat 660 gtggcctttg tcaagcactc gactatattt gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac 720 cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc cggaagccgg tagatgaata caaggactgc 780 cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac 840 ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa 900 ttccaactat tcagctctcc tcatgggaag gacctgctgt ttaaggactc tgcccacggg 960 tttttaaaag tcccccccag gatggatgcc aagatgtacc tgggctatga gtatgtcact 1020 gccatccgga atctacggga aggcacatgc ccagaagccc caacagatga atgcaagcct 1080 gtgaagtggt gtgcgctgag ccaccacgag aggctcaagt gtgatgagtg gagtgttaac 1140 agtgtaggga aaatagagtg tgtatcagca gagaccaccg aagactgcat cgccaagatc 1200 atgaatggag aagctgatgc catgagcttg gatggagggt ttgtctacat agcgggcaag 1260 tgtggtctgg tgcctgtctt ggcagaaaac tacaataaga gcgataattg tgaggataca 1320 ccagaggcag ggtattttgc tgtagcagtg gtgaagaaat cagcttctga cctcacctgg 1380 gacaatctga aaggcaagaa gtcctgccat acggcagttg gcagaaccgc tggctggaac 1440 atccccatgg gcctgctcta caataagatc aaccactgca gatttgatga atttttcagt 1500 gaaggttgtg cccctgggtc taagaaagac tccagtctct gtaagctgtg 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660 cctgataaaa ctgtgagatg gtgtgcagtg tcggagcatg aggccactaa gtgccagagt 720 ttccgcgacc atatgaaaag cgtcattcca tccgatggtc ccagtgttgc ttgtgtgaag 780 aaagcctcct accttgattg catcagggcc attgcggcaa acgaagcgga tgctgtgaca 840 ctggatgcag gtttggtgta tgatgcttac ctggctccca ataacctgaa gcctgtggtg 900 gcagagttct atgggtcaaa agaggaccca cagactttct attatgctgt tgctgtggtg 960 aagaaggata gtggcttcca gatgaaccag cttcgaggca agaagtcctg ccacacgggt 1020 ctaggcaggt ccgctgggtg gaacatcccc ataggcttac tttactgtga cttacctgag 1080 ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt 1140 gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc 1200 cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat 1260 gtggcctttg tcaagcactc gactatattt gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac 1320 cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc cggaagccgg tagatgaata caaggactgc 1380 cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac 1440 ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa 1500 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aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg 480 actgggcaga tcttcaagca gacctactgc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac 540 gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag 600 acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt cggatccgtc 660 cctgataaaa ctgtgagatg gtgtgcagtg tcggagcatg aggccactaa gtgccagagt 720 ttccgcgacc atatgaaaag cgtcattcca tccgatggtc ccagtgttgc ttgtgtgaag 780 aaagcctcct accttgattg catcagggcc attgcggcaa acgaagcgga tgctgtgaca 840 ctggatgcag gtttggtgta tgatgcttac ctggctccca ataacctgaa gcctgtggtg 900 gcagagttct atgggtcaaa agaggaccca cagactttct attatgctgt tgctgtggtg 960 aagaaggata gtggcttcca gatgaaccag cttcgaggca agaagtcctg ccacacgggt 1020 ctaggcaggt ccgctgggtg gaacatcccc ataggcttac tttactgtga cttacctgag 1080 ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt 1140 gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc 1200 cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat 1260 gtggcctttg tcaagcactc gactatattt gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac 1320 cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc cggaagccgg tagatgaata caaggactgc 1380 cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac 1440 ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa 1500 ttccaactat tcagctctcc tcatgggaag gacctgctgt ttaaggactc tgcccacggg 1560 tttttaaaag tcccccccag gatggatgcc aagatgtacc tgggctatga gtatgtcact 1620 gccatccgga atctacggga aggcacatgc ccagaagccc caacagatga atgcaagcct 1680 gtgagtggt gtgcgctgag ccaccacgag aggctcaagt gtgatgagtg gagtgttaac 1740 agtgtaggga aaatagagtg tgtatcagca gagaccaccg aagactgcat cgccaagatc 1800 atgaatggag aagctgatgc catgagcttg gatggagggt ttgtctacat agcgggcaag 1860 tgtggtctgg tgcctgtctt ggcagaaaac tacaataaga gcgataattg tgaggataca 1920 ccagaggcag ggtattttgc tgtagcagtg gtgaagaaat cagcttctga cctcacctgg 1980 gacaatctga aaggcaagaa gtcctgccat acggcagttg gcagaaccgc tggctggaac 2040 atccccatgg gcctgctcta caataagatc aaccactgca gatttgatga atttttcagt 2100 gaaggttgtg cccctgggtc taagaaagac tccagtctct gtaagctgtg tatgggctca 2160 ggcctaaacc tgtgtgaacc caacaacaaa gagggatact acggctacac aggcgctttc 2220 aggtgtctgg ttgagaaggg agatgtggcc tttgtgaaac accagactgt cccacagaac 2280 actgggggaa aaaaccctga tccatgggct aagaatctga atgaaaaaga ctatgagttg 2340 ctgtgccttg atggtaccag gaaacctgtg gaggagtatg cgaactgcca cctggccaga 2400 gccccgaatc acgctgtggt cacacggaaa gataaggaag cttgcgtcca caagatatta 2460 cgtcaacagc agcacctatt tggaagcaac gtaactgact gctcgggcaa cttttgtttg 2520 ttccggtcgg aaaccaagga ccttctgttc agagatgaca cagtatgttt ggccaaactt 2580 catgacagaa acacatatga aaaatactta ggagaagaat atgtcaaggc tgttggtaac 2640 ctgagaaaat gctccacctc atcactcctg gaagcctgca ctttccgtag accttaa 2697 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf-F primer <400> 10 catgctagct ccaccatgag gctcgccgtg ggagcc 36 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf-R primer <400> 11 agactcgagt taaggtctac ggaaagtgca g 31 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf (B) -F primer <400> 12 ctatgggtca aaagaggacc cacagacttt ctatt 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tf (B) -R primer <400> 13 aatagaaagt ctgtgggtcc tcttttgacc catag 35 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tranferrin signal peptide <400> 14 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu   1 5 10 15 Cys Leu Ala             <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preTf (B) primer <400> 15 ctcggatccg tccctgataa aactgtgaga tg 32 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-Th F primer <400> 16 atagctagct ccaccatggc tacaggctcc cggac 35 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-ThR primer <400> 17 tatggatccg aagccacagc tgccctcca 29 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH signal peptide <400> 18 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu   1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala              20 25 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHW-P00-T F primer <400> 19 gctgctcatc cagtgttggc tggagcccg 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHW-P00-T R primer <400> 20 cgggctccag ccaacactgg atgagcagc 29 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-T F primer <400> 21 tcaagcagac ctactgcaag ttcgacacac cc 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHC3-P00-T R primer <400> 22 gtttgtgtcg aacttgcagt aggtctgctt ga 32

Claims (19)

인간 성장 호르몬 단백질(human growth hormone protein)의 아미노산 서열에서 85번째 및 144번째 세린(Serine)이 각각 소수성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
A human growth hormone mutant protein consisting of an amino acid sequence in which the 85th and 144th serines are replaced with hydrophobic amino acids, respectively, in the amino acid sequence of human growth hormone protein.
제 1항에 있어서, 상기 인간 성장 호르몬 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된 것을 특징으로 하는 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
2. The human growth hormone mutation protein according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the human growth hormone protein is represented by SEQ ID NO:
제 1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 황화결합이 가능한 아미노산인 것을 특징으로 하는 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
The human growth hormone mutation protein according to claim 1, wherein the hydrophobic amino acid is an amino acid capable of sulfidation bonding.
제 1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 시스테인(Cysteine)인 것을 특징으로 하는 인간 성장 호르몬 변이 단백질.
The human growth hormone mutation protein according to claim 1, wherein the hydrophobic amino acid is cysteine.
제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자.
A gene encoding the protein of claim 1.
제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
An expression vector comprising a gene encoding the protein of claim 1.
제 6항의 발현 벡터가 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포 및 인간을 제외한 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 숙주세포에 도입된 형질전환체.
A transformant wherein the expression vector of claim 6 is introduced into any one host cell selected from the group consisting of Escherichia coli, yeast, fungi, plant cells and animal cells other than human.
제 1항의 인간 성장 호르몬 변이 단백질의 말단에 트랜스페린(transferrin)이 결합된 인간 성장 호르몬 변이 단백질과 트랜스페린의 융합 단백질.
A fusion protein of human growth hormone mutant protein and transferrin, wherein transferrin is bound to the end of the human growth hormone mutant protein of claim 1.
제 8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4로 표시된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
9. The fusion protein of claim 8, wherein the fusion protein is represented by SEQ ID NO: 4.
제 8항의 단백질을 암호화하는 유전자.
A gene encoding the protein of claim 8.
제 8항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
An expression vector comprising a gene encoding the protein of claim 8.
제 11항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 염기서열로 치환한 것인 발현벡터.
12. The expression vector according to claim 11, wherein the gene encoding the protein is obtained by replacing the base sequence of the restriction enzyme recognition site in the gene with another base sequence encoding the same amino acid as the amino acid encoding the base sequence.
제 11항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민(Thymine)을 사이토신(Cytosine)으로 치환한 것인 발현벡터.
12. The expression vector according to claim 11, wherein the gene encoding the protein is a gene encoding a Bam HI restriction enzyme recognition site sequence (GGATCC) in the gene by substituting Cytosine for the Thymine.
제 11항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 말단에 제한효소 인식부위를 추가적으로 포함하는 것인 발현벡터.
12. The expression vector according to claim 11, wherein the gene encoding the protein further comprises a restriction enzyme recognition site at the end of the gene.
제 11항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 발현벡터.
12. The expression vector according to claim 11, wherein the expression vector comprises any one of the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 6, 7, 8 and 9.
제 11항의 발현벡터가 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포 및 인간을 제외한 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 숙주세포에 도입된 형질전환체.
The transformant according to claim 11, wherein the expression vector is introduced into any one host cell selected from the group consisting of Escherichia coli, yeast, fungi, plant cells and animal cells except humans.
제 1항의 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 제 8항의 융합 단백질, 제 6항의 벡터, 제 11항의 벡터, 제 7항의 형질전환체 또는 제 16항의 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물.
A growth factor containing the human growth hormone mutation protein of claim 1, the fusion protein of claim 8, the vector of claim 6, the vector of claim 11, the transformant of claim 7 or the transformant of claim 16 as an active ingredient, Or growth retardation.
제 17항에 있어서, 상기 성장부전 또는 성장지연은 뇌하수체 성장호르몬 분비장애, 만성 신장 질환(chronic renal disease), 터너증후군(Turner's syndrome), 악액질(cachexia) 또는 AIDS 소모(AIDS wasting)에 기인한 것인, 성장부전(growth failure) 또는 성장지연(growth retardation) 치료용 약학적 조성물.
18. The method according to claim 17, wherein the growth failure or growth retardation is caused by pituitary gland hormone secretion disorder, chronic renal disease, Turner's syndrome, cachexia or AIDS wasting For the treatment of growth retardation or growth retardation.
제 1항의 인간 성장 호르몬 변이 단백질, 제 8항의 융합 단백질, 제 6항의 벡터, 제 11항의 벡터, 제 7항의 형질전환체 또는 제 16항의 형질전환체를 유효성분으로 함유하는 유년기 개시형 결핍증 또는 성인기 개시형 결핍증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A childhood-onset deficiency or an adult disease comprising the human growth hormone mutation protein of claim 1, the fusion protein of claim 8, the vector of claim 6, the vector of claim 11, the transformant of claim 7, or the transformant of claim 16, A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of starvation deficiency.
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