KR20170138556A - 항ccr4 항체를 이용하여 사이토카인 발현을 매개하는 방법 - Google Patents

항ccr4 항체를 이용하여 사이토카인 발현을 매개하는 방법 Download PDF

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KR20170138556A
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다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
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Abstract

본 발명은 조절 T 세포 활성 및 기능을 조절하는 방법을 제공한다.

Description

항CCR4 항체를 이용하여 사이토카인 발현을 매개하는 방법
관련 출원
본 출원은 2015년 5월 1일 출원된 미국 가출원 번호 62/155,966, 2015년 9월 11일 출원된 미국 가출원 번호 62/217,419, 및 2015년 10월 6일 출원된 미국 가출원 번호 62/237,942의 이점 및 우선권을 주장하고, 상기 각 가출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 T 세포 기능을 조절하는 것에 관한 것이다.
정부 권리
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 부여된 U01 CA-152990 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
케모카인은 주로 백혈구 활성화 및 주화성에서의 그의 역할이 공지되어 있는 분비된 단백질 패밀리이다. 표적 세포 상의 케모카인 수용체와 그의 특이적인 상호작용이 신호전달 캐스케이드를 일으키고, 그 결과로, 염증성 매개인자 방출, 세포 형상 변화, 및 세포 이동이 일어난다. CC 케모카인 수용체 4(CCR4: CC chemokine receptor 4)는 CC 케모카인 CCL17 및 CCL22에 대한 동족 수용체이고, 이는 T 헬퍼 2형 세포(Th2: T helper type 2 cell), 및 조절 T 세포(Treg: regulatory T cell) 대다수를 비롯한, 기능적으로 상이한 T 세포의 서브세트 상에서 발현된다. CCL17/22 분비가 악성 엔티티, 예컨대 직장결장, 난소, 호지킨 림프종 및 교아세포종에 의한 종양 침윤 Treg 수의 증가를 촉진시킨다는 것을 나타내는 증거가 점점 증가하고 있다. 종양 중 Treg 수준 증가는 효율적인 항종양 면역 반응을 방해하고, 대개는 불량한 임상 결과 및 종양 진행과 연관이 있다.
따라서, 성공적인 암 요법의 한 주된 장애는 Treg의 종양으로의 이동, 및 종양 미세환경에서의 그의 항종양 면역 반응 억제에 의해 유발될 수 있다. Treg 억제 기능을 폐기하여, 그 결과로 항종양 면역을 촉진시키기 위한 노력으로, 최근 임상전 및 임상 연구에서 Treg에 대한 면역치료제로서 단일클론 항체(mAb)를 평가하였다. 그러나, mAb 면역요법을 이용한 전신 Treg 고갈에 대한 통고는, 이것이 자가면역과 연관될 것이 크게 예상된다는 점이다. Treg 유도성 암 면역 회피를 막기 위한 대안적 전략법은 종양 조직에서 Treg 유인 및 축적을 직접적으로 방해하는 종양 연관 Treg 표적화 요법을 개발하는 것이다.
본 발명은 조절 T 세포(Treg)의 고갈을 필요로 하는 대상에게, 각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄를 갖는 인간화 항CCR4 항체를 투여함으로써 대상에서 조절 T 세포(Treg)를 고갈시키는 방법을 제공한다. 임의로, 항체는 IgG1 중쇄 불변 영역을 가진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 사이토카인 분비 종양을 갖는 대상에게, 각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄를 갖는 인간화 항CCR4 항체를 투여함으로써 대상에서 조절 T 세포(Treg)의 사이토카인 분비 종양으로의 이동을 억제하는 방법을 제공한다. 임의로, 항체는 IgG4 중쇄 불변 영역을 가진다. 일부 측면에서, 불변 영역은 S228P 돌연변이를 포함한다. 사이토카인은 CCl2, CCl4, CCL5, CCL17 또는 CCL22이다.
이펙터 T 세포는 실질적으로 고갈되지 않는다. 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율은 종양 또는 대상에서 조절되고, 예컨대, 증가된다. 이펙터 T 세포 증식은 증가되거나, 또는 실질적으로 감소되지 않는다. 이펙터 T 세포 개수는 증가되거나, 또는 실질적으로 감소되지 않는다.
일부 측면에서, 조절 T 세포는 여포성 조절 T 세포이다.
다양한 측면에서, 이펙터 T 세포 집단으로부터의 사이토카인 방출은 조절된다. 사이토카인은 예를 들어, 인터페론-감마이다. 또 다른 측면에서, 이펙터 T 세포 집단으로부터 방출되는 이펙터 폴리펩티드는 조절된다. 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어, 그랜자임 B 또는 퍼포린이다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포 성장의 억제를 필요로 하는 대상에게, 각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄를 갖는 인간화 항CCR4 항체를 투여함으로써 대상에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 항체는 IgG4 중쇄 불변 영역 또는 IgG1 중쇄 불변 영역을 가진다.
종양은 고형 종양 또는 혈액 종양이다. 혈액 종양은 피부 T 세포 림프종(CTCL: cutaneous T-cell Lymphoma), 균상 식육종(MF: mycosis fungoides), 원발성 피부 역형성 대세포 림프종(피부 ALCL: cutaneous anaplastic large cell Lymphoma), 시자리 증후군(Sezary syndrome), 또는 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL: adult T cell Leukemia/Lymphoma)이다.
고형 종양은 신장 세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 피부암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 신장암 또는 위암, 호지킨병 또는 다형성 교아세포종(GBM: glioblastoma multiforme)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상에게 항원 및 항CCR4 항체를 투여함으로써 항원에 대하여 백신 접종하는 방법을 제공한다. 항CCR4 항체는 항원 투여 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 투여된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 Treg를, 각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄를 갖는 인간화 항CCR4 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, CCR4+ Treg에 대한 IL-2 결합을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Treg를, 각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄를 갖는 인간화 항CCR4 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, CD25 절단을 유도하는 방법을 제공한다.
다양한 측면에서, 인간화 항CCR4 항체는 이중특이적 항체의 제1 구성원이다. 이중특이적 항체의 제2 구성원은 종양 연관 항원, T 세포 기능 조절 분자, T 세포 수용체 폴리펩티드에 대해 특이적인 것이다. 종양 연관 항원은 CA-IX, ErbB2 또는 HVEM이다. T 세포 기능 조절 분자는 PD-L1, PD1, CTLA4, GITR, IL21, IL21R, CD160, TIM3, LAG3 또는 GAL9이다. T 세포 수용체 폴리펩티드는 CD3이다.
본 발명에서는 하기 약학 조성물을 1회 이상 투여한 인간 대상에 존재하는 종양에서 또는 그 종양과 연관하여 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율을 증가시키는 데에 효과적인 양으로 인간화 항CCR4 항체를 갖는 약학 조성물 또한 제공한다. 종양은 예를 들어, 고형 종양이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 그와 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고 문헌은 명백하게 그의 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서에 우위를 둔다. 추가로, 본원에 기술된 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 설명되는 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이며, 그에 포함될 것이다.
도 1. CD4 + T 세포 집단 상의 CCR4 분자 확인. (a) 인간 T 세포 집단 및 CCR4 발현 T 세포 서브세트의 확인을 위한 게이팅 전략법. (b) T 세포 하위집단의 비율(%). (c) 독립된 3명의 건강한 기증자에서 유세포 분석법에 의해 콴티BRITE(QuantiBRITE) PE 비드(적색 선), CD25고CD127dim /-CCR4+ Treg(청색 선), 및 CD25dim/-CD127+CCR4+ T 세포(오렌지색 선)의 형광 히스토그램을 실행하였다. PE 비드는 형광색소가 저수준(474개의 PE 분자/비드), 중저수준(5,359개의 PE 분자/비드), 중고수준(23,843개의 PE 분자/비드), 및 고수준(62,336개의 PE 분자/비드)의 PE 분자를 함유하였다는 것을 보여주었다. (d) 각 T 세포 하위집단 중의 CCR4+ 서브세트의 비율(%). (e) CD4+CD25-CD127+ Teff 및 CD4+CD25고CD127dim /- Treg 상의 CCR4 분자의 발현 수준. 모든 실험은 독립된 3명의 기증자에서 수행되었고, 이는 평균 ± S.E.M.을 제시하였다.
도 2. CCR4 + Treg가 면역억제를 매개하였다. (a) 유세포 분석법에 의해 CD4+CD25+FoxP3+ Treg 상의 CCR4의 발현을 사정하였다. 건강한 기증자 혈액 샘플에서의 CD3+CD4+ 림프구에 대해 게이팅된 CD25 및 FoxP3 발현(좌측의 두 플롯) 및 CD25+FoxP3+ 림프구에 대해 게이팅된 CCR4 염색(우측 플롯)의 대표적인 형광 활성화된 세포 분류기(FACS: fluorescence-activated cell sorter) 플롯. (b) 20 ㎍/ml PHA 및 Treg 또는 CCR4-Treg(Teff:Treg=10:1인 비로)와 함께 또는 그의 부재하에 배양된 CD4+ 이펙터 T 세포의 CFSE 세포 증식 프로파일을 유세포 분석법을 사용하여 CFSE+ 세포를 게이팅하여 분석하였다. mAb2-3 접합된 비드를 사용하여 CCR4-Treg를 분리하였다. 백분율(%)은 배양 7일 후 CFSE 표지된 CD4+ Teff를 나눈 비율을 나타낸다. 실험은 독립된 3명의 기증자에서 재현하였다. (c) CCR4 고갈된 Treg의 공동 배양물 중 Teff의 시험관내 억제 검정법. 10/1인 Teff/Treg 비로 독립된 3명의 기증자로부터의 CD4+ CD25+ CD127dim /- CCR4+ Treg의 존재 또는 부재하에서 공동 배양되고, 5일 동안 PHA로 자극받은 CFSE 표지된 Teff의 증식에 의해 억제 검정법을 측정하였다. CFSE 희석 Teff의 백분율(%)을 산출하였다. 이원 ANOVA에 의해 분석된 평균 ± S.E.M.이 제시되어 있다. 값 < 0.05.
도 3. 시험관내 및 생체내에서의 mAb2 -3에 의한 난소암 세포 매개 Treg 주화성의 억제. (a) 난소암 세포주, IGROV-1, OVCAR-5, 및 OVCAR-8의 배양물 중 브레펠딘 A(BFA)를 첨가하거나(청색 선), 또는 첨가하지 않고(적색 선) 세포내 케모카인 CCL22 염색을 수행하였다. (b) 트랜스웰 검정법을 사용하여 CCL22 발현 난소암 세포 상청액에 의해 유도된 CD4+CD25+ Treg의 시험관내 주화성을 수행하였다. Treg 동원이 mAb2-3 IgG1 및 IgG4에 의해서는 억제되었지만, 대조군 항체에 의해서는 억제되지 않았다. (c) 루시페라제 처리된 CD4+ T 세포 및 (d) CD4+CD25+CD127dim /- Treg 주사 후 18 h째의 난소암 이종이식편 마우스 모델의 생체내 생체발광 영상. 좌측 패널에서 관심 영역(ROI: 영역 of interest)(적색 동그라미 표시, 이종이식된 종양)의 강도를 추가로 정량화하였다. 결과는 평균 ± S.D.로 표시하였다. "*" 및 "**"는 각각 스튜던츠 t 검정 p 값 < 0.05 및 0.01을 나타낸다.
도 4. IGROV -1 세포에 대한 종양 프라이밍된 T 세포의 활성. (a) 종양 프라이밍된 T 세포를 항CD3, CD4, CD8, CD25 및 (b) CCR4 항체에 의해 염색하였다. mAb2-3 접합된 비드에 의해 CCR4 고갈된 종양 프라이밍된 T 세포 및 종양 프라이밍된 T 세포 중 T 세포 서브세트를 유세포 분석법에 의해 분석하였다. (c) 종양 프라이밍된 T 세포 및 mAb2-3에 의해 고갈된 종양 프라이밍된 T 세포를 24 및 48시간 동안 IGROV-1 세포와 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, 상청액을 수거하고, IFN-γ의 발현 수준을 검출하였다. 공동 배양된 상청액 중 IFN-γ를 메조스케일 디스커버리(MSD: mesoscale discovery)에 의해 측정하였고, 종양 프라이밍된 T 세포 배양된 상청액 중의 IFN-γ 농도 배수를 나타내었다. (d) 공동 배양물로부터의 CD4 및 CD8 T 세포의 세포내 IFN-γ 염색. 세포를 공동 배양 후 48시간째에 수거하고; 브레펠딘 A의 존재하에서 6 h 동안 인큐베이션시키고; CD3, CD4, 및 CD8에 대해 염색하고; 파라포름알데히드 중에 고정시키고; 투과화시키고; 세포내 IFN-γ에 대하여 염색하였다. 세포를 림프구에 대해 크기 및 CD 마커에 의해 게이팅하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. (e) 종양 프라이밍된 T 세포 및 mAb2-3에 의해 고갈된 종양 프라이밍된 T 세포의 세포독성 활성을 LDH ELISA 검정법에 의해 추가로 검출하였다. 모든 실험은 각 시점에서 삼중으로 평균 ± S.D.로 나타내었고, 2회에 걸친 독립 실험으로 수행되었다. *, **, 및 ***는 각각 스튜던츠 t 검정 p 값 < 0.05, 0.01, 및 0.005를 나타낸다.
도 5. mAb2 -3은 IGROV -1 프라이밍된 T 세포로 재구성된 IGROV -1- 이종이식받 은 마우스에서 종양 성장 억제를 매개하였다. (a) NSG 마우스에 2x106개의 루시페라제 처리된 IGROV-1 종양 세포를 피하로 접종하고, 4x106개의 IGROV-1 프라이밍된 T 세포를 정맥내로 주사하고, 항CCR4 항체로 처리하였다. NSG 마우스에서의 루시페라제 처리된 IGROV-1 인간 난소 암종 종양 이종이식편의 종양 성장 곡선을 측정하였다. 마우스를 3 mg/kg의 대조군 IgG4(n=2), mAb2-3 IgG1(n=3), 및 mAb2-3 IgG4(n=3) 및 동일한 부피의 PBS(n=2)로 처리하였다. 항체를 5주 동안 주 2회에 걸쳐 정맥내로 투여하였다. 매 10일마다 IVIS 영상화 시스템을 사용하여 마우스를 영상화하였다. 컬러 스케일: 발광 신호 강도: 청색, 최소 강도의 신호; 적색, 최대 강도의 신호. (b) 각 군의 종양 조직의 루시페라제 신호를 정량화하였다. 항체로 처리된 마우스의 (c) 종양 크기 및 (d) 체중을 주 2회에 걸쳐 측정하였다. (e) 종양 조직을 수거하고, (f) 종양 중량을 측정하였다. 막대 스케일, 1 cm. *, p < 0.05; ***, p < 0.005; p 값은 이원 ANOVA로 산출하였다. 모든 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시하였다.
도 6. IL-2와 CD25 사이의 상호작용에서 mAb2 -3의 중개. (a) 외인성 IL-2의 부재하에서, mAb2-3과 함께 또는 그의 부재하에 인큐베이션된 1x104개의 CD4+CD25- Teff 배양된 상청액 중의 내인성 IL-2 수준을 ELISA에 의해 분석하였다. (b) CD4+CD127dimCD49d- Treg(3000/반응)를 20 ㎍/ml의 mAb, 및 0.5/1 ㎍/ml의 플레이트 결합된 항CD3/28 항체의 존재 및 부재하에서 0.25 IU/ml의 외인성 IL-2와 함께 인큐베이션시켰다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (c) 외인성 IL-2의 부재하에서, 1x104개의 Teff 단독 또는 Treg와의 것 및 20 ㎍/ml의 mAb2-3으로 처리된 것으로부터의 내인성 IL-2 농도를 나타내었다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (d) 4 IU/ml의 외부에서 첨가된 IL-2의 존재하에서의 mAb2-3으로 처리된 Teff 및 Treg 공동 배양물로부터의 상청액 중의 IL-2의 농도. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (e) 외인성 IL-2(20 IU/ml)의 존재하에서, 항체(mAb2-3 또는 항CD25, 항TAC 및 대조군 mAb 포함)로 처리되었거나, 또는 처리되지 않은 2x105개의 Mac-1 세포로부터의 상청액의 IL-2 농도를 ELISA에 의해 검출하였다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (f) 5일 동안 0.5 IU/ml IL-2, 20 ㎍/ml mAb2-3 IgG1, 및 20 ㎍/ml 대조군 IgG1의 존재 또는 부재하에서 이를 통해 처리된 배양된 Treg 중의 생존능 염료를 측정함으로써 시험관내 세포 생존 검정법을 수행하였다. 자발적 사멸 Treg 중 상이한 군으로부터의 정규화된 사멸 Treg 비율(%)이 제시되어 있다. 각 지점은 각 군 중의 개별 기증자를 나타낸다. 막대는 평균 ± S.E.M.을 나타낸다. "**" 및 "***"는 각각 스튜던츠 t 검정을 사용함으로써 제시되는 p 값 < 0.01 및 0.005를 나타낸다.
도 7. 인간 말초 혈액 T 세포 및 피코에리트린( PE : phycoerythrin ) 접합된 비드에 대한 대표적인 유세포 분석법 플롯. (a) CD3+CD4+ T 세포를 게이팅하고, (도 1에 제시된 바와 같은) Tcm, Tem, Teff, 및 T 나이브를 구별짓기 위해 PE-Cy5 접합된 항CD45RA 및 PerCp-Cy5 접합된 항CCR7 항체로 염색하였다. 추가 분석을 위해 CD4+CD25-CD127+CCR4+ T 세포 하위집단을 게이팅하였다. PE 비드 및 T 세포 하위집단의 형광 히스토그램을 각각 적색 선 및 청색 선으로 나타내었다. (b) PE 형광을 비드당 PE 분자의 개수와 연관시키는 보정 곡선. (c) T 세포 하위집단 상의 CCR4 분자의 발현 수준. 모든 실험은 독립된 3명의 기증자에서 수행되었고, 이는 평균 ± S.D.을 제시하였다.
도 8. mAb2 -3의 존재 및 부재하의 인간 PBMC의 생체내 분포. (a) 1x107개의 인간 PBMC 및 항체를 마우스 내로 정맥내로 주사하였다. 24시간 생체내 순환 후, 마우스 혈액을 수집하고, 인간 PBMC를 파시픽 블루(Pacific Blue) 접합된 항CD3, 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 접합된 항CD4, APC 접합된 항CD25, 및 PE-Cy7 접합된 항CD127로 염색하고, 게이팅하여 Treg를 구별지었다. (b) CD25+CD127- Treg의 비율은 각 군의 3마리의 개별 마우스로부터의 평균으로 제시된 것이다. *, p 값 < 0.05. (c) 생체내 순환 후의 Treg의 분석.
도 9. huPBL - NSG 동물 모델에서의 mAb2 -3 IgG4에 대한 인간 PBMC의 생체내 반응. (a) 107개의 새로 단리된 인간 PBMC를 성체인 NSG 면역결핍 마우스 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. huPBL-NSG 마우스는 주 2회에 걸쳐 꼬리 정맥을 통해 1 mg/kg 항체를 받았다. 매주 huPBL-NSG 마우스로부터 말초 혈액을 수집하고, 인간 CD45, (b) CD45와 함께 CD19, (c) CD45와 함께 CD3, (d) CD3 및 CD45와 함께 CD4, (e) CD3 및 CD45와 함께 CD8, 및 (f) CD3 및 CD45와 함께 CD25에 대한 항인간 특이적 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 104개의 PBMC당의 양으로 정량화하였다. (g) 혈액으로부터의 CD45+ 세포 중 CD3+CD4+CD25+CD127- 세포의 비율(%)을 매주 다른 처리에서 조사하였다. (h) 3주째의 혈액, 비장 및 골수로부터의 CD45+ 세포 중 CD3+CD4+CD25+CD127- 세포의 비율(%)이 제시되어 있다. 이원 ANOVA 검정을 수행하였다. 각 데이터 점은 평균(n=6 NSG 마우스, 2명의 PBMC 기증자) ± S.E.M.을 나타낸다. * 및 **는 각각 p 값 < 0.05 및 0.01.
도 10. mAb2 -3은 CCL22에 의해 매개되는 화학주성을 억제시켰다 . (a) IGROV-1 난소암 세포 상에서의 CCR4 발현. (b) mAb2-3은 용량에 의존하는 방식으로 CCR4 리간드인 CCL22로의 CD4+CD25- 및 (c) CD4+CD25+ T 세포로의 주화성을 효과적으로 억제시켰다.
도 11. CCL22 분비 난소암 세포에 의한 인간 림프구의 화학주성은 mAb2 -3에 의해 억제된다. (a) 영상은 루시페라제 처리된 CD4+CD25+CD127dim /- T 세포 주사 후 48시간째의 난소암 이종이식편 마우스 모델의 생체내 생체발광 영상(영상화)을 보여주는 것이다. (b) ROI(적색 동그라미 표시, 이종이식된 종양)의 강도의 정량화는 mAb2-3이 종양 조직으로의 Treg 동원을 억제시킨다는 것을 나타내었다. (c) 종양 조직을 수거하고, 콜라게나제에 의해 분해한 후, 항CD3, CD4, 및 CD25 항체에 의해 염색하였다. CD3+CD4+CD25+ T 세포를 분석하고, 유세포 분석법에 의해 계수하고, 종양 조직으로부터의 전체 세포에 대한 비율로서 제시하였다.
도 12. IGROV -1 펄싱된 수지상 세포 및 IGROV -1 프라이밍된 T 세포의 발생. (a) 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 및 인터루킨-4(IL-4: interleukin-4) 조합에 의한 단핵구의 수지상 세포(DC: dendritic cell)로의 분화. 단핵구를 인간 PBMC로부터 단리시키고, GM-CSF(100 ng/ml) 및 IL-4(100 ng/ml) 조합 존재하에서 배양하였다. 7일 동안 배양한 후, 세포를 수거하고, 유세포 분석법에 의해 명시된 바와 같은 DC 분화에 대한 각종 마커의 표면 발현에 대하여 분석하였다. (b) 종양 프라이밍된 T 세포(TP-T 세포: tumor-primed T cell), 비처리된 DC, 및 종양 펄싱된 DC의 공동 배양된 상청액으로부터 IFN-γ 분비물을 검출하였다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. "*"는 스튜던츠 t 검정 p < 0.05를 나타낸다.
도 13. mAb2 -3은 IGROV -1 프라이밍된 T 세포를 보유하는 대규모 IGROV -1- 이 종이식받은 마우스에서 종양 성장 억제를 매개하였다. (a) NSG 마우스에 5x106개의 IGROV-1 종양 세포를 피하로 접종하고, 1x107개의 IGROV-1 프라이밍된 T 세포를 정맥내로 주사하고, 항CCR4 항체로 처리하였다. NSG 마우스에서의 IGROV-1 인간 난소 암종 종양 이종이식편의 종양 성장 곡선을 측정하였다. 마우스를 3 mg/kg의 대조군 IgG4(n=2), mAb2-3 IgG1(n=2), mAb2-3 IgG4(n=2) 및 동일한 부피의 PBS(n=2)로 처리하였다. 항체를 4주 동안 주 2회에 걸쳐 정맥내로 투여하였다. 항체로 처리된 마우스에서의 종양 크기 및 (b) 체중을 주 1회로 측정하였다. (c) 종양 조직을 수거하였다. 막대 스케일, 1 cm. (d) 마우스 PBMC를 항인간 CD3, CD4, (e) CD8, 및 (f) CD25 항체에 의해 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; p 값은 이원 ANOVA로 산출하였고; 검은색 및 회색 별표 표시는 각각 대조군과 비교된 mAb2-3 IgG1 및 IgG4를 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ±S.E.M.로 제시되어 있다. (g) 각 군의 종양 조직에서 항CD3(상단 패널) 및 항CD25(하단 패널) 항체를 사용하여 면역조직화학법 염색을 수행하였다. 암적색 염색 막(화살표 표시)은 종양 중 CD3 또는 CD25 TP-T 세포를 나타낸다. 막대 스케일, 50 ㎛.
도 14. Treg에 의한 억제성 사이토카인 생산. CD4+CD25- 및 CD4+CD25+ T 세포와 비처리, 대조군 mAb 또는 mAb2-3의 배양물로부터 수집된 상청액 중 IL-10 및 TGF-β 사이토카인의 ELISA 측정을 사용하여 항체 처리가 Treg에 의한 억제성 사이토카인 생산에 미치는 효과를 평가하였다. mAb 부재하에서 배양된 T 세포를 IL-10 및 TGF-β의 임의의 검출된 배경 수준에 대한 대조군으로서 사용하였다. 데이터는 평균 ± S.D.로 제시되어 있다.
도 15. 유세포 분석법 기반 IL-2 결합 및 경쟁 분석. (a) Mac-1 세포를 냉 PBS로 세척한 후, 이어서, 순차적으로 20 ㎍/ml, 또는 (b) 3개 농도의 경쟁 항체(mAb2-3, 항TAC 또는 대조군 mAbs), 100 nM의 비오티닐화된 IL-2, 및 APC 표지된 스트렙트아비딘으로 염색하였다. 유세포 분석법에 의해 비오티닐화된 IL-2의 Mac-1 세포에 대한 결합을 검출하였다.
도 16. IL-2 결합에 대한 Ab2 -3의 작용 기전. IL-2와 CD25 사이의 상호작용에서 mAb2-3의 중개. (a) 외인성 IL-2의 부재하에서, mAb2-3과 함께 또는 그의 부재하에 인큐베이션된 1x104개의 CD4+CD25- Teff 배양된 상청액 중의 내인성 IL-2 수준을 ELISA에 의해 분석하였다. (b) CD4+CD127dimCD49d- Treg(3000/반응)를 20 ㎍/ml의 mAb, 및 0.5/1 ㎍/ml의 플레이트 결합된 항CD3/28 항체의 존재 및 부재하에서 0.25 IU/ml의 외인성 IL-2와 함께 인큐베이션시켰다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (c) 외인성 IL-2의 부재하에서, 1x104개의 Teff 단독 또는 Treg와의 것 및 20 ㎍/ml의 mAb2-3으로 처리된 것으로부터의 내인성 IL-2 농도를 나타내었다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (d) 4 IU/ml의 외부에서 첨가된 IL-2의 존재하에서의 mAb2-3으로 처리된 Teff 및 Treg 공동 배양물로부터의 상청액 중의 IL-2의 농도. 막대는 ± S.D.를 나타낸다. (e) 외인성 IL-2(20 IU/ml)의 존재하에서, 항체(mAb2-3 또는 항CD25, 항TAC 및 대조군 mAb 포함)로 처리되었거나, 또는 처리되지 않은 2x105개의 Mac-1 세포로부터의 상청액의 IL-2 농도를 ELISA에 의해 검출하였다. 막대는 ± S.D.를 나타낸다.
도 17. mAb2 -3 및 케모카인은 Mac-1 세포로부터의 CD25의 배출을 유도하였다. (a) Mac-1 세포를 MMP-9 억제제의 존재 또는 부재하에서 mAb2-3, CCL17, 또는 CCL22과 함께, 또는 MMP 억제제에 대한 음성 대조군과 함께 인큐베이션시켰다. 24시간 인큐베이션 후, 배양물 상청액을 수거하고, 가용성 CD25의 농도를 ELISA에 의해 시험하였다. 막대는 ± S.E.M.을 나타낸다. mAb2-3 또는 대조군 mAb로 처리된 Mac-1 세포의 (b) 12시간, (c) 24시간, 및 (d) 48시간 배양된 상청액 중의 가용성 CD25의 농도를 ELISA에 의해 조사하였다. 본 도면에는 배양된 상청액 중의 가용성 CD25 농도(pg/ml로 표시)가 제시되어 있다. 막대는 ± S.E.M.을 나타낸다. "*"는 스튜던츠 t 검정에 의한 p 값 < 0.05를 나타낸다.
도 18. mAb2 -3이 Treg로부터의 CD25 배출을 유도하였다. Treg를 mAb2-3 및 대조군 IgG1과 함께 인큐베이션시켰다. 48시간 인큐베이션 후, 배양물 상청액을 수거하고, ELISA에 의해 가용성 CD25의 농도에 대해 시험하였다. (a) mAb-2-3 또는 대조군 IgG1로 처리된 Treg의 48시간 배양된 상청액 중의 가용성 CD25(sCD25: soluble CD25)의 농도를 ELISA를 이용하여 조사하였다. 제시된 데이터는 독립된 3명의 기증자로부터의 평균이다. 막대는 ± S.E.M.을 나타낸다. "*" 및 "**"는 각각 이원 ANOVA를 사용함으로써 제시되는 p 값 < 0.05 및 0.01을 나타낸다. (b) 5일 동안 IL-2, mAB2-3 IgG1, 및 대조군 IgG1의 존재 또는 부재하에서 이를 통해 처리된 배양된 Treg 중의 생존능 염료를 측정함으로써 수행된 시험관내 세포 생존 검정법으로부터의 결과를 제시한 것이다. Treg의 자발적 사멸 중 상이한 군으로부터의 정규화된 Treg 사멸률(%)이 제시되어 있다. 막대는 ± S.E.M.을 나타낸다. "*" 및 "**"는 각각 스튜던츠 t 검정을 사용함으로써 제시되는 p 값 <0.01 및 0.005를 나타낸다.
도 19. 마카크 (Macaque) PBMC의 CD4 + CD25 + FoxP3 + T 세포에서의 CCR4 발현에 대한 대표적인 표현형 분석. 새로 단리된 PBMC를 CD4, CD25, CCR4 및 세포내 FoxP3으로 염색하였다. CD4+CD25+FoxP3+ 집단에서 CCR4 발현을 분석하였다. Treg 상의 평균 CCR4 발현을 독립된 3마리의 마카크에서 산출하였다.
본 발명은 부분적으로는, 항CCR4 항체인 mAb2-3이 조절 T 세포(Treg) 주화성 활성을 억제하고, 이펙터 T 세포(Teff) 증식을 회복시키고, CCR4+ Treg를 고갈시킨다는 발견에 기초한다.
암 면역요법에서 인간 mAb의 한가지 중요한 역할은 면역 회피를 촉진시키는 단백질의 표면 발현 및 분비를 징발하는 종양 세포에 의해 유발된 면역 조절장애를 역전시킬 수 있는 그의 능력에 있다. 종양 미세환경은 항종양 반응을 활성화시키거나, 또는 종양 진행을 촉진시킴으로써 종양 면역감시에서 역설적인 역할을 하는 무수한 혼합형 면역 세포 유형을 함유한다. 이들 중 종양 침윤성 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)는 국소 종양 면역을 억제하는 데 있어서 중요한 역할을 하는, 수개의 악성 종양에서 밝혀진 CD4+CD25+FoxP3+ Treg이다. Treg의 종양으로의 동원은 종양 세포 및 미세환경 대식세포에 의한 고수준의 CCR4 수용체 케모카인 CCL22 분비를 통해 매개된다. 상기 CCR4+ Treg는 국소 항종양 면역의 조절장애 및 종양 성장 증진에 바람직한 환경을 조성한다. 또한, 상이한 유형의 암을 앓는 환자에서 CCR4의 종양 연관 케모카인이 검출되었다. 따라서, 본원에 기술된 인간 항CCR4 mAb 면역요법의 표적화된 접근법이 암 면역요법적 효능은 개선시키면서, 동시에 그의 부작용은 감소시키는 데 있어서 상당한 이점을 제공한다.
하기 실시예에서 상세하게 기술되는 바와 같이, Treg에 대한 인간 항CCR4 mAb인 mAb2-3의 시험관내 및 생체내 활성을 조사하였다. Teff와 비교하여 약 85%의 CD4+CD25+FoxP3+ Treg가 CCR4를 과다발현하고(도 1 및 7), 이는 대다수의 억제인자 활성을 담당한다. 추가로, mAb2-3에 의한 CCR4+ Treg의 제거는 Teff 증식을 회복시킨다(도 2). 시험관내 연구를 통해 mAb2-3이 CCL22 발현 OvCA 세포로의 Treg 주화성 활성을 억제시킬 수 있다는 것이 입증되었다. OvCA 이종이식편을 보유하는 인간화 마우스 모델에서, mAb2-3은 인간 Treg 기능을 조절할 수 있고, 항종양 활성을 증진시킬 수 있는 치료학적 능력을 보였다(도 4, 5, 및 13).
mAb2-3 IgG1은 시험관내 및 생체내에서 CCR4를 발현하는 종양에 대하여 강력한 효능의 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체 의존성 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity) 활성을 보인다는 것이 앞서 입증되었다(18,42). (WO 2009/086514 및 WO 2013/166500(상기 문헌의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다) 참조)). 본원에서 제공하는 실시예에서, mAb2-3의 IgG1 및 IgG4 이소타입, 둘 모두의 생물학적 기능을 시험하였고, 이는 시험관내에서는 CCR4+ Treg 이동을 차단할 수 있는 유사한 능력을 보였지만(도 3b 및 10b), 생체내에서는 그의 상이한 작용 기전을 보였다. 특히, mAb2-3 IgG1은 생체내 제거 연구에 의해 입증된 바, Treg의 완전한 면역고갈을 유도하였고(도 3d 및 8b), 종양 세포 침윤을 감소시켰다(도 11). OvCA 이종이식편 연구에서, mAb2-3 IgG1 처리는 종양 세포 성장을 현저히 억제시켰고(도 5 및 13), 2마리의 동물 연구에서, 마우스는 유의적인 체중 감소를 보였다(도 5d 및 13b). 그에 반해, IgG4 이소타입은 주로 리간드-수용체 차단을 통해 작용하는 것으로 보였다(도 3, 9, 및 11). 생체내 수송 연구를 통해 상기 이소타입이 CCL22 분비 OvCA 종양으로의 Treg 주화성 차단 및 종양 세포 침윤 감소를 유발한 것으로 밝혀졌다(도 11). IgG4 이소타입은 또한 Treg의 더 느리고, 덜 완전한 고갈을 유발하였다(도 9g). 최근 보고에서 IgG4 이소타입은 IgG1과 유사한 ADCP 능력을 가진다고 밝혀진 바와 같이, Treg의 IgG4 매개 고갈에 대해 관찰된 생체내의 더 느린 제거는 상이한 작용 기전을 통해 이루어진 것일 수 있다(43). 추가로, mAb2-3 IgG4 처리는 더 작은 항종양 효과를 보였지만, 마우스에서는 어떤 체중 감소도 나타나지 않았다(도 5d 및 5f). 이러한 결과는 두 mAb2-3 이소타입이 상이한 병기의 OvCA 질환에서 독특한 역할을 할 수 있으며, 종양 부하가 더 작고, 면역 기능장애가 더 쉽게 역전될 때, IgG4 처리는 가능하게는 더 이른 조기 시점의 병기에서 바람직한 역할을 한다는 것을 제안한다.
추가로, mAb2-3이 CCR4+IL-2R+ Mac-1 및 Treg 세포에의 IL-2 결합을 억제시킬 수 있지만(도 6), 형질감염된 293T 세포를 사용였을 때, 단독으로 또는 조합하여 IL-2R 서브유니트에 결합하지 않은 것으로 나타났다. Mac1 세포의 경우, mAb2-3 처리는 CCR4 리간드인 CCL22 및 CCL17에 의해 공유되는 특성인 sCD25의 절단을 증진시켰다(도 18a 및 도 17b-d). 이러한 공유 활성은 mAb2-3이 효능제 활성을 가지고, 세포 활성화를 일으키며, 이로써, CD25 절단이 이루어진다는 것을 제안한다. CCL22/CCL17 결합을 통한 CCR4 신호전달에 관한 연구를 통해 PI(3) 키나제/AKT 활성화의 증거가 밝혀졌다(25,26). 추가로, CCR4의 상이한 입체구조가 두 리간드에 대해 다르게 반응하였다는 것이 보고되었으며, 상기 특성은 CCL22 및 mAb2-3이 CCL17보다 더욱 강력한 효능을 지닌, sCD25 절단 활성인자라는 본 발명자들의 증거에 의해 뒷받침된다(도 17a)(44,45). Treg 상의 높은 수준의 CD25 발현은 높은 친화도를 가진 삼량체의 IL-2 수용체 형성을 유도하고, 이는 생존에 필요한 것으로 밝혀진 더욱 큰 IL-2 결합을 뒷받침한다(46). CD25 절단이 증가하게 되면, Treg에의 IL-2 결합 친화도는 감소될 것이며, 방출된 sCD25는 Treg에 의한 IL-2 흡수 차단 및 그의 생존 감소와 연관이 있을 수 있다는 가능성이 존재한다(도 6a-f)(47).
본원에 제시된 데이터는 말초 혈액 CD4+CD25+FoxP3+ Treg 중 약 85%가 Teff와 비교하여 CCR4를 과다발현하고, 이는 억제인자 활성의 대부분을 담당한다는 것을 입증한다. 시험관내 연구를 통해 mAb2-3에 의한 CCR4+ Treg 고갈이 CCL22 발현 난소암(OvCA) 세포로의 Treg 주화성 활성을 억제하고, Teff 증식 및 항OvCA 면역을 회복시킨다는 것이 입증되었다. OvCA 이종이식편을 보유하는 인간화 마우스 모델에서, mAb2-3 IgG1 및 IgG4 이소타입, 둘 모두 인간 Treg 기능을 조절할 수 있고, 항종양 활성을 증진시킬 수 있는 치료학적 능력을 보였다.
본원에 제시된 데이터는 또한 mAb2-3 처리가 Treg에 의한 IL-2 흡수를 차단하고, IL-2 매개 생존을 억제하며, 이는 비면역고갈 mAb2-3 IgG4 경우에 관찰되는 생체내 항종양 효과에서도 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 입증한다.
mAb2-3의 IgG1 및 IgG4 이소타입, 둘 모두의 생물학적 기능을 시험하였고, 시험관내에서 CCR4+Treg 이동을 차단할 수 있는 유사한 능력을 보였지만, 이는 생체내에서는 그의 상이한 작용 기전을 나타내었다. 특히, mAb2-3 IgG1은 생체내 제거 연구에 의해 입증된 바, Treg의 극심한 면역고갈을 유도하였고, 종양 세포 침윤을 감소시켰다. OvCA 이종이식편 연구에서, mAb2-3 IgG1 처리는 종양 세포 성장을 현저하게 억제시켰고, 2마리의 동물 연구에서, 마우스는 유의적인 체중 손실을 보였다. 그에 반해, IgG4 이소타입은 주로 리간드-수용체 차단을 통해 작용하는 것으로 보였다. 생체내 수송 연구를 통해 상기 이소타입이 CCL22 분비 OvCA 종양으로의 Treg 주화성 차단 및 종양 세포 침윤 감소를 유발한 것으로 밝혀졌다. IgG4 이소타입은 또한 Treg의 더 느리고, 덜 완전한 고갈을 유발하였다.
치료 방법
본 발명은 항CCR4 항체를 투여함으로써 암, 또는 다른 질환 또는 장애 위험이 있는(또는 그에 걸리기 쉬운) 대상을 예방 및 치료하는 방법, 둘 모두를 제공한다. 상기 질환 또는 장애로는 예컨대, 조절 T 세포 매개 면역억제와 연관된 질환 또는 장애를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절 T 세포는 Treg 및/또는 여포성 조절 T 세포(TFR: follicular regulatory T cell)를 포함하는 것을 의미한다. 질환이 나타나기 이전에 예방제 투여가 이루어질 수 있고, 이로써, 질환은 예방되거나, 또는 대안적으로, 그의 진행은 지연된다. 본 발명은 CCR4 항체가 포함되거나, 또는 항원과 함께 투여되는, 백신 접종 방법을 추가로 제공한다. CCR4 항체는 조절 T 세포를 고갈시키고/거나, 이펙터 T 세포 증식을 증가시킴으로써, 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 애주번트로서의 역할을 한다.
예를 들어, 본 방법은 세포를 CCR4 항체와 접촉시키거나, 또는 대상에게 CCR4 항체를 투여함으로써 조절 T 세포(Treg 및/또는 TFR)를 고갈시키기 위해 및/또는 조절 T 세포의 사이토카인 분비 종양으로의 이동(예컨대, 주화성)을 억제하기 위해 사용된다. 사이토카인 분비 종양은 CCL1, CCL4, CCl5, CCL17 및/또는 CCL22를 분비한다. CCR4 항체가 조절 세포를 고갈시키기 위해 사용될 때, 항체는 바람직하게 IgG1 중쇄 불변 영역을 가진다. CCR4 항체가 조절 T 세포의 이동을 억제하기 위해 사용될 ‹š, 항체는 바람직하게 IgG4 중쇄 불변 영역을 가진다.
다양한 실시양태에서, 이펙터 T 세포는 실질적으로 고갈되지 않는다. "실질적으로 고갈되지 않는다"는 것은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%. 20%, 25% 이하의 이펙터 T 세포가 고갈된다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 T 세포 증식 및/또는 개수는 증가되거나, 또는 실질적으로 감소되지 않는다. "실질적으로 감소되지 않는다"라는 것은 이펙터 T 세포 증식을 의미하고/거나, 비처리 세포 집단과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%. 20%, 25% 초과로 감소되지 않는다는 것을 의미한다.
다른 실시양태에서, 본 방법은 이펙터 T 세포 증식을 증가시키기 위해 사용된다. 이펙터 T 세포 증식은 비처리 세포 집단과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%. 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 증가된다.
다른 실시양태에서, 본 방법은 종양 또는 대상에서 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율을 조절한다(예컨대, 증가시킨다). 상기 비율은 1, 2, 3, 4, 5 배 이상 증가된다.
본 방법은 이펙터 T 세포 집단으로부터의 사이토카인(예컨대, 인터페론-감마) 또는 이펙터 폴리펩티드(예컨대, 그랜자임 B 또는 퍼포린) 방출을 조절한다. 조절한다는 것은 사이토카인 또는 이펙터 폴리펩티드 방출을 증가 또는 감소시킨다는 것을 의미한다. 사이토카인 또는 이펙터 폴리펩티드 방출은 비처리 세포 집단과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%. 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 증가 또는 감소된다.
또 다른 측면에서, 종양 세포 성장은 세포를 CCR4 항체와 접촉시키거나, 또는 대상에게 CCR4 항체를 투여함으로써 억제되거나, 또는 저속화된다. 예를 들어, 종양은 혈액 암, 예컨대, 피부 T 세포 림프종(CTCL), 균상 식육종(MF), 원발성 피부 역형성 대세포 림프종(피부 ALCL), 시자리 증후군, 또는 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL)이다.
대안적으로, 종양은 고형 종양, 예컨대, 신장 세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 피부암(예컨대, 흑색종), 간암, 췌장암 호지킨병, 다형성 교아세포종(GBM) 또는 위암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암 또는 흑색종이다.
종양 성장을 억제 또는 저속화시키는 것이 종양을 갖는 대상의 생존을 연장시킨다. 생존은 1, 2, 3, 4, 5년 이상만큼 연장된다.
추가 측면에서, 본 발명은 조절 T 세포를 CCR4 항체와 접촉시킴으로써 IL-2의 CCR4+ 조절 T 세포에 대한 결합을 억제하거나, 또는 CD25 절단을 유도하는 방법을 제공한다. CD25를 통한 IL-2 결합 손실이 조절 T 세포 생존에 대한 IL-2의 의존도에 기인하여 대사성 기아를 일으키고, 이로써, 조절 T 세포 사멸을 유도한다. 조절 T 세포의 증가가 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율을 증가시킨다.
일부 측면에서, 상기 기술된 방법에서 사용되는 CCR4 항체는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 가진다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 예를 들어, IgG4 불변 영역은 S228P 돌연변이를 가진다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 대상은 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 CCR4 항체 및 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 CCR4 항체, 둘 모두를 받는다. 대안적으로, 대상은 질환 병기에 의존하여 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 CCR4 항체, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 CCR4 항체를 받는 것으로 선택된다. 예를 들어, 조기 병기의 질환을 앓는 환자의 경우, 종양 부하는 더 작고, 면역 기능장애는 더욱 쉽게 역전되기 때문에 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 CCR4 항체를 이용한 치료를 받는 것이 이로울 수 있다. 그에 반해, 환자가 후기 병기의 질환을 앓을 때, 예컨대, 종양 부하가 높을 때, 대상은 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 CCR4 항체를 이용한 치료를 받는 것이 이로울 수 있다.
세포는 CCR4를 발현하는 임의의 세포이다. 예를 들어, 세포는 T 세포이다. T 세포는조절 T 세포, 여포성 조절 T 세포, 및 이펙터 T 세포를 포함한다.
CCR4 항체
CCR4 항체는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 방법에서 사용하는 데 적합하다. 예시적인 인간화 CCR4 항체는 예를 들어, WO 2009/086514, WO 2013/166500 및 PCT/US2015/054202에 기술되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 참조로 포함되고, 하기에 기술된다. 바람직한 CCR4 항체는 mAb2-3이다. 본원에 기술된 예시적인 항체는 다른 인간화 CCR4 항체, 예컨대, 모가물리주맙(Mogamulizumab)과 비교하여 유익한 특징을 한다. 예를 들어, 본 발명의 예시적인 항체, 특히, mAb2-3은 N 말단 도메인을 포함하는 입체구조의 에피토프 및 생물학적 신호전달을 매개하는 세포외 루프를 인식한다. 이와 관련하여, Mac 1 세포 및 Treg의 mAb2-3 처리는, CCR4 리간드인 CCL22 및 CCL17과 공유하는 특성인 sCD25 배출을 증진시켰다. 따라서, 본 발명의 예시적인 항체, 특히, MAb2-3은 효능작용 활성을 가지고, 세포 활성화를 일으킨다. 추가로, 모가물리주맙과 달리, 본 발명의 예시적인 항체, 특히, MAb2-3은 보체 의존성 세포독성(CDC)을 매개한다. 이는 부착 각도가 보체 공극 형성을 위해 허용될 수 있도록 하는, Fc 영역의 최적의 배향의 직접적인 결과일 수 있다.
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선택된 항체의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 하기 표 9에 제시된다.
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본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적으로 활성인 부위, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는(항원과 면역반응하는) 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. "특이적으로 결합한다" 또는 "~와 면역반응한다"라는 것은 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고, 다른 폴리펩티드와는 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 항체는 다중클론, 단일클론, 키메라, dAb(도메인 항체: domain antibody), 단일 쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, scFv, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
단일 쇄 Fv("scFv": single chain Fv) 폴리펩티드 분자는 공유적으로 연결된 VH::VL 이종이량체로서, 이는 펩티드 코딩 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL-코딩 유전자를 비롯한 유전자 융합체로부터 발현될 수 있다(문헌 [Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883] 참조). 항체 V 영역으로부터의 자연적으로 응집되지만, 화학적으로 분리된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를, 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩되는 scFv 분자로 전환시키기 위한 화학 구조를 식별하는 수많은 방법이 기술되어 왔다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,091,513; 5,132,405; 및 4,946,778을 참조할 수 있다.
과다한 표적 분자에 대해 다양한 공급원의 재배열된 항체 유전자를 제공하기 위해 매우 큰 나이브 인간 scFv 라이브러리가 생성되어 왔고, 생성될 수 있다. 질환 특이적 항체를 단리시키기 위해 감염성 질환을 앓는 개체로부터 더 작은 라이브러리를 구성할 수 있다(문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992)]; [Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)] 참조).
일반적으로 인간으로부터 수득된 항체 분자는 분자 내에 존재하는 중쇄의 성질에 의해 서로 차이가 나는 임의 부류의 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD에 관한 것이다. 특정 부류는 또한 하위부류, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 , IgG4 등을 가진다. 추가로, 인간에서 경쇄는 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다. "항원 결합 부위," 또는 "결합부"라는 용어는 항원 결합에 관여하는 면역글로불린 분자의 일부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N 말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 매우 다른 3개의 스트레치는 "골격 영역," 또는 "FR(framework region)"로 알려져 있는 더욱 보존되는 측면 스트레치 사이에 삽입되어 있다. 따라서, "FR"이라는 용어는, 자연적으로 면역글로불린 중의 초가변 영역 사이에서 및 그에 인접하게 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 항원 결합 표면을 형성하도록 3차원 공간에서 서로 상대적으로 배치되어 있다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR(complementarity-determining region)"로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프"라는 용어는 면역글로불린, scFv, 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 보통 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 화학적으로 활성인 표면 분자 집단으로 이루어지며, 보통 특이적인 3차원 구조적 특징, 및 특이적인 전하 특징을 가진다. 예를 들어, 항체는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단 펩티드에 대해 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "면역학적 결합," 및 "면역학적 결합 특성"이라는 용어는 면역글로불린 분자와 면역글로불린의 특이성의 대상이 되는 항원 사이에 발생하는 비공유적 상호작용 유형을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도, 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있으며, 여기서, Kd가 작을수록 친화도는 더 크다는 것을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 정량화될 수 있다. 상기와 같은 한 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 단계를 수반하며, 여기서, 상기 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성, 및 양 방향 속도에 동등하게 영향을 주는 기하학적 파라미터에 의존한다. 따라서, "온 속도 상수"(K온) 및 "오프 속도 상수"(K오프), 이 둘 모두는 농도, 및 실제 결합 및 해리 속도를 산출하여 측정될 수 있다(문헌 [Nature 361:186-87 (1993)] 참조). K오프/K온 비율은 친화성과 관련이 없는 모든 파라미터를 무효화시킬 수 있으며, 해리 상수 Kd와 같다(일반적으로, 문헌 [Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 발명의 항체는, 검정법, 예컨대, 방사성 리간드 결합 검정법 또는 당업자에게 공지된 유사한 검정법에 의해 측정된 바, 평형 결합 상수(Kd)가 ≤1 μM, 바람직하게, ≤ 100 nM, 더욱 바람직하게, ≤ 10 nM, 및 가장 바람직하게, ≤ 100 pM 내지 약 1 pM일 때, CCR4 에피토프에 특이적으로 결합한다고 말한다.
CCR4 단백질, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 오솔로그는 이들 단백질 성분에 면역특이적으로 결합하는 항체 생성에서 면역원으로서 이용될 수 있다.
당업자는 과도한 실험 없이도, 인간 단일클론 항체가, 본 발명의 인간 단일클론 항체가 CCR에 결합하지 못하게 방해하는지 여부를 확인함으로써 전자가 후자와 동일한 특이성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명의 인간 단일클론 항체에 의한 결합 감소로 나타나는 바와 같이, 시험되는 인간 단일클론 항체가 본 발명의 인간 단일클론 항체와 경쟁한다면, 두 단일클론 항체는 동일하거나, 또는 매우 밀접한 에피토프에 결합할 가능성이 있다.
인간 단일클론 항체가 본 발명의 인간 단일클론 항체의 특이성을 갖는지 여부를 측정하는 또 다른 방법은 본 발명의 인간 단일클론 항체를, 그와 보통 반응성인 CCR4 단백질과 미리 인큐베이션시킨 후, 이어서, 시험되는 인간 단일클론 항체를 첨가하여 시험되는 인간 단일클론 항체가 그의 CCR4에 결합하는 능력이 억제되는지 여부를 측정하는 것이다. 시험되는 인간 단일클론 항체가 억제된다면, 이는 아마도 본 발명의 단일클론 항체와 동일하거나, 또는 기능적으로 등가인 에피토프 특이성을 갖는 것이다. 본 발명의 인간 단일클론 항체의 스크리닝은 또한 CCR4를 이용하고, 시험 단일클론 항체가 CCR4를 중화시킬 수 있는지 여부를 측정함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 단백질에 대한, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 오솔로그에 대한 다중클론 또는 단일클론 항체를 제조하는 데 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함됨) 참조).
항체는 널리 공지된 기술, 예컨대, 면역 혈청의 IgG 분획을 주로 제공하는 것인, 단백질 A 또는 단백질 G를 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이어서, 또는 대안적으로, 원하는 면역글로불린의 표적 또는 그의 에피토프인 특이적 항원을 컬럼 상에 고정화시켜 면역친화성 크로마토그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제할 수 있다. 면역글로불린의 정제는 예를 들어, 문헌 [D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)]에 의해 논의되고 있다.
본원에서 사용되는 바, "단일클론 항체" 또는 "mAb" 또는 "단일클론 항체 조성물"이라는 용어는 고유한 경쇄 유전자 생성물 및 고유한 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 항체 분자 단 하나의 분자 종만을 포함하는 항체 분자 집단을 지칭한다. 특히, 단일클론 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 그에 대한 고유한 결합 친화성을 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역반응을 할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다.
단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기술되어 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 전형적으로 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물을 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합하게 되는 항체를 생산하거나, 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 단백질 항원, 그의 단편 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 바람직한 경우에는 말초 혈액 림프구가 사용되거나, 비인간 포유동물 공급원이 바람직한 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 무한증식 세포주와 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 무한증식 세포주는 보통 형질전환된 포유동물 세포, 특히, 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 보통, 래트 또는 마우스는 골수종 세포주가 이용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모체 세포에 효소 하이포크잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없다면, 하이브리도마용의 배양 배지는 전형적으로 HGPRT 결핍 세포의 성장을 막는 물질인 하이포크잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 무한증식 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 안정된 높은 수준의 항체 발현을 지원하고, 배지, 예컨대, HAT 배지에 감수성인 것이다. 더욱 바람직한 무한증식 세포주는 뮤린 골수종 세포주이며, 이는 예를 들어, 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: 미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 입수할 수 있다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 인간 단일클론 항체 생산을 위한 것으로 기술되어 있다(문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63] 참조).
이어서, 하이브리도마 세포의 배양이 이루어지는 배양 배지는 항원에 대한 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해 또는 시험관내 결합 검정법, 예컨대, 방사성면역검정법(RIA: radioimmunoassay) 또는 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme-linked immunoabsorbent assay)에 의해 측정될 수 있다. 상기 기술 및 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 단일클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 단일클론 항체의 치료학적 적용에 있어서, 표적 항원에 대하여 높은 정도의 특이성 및 높은 결합 친화도를 갖는 항체를 확인하는 것이 중요하다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 방법에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103] 참조). 상기 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어, 둘베코 수정 이글즈 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수와 같이 생체내에서 배양될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법, 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리되거나 정제될 수 있다.
단일클론 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여)을 이용하여 쉽게 단리되고, 서열분석될 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리시키고 나면, DNA를 발현 벡터 내로 배치할 수 있고, 이어서, 이를 숙주 세포, 예컨대, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, 또는 다르게는 면역글로불린 단백질을 생산하지 못하는 골수종 세포로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성할 수 있다. 또한, 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신으로 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써(미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)] 참조), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전체 또는 그 일부를 공유적으로 연결시킴으로써 DNA를 변형시킬 수 있다. 상기 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신으로 치환될 수 있거나, 또는 키메라 2가 항체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신으로 치환될 수 있다.
완전 인간 항체는 CDR을 지닌 경쇄 및 중쇄, 둘 모두의 전체 서열이 인간 유전자로부터 유래된 것인 항체 분자이다. 상기 항체는 본원에서 "인간화 항체," "인간 항체," 또는 "완전 인간 항체"로 명명된다. 인간 단일클론 항체는 트리오마 기술; 인간 B 세포 하이브리도마 기술(문헌 [Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72] 참조); 및 인간 단일클론 항체를 제조하기 위한 EBV 하이브리도마 기술(문헌 [Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체가 사용될 수 있고, 이는 인간 하이브리도마를 사용하여(문헌 [Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030] 참조), 또는 시험관내에서 인간 B 세포를 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스로 형질전환시킴으로써(문헌 [Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조) 제조될 수 있다.
추가로, 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 추가 기술을 이용하여 제조될 수 있다(문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)] 참조). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예컨대, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 시험감염시, 유전자 재배열, 어셈블리, 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 측면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 상기 접근법은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)]; [Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]에 기술되어 있다.
인간 항체는 추가로 항원에 의한 시험감염에 대한 반응으로 동물의 내인성 항체보다는 완전 인간 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 비인간 동물을 이용하여 제조될 수 있다(PCT 공보 WO94/02602 참조). 비인간 숙주에서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 내인성 유전자는 무능력화되고, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 활성 유전자좌는 숙주의 게놈 내로 삽입된다. 인간 유전자는 예를 들어, 필요한 인간 DNA 세그먼트를 함유하는 효모 인공 게놈을 이용하여 도입된다. 이어서, 원하는 모든 변형을 제공하는 동물은 완전 상보체보다 더 적은 변형을 포함하는 중간 트랜스제닉 동물을 이종 교배시킴으로써 자손으로서 수득된다. 상기 비인간 동물의 바람직한 실시양태는 마우스이고, 이는 PCT 공보 WO 96/33735 및 WO WO 96/34096에 개시된 바와 같이 제노마우스(Xenomouse)™로 명명된다. 상기 동물은 완전 인간 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생산한다. 항체는 예를 들어, 다중클론 항체의 제조물로서 관심의 면역원으로 면역 후 동물로부터 직접적으로 수득될 수 있거나, 대안적으로, 예컨대, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마와 같이, 동물로부터 유래된 무한증식 B 세포로부터 수득될 수 있다. 추가로, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 회수하고, 발현하여 직접적으로 항체를 수득할 수 있거나, 또는 추가로 변형시켜 항체의 유사체, 예컨대, 예를 들어, 단일 쇄 Fv(scFv: single chain Fv) 분자를 수득할 수 있다.
내인성 면역글로불린 중쇄의 발현이 결여된, 마우스로 예시되는 비인간 숙주를 생산하는 방법의 예는 미국 특허 번호 5,939,598에 개시되어 있다. 이는 유전자좌의 재배열을 막고, 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전사체 형성을 막기 위해 배아 줄기 세포 중 적어도 하나의 내인성 중쇄 유전자좌로부터 J 세그먼트 유전자를 결실시키는 단계인, 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자를 함유하는 표적화 벡터에 의해 수행되는 결실 단계; 및 배아 줄기 세포로부터, 체세포 및 생식 세포가 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
관심의 대상이 되는 항체, 예컨대, 인간 항체를 제조하는 한 방법은 미국 특허 번호 5,916,771에 개시되어 있다. 본 방법은 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 배양물 중의 한 포유동물 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 또 다른 포유동물 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 두 세포를 융합하여 하이브리드 세포를 형성하는 단계를 포함한다. 하이브리드 세포는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 항체를 발현한다.
상기 방법에 대한 추가의 개선안으로, 면역원 상의 임상적으로 관련된 에피토프를 확인하는 방법, 및 높은 친화도로 관련 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 선별하는 연관된 방법은 PCT 공보 WO 99/53049에 개시되어 있다.
항체는 상기에 기술된 단일 쇄 항체를 코딩하는 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터에 의해 발현될 수 있다.
이는 벡터, 리포솜, 네이키드 DNA, 애주번트 지원 DNA, 유전자총, 카테터 등을 포함할 수 있다. 벡터는 예컨대, WO 93/64701에 기재된 것과 같이 표적화 모이어티(예컨대, 세포 표면 수용체에 대한 리간드), 및 핵산 결합 모이어티(예컨대, 폴리리신)를 갖는 화학 접합체, 바이러스 벡터(예컨대, DNA 또는 RNA 바이러스 벡터), 표적 모이어티(예컨대, 표적 세포에 특이적인 항체) 및 핵산 결합 모이어티(예컨대, 프로타민)을 포함하는 융합 단백질인, PCT/US 95/02140(WO 95/22618)에 기술된 것과 같은 융합 단백질, 플라스미드, 파지 등을 포함한다. 벡터는 염색체, 비염색체, 합성 벡터일 수 있다.
바람직한 벡터에는 바이러스 벡터, 융합 단백질, 및 화학 접합체를 포함된다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스를 포함한다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터로는 폭스 벡터, 예컨대, 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예컨대, 단순 포진 I 바이러스(HSV: herpes simplex I virus) 벡터를 포함한다(문헌 [Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995)]; [Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)]; [Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)]; [Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)] 참조), 아데노바이러스 벡터(문헌 [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993)]; [Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993)]; [Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)] 참조) 및 아데노 연관 바이러스 벡터(문헌 [Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)] 참조)를 포함한다.
폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포의 세포질 내로 도입한다. 아비폭스 바이러스 벡터는 핵산을 오직 단기간만 발현한다. 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 및 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터는 핵산을 중성 세포 내로 도입하는 데 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(약 4개월)보다 더 짧은 단기간 발현(약 2개월)하며, 결국 이는 HSV 벡터보다 더 짧다. 선택되는 특정 벡터는 표적 세포 및 치료되는 병태에 의존할 것이다. 도입은 표준 기술, 예컨대, 감염, 형질감염, 형질도입, 또는 형질전환에 의해 이루어질 수 있다. 유전자 전달 방식의 예로는 예컨대, 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포펙션, 세포 미세주입 및 바이러스 벡터를 포함한다.
벡터는 본질적으로 원하는 임의의 표적 세포를 표적화하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 벡터(예컨대, 아데노바이러스, HSV)를 원하는 위치로 유도하는 데 정위 주사법이 사용될 수 있다. 추가로, 입자는 미니펌프 주입 시스템, 예컨대, 신크로메드 인퓨젼 시스템(SynchroMed Infusion System)을 이용하여 뇌실내(icv: intracerebroventricular) 주입에 의해 전달될 수 있다. 대류로 명명되는 벌크 유동 기반의 방법 또한 대분자를 뇌의 확장된 영역에 전달하는 데에 효과적이라는 것이 입증되었고, 벡터를 표적 세포에 전달하는 데 유용할 수 있다(문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994)]; [Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)] 참조). 이용될 수 있는 다른 방법으로는 카테터, 정맥내, 비경구, 복강내 및 피하 주사 및 경구 또는 공지된 다른 투여 경로를 포함한다.
상기 벡터는 다양한 방식으로 사용될 수 있는 다량의 항체를 발현하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 중 CCR4의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체는 또한 CCR4에 결합하고, CCR4 활성을 파괴하려고 하는 데에도 사용될 수 있다.
기술은 본 발명의 항원 단백질에 특이적인 단일 쇄 항체 제조에 맞게 적합화될 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 4,946,778 참조). 추가로, 방법은 단백질 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인할 수 있도록 Fab 발현 라이브러리 구성에 맞게 적합화될 수 있다(예컨대 문헌(Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) 참조). (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 제조된 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 디술피드 브릿지를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편; (iii) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성된 Fab 단편 및 (iv) Fv 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 단백질 항원에 대한 이디오타입을 함유하는 항체 단편은 당업계에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
이종접합체 항체 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이종접합체 항체는 공유적으로 결합된 2개의 항체로 구성된다. 상기 항체는 예를 들어, 원치않는 세포에 면역계 세포를 표적화하도록(미국 특허 번호 4,676,980 참조), 및 HIV 감염 치료(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 참조)를 위해 제안되었다. 항체는 가교제를 포함하는 방법을 비롯한, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나, 티오에테르 결합을 형성함으로써 구성될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트 및 예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것을 포함한다. 이종접합체 항체는 또한 예를 들어, 공유적으로 연결된 2개의 단일 쇄 항체, 또는 scFv, 또는 상이한 항원을 인식하는 2개의 항체로부터의 공유적으로 연결된 2개의 가변 중쇄-가변 경쇄 이량체로 구성된 이중특이적 항체를 지칭할 수 있다.
이펙터 기능과 관련하여, 예컨대, 암을 치료하는 데 있어 항체의 효과를 증진시키도록 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역 내로 도입될 수 있고, 이로써, 상기 영역내 쇄간 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다(문헌 [Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)] 참조). 대안적으로, 항체는 이중 Fc 영역을 가지도록 조작될 수 있으며, 이로써, 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다(문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)] 참조).
본 발명은 또한 세포독성제, 예컨대, 독소(예컨대, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스티릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다. 각종 방사성 핵종이 방사성 접합된 항체 제조에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예컨대, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), a활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 핵종을 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다(WO94/11026 참조).
당업계의 숙련가는 매우 다양한 가능성을 띤 모이어티가 생성된 항체에 또는 본 발명의 다른 분자에 커플링될 수 있다는 것을 인지할 것이다(예를 들어, 문헌 ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)](상기 문헌의 전체 내용은 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
커플링은 항체 및 다른 모이어티가 그의 각각의 활성을 유지하는 한, 두 분자를 결합시키는 임의의 화학적 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 연결은 다수의 화학적 기전, 예를 들어, 공유 결합, 친화성 결합, 인터칼레이션, 배위 결합 및 복합체 형성을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 존재하는 측쇄의 직접적인 축합에 의해, 또는 외부 가교 분자의 도입에 의해 달성될 수 있다. 단백질 분자, 예컨대, 본 발명의 항체를 다른 분자에 커플링시키는 데 다수의 2가 또는 3가 연결제가 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제로는 유기 화합물, 예컨대, 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민을 포함할 수 있다. 상기 목록은 당업계에 공지된 다양한 부류의 커플링제의 완전한 목록인 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려, 더욱 일반적인 커플링제를 예시하는 것이다(문헌 [[Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)]; [Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982)]; 및 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조). 바람직한 링커는 문헌에 기술되어 있다(예를 들어, MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르의 사용을 기술하는 문헌 [Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)] 참조). 올리고펩티드 링커에 의해 항체에 커플링된 할로겐화된 아세틸 히드라지드 유도체의 사용을 기술하는 미국 특허 5,030,719 또한 참조한다. 특히 바람직한 링커로는 (i) EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드; (ii) SMPT(4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., 카탈로그(21558G); (iii) SPDP(숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트(Pierce Chem. Co., 카탈로그 번호 21651G); (iv) 술포-LC-SPDP(술포숙신이미딜 6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드]헥사노에이트(Pierce Chem. Co. 카탈로그 #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 술포-NHS(N-하이드록시술포-숙신이미드: Pierce Chem. Co., 카탈로그 #24510)를 포함한다.
상기 기술된 링커는 상이한 속성을 갖는 성분을 함유하는 바, 이에, 상이한 물리화학적 특성을 갖는 접합체를 유도한다. 예를 들어, 알킬 카복실레이트의 술포-NHS 에스테르는 방향족 카복실레이트의 술포-NHS 에스테르보다 더 안정적이다. NHS-에스테르 함유 링커는 술포-NHS 에스테르보다 더 작은 가용성을 띤다. 추가로, 링커 SMPT는 입체 장애를 갖는 디술피드 결합을 함유하고, 안정성이 증가된 접합체를 형성할 수 있다. 디술피드 결합은 일반적으로 다른 결합에 비해 덜 안정적인데, 그 이유는 디술피드 결합이 시험관내에서 절단되고, 이로써, 접합체의 이용가능성은 낮아지기 때문이다. 특히, 술포-NHS는 카보디미드 커플링의 안정성을 증진시킬 수 있다. 술포-NHS와 함께 사용될 때, 카보디미드 커플링(예컨대, EDC)은 카보디미드 커플링 반응 단독인 것보다 가수분해에 대하여 더 높은 내성을 띠는 에스테르를 형성한다.
일부 실시양태에서, mAb의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성이 변경되도록 돌연변이가 mAb의 불변 영역으로 도입된다. 예를 들어, 돌연변이는, Fc 영역의 234 및 235번 위치의 류신이 알라닌으로 돌연변이화되고, 특이적 Fc 수용체에 의한 결합을 폐기하는 CH2 도메인 내의 LALA 돌연변이이다. 한 측면에서, mAb는 이종이량체 mAb의 한 scFv 분자 상에 돌연변이를 함유하며, 이는 ADCC 활성을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, mAb는 이종이량체 mAb의 2개의 쇄 모두에 돌연변이를 함유하며, 이는 ADCC 활성을 완전히 제거한다. 예를 들어, mAb의 한 scFv 분자, 또는 두 scFv 분자 모두에 도입되는 돌연변이는 CH2 도메인 중의 LALA 돌연변이이다. 가변적인 ADCC 활성을 갖는 상기 mAb는 mAb가 mAb에 의해 인식되는 한 항원을 발현하는 세포에 대해 최대의 선택적인 사멸을 나타내지만, mAb에 의해 인식되는 제2 항원에 대해서는 최소의 사멸을 보이도록 최적화될 수 있다.
본원에 개시된 항체는 면역리포솜으로 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기술된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파디딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 공극 크기가 정의된 필터를 통해 압출시킴으로써 원하는 직경을 갖는 리포솜을 수득할 수 있다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)]에 기술된 바와 같이 디술피드 교환 반응을 통해 리포솜에 접합될 수 있다.
약학 조성물
CCR4 항체(이는 또한 본원에서 "활성 화합물"로 지칭됨), 및 그의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체는 투여에 적합한 약학 조성물로 포함될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로 항체 또는 작용제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 약학 투여와 화합성을 띠는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 및 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 본 분야의 표준 참조 교재인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]의 가장 최신판(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 상기 담체 또는 희석제의 바람직한 예로는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예컨대, 고정유 또한 사용될 수 있다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 화합성을 띠지 않은 경우를 제외하고는, 조성물에서 그를 사용하는 것이 고려된다. 또한, 보충 활성 화합물이 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 그가 의도하는 투여 경로와 화합성을 띠도록 제제화될 수 있다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대, 정맥내, 진피내, 피하, 경구(예컨대, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 진피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다; 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 아황산 수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성 조절제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제작된 다회 투약용 바이알로 동봉될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 현탁액 및 멸균의 주사액 또는 현탁액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, 크레모포르 EL(Cremophor EL)™(BASF: 미국 뉴저지주 파시퍼니 소재) 또는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균 상태여야 하고, 용이하게 주사될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 현탁 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해, 현탁액인 경우, 필요한 입자 크기 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 방지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 장기간 흡수될 수 있다.
멸균 주사액은 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 포함시킨 후, 이어서, 필요한 경우, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은, 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분으로 이루어진 분말을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 상기 조성물은 젤라틴 캡슐제에 동봉될 수 있거나, 정제로 압착될 수 있다. 치료학적인 경구 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고, 정제, 트로키, 또는 캡슐제 형태로 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 또한 유체 담체 중의 화합물이 경구적으로 적용하고, 스위싱되고(swished), 뱉거나 삼키는 구강 청결제로서 사용되는 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 화합성을 띠는 결합제 및/또는 애주번트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키 등은 하기 성분 중 임의의 것, 또는 성질이 유사한 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미정질의 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스; 붕해제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트 또는 세테로테스(Sterotes); 활택제, 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 분사제, 예컨대, 이산화탄소와 같은 가스를 포함하는 가압형 용기 또는 디스펜서, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
또한 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 계면활성제, 담즙산염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당 업계에 일반적으로 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제제화될 수 있다.
화합물은 또한 직장 전달을 위한 좌제(예컨대, 통상의 좌제 베이스, 예컨대, 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 함께) 또는 정체 관장제 형태로 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 활성 화합물은 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한, 방출 조절형 제제에서와 같이, 화합물이 신체로부터 빠르게 제거되지 않도록 하는 담체와 함께 제조된다. 생체분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제제의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단일클론 항체와 함께, 감염된 세포로 표적화되는 리포솜 포함) 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
경구용 또는 비경구용 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용되는 바, 투여 단위 형태란, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 얻을 수 있도록 산출된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 함유하는 것인, 치료하고자 하는 대상을 위해 단일 투여량으로 적합화된 물리적 개별 단위를 지칭한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료학적 효과, 및 개체 치료를 위한 상기 활성 화합물을 화합하는 기술에 내재하는 제약에 의해 좌우되고, 그에 직접적으로 의존한다.
약학 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체(bsAb: bi-specific antibody)는 2개의 가변 도메인 또는 scFv를 포함하는 항체로서, 이를 통해 생성된 항체는 2개의 상이한 항원을 인식하게 되는 항체이다. 본 발명은 CCR4 및 제2 항원을 인식하는 이중특이적 항체를 제공한다. 예시적인 제2 항원으로는 종양 연관 항원, 사이토카인 및 세포 표면 수용체, 예컨대, T 세포 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항원은 CAIX(카보닉 안하이드라제 IX: carbonic anhydrase IX, 또는 G250), ErbB2, PD-L1, CTLA-4, PD1, IL21, IL21R, HVEM, CD160, CD3, TIM3 또는 GAL9일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 CCR4 항체의 중쇄 및 경쇄 조합 또는 scFv를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는, 각각이 상이한 항원을 인식하는 것인 2개의 상이한 중쇄-경쇄 이종이량체 또는 2개의 상이한 scFv 항체, 또는 그의 단편이 두 scFv 분자 사이의 분자내 회합을 통해 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체가 형성될 수 있도록 허용하는 충분한 길이의 긴 링커 폴리펩티드에 의해 연결되어 있는 것인 단일 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, scFv 분자 중 하나, 예를 들어, 본원에 기술된 scFv 항체 중 임의의 것은 CCR4를 인식한다. 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 공유 또는 비공유 결합에 의해 연결된, 1개 초과의 폴리펩티드, 예를 들어, 2개의 별개의 scFv 항체, 또는 그의 단편으로서, scFv 항체 중 하나는 CCR4를 인식하는 것으로 구성된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 "놉 인투 홀(knob into hole)" 방법을 사용하여 구성된다(문헌 [Ridgway et al., Protein Eng 7:617-621 (1996)]). 상기 방법에서, 중쇄-경쇄 쌍형성을 유지하면서, 중쇄 쌍형성을 선택적으로 파괴하도록 2개의 상이한 가변 도메인의 Ig 중쇄를 환원시킨다. 2개의 상이한 항원을 인식하는 2개의 중쇄-경쇄 이종이량체를 혼합하여 이종결찰 쌍형성을 촉진시키며, 이는 CH3 도메인의 조작된 "놉 인투 홀"을 통해 매개된다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는, 제1 중쇄-경쇄 이종이량체는 CCR4를 인식하고, 제2 중쇄-경쇄 이종이량체는 제2 항원을 인시하는 하이브리드 항체를 생성하도록 하는 2개 이상의 상이한 항체로부터의 중쇄-경쇄 이종이량체의 교환을 통해 구성될 수 있다. 2개의 상이한 항체로부터의 2개의 중쇄-경쇄 이종이량체로 구성된 이중특이적 항체를 생성하는 기전은 이중특이적 분자로서도 또한 작용하는 인간 IgG4의 형성과 유사하다. IgG 중쇄의 이량체화는 분자내 힘, 예컨대, 각 중쇄의 CH3 도메인의 쌍형성 및 디술피드 브릿지에 의해 구동된다. CH3 도메인 중의 특정 아미노산(R409)의 존재가 IgG4 분자의 이량체 교환 및 구성을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 쌍형성은 또한 추가로 항체의 힌지 영역 중의 중쇄간 디술피드 브릿지에 의해 안정화된다. 구체적으로, IgG4에서, 힌지 영역은 (서열 Cys-Pro-Pro-Cys를 함유하는 안정적인 IgG1 힌지 영역과 비교하여) 아미노산 226-230에 아미노산 서열 Cys-Pro-Ser-Cys를 함유한다. 229번 위치가 세린인 상기와 같은 서열 차이는 힌지 영역에서 신규한 쇄내 디술피드를 형성하고자 하는 IgG4의 경향과 연관이 있는 것으로 나타났다(문헌 [Van der Neut Kolfschoten, M. et al., 2007, Science 317:1554-1557] 및 [Labrijn, A.F. et al, 2011, Journal of immunol 187:3238-3246]).
또 다른 실시양태에서, 2개의 상이한 전장의 항체로부터 이중특이적 항체를 제조하는 데 글루타티온 및 글루타티온 디술피드의 사용이 사용될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온을 환원시켜 항체를 중쇄-경쇄 이종이량체, 또는 분자로 분리시키면서, 각각이 상이한 항원을 인식하는 것인 전장의 항체를 인큐베이션시킨다. 중쇄-경쇄 이종이량체를 산화된 글루타티온(GSSG)과 혼합할 수 있고, 이로써, 재조립 및 재산화를 통해 고도로 순수한 이중특이적 항체가 형성될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 이중특이적 항체는 CH3 도메인 내 R409 잔기 및 CCR4 또는 제2 항원을 인식하는 항체의 힌지 영역 내 Cys-Pro-Ser-Cys 서열의 도입을 통해 생성될 수 있으며, 이로써, 중쇄-경쇄 이량체가 교환하여 CCR4를 인식하는 한 중쇄-경쇄 이량체 및 제2 항원을 인식하는 제2 중쇄-경쇄 이량체를 갖는 항체 분자를 생산하며, 여기서, 제2 항원은 본원에서 개시된 임의의 항원이다. 중쇄-경쇄 이종이량체 교환은 또한 교환을 촉진시키는 환원제, 예컨대, 환원된 글루타티온의 첨가로 증진될 수 있다. 공지된 IgG4 분자는 또한 중쇄 및 경쇄가 본원에서 개시된 바와 같이 CCR4 또는 제2 항원을 인식하도록 변경될 수 있다. Fc 영역이, 면역 반응의 이펙터 시스템, 예컨대, 특정 백혈구에 의해 발현되는 보체 및 Fc 수용체와 거의 상호작용을 하지 않는다는 점에서 다른 IgG 서브타입과 차이를 보이는 IgG4 분자의 고유한 특성에 기인하여 본 발명의 이중특이적 항체를 구성하는 상기 방법을 사용하는 것이 유익할 수 있다. 상기 특이적인 특성으로 인해 상기 IgG4-기반 이중특이적 항체는, 항체가 표적(들)에 결합하여야 하고, 표적(들)과 연관된 신호전달 경로를 기능적으로 변경시켜야 하지만, 이펙터 활성을 유발하지는 않는 치료학적 적용에 대한 관심의 대상이 된다.
일부 실시양태에서, bsAb의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성이 변경되도록 돌연변이가 bsAb의 불변 영역으로 도입된다. 예를 들어, 돌연변이는, Fc 영역의 234 및 235번 위치의 류신이 알라닌으로 돌연변이화되고, 특이적 Fc 수용체에 의한 결합을 폐기하는 CH2 도메인 내의 LALA 돌연변이이다. 한 측면에서, bsAb는 이종이량체 bsAb의 한 scFv 분자 상에 돌연변이를 함유하며, 이는 ADCC 활성을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, bsAb는 이종이량체 bsAb의 2개의 쇄 모두에 돌연변이를 함유하며, 이는 ADCC 활성을 완전히 제거한다. 예를 들어, bsAb의 한 scFv 분자, 또는 두 scFv 분자 모두에 도입되는 돌연변이는 CH2 도메인 중의 LALA 돌연변이이다. 가변적인 ADCC 활성을 갖는 상기 bsAb는 bsAb가 bsAb에 의해 인식되는 한 항원을 발현하는 세포에 대해 최대의 선택적인 사멸을 나타내지만, bsAb에 의해 인식되는 제2 항원에 대해서는 최소의 사멸을 보이도록 최적화될 수 있다
본 발명은 CCR 및 제2 항원을 인식하는 이중특이적 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 제2 항원은 PD-L1이다. 또 다른 실시양태에서, 제2 항원은 CAIX이다. 다른 실시양태에서, 제2 항원은 CA-IX, ErbB2, PD-L1, PD-1, CD3, IL21, IL21R, HVEM, CD160, TIM3, GITR, LAG3 또는 GAL9이다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 질환 또는 의학적 병태, 예를 들어, 암 치료에 유용할 수 있다. 암은 예를 들어, 고형 암, 예컨대, 신장 세포 암종, 유방암 또는 전립선암이다. 다른 실시양태에서, 암은, 암이 없는 조직 또는 암을 앓지 않는 대상과 비교하였을 때, CAIX, PD-L1 또는 HVEM이 과다발현되는 것인 암이다. 본 발명의 이중특이적 항체는 암을 치료, 예방, 또는 그의 증상을 완화시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 T 세포가 조절 T 세포인 T 세포 증식을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 T 세포 반응, 예컨대, 항원 특이적 T 세포 반응을 촉진시키거나, 또는 증강시키는 데 특히 유용할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 또한 이펙터 T 세포 증식의 조절 T 세포 매개 억제를 역전시키는 데에도 유용할 수 있다.
융합 단백질
일부 실시양태에서, CCR4 항체, 또는 그의 기능적 단편은 제2 단백질에 직접 결합된다. 다른 실시양태에서, CCR4 항체, 또는 그의 기능적 단편은 링커, 예컨대, 가요성 폴리펩티드 쇄를 통해 제2 단백질에 연결된다. 링커는 임의 길이의 임의의 적합한 링커일 수 있지만, 그 길이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30개의 아미노산 길이일 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 숙주의 면역글로불린 분자에 천연적으로 존재하는 바, 이로써, 링커의 존재가 포유동물에 의한 링커 서열에 대한 면역 반응을 일으키지 않는 아미노산 서열이다. CCR4 항체에 대해 1개 초과의 추가 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 각각의 추가 단백질 또는 펩티드 서열을 결합시키는 다중의 링커 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 당업자에게 공지된 재조합 방법에 의해 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CCR4 항체를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터는 제2 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 발현 시스템으로 도입되어 융합 단백질을 번역 및 생산할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 새로운 단백질 합성 기술을 쉽게 이용함으로써 본원에 기술된 융합 단백질을 제조할 수 있다.
조합 방법
본 발명은 CCR4 단백질의 동일한 에피토프, 또는 CCR4 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 항체를 투여하는 방법을 제공한다. 또한, 암은 CCR4에 결합하는 제1 항체, 및 CCR4 이외의 다른 단백질에 결합하는 제2 항체를 투여함으로써 치료된다.
추가로, 본 발명은 CCR4 단백질에 결합하는 항체, 및 항신생물제, 예컨대, 소분자, 성장 인자, 사이토카인, 또는 생체분자, 예컨대, 펩티드, 펩티드모방체, 펩토이드, 폴리뉴클레오티드, 지질 유래 매개인자, 소형 생원성 아민, 호르몬, 뉴로펩티드 및 프로테아제를 비롯한 다른 치료제의 투여를 제공한다. 소분자는 무기 분자 및 소형 유기 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 성장 인자 또는 사이토카인으로는 IL-2, GM-CSF, IL-12, 및 TNF-알파를 포함한다. 소분자 라이브러리가 당업계에 공지되어 있다(문헌 [Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997.] 참조).
본 발명은 특정 방법, 프로토콜 및 시약, 및 본원에 기술된 예로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어 및 예는 단지 특정 실시양태를 기술하고자 하는 목적의 것이고, 당업자에게 가이던스를 제공하고자 하는 의도 및 목적의 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 일반 방법
T 세포 표면 상의 분자 밀도 측정
T 세포를 데이터시트에서 권고된 농도로 PacBlue-항CD3, BV570-항CD4, APC-항CD25, PE-Cy7-항CD127, PE-Cy5-항CD45RA, PerCP-Cy5.5-CCR7 및 PE-항CCR4 mAb와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 4℃에서 30 min 동안 100 ㎕의 FACS 완충제(5 mM EDTA 및 1% BSA로 보충된 PBS) 중에서 염색시켰다. T 세포를 CD 마커에 따라 상이한 T 세포 서브세트로 게이팅하고, PE 형광 강도에 대하여 분석하였다. 형광 강도를 표준 보정 BD 콴티BRITE PE 비드(BD Biosciences: 미국 캘리포니아주 산호세 소재)와 비교하여 분자 총 개수/세포/비드를 측정하고, 이를 세포/비드 표면적으로 나누어 부위 밀도를 구하였다.
Treg 억제 검정법
CD4+CD25- T 세포를 5 μM 농도로 CFSE(BioLegend: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 표지하고, 96 웰 플레이트 중 5x104개의 세포/웰로 각각 T 세포 증식에 대한 양성 및 음성 대조군으로서 20 ㎍/ml 피토헤마글루티닌(PHA: phytohemagglutinin, Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 존재 및 부재하에서 배양하였다. Treg 인리치먼트 키트(Treg Enrichment Kit)(StemCell: 캐나다 밴쿠버 소재) 및 mAb2-3 접합된 다이나비즈(Dynabeads) M-280(Life Technologies:미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 이용하여 CD4+ 및 CD4+CCR4- Treg를 단리시켰다. 5x103개의 CD4+ 및 CD4+CCR4- Treg를 개별적으로 37℃에서 7일 동안 CFSE 표지된 CD4+CD25- T 세포와 함께 인큐베이션시켰다. CFSE 표지된 T 세포의 증식을 측정하기 위해, 공동 배양된 세포를 바이어빌러티 다이 e플루오르 506(Viability Dye eFluor 506)(eBioscience: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 염색한 후, 이어서, 생 CFSE+ 세포를 게이팅하고, 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다.
생존 검정법을 위해, CD4+CD127dim /- CD49d Treg를 Treg 셀 인리치먼트 키트(Treg Cell Enrichment Kit)를 이용하여 PBMC로부터 단리시켰다. 1x105개의 Treg를 0.5 IU/ml IL-2, 20 ㎍/ml mAb2-3 IgG1, 및 20 ㎍/ml 대조군 IgG1와 별개로 또는 조합하여 함께 배양하고, 37℃에서 5일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 바이어빌러티 다이(eBioscience)로 염색시키고, 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다.
세포
OvCA 세포주인 IGROV-1, OVCAR-5, 및 OVCAR-8을 5% CO2 함유 대기 중 37℃에서 인큐베이션시켰다. OVCAR-5 및 OVCAR-8을 10% 우태아 혈청(FBS: fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies)으로 보충된 RPMI-1640(Life Technologies) 중에서 배양하였다. IGROV-1은 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 둘베코 수정 이글 배지(DMEM: Dulbecco's modification of Eagle medium, Life Technologies)에서 배양하였다. 루시페라제 리포터 레트로바이러스를 루시페라제 발현 IGROV-1 및 T 세포에 안정적으로 형질도입시키고, 발광을 검출함으로써 상기 세포주를 확인하였다. 입안자는 상기 세포주에 대한 추가 확인을 수행하지 않았다.
동물
본 연구에서는 6-8주령된 암컷 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스(The Jackson Laboratory: 미국 메인주 바 하버 소재)를 사용하였다. 2x106 또는 5x106개의 루시페라제 발현 IGROV-1 세포를 각각 NSG 마우스의 배측면 옆구리에 피하로(s.c.) 주사하고, 1일 또는 3일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 마우스를 무작위로 상이한 군으로 배정하고, i.v. 주사에 의해 IGROV-1 프라이밍된 T 세포(4x106 또는 1x107) 및 3 mg/kg mAb2-3 IgG1, mAb2-3 IgG4 및 대조군 mAb(5주 동안 주 2회)로 처리하였다. 디지털 캘리퍼스 및 제노겐(Xenogen) 영상화를 이용하여 체중 및 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피는 길이x(너비)2x0.52로서 산출하였다. 다나-파버 캔서 인스티튜트(Dana-Farber Cancer Institute: 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)의 동물 관리 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 가이드라인에 따라 동물 관리를 수행하였다.
주화성
T 세포(1x106개의 세포/웰)를 37℃에서 5시간 동안 mAb2-3과 함께 또는 그의 부재하에서 트랜스웰 이동 웰(Corning: 미국 매사추세츠주 턱스베리 소재)에 배치하였다. OvCA 세포 배양된 배지 또는 100 ng/mL 인간 CCL22(R&D Systems)를 함유하는 하단 챔버로부터 이동 세포를 수거하고, FACS 분석에 의해 계수하였다. IGROV-1-, OVCAR-5-, 및 OVCAR-8-배양된 배지의 상청액(1x106개의 세포/ml)으로부터 OvCA 세포 배양된 배지를 수거하였다. 배양물 또는 CCL22 보충 배지 대비의 상대적인 비율로서 T 세포 이동을 산출하였다.
종양 프라이밍된 T(TP-T) 세포의 확립
PBMC(2x106/ml)를 재조합 IL-2(30 IU/ml) 및 IL-7(5 ng/ml)을 함유하는 완전 배지 중에서 자가 IGROV-1 펄싱된 수지상 세포(DC, 2x105/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 37℃하에 5% CO2 인큐베이터 중 50 ml 조직 배양 플라스크에서 인큐베이션시켰다. PBMC를 매 2주마다 용해물 펄싱된 자가 DC로 재자극시키고, 매 5일마다 배양물에 재조합 IL-2 및 IL-7을 함유하는 신선한 배지를 공급하였다. 항원 자극 및 선별로 이루어진 3 내지 4회의 사이클 후, TP-T 세포가 확립되었고, 이 세포를 2주 동안 재조합 IL-2 및 IL-7을 함유하는 완전 배지 중에서 확장시키고, 그에 대하여 기능 검사를 수행하였다.
사이토카인 생산 분석
TP-T 세포(1x105)를 37℃에서 완전 배지 중에서 자가 IGROV-1 펄싱된 DC(2x104), 펄싱되지 않은 DC(2x104), 또는 다이나비즈 휴먼 T-액티베이터 CD3/CD28(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28)(Life Technologies)과 함께 인큐베이션시켰다. 48시간 인큐베이션 후, 상청액을 수거하고, 휴먼 IFN-γ 리에이전트 키트(Human IFN-γ Reagent Kit)(Pierce Biotechnology: 미국 일리노이주 록퍼드 소재) 및 메조 스케일 디스커버리 섹터 이미저 2400(Meso Scale Discovery Sector Imager 2400)(MSD: 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 IFN-γ를 검출하였다. 추가로, TP-T 세포를 mAb2-3 접합된 비드와 함께 인큐베이션시켜 CCR4+ TP-T 세포를 고갈시켰다. TP-T 또는 CCR4- TP-T 세포(1x105)를 완전 배지 중에서 20 ㎍/ml의 mAb2-3 IgG1 또는 IgG4의 존재 또는 부재하에서 IGROV-1(1x104)과 함께 인큐베이션시켰다. 24 및 48시간 인큐베이션 후, MSD 및 세포내 FACS 분석에 의해 TP-T 세포에 의한 IFN-γ 생산을 사정하였다.
상청액 사이토카인, IL-2, 및 sCD25 검출
IL-2, IL-10, 및 TGF-β에 대하여 ELISA 레디-세트-고! 키츠(ELISA Ready-SET-Go! Kits)(eBioscience) 및 휴먼 IL-2 sRα ELISA 세트(Human IL-2 sRα ELISA Set)(BD Biosciences)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 세포 배양물 상청액 중에서 사이토카인 및 가용성 CD25를 검출하였다. (필요할 경우) 샘플을 RPMI-1640 중에서 희석하였다. IL-10 및 TGF-β의 경우, 자가 CD4+CD25- 및 CD4+CD25+ T 세포(1:1)를 20 ㎍/ml 항체의 존재 또는 부재하에서 항CD3/28(1/0.5 ㎍/ml) 코팅된 플레이트 중에서 10% FBS RPMI-1640 배지를 이용하여 배양하였다. IL-2의 경우, Teff 및 Treg 단독 또는 공동 배양물을 외인성 IL-2 또는 항체의 존재 또는 부재하에서 10% FBS RPMI-1640 배지를 이용하여 인큐베이션시켰다. 외인성 IL-2(20 IU/ml)의 존재하에서, 2x105개의 Mac-1 세포를 항체(mAb2-3 또는 항CD25, 항TAC 및 대조군 mAb 포함)와 함께, 또는 그의 부재하에서 배양하였다. 경쟁 검정법을 위해 Mac-1 세포를 상이한 농도의 항체의 존재 또는 부재하에서 비오티닐화된 IL-2로 염색한 후, FACS에 의해 검출하였다. sCD25 연구를 위해, Mac-1 세포를 MMP-9 억제제(CAS 1177749-58-4), 또는 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터의 음성 대조군인 GM6001(EMD Biosciences: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 존재 및 부재하에서 mAb2-3, CCL17, 또는 CCL22와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 12, 24, 및 48시간 동안 인큐베이션시킨 후, ELISA를 위해 배양된 상청액을 수거하였다.
통계학적 분석
시험관내 및 생체내 실험에 대하여 각각 양측 독립 표본 스튜던트 t 검정 및 이원 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석하였다. *, **, 및 ***는 각각 P 값 < 0.05, 0.01, 및 0.005를 나타낸다.
실시예 2: 인간 T 세포 집단 상의 CCR4 발현 프로파일
건강한 기증자로부터 인간 말초 혈액 단핵구 세포(hPBMC: human peripheral blood mononuclear cell)를 단리시키고, 다중 T 세포 표면 마커로 염색하여 T 세포 하위집단을 기술하였다(도 1a). 세포 마커(CD3, CD4, CD25, 및 CD127)를 사용하여 CD4+CD25고CD127dim/- Treg 및 CD4+CD25-CD127+ Teff를 확인하였다. 추가로, 항CCR7 및 항CD45RA 항체를 사용하여 Teff를 4개의 서브세트, 즉, 나이브(T나이브), 중앙 기억(Tcm), 이펙터 기억(Tem), 및 다른 Teff 집단(oTeff)으로 배정하였다. hPBMC로부터의 각 CD4+ T 세포 서브세트의 비율(%)을 측정하였다(도 1b). CD4+ T 세포 서브세트의 CCR4 발현 프로파일을 추가로 스크리닝하고, 유세포 분석법을 사용하여 콴티BRITE PE 비드 및 PE 표지된 항CCR4 항체에 의해 정량화하였다(도 1c, 7a, 및 S1b). CCR4 분자는 Teff(8063 ± 165, n=3) 상에서보다 약 2.5배 더 높은 표면 밀도(19,717 ± 1416, n=3)로(도 1e), Treg 상에서 균일하게 발현되었다(도 1d). 비록 Teff 상에서의 CCR4 발현이 가변적이기는 하였지만(4-40%)(도 1d), 유사한 개수의 CCR4 분자가 CCR4 양성 세포 상에 존재하였다(도 7c).
실시예 3: Teff 세포 증식에 미치는 CCR4 + Treg의 면역억제 능력
CCR4+ Treg가 면역억제를 매개하는지 여부를 평가하기 위해, CD25 및 FoxP3 공동 염색과 함께 CCR4 염색을 수행하였다. 도 2a에서, CD3+, CD4+, CD25+, 및 FoxP3+ T 세포 게이트에서 85%의 세포가 CCR4를 공동 발현하는 것으로 나타났다. 이어서, Treg 억제 검정법을 수행하여 CCR4+ Treg의 생물학적 기능을 측정하였다. 도 2b 및 2c에 제시된 바와 같이, Teff 증식이 전체 Treg와의 공동 배양에서는 억제되었지만, CCR4- Treg와의 공동 배양에서는 억제되지 않았으며, 이는 CCR4+ Treg 서브세트가 억제인자 활성에서 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.
실시예 4: huPBL - NSG 마우스에서의 mAb2 -3 IgG1에 의한 Treg의 생체내 고갈
mAb2-3 처리가 생체내에서 Treg 집단을 조절할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 2가지 이소타입의 mAb2-3 - IgG1 및 IgG4 이소타입을 사용하였으며, 후자의 경우, Fcγ 수용체(FcγR: Fcγ receptor)에 대한 그의 좁은 범위의 낮은 친화도로 인해 제한된 생체내 고갈 활성을 가진다(20). 상기 항체를 인간 말초 혈액 림프구 NSG 마우스(즉: huPBL-NSG 마우스: human peripheral blood lymphocyte NSG mouse) 내로 주사하고, 마우스 혈액 중 Treg의 비율(%)을 조사하였다. 도 8a에 제시된 바와 같이, 처리 후 1일째, CD4+CD25+CD127dim /- Treg 집단은 mAb2-3 IgG1 군에서는 현저히 감소되었지만, 예상대로, mAb2-3 IgG4 또는 대조군 mAb 처리군에서는 감소되지 않았다(도 8b 및 8c). 7일째, mAb2-3 IgG4 및 대조군 mAb 처리군과 비교하였을 때, mAb2-3으로 처리된 마우스에서는 Treg 회복이 <50%로 이루어졌다. hu-PBL-NSG 마우스에서의 mAb2-3 IgG4 다중 투약 처리의 장기간의 효과 또한 조사하였다. 도 9는 마우스 혈액, 비장, 및 골수에서 인간 CD45+ 림프구 중의 CD3+CD4+CD25+CD127- 세포의 비율이 3주간의 연구 동안 유의적으로 변경되지 않았음을 보여주는 것이다. 흥미롭게도, CD3+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 개수는 mAb2-3 IgG4로 처리된 마우스에서 최종 시점에 증가되었다(각각 도 9c&e). 이러한 결과는 IgG4가 아닌 mAb2-3 IgG1이 Treg의 생체내 고갈을 유도한다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 5: 시험관내 및 생체내에서의 mAb2 -3에 의한, OvCA 매개 Treg 이동 억제
3개의 OvCA 세포주, IGROV-1, OVCAR-5 및 OVCAR-8에서의 CCL22 발현 수준을 조사하였다. 전사 프로파일링 연구와 일치하여(데이터 나타내지 않음), CCL22 발현은 IGROV-1에서 가장 높고, OVCAR-5에서 보통 정도였고, OVCAR-8 세포에서는 검출불가능하였다(도 3a). 상기 세포주 중 어느 것에서도 CCR4 발현은 검출되지 않았다(도 10a). 본 발명자들은 상기 세포주로부터의 배양물 상청액 또는 재조합 인간 CCL22를 사용하여 주화성 검정법을 수행하였다. 신선한 배지와 비교하여, 배양된 배지 3개 모두 증가된 Treg 이동을 보였다. 그러나, mAb2-3 IgG1 및 IgG4, 둘 모두는 OVCAR-8 상청액이 아닌 CCL22 함유 IGROV-1 및 OVCAR-5 상청액에 의해 유도된 Treg 주화성을 억제시킬 수 있었다(도 3b). CCL22로의 Treg 주화성은 또한 용량에 의존하는 방식으로 mAb2-3에 의해 억제되었다(도 10b). 상기 결과는 mAb2-3 IgG1 및 IgG4, 둘 모두 시험관내에서 Treg의 CCL22 분비 OvCA 세포로의 동원을 억제시킬 수 있었다는 것을 시사한다.
mAb2-3이 생체내에서 Treg 동원을 차단시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, w 루시페라제 형질도입된 CD4+ 또는 CD4+CD25+ T 세포를 IGROV-1 이종이식편 종양 보유 마우스 내로 주사한 후, 이어서, mAb2-3 또는 대조군 항체로 처리하였다. 18시간 후, 생체발광성 영상화 결과, 대조군 IgG1로 처리된 마우스에서 CCL22 분비 종양은 CD4+ 및 CD4+CD25+ T 세포를 동원하였지만, 그러한 동원은 mAb2-3 IgG1 처리에 의해 감소된 것으로 나타났다(각각 도 3c 및 3d). mAb2-3 처리 48시간 후 CD4+CD25+CD127dim/- Treg 동원을 조사하였고, 그 결과, a) Treg는 대조군 IgG1 군에서는 종양 조직에 축적되었고, b) Treg는 mAb2-3 IgG1에 의해 고갈되었고, c) Treg는 mAb2-3 IgG4로 처리된 마우스에서는 넓게 분포되어 있는 것으로 나타났다(도 11a). 대조군과 비교하여 mAb2-3 IgG1 및 IgG4 처리, 둘 모두 종양 조직에서 더 낮은 생체발광 강도(도 11b) 및 더 적은 종양 침윤성 Treg(도 11c)를 일으켰다. 본 결과는 생체내에서 mAb2-3 IgG1 처리는 Treg 고갈을 일으킨 반면, mAb2-3 IgG4 처리는 종양 침윤성 Treg 동원을 억제시킨다는 것을 시사한다.
실시예 6: 시험관내에서의 mAb2 -3에 의해 매개되는 증진된 항종양 면역
OvCA 이종이식편 보유 인간화 마우스 모델을 확립하기 위해, 차후에 생체내 면역요법에 대해 시험될 수 있는 IGROV-1-특이 T 세포를 시험관내에서 생성하였다. hPBMC로부터 수거된 단핵구로부터 수지상 세포(DC)를 분화시키고(도 12a), IGROV-1 세포 용해물로 펄싱하고, 자가 hPBMC와 함께 공동 배양하여 종양 프라이밍된 T(TP-T) 세포를 생성하였다. 상기 TP-T 세포는 종양 세포에 대하여 반응할 수 있었고, 이로써, IGROV-1 펄싱된 DC와의 공동 배양물 중에서 IFN-γ의 생산을 유도하였다(도 12b). 추가로, 도 4a의 대표 실험에서 제시된 바와 같이, TP-T 세포는 전체 CD4+ T 세포 중 약 31.6±1.4%(n=3) CD25+ CCR4+ T 세포로 이루어졌다. 상기 CCR4+ TP-T 세포는 또한 mAb2-3 접합된 자기 비드 사용으로 제거될 수 있었다(도 4b). 도 4c에 제시된 바와 같이, IGROV-1 세포와 함께 공동 배양된 TP-T 세포는 단독으로 배양된 TP-T 세포와 비교하였을 때, 증가된 IFN-γ 방출을 보였다. 세포 염색 연구 결과, 동일한 기증자로부터의 프라이밍되지 않은 T 세포와 비교하여 IGROV-1 세포에 대하여 반응하는 CD8+ 및 CD4+ TP-T 세포, 둘 모두의 IFN-γ 발현은 증가한 것으로 나타났다(도 4d).
추가로, CCR4+ 세포가 mAb2-3으로 TP-T 집단으로부터 고갈되었을 때, 공동 배양물은 증진된 IFN-γ 활성을 보였다(도 4c). 그러나, 대조군 IgG1과 비교하였을 때 가용성 mAb2-3 IgG1 또는 IgG4 처리에는 증진 효과는 없었다. 이러한 mAb2-3 증진이 없다는 것은, 공동 배양물 중의 Treg의 비율이 높고/거나, 그가 억제성 매개인자를 방출하고/거나, 그가 세포 대 세포의 접촉을 필요로 하기 때문에 TP-T 억제가 역전될 수 있도록 하기 위해서는 상기 시험관내 시스템에서는 Treg 고갈이 요구될 수 있다는 것을 제안하였다. 또한, mAb2-3에 의해 고갈된 TP-T 세포는 고갈되지 않은 TP-T 세포와 비교하였을 때, IGROV-1 세포에 대하여 더 높은 세포성 세포독성을 유도할 수 있었다(도 4e). 본 데이터는 TP-T 세포, 특히, mAb2-3에 의해 고갈된 CCR4+ TP-T 세포가 항종양 반응을 유도할 수 있고, 종양 세포 사멸을 매개할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7: 생체내 mAb2 -3 항종양 효과 평가
mAb2-3에 의해 매개된 고갈 또는 차단에 의한 감소된 종양 침윤성 Treg가 항종양 활성을 증진시킬 수 있다는 관찰결과의 기능적 관련성, 및 따라서, 치료학적인 관련성을 확인하였다. 루시페라제 발현 IGROV-1 이종이식편을 보유하는 마우스는 4x106개의 TP-T 세포를 받았고, 이를 5주 동안 주 2회에 걸쳐 mAb2-3으로 처리하였다. 매 10일마다 생체발광 영상을 촬영하여 종양 크기를 정량화하였다(도 5a). mAb2-3 IgG1 및 IgG4로 처리된 마우스는 대조군과 비교하여 상대적으로 더 낮은, 낮은 발광 강도를 보였고, 여기서, mAb2-3 IgG1 처리는 mAb2-3 IgG4보다 더욱 큰 항종양 효과를 보였다(도 5b). 종양 크기 측정값에서도 같은 관찰결과가 나타났다(도 5c). 흥미롭게도, 마우스 체중 감소는 mAb2-3 IgG1로 처리된 군에서 가장 큰 것으로 관찰되었다(도 5d). 종양 조직(도 5e) 및 종양 중량(도 5f)에서도 또한 mAb2-3의 항종양 효과가 관찰되었다. 본 결과는 mAb2-3이 생체내에서의 TP-T 세포의 종양에 대한 종양 성장 억제를 매개하였다는 것을 나타내었다.
mAb2-3의 강력한 치료학적 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 IGROV-1 이종이식을 보유하는 마우스 내로 주시되는 TP-T 세포의 개수를 2.5배만큼 증가시켰다. 본 실험 조건하에서, mAb2-3 IgG1 및 IgG4로 처리된 마우스, 둘 모두 종양 성장 곡선에서 통계학상 유의적인 감소를 보였다(도 13a). 체중 및 종양 조직은 도 5 와 유사한 결과를 보였다(도 13b 및 13c). TP-T 세포(CD3+)는 모든 처리군에서 종양 이식 부위로 침윤된 것으로 나타났다(도 13g, 상단 패널). 추가로, CD25+ TP-T 세포는 PBS 및 대조군 mAb로 처리된 이종이식된 종양에서 검출가능하였고, 축적된 반면, mAb2-3 IgG1 및 IgG4로 처리된 종양에서는 CD25+ TP-T 세포의 축적이 감소되었다(도 13g, 하단 패널). 마우스 혈액 중의 TP-T 세포를 FACS에 의해 추가로 조사하였고, 그 결과, 각 처리군 사이에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 차이는 없었지만, Treg 집단은 오직 mAb2-3 IgG1 처리군에서만 오직 감소된 것으로 나타났다(도 13d-f). 종합해 보면, 본 결과는 mAb2-3 IgG1에 의한 Treg 고갈 및 mAb2-3 IgG4에 의한 종양 동원 Treg 차단이 생체내에서 항종양 면역을 증진시킬 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 8: mAb2 -3의 작용 기전
Treg에 의해 사용된 억제 기전은 억제성 사이토카인 및 세포용해성 효소의 방출 뿐만 아니라, CD25/IL-2 및 CD39/아데노신에 의한 대사성 파괴 매개를 포함한다(21). Treg에 의한 사이토카인 생산이 연구되었고, 그 결과, mAb2-3은 억제성 사이토카인, 즉, IL-10 및 TGF-β의 수준을 변경시키지 않은 것으로 나타났다(도 14). 이어서, Teff 및 Treg 상의 CCR4에의 mAb2-3의 결합이 CD25(TAC), IL-2 수용체(IL-2R: IL-2 receptor)의 α 쇄와 IL-2 사이의 상호작용에 영향을 줄 수 있는지 측정하였다. 도 6a는 Teff로부터의 내인성 IL-2 분비가 mAb2-3 처리에 의해 유도되지 않았음을 보여주는 것이다. 그에 반해, 외인성 IL-2가 Treg 배양물에 첨가되었을 때, 오직 mAb2-3 경우에서만 상청액 중에서 IL-2 축적의 현저한 증가가 검출되었다(도 6b). 추가로, 세포를 mAb2-3 또는 대조군 mAb로 처리하고, 또한 외인성 IL-2의 부재하에서(도 6c) 또는 그와 함께(도 6d) 인큐베이션시킨, Teff/Treg 공동 배양 시스템을 셋업하였다. 본 결과, 대조군 mAb 처리가 아닌, mAb2-3 처리가 두 공동 배양물 상청액 모두에서 IL-2 수준을 증가시키는 것으로 나타났다.
이어서, CCR4 및 IL-2R, 둘 모두를 발현하는 Mac-1 세포를 사용하여 경쟁 검정법에서 mAb2-3이 IL-2의 IL-2R에 대한 결합에 영향을 미쳤는지 여부를 추가로 조사하였다. 본 결과, 항TAC(IL-2Rα) mAb와 유사하게, mAb2-3은, IL-2 결합을 차단시키지 못하는 대조군 항CD25 mAb 처리와 비교하였을 때, 비오티닐화된-IL-2의 Mac-1 세포에 대한 결합을 효과적으로 억제시킨 것으로 나타났다(도 15a 및 15b)(22). 추가로, 외인성 IL-2 및 상이한 mAb로 처리한 후, Mac-1 배양물 상청액을 수거하고, 가용성 IL-2 검출을 위해 ELISA 검정법을 수행하였다. 항TAC mAb 및 mAb2-3 처리 둘 모두, 가정컨대, Mac-1 세포에의 외인성 IL-2 결합 억제에 기인하여 기인하여, 배양물 상청액 중의 IL-2 수준을 증가시키지만, 대조군 mAb 처리군 또는 비처리군은 증가시키지 않았다(도 6e).
IL-2R은 3개의 서브유니트, α, β, 및 γ 쇄로 구성되고, α 쇄가 상기 수용체의 IL-2에의 친화도를 Kd=1 nM(βγ 쇄)에서 Kd= 10 pM(αβγ 쇄)으로 현저히 증가시키는 것으로 알려져 있다. 일시적으로 형질감염된 293T 세포를 이용한 대조군 실험에서, IL-2 결합 억제는 mAb2-3의 개별 α, β, 및 γ 서브유니트 쇄에의, 또는 복합체에의 직접적인 결합에 기인하지 않는 것으로 밝혀졌다. 보고에 따르면, CD25 또한 T 세포 활성화 이후에 Kd=30 nM로 가용성 형태(sCD25)로 절단된다(24). mAb2-3 또는 대조군 mAb 처리 후 배양물 상청액 중의 sCD25를 모니터링하였다. 세포를 mAb2-3으로 용량에 의존하는 방식으로 처리하였을 때, 상청액 중의 sCD25의 수준은 증가하였고(도 18a), 이러한 효과는 인큐베이션 시간과 양의 상관관계를 가졌다는 것(도 17b-17d)이 데이터를 통해 입증되었다. 본 결과는 CCR4의 mAb2-3 인게이지먼트는 아마도 그의 리간드 CCL17 및 CCL22와 유사하게 T 세포 활성화를 일으켰다는 것을 제안하였다(25,26). 실제로, 두 리간드 모두, 이 또한 sCD25 배출을 유도하였다(도 17a). Treg 생존에 대한 mAb2-3 매개 sCD25 배출의 기능을 추가로 측정하기 위해, Treg를 IL-2 및/또는 mAb2-3/대조군 IgG1과 함께 배양하였다. IL-2는 Treg 생존을 유지시킬 수 있는 능력을 보였지만, 흥미롭게도, IL-2가 Treg 생존에 미치는 긍정적인 효과는 mAb2-3에 의해 억제되었다(도 6f). 이러한 결과는 Treg 상의 CCR4의 mAb2-3 인게이지먼트가 IL-2/IL-2R 복합체를 조절하고, 이로써, Treg 사멸이 증가될 수 있다는 것을 입증한다.
mAb2-3이 CCL17/22와 CCR4의 상호작용을 차단할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 CCR4의 mAb2-3 인게이지먼트가 mAb2-3과 유사하게 sCD25 배출을 유도할 수 있는지 여부를 이해하고자 하였다. 도 17a는 CCL17 및 CCL22 리간드, 둘 모두, sCD25 배출을 유도하는 활성을 보였다는 것을 입증하는 것으로, 이는 이전에 보고된 바 없었다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 9(MMP-9: matrix metalloproteinase 9)가 CD25를 절단할 수 있는 능력을 가진다는 것이 여러 연구를 통해 밝혀졌다(27-29). CD25 배출 유도에서 mAb2-3, CCL17, 및 CCL22의 작용 기전을 조사하기 위해, 배양물을 MMP-9 억제제 또는 대조군 MMP 억제제로 처리하였다(도 17a). 흥미롭게도, MMP-9 억제제는 모든 처리군에서 sCD25의 배출을 감소시켰고, 대조군 억제제로부터는 어떤 효과도 관찰되지 않았다(도 17a 및 도 18a-b). 본 결과는 mAb2-3 처리가 CCL22/17과 유사한 방식으로 CD25 절단을 유도한다는 것을 시사하며, 이는 mAb2-3이 효능작용 활성을 가지며, MMP-9 기능 및 sCD25 절단을 활성화시킬 수 있는 능력을 CCR4 리간드와 공유하며, 여기서, 최종 결과는 IL-2 결합 손실이라는 것을 제안한다.
참고 문헌
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Figure pct00013
Figure pct00014
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다른 실시양태
본 발명은 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니라, 그를 예시하고자 하는 것이며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의된다. 다른 측면, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dana-Farber Cancer Institute, Inc. <120> METHODS OF MEDIATING CYTOKINE EXPRESSION <130> DFCI-116/001WO 322270-2539 <150> US 62/155,966 <151> 2015-05-01 <150> US 62/217,419 <151> 2015-09-11 <150> US 62/237,942 <151> 2015-10-06 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH chain of mAb2-3 nucleic acid <400> 1 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttgcg agcgcgtgga tgcattggat gcgccaggcg 120 ccgggccagg gcctggaatg gattggctgg attaacccgg gcaacgtgaa caccaaatat 180 aacgaaaaat ttaaaggccg cgcgaccctg accgtggata ccagcaccaa caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcagcacc 300 tattatcgcc cgctggatta ttggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH chain of mAb2-3 IgG4 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys 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ctggagcttc cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcgcc agcagctgga tgcactggat gcggcaggca 120 cctggacagg gcctcgaatg gatcggctgg atcaaccccg gcaacgtgaa caccaagtac 180 aacgagaagt tcaagggcag ggccaccctg accgtggaca ccagcaccaa caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcacg 300 tggtatcggc cgaatgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody 1-49 VH chain amino acid sequence <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Ser 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Trp Tyr Arg Pro Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Lys Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antibody 2-1 VH chain nucleic acid sequence <400> 23 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggagcttc cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcgcc agcagctgga tgcactggat gcggcaggca 120 cctggacagg gcctcgaatg gatcggctgg atcaaccccg gcaacgtgaa caccaagtac 180 aacgagaagt tcaagggcag ggccaccctg accgtggaca ccagcaccaa caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaaccacc 300 cgttatcggc ccctggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2-1 VH chain amino acid sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Ser 20 25 30 Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Thr Arg Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antibody 2-1 VL chain nucleic acid sequence <400> 25 gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcatcctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtatcagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc cagcacccgg 180 gagagcggcg tgcccgaccg gtttagcggc agcggctccg gcaccgactt caccctgacc 240 atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccaccagta ccgtagcagc 300 tacaccttcg gccagggcac aaagctggaa atcaag 336 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2-1 VL chain amino acid sequence <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Arg Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antibody 2-2 VH chain nucleic acid sequence <400> 27 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggagcttc cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcgcc agccaatata tgcactggat gcggcaggca 120 cctggacagg gcctcgaatg gatcggctgg atcaaccccg gcaacgtgaa caccaagtac 180 aacgagaagt tcaagggcag ggccaccctg accgtggaca ccagcaccaa caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagactgacc 300 tattatcggc cgccggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2-2 VH chain amino acid sequence <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Gln 20 25 30 Tyr Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antibody 2-2 VL chain nucleic acid sequence <400> 29 gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcatcctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtatcagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc cagcacccgg 180 gagagcggcg tgcccgaccg gtttagcggc agcggctccg gcaccgactt caccctgacc 240 atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccaccagta ctatagcagc 300 tacaccttcg gccagggcac aaagctggaa atcaag 336 <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2-2 VL chain amino acid sequence <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1-44 heavy chain CDR <400> 32 Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Gln Trp 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1-49 heavy chain CDR <400> 33 Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Ser Trp 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1-44 heavy chain CDR <400> 34 Ser Thr Trp Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1-49 heavy chain CDR <400> 35 Ser Thr Trp Tyr Arg Pro Asn Asp Tyr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab2-1 heavy chain CDR <400> 36 Thr Thr Arg Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab2-2 heavy chain CDR <400> 37 Leu Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asp Tyr 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1-44 light chain CDR <400> 39 His Gln Tyr Ile Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab1-49 light chain CDR <400> 40 His Gln Tyr Lys Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab2-1 light chain CDR <400> 41 His Gln Tyr Arg Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab2-2 light chain CDR <400> 42 His Gln Tyr Tyr Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 43 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggagcttc cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcgcc agctactaca tgcactggat gcggcaggca 120 cctggacagg gcctcgaatg gatcggctgg atcaaccccg gcaacgtgaa caccaagtac 180 aacgagaagt tcaagggcag ggccaccctg accgtggaca ccagcaccaa caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcacc 300 tactaccggc ccctggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 44 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 336 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 50 55 60 Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys 85 90 95 Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr 100 105 110 Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala 115 120 125 Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly 130 135 140 Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala 145 150 155 160 Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys 165 170 175 Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Cys Gly 195 200 205 Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys 210 215 220 Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys 225 230 235 240 Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly 245 250 255 Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr 260 265 270 Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly 275 280 285 Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Ala 290 295 300 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys 305 310 315 320 Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 335 <210> 46 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (32)

  1. 대상에서 조절 T 세포(Treg)를 고갈시키는 방법으로서, 조절 T 세포(Treg)의 고갈을 필요로 하는 대상에게,
    각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄
    를 갖는 인간화 항CCR4 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 것인 방법.
  3. 대상에서 조절 T 세포(Treg)의 사이토카인 분비 종양으로의 이동을 억제하는 방법으로서, 사이토카인 분비 종양을 갖는 대상에게,
    각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄
    를 갖는 인간화 항CCR4 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항체가 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 사이토카인이 CCl2, CCl4, CCL5, CCL17 또는 CCL22인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 불변 영역이 S228P 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포가 실질적으로 고갈되지 않는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율이 종양 또는 대상에서 조절되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율이 증가되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 증식이 증가되거나, 또는 실질적으로 감소되지 않는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 개수가 증가되거나, 또는 실질적으로 감소되지 않는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 집단으로부터의 사이토카인 방출이 조절되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 사이토카인이 인터페론-감마를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 집단으로부터의 이펙터 폴리펩티드 방출이 조절되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 이펙터 폴리펩티드가 그랜자임 B 또는 퍼포린을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 T 세포가 여포성 조절 T 세포인 방법.
  17. 대상에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법으로서, 종양 세포 성장의 억제를 필요로 하는 대상에게,
    각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄
    를 갖는 인간화 항CCR4 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 종양이 고형 종양 또는 혈액 종양인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 혈액 종양이 피부 T 세포 림프종(CTCL), 균상 식육종(MF), 원발성 피부 역형성 대세포 림프종(피부 ALCL), 시자리 증후군(Sezary syndrome), 또는 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL)인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 고형 종양이 신장 세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 피부암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 신장암 또는 위암, 호지킨병 또는 다형성 교아세포종(GBM)인 방법.
  21. 제3항에 있어서, 항체가 IgG4 중쇄 불변 영역 또는 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 것인 방법.
  22. 대상에게 항원 및 항CCR4 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대하여 백신 접종하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 항CCR4 항체는 항원 투여 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 투여되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항CCR4 항체가 이중특이적 항체의 제1 구성원인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 이중특이적 항체의 제2 구성원이 종양 연관 항원, T 세포 기능 조절 분자, T 세포 수용체 폴리펩티드에 대해 특이적인 것인 방법.
  26. 제21항에 있어서, 종양 연관 항원이 CA-IX, ErbB2 또는 HVEM인 방법.
  27. 제21항에 있어서, T 세포 기능 조절 분자가 PD-L1, PD1, CTLA4, GITR, IL21, IL21R, CD160, TIM3, LAG3 또는 GAL9인 방법.
  28. 제21항에 있어서, T 세포 수용체 폴리펩티드가 CD3인 방법.
  29. CCR4+ Treg에 대한 IL-2 결합을 억제하는 방법으로서, 상기 Treg를,
    각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄
    를 갖는 인간화 항CCR4 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  30. CD25 절단을 유도하는 방법으로서, Treg를,
    각각 아미노산 서열 GYTFASAW(서열 번호 9), INPGNVNT(서열 번호 11) 및 STYYRPLDY(서열 번호 13)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 중쇄, 및 각각 아미노산 서열 QSILYSSNQKNY(서열 번호 10), WASTRE(서열 번호 12) 및 HQYMSSYT(서열 번호 14)를 포함하는 3개의 CDR을 지닌 경쇄
    를 갖는 인간화 항CCR4 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  31. 하기 약학 조성물을 1회 이상 투여한 인간 대상에 존재하는 종양에서 또는 그 종양과 연관하여, 조절 T 세포에 대한 이펙터 T 세포의 비율을 증가시키는 데에 효과적인 양으로 인간화 항CCR4 항체를 포함하는 약학 조성물.
  32. 제28항에 있어서, 종양이 고형 종양인 약학 조성물.
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