JPH1192499A - Human growth hormone variant - Google Patents

Human growth hormone variant

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JPH1192499A
JPH1192499A JP9275277A JP27527797A JPH1192499A JP H1192499 A JPH1192499 A JP H1192499A JP 9275277 A JP9275277 A JP 9275277A JP 27527797 A JP27527797 A JP 27527797A JP H1192499 A JPH1192499 A JP H1192499A
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JP
Japan
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hgh
variant
growth hormone
amino acid
acid sequence
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JP9275277A
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Japanese (ja)
Inventor
Kunio Nakajima
邦夫 中島
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceut Co Ltd
住友製薬株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject new variant having such structure that the amino acids on specific sites of the amino acid sequence of a natural type human growth hormone are substituted, resistant to decomposition by thrombin and also resistant to decomposition by a protease in the blood, and useful for e.g. treating dwarfism. SOLUTION: This new human growth hormone variant has such structure that the arginine (Arg) on the 134TH site and the threonine (Thr) on the 135TH site are substituted by aspartic acid (Asp) and proline (Pro), respectively, in the 1 to 191TH sites of the amino acid sequence of a natural type human 22kDa growth hormone (hGH) having an amino acid sequence of the formula, being resistant to decomposition by thrombin, having activity nearly equivalent to that of natural type hGH, also having high stability in the blood or body fluid, therefore being useful for e.g. treating dwarfism. This variant is obtained by modifying the 134TH and 135TH, sites of the amino acid sequence of natural type hGH by the use of a vector including a DNA sequence encoding the above amino acid sequence by such a means as site-specific mutation technique followed by expression in hosts.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、対分解酵素耐性を高められた、ヒト成長ホルモン(以下、hGH)の変異体、より詳しくは、血液中のプロテアーゼである、トロンビンまたはプラスミンによる分解を受けにくいhGH BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention has an elevated versus resistance to enzymatic degradation, human growth hormone (hereinafter, hGH) variants, more particularly, a protease in blood, undergo degradation by thrombin or plasmin hard to hGH
変異体に関する。 It relates to variants.

【0002】 [0002]

【従来の技術】現在、小人症治療などに用いられているhGH医薬製剤は、主に組換え製法〔日本特許2521 BACKGROUND OF THE INVENTION Currently, hGH pharmaceutical formulations are used to, such as dwarfism treatment, mainly recombinant production process [Japanese Patent 2521
413号など〕によるものであり、アミノ酸191個、 413 Patent is due, etc.], 191 amino acids,
分子量約22kDの天然hGHと同一のアミノ酸配列を有する。 It has the same amino acid sequence as native hGH with a molecular weight of about 22 kD. このような組換えhGHは、臨床応用された組換えタンパクとして最も成功したもののひとつであるが、近年、hGHのアミノ酸を一部改変して、hGHタンパク製剤の体内動態をさらに好ましいものにする技術が試みられている。 Such recombinant hGH is the one but the most successful clinical application recombinant proteins, in recent years, the amino acids of hGH was partially modified to be even preferred pharmacokinetics of hGH protein preparation technique attempts have been made.

【0003】即ち、元々の生理活性を保ちつつ、安定性などの面で好ましい特性を示すhGHの改変体が種々特許出願されている。 [0003] That is, while maintaining the original physiological activity, the variant of hGH indicating preferred characteristics in terms of stability, etc. have been variously patent application. 代表的なものを下記に列挙する。 It listed typical to the following. (1)149位AsnをAspに置換したもの〔特開平1−275599〕。 (1) the position 149 Asn those substituted with Asp [Hei 1-275599]. (2)成長ホルモン中のシステイン残基の改変体〔特開平3−4797〕。 (2) Variants of the cysteine ​​residues in the growth hormone [JP 3-4797]. (3)αヘリックス3領域の改変体〔特開平5−704 (3) alpha variant of helix 3 region [Patent 5-704
97〕。 97]. (4)αヘリックス1領域の改変体〔特開平5−105 (4) alpha variant of helix 1 region [Patent 5-105
634〕。 634]. (5)140位Lysのアミノ酸置換改変体〔特開平5 (5) 140-position amino acid substitution variant of Lys [Patent 5
−199880〕。 -199,880]. (6)134位ArgをAla、Leu、Thr、Ph (6) 134 of Arg to Ala, Leu, Thr, Ph
e、Pro又はHisに置換したもの〔特開平5−31 e, which was replaced with Pro or His [Patent 5-31
0794〕。 0794]. 特に、(6)特開平5−310794では、134位A In particular, (6) in JP-A-5-310794, 134 of A
rgを別の中性あるいは弱塩基性のアミノ酸に置換して、天然型hGHとほぼ同等の活性を示す組換えhGH By replacing the rg to another neutral or weakly basic amino acids, recombinant hGH showing almost the same activity as the native hGH
変異体を得ている。 To obtain a mutant. 134位、135位の間のファクターXaによる分解を防ぐとされている。 Position 134, there is a preventing degradation by Factor Xa between the position 135. また、(5)特開平5−199880には、140位LysをAsnに置換したものが開示されている。 Also, (5) Japanese Patent Laid-Open 5-199880 discloses a those with substitution of 140-position Lys to Asn.

【0004】しかしながら、(6)のhGH変異体が耐性を示すとされるファクターXaは、血液由来のプロテアーゼとしては主要なものではない。 However, factor Xa which hGH variant is to exhibit resistance (6) are not major ones as a blood-derived proteases. この変異体が、プラスミンやスロンビンのような血液中により多く存在するプロテアーゼに対して、耐性を示すかどうか、また、 This variant, with respect to proteases present more in the blood, such as plasmin and thrombin, whether resistant, also,
血液中で安定かどうかは、同出願に開示されていない。 Whether stable in the blood is not disclosed in the application.
(5)に開示された変異体も、プラスミンやスロンビンに対して安定であるということは示唆されていない。 (5) to the disclosed variants also it does not suggest that it is stable against plasmin and thrombin.

【0005】 [0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然型hGHとほぼ同等の活性を示し、かつ生体への投与時、血液中での安定性を高められた改変タンパク質を提供することである。 The purpose of the 0008] The present invention shows almost the same activity as the native hGH, and upon administration to a living body, to provide a modified protein elevated stability in the blood is there.

【0006】 [0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々のh Means for Solving the Problems The present inventors have found that various h
GHアミノ酸配列改変体を作成し、その対プロテアーゼ安定性を評価した。 Create a GH amino acid sequence variants, to evaluate its pair protease stability. その結果、プラスミンによる分解箇所134位ArgをAspに、135位ThrをPro As a result, the decomposition point 134 of Arg by plasmin to Asp, a position 135 Thr Pro
に、更には140位LysをAlaに変換したhGH In, and further converts the 140-position Lys to Ala hGH
が、hGH活性を損なうことなく、血液中での高い安定性を示すことを見いだし、本発明を完成した。 But without compromising the hGH activity, it found to exhibit high stability in the blood, and completed the present invention. 特に、1 In particular, 1
34位の変換は、強塩基性残基Argから酸性残基As Position 34 of the transformation, the acidic residues As from strongly basic residues Arg
pに変えるという、従前知られている置換より激しいものであったが、驚くべきことに生理活性は殆ど低下しなかった。 Of changing the p, but was more violent substitutions known previously, surprisingly physiological activity was not decreased almost.

【0007】すなわち、本発明は、下記の医薬に関するものである。 Accordingly, the present invention relates to a pharmaceutical below. (1)天然型ヒト22kDa成長ホルモン(hGH)のアミノ酸配列1−191位において、134位アルギニン(Arg)および135位スレオニン(Thr)が、 (1) in the amino acid sequence of 1-191 of native human 22kDa growth hormone (hGH), threonine (Thr) is in position 134 arginine (Arg) and at position 135,
それぞれアスパラギン酸(Asp)およびプロリン(P Each aspartic acid (Asp) and proline (P
ro)に、置換されており、スロンビンによる分解に耐性を有することを特徴とするヒト成長ホルモン変異体。 To ro), is substituted, human growth hormone variant characterized by having a resistance to degradation by thrombin. (2)140位リジン(Lys)が、アラニン(Al (2) 140 of lysine (Lys), alanine (Al
a)に置換されていることを特徴とする(1)のヒト成長ホルモン変異体。 Human growth hormone variants, characterized in that it is substituted with a) (1). (3)天然型ヒト22kDa成長ホルモン(hGH)のアミノ酸配列において、134位アルギニン(Ar (3) in the amino acid sequence of native human 22kDa growth hormone (hGH), 134-position arginine (Ar
g)、135位スレオニン(Thr)および140位リジン(Lys)が、それぞれアスパラギン酸(As g), 135 of threonine (Thr) and 140 of lysine (Lys), respectively aspartate (As
p)、プロリン(Pro)、およびアラニン(Ala) p), proline (Pro), and alanine (Ala)
に置換されており、スロンビンおよびプラスミンによる分解に耐性を有するヒト成長ホルモン変異体。 Human growth hormone variants with is substituted, the resistance to degradation by thrombin and plasmin. (4)(1)〜(3)のヒト成長ホルモン変異体を有効成分として含有する医薬製剤。 (4) (1) a pharmaceutical formulation containing as an active ingredient the human growth hormone variant to (3).

【0008】以下、詳細に本発明を説明する。 [0008] In the following, the present invention will be described in detail. 本明細書において、「天然型ヒト22kDa成長ホルモンのアミノ酸配列」とは、日本特許2521413号、第20 As used herein, "amino acid sequence of native human 22kDa growth hormone", JP 2521413, 20th
頁、図8に記載されたアミノ酸配列1−191(配列番号1)を意味する。 Page, means an amino acid sequence 1-191 (SEQ ID NO: 1) described in FIG. 本発明のヒト成長ホルモン変異体は、上記のアミノ酸配列における134位Arg→As Human growth hormone variants of the present invention, 134 of Arg → As in the above amino acid sequence
p、135位Thr→Proおよび/または140位L p, 135 of Thr → Pro and / or 140 of L
ys→Ala置換がなされたhGH活性を有するタンパク質を言い、抗スロンビン、抗プラスミンあるいは、血漿中で分解されにくいという特性を有する限り、その他の位置のアミノ酸配列が置換、除去、付加等されていても、本発明の技術範囲に入るものとする。 ys → Ala substitution refers to proteins having an hGH activity was made, anti-thrombin, antiplasmin or as long as it has the property that hardly degraded in plasma, the amino acid sequence of other locations are substituted, eliminated, have been added, etc. It is also intended to fall within the scope of present invention. なお、hGH It should be noted, hGH
活性とは、主として成長期にある、ヒトの脳を除く全組織(特に骨)を成長させる総合的な成長促進活性を意味する。 The activity, primarily in anagen, means the overall growth promoting activity of growing all tissues (especially bone) except human brain. すなわち、(1)ソマトメジン(IGF−I)誘導を介した骨や軟骨の増殖促進作用、(2)アミノ酸の細胞への取り込みとタンパク合成の促進、タンパク分解の抑制作用、(3)中性脂肪代謝促進作用、(4)糖代謝促進作用、(5)Na、K等、電解質貯留促進作用、 That is, (1) somatomedins (IGF-I) induced proliferation promoting action of bone and cartilage through, (2) facilitate the uptake and protein synthesis of an amino acid into a cell, inhibition of proteolysis, (3) triglyceride uptake-promoting activity, (4) glucose uptake-promoting effect, (5) Na, K, etc., electrolyte reservoir promoting action,
など公知のhGH生理活性の全部または一部を意味するものである。 It is intended to mean all or some known hGH bioactivity like.

【0009】「スロンビンによる分解に耐性を示す」とは、hGH変異体の10分の1量(重量比)のスロンビンと37℃24時間反応させたときに、実質的にhGH [0009] The term "resistant to degradation by thrombin", 1 volume of 10 minutes of hGH variants when reacted thrombin and 37 ° C. 24 hours (weight ratio), substantially hGH
変異体タンパクが分解されないことを言い、具体的には、SDS−PAGE分析で反応液からhGH(分子量:約22kD)より分子量の小さいフラグメントが検出されないことを意味する。 It means that the mutant protein is not degraded, specifically, hGH from the reaction solution by SDS-PAGE analysis: Small fragments of (molecular weight about 22 kD) than the molecular weight means not detected.

【0010】「プラスミンによる分解に耐性を示す」とは、hGH変異体の20分の1量(重量比)のプラスミンと37℃24時間反応させたときに、実質的にhGH [0010] The term "resistant to degradation by plasmin," 1 of 20 minutes of hGH variants when reacted plasmin and 37 ° C. 24 hours (weight ratio), substantially hGH
変異体タンパクが分解されないことを言い、具体的には、SDS−PAGE分析で反応液からhGH(分子量:約22kD)より分子量の小さいフラグメントが検出されないことを意味する。 It means that the mutant protein is not degraded, specifically, hGH from the reaction solution by SDS-PAGE analysis: Small fragments of (molecular weight about 22 kD) than the molecular weight means not detected.

【0011】(製造方法)本発明のhGH変異体の生産方法としては、主に大腸菌を宿主に用いた組換え技術が用いられる。 [0011] (Production method) The method of producing hGH variants of the present invention mainly recombinant techniques using E. coli host is used. 天然型hGHのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む公知のベクターを用い、134、13 Using a known vector comprising a DNA sequence encoding the amino acid sequence of native hGH, 134,13
5、および140位の改変を部位特異的突然変異法など、自体公知の方法で行う。 5, and it performs the 140-position of the modified such as site-directed mutagenesis, in a manner known per se. hGH変異体をコードするベクターを取得後、大腸菌などの宿主で、hGH変異体を発現させ、製造することができる。 After obtaining a vector encoding a hGH variant, a host such as E. coli, to express the hGH variant can be produced.

【0012】(hGH変異体遺伝子の取得)配列番号1 [0012] (acquisition of hGH variant gene) SEQ ID NO: 1
で示されるhGH・DNA配列を含むベクターを用いて、本発明のhGH変異体の発現ベクターを構築する。 In using a vector containing hGH · DNA sequence shown, to construct an expression vector of hGH variants of the present invention.
原料となるベクターは、公知のhGH遺伝子含有ベクターであれば、特に制限されないが、代表的なものとして、pKKhGH1〔Yamakawa,M. Vector as a raw material, any known hGH gene-containing vector is not particularly limited, as a typical, PKKhGH1 [Yamakawa, M. eta eta
l. l. 、Biochimica et Biophysi , Biochimica et Biophysi
ca Acta 1009巻、156−160頁、(1 ca Acta 1009, pp. 156-160, (1
989)〕が挙げられる。 989)], and the like. 134、135および140 134, 135 and 140
位の置換には、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異法が便利である。 The position of the replacement, site-specific mutagenesis using oligonucleotides are useful. オリゴヌクレオチドプライマーは、特に制限されないが、配列番号2〜配列番号5のプライマーが好適である。 Oligonucleotide primer is not particularly limited, it is preferred primer of SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 5.

【0013】(発現ベクターの構築)発現ベクターには、適当な大腸菌、枯草菌、酵母、動物昆虫細胞等の宿主内で増殖できるプラスミドやファージが選ばれるが、 [0013] The (expression vector construction) expression vector, suitable E. coli, Bacillus subtilis, yeast, Plasmids and phage can proliferate in a host such as animal insect cells are selected,
例えば、大腸菌由来のpBR322、pBR325、 For example, E. coli-derived pBR322, pBR325,
〔Gene、4巻121頁(1978)〕、pUC1 [Gene, 4 vol. 121, pp. (1978)], pUC19
8、枯草菌由来pUB110〔Biochem. 8, derived from Bacillus subtilis pUB110 [Biochem. Bio Bio
phys. phys. Res. Res. Commun. Commun. 112巻,678頁(1983)〕、COS細胞に好適なpCDM8等が挙げられる。 Vol. 112, 678 pp (1983)], and a suitable pCDM8 like into COS cells. cDNAをプラスミドに組み込む方法としては、常法が、マニアティス(T.Maniatis) As a method of incorporating the cDNA into a plasmid, the conventional method is, Maniatis (T. Maniatis)
他、モレキュラー・クローニング(Molecular Other, Molecular Cloning (Molecular
cloning)、コールドスプリング ハーバー cloning), Cold Spring Harbor
ラボラトリー(Cold spring harbar Laboratory (Cold spring harbar
lab. lab. )239頁(1982)に記載されている。 ) It is described in 239 (1982).

【0014】(宿主)宿主は、特に限定されないが、大腸菌が大量生産に便利である。 [0014] (host) host, but are not limited to, E. coli is useful for mass production. その他、細菌としては、 Other examples of the bacteria,
枯草菌(バチルス類)等、酵母としては、サッカロマイセス属、トルラ属、ピキア属等、動物細胞としては、C Bacillus subtilis (Bacillus acids), etc., as the yeast, Saccharomyces, Torula, Pichia etc. Examples of animal cells, C
OS細胞、CHO細胞、NSO細胞等が代表例である。 OS cells, CHO cells, NSO cells, and the like is a representative example.
培養昆虫細胞、真菌、植物細胞、単細胞系だけでなく、 Cultured insect cells, fungal, plant cells, as well as unicellular,
目的蛋白質遺伝子を組み込まれた昆虫や哺乳類、植物も宿主の範疇に入る。 Desired protein gene incorporated insects and mammals, plants enters a host category of.

【0015】(活性測定)形質転換体から、公知の方法、例えば、コロニー・ハイブリダイゼイション法〔G [0015] (activity measurement) from the transformant by a known method, for example, colony hybridization method [G
ene,10巻 63頁(1980)〕およびDNA塩基配列決定法〔Proc. ene, 10 vol 63 (1980)] and DNA sequencing [Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sc Sc
i. i. USA 74巻560頁(1977)〕を用い、所望のクローンを選出する。 USA 74 vol 560 pp used (1977)], selects the desired clone. また、COS細胞にて一過性に発現させ、培養上清の生理活性を評価してクローン選択することも可能である。 Also, it expressed transiently in COS cells, it is also possible to clone selected by evaluating the physiological activity of the culture supernatant. 発現されたhGH変異体蛋白の生理活性は、Nb2細胞などの培養細胞の増殖促進作用を測定することにより評価できる〔Gout,P. Physiological activity of the expressed hGH variant protein can be evaluated by measuring the growth promoting effect of cultured cells, such as Nb2 cells [Gout, P.
W. W. et al. et al. Cancer Research、第40巻、2433−2436頁(1980)〕。 Cancer Research, Vol. 40, pp. 2433-2436 (1980)].

【0016】(精製)組換え技術により生産されたhG [0016] (purified) hG which has been produced by recombinant technology
H変異体蛋白は、生化学の分野で常用される精製方法にて精製が可能である。 H variant protein is capable purified by purification methods conventionally used in the field of biochemistry. イオン交換クロマトグラフィー、 Ion-exchange chromatography,
ゲル濾過、逆相HPLC、硫安沈澱、限外濾過、SDS Gel filtration, reverse phase HPLC, ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration, SDS
−PAGEなどが適宜組み合わせて用いられる。 Such -PAGE are used in combination as appropriate. hGH hGH
に対する特異的抗体を用いた抗体カラムクロマトグラフィーなども大量精製に好適である。 Antibody column chromatography using specific antibodies to be suitable to be mass purification like. hGH変異体蛋白に対する抗体は、ポリクローナル、モノクローナル共に、 Antibody against hGH variant proteins, polyclonal, monoclonal both,
自体公知の方法で作製し得る。 It is prepared in a manner known per se. hGH特異的抗体は抗体カラムに使用出来るだけでなく、ELISA等の免疫化学的定量法に使用できる。 hGH specific antibodies not only be used for antibody column can be used in immunochemical assay, such as ELISA.

【0017】(製剤)製剤としては、注射剤、経口剤、 [0017] Examples of the (formulation) formulation, injection, oral agents,
液剤、凍結乾燥品いずれも用いることが出来るが、特に皮下投与用注射製剤が好ましい。 Solutions, although it is possible to use any lyophilizate, subcutaneous injectable formulation is particularly preferable. これら非経口投与製剤には、当該分野にて公知の安定化剤、担体を用いることができ、使用時に等張溶液として用いるのが好ましい。 These include parenteral formulations, known stabilizing agents in the art, it may be used a carrier, preferably used as isotonic solutions in use.
医薬担体としては、例えば、アルブミン等の血漿由来蛋白、グリシン等のアミノ酸、マンニトール等の糖を用いることができ、通常、皮下あるいは筋肉内投与用凍結乾燥製剤に用いられる。 Pharmaceutical carriers, for example, plasma-derived protein such as albumin, amino acids such as glycine, may be used sugars such as mannitol, normally used subcutaneously or lyophilized formulation for intramuscular administration. また、水溶製剤、凍結乾燥製剤として使用する場合、凝集を防ぐためにTween80などの界面活性剤を添加するのが好ましい。 Also, water formulations, when used as a freeze-dried preparation, it is preferable to add a surfactant such as Tween80 in order to prevent aggregation. 長期の薬効を要する場合は、公知のタンパク徐放性製剤用担体(コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、シリコンなど) If it takes long drug efficacy, known protein sustained-release preparation carrier (collagen, polylactic acid, polyglycolic acid, silicone, etc.)
を用いて製剤する事もできる。 It can also be formulated with.

【0018】(使用方法および毒性)本発明のhGH変異体製剤は、公知のhGH製剤と同様に使用しうる。 [0018] (usage and toxicity) hGH variant formulation of the present invention may be used in analogy to known hGH formulation. h
GH変異体製剤の投与方法は、皮下投与、静脈投与、筋肉内投与、いずれも可能であるが、皮下投与が通常用いられる。 Method of administering the GH variant formulation, subcutaneous administration, intravenous administration, intramuscular administration, but any possible, subcutaneous administration is usually employed. hGHの投与量および投与回数は、患者の状態や年令性別等により、適宜増減すべきものではあるが、 The dosage and frequency of administration of hGH, the patient's condition and age sex and the like, although intended to be appropriately increased or decreased,
下垂体性小人症治療には、一般的には、体重kg当たり、0.5IUを2〜4回/週投与する。 The pituitary dwarfism treatment, in general, per kg, and is administered two to four times / week 0.5 IU. hGHは過去10年以上、臨床で使用された実績があり、本発明の変異体もhGHと同様の生理活性を示すことから毒性は低いと考えられる。 hGH past 10 years, there is a track record in clinical use, toxicity since the variants of the present invention also show similar physiological activities and hGH is considered to be low.

【0019】 [0019]

【発明の効果】本発明のhGH変異体は、天然型hGH hGH variants of the present invention, according to the present invention, the natural-type hGH
とほぼ同等の活性を示し、かつ血液あるいは体液中で優れた安定性を示す。 When it showed almost the same activity, and exhibit excellent stability in blood or body fluids.

【0020】 [0020]

【実施例】以下、本発明を実施例にて説明する。 EXAMPLES The present invention will be described in Examples. 実施例1 ベクターの構築 ・hGH(R134D/T135P)をコードするDN DN encoding construct · hGH in Example 1 vector (R134D / T135P)
A ヒトhGH変異体の構造遺伝子に相当するDNA断片(配列番号1)を担持するプラスミドpKKhGH1 Plasmid pKKhGH1 carrying the DNA fragment (SEQ ID NO: 1) corresponding to the structural gene of A human hGH variant
と、大腸菌発現ベクターであるpUC18(ファルマシア&アップジョン社)をXbaIとHindIIIで切断し、つなぎ合わせて、pUC18hGHを得る。 If, pUC18 is an E. coli expression vector (Pharmacia & Upjohn) was digested with XbaI and HindIII, and pieced together, get a pUC18hGH. このプラスミドと、プライマー1(配列番号2)とプライマー2(配列番号3)を用いたPCRにより、134位にAsp、135位にProをコードするDNA配列を導入、hGH変異体DNA断片を増幅した(図1)。 This plasmid, by PCR using primers 1 (SEQ ID NO: 2) and Primer 2 (SEQ ID NO: 3), introduced a DNA sequence encoding a Pro to Asp, 135-position to 134-position, were amplified hGH variant DNA fragment (Figure 1). その後、pCRTMII(インビトロゲン社)にて当該DN After that, the DN in pCRTMII (Invitrogen)
A断片をクローニングし、これとpKKhGH1をXb It was cloned A fragment, this with PKKhGH1 Xb
aIとBglIIでつないで、プラスミドpKKhGH Connect with aI and BglII, the plasmid pKKhGH
5を得た。 5 was obtained. このプラスミドは、hGH(R134D/T This plasmid, hGH (R134D / T
135P)の遺伝子を担持する(図2)。 Carrying the gene for 135P) (Figure 2). ・hGH(K140A)をコードするDNA 前記プラスミドpUC18hGHと、プライマー3(配列番号4)とプライマー4(配列番号5)を用いたPC A DNA the plasmid pUC18hGH encoding · hGH to (K140A), using primers 3 (SEQ ID NO: 4) and primer 4 (SEQ ID NO: 5) PC
Rにより、140位にAlaコドンを導入、hGH変異体DNA断片を増幅した(図1)。 The R, introducing Ala codon at position 140 was amplified hGH variant DNA fragment (Figure 1). その後、これとpK After that, this and pK
KhGH1をHindIIIとBglIIでつないで、 By connecting KhGH1 with HindIII and BglII,
プラスミドpKKhGH6を得た。 Resulting in plasmid pKKhGH6. このプラスミドは、 This plasmid,
hGH(K140A)の遺伝子を担持する(図2)。 Carrying the gene for hGH (K140A) (Figure 2). ・hGH(R134D/T135P/K140A)をコードするDNA 前記プラスミドpKKhGH5とpKKhGH6をHi · HGH (R134D / T135P / K140A) a DNA the plasmid pKKhGH5 and pKKhGH6 encoding Hi
ndIIIとBglIIでつないで、プラスミドpKK Connect with ndIII and BglII, the plasmid pKK
hGH7を得た。 hGH7 was obtained. このプラスミドは、hGH(R134 This plasmid, hGH (R134
D/T135P/K140A)の遺伝子を担持する(図2)。 D / T135P / K140A) carrying the gene (Figure 2).

【0021】実施例2 発現 実施例1で得られたhGH(R134D/T135 [0021] hGH obtained in Example 2 Expression Example 1 (R134D / T135
P)、hGH(K140A)、hGH(R134D/T P), hGH (K140A), hGH (R134D / T
135P/K140A)をコードするDNA配列を、t The 135P / K140A) DNA sequence encoding, t
acプロモーターを有するプラスミドpKK223−3 The plasmid having the ac promoter pKK223-3
(ファルマシア&アップジョン社)〔De Berr, (Pharmacia & Upjohn, Inc.) [De Berr,
H. H. A. A. et al. et al. Proc. Proc. Natl. Natl. Acad. Acad.
Sci. Sci. USA、第80巻、21−25頁(198 USA, Vol. 80, pp. 21-25 (198
3)〕に導入し、それぞれの発現ベクターを得た。 Was introduced into 3)] to give the respective expression vector. そして、常法に従って、大腸菌(JM103株)を形質転換し、hGH(R134D/T135P)、hGH(K1 The usual manner, Escherichia coli (JM103 strain) transformed, hGH (R134D / T135P), hGH (K1
40A)およびhGH(R134D/T135P/K1 40A) and hGH (R134D / T135P / K1
40A)発現株を培養して、ヒトhGH変異体の発現と生産を行った。 40A) culturing the expression strain were produced and expression of human hGH variant. 培養条件は、下記の通りである。 Culture conditions are as follows. なお、 It should be noted that,
対照として、pKKhGH1由来の天然型hGH遺伝子も同じ条件で発現させた。 As a control, native hGH gene from pKKhGH1 also expressed in the same conditions. hGH(R134D/T13 hGH (R134D / T13
5P/K140A)の全アミノ酸配列は、配列番号6に示される。 5P / K140A) the entire amino acid sequence of shown in SEQ ID NO: 6.

【0022】各hGH変異体発現ベクターで形質転換されたJM103株を、アンピシリン50μg/mlおよびIPTG1mMを含むLB培地500ml:4本に植え込み、37℃で36時間振とう培養した。 [0022] The JM103 strain transformed with each hGH variant expression vector, ampicillin 50 [mu] g / ml and LB medium containing 1 mM IPTG 500 ml: 4 present the implantation, and cultured with shaking for 36 hours at 37 ° C.. IPTGを培養の最初から系に添加することにより、良い発現効率が得られた。 By adding IPTG from the beginning of the culture system, we obtained good expression efficiency.

【0023】実施例3 抽出精製 培地から回収した菌体を遠心分離で集め、破砕後、不溶性画分より、デタージェント処理にてhGH変異体を可溶化し回収した。 [0023] The bacterial cells were recovered from Example 3 extraction and purification media were collected by centrifugation, crushed, from the insoluble fraction was solubilized hGH variant at detergent treatment recovery. 粗抽出液は(1)ミクロフィルター濾過、(2)セファクリル S−200ゲル濾過、(3) The crude extract (1) micro-filtration, (2) Sephacryl S-200 gel filtration, (3)
DEAEセファロースCL−6Bイオン交換クロマトグラフィーを行い、精製した。 DEAE Sepharose CL-6B by ion exchange chromatography and purified. hGH変異体は、いずれも上記の処理でほぼ均一にまで精製された(図3、図4)。 hGH variants are all purified to near homogeneity by the above processing (FIG. 3, FIG. 4).

【0024】実施例4 hGH活性 精製されたhGH変異体を用いて、Goutらの方法〔Gout,P. [0024] Using Example 4 hGH activity Purified hGH variant, Gout et al's method [Gout, P. W. W. etal. etal. Cancer Res Cancer Res
earch、第40巻、2433−2436頁(198 earch, Vol. 40, pp. 2433-2436 (198
0)(前出)〕に従って、細胞増殖活性を評価した。 According to 0) (supra)], it was to assess cell proliferation activity. 即ち、1x10 5個のNb細胞をシャーレに播種し、各h In other words, seeded with 1x10 5 pieces of Nb cells in a petri dish, each h
GH変異体と陽性対照として天然型hGHとプロラクチン10ng/mlを添加して(各3連)、24時間ごとの細胞数を3日目までカウントした。 And the native hGH and prolactin 10 ng / ml was added as GH variant and positive control (each in triplicate) and counted the number of cells per 24-hour day three. hGH変異体はすべて陽性対照と同じ活性を示した(図5)。 All hGH variants showed the same activity as the positive control (Figure 5).

【0025】実施例5 対スロンビン耐性 精製されたhGH変異体を用いて、スロンビン分解に対する耐性を検討した。 [0025] Using Example 5 vs. thrombin resistant purified hGH mutants were investigated resistance to thrombin degradation. 即ち、各hGH変異体と対照として天然型hGH、各5μgを1/10量(重量比)のスロンビンと、0.15MNaCl存在下、pH7.4のトリス塩酸緩衝液中で37℃24時間インキュベートし、培養液をTricine SDS−PAGEで分析した。 In other words, native hGH, and thrombin of each 5μg 1/10 (weight ratio), the presence 0.15M NaCl, 37 ° C. 24 h and incubated in Tris-HCl buffer pH7.4 as controls with each hGH variant , and we analyzed the culture solution in the Tricine SDS-PAGE. 天然型hGHとhGH(K140A)は、ほぼ1 Natural-type hGH and hGH (K140A) is approximately 1
00%分解され、分解産物F−IとF−IIになったが、hGH(R134D/T135P)およびhGH Decomposed 100%, becomes decomposed products F-I and F-II but, hGH (R134D / T135P) and hGH
(R134D/T135P/K140A)は全く変化しなかった(図6)。 (R134D / T135P / K140A) there was no change (Fig. 6).

【0026】実施例6 対プラスミン耐性 精製されたhGH変異体を用いて、プラスミン分解に対する耐性を検討した。 [0026] with reference to Examples 6 to plasmin resistant purified hGH mutants were investigated resistance to plasmin degradation. 即ち、各hGH変異体と対照として天然型hGH、各5μgを1/20量(重量比)のプラスミンと、0.15MNaCl存在下、pH7.4のトリス塩酸緩衝液中で37℃24時間インキュベートし、培養液をTricine SDS−PAGEで分析した。 In other words, native hGH, and plasmin each 5μg 1/20 (weight ratio), the presence 0.15M NaCl, 37 ° C. 24 h and incubated in Tris-HCl buffer pH7.4 as controls with each hGH variant , and we analyzed the culture solution in the Tricine SDS-PAGE. 天然型hGHとhGH(K140A)は、ほぼ1 Natural-type hGH and hGH (K140A) is approximately 1
00%分解され、分解産物F−IaとF−IIになった。 Decomposed 100%, becomes decomposed products F-Ia and F-II. また、hGH(R134D/T135P)は、分解されて、分解産物F−IbとF−IIとして検出された。 Also, hGH (R134D / T135P) is degraded, which is detected as a degradation product F-Ib and F-II. しかし、hGH(R134D/T135P/K14 However, hGH (R134D / T135P / K14
0A)は全く分解されなかった(図7)。 0A) was not degraded at all (Fig. 7).

【0027】実施例7 血漿中安定性 精製されたhGH変異体を用いて、血漿中での安定性を検討した。 [0027] Using Example 7 Plasma stability purified hGH mutants was studied the stability in plasma. 即ち、hGH変異体と対照として天然型hG In other words, the native hG as a contrast to the hGH variant
H、各5μgを25μlのヒト血漿を含む100μlP H, 100μlP each 5μg comprising human plasma 25μl
BSと37℃でインキュベートした。 It was incubated at BS and 37 ℃. 1日および7日後の反応液をウェスタンブロットで分析した。 The reaction solution after 1 day and 7 days were analyzed by Western blot. 天然型hG Native hG
HとhGH(K140A)は、1日目でかなり分解されたが、hGH(R134D/T135P)では、分解産物は認められなかった。 H and hGH (K140A) has been significantly degraded in the first day, the hGH (R134D / T135P), degradation products was observed. さらに、hGH(R134D/ In addition, hGH (R134D /
T135P/K140A)では1日目、7日目を通して、殆ど全く分解産物は認められなかった(図8)。 T135P / K140A) in 1 day, through day 7 was not observed at all degradation products most (FIG. 8).

【0028】実施例8 製剤例1 本発明のhGH変異体製剤のうち、代表的なものである皮下投与用凍結乾燥あるいは水性製剤は、以下のように製造することができる。 [0028] Example 8 of the hGH variant formulation Formulation Example 1 The present invention, freeze-drying or aqueous formulation for subcutaneous administration are representative, can be prepared as follows. (1)精製組換えhGH変異体1mgに対し、グリシン0.34mg、マンニトール9mg、非イオン性界面活性剤:ポリソルベート80、0.2mgを加え、燐酸緩衝液1ml(pH7.4、5mM)に溶解させ、hGH (1) to purified recombinant hGH variant 1 mg, glycine 0.34 mg, mannitol 9 mg, nonionic surfactant: Polysorbate 80,0.2mg was added, dissolved in phosphate buffer 1 ml (pH 7.4, 5 mM) then, hGH
変異体水溶液を得る。 Obtaining a variant solution. 無菌的にバイアル充填し、常法に従って凍結乾燥して、hGH変異体凍結乾燥製剤を得る。 Put into vials aseptically, and lyophilized in a conventional manner to obtain a hGH variant lyophilized formulation. (2)150mM塩化ナトリウム、0.01%ポリソルベート80を含有する10mMクエン酸緩衝液(p (2) 150 mM sodium chloride, 10 mM citrate buffer containing 0.01% Polysorbate 80 (p
H6.0)でhGH変異体を5mg/mlになるように調製し、hGH変異体水溶液を得る。 The hGH variant was prepared to be 5 mg / ml in H6.0), obtain the hGH variant solution.

【0029】 [0029]

【配列表】 [Sequence Listing]

配列番号:1 配列の長さ:191 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 起源 生物名:ヒト 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg SEQ ID NO: 1 Length of sequence: 191 SEQ type: amino acid Topology: linear sequence type: peptide Origin Organism: human sequence Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

【0030】配列番号:2 配列の長さ:19bp 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GGAAACAGCT ATGACCATG [0030] SEQ ID NO: 2 sequence length of: the type of 19bp sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand Topology: linear sequence: GGAAACAGCT ATGACCATG

【0031】配列番号:3 配列の長さ:30bp 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GAAGATCTGC CCTGGATCGG GGCTGCCATC [0031] SEQ ID NO: 3 sequence Length: type 30bp sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand Topology: linear sequence: GAAGATCTGC CCTGGATCGG GGCTGCCATC

【0032】配列番号:4 配列の長さ:30bp 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CAGATCTTCG CTCAGACCTA CAGCAAGTTC [0032] SEQ ID NO: 4 sequence Length: type 30bp sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand Topology: linear sequence: CAGATCTTCG CTCAGACCTA CAGCAAGTTC

【0033】配列番号:5 配列の長さ:20bp 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CAAGCTTGGC TGCAGGTCGA [0033] SEQ ID NO: 5 SEQ Length: type 20bp sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand Topology: linear sequence: CAAGCTTGGC TGCAGGTCGA

【0034】配列番号:6 配列の長さ:191 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 起源 生物名:ヒト 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Asp Pro Gly Gln Ile Phe Ala Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 1 [0034] SEQ ID NO: 6 Length of sequence: 191 SEQ type: amino acid Topology: linear sequence type: peptide Origin Organism: human sequence Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Asp Pro Gly Gln Ile Phe Ala Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 1 65 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 65 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】hGH変異体を構築するためのプライマー。 FIG. 1 is a primer for the construction of hGH variant. A
は、プライマーの位置、Bは、プライマーのDNA配列を示す。 The position of the primer, B shows the DNA sequence of the primer.

【図2】hGH変異体発現ベクターの構築図。 FIG. 2 is a construction diagram of the hGH variant expression vector.

【図3】hGH変異体遺伝子発現産物のゲル濾過による精製。 [Figure 3] Purification by gel filtration of the hGH variant gene expression products. 図は、hGH(R134D/T135P)発現物をセファクリル S−200カラムにかけ、溶出液をS Figure multiplied by hGH (R134D / T135P) expression product to Sephacryl S-200 column, the eluate S
DS−PAGEで分析したものである。 One in which was analyzed by DS-PAGE. レーンBはクロマトグラフィー以前のサンプル、レーン1〜9は各フラクションを示す。 Lane B shows the chromatographic previous sample, Lanes 1-9 each fraction. クロマトグラフィーの条件は、カラム:2.5x70cm、溶出液:10mM 2−メルカプトエタノールと0.1%SDSを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)、流速:40ml/min、 Chromatographic conditions column: 2.5X70cm, eluent: 10 mM 2-mercaptoethanol and 50mM Tris-HCl buffer containing 0.1% SDS (pH7.4), flow rate: 40 ml / min,
フラクション体積:各6ml。 Fraction volume: each 6ml.

【図4】hGH変異体遺伝子発現産物のイオン交換クロマトグラフィーによる精製。 [4] Purification by ion exchange chromatography of hGH variant gene expression products. 図は、hGH変異体発現産物の再生、透析後の画分をDEAEセファロースCL− Figure regeneration of hGH variant expression product fractions after dialysis DEAE Sepharose CL-
6Bにかけ、溶出液をSDS−PAGEで分析したものである。 Subjected to 6B, in which the eluate was analyzed by SDS-PAGE. レーン1は天然型hGH、レーン2はhGH Lane 1 of the natural hGH, lane 2 hGH
(R134D/T135P)、レーン3はhGH(K1 (R134D / T135P), lane 3 hGH (K1
40A)、レーン4はhGH(R134D/T135P 40A), lane 4 is hGH (R134D / T135P
/K140A)を示す。 / K140A) show a. クロマトグラフィーの条件は、 Chromatographic conditions,
カラム:2.2x26cm、担持/溶出用緩衝液:0. Column: 2.2X26cm, bearing / elution buffer: 0.
1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液(p 10mM Tris-HCl buffer containing 1 mM EDTA (p
H8.0、0〜1MのNaClグラジエント溶出)、流速:2ml/min、フラクション:各6ml。 NaCl gradient elution H8.0,0~1M), flow rate: 2 ml / min, Fraction: each 6 ml.

【図5】hGH変異体の細胞増殖活性の評価。 [Figure 5] evaluation of cell proliferation activity of hGH variant. 縦軸はN The vertical axis N
b2細胞の数、横軸は、培養時間を表す。 b2 number of cells and the horizontal axis represents the incubation time.

【図6】スロンビン分解に対する耐性の評価。 [6] Evaluation of resistance to thrombin decomposition. 図は、スロンビン処理した各hGH変異体をSDS−PAGEで分析したものである。 Figure is analyzed by SDS-PAGE of each hGH variant that thrombin treatment. レーン1はスロンビン、レーン2 Lane 1 is thrombin, lane 2
は天然型hGH(未処理)、レーン3、4、5、6はは、それぞれ、1/10量のスロンビンと37℃24時間処理された、天然型hGH:レーン3、hGH(R1 Native hGH (untreated) are lanes 3,4,5,6 mother, respectively, 1/10 volume of thrombin and 37 ° C. was 24 hours, native hGH: lane 3, hGH (R1
34D/T135P):レーン4、hGH(K140 34D / T135P): lane 4, hGH (K140
A):レーン5、hGH(R134D/T135P/K A): lane 5, hGH (R134D / T135P / K
140A):レーン6を示す。 140A): it shows the lane 6.

【図7】プラスミン分解に対する耐性の評価。 [7] Evaluation of resistance to plasmin degradation. 図は、プラスミン処理した各hGH変異体をSDS−PAGEで分析したものである。 Figure is the hGH mutants plasmin treated those analyzed by SDS-PAGE. レーン1はプラスミン、レーン2 Lane 1 is plasmin, lane 2
は天然型hGH(未処理)、レーン3、4、5、6はは、それぞれ、1/20量のプラスミンと37℃24時間処理された、天然型hGH:レーン3、hGH(R1 Native hGH is (untreated), lanes 3,4,5,6 mother, respectively, 1/20 of plasmin and 37 ° C. was 24 hours, native hGH: lane 3, hGH (R1
34D/T135P):レーン4、hGH(K140 34D / T135P): lane 4, hGH (K140
A):レーン5、hGH(R134D/T135P/K A): lane 5, hGH (R134D / T135P / K
140A):レーン6を示す。 140A): it shows the lane 6.

【図8】血漿中安定性の評価。 [8] Evaluation of plasma stability. 図は、血漿とインキュベートした各hGH変異体をSDS−PAGEで分析したもの。 Figure that each hGH variant was incubated with plasma and analyzed by SDS-PAGE. レーン1はスロンビン、レーン2は天然型hGH Lane 1 is thrombin, lane 2 natural-type hGH
(未処理)、レーン1、2、3、4は、それぞれ、血漿を含む燐酸緩衝生理食塩水と37℃でインキュベートされた、天然型hGH:レーン1、hGH(R134D/ (Untreated), lanes 1, 2, 3 and 4, respectively, were incubated with phosphate buffered saline and 37 ° C. containing plasma, native hGH: lane 1, hGH (R134D /
T135P):レーン2、hGH(K140A):レーン3、hGH(R134D/T135P/K140 T135P): lane 2, hGH (K140A): lane 3, hGH (R134D / T135P / K140
A):レーン4を示す。 A): it shows the lane 4. Aは1日目、Bは7日目の分析結果である。 A day 1, B is the analysis result of 7 days.

Claims (4)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】天然型ヒト22kDa成長ホルモン(hG 1. A native human 22kDa growth hormone (hG
    H)のアミノ酸配列1−191位において、134位アルギニン(Arg)および135位スレオニン(Th In the amino acid sequence position 1-191 of H), 134-position arginine (Arg) and at position 135 threonine (Th
    r)が、それぞれアスパラギン酸(Asp)およびプロリン(Pro)に、置換されており、スロンビンによる分解に耐性を有することを特徴とするヒト成長ホルモン変異体。 r) are each aspartic acid (Asp) and proline (Pro), is substituted, human growth hormone variant characterized by having a resistance to degradation by thrombin.
  2. 【請求項2】140位リジン(Lys)が、アラニン(Ala)に置換されていることを特徴とする請求項1 2. A 140-position lysine (Lys) is, according to claim 1, characterized in that it is substituted with alanine (Ala)
    記載のヒト成長ホルモン変異体。 Human growth hormone variant according.
  3. 【請求項3】天然型ヒト22kDa成長ホルモン(hG 3. A native human 22kDa growth hormone (hG
    H)のアミノ酸配列において、134位アルギニン(A In the amino acid sequence of H), 134-position arginine (A
    rg)、135位スレオニン(Thr)および140位リジン(Lys)が、それぞれアスパラギン酸(As rg), 135 of threonine (Thr) and 140 of lysine (Lys), respectively aspartate (As
    p)、プロリン(Pro)、およびアラニン(Ala) p), proline (Pro), and alanine (Ala)
    に置換されており、スロンビンおよびプラスミンによる分解に耐性を有するヒト成長ホルモン変異体。 Human growth hormone variants with is substituted, the resistance to degradation by thrombin and plasmin.
  4. 【請求項4】請求項1〜3のヒト成長ホルモン変異体を有効成分として含有する医薬製剤。 4. A pharmaceutical formulation comprising as an active ingredient the human growth hormone variant of claims 1-3.
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