KR20170140729A

KR20170140729A - 선복화 추출물의 적합성 시험방법

Info

Publication number: KR20170140729A
Application number: KR1020160073418A
Authority: KR
Inventors: 서정훈; 신동규
Original assignee: 제너럴바이오(주)
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2017-12-21

Abstract

본 발명은 선복화 추출물의 인체피부에 대한 적합성을 간단하면서도 명확하게 확인할 수 있는 선복화 추출물의 적합성 시험방법에 관한 것이다.
이를 위해, 본 발명은 선복화 추출물의 세포독성을 시험하는 세포독성 시험단계; 상기 선복화 추출물의 멜라닌 생합성 저해능을 시험하는 멜라닌 생합성 저해능 시험단계; 그리고, 상기 선복화 추출물의 타이로시나제 저해 활성능을 측정하는 타이로사나제(Tyrosinase) 저해 활성 측정단계를 포함하며, 상기 세포독성 시험단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법을 제공한다.

Description

선복화 추출물의 적합성 시험방법{Testing method for conformance of extracts of inulae flos}

본 발명은 선복화 추출물의 적합성 시험방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 선복화 추출물의 인체피부에 대한 적합성을 간단하면서도 명확하게 확인할 수 있는 선복화 추출물의 적합성 시험방법에 관한 것이다.

선복화는 Inula japonica Thunberg 또는 구아선복화(歐亞旋覆花) Inula britannica Linn (국화과 Compositae)의 꽃이다. 일명 금불초(金佛草)라고도 한다.

꽃으로 납작한 구형~구형이며 지름 1~2cm이며, 총포는 여러 개의 포편으로 이루어져 있고 엎어놓은 기와모양으로 배열되어 있다. 포편은 피침형 또는 막대모양으로 회황색이며 길이 0.4~1.1cm이고, 총포의 밑 부분에는 꽃줄기의 자국이 있고 포편과 꽃줄기의 겉면에는 흰색 융모로 덮여 있으며, 한 줄의 설상화는 미황색~노란색으로 길이가 약 0.7cm이며 대개 말려 있거나 탈락되어 있고 위끝에는 3개의 치열이 있다.

관상화는 여러 개로 황갈색이며 길이 0.5cm이며 위끝에는 5개의 치열이 있다. 자방의 끝에는 여러 개의 흰색 관모가 있고 길이 0.5~0.6cm이다. 어떤 것은 타원형의 작은 수과가 있으며, 가볍고 쉽게 부서지고, 냄새가 약간 있고 맛은 약간 쓰다.

이러한 선복화는 의학에서는 진토, 거담, 기관지 경련 이완 및 이뇨 작용이 있다고 하여, 가래가 나오는 증상이나 소화불량 등에 널리 사용되며, 최근에는 선복화로부터 대장암, 유방암 및 자궁 경부암에 대한 항암활성이 보고되었다.

또한, 항산화, 신경세포 및 간세포 보호 활성을 갖는 선복화의 유용 성분이 보고된 바 있다.

하지만, 선복화를 화장품 등으로 피부에 적용한 예는 보고되지 않았으며, 이러한 기술 분야에의 적용을 위한 연구개발이 요구된다.

한국공개특허 제10-2005-0100884호

본 명세서가 해결하고자 하는 과제는 선복화 추출물의 인체피부에 대한 적합성을 간단하고 명확하게 확인할 수 있는 선복화 추출물의 적합성 시험방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 선복화 추출물의 세포독성을 시험하는 세포독성 시험단계; 상기 선복화 추출물의 멜라닌 생합성 저해능을 시험하는 멜라닌 생합성 저해능 시험단계; 그리고, 상기 선복화 추출물의 타이로시나제 저해 활성능을 측정하는 타이로사나제(Tyrosinase) 저해 활성 측정단계를 포함하며, 상기 세포독성 시험단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법을 제공한다.

상기 멜라닌 생합성 저해능 시험단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하여 세포 내에 멜라닌의 생성량을 확인하는 제1 멜라닌 생합성 저해능 시험단계와, 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하여 세포 외에 멜라닌의 생성량을 확인하는 제1 멜라닌 생합성 저해능 시험단계를 포함할 수 있다.

상기 타이로사나제(Tyrosinase) 저해 활성 측정단계는 세포 내의 타이로시나제 저해 활성을 측정하는 제1 타이로시나제 저해 활성 측정단계와, 세포 외의 타이로시나제 저해 활성을 측정하는 제2 타이로시나제 저해 활성 측정단계를 포함할 수 있다.

상기 제1 타이로시나제 저해 활성 측정단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)를 웰 플레이트(well plate)에 분주하는 단계와, 분주한 후 일정 조건의 항온기에서 배양한 후, 배양액을 제거하고 부착된 세포에 선복화 추출물이 포함된 배양액을 넣고 배양하는 단계와, 배양된 세포를 모아 triton X-100 용액 및 폐닐메틸술포닐플로라이드(phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF))를 넣어 단백질을 추출하는 단계와, 추출된 단백질추출물에 L-dopa solution과 함께 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 흡광도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 제2 타이로시나제 저해 활성 측정단계는 머쉬룸 타이로시나제(mushroom tyrosinase), 기질로서 L-DOPA (dihydroxyphenylalanine) 및 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate Buffer)를 혼합하여 혼합액을 만드는 혼합액 제조단계와, 상기 혼합액을 상기 선복화 추출물에 첨가한 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 흡광도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 선복화 추출물의 적합성 시험방법은 선복화 추출물의 인체피부에 대한 적합성을 간단하면서도 명확하게 확인할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 실시예 1의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 3은 비교예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 4는 비교예 2을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 6은 비교예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 7은 비교예 2를 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 8은 비교예 3을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 10은 비교예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 11은 비교예 2를 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 12는 비교예 3을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 13은 실시예 1의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 14는 비교예 1의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 15는 비교예 2의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 16은 비교예 3의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 17은 실시예 1의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 18은 비교예 1의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 19는 비교예 2의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 20은 비교예 3의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.

이하, 본 발명에 의한 선복화 추출물의 적합성 시험방법에 대하여 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시목적을 위한 것이고, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 명세서에서 상기 선복화 추출물은 선복화를 통상의 방법에 따라 추출하여 수득한 추출물을 의미하는 것이다.

또한, 선복화 추출물은 상기 선복화 추출물을 효모, 유산균 또는 비피더스균에 접종 및 배양하여 수득되거나, 선복화 자체나 분쇄물에 곰팡이를 첨가하여 고체발효시켜 수득되는 2차 추출물을 의미하는 것이다.

본 발명자들은 멜라닌 합성 유도 자체를 억제하는 물질까지 스크리닝(screening)할 수 있는 쥐의 멜라노마 세포(B16 mouse melanoma cell)를 이용하여 연구를 거듭한 결과, 선복화 추출물이 월등히 우수한 멜라닌 생성 억제 효과와 미백 효과 및 주름 개선 효과가 있음을 밝혀내고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서의 상기 화장료 조성물은 선복화 추출물을 유효성분으로 포함한다.

선복화는 통상의 방법에 따라 추출물로 제조할 수 있다. 예를 들어 증류수, 탄소수 1∼4 개의 무수 또는 함수 저급알코올과 같은 유기용매로 추출한 후 감압 농축한 다음 건조하여 1차 추출물을 수득할 수 있다. 구체적으로, 선복화를 이를 구입하여 잘게 분쇄하고, 분쇄물 건조 중량에 대하여 5 내지 20 부피의 물이나, 탄소수 1∼4 개의 무수 또는 함수 저급알코올과 같은 유기용매로 환류냉각기가 달린 추출기에서 50∼100 ℃로 1∼5 시간 동안 가열하여 선복화의 추출물을 수득한다. 그 다음 여과포로 여과한 후, 잔사를 같은 방법으로 1 회 이상씩 더 추출한 후, 추출액들을 합하여 감압농축하고, 동결건조나 분무건조하여 건조추출물을 얻는다.

상기와 같이 수득한 추출물을 효모, 유산균 또는 비피더스균에 첨가, 배양하여 최종 발효 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 상기 선복화의 추출물은 효모, 유산균 또는 비피더스균의 기본 배지에 1 내지 20 중량%로 첨가되는 것이 바람직하다.

상기 효모는 Saccharomyces cerevisiae(사카로마이세스 세레비제), Schizosaccharomyces ellipsoids(스키조사카로마이세스 일립소이드), Saccharomyces boulardii(사카로마이세스 보울라디)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

상기 유산균은 Lactobacillus acidophilus(락토바실러스 아시도필루스), Lactobacillus casei(락토바실러스 카제이), Lactobacillus bulgaricus (락토바실러스 불가리쿠스), Lactobacillus rhamnosus(락토바실러스 람노서스), Lactobacillus plantarum(락토바실러스 플란타룸) Lactobacillus reuteri (락토바실러스 루테리), Lactobacillus confusus(락토바실러스 컨퓨서스), Lactobacillus fermentum(락토바실러스 퍼멘툼) 및 Lactobacillus brevis(락토바실러스 브레비스)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

상기 비피더스균은 Bifidobacterium bifidum(비피도박테리움 비피덤), Bifidobacterium longum(비피도박테리움 롱검) 및 Bifidobacterium infantis(비피도박테리움 인판티스)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 선복화 추출물은 선복화 자체 또는 절편, 분말화하여 곰팡이(fungi)를 접종하고 고체발효하여 수득되는 것일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 곰팡이는 차가버섯(Inonnotus-obliquus), 동충하초균류(Cordyceps sinensis, Paecilomyces japonica), 상황버섯(phellinus linteus) 및 영지버섯(Ganoderma lucidum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

보다 구체적으로 설명하면, 미생물로 효모를 사용할 경우에는 일정한 농도(약 10⁵ ∼10⁷ cells/mL)로 선복화의 1차 추출물이 각각 함유된 기본 배지(YM배지)에 효모를 접종한 후, pH 5.5∼6.5, 온도 25∼35 ℃, 통기량 0.05∼0.5 VVM의 조건을 유지하면서 30∼120시간 동안 배양한다. 그 뒤, 이 발효액을 원심분리하여 고분자 침전물과 효모균체를 제거하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치에서 60 ℃로 감압농축한 후 동결건조하여 발효 추출물을 수득할 수 있다.

미생물로 유산균을 사용할 경우에는 일정한 농도(약 10⁵∼10⁷ cells/mL)로 선복화의 1차 추출물이 각각 함유된 기본 배지(MRS 배지)에 유산균을 접종한 후, pH 6.5∼7.5, 온도 35∼38 ℃, 통기량 1 VVM의 조건을 유지하면서 24∼120 시간 동안 배양한다. 그 뒤, 이 발효액을 원심분리하여 고분자 침전물과 유산균체를 제거하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치에서 60 ℃로 감압농축한 후 동결건조하여 각각의 약재 발효 추출물을 수득할 수 있다.

미생물로 비피더스균을 사용할 경우에는 일정한 농도(약 10⁵∼10⁷ cells/mL)로 선복화의 1차 추출물이 각각 함유된 기본 배지(BL 배지)에 비피더스균을 접종한 후, pH 6.5∼7.5, 온도 35∼38 ℃, 혐기배양 조건을 유지하면서 24∼120 시간 동안 배양한다. 그 뒤, 이 발효액을 원심분리하여 고분자 침전물과 비피더스균체를 제거하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치에서 60 ℃로 감압농축한 후 동결건조하여 발효 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 미생물로 곰팡이(fungi)를 사용할 경우에는 선복화 자체 또는 절편, 분말화한 분쇄물 각각에 곰팡이를 1∼10 중량%로 접종하고, 18∼25 ℃, 습도 60∼70 %에서 60 일간 고체발효시켜 발효 추출물을 수득할 수 있다.

상기와 같은 발효 추출액들은 쥐의 멜라노마 세포(B-16 melanoma cell)에 처리하였을 때 월등히 우수한 멜라닌 합성 저해효과를 나타낸다. 또한, 상기 발효 추출액들을 이용하여 화장료를 제조한 후 사람의 피부에 도포하였을 때 어떤 부작용의 발생 없이 피부에 안전하며, 매우 우수한 기미, 주근깨 개선, 주름개선 효과 및 피부 미백 효과를 나타낸다.

본 명세서에서 상기 선복화의 발효추출물로 DPPH 라디칼 소거 활성 확인 실험, 세포독성 확인 실험, 멜라닌생성 억제효과확인 실험, 타이로시나제(Tyrosinase) 활성 억제 효과 확인 실험을 수행한 결과 우수한 효과를 보였다. 또한, 피부 적용 시험 결과, 주름개선 효과, 미백 및 노화 억제 활성이 우수하다는 사실을 확인하였다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 선복화 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 조성물 총 중량에 대하여 0.0001중량% 이상, 상세하게는 0.001 중량% 이상, 더욱 상세하게는 0.01중량% 이상을 함유될 수 있고, 10%이하, 상세하게는 2% 이하, 더욱 상세하게는 1 중량% 이하로 포함될 수 있다. 사용량이 0.0001 중량% 미만이면 미백효과 또는 주름 개선 효과가 크게 감소되며, 10 중량%를 초과하면 피부 독성 등의 문제가 생길 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 화장료 조성물로는 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.

예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 로션, 바디로션, 영양 크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 패치, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료, 립스틱, 메이크업베이스 또는 파운데이션 등의 색조 화장료, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 치약 또는 구강 청정제 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 팩일 수 있다. 팩은 피부의 보습, 혈행 촉진, 청정을 목적으로 대상 부위에 도포하는 것이다. 팩은 일반적으로, 젤리상, 페이스트상, 분말상, 크림상 액상 등을 예시할 수 있으며, 안면에 도포하여 피막을 형성시킨 후 박리하는 것이나, 도포 후에 닦아내는 것, 도포 후 씻어내는 것 등이 있다. 분말상의 것은 사용시에 물 등에 균일하게 녹이던지 현탁해서 사용한다. 또한, 아이마스크 등의 형상의 부직포나 콜라겐 시트에 화장료 조성물을 함침시킨 팩이거나, 상기 부직포 등을 사용시에 화장료 조성물에 침지해 이용하는 팩일 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.

그리고, 본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

이하, 본 명세서를 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 명세서를 예시하는 것일 뿐, 본 명세서의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 명세서의 개시가 완전하도록 하고, 본 명세서이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명세서의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1>

항산화 활성 시험으로서 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Aldrich, USA)를 이용하여 시료의 자유 라디칼(Free-radical) 소거효과를 측정하였다. 메탄올에 용해시킨 0.4mM DPPH 용액, 0.8 mL와 0.1M phosphate buffer (pH 6.5) 2 mL, 99.9% 에탄올 2mL, 선복화 추출물(실시예 1)을 상온에서 10 초간 혼합 후 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 선복화 추출물은 통상의 방법으로 제조하였다. 전자공여능은 선복화 추출물(실시예 1) 첨가군과 이를 첨가하지 않은 대조군과의 흡광도차를 비교하여 측정하였고, 라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다. 도 1은 실시예 1의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.

< 실험예 2>

멜라닌 색소를 다량 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 선복화 추출물(실시예 1), 나이아신 아마이드(비교예 1), 그리고 아데노신(비교예 2)을 농도별로 처리한 후, 세포독성을 MTT 방법을 통하여 확인하였다. 도 2는 실시예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 것이다. 도 3은 비교예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 것이다. 도 4는 비교예 2을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 것이다. 세포생존율을 살펴보면 본 실시 예에 따른 선복화 추출물을 사용하는 경우에 세포 생존율이 높음을 알 수 있다.

<실험예 3>

멜라닌 색소를 다량 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 선복화 추출물(실시예 1), 나이아신 아마이드(비교예 1), 아데노신(비교예 2), 아르부틴(비교예 3)을 농도별로 처리한 후, 멜라닌의 세포외 및 세포내 생성양을 확인하였다. 그 결과 선복화 추출물에 농도의존적으로 멜라닌 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 도 5는 실시예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다. 도 6은 비교예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.도 7은 비교예 2를 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.도 8은 비교예 3을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포외 멜라닌 함량을 나타낸 것이다. 선복화 추출물을 사용하는 경우 세포외에서 멜라닌 생성이 효율적으로 억제됨을 알 수 있다.

도 9는 실시예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다. 도 10은 비교예 1을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다. 도 11은 비교예 2를 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.도 12는 비교예 3을 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 농도별로 처리하였을 때 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것이다. 그 결과 선복화 추출물의 농도에 의존적으로 멜라닌의 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있다.

< 실험예 4>

세포외 타이로시나제 활성 측정은 도파크롬(dopachrome) 방법을 이용하였다. 머쉬룸 타이로시나제(mushroom tyrosinase)를 1,250 unit/mL, 기질로서 L-DOPA (dihydroxyphenylalanine) 5 mM, 0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate Buffer) (pH 6.8) 혼합액을 시료(선복화 추출물(실시예 1), 나이아신 아마이드(비교예 1), 아데노신(비교예 2) 또는 아르부틴(비교예 3))와 함께 첨가한 후 37 ℃에서 15분간 반응시켜 475 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 흡광도를 측정하였다. 타이로시나제 저해 활성능은 아래 환산식에 의하여 계산하였다.

타이로시나제 저해 활성능 (%) ＝{1－(A－B) / (C - D) } × 100

A와 B는 각각 시료가 첨가된 용액의 배양 후와 배양 전의 흡광도이며, C와 D는 각각 시료를 넣지 않은 용액 (기준 용액)의 배양 후와 배양 전의 흡광도이다. 이들 티로시나아제 억제효과는 100으로 나타날 때 완전한 억제를 의미하며, 0일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미한다. 도 13은 실시예 1의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 도 14는 비교예 1의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다.도 15는 비교예 2의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 도 16은 비교예 3의 세포외 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 결과적으로, 세포외의 타이로시나제 저해 활성능은 시료(선복화 추출물 등)의 농도에 의존적임을 알 수 있다.

<실험예 5>

멜라닌 색소를 다량 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)를 12 well plate에 0.4×10⁵ cells/mL 농도로 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건의 항온기에서 전 배양 24시간 후 배양액을 제거하고 부착된 세포에 시험 시료(선복화 추출물(실시예 1), 나이아신 아마이드(비교예 1), 아데노신(비교예 2) 또는 아르부틴(비교예 3))가 포함된 동일양의 배양액을 처리하여 2-3일간 같은 조건에서 배양하였다. 배양된 세포를 모아 0.1% triton X-100 용액과 0.1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)를 넣어 단백질을 추출하였다. 단백질추출물에 0.1% L-dopa solution (5.0 mM in 50 mM phosphate-buffered saline, pH 6.8)과 함께 37 ℃에서 30 분 간 반응 시킨 후 490 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 흡광도를 측정하였다. 도 17은 실시예 1의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 도 18은 비교예 1의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 도 19는 비교예 2의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 도 20은 비교예 3의 세포내 타이로시나제 저해 활성을 측정한 것이다. 그 결과 선복화 추출물의 경우에 세포 내의 타이로시나제 저해 활성능이 높은 것을 확인할 수 있다.

하기에 본 명세서에 따른 화장료 조성물의 제형예를 설명하나, 하기 예시 이외에도 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 명세서를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 영양 화장수(로션)

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
선복화의 발표 추출물	1.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 2] 유연 화장수(스킨 로션)

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
선복화의 발표 추출물	1.0
글리세린	3.5
올레일알코올	1.5
에탄올	5.5
폴리솔베이트 80	3.2
카르복실비닐폴리머	1.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 3] 영양 크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
선복화의 발표 추출물	1.0
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 4] 맛사지 크림

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 맛사지 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
선복화의 발표 추출물	1.0
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
파라핀	1.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 5] 팩

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
선복화의 발표 추출물	1.0
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올 방부제	적량
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

< 실험예 6>

상기 제형예 1의 로션(시험 제품)을 만 29~59세의 여성을 대상으로 8주 동안 안면 한쪽에 사용하게 하고, 안면의 다른 한 쪽에 대조제품(Placebo)을 사용하게 한 후, 제품 사용 전후 시험 부위를 평가하고 시험 종료 후 유효성 및 기호도 설문평가를 하였다. 본 시험을 종료한 시험 대상자는 22명이었고, 중도 탈락자는 1명이었다. 모두 여성으로 평균 연령 47.55세였다. 선정된 시험 대상자들은 특별한 피부 증상은 없었으며 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용이 없었다. 시험제품군의 피부 밝기(L*) 측정값은 사용 전과 비교하여 사용 8주 후 유의하였다(p<0.05). 대조제품과 비교하여 사용 8주 후 모두 유의하게 감소하였다. 시험제품군의 멜라닌(M.I) 측정값은 사용 전과 비교하여 사용 4주 후, 8주 후 유의하였다(p<0.05). 대조제품과 비교하여 사용 8주 후 모두 유의하게 감소하였다. 유효성 평가 설문조사 결과, 시험제품의 미백 개선 정도에 대하여 95.45%의 시험대상자가 보통 이상으로 평가하였다. 시험대상자가 8주간 제품을 사용하는 동안 특별한 피부 이상 반응에 대하여 보고하지 않았고, 피부과 전문의에 의한 의학적 검사상에도 이상 소견이 관찰되지 않았다. 따라서 시험제품인 로션은 8주 사용으로 피부에 자극 없이 미백 개선에 도움을 주는 것으로 판단되었다.

< 실험예 7>

상기 제형예 1의 로션(시험 제품)을 만 29~59세의 여성을 대상으로 8주 동안 안면 한쪽에 사용하게 하고, 안면의 다른 한 쪽에 대조제품(Placebo)을 사용하게 한 후, 제품 사용 전후 시험 부위를 평가하고 시험 종료 후 유효성 및 기호도 설문평가를 하였다. 본 시험을 종료한 시험 대상자는 22명이었고, 중도 탈락자는 1명이었다. 모두 여성으로 평균 연령 47.55세였다. 선정된 시험 대상자들은 특별한 피부 증상은 없었으며 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용이 없었다. 시험제품군의 눈가 주름 분석값 R1은 사용 전과 비교하여 사용 8주 후 유의하였다(p<0.05). 대조제품과 비교하여 사용 8주 후 모두 유의하게 감소하였다. 시험제품군의 눈가 주름 분석값 R2는 사용 전과 비교하여 사용 8주 후 유의하였다(p<0.05). 대조제품과 비교하여 사용 8주 후 모두 유의하게 감소하였다. 시험제품군의 눈가 주름 분석값 R3은 사용 전과 비교하여 사용 4주 후, 8주 후 유의하였다(p<0.05). 대조제품과 비교하여 사용 8주 후 모두 유의하게 감소하였다. 유효성 평가 설문조사 결과, 시험제품의 미백 개선 정도에 대하여 95.45%의 시험대상자가 보통 이상으로 평가하였다. 시험대상자가 8주간 제품을 사용하는 동안 특별한 피부 이상 반응에 대하여 보고하지 않았고, 피부과 전문의에 의한 의학적 검사상에도 이상 소견이 관찰되지 않았다. 따라서 시험제품인 로션은 8주 사용으로 피부에 자극 없이 주름 개선에 도움을 주는 것으로 판단되었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

선복화 추출물의 세포독성을 시험하는 세포독성 시험단계;
상기 선복화 추출물의 멜라닌 생합성 저해능을 시험하는 멜라닌 생합성 저해능 시험단계; 그리고,
상기 선복화 추출물의 타이로시나제 저해 활성능을 측정하는 타이로사나제(Tyrosinase) 저해 활성 측정단계를 포함하며,
상기 세포독성 시험단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법.
제1항에 있어서,
상기 멜라닌 생합성 저해능 시험단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하여 세포 내에 멜라닌의 생성량을 확인하는 제1 멜라닌 생합성 저해능 시험단계와, 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포에 상기 선복화 추출물을 농도별로 처리하여 세포 외에 멜라닌의 생성량을 확인하는 제1 멜라닌 생합성 저해능 시험단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법.
제1항에 있어서,
상기 타이로사나제(Tyrosinase) 저해 활성 측정단계는 세포 내의 타이로시나제 저해 활성을 측정하는 제1 타이로시나제 저해 활성 측정단계와, 세포 외의 타이로시나제 저해 활성을 측정하는 제2 타이로시나제 저해 활성 측정단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법.
제3항에 있어서,
상기 제1 타이로시나제 저해 활성 측정단계는 멜라닌 색소를 함유하고 있는 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)를 웰 플레이트(well plate)에 분주하는 단계와,
분주한 후 일정 조건의 항온기에서 배양한 후, 배양액을 제거하고 부착된 세포에 선복화 추출물이 포함된 배양액을 넣고 배양하는 단계와,
배양된 세포를 모아 triton X-100 용액 및 폐닐메틸술포닐플로라이드(phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF))를 넣어 단백질을 추출하는 단계와,
추출된 단백질추출물에 L-dopa solution과 함께 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법.
제3항에 있어서,
상기 제2 타이로시나제 저해 활성 측정단계는 머쉬룸 타이로시나제(mushroom tyrosinase), 기질로서 L-DOPA (dihydroxyphenylalanine) 및 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate Buffer)를 혼합하여 혼합액을 만드는 혼합액 제조단계와,
상기 혼합액을 상기 선복화 추출물에 첨가한 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 선복화 추출물의 적합성 시험방법.