ES2880024T3

ES2880024T3 - Métodos y dispositivos de separación y extracción de células de plasma rico en plaquetas y aspirado de médula ósea

Info

Publication number: ES2880024T3
Application number: ES16769195T
Authority: ES
Inventors: Jane F Emerson
Original assignee: University of California; University of Southern California USC
Current assignee: University of California; University of Southern California USC
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: PL3047864T3; HK1223574A1; EP3047864A1; EP3047864B1; ES2671747T3; DK3047864T3

Abstract

Un dispositivo de transferencia (900, 1000), que comprende: una carcasa (1010) que tiene una primera sección interna (910, 1050), una segunda sección interna (920, 1060), primero y segundo extremos abiertos, y una estructura de base que se coloca entre los primeros y segundos extremos abiertos; en donde la estructura de base incluye una primera porción de base que se acopla de manera fija a una superficie interior de la carcasa (1010), y una segunda porción de base que se acopla de manera móvil a la superficie interior de la carcasa (1010); una primera aguja (902, 1020) que comprende (i) una primera porción de aguja que se extiende desde la primera porción de base hasta la primera sección interna (910, 1050) y (ii) una segunda porción de aguja que se extiende desde la primera porción de base hasta la segunda sección interna (920, 1060); una segunda aguja (904, 1030) que comprende una tercera porción de aguja que se extiende desde la segunda porción de base hasta la primera sección interna (910, 1050); y una ventilación (930, 1035) que se acopla a la tercera porción de aguja, caracterizada porque la ventilación (930, 1035) se extiende a través de una ranura alargada (925, 1040) de la carcasa (1010).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y dispositivos de separación y extracción de células de plasma rico en plaquetas y aspirado de médula ósea

Campo de la Invención

El campo de la invención son las tecnologías de separación.

Antecedentes

La descripción de los antecedentes incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión de que cualquier información que se proporciona en la presente descripción sea de la técnica anterior o relevante para la invención que se reivindica actualmente, o que cualquier publicación a la que se haga referencia específica o implícitamente sea de la técnica anterior.

La terapia con plasma rico en plaquetas (PRP) se ha usado para la reparación y regeneración ósea, cirugía plástica, aplicaciones de cirugía oral y tratamiento ocular, y está recibiendo una mayor atención y reconocimiento por su eficacia en el tratamiento de lesiones deportivas, lesiones nerviosas, tendinitis y osteoartritis. El PRP se puede ver como una fuente concentrada de plaquetas que se puede administrar al sitio de una lesión y se activa para permitir la liberación rápida del factor de crecimiento y la estimulación de la recuperación ósea o de tejidos blandos. Debe evitarse la activación precoz e involuntaria de las plaquetas, ya que muchos factores de crecimiento tienen semividas cortas y puede resultar una mayor eficacia si se activan en el momento de su uso o justo antes (por ejemplo, inyección).

Se han expuesto algunos esfuerzos para preparar o separar PRP mediante el uso de métodos de centrifugación. Ejemplos incluyen las patentes de Estados Unidos núms. 6,596,180, 6,610,002, 6,827,863, 6,899,813, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0294383, y la publicación de solicitud de patente internacional núm. WO 02/081007. Desafortunadamente, los métodos que se conocen sufren al menos una de varias desventajas, que incluyen la alta activación de las plaquetas, la incapacidad para eliminar todo o sustancialmente todo el PRP sin correr el riesgo de dividir en alícuotas una capa leucocitaria o gel con el PRP, o la incapacidad de obtener homogeneidad del PRP y el requisito para el procesamiento de tubos abiertos estériles.

"Platelet Separation From Whole Blood in an Aqueous Two-Phase System With WaterSoluble Polymers" por Sumida y otros publicado en J Pharmacol Sci 101, 91-97 (2006) reconoció un problema de alta activación de las plaquetas mediante el uso de métodos de centrifugación convencionales y desarrolló un método para separar plaquetas sin centrifugación. Más específicamente, se mezclaron varios polímeros con sangre total que contenía citrato dextrosa y se observó la separación de las células sanguíneas y la activación de las plaquetas. Desafortunadamente, Sumida descubrió que donde los polímeros separaban las plaquetas de manera más eficiente, se activaban más plaquetas. En cambio, cuando se logró una disminución de la activación de las plaquetas, hubo un bajo rendimiento plaquetario. Además, debido a los protocolos de sedimentación, las plaquetas generalmente no se distribuyen de manera homogénea en las fracciones de PRP y, por lo tanto, la cuantificación es difícil.

Los aspirados de médula ósea que contienen células madre pluripotentes regenerativas también se han usado para ayudar a tratar diversas afecciones óseas y articulares. Desafortunadamente, los métodos de centrifugación que se conocen provocan una pérdida significativa de las células deseadas (por ejemplo, células B, plaquetas, células T, monocitos, células madre hematopoyéticas, células estromales mesenquimales, células progenitoras endoteliales, células pequeñas de tipo embrionarias).

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de métodos mejorados para preparar PRP y fracciones de aspirado de médula ósea.

Aún más, los esfuerzos de separación anteriores aparentemente requieren pipetear o retirar manualmente un PRP o una fracción de aspirado de médula ósea (u otra fracción de un fluido) del tubo de recolección en el que se prepara o separa para transferirlo a un recipiente de almacenamiento separado para usos comerciales. La etapa de extracción puede tener uno o más efectos no deseados, que incluyen, por ejemplo, no dividir en alícuotas todo el PRP u otra fracción deseada, romper la esterilidad, dividir en alícuotas fracciones o materiales no deseados o la contaminación. Por lo tanto, todavía existe una necesidad en la técnica de dispositivos y métodos de transferencia estériles mejorados.

El documento US 2011/1068294 A1 se refiere a un dispositivo de llenado que comprende una carcasa, cuya carcasa comprende un primer medio de posición que se adapta para recibir un depósito para un dispositivo de suministro, un segundo medio de posición que se adapta para recibir un cartucho que contiene un líquido, una unidad que proporciona una trayectoria de flujo cuando tanto el depósito como el cartucho se reciben respectivamente por los medios de posición primero y segundo, y una unidad de ventilación que proporciona acceso de gas al cartucho durante el vaciado del cartucho. Al menos una parte de la unidad de ventilación se coloca fuera del centro de rotación de la carcasa y se une a una parte que puede girar con relación a la carcasa.

Resumen de la Invención

La presente invención se define en la reivindicación adjunta 1. Las características/modalidades preferidas se establecen en las reivindicaciones dependientes.

En la presente descripción se describen aparatos, sistemas y métodos en los que una fracción de plasma rico en plaquetas (PRP) que tiene una concentración deseada de plaquetas funcionales se separa de una muestra de sangre total. También se describen en la presente descripción aparatos, sistemas y métodos en los que una fracción de aspirado de médula ósea (BMAF) que tiene una concentración deseada de plaquetas funcionales u otras células se separa de una muestra de fluido de médula ósea. La separación se logra mediante el uso de una sustancia separadora polimerizable que es fluida con la sangre total y se puede curar para formar una barrera sólida.

Como se usa en la presente descripción y en todas las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "una" y "el/la" incluye la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, como se usa en la presente descripción, el significado de "en" incluye "en" y "sobre" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en la presente descripción, una fracción de PRP comprende al menos el 150 % de la concentración de plaquetas en la muestra de sangre total, menos del 20 % de los glóbulos blancos de la muestra de sangre total de la que se obtiene y menos del 20 % de glóbulos rojos de la muestra de sangre total de la que se obtiene. Se apreciará que los niveles de plaquetas, WBC y RBC podrían determinarse antes y después de la separación mediante un hemograma completo (CBC), frotis de sangre o cualquier otra prueba comercialmente adecuada.

Como se usa en la presente descripción, una fracción de aspirado de médula ósea (BMAF) comprende al menos el 100% de la concentración de plaquetas viables en la precentrifugación del aspirado de médula ósea. En algunas modalidades preferidas, la BMAf puede comprender al menos 105%, al menos 110 %, al menos 115 %, al menos 120 %, al menos 125 % o incluso más de la concentración de plaquetas viables en la precentrifugación del aspirado de médula ósea. La recuperación de plaquetas de aspirados de médula ósea ha sido mucho más variable que la recuperación de plaquetas de muestras de sangre total. El solicitante descubrió sorprendentemente que la centrifugación de aspirados de médula ósea mediante el uso de sustancias separadoras polimerizables de la presente descripción produjo una fracción rica en plaquetas con concentraciones mayores de plaquetas viables en comparación con los sistemas que se conocen, y menos daño o muerte celular. Como la centrifugación de los aspirados de médula ósea separa las plaquetas y las células madre de la muestra de médula ósea, se espera que el aumento de las concentraciones de plaquetas viables se correlacione con una mayor separación/captura de células madre.

La sustancia separadora polimerizable se puede incluir en un tubo de recolección con la muestra de sangre total que se centrifuga hasta que la sustancia separadora polimerizable se asiente entre la fracción de PRP y una fracción sin PRP de la muestra de sangre total. Dado que la sustancia separadora polimerizable (antes del curado) comprende bloques de construcción más pequeños (por ejemplo, oligómeros), resultan sustancialmente menos fuerzas de fricción y cizallamiento entre las plaquetas (u otras células deseadas) y los materiales de la sustancia separadora, lo que resulta en una menor activación de las plaquetas y una menor muerte o daño celular.

Una vez que la sustancia separadora polimerizable se asienta entre las fracciones de PRP y sin PRP (u otras fracciones de un fluido), la sustancia separadora polimerizable se puede endurecer para formar una barrera sólida, en donde la sustancia separadora polimerizable de la barrera sólida tiene un peso molecular promedio que es superior al peso molecular promedio de la sustancia separadora polimerizable cuando es fluida, y en donde la polimerización no tiene un efecto sustancialmente adverso sobre la viabilidad plaquetaria. La barrera sólida será preferentemente estacionaria con respecto al tubo de recolección e impermeable hasta un grado que evite la mezcla de la fracción de PRP y la fracción sin PRP al agitarla. Ventajosamente, esto permitirá al usuario homogeneizar la fracción de PRP y retirarla por completo del tubo de recolección sin volver a mezclar las fracciones de PRP y sin PRP.

La presente descripción también proporciona aparatos, sistemas y métodos en los que una muestra estéril puede transferirse desde un recipiente de separación/preparación (por ejemplo, un vacutainer) a un consumidor u otro recipiente (por ejemplo, un cuentagotas) mientras se mantiene la esterilidad de la muestra.

En un aspecto de la presente descripción, un dispositivo de transferencia comprende una carcasa que encierra una base y al menos dos agujas. La carcasa comprende dos extremos abiertos (por ejemplo, un tubo cilíndrico) e incluye dos secciones internas en los lados opuestos de la base que encierra.

Una de las dos agujas se acopla a una primera porción de la estructura de base de manera que un primer extremo de la aguja se coloca dentro de una sección interna y un segundo extremo de la aguja se coloca dentro de una segunda sección interna. Se apreciará que en algunas modalidades, el primer extremo de la aguja y el segundo extremo de la aguja podrían componer dos agujas separadas que se colocan cerca de extremos opuestos de un agujero pasante de la estructura de base.

La segunda aguja podría ser una segunda porción de la estructura de base de manera que se pueda mover con relación a la carcasa, un extremo se coloca dentro de la primera sección interna (junto al primer extremo de la primera aguja) y un segundo extremo se coloca dentro de la base, no en la segunda sección interna. Preferentemente, el segundo extremo se acopla en ángulo a una estructura de ventilación que se extiende fuera de una ranura de la carcasa.

Los dispositivos de transferencia que se presentan en la presente descripción pueden permitir ventajosamente a un usuario transferir un fluido de un tubo a otro sin comprometer la esterilidad. Adicional o alternativamente, los dispositivos de transferencia pueden permitir que se transfiera toda la fracción de PRP (o BMAF u otra fracción deseable) sin agitar, girar o manipular de otro modo los tubos.

Pueden incorporarse uno o más filtros al dispositivo. Por ejemplo, se pueden acoplar uno o más filtros al orificio de ventilación, la aguja de transferencia o cualquier otra porción del dispositivo. Los filtros que se contemplan pueden realizar al menos una de las siguientes funciones: (a) prevenir fugas (por ejemplo, cuando el dispositivo se inclina) y (b) esterilizar el aire que entra en el dispositivo (por ejemplo, la ventilación, la aguja de ventilación) o el tubo de preparación. En algunas modalidades, un filtro puede comprender una membrana hidrófoba.

Varios objetos, características, aspectos y ventajas del objeto de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas, junto con las figuras de los dibujos acompañantes en las que números similares representan componentes similares.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 ilustra un tubo de recolección que se usa de acuerdo con un método para separar una fracción de plasma rico en plaquetas de sangre total que se describe en la presente descripción.

La Figura 2 es una ilustración esquemática de un método para separar una fracción de plasma rico en plaquetas de una muestra de sangre total.

La Figura 3 muestra los "Ct" (umbral de ciclo) del control, el tubo con LAI y el tubo con LAIT.

La Figura 4 muestra la no reproducibilidad de los recuentos de ADNcf que se toman de plasma sin mezclar.

La Figura 5 muestra la agregación de un control, LAI y LAIE a ristocetina.

La Figura 6 muestra la agregación de un control, LAI y LAIE al colágeno.

La Figura 7 es una ilustración esquemática de otro método para separar una fracción de plasma rico en plaquetas de una muestra de sangre total.

La Figura 8 es una ilustración esquemática de otro método más para separar una fracción de plasma rico en plaquetas de una muestra de sangre total.

Las Figuras 9A a 9I ilustran un dispositivo de transferencia que se usa para transferir una sustancia separada de un primer recipiente a un segundo recipiente.

Las Figuras 10A a 10D proporcionan vistas en sección transversal de un dispositivo de transferencia que se usa para transferir una sustancia separada de un recipiente a otro.

Las Figuras 11A-11B ilustran un dispositivo de transferencia alternativo que se describe en la presente descripción.

Las Figuras 12A-12B ilustran otro dispositivo de transferencia alternativo.

Las Figuras 13A-C ilustran dispositivos de transferencia ilustrativos que tienen una ventilación que no se extiende fuera de la carcasa.

La Figura 14 ilustra un dispositivo de transferencia que tiene una cubierta.

Descripción Detallada

La siguiente descripción proporciona muchas modalidades ilustrativas. Aunque cada modalidad representa una combinación única de elementos, se considera que la descripción incluye todas las combinaciones posibles de los elementos descritos. Por lo tanto, si una modalidad comprende los elementos A, B y C, y una segunda modalidad comprende los elementos B y D, entonces se considera que la descripción también incluye otras combinaciones restantes de A, B, C o D, incluso si no se describen explícitamente.

Se apreciará que las técnicas descritas proporcionan muchos efectos técnicos ventajosos que incluyen una mayor separación de plaquetas en presencia de una sustancia separadora polimerizable (PSS) sin una activación sustancial de las plaquetas separadas. Adicionalmente, las composiciones y métodos que se proporcionan permiten al usuario invertir un tubo de recolección tras la polimerización de la sustancia separadora para mezclar la fracción de PRP separada o BMAF, sin volver a mezclar con las fases separadas o la PSS, hasta obtener una distribución sustancialmente homogénea de plaquetas. Adicionalmente, los métodos y dispositivos que se proporcionan permiten el uso comercial de una BMAF, PRP u otra fracción de un fluido sin retirar la fracción del tubo de recolección en el que se preparó o separó para su colocación en un recipiente de almacenamiento separado.

Un ejemplo de separación de una fracción de PRP de acuerdo con la presente descripción se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Se contempla que podría usarse cualquier tubo de recolección adecuado para realizar los métodos de la presente descripción. El tubo se hace preferentemente de un material rígido (por ejemplo, plástico duro, vidrio, etc.) adecuado para soportar un vacío dentro de su lumen, y tiene un volumen suficiente para contener una muestra deseable de sangre total o aspirado de médula ósea de la que se puede separar una cantidad deseable de PRP o BMAF. Un tubo ilustrativo incluye los productos BD Vacutainer®. Aunque los dispositivos y métodos preferidos que se describen en la presente descripción incluyen el uso de un tubo de recolección, se contempla que un tubo de recolección podría sustituirse por otros recipientes tales como matraces, frascos, vasos de precipitados, botellas o viales.

En el ejemplo de la Figura 1, un tubo de recolección 100 que contiene una sustancia separadora fluida/polimerizable 105 se expone a una fuente de energía esterilizante 110, que aplica energía de esterilización 115 (por ejemplo, radiación gamma, radiación con haz de electrones, calor) al tubo 100 y a la sustancia separadora 105, lo que da como resultado un tubo de separación esterilizado y una sustancia separadora 120 esterilizada (pero todavía fluida y curable por radiación ultravioleta). Puede añadirse una muestra de sangre total 125 al tubo 100, formando de esta manera una mezcla 130 de la muestra y la sustancia separadora esterilizada.

El tubo 100 y la mezcla 130 se pueden centrifugar luego hasta que la sustancia separadora 140, componente de la mezcla 130, se asiente entre una fracción de PRP 145 y una fracción sin PRP 135 de la muestra de sangre total 125. La fracción de PRP 145 preferentemente tendrá una concentración de plaquetas que es al menos el 150 % de la concentración de plaquetas de la muestra 125, y la fracción sin PRP 135 comprenderá preferentemente al menos el 90 % de los WBC y los RBC de la muestra 125.

Si bien la presente descripción se dirige generalmente a la separación de una fracción de PRP de una muestra de sangre total, se apreciará que se podrían usar los mismos dispositivos y métodos para separar una fracción de aspirado de médula ósea de los aspirados de médula ósea. En el tubo de recolección, la BMAF se colocaría por encima de la PSS y los componentes restantes de los aspirados de médula ósea se colocarían debajo de la PSS.

La sustancia separadora polimerizable 140 puede polimerizarse en su totalidad o en parte. Por lo tanto, la exposición de la sustancia separadora 140 a la energía 150 (por ejemplo, energía ultravioleta) que se genera por una fuente de energía adecuada 155 (por ejemplo, una fuente de luz ultravioleta) iniciará la polimerización por radicales libres y hará que al menos una porción de la sustancia separadora 140 forme una composición reticulada sólida 160 que actúa como una barrera impermeable entre la fracción de PRP 145 y la fracción sin PRP 135. En algunas modalidades, el grosor final de la barrera (después del curado con radiación ultravioleta) no será superior a 10 mm, y con mayor preferencia no superior a 5 mm.

La sustancia separadora polimerizable (o la porción polimerizable de una sustancia separadora polimerizable) podría formularse para polimerizar en diez minutos hasta una dureza de al menos 1 en la escala de dureza Shore 00, con mayor preferencia una dureza de al menos 10 en la escala de dureza Shore A, cuando se activa por una fuente de energía adecuada (por ejemplo, luz ultravioleta), y forma un sólido con respecto a una sonda, una pipeta, una decantación o incluso una congelación. La barrera sólida endurecida que se forma puede adherirse a las paredes de un lumen de un tubo para sellar sustancial o completamente la fracción de PRP de una o más de otras fracciones, protegiendo de esta manera la fracción de PRP de la contaminación debida a la difusión, agitación, extracción de muestras u otras interacciones indeseables.

La fuente de luz adecuada podría emitir una luz con una intensidad de entre 5 a 100 W/cm2, entre 10 a 75 W/cm2, entre 15 a 50 W/cm2 o cualquier otra intensidad adecuada, todas medidas a una distancia de 10 cm de la fuente de luz. Adicional o alternativamente, la fuente de energía adecuada podría producir una luz con un pico máximo a una longitud de onda de entre 50 a 400 nm, por ejemplo entre 200 a 280 nm (UVC), entre 280 a 315 nm (UVB), entre 315 a 400 nm (UVA) o entre 200 a 400 nm. Adicional o alternativamente, la fuente de energía adecuada podría emitir una luz con una irradiancia pico de entre 0,1-10 W/cm2, por ejemplo, entre 0,3-1 W/cm2, entre 1,5-2,5 W/cm2, o entre 0,5-3,5 W/cm2. Adicional o alternativamente, la luz que produce la fuente de luz adecuada podría llegar a la superficie a curar con una densidad de energía radiante de entre 0,3-8 J/cm2, por ejemplo, entre 1-5 J/cm2, o entre 1-2 J/cm2.

Una fuente de luz adecuada ilustrativa es una caja de luz personalizada fabricada por Heraeus que produce una luz que tiene un pico máximo a una longitud de onda de 385 nm y una irradiancia pico de 2,2 W/cm2 Esta fuente de luz se usó con un ajuste de energía del 25 % de la energía de salida óptica máxima de 25 W. Algunas de las sustancias fotocurables que se probaron tenían un volumen de entre 0,25-1 ml, se dispusieron en tubos vacutainer y las fuentes de energía adecuadas fueron diodos emisores de luz que emiten energía entre 380 a 390 nm, con una irradiancia pico de 2,2 W/cm2. Sin embargo, se apreciará que pueden modificarse uno o más factores de exposición (por ejemplo, irradiancia, longitudes de onda, energía radiante), se pueden modificar las concentraciones de componentes de la sustancia (por ejemplo, la concentración de antioxidantes, la concentración del fotoiniciador) o podrían usarse diferentes fuentes de energía, para lograr un tiempo de curado similar para volúmenes más pequeños o más grandes.

Cuando una sustancia separadora 140 es polimerizable solo en parte, se contempla que la porción no polimerizable (por ejemplo, un componente de gel tixotrópico) pueda asentarse debajo de la porción polimerizable de manera que la fracción de PRP deseada se pueda usar o retirar por completo del tubo de recolección sin mezclar la fracción de PRP con la fracción sin PRP o la porción no polimerizable. La porción no polimerizable podría incluir, por ejemplo, geles disponibles en el mercado (por ejemplo, BD Vacutainer® SST™, BD Vacutainer® PST™, tubos de recolección de sangre Vacuette® con separadores de gel, tubos de gel separadores de suero PPMA, tubos de gel separadores de suero de polipropileno, etc.), o cualquier otro gel comercialmente adecuado.

Se apreciará que una sustancia separadora descrita en la presente descripción, en virtud de la barrera sólida que se forma, puede permitir que un usuario logre y vuelva a lograr una homogeneidad sustancial de la BMAF, PRP u otra fracción, por ejemplo, mezclando o agitando de otro modo la fracción de PRP en el tubo de recolección sin desprender la barrera entre las fracciones de PRP y sin PRP. Adicionalmente, la homogeneidad sustancial podría lograrse sin alteración de las células, por ejemplo, sin activación sustancial de las plaquetas. Adicionalmente, cuando al menos una porción de la sustancia separadora es polimerizable para formar un sólido, el curado de la sustancia separadora polimerizable puede formar una red polimérica que mantiene la separación de la fracción de PRP tan eficientemente como, o incluso mejor, de lo que lo haría una sustancia separadora polimérica.

Algunas sustancias separadoras polimerizables que se contemplan pueden comprender: (1) un oligómero (por ejemplo, una combinación (por ejemplo, Ebecryl, Cytec) de los mismos), con (2) un fotoiniciador (por ejemplo, Additol® BDK, Additol® TPO) y (3) un estabilizador (fenotiazina). Los ejemplos de composiciones fotocurables que se contemplan incluyen, entre otras cosas, LAI (por ejemplo, L1A1 y fenotiazina) y LAIR. Como se usa en la presente descripción, L = un oligómero (por ejemplo, L1 = Ebecryl 230 de Allnex, anteriormente de Cytec Industries, Inc., etc.); A = un fotoiniciador (por ejemplo, A1 = Additol BDK); I = un estabilizador (por ejemplo, fenotiazina, etc.). Consultar la Tabla 1 a continuación para ver más ejemplos de componentes que pueden incluirse en una PSS.

Tabla 1

En algunas sustancias separadoras polimerizables que se contemplan, el fotoiniciador (por ejemplo, Azobisisobutironitrilo, peróxido de benzoilo, canforquinona, un fotoiniciador de óxido de fosfina, un fotoiniciador a base de cetona, un fotoiniciador de éter de benzoína) está presente en una concentración de menos del 10 % en peso, menos del 5 % en peso o incluso menos del 2 % en peso, y un estabilizador está presente a una concentración de menos del 5 % en peso, menos del 2 % en peso, menos del 1 % en peso o incluso menos del 0,5 % en peso. Como ejemplo más específico y no limitante, una sustancia separadora puede comprender un oligómero presente en una concentración de entre 95 y 100% (por ejemplo, 100% en peso), un fotoiniciador presente en una concentración de entre 0,8 y 1,2 % (por ejemplo, 1 % en peso) y un estabilizador presente en una concentración de entre 0,01 y 0,05 % (por ejemplo, 0,1 % en peso).

Los fotoiniciadores que se contemplan incluyen, entre otras cosas, Additol BDK y Additol TPO. Los estabilizadores que se contemplan incluyen, entre otras cosas, fenotiazina. Una sustancia separadora también puede incluir un antioxidante, especialmente cuando se desea la esterilización por irradiación del tubo de recolección con una sustancia separadora sin un curado sustancial de la sustancia separadora. Se puede preferir la esterilización por irradiación para un alto rendimiento, pero el mecanismo de acción se basa en la generación de radicales libres que es intrínsecamente problemático debido al curado prematuro no deseado de la sustancia separadora. Sin embargo, el solicitante descubrió sorprendentemente que cuando se incluye un eliminador de radicales como el tocoferol, algunas composiciones de la presente descripción (por ejemplo, ^lA ⁱE) mantendrán la fluidez durante la esterilización por irradiación a una dosis de radiación de más de 3 kG, mientras que algunas otras composiciones (por ejemplo, LAI) no mantendrán la fluidez bajo la misma dosis de radiación como se describe en más detalle en el número de solicitud PCT/US15/57359 y en el número de solicitud europeo 14190681.8. Visto desde otra perspectiva, se descubrió que LAI solo mantiene la fluidez durante la esterilización por irradiación hasta una dosis de radiación de aproximadamente 3 kG. En algunas modalidades preferidas, el al menos uno de: el eliminador de radicales y el antioxidante, comprende tocoferol y está presente en la composición en una concentración molar de al menos 75 mM, con mayor preferencia al menos 100 mM, e incluso con mayor preferencia al menos 135 mM. Las concentraciones más bajas de tocoferol (por ejemplo, menos de aproximadamente 75 mM) no son preferentes por varias razones. Por ejemplo, las sustancias separadoras con concentraciones más bajas de tocoferol solo pueden mantener la fluidez en dosis de radiación más bajas, lo que puede no permitir una esterilización rentable según el protocolo ISO. Adicionalmente, las sustancias separadoras con concentraciones de tocoferol más bajas típicamente requieren concentraciones de fotoiniciador más bajas (por ejemplo, menos del 1 % en peso), lo que generalmente requiere un tiempo de curado más largo.

Algunos antioxidantes que se contemplan incluyen antioxidantes que contienen hidroxilo (AOH) (por ejemplo, Vitamina E (a-tocoferol), vitamina C (ácido ascórbico), ácido gálico) y antioxidantes de nitróxido (RNO) (por ejemplo, TEMPO (2,2,6,6-tetrametilpiperidina 1-oxilo), TEMPOL (4-Hidroxi-TEMPO). Visto desde otra perspectiva, los antioxidantes que se contemplan incluyen, entre otras cosas, tocoferol, hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), caroteno, bilirrubina y ácido ascórbico.

Una sustancia separadora polimerizable ilustrativa comprende un oligómero, un fotoiniciador y un estabilizador, en donde el fotoiniciador está presente en una concentración de menos de 5 % en peso (por ejemplo, entre 0,1 y 5 %, entre 0,1 y 3 %), y en donde el estabilizador está presente en una concentración de menos de 0,5 % en peso (por ejemplo, entre 0,1 y 0,5 %, entre 0,1 y 0,3 %).

LAI (por ejemplo, L1, Al y fenotiazina) compone algunas composiciones fotocurables especialmente preferentes, y puede formularse para tener el intervalo de densidad deseado de 1,00 a 1,09 g/cm3. Aunque se realizaron experimentos mediante el uso de una composición fotocurable que tiene un oligómero, se contempla que las composiciones que contienen monómeros también pueden ser adecuadas para su uso en la preparación de PRP ya que muchos monómeros y oligómeros tienen una reactividad similarmente alta, y muchos monómeros y oligómeros pueden polimerizar en presencia de luz ultravioleta.

Otros ejemplos de sustancias separadoras fotocurables potencialmente adecuadas incluyen las descritas en las patentes de Estados Unidos núms. 7,674,388, 7,673,758, 7,775,962, 7,971730, 7,780,861, 8,206,638, 8,282,540, 8,151,996, y 8,318077, LAIE (por ejemplo, L1, A1, fenotiazina y tocoferol) y LAIER, en donde R = un agente gelificante (por ejemplo, DBS, sílice, etc.), y E = al menos uno de un antioxidante y un eliminador de radicales (por ejemplo, Vitamina E, hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), caroteno, bilirrubina, ácido ascórbico, etc.). Aunque R y E generalmente no son componentes necesarios de una composición fotocurable, cada uno puede proporcionar características ventajosas a la composición fotocurable para algunos usos. Por ejemplo, un agente gelificante puede no ser un componente necesario de la composición fotocurable donde la sustancia separadora también comprende un componente de gel blando tixotrópico que se carga en el tubo de recolección por encima de la composición fotocurable de manera que no se producirá flujo antes de su uso. No obstante, puede ser deseable tener una composición fotocurable tixotrópica, por ejemplo, cuando se desee disponer el sellador en el tubo sin un componente de gel blando, o encima del componente de gel blando. Sin embargo, se debe señalar que se ha descubierto que un aumento en la concentración del agente gelificante conduce a un curado prematuro durante la esterilización por irradiación.

Otros ejemplos adicionales son composiciones que incluyen: (1) al menos uno de un monómero y un oligómero (por ejemplo, una combinación (por ejemplo, Ebecryl, Cytec) de los mismos), con (2) un fotoiniciador (por ejemplo, Additol® BDK, Additol® TPO) y (3) un estabilizador (fenotiazina). Se apreciará que se puede usar cualquier composición fotocurable comercialmente adecuada. Las composiciones fotocurables adecuadas son típicamente al menos una de un gel (por ejemplo, cuando se agrega un agente gelificante (por ejemplo, DBS o sílice)) y fluido (con sangre total) antes de la polimerización, y pueden solidificarse cuando se exponen a una fuente de energía adecuada (por ejemplo, luz ultravioleta). Estas pueden incluir, entre otras cosas, MLA (por ejemplo, M1L1A1), MLAI (por ejemplo, M1L1A1 y fenotiazina), MAI (por ejemplo, M1A1 y fenotiazina), LAI (por ejemplo, L1A1 y fenotiazina) y LMA (por ejemplo, L1M1A1). Como se usa en la presente descripción, M = un monómero (por ejemplo, M1, que es un monómero triacrilato de propoxilato de trimetilolpropano de Sigma-Aldrich Cat. No. 407577); L = un oligómero (por ejemplo, L1 = Ebecryl 230 de Allnex, anteriormente de Cytec Industries, Inc.); A = un fotoiniciador (por ejemplo, A1 = Additol BDK); I = un estabilizador (por ejemplo, fenotiazina).

Se puede incluir un eliminador de radicales tal como los compuestos que tienen actividad de vitamina E (por ejemplo, tocoferol), aunque no es necesario, para permitir que la composición fotocurable se esterilice mediante irradiación sin curar (por ejemplo, cambiando las propiedades de densidad), en lugar de requerir esterilización por calor para mantener una fluidez eficaz que permita la sedimentación entre dos fracciones de una muestra de sangre total. Cuando se desee la esterilización por calor, se puede lograr exponiendo el tubo de recolección y la sustancia separadora a un calor de al menos 200 grados Celsius, con mayor preferencia al menos 225 grados Celsius y con la máxima preferencia al menos 250 grados Celsius.

En algunos ejemplos, cuando se incluye tocoferol u otro antioxidante adecuado, se puede esterilizar un tubo de recolección que incluye la sustancia separadora para satisfacer los protocolos de la Organización Internacional de Normalización (ISO) antes de venderse. El solicitante descubrió sorprendentemente que cuando se incluye un eliminador de radicales tal como el tocoferol, algunas composiciones de la presente descripción (por ejemplo, LAIE) mantendrán la fluidez durante la esterilización por irradiación a una dosis de radiación de más de 3 kG, mientras que algunas otras composiciones (por ejemplo, lA i) no mantendrán la fluidez bajo la misma dosis de radiación. Visto desde otra perspectiva, se descubrió que LAI solo mantiene la fluidez durante la esterilización por irradiación hasta una dosis de radiación de aproximadamente 3 kG. En algunas modalidades preferidas, el al menos uno de: el eliminador de radicales y el antioxidante, comprende tocoferol y está presente en la composición en una concentración molar de al menos 75 mM, con mayor preferencia al menos 100 mM, e incluso con mayor preferencia al menos 135 mM. Las concentraciones más bajas de tocoferol (por ejemplo, menos de aproximadamente 75 mM) no son preferentes por varias razones. Por ejemplo, las sustancias separadoras con concentraciones más bajas de tocoferol solo pueden mantener la fluidez en dosis de radiación más bajas, lo que puede no permitir una esterilización rentable según el protocolo ISO. Adicionalmente, las sustancias separadoras con concentraciones de tocoferol más bajas típicamente requieren concentraciones de fotoiniciador más bajas (por ejemplo, menos del 1 % en peso), lo que generalmente requiere un tiempo de curado más largo.

Por ejemplo, los tubos se pueden esterilizar (preferentemente sin una polimerización sustancial de la sustancia separadora o una porción de la misma) mediante el uso de radiación gamma (por ejemplo, de una fuente de cobalto (por ejemplo, Cobalto 60)), mediante el uso de radiación con haz de electrones (por ejemplo, de una fuente de haz de electrones de un acelerador lineal pulsado (LINAC) de 7 MeV), gas (por ejemplo, óxido de etileno) o un calor entre 50 a 80 grados Celsius por una duración de entre aproximadamente 10 a 60 minutos, o un calor entre 100 a 250 grados Celsius o incluso más. Visto desde otra perspectiva, la sustancia separadora puede ser eficaz para permitir la esterilización por irradiación, gas o calor sin curar más del 40 %, con mayor preferencia sin curar más del 30 %, y para permitir la polimerización posterior mediante radiación ultravioleta u otro curado. Se puede introducir un vacío opcional, por ejemplo, simplemente descomprimiendo el volumen del lumen del tubo mediante el uso de una bomba adecuada.

Se contemplan todos los tiempos de esterilización adecuados (por ejemplo, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos, menos de 2 minutos, entre 5 y 120 segundos, entre 5 y 90 segundos), donde los tubos de recolección (y las sustancias separadoras) se esterilizan con haz de electrones en dosis de entre 5 y 25 kGy, más típicamente entre 10 y 20 kGy. Se contemplan todos los tiempos de esterilización adecuados (por ejemplo, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos, menos de 2 minutos, entre 5 y 120 segundos, entre 5 y 90 segundos), donde los tubos de recolección (y las sustancias separadoras) se esterilizan con rayos gamma en dosis de entre 5 y 25 kGy, más típicamente entre 10 y 20 kGy. Se ha observado que con la esterilización gamma, las fuentes más débiles con velocidades de administración de dosis más bajas, tenían más probabilidades de curar el compuesto. La dosis que requiere la ISO depende, entre otras cosas, de la carga biológica del objeto que se esteriliza. El tiempo de radiación que se requiere depende no solo de la técnica de esterilización usada, sino también, por ejemplo, de la carga biológica del objeto que se esteriliza y de la dosis de radiación (kGy).

A menos que el contexto dicte lo contrario, todos los intervalos que se establecen en la presente descripción deben interpretarse como que incluyen sus valores extremos y los intervalos abiertos deben interpretarse para incluir solo valores comercialmente prácticos. De manera similar, todas las listas de valores deben considerarse como inclusivas de valores intermedios a menos que el contexto indique lo contrario.

También se contempla que se podría esterilizar un tubo de recolección, y posteriormente se podría añadir al tubo una sustancia separadora esterilizada. Adicional o alternativamente, un usuario podría agregar una o más sustancias separadoras a un tubo de recolección después de la compra, en lugar de tener una sustancia separadora predispuesta dentro del tubo.

Cuando se añade una muestra (por ejemplo, sangre total) a un tubo de recolección de la presente descripción, la centrifugación podría separar la sangre total en una fracción de PRP y una fracción sin PRP. Cuando la sustancia separadora tiene una densidad intermedia a la de las fracciones de PRP y sin PRP, puede migrar entre las dos fracciones durante la centrifugación, aislando de esta manera las fracciones entre sí. La sustancia separadora puede entonces endurecerse rápidamente mediante polimerización cuando se activa mediante una fuente de energía adecuada para proporcionar una barrera sólida entre las dos fracciones.

Se contempla que se pueda incluir un anticoagulante en el tubo de recolección, opcionalmente como parte de la sustancia separadora, para evitar la coagulación de la muestra de sangre total y obtener plasma que contenga fibrinógeno y factores de coagulación. Los anticoagulantes que se contemplan incluyen citrato de sodio, EDTA, citrato dextrosa o cualquier otro anticoagulante adecuado. Es de destacar que aunque se inicia y se realiza la polimerización por radiación, la química usada y especialmente la polimerización acrílica no afectarán la activación o función plaquetaria, ni interferirán con muchas o la mayoría de las otras pruebas que se pueden realizar en la fracción de PRP.

La Figura 2 ilustra un método 200 para separar una fracción de PRP de una muestra de sangre total en un tubo de recolección que incluye una sustancia separadora polimerizable (PSS). Si bien se puede incluir cualquier cantidad adecuada de la sustancia separadora en el lumen del tubo, se prefiere que no se incluyan más de aproximadamente 1 ml o 2 gramos de la sustancia separadora por 10 ml de volumen del tubo.

El método 200 incluye la etapa de centrifugar la muestra de sangre total en el tubo de recolección, incluyendo la PSS, mediante el uso de un protocolo de centrifugación como se muestra en la etapa 210. Se contempla cualquier protocolo de centrifugación adecuado que sea suficiente para hacer que la PSS fluya entre dos fracciones de una muestra, incluida, por ejemplo, la centrifugación durante diez minutos a 24 °C y 1000 RPM como se muestra en la etapa 212. Otros ejemplos de protocolos de centrifugación adecuados podrían incluir: un tiempo de centrifugación de entre un minuto y treinta minutos, inclusive, a entre 500 RPM y 5000 RPM, inclusive; o un tiempo de centrifugación de entre cinco minutos y veinte minutos, inclusive, a entre 700 RPM y 3600 RPM, inclusive. Como bien se conoce en la técnica, las condiciones de centrifugación determinan la sedimentación y la velocidad de sedimentación de las plaquetas. El experto en la técnica podrá, sin experimentación indebida, determinar las fuerzas G aplicadas apropiadas y el tiempo para lograr un rendimiento deseado de plaquetas por encima de la PSS. Por lo tanto, se puede lograr fácilmente un aumento o una disminución de los rendimientos deseados mediante el uso de las consideraciones anteriores.

La siguiente Tabla 2A ilustra algunos de los protocolos de centrifugación usados para separar PRP de una muestra de sangre total mediante el uso de una PSS de la presente descripción. La composición LAI incluyó 100 % de L, 1 % de A y 0,10% de I.

Tabla 2A

Protocolos de centrifugación

Tiempo (minutos) RCF (g) Aumento de plaquetas Agotamiento de RBC LAI 5 300 186 99 LAI 5 300 202 99 LAIR (5 % R) 5 300 250 99 LAIR (5 % R) 5 300 233 99 LAI 12 200 122 99 LAI 12 200 119 99 LAIR (5 % R) 12 200 132 99 LAIR (5 % R) 12 200 139 99 LAI 10 150 144 98 LAI 10 150 119 98 LAIR (5 % R) 10 150 122 99 LAIR (5 % R) 10 150 125 99 LAI 20 150 133 99 LAI 20 150 98 99 LAIR (5 % R) 20 150 122 99 LAIR (5 % R) 20 150 114 99 LAI 10 300 180 99 LAI 10 300 190 99 LAIE 10 300 200 97 LAIE (E 200 mM) 10 300 210 99 La siguiente Tabla 2B ilustra algunos de los protocolos de centrifugación usados para separar una BMAF de un aspirado de médula ósea mediante el uso de una PSS de la presente descripción.

Tabla 2B

Muestra 1 (700 RPM, 15 minutos):

Recuento de plaquetas antes de la

centrifugación: l66x10A3/uL

Recuento de plaquetas después de la

centrifugación: 219x10A3/uL

Factor de aumento: 1,32

Muestra 2 (600 RPM, 20 minutos):

Recuento de plaquetas antes de la

centrifugación: 41x10A3/uL

Recuento de plaquetas después de la

centrifugación: 51x10A3/uL

Factor de aumento: 1,24

Muestra 3 (1500 RPM, 5 minutos)

Recuento de plaquetas antes de la

centrifugación: 236x10A3/uL

Recuento de plaquetas después de la

centrifugación: 26ox10A3/uL

Factor de aumento: 1,1

Muestra 4 (700 RPM, 10 minutos)

Recuento de plaquetas antes de la

centrifugación: 61x10A3/uL

Recuento de plaquetas después de la

centrifugación: 67x10A3/uL

Factor de aumento: 1,09

En las modalidades con la máxima preferencia, la PSS será fluida con al menos uno de: la sangre total y el aspirado de médula ósea, y tendrá una densidad que es al menos uno de: (a) entre una densidad promedio de una fracción de PRP y una densidad promedio de una fracción sin PRP de acuerdo con la etapa 215, y (b) entre una densidad promedio de una BMAF y una densidad promedio de una fracción que no es una BMAF.

Para lograr una densidad inicial deseada, se contempla que la densidad de la sustancia separadora pueda ajustarse en virtud de la composición molecular o mediante la inclusión de materiales de relleno apropiados (por ejemplo, sílice, látex u otro material inerte). Puede ser deseable ajustar la densidad de una PSS para separar diferentes tipos de células (por ejemplo, plaquetas, células madre, RBC, glóbulos blancos) mediante centrifugación. Se contemplan todos los ajustadores de densidad comercialmente adecuados, incluido, por ejemplo, Ebecryl 113.

Adicional o alternativamente, la centrifugación bajo un protocolo adecuado puede hacer que la PSS fluya entre las dos fracciones, por ejemplo, la fracción de PRP y la fracción sin PRP, sin una activación sustancial de plaquetas de acuerdo con la etapa 218. Se contempla que cuando la PSS se usa para la separación de una muestra de un fluido diferente, o para la separación de una muestra de sangre total en fracciones distintas a la fracción de PRP y la fracción sin PRP, se contempla que la PSS podría tener una densidad entre una densidad promedio de una primera fracción a separar y una densidad promedio de una segunda fracción a separar.

Como se usa en la presente descripción, la centrifugación mediante el uso de un primer protocolo de centrifugación para hacer que la PSS fluya entre dos fracciones de una muestra sin una activación sustancial de las plaquetas, significa que las plaquetas retienen la función dentro del 15 %, con mayor preferencia dentro del 10 %, de lo que retendrían las plaquetas durante un protocolo de centrifugación por lo demás idéntico al primer protocolo de centrifugación donde no se usa una PSS (por ejemplo, sin ninguna sustancia separadora). La activación sustancial de las plaquetas se puede medir, entre otras cosas, en base a la capacidad de las plaquetas en la fracción de PRP, la fracción sin PRP, o ambas, para agregarse al menos a uno de ristocetina y colágeno.

El método 200 también incluye la etapa 220 de endurecimiento de la PSS sin una activación sustancial de las plaquetas para formar una barrera sólida entre las fracciones, por ejemplo, la fracción de PRP y la fracción sin PRP. En dependencia de la formulación de la sustancia separadora, se contempla que el modo o mecanismo de polimerización puede variar considerablemente. Si bien la presente descripción se dirige principalmente a la polimerización por energía ultravioleta, todos los métodos de polimerización que se conocen se consideran adecuados para su uso en la presente descripción. Por ejemplo, las polimerizaciones que se contemplan incluyen varias polimerizaciones radicales o catiónicas (por ejemplo, mediante el uso de compuestos fotolábiles, iniciadores de radicales, etc.), polimerización por condensación, esterificación, formación de amidas, etcétera. Los grupos reactivos pueden incluir grupos ácidos, con la máxima preferencia grupos mono y dicarboxílicos), grupos dieno conjugado, grupos vinilo aromáticos y (met) acrilato de alquilo. Ventajosamente, la polimerización puede soportarse totalmente por grupos reactivos de los monómeros u oligómeros de la sustancia separadora, pero también pueden ser adecuados reactivos adicionales, incluidos los iniciadores de radicales.

La etapa de endurecimiento puede formar ventajosamente una barrera sólida entre la fracción de PRP y la fracción sin PRP (u otras fracciones separadas) que es estacionaria con respecto al tubo de recolección. Visto desde otra perspectiva, se puede formar una barrera sólida que no se desprenda de su posición dentro del tubo cuando el tubo se agita manualmente, cuando el tubo se centrifuga para volver a homogeneizar una fracción separada o cuando la fracción separada se retira mediante una pipeta, un dispositivo de transferencia o se decanta. Adicionalmente, la barrera sólida puede ser impermeable hasta un grado que evite la mezcla de las fracciones separadas tras la agitación, como se muestra en la etapa 222. La PSS de la barrera sólida tendrá un peso molecular promedio que es mayor que el peso molecular promedio de la PSS cuando es fluida con la sangre total de acuerdo con la etapa 225. Como se usa en la presente descripción, endurecer la sustancia separadora polimerizable sin una activación sustancial de las plaquetas significa que las plaquetas retienen la función dentro del 15%, con mayor preferencia dentro del 10 %, de lo que retendrían las plaquetas donde no se usa la PSS y donde no hay una etapa de endurecimiento.

La barrera sólida permite ventajosamente una etapa de retirar al menos el 90 %, con mayor preferencia al menos el 95 % y con la máxima preferencia el 100 % del PRP u otra fracción separada del tubo de recolección sin volver a mezclar las fracciones (por ejemplo, sin volver a mezclar la fracción de PRP con la fracción sin PRP). Esto podría lograrse retirando la fracción de PRP tal como está del tubo de recolección (por ejemplo, vertiendo, pipeteando, etc.), o incluyendo una solución salina u otro fluido en el tubo para ayudar a retirar toda la fracción de PRP. Adicional o alternativamente, esto podría lograrse mediante el uso de un dispositivo de transferencia del objeto de la invención como se describe más abajo.

El método 200 podría incluir opcionalmente una etapa de homogeneización del PRP u otra fracción deseada y separada, después de la etapa de endurecimiento, de manera que las diferentes alícuotas que se toman del mismo tengan recuentos de plaquetas dentro de un coeficiente de variación de un método de recuento de células usado. Esto puede ser muy beneficioso para proporcionar reproducibilidad y uniformidad. La homogeneización de la fracción de PRP se puede lograr mediante el uso de cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, agitación mecánica, agitación de burbujas, voltear el tubo boca abajo o agitar de otro modo, o triturar a través de una pipeta de boca ancha.

Recuperación de Plaquetas

Muchos en las industrias de cosméticos y de la salud han descubierto que el PRP que tiene una concentración de plaquetas del 200 al 250 % de una muestra de sangre, es óptimo. También es deseable obtener plaquetas u otros componentes deseables purificados o concentrados mientras se mantiene la integridad celular durante la centrifugación. El aumento del recuento de plaquetas viables sería deseable para usos terapéuticos y presumiblemente se correlacionaría con un aumento de recuentos de otras células deseables.

Los tubos de recolección usados anteriormente (por ejemplo, BD Vacutainers de tapa violeta sin sustancia separadora) para recuperar fracciones de sangre total implican centrifugar la sangre para dar como resultado un sobrenadante de fracción de suero, una capa leucocitaria intermedia y una fracción de glóbulos rojos debajo de la capa leucocitaria. Dichos tubos y métodos hacen que sea muy difícil o incluso imposible eliminar el sobrenadante sin retirar los glóbulos blancos de la capa leucocitaria. Por otro lado, cuando se usa un gel, el resultado es una fracción de PRP o de suero en dependencia del protocolo de centrifugación, luego una capa de gel intermedia, luego una capa leucocitaria y una última fracción de RBC. Nuevamente, es muy difícil, si no imposible, retirar la totalidad de la fracción de PRP o de suero sin aspirar el gel con el PRP o el suero. Y en cualquier caso, hay una mala distribución significativa de plaquetas en la fracción de PRP.

La PSS y los métodos de la presente descripción permiten ventajosamente la recuperación de plaquetas a diversas concentraciones (incluido el intervalo de 200 a 250 %) y también permiten el uso de la totalidad del sobrenadante de PRP. La Tabla 3 a continuación ilustra que el rendimiento plaquetario mediante el uso de LAI o LAIR fue al menos tan bueno como cuando se usó un control. La Tabla 3 también ilustra que mediante el uso de LAI o LAIR podría lograrse el mismo agotamiento de glóbulos rojos que se logra cuando se usa el control.

Tabla 3

La Tabla 4 a continuación ilustra que el rendimiento plaquetario mediante el uso de LAI o LAIE fue al menos tan bueno como cuando se usó un control. La Tabla 4 también ilustra que mediante el uso de LAI o LAIE podría lograrse el mismo o similar agotamiento de glóbulos blancos que se logra cuando se usa el control.

Las composiciones (LAI y LAIE) que se probaron se componen de lo siguiente:

El diferencial manual de LAI fue el siguiente: 8% de neutrófilos, 80% de linfocitos, 10% de monocitos, 2% de eosinófilos; El diferencial manual de LAIE fue el siguiente: 5 % de neutrófilos, 89 % de linfocitos, 5 % de monocitos, 1 % de eosinófilos.

Tabla 4

La Tabla 5 muestra el rendimiento plaquetario y el agotamiento de glóbulos blancos bajo un protocolo de centrifugación como sigue: 1000 RPM durante diez minutos a 24 °C. Hubo un ligero aumento en el rendimiento plaquetario y un agotamiento similar de glóbulos blancos/glóbulos rojos.

Las composiciones (LAI y LAIE) que se probaron se componen de lo siguiente:

Los experimentos se realizaron en tubos de citrato de sodio.

TABLA 5

Recuperación de una Fracción de PRP Homogénea

La PSS de la presente descripción proporciona una ventaja adicional de permitir la preparación de una BMAF, PRP u otra fracción sustancialmente homogénea. El solicitante comparó la recuperación de ADN libre de células en 3 tipos de tubos y determinó que las alícuotas que se tomaron de una muestra sin mezclar darían lugar a resultados variables. Visto desde una perspectiva diferente, si un usuario divide en alícuotas el plasma de un tubo sin gel, sin mezclar, las alícuotas serán muy variables. Si un usuario divide en alícuotas el plasma del tubo y lo mezcla fuera del tubo, los resultados pueden ser más reproducibles pero la recuperación es peor.

Los 3 tipos de tubos que se probaron son los siguientes: control ("Sin gel"), tubo con fotogel LAI y tubo con fotogel LAIT donde L = oligómero, A = fotoiniciador de additol BDK, 1 = estabilizador de fenotiazina y T = Nitróxido de TEMPO. La Figura 3 muestra los "Ct" (umbral de ciclo) del control, el tubo con LAI y el tubo con LAIT. El Ct más bajo de LAI y LAIT en comparación con el control indica una mejor recuperación en comparación con el control. La Figura 5 también muestra que los resultados con el uso de LAI y LAIT fueron reproducibles de manera similar al control. N = 4 para cada tipo de tubo.

El protocolo usado es el siguiente: la sangre combinada y almacenada se mezcló y se cargó con una pipeta en cada uno de los nueve tubos. Los tubos de fotogel se precargaron con LAI o LAIT. Todos los tubos se centrifugaron a temperatura ambiente durante 10 minutos a 3000 RPM. Después de la centrifugación, los tubos de fotogel se expusieron a luz ultravioleta en una caja de luz durante 1 minuto. Se extrajo el plasma de cada tubo y, para los tubos que incluían la barrera solidificada, se extrajo todo el plasma. Para el tubo de control sin gel, se tuvo cuidado de no romper la capa celular, lo que requería dejar algo de plasma (aproximadamente 100 uL). El plasma se envió al laboratorio de patología molecular para el análisis de ADN-Braf. Allí, los cuatro tubos se dividieron en alícuotas adicionales en tres muestras cada uno. Por lo tanto, la variabilidad que se muestra incluye el proceso de dividir el plasma de cada tubo de tres maneras.

El plasma que se obtuvo de un tubo con EDTA sin gel se muestreó manualmente en la capa superior, la capa inferior (cerca de las células) y la porción media. El plasma se mezcló mediante vórtice y se muestreó nuevamente ("mezclado"). Las curvas de fusión que se muestran más abajo demuestran que el ADNcf recuperado varía con el muestreo manual. Se usó ADN libre de células como marcador putativo para la recuperación de plaquetas.

En el ejemplo que se muestra en la Figura 4, la alícuota que se tomó de la capa inferior del plasma sin mezclar tenía más ADNcf que la alícuota que se tomó de una porción central o de una porción superior mixta (mayor profundidad indica una mayor recuperación).

Debido a que los métodos que se describen en la presente descripción incluyen el uso de una PSS que se endurece para formar una barrera sólida, la fracción de PRP se puede mezclar dentro del tubo de recolección en el que se obtiene o separa, lo que permite homogeneizar la fracción de PRP en el tubo de recolección sin exposición a un entorno fuera del tubo de recolección. Se apreciará que la PSS permite al usuario obtener un recuento de plaquetas fiable y homogéneo debido a que las cantidades que se obtienen de diferentes porciones del tubo pueden estar dentro de un coeficiente de variación del método de recuento de células usado.

Viabilidad Plaquetaria

Como se discutió anteriormente, los solicitantes pudieron demostrar que se podría lograr una recuperación de plaquetas similar o incluso mejorada mediante el uso de los métodos y las PSS de la presente descripción. Se sabe en la técnica que las barreras sólidas con polímeros largos, aunque a menudo mejoran la recuperación de plaquetas, interfieren con la función plaquetaria. Los experimentos y los datos que se proporcionan más abajo muestran que los métodos del solicitante y las PSS permiten una recuperación de plaquetas óptima mientras se mantiene la viabilidad de las plaquetas.

La viabilidad plaquetaria se probó observando la agregación plaquetaria a agonistas específicos en el agregómetro Chrono-log. El PRP se obtuvo centrifugando sangre total cargada en un tubo de control (tubo de citrato de sodio BD, sin gel), tubo LAI (citrato de sodio BD al que se agregó LAI) y tubo LAIE (tubo de citrato de sodio BD con LAIE agregado). Los tubos de fotogel se expusieron a luz ultravioleta después de la centrifugación para solidificar la barrera. El PRP se dividió en alícuotas y se diluyó con plasma pobre en plaquetas hasta una concentración de plaquetas requerida por el procedimiento operativo estándar Chrono-log. Más abajo se muestran ejemplos de curvas de agregación plaquetaria a ristocetina y colágeno. El colágeno es un agonista fuerte que induce la agregación, la secreción de gránulos plaquetarios y la síntesis de tromboxano, por lo que es una prueba inclusiva para la viabilidad plaquetaria.

Como se ilustra en la Figura 5, no se mostró una diferencia significativa en la agregación a la ristocetina entre el control, LAI y LAIE.

Como se ilustra en la Figura 6, no se observa una diferencia apreciable en las curvas de agregación plaquetaria de plaquetas a colágeno de las curvas de control, LAI o LAIE, lo que indica que LAI y LAIE no afectan sustancialmente la funcionalidad plaquetaria.

La Figura 7 ilustra otro método 700 para separar una fracción de PRP de una muestra de sangre total en un tubo de recolección que incluye una PSS que es fluida con sangre total y tiene una densidad entre una densidad promedio de una fracción de p Rp y una densidad promedio de una fracción sin PRP de sangre total.

El método 700 incluye la etapa de centrifugar la muestra de sangre total en el tubo de recolección, incluida la PSS, mediante el uso de un protocolo de centrifugación como se muestra en la etapa 710. De manera similar a la etapa de centrifugación del método 200, la centrifugación mediante el uso de un protocolo de centrifugación adecuado hará que la PSS fluya entre la fracción de PRP y la fracción sin PRP sin una activación sustancial de plaquetas como se muestra en la etapa 712. La activación sustancial se puede medir en base a la capacidad de las plaquetas en la fracción de PRP para agregarse al menos a uno de ristocetina y colágeno, como se muestra en la etapa 715. El método 700 incluye además la etapa de endurecer la PSS sin una activación sustancial de las plaquetas para formar una barrera sólida entre la fracción de PRP y la fracción sin PRP como se muestra en la etapa 720. La PSS de la barrera sólida tendrá un peso molecular promedio mayor que el peso molecular promedio de la PSS cuando es fluida con la sangre total (por ejemplo, antes de la etapa de endurecimiento) de acuerdo con la etapa 725.

En algunos métodos preferidos, la barrera sólida, después de la exposición a la energía ultravioleta, será estacionaria con respecto al tubo de recolección en una posición intermedia por debajo de la fracción de PRP y por encima de la fracción sin PRP y será impermeable hasta un grado que evite la mezcla de la fracción de PRP y la fracción sin PRP tras la agitación como se muestra en la etapa 722. La barrera sólida permite la extracción de al menos el 90 %, con mayor preferencia al menos el 95 % y con la máxima preferencia el 100 % de la fracción de PRP del tubo de recolección. Visto desde una perspectiva diferente, el método 700 incluye una etapa opcional de retirar al menos el 95 % de la fracción de PRP del tubo de recolección de acuerdo con la etapa 730.

La fracción de PRP puede comprender ventajosamente no más del 10% de glóbulos blancos de la muestra de sangre total. Adicional o alternativamente, se contempla que no más del 25 % de los glóbulos blancos en la fracción de PRP serán granulocitos. Visto desde otra perspectiva, una reducción significativa de glóbulos blancos (por ejemplo, menos del 60 %, menos del 70 %, menos del 80 % o incluso menos del 90 %) y una reducción significativa de granulocitos (por ejemplo, menos del 50 %, menos del 70 %, menos del 80 % o incluso menos del 90 %) se pueden encontrar en una fracción de PRP en comparación con el mismo volumen de muestra en sangre total.

El método 700 también podría comprender homogeneizar la fracción de PRP en el tubo de recolección después de la etapa de endurecimiento. La etapa de homogeneización podría realizarse inmediatamente después del endurecimiento, dentro de una hora después del endurecimiento, dentro de un día después del endurecimiento, al menos dos días después del endurecimiento, al menos cinco días después del endurecimiento, o incluso al menos un mes después del endurecimiento. La homogeneización de la fracción de PRP da como resultado una fracción de PRP sustancialmente homogénea, de manera que las diferentes alícuotas que se toman de la misma tienen recuentos de plaquetas que se encuentran dentro de un coeficiente de variación de un método de recuento de células usado.

La Figura 8 ilustra aún otro método 800 para separar una fracción de PRP de una muestra de sangre total en un tubo de recolección que incluye una PSS que es fluida con sangre total y tiene una densidad entre una densidad promedio de una fracción de PRP y una densidad promedio de una fracción sin PRP de sangre total.

Se apreciará que una fracción de PRP podría tener cualquier concentración de plaquetas adecuada que sea mayor que la concentración de plaquetas de una muestra de sangre total de la que se obtiene o se separa. Por ejemplo, una fracción de PRP podría comprender al menos 150 %, al menos 200 %, al menos 250 % o incluso una mayor concentración de plaquetas de una concentración de plaquetas de la muestra de la que se obtiene. Visto desde una perspectiva diferente, una fracción de PRP podría comprender entre un 180% y un 260% de concentración de plaquetas o entre un 200 % y un 250 % de concentración de plaquetas de una concentración de plaquetas de la muestra de la que se obtiene.

El método 800 incluye una etapa de centrifugar una muestra de sangre total en un tubo de recolección que incluye una PSS y bajo un primer protocolo de centrifugación como se muestra en la etapa 810. La centrifugación según el primer protocolo puede hacer que la PSS fluya entre la fracción de PRP y la fracción sin PRP, preferentemente sin una activación sustancial de las plaquetas como se muestra en la etapa 812.

El método 800 también incluye una etapa de exposición del tubo de recolección, después de la centrifugación, a una energía ultravioleta durante un período de menos de diez minutos para polimerizar la PSS y formar una barrera sólida como se muestra en la etapa 820. La PSS de la barrera sólida tendrá un peso molecular promedio que es mayor que el peso molecular promedio de la PSS cuando es fluida con la muestra de sangre total como se muestra en la etapa 822.

El método 800 incluye además una etapa de homogeneización de la fracción de PRP en presencia de la barrera sólida para formar una fracción de PRP sustancialmente homogénea de manera que las diferentes alícuotas que se toman de la misma tengan recuentos de plaquetas dentro de un coeficiente de variación de un método de recuento de células usado.

Los métodos que se describen en la presente descripción permiten ventajosamente al usuario separar fracciones de diferentes densidades de una muestra (por ejemplo, sangre) que se incluye en un tubo de recolección con una PSS. La barrera sólida permite tanto la homogeneidad como la reproducibilidad, y el solicitante descubrió que se podrían lograr más ventajas proporcionando un adaptador de manera que los tubos en los que se separan las fracciones nunca necesiten abrirse.

Una vez que se separa una BMAF o una fracción de PRP en un tubo de recolección, sería ventajoso transferir la fracción desde el tubo de separación/preparación a otro recipiente mientras se mantiene la esterilidad de la muestra. Esto podría permitir el uso doméstico de la fracción separada, por ejemplo, como una solución de gotas oftalmológicas de PRP para el tratamiento de heridas, llagas u otras afecciones.

Las Figuras 9A-9I ilustran una modalidad de un dispositivo de transferencia 900 contemplado que se usa para transferir una sustancia separada (por ejemplo, PRP, BMAF) desde un primer vacutainer a un segundo vacutainer. Se apreciará que, sin embargo, el dispositivo de transferencia 900 podría usarse para transferir cualquier sustancia desde cualquier recipiente de preparación comercialmente adecuado a cualquier recipiente de usuario comercialmente adecuado. Como un ejemplo no limitante, el dispositivo de transferencia 900 podría usarse para transferir una fracción de PRP de sangre total desde un vacutainer a un recipiente cuentagotas estéril que tenga un septo autosellante.

El dispositivo de transferencia 900 incluye una carcasa que encierra al menos parcialmente una estructura de base, una aguja de transferencia y una aguja de ventilación (902 y 904, respectivamente). La carcasa y una primera porción de la estructura de base se acoplan o unen de manera fija entre sí y definen al menos parcialmente una primera sección interna 910 y una segunda sección interna 920 en lados opuestos de la primera porción.

La carcasa y la segunda porción de la estructura de base se acoplan entre sí de manera móvil. La segunda porción de la estructura de base se acopla de manera móvil a una pared interior de la carcasa, y la primera porción de la estructura de base se une de manera fija a una pared interior de la carcasa.

Cuando una porción de la estructura de base es móvil, se apreciará que los volúmenes de las secciones internas primera y segunda no cambian. En cambio, las secciones internas primera y segunda deberían verse como las secciones separadas por la estructura de base cuando las diferentes porciones de la estructura de base se alinean una al lado de la otra en la medida de lo posible.

Como se ilustra, la primera sección interna 910 incluye una porción de la aguja de transferencia 902 y una porción de la aguja de ventilación 904. La segunda sección interna 920 solo incluye una porción de la aguja de transferencia 902. La aguja de ventilación 902 solo se extiende por encima de la base y se configura para perforar solo un tubo que se dispone dentro de la primera sección interna 910. Más específicamente, la aguja de transferencia 902 se extiende a través de una primera porción de la base del dispositivo de transferencia, y la aguja de ventilación 904 se puede unir a (pero no extenderse a través de) una segunda porción de la base del dispositivo de transferencia. La segunda porción de la base que incluye la segunda aguja de ventilación puede moverse con relación a la carcasa. La aguja de ventilación 902 se acopla a una ventilación 930 que se extiende a través de una ranura alargada 925 de la carcasa. Cuando la aguja de ventilación 902 perfora un tapón de goma del tubo de preparación, el aire puede fluir a través de la ventilación 930, a través de la aguja de ventilación 902 y al interior del tubo de preparación. La cantidad de aguja de ventilación 902 que se coloca dentro de la primera sección interna 910 y por lo tanto puede perforar un tubo de preparación puede variar en dependencia de la posición de la ventilación 930 a través de la ranura alargada 925 y la posición de la segunda porción de la base con relación a la carcasa.

Se contempla que la ventilación se pueda acoplar de manera fija a la segunda porción de la base. El acoplamiento de las agujas, la ventilación y una segunda porción móvil de la estructura de base a la carcasa puede garantizar que la aguja de ventilación (y el aire a través de la ventilación) no entre en un tubo de preparación 935 hasta que la aguja de transferencia entre en el tubo de transferencia 940.

Se contempla que la ventilación podría acoplarse de manera móvil (por ejemplo, deslizable) a la segunda porción de la base. El acoplamiento de las agujas, la ventilación y la porción de la sección fija de la estructura de base a la carcasa puede garantizar que la aguja de ventilación no entre en el tubo de preparación 935 hasta que la aguja de transferencia entre en el tubo de transferencia 940. El usuario podría perforar un tubo de preparación y un tubo de transferencia con la aguja de transferencia (dentro de las secciones internas primera y segunda de la carcasa), y luego deslizar la ventilación hacia la primera sección interna 910 de la carcasa para perforar el tubo de preparación con la aguja de ventilación.

Adicional o alternativamente, se apreciará que tanto la segunda porción de la estructura de base como la ventilación podrían ser móviles con relación a la carcasa.

Cuando se usa el dispositivo de transferencia 900, la ventilación 930 estará inicialmente preferentemente en una configuración como se muestra en las Figuras 9E y 9F, en un borde inferior de la ranura hacia la segunda sección interna. En dicha configuración, la ventilación 930 se coloca dentro de la ranura en una posición más cercana a la segunda porción interna de la carcasa. Cuando el tubo de preparación 935, que incluye la muestra a transferir, se coloca al menos parcialmente dentro de la primera sección interna 910, la aguja de transferencia podría perforar su septo de goma y la aguja de ventilación podría permanecer fuera del tubo 935.

El tubo de transferencia estéril 940 puede entonces insertarse parcialmente en la segunda porción interna 920 de manera que la aguja de transferencia perfora el septo autosellante del tubo 940 (u otro recipiente). A medida que la aguja de transferencia entra en el tubo 940, se contempla que la ventilación 930 y la aguja de ventilación se muevan como se muestra en las Figuras 9D y 9G de manera que la segunda aguja perfore un septo del tubo 935.

A medida que la aguja de ventilación perfora el septo del tubo 935, el aire entra en el tubo 935 a través de la ventilación 930 y hace que sustancialmente todo el PRP del tubo 935 se transfiera al tubo 940 a través de la aguja de transferencia, como se muestra en las Figuras 9G, 9H y 9I.

Las Figuras 10A-10D proporcionan vistas en sección transversal de otro dispositivo de transferencia que se usa para transferir una sustancia separada de un primer recipiente a un segundo recipiente.

En la Figura 10A, el recipiente de preparación (recipiente superior) 1080 se coloca boca abajo en la primera sección interna 1050 del dispositivo de transferencia. El recipiente de preparación 1080 incluye un tapón de goma 1089, una fracción de suero 1088, aire 1086, una sustancia separadora 1084 y una fracción celular 1082. Cuando la sustancia separadora es una PSS como se describe en la presente descripción, se apreciará que el recipiente de preparación puede colocarse ventajosamente boca abajo en la primera sección interna sin que se desprenda o se mueva de otro modo.

De manera similar al dispositivo 900, el dispositivo 1000 incluye una carcasa (o cubierta de seguridad) 1010, una estructura de base, una aguja de transferencia 1020 que se extiende a través de las secciones internas primera y segunda (1050 y 1060, respectivamente) y una aguja de ventilación móvil 1030 que se acopla a una ventilación 1035 y se extiende desde la estructura de base hasta la primera sección interna 1050.

Una vez que la aguja de transferencia 1020 perfora el recipiente de preparación 1080, el tubo de vacío (recipiente inferior) 1090 podría colocarse dentro de la segunda sección interna 1060 y perforarse con la aguja de transferencia 1020.

La Figura 10B ilustra el posible posicionamiento de los componentes dentro del dispositivo de transferencia después de perforar el recipiente de preparación con la aguja de transferencia pero antes de perforar el recipiente de preparación con la aguja de ventilación. La aguja de transferencia 1020 se mantiene en su lugar en una primera parte de la estructura de base con pegamento que se inserta a través de un orificio 1045 en la carcasa.

La aguja de ventilación 1030 se acopla a una ventilación 1035 que preferentemente se extiende de manera ortogonal a la aguja de ventilación. La ventilación 1035 podría acoplarse a una parte deslizante o móvil de la estructura de base, y extenderse a través de una ranura 1040 de la carcasa. Aquí, la ventilación 1035 se coloca a través de la ranura 1040 en el extremo más cercano a la segunda porción interna 1060 de la carcasa.

En algunas modalidades preferidas, la aguja de transferencia se extenderá más hacia la segunda porción interna que la parte deslizante de la estructura de base incluso cuando la ventilación se coloque en el extremo de la ranura más cercana a la segunda porción interna de la carcasa. Esto podría ayudar a asegurar que el recipiente de transferencia (recipiente inferior) 1090 se perfore antes de que la aguja de ventilación perfore el recipiente de preparación de manera que el PRP no se desperdicie. Se pueden incluir manguitos de goma u otros (por ejemplo, 1022, 1032 y 1024) para cubrir las porciones de extremo expuestas de una o ambas agujas para evitar la contaminación o para proporcionar seguridad y esterilidad adicionales.

En la Figura 10C, la aguja de transferencia 1020 perfora el recipiente de preparación 1080 en la primera porción interna 1050 de la carcasa, y la aguja de ventilación 1030 permanece completamente fuera del recipiente de preparación 1080. En la Figura 10D, la aguja de transferencia 1020 perfora el recipiente de transferencia 1090 en la segunda porción interna 1060 de la carcasa y se mueve hacia la primera porción interna 1050. Mientras que el recipiente de transferencia 1090 se mueve hacia la primera porción interna 1050, la parte móvil de la base, la ventilación 1035 y la aguja de ventilación 1030 también se mueven hacia la primera porción interna 1050. La aguja de ventilación 1030 perfora el recipiente de preparación 1080, haciendo que entre aire en el tubo de preparación 1080 y fuerce el suero 1088 al interior del recipiente de transferencia 1090.

Las Figuras 11A-11B proporcionan un dispositivo de transferencia alternativo 1100 que podría usarse para transferir fluido desde un recipiente de preparación a otro recipiente.

En la Figura 11A, el dispositivo de transferencia 1100 comprende una aguja de transferencia de suero 1120 y una aguja de transferencia de aire 1130 que se extienden cada una hacia las secciones internas primera y segunda de una carcasa 1110. El tubo de preparación 1180 se coloca al menos parcialmente en un extremo del dispositivo de transferencia 1120, y un tubo de vacío 1190 o cuentagotas se coloca al menos parcialmente en otro extremo del dispositivo de transferencia 1120 de manera que tanto los extremos de una aguja de transferencia de suero 1120 como los de una aguja de transferencia de aire 1130 estén en ambos tubos. El extremo de la aguja de transferencia de aire que se dispone dentro de la primera sección interna se insertará preferentemente a un nivel por encima del suero 1150 en el tubo de preparación 1180. Una bomba peristáltica 1140 o de otro tipo podría funcionar para mover aire desde el tubo de vacío 1090 al tubo de preparación 1080 a través de la aguja de transferencia de aire 1130. Este volumen X de aire que se extrae del tubo de vacío crea un vacío en el tubo de vacío 1190 y el mismo volumen X de suero 1150 puede extraerse del tubo de preparación 1180 al tubo de vacío 1190 mediante la aguja de transferencia de suero 1120. La Figura 11B muestra como el volumen X de suero se mueve hacia el tubo de vacío.

Las Figuras 12A-12B proporcionan otro dispositivo más de transferencia 1200 que incluye la carcasa 1210. El dispositivo de transferencia es similar al dispositivo de las Figuras 11A a 11B. Sin embargo, se usa un dispositivo de presión 1250 en combinación con un tubo flexible 1240 en lugar de una bomba. El dispositivo de presión puede hacer que un volumen Y de aire se mueva al interior del tubo de preparación 1280 y, al mismo tiempo, hacer que se extraiga el mismo volumen Y de aire del tubo de vacío 1290. Este aire adicional en el tubo de preparación y la menor cantidad de aire en el tubo de vacío pueden hacer que el mismo volumen Y de suero 1285 se mueva desde el tubo de preparación al tubo de vacío a través de la aguja de transferencia de suero 1220.

El mecanismo que se ilustra en las Figuras 12A y 12B para mover aire al interior del tubo de preparación es un dispositivo de presión que comprime el tubo flexible y se puede mover a través del tubo con una perilla 1260. Se puede proporcionar una ranura 1270 en la carcasa 1210 del dispositivo de transferencia 1200 a través de la cual un usuario podría mover la perilla 1260 y el dispositivo de presión 1250. A medida que el dispositivo de presión 1250 se mueve hacia la primera sección interna de la carcasa, actúa para empujar el volumen Y de aire hacia arriba a través de la aguja de transferencia de aire 1230 hacia el tubo de preparación por encima del suero 1285. Simultáneamente, a medida que se mueve el dispositivo de presión, se crea un vacío en el tubo de vacío o cuentagotas de manera que el aire del tubo de vacío se introduce en el tubo flexible 1240. La Figura 12B muestra cómo el volumen X de suero 1285 se puede mover al tubo de vacío 1290.

Si bien una ventilación que se extiende a través de una ranura de la carcasa podría ser beneficiosa para permitir que un usuario coloque fácil y correctamente la aguja de ventilación como desee, dicha ventilación podría moverse por error hacia el tubo de preparación y hacer que la aguja de ventilación perfore el tubo de preparación antes de que la aguja de transferencia haya perforado el tubo de transferencia. Para diversos usos de dispositivos de transferencia, especialmente cuando un dispositivo debe ser un dispositivo desechable de un solo uso, sería ventajoso tener todos los componentes del dispositivo dispuestos dentro de una carcasa exterior para reducir o eliminar el riesgo de ajustes involuntarios.

Las Figuras 13A-C ilustran algunos dispositivos de transferencia ilustrativos donde todos los componentes se disponen dentro de la carcasa, incluida una ventilación para permitir el flujo de aire al interior del tubo de preparación.

En la Figura 13A, el dispositivo de transferencia 1300A incluye una carcasa 1310A, que incluye dos extremos abiertos, y aloja una aguja de transferencia 1320A, una aguja de ventilación 1330A, una ventilación 1350A, una primera porción de base que se acopla con la aguja de transferencia 1320A y una segunda porción de base móvil 1340A. Como se ilustra, ningún componente del dispositivo sobresale de la pared de la carcasa. En su lugar, el aire puede entrar en la ventilación, la aguja de ventilación y el tubo de preparación 1360A a través de la segunda porción interna donde se colocaría un tubo de transferencia.

En la Figura 13B, el dispositivo de transferencia 1300B incluye una carcasa 1310B, que incluye dos extremos abiertos, y aloja una aguja de transferencia 1320B, una aguja de ventilación 1330B, una ventilación 1350B, una primera porción de base que se acopla con la aguja de transferencia 1320B y una segunda porción de base móvil 1340B, a través del cual la ventilación 1350B se extiende al menos parcialmente en línea con la aguja de ventilación 1330B. Se apreciará que la porción de base podría comprender cualquier longitud adecuada para permitir que la aguja de ventilación 1330B se empuje dentro del tubo de preparación 1360B hasta un punto deseado. Se apreciará también que la ventilación 1350B puede extenderse a través de la porción de base 1340B en un ángulo, por ejemplo, hacia la segunda porción interna y luego extenderse fuera alejándose de la aguja de transferencia. Como se ilustra, ningún componente del dispositivo sobresale de la pared de la carcasa. En su lugar, el aire puede entrar en la ventilación, la aguja de ventilación y el tubo de preparación 1360A a través de la segunda porción interna donde se colocaría un tubo de transferencia.

En la Figura 13C, el dispositivo de transferencia 1300C incluye una carcasa 1310C, que incluye dos extremos abiertos, y aloja una aguja de transferencia 1320C, una aguja de ventilación 1330C, una ventilación 1350C, una primera porción de base que se acopla con la aguja de transferencia 1320C y una segunda porción de base móvil 1340C. Como se ilustra, ningún componente del dispositivo sobresale de la pared de la carcasa. En su lugar, el aire puede entrar en la ventilación, la aguja de ventilación y el tubo de preparación 1360C a través de una abertura en la carcasa 1310C.

Se apreciará que los dispositivos de transferencia adecuados pueden tener varias configuraciones. Algunos dispositivos de transferencia preferidos incluyen una aguja de transferencia que se configura para perforar simultáneamente un tubo de preparación y un tubo de transferencia, y una aguja de ventilación que se puede mover para perforar el tubo de preparación, en donde la aguja de ventilación se acopla a una ventilación a través de la cual el aire podría entrar al tubo de preparación. La ventilación podría disponerse por completo dentro de una carcasa, o podría extenderse fuera de la carcasa a través de una ranura u otra abertura.

Cualquiera de los dispositivos de transferencia que se describen en la presente descripción puede incluir uno o más filtros, que se pueden colocar sobre o adyacentes a una ventilación, una aguja de ventilación, una aguja de transferencia, una abertura de la carcasa (por ejemplo, un extremo abierto, una ranura o una abertura) o cualquier otra porción o porciones del dispositivo. Los filtros que se contemplan pueden realizar al menos una de las siguientes funciones: (a) prevenir fugas (por ejemplo, cuando el dispositivo se inclina) y (b) esterilizar el aire que entra en el dispositivo (por ejemplo, la ventilación, la aguja de ventilación) o el tubo de preparación. En al menos algunas modalidades, un filtro puede ser hidrófobo. Cuando se desea una transferencia estéril, se prefiere especialmente un filtro para la esterilidad del aire.

La Figura 14 ilustra el dispositivo de transferencia 1400, que incluye una cubierta que permite al usuario acceder y mover la ventilación 1410 a una posición deseada. La cubierta 1420 incluye una lengüeta que permite al usuario deslizar la cubierta 1420 hacia la cavidad 1430 de la carcasa. Si bien la cubierta 1420 se muestra como una puerta corrediza, se apreciará que se contempla cualquier cubierta móvil adecuada. Adicional o alternativamente, la cubierta 1420 podría ser fija pero transparente de manera que un usuario pudiera ver la posición de la ventilación 1410.

Se apreciará que se contemplan otros dispositivos de transferencia diversos que permitirían transferir un fluido desde un recipiente sellado a otro. Típicamente, cuando se coloca un tubo de preparación en un extremo de un dispositivo de transferencia comercialmente adecuado, y el tubo de evacuación o cuentagotas se coloca en otro extremo del dispositivo de transferencia, no es probable que un volumen significativo de fluido se mueva desde el tubo de preparación al tubo de evacuación por gravedad solamente. Aunque el tubo de vacío se sella al vacío y el sistema naturalmente querrá alcanzar un equilibrio, el movimiento del suero fuera del tubo de preparación crearía un vacío en el tubo de preparación. Estos dos vacíos aparentemente funcionarían uno contra el otro y alcanzarían el equilibrio antes de que pueda pasar suficiente suero al tubo de evacuación. Por lo tanto, es ventajoso aliviar el vacío que se crea en el tubo de preparación o crear un vacío más fuerte en el tubo de evacuación. La descripción anterior ilustra algunas formas de lograrlo.

Como se usa en la presente descripción, y a menos que el contexto indique lo contrario, el término "se acopla a" pretende incluir tanto el acoplamiento directo (en el que dos elementos que se acoplan entre sí entran en contacto entre sí) como el acoplamiento indirecto (en el que al menos un elemento adicional se ubica entre los dos elementos). Por lo tanto, los términos "se acopla a" y "se acopla con" se usan como sinónimos.

Será evidente para los expertos en la técnica que son posibles muchas más modificaciones además de las ya descritas sin apartarse de los conceptos inventivos en la presente descripción. El objeto de la invención, por lo tanto, no debe restringirse excepto en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Además, al interpretar tanto la descripción como las reivindicaciones, todos los términos deben interpretarse de la manera más amplia posible de acuerdo con el contexto. En particular, los términos "comprende" y "que comprende" deben interpretarse en el sentido de que se refieren a elementos, componentes o etapas de manera no exclusiva, lo que indica que los elementos, componentes o etapas a los que se hace referencia pueden estar presentes, utilizarse o combinarse con otros elementos, componentes o etapas a los que no se hace referencia expresamente. Cuando las reivindicaciones de la descripción se refieren al menos a uno de los elementos que se seleccionan del grupo que consiste de: A, B, C ... y N, el texto debe interpretarse como que requiere solo un elemento del grupo, no A más N o B más N, etc.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de transferencia (900, 1000), que comprende:

una carcasa (1010) que tiene una primera sección interna (910, 1050), una segunda sección interna (920, 1060), primero y segundo extremos abiertos, y una estructura de base que se coloca entre los primeros y segundos extremos abiertos;

en donde la estructura de base incluye una primera porción de base que se acopla de manera fija a una superficie interior de la carcasa (1010), y una segunda porción de base que se acopla de manera móvil a la superficie interior de la carcasa (1010);

una primera aguja (902, 1020) que comprende (i) una primera porción de aguja que se extiende desde la primera porción de base hasta la primera sección interna (910, 1050) y (ii) una segunda porción de aguja que se extiende desde la primera porción de base hasta la segunda sección interna (920, 1060);

una segunda aguja (904, 1030) que comprende una tercera porción de aguja que se extiende desde la segunda porción de base hasta la primera sección interna (910, 1050); y

una ventilación (930, 1035) que se acopla a la tercera porción de aguja, caracterizada porque la ventilación (930, 1035) se extiende a través de una ranura alargada (925, 1040) de la carcasa (1010).

2. El dispositivo de transferencia (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde la tercera porción de aguja es la única porción de aguja que se extiende desde la segunda base, y en donde la tercera porción de aguja no se extiende hasta la segunda sección interna (920, 1060).

3. El dispositivo de transferencia (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde la ventilación (930, 1035) se acopla de manera deslizante a la carcasa (1010).

4. El dispositivo de transferencia (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde la ventilación (930, 1035) se acopla de manera fluida a la tercera porción de aguja.

5. El dispositivo de transferencia (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde la primera aguja (902, 1020) se fija a la primera porción de base e incluye un primer extremo que se coloca dentro de la primera sección interna (910, 1050) de la carcasa (1010), y un segundo extremo que se coloca dentro de la segunda sección interna (920, 1060) de la carcasa (1010).

6. El dispositivo de transferencia (900, 1000) de la reivindicación 5, en donde la segunda aguja (904) se acopla a la segunda porción de base e incluye un tercer extremo que se coloca dentro de la primera sección (910, 1050) de la carcasa (1010), y un cuarto extremo que se acopla a la ventilación (930, 1035).

7. El dispositivo de transferencia (900, 1000) de la reivindicación 6, en donde la segunda aguja (904, 1030) se puede mover desde una primera posición a una segunda posición moviendo la estructura de ventilación (930, 1035) de manera que una posición del tercer extremo con relación al primer extremo abierto de la carcasa (1010) es ajustable.

8. El dispositivo (900, 1000) de la reivindicación 6, en donde el cuarto extremo se acopla a la ventilación (930, 1035) en un ángulo.

9. El dispositivo (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde la segunda aguja (904, 1030) se fija a la segunda porción de base.

10. El dispositivo (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde la ventilación se dispone completamente dentro de la carcasa (1010) entre los primeros y segundos extremos abiertos.

11. El dispositivo (900, 1000) de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los primeros y segundos extremos abiertos de la carcasa (1010) se cubre por una membrana.