KR20180000718A

KR20180000718A - 혈소판 풍부 혈장 및 골수 흡인물 세포 분리 및 제거 방법과 장치

Info

Publication number: KR20180000718A
Application number: KR1020177023243A
Authority: KR
Inventors: 제인 에프. 에머슨
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아; 유니버시티 오브 써던 캘리포니아
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2018-01-03
Also published as: WO2016153590A2; JP2018506343A; EP3247419A4; WO2016153590A3; AU2016236089B2; BR112017015758A2; EP3247419A2; US20180296748A1; KR102555147B1; JP6768676B2; PL3247419T3; EP3247419B1; US11166875B2; CA2974698A1; CN107960057A; EP3247419B8; AU2016236089A1

Abstract

전혈 또는 골수 흡인물의 샘플을 혈소판 및 만능 세포 중의 적어도 하나가 풍부한 분획으로 분리하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 전혈의 샘플을, PRP 분획 및 적어도 하나의 다른 분획 사이에 침강하도록 제형화된 분리기 물질을 포함하는 수집관에서 원심분리시킬 수 있다. 바람직하게는, 원심분리는 혈소판의 실질적인 활성화 없이 완료된다. 임의로, 분리기 물질은 PRP 분획을 적어도 하나의 다른 분획과 재혼합하지 않고서 PRP 분획 중의 혈소판의 전부 또는 실질적으로 전부를 제거할 수 있는 고체 차단막을 형성하도록 경화될 수 있다. 멸균 샘플을 샘플의 멸균성을 유지하면서 분리/제조 용기(예, 진공채혈기)에서 소비자 또는 다른 용기(예, 점적기)로 이동시킬 수 있는 이동 장치 및 방법이 또한 제공된다.

Description

혈소판 풍부 혈장 및 골수 흡인물 세포 분리 및 제거 방법과 장치

본 출원은 2015년 1월 22일자로 출원된 유럽 특허 출원 제15152110.1호, 및 2015년 10월 5일자로 출원된 U.S. 가특허 출원 제62/237407호에 대한 우선권을 주장한다. 이러한 및 모든 다른 외부 참고문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 참고로 포함되는 것과 같이 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 포함된 참고문헌에서 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공된 해당 용어의 정의와 불일치하거나 상반되는 경우, 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며 참고문헌에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.

발명의 분야

본 발명의 분야는 분리 기술이다.

배경 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이것은 본원에 제공된 어떠한 정보가 선행 기술이거나 본원에 청구된 발명과 관련된다는 것, 또는 구체적으로 또는 함축적으로 참조된 임의의 공보가 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.

혈소판-풍부 혈장(PRP) 요법은 골 수선 및 재생, 성형 수술, 구강 수술 분야 및 눈 치료에 사용되어 왔으며, 스포츠 부상, 신경 손상, 건염 및 골관절염을 치료하는데 있어서의 이의 효험에 대해 증가된 주목과 인식을 받고 있다. PRP은 손상 부위로 전달되고 활성화되어 성장 인자를 급속하게 방출시키고 골 또는 연조직 회복을 자극할 수 있는 혈소판의 중심 공급원으로서 간주될 수 있다. 혈소판의 의도치 않은 조기 활성화는 여러 성장 인자가 짧은 반감기를 갖기 때문에 피해야 하며, 혈소판이 사용(예, 주사) 시에 또는 사용 직전에 활성화되면 보다 큰 효능이 야기될 수 있다.

원심분리법을 사용하여 PRP를 제조 또는 분리하는데 얼마간의 노력들이 이루어져 왔다. 예는 U.S. 특허 제6,596,180호, 제6,610,002호, 제6,827,863호, 제6,899,813호, U.S. 특허 출원 공보 제2009/0294383호, 및 국제 특허 출원 공보 제WO 02/081007호를 포함한다. 불행하게도, 공지된 방법들은 높은 혈소판 활성화, 연막(buffy coat) 또는 PRP를 갖는 겔을 분취할 위험 없이 모든 또는 실질적으로 모든 PRP을 제거하지 못함, 또는 PRP의 균질성 및 멸균 개방관 프로세싱을 위한 요건을 수득할 수 없음을 포함한 몇 가지 결점들 중의 적어도 하나로 고민하고 있다.

문헌[참조; "Platelet Separation From Whole Blood in an Aqueous Two-Phase System With Water-Soluble Polymers " by Sumida et al. published in J Pharmacol Sci 101, 91-97 (2006)]에서는 종래의 원심분리법을 사용한 고 혈소판 활성화의 문제를 인식하고, 원심분리 없이 혈소판을 분리하는 방법을 개발하였다. 보다 구체적으로, 다양한 중합체를 시트레이트 덱스트로스를 함유하는 전혈과 혼합하고 혈구 분리 및 혈소판 활성화를 관찰하였다. 불행하게도, 스미다(Sumida)는 중합체가 혈소판을 더욱 효율적으로 분리할수록, 더 많은 혈소판이 활성화된다는 것을 발견하였다. 반대로, 감소된 혈소판 활성화가 달성되는 경우, 혈소판 수율은 불량하였다. 게다가, 침강 프로토콜 때문에, 혈소판은 전형적으로 PRP 분획에 균일하게 분포되지 않고, 따라서 정량이 어렵다.

재생성 만능 줄기 세포를 함유하는 골수 흡인물이 또한 다양한 골 및 관절 병태를 치료하는데 도움을 주기 위해 사용되어 왔다. 불행하게도, 공지된 원심분리법은 목적하는 세포(예, B-세포, 혈소판, T-세포, 단핵구, 조혈 줄기 세포, 중간엽 간질 세포, 내피 전구 세포, 작은 배아-유사 세포)의 상당한 손실을 야기한다.

따라서, PRP 및 골수 흡인물 분획을 제조하는 개선된 방법이 여전히 필요하다.

여전히 추가로, 선행의 분리 노력들은 상업적 사용을 위한 별도의 저장 용기로의 이동을 위해 이것이 제조되고 분리되는 수집관으로부터 PRP 또는 골수 흡인물 분획(또는 체액의 다른 분획)을 피펫팅하거나 수동으로 제거하는 것을 필요로 하는 것 같다. 제거 단계는, 예를 들면, PRP 또는 기타의 목적하는 분획 모두를 분취하지는 못하는 것, 멸균성을 깨뜨리는 것, 원치않는 분획 또는 물질을 분취한다는 것, 또는 오염을 포함하는 하나 이상의 원치 않는 효과를 가질 수 있다.

따라서, 개선된 멸균 이동 장치 및 방법이 당업계에서 여전히 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명의 대상는 목적하는 농도의 기능성 혈소판을 갖는 혈소판-풍부 혈장(PRP) 분획을 전혈의 샘플로부터 분리하는 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 본 발명의 대상는 또한 목적하는 농도의 기능성 혈소판 또는 기타 세포를 갖는 골수 흡인물 분획(BMAF)을 골수액의 샘플로부터 분리하는 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 분리는 전혈과 유동 가능하고 고체 차단막을 형성하도록 경화 가능한 중합 가능한 분리기 물질을 사용하여 달성된다.

본원 설명에서 및 하기 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 관사("a", "an" 및 "the")의 의미는 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수형 인용을 포함한다. 또한, 본원 설명에서 사용되는 바와 같이, 조사("in")의 의미는 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않는 한 조사("in" 및 "on")을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, PRP 분획은 전혈의 샘플에서 적어도 150%의 혈소판 농도, 이것이 수득되는 전혈의 샘플로부터 20% 미만의 백혈구, 및 이것이 수득되는 전혈의 샘플로부터 20% 미만의 적혈구를 포함한다. 혈소판, WBC 및 RBC 수준은 전체 혈구 계산(CBC), 혈액 도말, 또는 임의의 다른 상업적으로 적합한 검사를 통해 분리전 및 분리후 결정될 수 있음을 인지해야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 골수 흡인물 분획(BMAF)은 원심분리전 골수 흡인물 중에 적어도 100%의 생존 가능한 혈소판 농도를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, BMAF는 원심분리전 골수 흡인물 중에 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125% 또는 심지어 그 이상의 생존 가능한 혈소판 농도를 포함할 수 있다. 골수 흡인물로부터의 혈소판 회수는 전혈 샘플로부터의 혈소판 회수보다 훨씬 더 가변적이다. 출원인은 놀랍게도, 본 발명의 대상의 중합 가능한 분리기 물질을 사용한 골수 흡인물의 원심분리가 공지된 시스템에 비해 더 큰 생존 가능한 혈소판 농도를 갖는 혈소판 풍부 분획 및 덜한 세포 손상 또는 세포사를 초래한다는 것을 밝혀내었다. 골수 흡인물의 원심분리가 골수 샘플로부터 혈소판 및 줄기 세포를 분리하기 때문에, 생존 가능한 혈소판 농도의 증가는 더 큰 줄기 세포 분리/포획과 상관 관계가 있는 것으로 예상된다.

중합 가능한 분리기 물질(polymerizable separator substance)은 중합 가능한 분리기 물질이 전혈 샘플의 PRP 분획과 비-PRP 분획 사이에 침강할 때까지 원심분리된 전혈의 샘플을 갖는 수집관에 포함될 수 있다. 중합 가능한 분리기 물질은 (경화 전) 더 작은 구성 블록(예, 올리고머)을 포함하기 때문에, 혈소판(또는 다른 목적하는 세포)과 분리기 물질 간에 상당히 덜한 마찰력 및 전단력이 초래되어, 혈소판이 덜 활성화되고 세포사 또는 세포 손상이 덜 초래된다.

일단 중합 가능한 분리기 물질이 PRP와 비-PRP 분획(또는 체액의 다른 분획) 사이에 침강되면, 중합 가능한 분리기 물질은 경화되어 고체 차단막을 형성할 수 있으며, 여기서 고체 차단막의 중합 가능한 분리기 물질은 유동 가능한 경우 중합 가능한 분리기 물질의 평균 분자량보다 높은 평균 분자량을 가지며, 중합은 혈소판 생존능에 실질적으로 불리한 영향을 미치지 않는다. 고체 차단막은 바람직하게는 수집관에 대해 정지되며 교반시 PRP 분획과 비-PRP 분획의 혼합을 방지하는 정도로 불투과성일 것이다. 이것은 유리하게는 사용자가 PRP 분획을 균질화할 수 있고, PRP와 비-PRP 분획을 재혼합하지 않으면서 수집관으로부터 이를 전적으로 제거할 수 있게 할 것이다.

본 발명은 또한 멸균 샘플을 샘플의 멸균성을 유지하면서 분리/제조 용기(예, 진공채혈기)로부터 소비자 또는 다른 용기(예, 점적기)로 이동시킬 수 있는 장치, 시스템 및 방법을 제공한다.

본 발명의 대상의 하나의 측면에서, 이동 장치는 기저 및 적어도 두 개의 니들을 에워싼 하우징을 포함한다. 하우징은 두 개의 개방 말단(예, 원통형 관)을 포함할 수 있고, 에워싸인 기저의 반대편에 두 개의 내부 구획을 포함한다.

두 개의 니들 중의 하나는, 니들의 제1 말단은 하나의 내부 구획 내에 배치되고 니들의 제2 말단은 제2 내부 구획 내에 배치되도록 기저 구조의 제1 부분에 연결될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 니들의 제1 말단 및 니들의 제2 말단은 기저 구조의 구멍을 통해 반대 말단 근처에 배치된 두 개의 별도의 니들을 포함할 수 있음을 인지해야 한다.

제2 니들은 하우징에 따라 이동할 수 있도록 기저 구조의 제2 부분에 연결될 있으며, 한 쪽 말단은 (제1 니들의 제1 말단 바로 옆의) 제1 내부 구획 내에 배치되고, 제2 말단은 - 제1 내부 구획이 아니라 - 기저 내에 배치된다. 바람직하게는, 제2 말단은 하우징의 슬롯으로 뻗어 있는 벤트 구조에 비스듬히 연결된다.

본원에 제시된 이동 장치는 유리하게는 멸균성을 손상하지 않으면서 사용자가 유체를 하나의 관에서 다른 관으로 이동시키도록 할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 이동 장치는 전체 PRP 분획(또는 BMAF 또는 다른 바람직한 분획)이 흔들림, 회전 또는 달리 관 조작 없이 이동되도록 할 수 있다.

하나 이상의 필터가 장치에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 필터가 에어 벤트, 이동 니들, 또는 장치의 임의의 다른 부분에 연결될 수 있다. 고려되는 필터는 (a) 누출 방지(예, 장치가 기울어진 경우), 및 (b) 장치(예, 벤트, 벤트 니들) 또는 제조 관으로 들어오는 공기 살균 중의 적어도 하나일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 필터는 소수성 막을 포함할 수 있다.

본 발명의 대상의 다양한 목적, 특징, 측면 및 이점은, 첨부된 도면(여기서, 동일한 숫자는 동일한 성분을 나타낸다)와 함께, 하기 바람직한 양태의 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.

도 1은 전혈의 혈소판 풍부 혈장 분획을 분리하기 위한 본 발명의 대상의 방법에 따라 사용되는 수집관을 예시한다.
도 2는 전혈의 샘플로부터 혈소판 풍부 혈장 분획을 분리하는 방법의 개략도이다.
도 3은 대조군, LAI를 갖는 관, 및 LAIT를 갖는 관의 "Ct"(사이클 역치)를 보여준다.
도 4는 비혼합 혈장으로부터 취한 cfDNA 계수의 비-재현성을 보여준다.
도 5는 리스토세틴에 대한 대조군, LAI 및 LAIE의 응집을 보여준다.
도 6는 콜라겐에 대한 대조군, LAI 및 LAIE의 응집을 보여준다.
도 7은 전혈의 샘플로부터 혈소판 풍부 혈장 분획을 분리하는 또 다른 방법의 개략도이다.
도 8은 전혈의 샘플로부터 혈소판 풍부 혈장 분획을 분리하는 또 다른 방법의 개략도이다.
도 9a-9i는 분리된 물질을 제1 용기에서 제2 용기로 이동시키는데 사용되는 이동 장치를 예시한다.
도 10a-10d는 분리된 물질을 하나의 용기에서 다른 용기로 이동시키는데 사용되는 이동 장치의 단면도를 제공한다.
도 11a-11b는 본 발명의 대상의 대안적인 이동 장치를 예시한다.
도 12a-12b는 또 다른 대안적인 이동 장치를 예시한다.
도 13a-c는 하우징 외부로 확장되지 않는 벤트를 갖는 예시적인 이동 장치를 예시한다.
도 14는 덮개를 갖는 이동 장치를 예시한다.

하기 논의는 본 발명의 대상의 여러 예시적인 실시형태들을 제공한다. 각 실시형태가 본 발명의 요소의 단일 조합을 나타내기는 하지만, 본 발명의 대상는 개시된 요소의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 간주된다. 따라서 하나의 실시형태가 요소 A, B, 및 C를 포함하고, 두 번째 실시형태가 요소 B 및 D를 포함한다면, 본 발명의 대상는 비록 명백히 개시되지 않더라도 A, B, C, 또는 D의 다른 남은 조합을 포함하는 것으로 또한 간주된다.

개시된 기술들은 분리된 혈소판의 상당한 활성화 없이 중합 가능한 분리기 물질(PSS)의 존재하에서 증가된 혈소판 분리를 포함한 다수의 유리한 기술 효과를 제공한다는 것을 인지해야 한다. 추가로, 제공된 조성물 및 방법은 사용자가 분리기 물질의 중합시 수집관을 뒤집어서, 분리된 상들 또는 PSS를 재혼합시키지 않으면서, 혈소판의 상당히 균일한 분포가 수득될 때까지 분리된 PRP 분획 또는 BMAF를 혼합할 수 있게 한다. 추가로, 제공된 방법 및 장치는 BMAF, PRP 또는 체액의 다른 분획이 별도의 저장 용기에 배치하기 위해 제조 또는 분리되는 수집관으로부터 분획을 제거하지 않고도 BMAF, PRP 또는 체액의 다른 분획의 상업적 사용을 가능하게 한다.

본 발명의 대상에 따라 PRP 분획을 분리하는 하나의 실시형태는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 본 발명의 대상의 방법을 수행하기 위해 임의의 적합한 수집관을 사용할 수 있음이 고려된다. 관은 바람직하게는 루멘 내에 진공을 지지하기에 적합한 강성 물질(예, 경질 플라스틱, 유리 등)로 이루어지며, 바람직한 양의 PRP 또는 BMAF를 분리할 수 있는 전혈 또는 골수 흡인물의 바람직한 샘플을 보유하기에 충분한 용적이다. 예시적인 관은 BD Vacutainer® 제품을 포함한다. 본원에 기재된 바람직한 장치 및 방법이 수집관의 사용을 포함하고 있지만, 수집관은 플라스크, 자(jar), 비이커, 보틀 또는 바이알과 같은 다른 용기로 대체될 수 있는 것으로 고려된다.

도 1의 실시형태에서, 유동 가능한 / 중합 가능한 분리기 물질(105)을 함유하는 수집관(100)을 멸균 에너지원(110)에 노출시키고, 이것이 멸균 에너지(115)(예, 감마 방사선, e-빔 방사선, 열)을 관(100) 및 분리기 물질(105)에 적용하여, 멸균된 분리관 및 멸균된(그러나 여전히 유동 가능하고 UV 경화 가능한) 분리기 물질(120)을 생성한다. 전혈(125)의 샘플을 관(100)에 가하여, 샘플 및 멸균된 분리기 물질의 혼합물(130)을 형성할 수 있다.

그 후, 관(100) 및 혼합물(130)은 혼합물(130)의 분리기 물질(140) 성분이 전혈(125)의 샘플의 PRP 분획(145)과 비-PRP 분획(135) 사이에 침강할 때까지 원심분리할 수 있다. PRP 분획(145)은 바람직하게는 샘플(125)의 혈소판 농도의 적어도 150%인 혈소판 농도를 가질 것이고, 비-PRP 분획(135)은 바람직하게는 샘플(125)로부터의 WBC 및 RBC의 적어도 90%를 포함할 것이다.

본원의 설명이 일반적으로 전혈의 샘플로부터의 PRP 분획의 분리에 관한 것이지만, 동일한 장치 및 방법이 골수 흡인물부터 골수 흡인물 분획을 분리하는데 사용될 수 있음을 인지해야 한다. 수집관에서, BMAF는 PSS 위에 배치되고, 골수 흡인물의 나머지 성분들은 PSS 아래에 배치된다.

중합 가능한 분리기 물질(140)은 전부 또는 일부 중합 가능할 수 있다. 따라서, 적당한 에너지원(155)(예, UV 광원)에 의해 생성된 에너지(150)(예, UV 에너지)에 분리기 물질(140)을 노출시키는 것이 라디칼 중합을 개시하고 분리기 물질(140)의 적어도 일부가 PRP 분획(145)과 비-PRP 분획(135) 사이에 불투과성 차단막으로 작용하는 고체 가교결합된 조성물(160)을 형성하게 할 것이다. 몇몇 실시형태에서, (UV 경화 후) 차단막의 최종 두께는 10mm 이하, 및 보다 바람직하게는 5mm 이하일 것이다.

중합 가능한 분리기 물질(또는 중합 가능한 분리기 물질의 중합 가능한 부분)은, 적합한 에너지원(예, UV 광)에 의해 촉발되는 경우, 10분내에 쇼어 00 경도계로 적어도 1의 경도, 보다 바람직하게는 쇼어 A 경도계로 적어도 10의 경도로 중합되고 프로브, 피펫, 경사여과 또는 심지어 동결에 대해 고체를 형성하도록 제형화될 수 있다. 형성된 경화된 고체 차단막은 관의 루멘의 벽에 달라붙어 하나 이상의 다른 분획으로부터 PRP 분획을 상당히 또는 완전히 밀봉시킴으로써, 확산, 교반, 샘플 추출, 또는 다른 바람직하지 않은 상호작용으로 인한 오염으로부터 PRP 분획을 보호할 수 있다.

적당한 광원은 5-100 W/cm², 10-75 W/cm², 15-50 W/cm²의 강도, 또는 임의의 다른 적합한 강도를 갖는 광을 방출할 수 있다 - 모두 광원으로부터 10 cm의 거리에서 측정하였다. 추가로 또는 대안적으로, 적합한 에너지원은 50-400nm, 예를 들면 200-280nm (UVC), 280-315nm (UVB), 315-400nm (UVA), 또는 200-400nm의 파장에서 최대 피크를 갖는 광을 생산할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 적합한 에너지원은 0.1-10 W/cm², 예를 들면, 0.3-1 W/cm², 1.5-2.5 W/cm², 또는 0.5-3.5 W/cm²의 피크 복사조도(irradiance)를 갖는 광을 방출할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 적합한 광원에 의해 생산된 광은 0.3-8 J/cm², 예를 들면, 1-5 J/cm², 또는 1-2 J/cm²의 복사 에너지 밀도로 경화시키고자 하는 표면에 도달할 수 있다.

하나의 예시적인 적합한 광원은 385nm의 파장에서 최대 피크를 갖고 2.2 W/cm²의 최대 복사조도를 갖는 광을 생산하는 헤레우스(Heraeus)에 의해 만들어진 맞춤형 라이트 박스(light box)이다. 이러한 광원은 25W의 최대 광학 출력 전력의 25%의 전력 세팅으로 사용되었다. 시험된 광경화성 물질의 일부는 0.25-lmL의 용적을 가졌으며, 진공채혈관에 배치되고, 적합한 에너지원은 2.2 W/cm²의 피크 복사조도로 380-390 nm에서 에너지를 방출하는 광 방출 다이어드이었다. 그러나, 보다 작거나 큰 용적에 대해 유사한 경화 시간을 달성하기 위해 하나 이상의 노출 인자(예, 복사조도, 파장, 복사 에너지)가 변경될 수 있거나, 물질 성분의 농도가 변경될 수 있거나(예, 항산화제 농도, 광개시제 농도), 또는 다른 에너지원이 사용될 수 있음을 인지해야 한다.

분리기 물질(140)이 단지 부분적으로 중합 가능한 경우, 목적하는 PRP 분획이 PRP 분획을 비-PRP 분획 또는 비-중합 가능한 부분과 혼합하지 않으면서 수집관으로부터 사용되거나 완전히 제거될 수 있도록 비-중합 가능한 부분(예, 요변성 겔 성분)이 중합 가능한 부분 아래에 침강할 수 있는 것으로 고려된다. 비-중합 가능한 부분은, 예를 들면, 규격품 겔(off the shelf gels)(예, BD Vacutainer® SST™, BD Vacutainer® PST™, 겔 분리기를 갖는 Vacuette® 혈액 수집관, PPMA 혈청 분리기 겔 튜브, 폴리프로필렌 혈청 분리기 겔 튜브 등), 또는 임의의 다른 상업적으로 적합한 겔을 포함할 수 있다.

본 발명의 대상의 분리기 물질은, 형성된 고체 차단막 덕분에, 사용자로 하여금, 예를 들면, PRP와 비-PRP 분획 사이에 차단막을 제거하지 않고도 수집관에서 PRP 분획을 혼합하거나 달리 교반함으로써 BMAF, PRP 또는 다른 분획의 상당한 균질성을 달성하고 재-달성할 수 있게 함을 인지해야 한다. 추가로, 상당한 균질성은 세포의 붕괴 없이, 예를 들면, 혈소판의 상당한 활성화 없이 달성될 수 있다. 추가로, 분리기 물질의 적어도 일부가 고체를 형성하도록 중합 가능한 경우, 중합 가능한 분리기 물질의 경화는 중합체성 분리기 물질 만큼 효율적으로 또는 심지어 그보다 더 양호하게 PRP 분획의 분리를 유지하는 중합체성 망상구조를 형성할 수 있다.

몇가지 고려되는 중합 가능한 분리기 물질은 다음을 포함한다: (1) 올리고머(예, 이의 배합물(예, Ebecryl, Cytec))와 (2) 광개시제(예, Additol® BDK, Additol® TPO) 및 (3) 안정화제(페노티아진). 고려되는 광경화성 조성물의 예는, 다른 것들 중에서도, LAI (예, L1Al 및 페노티아진), 및 LAIR을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, L = 올리고머(예, LI = Allnex, 이전에 Cytec Industries, Inc.로부터의 Ebecryl 230, 등); A = 광개시제(예, Al = Additol BDK); I = 안정화제(예, 페노티아진, 등). PSS에 포함될 수 있는 성분의 더 많은 예에 대해서는 아래 표 1을 참고한다.

[표 1]

몇가지 고려되는 중합 가능한 분리기 물질에서, 광개시제(예, 아조비스이소부티로니트릴, 벤조일 퍼옥사이드, 캄포르퀴논, 포스핀 옥사이드 광개시제, 케톤계 광개시제, 벤조인 에테르 광개시제)는 10wt% 미만, 5wt% 미만 또는 심지어 2wt% 미만의 농도로 존재하고, 안정화제는 5wt% 미만, 2wt% 미만, lwt% 미만 또는 심지어 0.5wt% 미만의 농도로 존재한다. 보다 구체적인 비제한적 예로서, 분리기 물질은 95 내지 100% (예, 100wt%)의 농도로 존재하는 올리고머, 0.8 내지 1.2% (예, lwt%)의 농도로 존재하는 광개시제, 및 0.01 내지 0.05% (예, 0.1wt%)의 농도로 존재하는 안정화제를 포함할 수 있다.

고려되는 광개시제는, 다른 것들 중에서도, Additol BDK 및 Additol TPO를 포함한다. 고려되는 안정화제는, 다른 것들 중에서도, 페노티아진을 포함한다. 분리기 물질은 또한 특히 분리기 물질의 상당한 경화 없이 분리기 물질을 갖는 수집관의 조사 멸균이 요구되는 경우에 항산화제를 포함할 수 있다. 조사 멸균(irradiation sterilization)은 고속 처리(high throughput)를 위해 바람직할 수 있지만, 작용 메카니즘은 분리기 물질의 원치않는 조기 경화로 인해 본질적으로 문제가 되는 자유-라디칼 생산에 의존한다. 그러나, 출원인은 놀랍게도, 본원에 참고로 포함된 출원 제PCT/US15/57359호 및 유럽 출원 제14190681.8호에 추가로 논의된 바와 같이, 토코페롤과 같은 라디칼 스캐빈저가 포함되는 경우, 본 발명의 대상의 일부 조성물(예, LAIE)은 3kG 이상의 방사 선량에서 조사 멸균 동안 유동성을 유지하는 반면, 일부 다른 조성물(예, LAI)은 동일한 방사 선량 하에서 유동성을 유지하지 못한다는 것을 발견하였다. 또 다른 관점에서 볼 때, LAI는 단지 조사 멸균 동안 대략 3kG의 방사 선량까지 유동성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 라디칼 스캐빈저 및 항산화제 중의 적어도 하나는 토코페롤을 포함하고, 적어도 75mM, 보다 바람직하게는 적어도 lOOmM, 보다 더 바람직하게는 적어도 135mM의 몰 농도로 조성물에 존재한다. 더 낮은 농도의 토코페롤(예, 약 75 mM 미만)은 다양한 이유로 바람직하지 않을 수 있다. 예를 들면, 보다 낮은 토코페롤 농도를 갖는 분리기 물질은 단지 낮은 방사 선량에서 유동성을 유지할 수 있으며, 이것은 ISO 프로토콜 하에서 비용-효과적인 멸균을 가능하게 하지 못한다. 추가로, 보다 낮은 토코페롤 농도를 갖는 분리기 물질은 전형적으로 보다 낮은 광개시제 농도(예, 1 wt% 미만)를 필요로 하며, 이것은 일반적으로 더 긴 경화 시간을 필요로 한다.

몇가지 고려되는 항산화제는 하이드록실 함유 (AOH) 항산화제(예, 비타민 E (α-토코페롤), 비타민 C (아스코르브산), 갈산), 및 니트록시드 (RNO) 항산화제 (예, TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 1-옥실), TEMPOL (4-하이드록시-TEMPO)을 포함한다. 또 다른 관점에서 볼 때, 고려되는 항산화제는, 다른 것들 중에서도, 토코페롤, 부틸화 하이드록시톨루엔 (BUT), 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 캐로틴, 빌리루빈 및 아스코르브산을 포함한다.

예시적인 중합 가능한 분리기 물질은 올리고머, 광개시제 및 안정화제를 포함하고, 여기서, 광개시제는 5wt% 미만 (예, 0.1-5%, 0.1-3%)의 농도로 존재하며, 안정화제는 0.5 wt% 미만(예, 0.1-0.5%, 0.1-0.3%)의 농도로 존재한다.

LAI (예, L1, Al 및 페노티아진)는 몇몇 특히 바람직한 광경화성 조성물을 포함하며, 1.00-1.09 g/cm³의 목적하는 밀도 범위를 갖도록 제형화될 수 있다. 실험은 올리고머를 갖는 광경화성 조성물을 사용하여 수행하였지만, 다수의 단량체 및 올리고머가 유사하게 높은 반응성을 갖고, 다수의 단량체 및 올리고머가 UV 광의 존재하에서 중합될 수 있기 때문에 단량체-함유 조성물 또한 PRP 제조에 사용하기에 적합할 수 있는 것으로 고려된다.

잠재적으로 적합한 광경화성 분리기 물질의 또 다른 예는 U.S. 특허 제7,674,388호, 제7,673,758호, 제7,775,962호, 제7,971730호, 제7,780,861호, 제8,206,638호, 제8,282,540호, 제8,151,996호, 및 제8,318077호에 기재된 것들, LAIE (예, LI, Al, 페노티아진 및 토코페롤), 및 LATER을 포함하고, 여기서 R = 겔화제 (예, DBS, 실리카, 등)이고, E = 항산화제 및 라디칼 스캐빈저 중의 적어도 하나 (예, 비타민 E, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 캐로틴, 빌리루빈, 아스코르브산, 등)이다. R 및 E가 일반적으로 광경화성 조성물의 필수 성분은 아니지만, 각각은 몇가지 용도를 위해 광경화성 조성물에 유리한 특징을 제공할 수 있다. 예를 들면, 분리기 물질이 사용 전에 어떠한 유동도 초래되지 않도록 광경화성 조성물 위에 수집관으로 부하되는 요변성 연질 겔 성분을 또한 포함하는 경우 겔화제는 광경화성 조성물의 필수 성분이 아닐 수 있다. 그럼에도 불구하고, 예를 들면, 연질 겔 성분 없이 관에, 또는 연질 겔 성분의 상부에 실란트를 배치하는 것이 바람직한 경우, 요변성 광경화성 조성물을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 겔화제 농도의 증가가 조사 멸균 동안 조기 경화를 야기하는 것으로 밝혀졌음을 주지해야 한다.

여전히 추가의 예는 다음을 포함하는 조성물이다: (1) 적어도 하나의 단량체, 및 올리고머 (예, 이의 배합물(예, Ebecryl, Cytec))와, (2) 광개시제 (예, Additol® BDK, Additol® TPO) 및 (3) 안정화제 (페노티아진). 임의의 상업적으로 적합한 광경화성 조성물이 사용될 수 있음을 인지해야 한다. 적합한 광경화성 조성물은 전형적으로 적어도 하나의 겔이고(예, 겔화제가 첨가되는 경우(예, DBS 또는 실리카)) 중합 전에 (전혈과) 유동 가능하며, 적합한 에너지원(예, UV 광)에 노출되는 경우 고화될 수 있다. 이들은, 다른 것들 중에서도, MLA (예, M1L1A1), MLAI (예, M1L1A1 및 페노티아진), MAI (예, M1A1 및 페노티아진), LAI (예, L1A1 및 페노티아진), 및 LMA (예, L1M1A1)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, M = 단량체 (예, Ml, 이것은 Sigma-Aldrich Cat. No. 407577로부터의 단량체 트리메틸롤프로판 프로폭실레이트 트리아크릴레이트이다); L = 올리고머 (예, LI = Allnex, 이전에 Cytec Industries로부터의 Ebecryl 230, Inc.); A = 광개시제 (예, Al = Additol BDK); I = 안정화제 (예, 페노티아진).

비타민 E 활성을 갖는 화합물(예, 토코페롤)과 같은 라디칼 스캐빈저는, 필수적인 것은 아니지만, 전혈의 샘플의 두 개의 분획 간에 침강을 가능하게 하기에 효과적인 유동성을 유지하기 위해 가열 살균을 필요로 하기 보다는 (예, 밀도 특성을 변화시킴으로써) 광경화성 조성물이 경화 없이 조사를 통해 멸균될 수 있도록 포함될 수 있다. 가열 살균이 요구되는 경우, 이것은 수집관 및 분리기 물질을 적어도 200 섭씨 온도, 보다 바람직하게는 적어도 225 섭씨 온도, 가장 바람직하게는 적어도 250 섭씨 온도의 열에 노출시킴으로써 달성될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 토코페롤 또는 다른 적합한 항산화제가 포함되는 경우, 분리기 물질을 포함하는 수집관을 판매 전에 국제 표준화 기구(ISO) 프로토콜을 만족시키기 위해 멸균시킬 수 있다. 출원인은 놀랍게도, 토코페롤과 같은 라디칼 스캐빈저가 포함되는 경우, 본 발명의 대상의 일부 조성물(예, LALE)은 3kG 이상의 방사 선량에서 조사 멸균 동안 유동성을 유지하는 반면 일부 다른 조성물(예, LAI)은 동일한 방사 선량 하에서 유동성을 유지하지 못한다는 것을 발견하였다. 또 다른 관점에서 볼 때, LAI는 단지 대략 3kG의 방사 선량까지는 조사 살균 동안 유동성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 라디칼 스캐빈저 및 항산화제 중의 적어도 하나는 토코페롤을 포함하고, 적어도 75mM, 보다 바람직하게는 적어도 1OOmM, 보다 더 바람직하게는 적어도 135mM의 몰 농도로 조성물에 존재한다. 보다 낮은 농도의 토코페롤(예, 약 75 mM 미만)은 다양한 이유로 바람직하지 않다. 예를 들면, 보다 낮은 토코페롤 농도를 갖는 분리기 물질은 단지 보다 낮은 방사 선량에서 유동성을 유지할 수 있으며, 이것은 ISO 프로토콜 하에서 비용-효과적인 멸균을 가능하게 하지 못한다. 추가로, 보다 낮은 토코페롤 농도를 갖는 분리기 물질은 전형적으로 보다 낮은 광개시제 농도(예, 1 wt% 미만)를 필요로 하며, 이것은 일반적으로 더 긴 경화 시간을 필요로 한다.

예를 들면, 관은 감마 방사선(예, 코발트원으로부터(예, Colbalt 60))을 사용하거나, e-빔 방사선(예, 7MeV 펄스 선형 가속기(LINAC) 전자 빔 공급원으로부터), 가스(예, 에틸렌 옥사이드), 또는 약 10-60분의 지속시간 동안 50-80 섭씨 온도의 열, 또는 100 내지 250 섭씨 온도 또는 그 이상의 열을 사용하여 (바람직하게는 분리기 물질 또는 이의 일부의 상당한 중합 없이) 멸균시킬 수 있다. 또 다른 관점에서 볼 때, 분리기 물질은 40% 이상 경화시키지 않으면서, 보다 바람직하게는 30% 이상 경화시키지 않으면서 조사, 가스, 또는 열 안정화를 가능하게 하고 UV 또는 다른 경화를 통한 후속적인 중합을 가능하게 하기에 효과적일 수 있다. 예를 들면, 적당한 펌프를 사용하여 관의 루멘의 용적을 감압시킴으로써 임의의 진공을 도입할 수 있다.

수집관(및 분리기 물질)이 5-25kGy, 보다 전형적으로 10-20 kGy의 선량에서 e-빔 멸균되는 경우, 모든 적합한 멸균 시간이 고려된다(예, 10분 미만, 5분 미만, 2분 미만, 5-120초, 5-90초). 수집관(및 분리기 물질)이 5-25kGy, 보다 전형적으로 10-20 kGy의 선량에서 감마 멸균되는 경우 모든 적합한 멸균 시간이 고려된다(예, 10분 미만, 5분 미만, 2분 미만, 5-120초, 5-90초). 감마 멸균시에는, 보다 낮은 선량 전달률을 갖는 보다 약한 공급원이 좀 더 화합물을 경화시킬 것 같다고 관찰되었다. ISO에 의해 요구되는 선량은, 다른 것들 중에서도, 멸균되는 물체의 바이오버든(bioburden)에 따라 좌우된다. 요구되는 조사 시간은 사용되는 멸균 기술 뿐만 아니라, 예를 들면, 멸균되는 물체의 바이오버든, 및 조사 선량(kGy)에 따라 좌우된다.

문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 본원에 제시된 모든 범위는 이들의 종점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며 오픈-엔드 범위는 단지 상업적으로 실용적인 값을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 값들의 모든 목록은, 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 중간 값들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

수집관은 멸균될 수 있고, 멸균된 분리기 물질이 후속적으로 관에 첨가될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 추가로 또는 대안적으로, 사용자는, 분리기 물질이 관 내에 미리 배치된 것과는 대조적으로, 구입 후 하나 이상의 분리기 물질을 수집관에 첨가할 수 있다.

샘플(예, 전혈)을 본 발명의 대상의 수집관에 첨가하는 경우, 원심분리가 전혈을 PRP 분획 및 비-PRP 분획으로 분리할 수 있다. 분리기 물질이 PRP와 비-PRP 분획의 밀도의 중간인 밀도를 갖는 경우, 이것이 원심분리 동안 두 개의 분획 사이를 이동하여, 분획을 서로 단리시킬 수 있다. 그후, 분리기 물질은 두 개의 분획 사이에 고체 차단막을 제공하도록 적합한 에너지원에 의해 촉발되는 경우 중합을 통해 급속하게 경화될 수 있다.

항응고제가, 임의로 분리기 물질의 일부로서, 전혈의 샘플의 응고를 방지하고 피브리노겐 및 응고 인자를 함유하는 혈장을 수득하기 위해 수집관에 포함될 수 있는 것으로 고려된다. 고려되는 항응고제는 나트륨 시트레이트, EDTA, 시트레이트 덱스트로스, 또는 임의의 다른 적합한 항응고제를 포함한다. 비록 방사선 중합이 개시되고 수행되더라도, 사용되는 화학 및 특히 아크릴 중합이 혈소판 활성화 또는 기능에 영향을 미치지도, PRP 분획에서 수행될 수 있는 다수의 또는 대부분의 다른 시험을 방해하지도 않는다는 것은 주목할 만하다.

도 2는 중합 가능한 분리기 물질(PSS)을 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플로부터 PRP 분획을 분리하는 방법(200)을 예시한다. 임의의 적합한 양의 분리기 물질이 관의 루멘에 포함될 수 있지만, 관의 용적 10ml당 불과 약 1ml 또는 2그램의 분리기 물질이 포함되는 것이 바람직하다.

방법(200)은 단계(210)에 나타낸 바와 같이 원심분리 프로토콜을 사용하여 PSS를 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플을 원심분리하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 단계(212)에 나타낸 바와 같이 24℃ 및 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리함을 포함하여, PSS가 샘플의 두 개의 분획 사이에 유동하도록 하는데 충분한 임의의 적합한 원심분리 프로토콜이 고려된다. 적합한 원심분리 프로토콜의 또 다른 예는 다음을 포함할 수 있다: 1분 내지 30분의 원심분리 시간(1분 및 30분 포함), 500 RPM 내지 5000 RPM(500 및 5000 RPM 포함); 또는 5분 내지 20분의 원심분리 시간(5분 및 20분 포함), 700 RPM 내지 3600 RPM(700 및 3600 RPM 포함). 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 원심분리 조건이 혈소판의 침강 및 침강률을 결정한다. PHOSITA은, 과도한 실험 없이, PSS 위에 목적하는 수율의 혈소판을 달성하는데 적합한 인가된 G 힘 및 시간을 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 목적하는 수율의 증가 또는 감소는 상기 고려사항을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.

아래 표 2A는 본 발명의 대상의 PSS를 사용하여 전혈의 샘플로부터 PRP를 분리하는데 사용되는 원심분리 프로토콜의 일부를 예시한다. LAI 조성물은 100% L, 1% A, 및 0.10% I를 포함하였다.

[표 2A]

아래 표 2B는 본 발명의 대상의 PSS를 사용하여 골수 흡인물로부터 BMAF를 분리하는데 사용되는 원심분리 프로토콜의 일부를 예시한다.

[표 2B]

가장 바람직한 실시형태에서, PSS는 전혈 및 골수 흡인물 중의 적어도 하나와 유동 가능하며, (a) 단계(215)에 따라 PRP 분획의 평균 밀도 내지 비-PRP 분획의 평균 밀도 사이, 및 (b) BMAF의 평균 밀도 내지 비-BMAF 분획의 평균 밀도 사이 중의 적어도 하나인 밀도를 가질 것이다.

목적하는 초기 밀도를 달성하기 위해, 분리기 물질의 밀도는 분자 조성에 의해, 또는 적당한 충전제 물질(예, 실리카, 라텍스, 또는 기타 불활성 물질)의 포함에 의해 조절될 수 있음이 고려된다. PSS의 밀도를 조절하는 것은 원심분리를 통해 상이한 유형의 세포(예, 혈소판, 줄기 세포, RBCs, WBCs)를 분리하는데 바람직할 수 있다. 예를 들면, Ebecryl 113을 포함하여, 모든 상업적으로 적합한 밀도 조절제가 고려된다.

추가로 또는 대안적으로, 단계(218)에 따르면 적합한 프로토콜 하에서의 원심분리는 혈소판의 상당한 활성화 없이 PSS가 두 개의 분획, 예를 들면, PRP 분획 및 비-PRP 분획 사이를 유동하도록 할 수 있다. PSS가 상이한 체액의 샘플의 분리를 위해 또는 PRP 및 비-PRP 분획 이외의 분획으로의 전혈의 샘플의 분리를 위해 사용되는 경우, PSS는 분리하고자 하는 제1 분획의 평균 밀도와 분리하고자 하는 제2 분획의 평균 밀도 사이의 밀도를 가질 수 있는 것으로 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, PSS가 혈소판의 상당한 활성화 없이 샘플의 두 분획 사이에 유동하도록 하는 제1 원심분리 프로토콜을 사용한 원심분리는 혈소판이 PSS가 사용되지 않는 경우(예, 어떠한 분리기 물질 없이) 제1 원심분리 프로토콜로서 달리 동일한 원심분리 프로토콜 동안 혈소판에 의해 보유되는 것의 15% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내로 기능을 보유함을 의미한다. 혈소판의 상당한 활성화는, 다른 것들 중에서도, PRP 분획, 비-PRP 분획, 또는 이들 둘 다 중의 혈소판이 리스토세틴 및 콜라겐 중의 적어도 하나에 응집되는 능력에 기초하여 측정 가능하다.

방법(200)은 또한 PSS를 혈소판의 상당한 활성화 없이 경화시켜 분획들, 예를 들면, PRP 분획 및 비-PRP 분획 사이에 고체 차단막을 형성하는 단계(220)를 포함한다. 분리기 물질의 제형에 따라, 중합의 방식 또는 메카니즘이 상당히 변할 수 있는 것으로 고려된다. 본원의 논의가 주로 UV 에너지 중합에 관한 것이기는 하지만, 모든 공지된 중합 방법이 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들면, 고려되는 중합은 다양한 라디칼 또는 양이온 중합(예, 광불안정 화합물, 라디칼 스타터 등을 사용함), 축합 중합, 에스테르화, 아미드 형성 등을 포함한다. 반응성 그룹은 산 그룹, 가장 바람직하게는 모노- 및 디카복실산 그룹), 공액 디엔 그룹, 방향족 비닐 그룹, 및 알킬(메트)아크릴레이트를 포함할 수 있다. 중합은 유리하게는 분리기 물질의 단량체 또는 올리고머의 반응성 그룹에 의해 충분히 지지될 수 있지만 라디칼 스타터를 포함한 추가의 시약들이 또한 적합할 수 있다.

경화 단계는 유리하게는 수집관에 대해 정지된 PRP 분획 및 비-PRP 분획(또는 기타의 분리된 분획) 사이에 고체 차단막을 형성할 수 있다. 또 다른 관점에서 볼 때, 관을 수동으로 흔드는 경우, 분리된 분획을 재균질화하기 위해 관을 원심분리하는 경우, 또는 분리된 분획을 피펫, 이동 장치 또는 경사여과를 통해 제거하는 경우, 관 내에 이의 위치로부터 벗어나지 않는 고체 차단막이 형성될 수 있다. 추가로, 단계(222)에 나타낸 바와 같이 고체 차단막은 교반시 분리된 분획의 혼합을 방지하는 정도로 불투과성일 수 있다. 단계(225)에 따르면 고체 차단막의 PSS는 전혈과 유동 가능한 경우 PSS의 평균 분자량보다 큰 평균 분자량을 가질 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 중합 가능한 분리기 물질을 혈소판의 상당한 활성화 없이 경화시킨다는 것은, 혈소판이 PSS이 사용되지 않는 경우 및 경화 단계가 없는 경우 혈소판에 의해 유지되는 바의 15% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내로 기능을 유지함을 의미한다.

고체 차단막은 유리하게는 분획을 재혼합하지 않고서(예, PRP 분획을 비-PRP 분획과 재혼합하지 않고서) 수집관로부터 PRP 또는 다른 분리된 분획의 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100%를 제거하는 단계를 가능하게 한다. 이것은 수집관으로부터 PRP 분획을 그대로 제거함으로써(예, 쏟아 붓기, 피펫팅 등에 의해), 또는 전체 PRP 분획을 제거하는데 도움을 주기 위해 염수 또는 기타의 유체를 관에 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 이것은 아래 기재된 바와 같이 본 발명의 대상의 이동 장치를 사용하여 달성될 수 있다.

방법(200)은 경화 단계 후, PRP 또는 기타의 목적하는 분리된 분획을 이로부터 취한 상이한 분취액이 사용된 세포 계수법의 1 변동 계수 내에 있는 혈소판 수를 갖도록 균질화시키는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 이것은 재현성 및 균질성을 제공하는데 매우 유리할 수 있다. PRP 분획의 균질화는, 예를 들면, 기계적 교반, 버블 교반, 관을 뒤집어 놓거나 달리 교반함, 또는 입구가 넓은 피펫을 통한 분말화(triturating)를 포함하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

혈소판 회수

화장품 및 건강 산업에서, 혈액 샘플의 200-250%의 혈소판 농도를 갖는 PRP이 최적인 것으로 밝혀졌다. 원심분리 동안 세포 보존을 유지하면서 정제되거나 농축된 혈소판 또는 기타 바람직한 성분들을 수득하는 것이 또한 바람직하다. 생존 가능한 혈소판 수의 증가가 치료 용도를 위해 바람직할 것이며, 이것은 아마도 다른 바람직한 세포에 대한 증가된 수와 상관성이 있을 것이다.

전혈의 분획을 회수하기 위해 이전에 사용된 수집관(예, 분리기 물질을 갖지 않는 핌플 톱 BD 진공채혈기)은 혈청 분획 상청액, 중간 연층, 및 연층 아래의 적혈구 분획을 야기하기 위해 혈액을 원심분리함을 수반한다. 이러한 관 및 방법은 연막으로부터 백혈구를 제거하지 않으면서 상청액을 제거하기가 매우 어렵거나 심지어 불가능하다. 다른 한편으로, 겔이 사용되는 경우, 결과는 원심분리 프로토콜에 따라 PRP 또는 혈청 분획, 그 다음 중간 겔 층, 그 다음 연막, 및 맨아래 RBC 분획이다. 다시, PRP 또는 혈청을 갖는 겔을 흡인하지 않고서 PRP 또는 혈청 분획의 전체를 제거하는 것은 불가능하지는 않지만 매우 어렵다. 그리고, 어느 경우든, PRP 분획에서 혈소판의 편재가 상당하다.

본 발명의 대상의 PSS 및 방법은 유리하게는 다양한 농도(200-250% 범위 포함)로 혈소판을 회수할 수 있고, 또한 PRP 상청액의 전부를 사용할 수 있다. 아래 표 3은 LAI 또는 LAIR을 사용한 혈소판 수율이 적어도 대조군을 사용한 경우나 다름없음을 예시한다. 표 3은 또한 동일한 적혈구 고갈이 대조군을 사용하는 경우만큼 LAI 또는 LAIR을 사용하여 달성될 수 있음을 예시한다.

[표 3]

아래 표 4는 LAI 또는 LAIE를 사용한 혈소판 수율이 적어도 대조군을 사용한 경우나 다름없음을 예시한다. 표 4는 또한 동일하거나 유사한 백혈구 고갈이 대조군을 사용하는 경우만큼 LAI 또는 LAIE를 사용하여 달성될 수 있음을 예시한다.

시험된 조성물(LAI 및 LAIE)은 다음으로 구성된다:

LAI의 매뉴얼 차이는 다음과 같았다: 8% 호중구, 80% 림프구, 10% 단핵구, 2% 호산구; LAIE의 매뉴얼 차이는 다음과 같았다: 5% 호중구, 89% 림프구, 5% 단핵구, 1% 호산구.

[표 4]

표 5는 다음과 같은 원심분리 프로토콜 하에서의 혈소판 수율 및 백혈구 고갈을 보여준다: 24℃에서 10분 동안 1000 RPM. 혈소판 수율은 약간 증가하였고 백혈구/적혈구 고갈은 비슷하였다.

시험된 조성물(LAI 및 LAIE)은 다음으로 구성된다:

실험은 나트륨 시트레이트 관에서 수행하였다.

[표 5]

균질한 PRP 분획의 회수

본 발명의 대상의 PSS는 실질적으로 균질한 BMAF, PRP, 또는 다른 분획의 제조를 가능하게 한다는 추가의 장점을 제공한다. 본 출원인은 무세포 DNA의 회수를 3가지 관 타입에서 비교하였으며 비혼합 표본으로부터 취한 분취액이 가변적인 결과를 초래한다는 것을 알아내었다. 다른 관점에서 볼 때, 사용자가 혼합 없이 비-겔 관으로부터 혈장을 분취한다면, 분취액이 매우 가변적일 것이다. 사용자가 관으로부터 혈장을 분취하여 이것을 관 바깥에서 혼합한다면, 결과는 매우 재현성이 있지만 회수는 불량하다.

시험된 3가지 관 타입은 다음과 같다: 대조군("겔 없음"), LAI 포토겔을 갖는 관 및 LAIT 포토겔을 갖는 관, 여기서 L= 올리고머, A=additol BDK 광개시제, 1= 페노티아진 안정화제, 및 T=템포 니트록시드. 도 3은 대조군, LAI를 갖는 관, 및 LAIT를 갖는 관의 "Ct"(사이클 역치)를 보여준다. 대조군과 비교하여 LAI 및 LAIT의 보다 낮은 Ct는 대조군과 비교하여 보다 양호한 회수를 가리킨다. 도 5는 또한 LAI 및 LAIT를 사용한 결과가 대조군과 유사하게 재현성이 있음을 보여준다. 각 관 타입에 대해 N=4.

사용되는 프로토콜은 다음과 같다: 혼주된 혈액을 혼합하고 피펫으로 9개의 관 각각에 부하하였다. 포토겔 관을 LAI 또는 LAIT 중의 어느 하나로 미리 부하하였다. 모든 관을 실온에서 10분 동안 3000 RPM에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 포토겔 관을 라이트 박스에서 1분 동안 UV 광에 노출시켰다. 각 관으로부터 혈장을 빼내고, 고화된 차단막을 포함하는 관의 경우, 모든 혈장을 빼냈다. 겔이 없는 대조군 관의 경우, 약간의 혈장(대략 100 uL)을 남겨 두는 것을 필요로 하는 세포 층을 파괴하지 않도록 주의하였다. DNA-Braf 분석을 위해 혈장을 분자 병리학 랩에 보냈다. 거기서, 네 개의 관에 세 개의 샘플 각각을 분취하였다. 따라서 나타낸 가변성은 각 관으로부터의 혈장을 세 가지 방식으로 나누는 방법을 포함한다.

겔이 없는 EDTA 관으로부터 수득된 혈장을 상부 층, 바닥 (세포 부근) 층, 및 중간부에서 수동으로 샘플링하였다. 혈장을 보텍스로 혼합하고 다시 샘플링하였다("혼합"). 아래 나타낸 용융 곡선은 회수된 cfDNA가 수동 샘플링에 따라 변함을 입증한다. 무세포 DNA가 혈소판 회수에 대한 대리 마커로서 사용되었다.

도 4에 나타낸 예에서, 비혼합 혈장의 바닥 층으로부터 취한 분취액은 중심부 또는 혼합된 상부로부터 취한 분취액보다 더 많은 cfDNA를 가졌다(더 깊은 트로프는 더 큰 회수를 나타낸다).

본원에 기재된 방법이 경화되어 고체 차단막을 형성하는 PSS의 사용을 포함하기 때문에, PRP 분획을 이것이 수득되거나 분리되는 수집관 내부에서 혼합할 수 있으며, 이것은 수집관의 바깥 환경에 노출시키지 않으면서 수집관에서 PRP 분획을 균질화시킬 수 있게 한다. PSS는, 관의 상이한 부분으로부터 수득된 양이 사용된 세포 계수법의 1 변동 계수(one coefficient of variation) 내에 있을 수 있기 때문에, 사용자가 균일하고 신뢰성있는 혈소판의 수를 수득할 수 있도록 한다는 것을 인지해야 한다.

혈소판 생존능

앞서 논의된 바와 같이, 출원인은 본 발명의 대상의 방법 및 PSS를 사용하여 유사한 또는 심지어 개선된 혈소판 회수를 달성할 수 있음을 입증할 수 있었다. 긴 중합체를 갖는 고체 차단막은, 종종 혈소판 회수를 개선시키지만, 혈소판 기능을 방해하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 아래 제공된 실험 및 데이터는 출원인의 방법 및 PSS가 혈소판의 생존능을 유지하면서 최적의 혈소판 회수를 가능하게 한다는 것을 보여준다.

혈소판 생존능은 Chrono-log 응집측정기 상에서 특정 효능제에 대한 혈소판 응집을 관찰함으로써 시험하였다. PRP는 대조군 관(BD 나트륨 시트레이트 관, 겔 없음), LAI 관(LAI가 첨가된 BD 나트륨 시트레이트), 및 LAIE 관(LATE가 첨가된 BD 나트륨 시트레이트 관)에 부하된 전혈을 원심분리함으로써 수득하였다. 포토겔 관을 원심분리 후 UV 광에 노출시켜 차단막을 고화시켰다. PRP을 분취하고 혈소판이 거의 없는 혈장으로 Chrono-log 표준 작동 프로토콜에 의해 요구되는 혈소판 농도로 되도록 희석시켰다. 다음은 리스토세틴 및 콜라겐에 대한 혈소판 응집의 예시적인 곡선이다. 콜라겐은 응집, 혈소판 과립의 분비 및 트롬복산 합성을 유도하는 강력한 효능제이며, 따라서 이것이 혈소판 생존능에 대한 포괄적인 시험이다.

도 5에 예시된 바와 같이, 리스토세틴에 대한 응집에서의 유의적인 차이는 대조군, LAI 및 LAIE 간에 보이지 않았다.

도 6에 예시된 바와 같이, 대조군, LAI 또는 LAIE 곡선으로부터 콜라겐에 대한 혈소판의 혈소판 응집 곡선에서는 인지할 수 있는 차이가 보이지 않으며, 이것은 LAI 및 LAIE가 혈소판 기능성에 실질적으로 영향을 주지 않음을 나타낸다.

도 7은 전혈과 유동 가능하고 전혈의 PRP 분획의 평균 밀도와 비-PRP 분획의 평균 밀도 사이의 밀도를 갖는 PSS를 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플로부터 PRP 분획을 분리하는 또 다른 방법(700)을 예시한다.

방법(700)은 단계(710)에 나타낸 바와 같이 원심분리 프로토콜을 사용하여 PSS를 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플을 원심분리하는 단계를 포함한다. 방법(200)의 원심분리 단계와 유사하게, 단계(712)에 나타낸 바와 같이 적합한 원심분리 프로토콜을 사용한 원심분리는 PSS가 혈소판의 상당한 활성화 없이 PRP 분획과 비-PRP 분획 사이에 유동하도록 할 것이다. 단계(715)에 나타낸 바와 같이 상당한 활성화는 PRP 분획 중의 혈소판이 리스토세틴 및 콜라겐 중의 적어도 하나로 응집하는 능력에 기초하여 측정 가능하다.

방법(700)은 단계(720)에 나타낸 바와 같이 PRP 분획과 비-PRP 분획 사이에 고체 차단막을 형성하도록 혈소판의 상당한 활성화 없이 PSS를 경화시키는 단계를 추가로 포함한다. 단계(725)에 따르면 (예, 경화 단계 전에) 고체 차단막의 PSS는 전혈과 유동 가능한 경우 PSS의 평균 분자량보다 큰 평균 분자량을 가질 것이다.

몇몇 바람직한 방법에서, 고체 차단막은, UV 에너지에 노출 후, PRP 분획 아래 및 비-PRP 분획 위의 중간 위치에서 수집관에 대해 정지될 것이며, 단계(722)에 나타낸 바와 같이 교반시 PRP 분획과 비-PRP 분획의 혼합을 방지하는 정도로 불투과성일 것이다. 고체 차단막은 수집관으로부터 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100%의 PRP 분획을 제거할 수 있다. 또 다른 관점에서 볼 때, 방법(700)은 단계(730)에 따라 수집관으로부터 PRP 분획의 적어도 95%를 제거하는 임의 단계를 포함한다.

PRP 분획은 유리하게는 전혈의 샘플로부터 10% 이하의 백혈구를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, PRP 분획 중의 백혈구의 25% 이하가 과립구일 것으로 고려된다. 또 다른 관점에서 볼 때, 전혈에서 동일한 샘플 용적과 비교하여 WBC의 유의적인 감소(예, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만 또는 심지어 90% 미만), 과립구의 유의적인 감소(예, 50% 미만, 70% 미만, 80% 미만 또는 심지어 90% 미만)를 PRP 분획에서 발견할 수 있다.

방법(700)은 경화 단계 후 수집관에서 PRP 분획을 균질화시킴을 또한 포함할 수 있다. 균질화 단계는 경화 직후, 경화한지 1시간 내, 경화한지 1일 내, 경화한지 적어도 2일 후, 경화한지 적어도 5일 후, 또는 심지어 경화한지 적어도 1달 후에 수행할 수 있다. PRP 분획을 균질화하면, 이로부터 취한 상이한 분취액이 사용된 세포 계수법의 1 변동 계수 내에 있는 혈소판 수를 갖도록 실질적으로 균일한 PRP 분획이 야기된다.

도 8은 전혈과 유동 가능하고 전혈의 PRP 분획의 평균 밀도와 비-PRP 분획의 평균 밀도 사이의 밀도를 갖는 PSS를 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플로부터 PRP 분획을 분리하는 또 다른 방법(800)을 예시한다.

PRP 분획은 수득되거나 분리되는 전혈의 샘플의 혈소판 농도보다 큰 임의의 적합한 혈소판 농도를 가질 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들면, PRP 분획은 수득되는 샘플의 혈소판 농도의 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250% 또는 심지어 그 이상의 혈소판 농도를 포함할 수 있다. 또 다른 관점에서 볼 때, PRP 분획은 수득되는 샘플의 혈소판 농도의 180% 내지 260% 혈소판 농도 또는 200% 내지 250% 혈소판 농도를 포함할 수 있다.

방법(800)은 단계(810)에 나타낸 바와 같이 PSS를 포함하는 수집관에서 제1 원심분리 프로토콜 하에 전혈의 샘플을 원심분리하는 단계를 포함한다. 제1 프로토콜 하의 원심분리는 단계(812)에 나타낸 바와 같이 PSS가, 바람직하게는 혈소판의 상당한 활성화 없이 PRP 분획과 비-PRP 분획 사이에 유동하도록 할 수 있다.

방법(800)은 또한 단계(820)에 나타낸 바와 같이 PSS를 중합시키고 고체 차단막을 형성하기 위해, 원심분리 후, 수집관을 10분 미만의 기간 동안 UV 에너지에 노출시키는 단계를 포함한다. 고체 차단막의 PSS는 단계(822)에 나타낸 바와 같이 전혈의 샘플가 유동 가능한 경우 PSS의 평균 분자량보다 큰 평균 분자량을 가질 것이다.

방법(800)은 PRP 분획을 이로부터 취한 상이한 분취액이 사용된 세포 계수법의 1 변동 계수 내에 있는 혈소판 수를 갖도록 고체 차단막의 존재하에서 균질화시켜 실질적으로 균일한 PRP 분획을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 방법은 유리하게는 사용자가 PSS를 갖는 수집관에 포함된 샘플(예, 혈액)의 상이한 밀도의 분획을 분리할 수 있게 한다. 고체 차단막은 균질성 및 재현성 둘 다를 가능하게 하며, 출원인은 분획이 분리되는 관을 열 필요 없도록 어댑터를 제공함으로써 추가의 이점을 달성할 수 있음을 발견하였다.

일단 BMAF 또는 PRP 분획이 수집관에서 분리되면, 분획을 샘플의 멸균성을 유지하면서 분리/제조 관으로부터 다른 용기로 이동시키는 것이 유리할 것이다. 이것은, 예를 들면, 부상, 상처, 또는 기타 병태의 치료를 위한 PRP 점안액으로서의 분리된 분획의 가정용 사용을 가능하게 한다.

도 9a-9i는 분리된 물질(예, PRP, BMAF)을 제1 진공채혈기에서 제2 진공채혈기로 이동시키는데 사용하기 위해 고려되는 이동 장치(900)의 실시형태를 예시한다. 그러나, 이동 장치(900)는 임의의 물질을 임의의 상업적으로 적합한 제조 용기에서 임의의 상업적으로 적합한 사용자 용기로 이동시키는데 사용될 수 있음을 인지해야 한다. 하나의 비제한적인 예로서, 이동 장치(900)는 전혈의 PRP 분획을 진공채혈기에서 자가-밀봉 격막을 갖는 멸균 점안기 용기로 이동시키는데 사용될 수 있다.

이동 장치(900)는 기저 구조, 이동 니들, 및 벤트 니들(각각 902 및 904)을 적어도 부분적으로 에워싼 하우징을 포함한다. 하우징 및 기저 구조의 제1 부분은 서로 고정되어 연결되거나 부착될 수 있으며 적어도 부분적으로 제1 부분의 반대편에서 제1 내부 구획(910) 및 제2 내부 구획(920)을 정한다.

추가로 또는 대안적으로, 하우징 및 기저 구조의 제1 부분은 서로 이동 가능하게 또는 심지어 탈착 가능하게 연결될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 하우징 및 기저 구조의 제2 부분은 서로 고정되어 연결되거나 부착될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 하우징 및 기저 구조의 제2 부분은 서로 이동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들면, 기저 구조의 제2 부분은 하우징에 고정되어 연결된 기저의 제1 부분에 이동 가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 예로서, 기저 구조의 제2 부분은 하우징의 내벽에 이동 가능하게 연결될 수 있고, 기저 구조의 제1 부분은 하우징의 내벽에 고정되게 부착될 수 있다.

기저 구조의 일부가 이동가능한 경우, 제1 및 제2 내부 구획의 용적은 변하지 않는다는 것을 인지해야 한다. 대신, 상이한 기저 구조 부분이 가능한 최대로 나란히 정렬되는 경우 제1 및 제2 내부 구획은 기저 구조에 의해 분리된 구획으로 보아야 한다.

예시된 바와 같이, 제1 내부 구획(910)은 이동 니들(902)의 일부, 및 벤트 니들(904)의 일부를 포함할 수 있다. 제2 내부 구획(920)은 단지 이동 니들(902)의 일부를 포함한다. 벤트 니들(902)은 단지 기저 위로 뻗어 있고, 제1 내부 구획(910) 내에 배치된 관 만을 뚫도록 배열된다. 보다 구체적으로, 이동 니들(904)은 이동 장치 기저의 제1 부분을 통해 뻗어 있을 수 있고, 벤트 니들(902)은 이동 장치 기저의 제2 부분에 부착될 수 있다(그러나 이를 통해 뻗어 있는 것은 아님).

제2 벤트 니들을 포함하는 기저의 제2 부분은 하우징을 기준으로 하여 이동 가능할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 벤트 니들(902)은 하우징의 연신된 슬롯(925)을 통해 뻗어있는 벤트(930)에 연결될 수 있다. 벤트 니들(902)이 제조 관의 고무 마개를 천공하는 경우, 공기가 벤트(930)를 통해 벤트 니들(902)을 지나 제조 관으로 유동할 수 있다. 제1 내부 구획(910) 내에 배치되어 제조 관을 천공할 수 있는 벤트 니들(902)의 양은 연신된 슬롯(925)을 통한 벤트(930)의 위치, 및 하우징을 기준으로 한 기저의 제2 부분의 위치에 따라 변할 수 있다.

기저 구조의 제2 부분이 하우징에 이동 가능하게 연결되는 경우, 벤트가 기저의 제2 부분에 고정되어 연결될 수 있는 것으로 고려된다. 니들, 벤트, 및 기저 구조의 이동식 제2 부분이 하우징에 연결되면, 이동 니들이 이동 관(940)에 들어갈 때까지 벤트 니들(및 벤트를 통한 공기)이 제조 관(935)에 들어가지 못하게 보장할 수 있다.

기저 구조의 제2 부분이 하우징에 고정되어 연결된 경우, 벤트가 기저의 제2 부분에 이동 가능하게(예, 슬라이딩 가능하게) 연결될 수 있는 것으로 고려된다. 니들, 벤트, 및 기저 구조의 고정된 구획 부분을 하우징에 연결하면, 이동 니들이 이동 관(940)에 들어갈 때까지 벤트 니들이 제조 관(935)에 들어가지 못하게 보장할 수 있다. 사용자는 (하우징의 제1 및 제2 구획 내에서) 이동 니들로 제조 관 및 이동 관을 뚫은 다음 하우징의 제1 내부 구획(910) 쪽으로 벤트를 슬라이딩시켜 벤트 니들로 제조 관을 뚫을 수 있다.

추가로 또는 대안적으로, 기저 구조의 제2 부분 및 벤트 둘 다는 하우징을 기준으로 하여 이동 가능하다는 것을 인지해야 한다.

이동 장치(900)가 사용되는 경우, 벤트(930)는 바람직하게는 초기에 제2 내부 구획 쪽으로 슬롯의 하부 가장자리에 도 9e 및 9f에 나타낸 바와 같은 배열로 있을 것이다. 이러한 배열에서, 벤트(930)는 하우징의 제2 내부 부분에 가장 가까운 위치에서 슬롯 내에 배치된다. 이동시키고자 하는 샘플을 포함하는 제조 관(935)이 적어도 부분적으로 제1 내부 구획(910) 내에 위치하는 경우, 이동 니들이 이의 고무 격막을 뚫어, 벤트 니들이 관(935) 바깥에 있을 수 있다.

그후, 이동 니들이 관(940)(또는 다른 용기)의 자가-밀봉 격막을 뚫도록 멸균 이동 관(940)을 제2 내부 부분(920)에 부분적으로 삽입할 수 있다. 이동 니들이 관(940)에 들어감에 따라, 제2 니들이 관(935)의 격막을 뚫도록 벤트(930) 및 벤트 니들이 도 9d 및 9g에 나타낸 바와 같이 이동할 것으로 고려된다.

벤트 니들이 관(935)의 격막을 뚫음에 따라, 공기가 벤트(930)를 통해 관(935)에 들어가고, 도 9g, 9h 및 9i에 나타낸 바와 같이 관(935)으로부터의 PRP의 실질적으로 전부가 이동 니들을 통해 관(940)으로 이동한다.

도 10a-10d는 분리된 물질을 제1 용기에서 제2 용기로 이동시키는데 사용되는 본 발명의 대상의 또 다른 이동 장치의 단면도를 제공한다.

도 10a에서, 제조 용기(상부 용기)(1080)는 이동 장치의 제1 내부 구획(1050)에 거꾸로 배치된다. 제조 용기(1080)는 고무 마개(1089), 혈청 분획(1088), 공기(1086), 분리기 물질(1084), 및 세포 분획(1082)을 포함한다. 분리기 물질이 본 발명의 대상의 PSS인 경우, 제조 용기는 유리하게는 제자리를 벗어나거나 달리 이동하지 않고서 제1 내부 구획에 거꾸로 배치될 수 있음을 인지해야 한다.

장치(900)과 유사하게, 장치(1000)는 하우징(또는 안전 장막)(1010), 기저 구조, 제1 및 제2 내부 구획(각각 1050 및 1060)을 통해 뻗어 있는 이동 니들(1020), 및 벤트(1035)에 연결되어 기저 구조로부터 제1 내부 구획(1050)으로 뻗어 있는 이동 가능한 벤트 니들(1030)을 포함한다.

일단 제조 용기(1080)가 이동 니들(1020)에 의해 뚫려지면, 진공관(evacuated tube)(하부 용기)(1090)이 제2 내부 구획(1060) 내에 배치되어 이동 니들(1020)에 의해 뚫려질 수 있다.

도 10b는 제조 용기를 이동 니들로 뚫은 후, 그러나 제조 용기를 벤트 니들로 뚫기 전 이동 장치 내의 성분들의 가능한 위치를 예시한다. 이동 니들(1020)은 하우징에 구멍(1045)을 통해 삽입된 접착제로 기저 구조의 제1 부분 상에 제위치에서 유지된다.

벤트 니들(1030)은 바람직하게는 직각으로 벤트 니들로 뻗어 있는 벤트(1035)에 연결된다. 벤트(1035)는 기저 구조의 슬라이딩 또는 그 외의 이동 부분에 연결되고, 하우징의 슬롯(1040)을 통해 뻗어 있을 수 있다. 여기서, 벤트(1035)는 하우징의 제2 내부 부분(1060)에 가장 가까운 말단에서 슬롯(1040)을 통해 배치된다.

몇몇 바람직한 실시형태에서, 벤트가 하우징의 제2 내부 부분에 가장 가까운 슬롯의 말단에 배치되는 경우라도 이동 니들은 기저 구조의 슬라이딩 부분 보다는 제2 내부 부분으로 더욱 뻗어 있을 것이다. 이것은 PRP가 폐기되지 않도록 벤트 니들이 제조 용기를 뚫기 전에 이동 용기(하부 용기)(1090)가 뚫리도록 도울 수 있다. 오염을 방지하거나 추가의 안전성 및 멸균성을 제공하기 위해 니들 중의 하나 또는 둘 다의 노출된 말단부를 덮도록 고무 또는 기타 슬리브(예, 1022, 1032, 및 1024)가 포함될 수 있다.

도 10c에서, 제조 용기(1080)는 하우징의 제1 내부 부분(1050)에서 이동 니들(1020)에 의해 뚫리며, 벤트 니들(1030)은 전적으로 제조 용기(1080)의 바깥에 위치한다. 도 10d에서, 이동 용기(1090)는 하우징의 제2 내부 부분(1060)에서 이동 니들(1020)에 의해 뚫리며, 제1 내부 부분(1050) 쪽으로 움직한다. 이동 용기(1090)가 제1 내부 부분(1050) 쪽으로 움직이면서, 기저의 이동 부분, 벤트(1035) 및 벤트 니들(1030) 또한 제1 내부 부분(1050) 쪽을 움직인다. 벤트 니들(1030)이 제조 용기(1080)를 뚫어서, 공기가 제조 관(1080)으로 들어오고 혈청(1088)이 이동 용기(1090)로 밀려 들어간다.

도 11a-11b는 유체를 제조 용기에서 다른 용기로 이동시키는데 사용되는 대안적인 이동 장치(1100)를 제공한다.

도 11a에서, 이동 장치(1100)는 각각이 하우징(1110)의 제1 및 제2 내부 구획으로 뻗어 있는 혈청 이동 니들(1120) 및 공기 이동 니들(1130)을 포함한다. 혈청 이동 니들(1120) 및 공기 이동 니들(1130) 말단 둘 다가 관 둘 다에서 있도록, 제조 관(1180)은 적어도 부분적으로 이동 장치(1120)의 한쪽 말단에 배치되고, 진공관(1190) 또는 점안기는 적어도 부분적으로 이동 장치(1120)의 또 다른 말단에 배치된다. 제1 내부 구획 내에 배치된 공기 이동 니들의 말단은 바람직하게는 제조 관(1180)에서 혈청(1150)보다 높은 수준으로 삽입될 것이다. 연동 또는 기타 펌프(1140)가 공기를 공기 이동 니들(1130)을 통해 진공관(1090)에서 제조 관(1080)으로 이동시키도록 작동할 수 있다. 진공관으로부터 제거된 공기의 이러한 용적 X가 진공관(1190)에 진공을 생성하고 동일한 용적 X의 혈청(1150)이 혈청 이동 니들(1120)을 통해 제조 관(1180)에서 진공관(1190)으로 빨려 들어갈 수 있다. 도 11b는 용적 X의 혈청이 어떻게 진공관으로 이동하는지를 보여준다.

도 12a-12b는 하우징(1210)을 포함하는 본 발명의 대상의 또 다른 이동 장치(1200)를 제공한다. 이동 장치는 도 11a-11b의 장치와 유사하다. 그러나, 가요성 관(1240)과 함께 핀칭 장치(1250)가 펌프 대신에 사용된다. 핀칭 장치는 용적 Y의 공기를 제조 관(1280)으로 이동시키는 동시에 동일 용적 Y의 공기를 진공 관(1290)으로부터 빨아들일 수 있다. 제조 관에서의 이러한 여분의 공기 및 진공 관에서의 보다 적은 양의 공기로 인해 동일한 용적 Y의 혈청(1285)이 혈청 이동 니들(1220)을 통해 제조 관에서 진공 관으로 이동할 수 있다.

공기를 제조 관으로 이동시키기 위해 도 12a 및 12b에 예시된 메카니즘은 가요성 관을 핀칭시키고, 관을 가로질러 손잡이(1260)로 이동할 수 있는 핀칭기이다. 손잡이(1260)와 핀칭기(1250)가 사용자에 의해 이동될 수 있게 하는 슬롯(1270)이 이동 장치(1200)의 하우징(1210)에 제공될 수 있다. 핀칭기(1250)가 하우징의 제1 내부 구획 쪽으로 이동함에 따라, 이것이 용적 Y의 공기를 공기 이동 니들(1230)을 통해 혈청(1285) 위의 제조 관으로 밀어 올리는 작용을 한다. 동시에, 핀칭기가 이동함에 따라, 진공관으로부터의 공기가 가요성 튜브(1240)로 빨려 들어가도록 진공 관 또는 점안기에 진공이 생성된다. 도 12b는 용적 X의 혈청(1285)이 어떻게 진공 관(1290)으로 이동될 수 있는지를 보여준다.

하우징의 슬롯을 통해 뻗어있는 벤트가, 사용자가 벤트 니들을 원하는 대로 쉽고 적절하게 위치시킬 수 있도록 하는데 있어서 유리할 수는 있지만, 이러한 벤트는 실수로 제조 관 쪽으로 이동될 수 있어, 이동 니들이 이동 관을 천공하기 전에 벤트 니들이 제조 관을 천공할 수 있다. 이동 장치의 다양한 사용을 위해, 특히 장치가 일회용의 한번 사용이 가능한 장치인 경우, 의도하지 않은 조정의 위험을 감소시키거나 없애기 위해 장치의 모든 성분들을 외부 하우징 내에 배치하는 것이 유리할 것이다.

도 13a-c는 공기가 제조 관으로 유동하도록 하는 벤트를 포함하는, 모든 성분들이 하우징 내에 배치된 몇가지 예시적인 이동 장치를 예시한다.

도 13a에서, 이동 장치(1300A)는 두 개의 개방 말단을 포함하는 하우징(1310A)을 포함하고, 이동 니들(1320A), 벤트 니들(l330A), 벤트(1350A), 이동 니들 (1320A)과 연결된 제1 기저 부분, 및 이동 가능한 제2 기저 부분(1340A)을 수용한다. 예시된 바와 같이, 어떠한 장치 성분도 하우징 벽으로부터 뻗어나가지 않는다. 대신, 공기는 이동 관이 배치되는 제2 내부 부분을 통해 벤트, 벤트 니들, 및 제조 관(1360A)에 들어갈 수 있다.

도 13b에서, 이동 장치(1300B)는 두 개의 개방 말단을 포함하는 하우징(1310B)을 포함하고, 이동 니들(1320B), 벤트 니들(l330B), 벤트(1350B), 이동 니들(1320B)와 연결된 제1 기저 부분, 및 벤트(1350B)가 적어도 부분적으로 벤트 니들(1330B)과 일직선으로 이를 통해 뻗어있는 이동 가능한 제2 기저 부분(1340B)을 수용한다. 벤트 니들(1330B)을 제조 관(1360B)에 원하는 지점으로 밀어 넣기에 적합한 길이를 포함할 수 있음을 인지해야 한다. 벤트(1350B)는 기저 부분(1340B)을 통해 비스듬하게, 예를 들면, 제2 내부 부분 쪽으로 뻗어 나간 다음 이동 니들로부터 밖으로 뻗어 나갈 수 있음을 또한 인지해야 한다. 예시된 바와 같이, 어떠한 장치 성분도 하우징 벽으로부터 뻗어나가지 않는다. 대신, 공기는 이동 관이 배치되는 제2 내부 부분을 통해 벤트, 벤트 니들, 및 제조 관(1360A)에 들어갈 수 있다.

도 13c에서, 이동 장치(1300C)는 두 개의 개방 말단을 포함하는 하우징(1310C)을 포함하고, 이동 니들(1320C), 벤트 니들(1330C), 벤트(1350C), 이동 니들(1320C)과 연결된 제1 기저 부분, 및 이동 가능한 제2 기저 부분(1340C)을 수용한다. 예시된 바와 같이, 어떠한 장치 성분도 하우징 벽으로부터 뻗어나가지 않는다. 대신, 공기는 하우징(1310C)에 천공을 통해 벤트, 벤트 니들, 및 제조 관(1360C)에 들어갈 수 있다.

적합한 이동 장치가 다양한 구성을 가질 수 있음을 인지해야 한다. 몇가지 바람직한 이동 장치는 제조 관과 이동 관을 동시에 천공하도록 배열된 이동 니들, 및 제조 관을 천공하도록 이동 가능한 벤트 니들을 포함하며, 여기서 벤트 니들이 벤트에 연결되고 이를 통해 공기가 제조 관에 들어갈 수 있다. 벤트는 전적으로 하우징 내에 배치될 수 있거나, 슬롯 또는 다른 구멍을 통해 하우징으로부터 뻗어 나갈 수 있다.

본원에 기재된 이동 장치 중의 어느 것은 하나 이상의 필터를 포함할 수 있으며, 이것은 벤트, 벤트 니들, 이동 니들, 하우징 개구부(예, 개방 말단, 슬롯, 또는 구멍) 또는 장치의 임의의 다른 부분(들) 상에 또는 인접에 위치할 수 있다. 고려되는 필터는 (a) (예, 장치가 기울어져 있는 경우) 누출 방지, (b) 장치(예, 벤트, 벤트 니들) 또는 제조 관에 들어오는 공기 살균 중의 적어도 하나일 수 있다. 적어도 몇몇 실시형태에서, 필터는 소수성일 수 있다. 멸균 이동이 바람직한 경우에, 공기 살균용 필터가 특히 바람직하다.

도 14는 이동 장치(1400)를 예시하며, 이것은 사용자가 벤트(1410)를 목적하는 위치로 접근 및 이동시킬 수 있게 하는 덮개를 포함한다. 덮개(1420)는 사용자가 덮개(1420)를 하우징 리세스(1430) 쪽으로 슬라이딩시킬 수 있게 하는 탭(tab)을 포함한다. 덮개(1420)가 슬라이딩 도어로서 나타내어져 있지만, 어떠한 적합한 이동 가능한 덮개라도 고려됨을 인지해야 한다. 추가로 또는 대안적으로, 덮개(1420)는 고정되지만, 사용자가 벤트(1410)의 위치를 볼 수 있도록 투명할 수 있다.

유체를 하나의 밀봉된 용기에서 다른 용기로 이동시킬 수 있는 기타 다양한 이동 장치가 고려됨을 인지해야 한다. 전형적으로, 제조 관이 상업적으로 적합한 이동 장치의 한쪽 말단에 배치되고 진공 관 또는 점안기가 이동 장치의 다른쪽 말단에 배치되는 경우, 상당한 용적의 유체가 중력 만을 통해서는 제조 관에서 진공 관으로 이동하지 못할 것 같다. 진공 관이 진공 밀봉되고 시스템이 자연적으로 평형에 도달하기를 원하지만, 제조 관으로부터의 혈청의 이동이 제조 관에 진공을 생성한다. 충분한 혈청이 진공 관을 통과할 수 있기 전에 이러한 두 개의 진공이 명백히 서로에 대해 작동하여 평형에 도달한다. 따라서, 제조 관에서 생성된 진공을 해제시키거나 진공 관에 더 강한 진공을 생성하는 것이 유리하다. 상기 설명은 이것이 달성될 수 있는 몇가지 방식을 예시한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 용어 "에 연결된(coupled to)"은 직접 연결(여기서, 서로 연결된 두 개의 요소들이 서로 접촉함) 및 간접 연결(여기서, 적어도 하나의 추가의 요소가 두 개의 요소 사이에 위치함) 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "에 연결된(coupled to)" 및 "와 연결된(coupled with)"은 동의어로 사용된다.

본원에 개시된 발명의 대안적인 요소들 또는 실시형태들의 그룹이 제한으로서 해석되어서는 안된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와 함께 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 이러한 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 명세서는 첨부된 청구항에서 사용된 모든 마쿠쉬(azrkush) 그룹의 상세한 설명을 충족하기 위하여 변형된 것처럼, 그룹을 함유하는 것으로 본원에서 간주된다.

본원에서 본 발명의 개념을 벗어나지 않으면서 이미 기재된 것 외에 더 많은 개질이 가능하다는 것이 당업계의 숙련가들에게 자명해야 한다. 따라서, 본 발명의 대상는 첨부된 청구항의 취지를 제외하고는 제한되지 않는다. 더욱이, 명세서 및 청구항 둘 다를 해석하는데 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가장 광범위하게 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 요소들, 성분들, 또는 단계들을 비배타적 방식으로 나타내는 것으로 해석되어야 하며, 이것은 인용된 요소들, 성분들, 또는 단계들이 명백히 인용되지 않은 다른 요소들, 성분들, 또는 단계들에 존재하거나 이용되거나 조합될 수 있음을 나타낸다. 명세서 청구항이 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들 중의 적어도 하나를 나타내는 경우, 문맥은 A + N, 또는 B + N 등이 아니라 그룹으로부터 단지 하나의 요소를 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

중합 가능한 분리기 물질(여기서, 중합 가능한 분리기 물질은 올리고머, 광개시제, 및 안정화제를 포함하고, 전혈과 유동 가능하고, 제1 평균 분자량을 가지며, PRP 분획의 평균 밀도와 비-PRP 분획의 평균 밀도 사이의 밀도를 갖는다)을 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플로부터 PRP 분획을 분리하는 방법으로서,
원심분리 프로토콜을 사용하여, 중합 가능한 분리기 물질을 포함하는 수집관에서 전혈의 샘플을 원심분리하는 단계;
(여기서, 원심분리 프로토콜을 사용한 원심분리는 중합 가능한 분리기 물질이 PRP 분획에서 혈소판의 상당한 활성화 없이 PRP 분획과 비-PRP 분획 사이를 유동할 수 있게 하고, 상당한 활성화는 PRP 분획 중의 혈소판이 리스토세틴 및 콜라겐 중의 적어도 하나에 응집하는 능력에 기초하여 측정 가능하다);
상기 분리기 물질을, UV 에너지에의 노출을 통해, 혈소판의 상당한 활성화 없이 경화시켜 고체 차단막을 형성하는 단계로서, 고체 차단막의 중합 가능한 분리기 물질은 제1 평균 분자량보다 큰 제2 평균 분자량을 갖는, 단계; 및
(여기서, 고체 차단막은, UV 에너지에의 노출 후, 수집관에 대해 정지되며 수집관으로부터 PRP 분획의 적어도 95%를 제거하도록 PRP 분획 아래 및 비-PRP 분획 위의 중간 위치에 있다)
를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 PRP 분획이 전혈의 샘플로부터 10% 이하의 백혈구를 포함하고, 상기 PRP 분획 중의 백혈구의 25% 이하가 과립구인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 경화 단계 이후 적어도 1일 후에 상기 수집관에서 상기 PRP 분획을 균질화시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 PRP 분획의 균질화 단계가, 이로부터 취한 상이한 분취액이 사용된 세포 계수법의 1 변동 계수 (one coefficient of variation)내에 있는 혈소판 수를 갖도록 실질적으로 균일한 PRP 분획을 야기하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 PRP 분획이 상기 전혈의 샘플의 혈소판 농도의 적어도 200%인 혈소판 농도를 갖는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 PRP 분획이 상기 전혈의 샘플의 혈소판 농도의 180%(포함) 내지 260%(포함)인 혈소판 농도를 갖는, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 PRP 분획이 상기 전혈의 샘플의 혈소판 농도의 200%(포함) 내지 250%(포함)인 혈소판 농도를 갖는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 분리기 물질이 올리고머, 광개시제 및 안정화제를 포함하고, 상기 광개시제가 5% 미만의 농도도 존재하며, 상기 안정화제가 0.5 wt% 미만의 농도로 존재하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 수집관이 튜브 캡(tube cap)을 포함하고,
상기 캡의 적어도 일부를 뚫고 상기 수집관에서 PRP 분획과 접촉하도록 하는 크기 및 치수의 니들을 포함하는 어댑터를 제공하는 단계를 추가로 포함하며;
여기서, 상기 니들이 유체 분배기에 유동적으로 연결되고;
상기 니들이 상기 수집관에 적어도 부분적으로 있는 경우 상기 유체 분배기가 수집관의 바깥에 있으며;
상기 유체 분배기가 점안기로서 배열되고 PRP 분획의 멸균되고, 조절된 점적식 분배를 가능하게 하는 메카니즘을 포함하는, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 유체 분배기가 작은 튜브 및 진공 벌브를 포함하고, 한번에 단일 방울(single drop)로 제1 말단으로부터 PRP 분획을 채취하고 제2 말단으로부터 PRP 분획을 방출하도록 구성되는, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 메카니즘이 적어도 제1 일방향 밸브를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 수집관이 튜브 캡을 포함하고, PRP 분획을 이동시키기 위해 어댑터를 사용하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 어댑터가
제1 내부 구획, 제2 내부 구획, 및 제1 및 제2 개방 말단 사이에 배치된 기저 구조를 갖는 하우징;
(여기서, 기저 구조는 하우징의 내부면에 고정되어 연결된 제1 기저 부분, 및 하우징의 내부면에 이동 가능하게 연결된 제2 기저 부분을 포함한다);
제1 기저 부분에서 제1 내부 구획으로 뻗어 있는 제1 니들 부분;
제1 기저 부분에서 제2 내부 구획으로 뻗어 있는 제2 니들 부분;
제2 기저 부분에서 제1 내부 구획으로 뻗어 있는 제3 니들 부분; 및
상기 하우징을 통해 뻗어 나와 제3 니들 부분에 연결되는 벤트
를 포함하는, 방법.
이동 장치로서,
하우징 내에 배치된 제1 니들, 제2 니들, 및 기저 구조를 포함하고;
여기서, 상기 하우징이 제1 및 제2 개방 말단을 갖고, 상기 기저의 반대 말단에 제1 및 제2 내부 구획을 포함하며;
제1 니들이 상기 기저 구조의 제1 부분에 고정되고, 상기 하우징의 제1 내부 구획 내에 위치한 제1 말단, 및 상기 하우징의 제2 내부 구획 내에 위치한 제2 말단을 포함하며;
제2 니들이 상기 기저 구조의 제2 부분에 연결되고, 상기 하우징의 제1 구획 내에 위치한 제1 말단, 및 벤트 구조에 연결된 제2 말단을 포함하며;
상기 제2 니들이 상기 하우징의 제1 개방 말단을 기준으로 한 제1 말단의 위치가 조정 가능하도록 제1 위치에서 제2 위치로 이동 가능한, 이동 장치.
청구항 12에 있어서, 상기 제2 말단이 비스듬하게 상기 벤트 구조에 연결되는, 장치.
청구항 12에 있어서, 상기 기저 구조의 제2 부분은 이동 가능하고, 상기 제2 니들은 상기 기저 구조의 제2 부분에 고정되는, 장치.
청구항 12에 있어서, 상기 벤트가 전체적으로 상기 하우징 내에 제1 및 제2 개방 말단 사이에 배치되는, 장치.
청구항 12에 있어서, 상기 하우징의 제1 및 제2 개방 말단 중의 적어도 하나가 막에 의해 덮혀 있는, 장치.
이동 장치로서,
제1 내부 구획, 제2 내부 구획, 및 제1 및 제2 개방 말단 사이에 배치된 기저 구조를 갖는 하우징;
(여기서, 기저 구조는 하우징의 내부면에 고정되어 연결된 제1 기저 부분, 및 하우징의 내부면에 이동 가능하게 연결된 제2 기저 부분을 포함한다);
제1 기저 부분에서 제1 내부 구획으로 뻗어 있는 제1 니들 부분;
제1 기저 부분에서 제2 내부 구획으로 뻗어 있는 제2 니들 부분;
제2 기저 부분에서 제1 내부 구획으로 뻗어 있는 제3 니들 부분; 및
상기 하우징의 벽을 통해 뻗어 나와 제3 니들 부분에 연결되는 벤트
를 포함하는, 이동 장치.
청구항 17에 있어서, 상기 제3 니들 부분이 상기 제2 기저로부터 뻗어 있는 유일한 니들 부분이고, 상기 제3 니들 부분이 상기 제2 내부 구획으로 뻗어 있지 않은, 이동 장치.
이동 장치로서,
제1 내부 구획, 제2 내부 구획, 및 제1 및 제2 개방 말단 사이에 배치된 기저 구조를 갖는 하우징;
기저 부분에서 제1 내부 구획으로 뻗어 있는 제1 니들 부분;
기저 부분에서 제2 내부 구획으로 뻗어 있는 제2 니들 부분;
기저 부분에서 제1 내부 구획으로 뻗어 있는 제3 니들 부분;
상기 하우징에 슬라이딩 가능하게 연결되는 벤트; 및
(여기서, 벤트는 제3 니들 부분에 유동적으로 연결된다)
를 포함하는, 이동 장치.
중합 가능한 분리기 물질을 포함하는 수집관에서 골수 흡인물로부터 골수 흡인물 분획(BMAF)(여기서, 골수 흡인물은 초기 혈소판 농도 X를 갖고, 중합 가능한 분리기 물질은 올리고머, 광개시제, 및 안정화제를 포함하고, 골수 흡인물과 유동 가능하며, 제1 평균 분자량을 갖고, BMAF 분획의 평균 밀도와 비-BMAF 분획의 평균 밀도 사이의 밀도를 갖는다)을 분리하는 방법으로서,
원심분리 프로토콜을 사용하여, 중합 가능한 분리기 물질을 포함하는 수집관에서 골수 흡인물을 원심분리하는 단계;
(여기서, 원심분리 프로토콜을 사용한 원심분리는 중합 가능한 분리기 물질이 BMAF 분획과 비-BMAF 분획 사이를 유동할 수 있게 한다);
상기 분리기 물질을, UV 에너지에의 노출을 통해 경화시키는 단계로서, 고체 차단막의 중합 가능한 분리기 물질은 제1 평균 분자량보다 큰 제2 평균 분자량을 갖는, 단계;
(여기서, 고체 차단막은, UV 에너지에의 노출 후, 수집관에 대해 정지되며 수집관으로부터 BMAF 분획의 적어도 95%를 제거하도록 BMAF 분획 아래 및 비-BMAF 분획 위의 중간 위치에 있고;
여기서, BMAF는 적어도 1.1X의 혈소판 농도를 갖는다)
를 포함하여, 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 골수 흡인물이 초기 생존 가능한 혈소판 농도 Y 를 갖고, BMAF가 적어도 1.1Y의 생존 가능한 혈소판 농도를 갖는, 방법.