KR20170136277A

KR20170136277A - 심장비대증 진단용 조성물

Info

Publication number: KR20170136277A
Application number: KR1020160068148A
Authority: KR
Inventors: 양동권
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2017-12-11

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA인 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706의 심장비대 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명은 심장비대증에 대한 진단용 조성물, 진단용 키트, 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법, 예방 또는 치료용 의약 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 심장비대증을 정확하고 신속하며, 저비용으로 진단하는 것이 가능하다.

Description

심장비대증 진단용 조성물{Composition for Diagnosis of Cardiac Hypertrophy}

본 발명은 심장비대증 진단용 조성물에 관한 것이다.

심장비대는 고혈압, 심장판막증 및 심근경색을 포함하는 다양한 병리학적 자극에 대해 발생하는 적응 반응이다¹ ^- ³. 심장비대는 초기 단계에서 보상적 반응인 것으로 여겨지나, 비대성 자극이 지속될 경우, 종종 심부전으로 진행된다. 따라서, 심장비대는 심혈관계 이병율 및 치사율에 대한 독립적인 주요 위험인자이다⁴.

마이크로 RNA(miRNA)는 ~22 뉴클레오타이드의 작은 RNA로 mRNA를 불안정하게 만들거나 번역을 억제함으로써 전사 후 유전자 조절을 통해 유전자 발현을 억제한다⁵. 최근, 많은 miRNA가 심장비대, 심부전 및 심장부정맥을 포함하는 다양한 심혈관계 질환에 관여한다는 것이 밝혀졌다⁶. 또한, miRNA 발현 프로파일링 연구는 많은 miRNA 가 다르게 발현되며, 프로- 또는 항-비대성 활성을 나타냄으로써 심장비대 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다⁷ ^, ⁸. 몇몇 miRNA는 세포 생존, 분화 및 항-비대성 신호전달 경로에 관여하는 타겟 유전자의 발현을 억제함으로써 심장비대를 촉진한다⁹. 최근, 심장 질환 진단용 바이오마커로써 심장에 특이적인 miRNA에 대한 연구가 집중적으로 이루어지고 있다. 일부 miRNA는 비대해진 심근에서 발현되는 것으로 확인되었으나, 그들의 비대 효과의 기초가 되는 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

[1] J. Heineke, J.D. Molkentin, Nature reviews. Molecular cell biology 7 (2006) 589-600. [2] G.W. Dorn, 2nd, J. Robbins, P.H. Sugden, Circ Res 92 (2003) 1171-1175. [3] J.J. Hunter, K.R. Chien, N Engl J Med 341 (1999) 1276-1283. [4] A.M. Katz, The New England journal of medicine 322 (1990) 100-110. [5] D.P. Bartel, Cell 116 (2004) 281-297. [6] D. Sayed, C. et al., Circ Res 100 (2007) 416-424. [7] E. van Rooij, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (2006) 18255-18260. [8] C. Jentzsch, et al., Journal of molecular and cellular cardiology 52 (2012) 13-20. [9] E.M. Small, et al., Circulation 121 (2010) 1022-1032.

본 발명자들은 생물학적 시료에서 심장비대증을 초기에 정확하게 진단할 수 있는 바이오 마커 물질을 발굴하기 위해 심도 있는 연구를 수행하였다. 그 결과, 마이크로 RNA 라이브러리로부터 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706이 심장비대증 환자의 생물학적 시료에서 유의하게 높은 수준으로 발현되어 심장비대증의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 실험적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 심장비대증 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 심장비대증의 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 심장비대증 진단용 바이오마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 심장비대증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 심장비대증 바이오 마커인 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 심장비대증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 생물학적 시료에서 심장비대증을 초기에 정확하게 진단할 수 있는 바이오 마커 물질을 발굴하기 위해 심도 있는 연구를 수행하였다. 그 결과, 마이크로 RNA 라이브러리로부터 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706이 심장비대증 환자의 생물학적 시료에서 유의하게 높은 수준으로 발현되어 심장비대증의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 실험적으로 규명하였다.

본 발명은 마이크로 RNA miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706의 심장비대증 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.

본 발명의 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706의 염기서열은 각각 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열에 개시된다.

본 발명자들은 상기 마이크로 RNA miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706이 심장비대증을 나타내는 개체에게서 유의하게 높은 수준으로 발현된다는 점을 확인하였고, 생물학적 시료에서 상기 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정함으로써 심장비대증을 정확하게 진단할 수 있다는 것을 실험적으로 입증하였다.

본 발명에서 상기 마이크로 RNA miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706을 검출할 수 있는 제제는 상기 마이크로 RNA와 특이적으로 결합 또는 반응하여 이의 존재 또는 농도를 확인할 수 있는 제제를 의미하며, 구체적으로 마이크로 RNA miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 핵산(nucleic acid), 올리고뉴클레오타이드, 항체(antibody) 또는 이의 단편, 펩타이드 및 PNA(Peptide nucleic acid)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로 RNA miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706을 검출할 수 있는 제제는 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)이다.

본 명세서에서 용어 “상보적”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 “상보적”은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용되는 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소연쇄반응(PCR)(USP 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(USP 6,410,276), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR) (USP 4,437,975), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(USP 5,413,909 및 5,861,245), 핵산염기서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(USP 5,130,238, USP 409,818, USP 5,554,517, 및 USP 6,063,603), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 USP 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 심장비대증으로 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 대해 사용한다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료”는 심장비대증의 발병 여부를 확인하기 위해 마이크로 RNA를 검출하는데 사용되는 시료를 의미한다. 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 요액(urine), 혈액, 혈청, 혈장, 조직(tissue) 또는 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 조성물을 포함하는 심장비대증 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 심장비대증 진단용 키트는 마이크로어레이 키트 또는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 본 발명의 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 마이크로어레이 칩에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 지지체(substrate)상에 고정화된다. 바람직한 지지체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 지지체상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 RNA miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 또는 miR-706을 포함하는 심장비대증의 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 심장비대증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다:

(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 마이크로 RNA의 발현 양을 분석하는 단계; 상기 마이크로 RNA가 상향-조절(up-regulation) 되는 경우에 심장비대증으로 판정한다.

상기 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): miRNA의 발현을 측정하는 단계

개체로부터 분리된 생물학적 시료의 miRNA의 발현을 측정한다.

심장비대를 진단하기 위해 miRNA의 발현 양을 분석한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 miRNA의 발현 양의 분석은 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 반응을 실시하여 측정한다.

상기 마이크로어레이는 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다.

본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현 정도, 예컨대, 마이크로어레이, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현 정도를 정상 대조군과 비교한다.

단계 (b): 심장비대의 진단 단계

다음, 상기 miRNA의 발현 양을 분석하여 심장비대를 진단한다.

상기 진단은 정상 조직의 miRNA 발현 양과 비교하여 심장비대를 판정한다; miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마이크로 RNA가 정상 조직과 비교하여 상향-조절(up-regulated)되는 경우에 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 심장비대를 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정한다.

본 발명은 마이크로 RNA의 발현 정도와 심장비대 사이의 상관성에 기초한다. 즉, miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706의 발현은 심장비대 환자에서 상향-조절 되는 양상으로 나타난다.

본 명세서에서 miRNA를 언급하면서 사용되는 용어 “상향-조절”은 조사 대상의 시료(예컨대, 세포)에서의 상기 miRNA의 발현 정도가 정상 조직 세포의 miRNA 발현 정도와 비교하여 높은 경우를 의미한다.

본 발명의 심장비대를 판정하는데 있어서, 상기 상향-조절은 1.2배 이상, 1.5배 이상 또는 2.0배 이상 발현 양이 증가된 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질(drug candidate)의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질(drug candidate)의 스크리닝 방법을 단계별로 상세하게 설명한다.

단계 (a): 심장 세포에 분석시료를 접촉하는 단계

본 발명의 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질을 스크리닝 하기 위해, 심장 세포에 분석시료를 접촉한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 분석시료는 화학물질, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시료는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed. Engl . 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

단계 (b): miRNA 발현 수준을 측정하여 분석시료를 판정하는 단계

상기 심장 세포의 miRNA 발현 수준을 측정하여 분석시료를 판정한다. 보다 상세하게는, miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 microRNA가 하향-조절(down-regulation) 되는 경우에 상기 분석시료는 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질로 판정한다.

본 발명의 스크리닝 방법을 상기 miRNA의 발현을 분석하여 실시하는 경우, miRNA의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 마이크로 RNA인 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706의 심장비대 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 심장비대증에 대한 진단용 조성물, 진단용 키트, 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법, 예방 또는 치료용 의약 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명에 의하면 심장비대증을 정확하고 신속하며, 저비용으로 진단하는 것이 가능하다.

도 1은 심장비대증 마우스 모델을 평가한 결과이다.
도 2는 마이크로어레이를 통해 심장비대증에서 상향 조절되는 마이크로 RNA를 분석한 결과이다.
도 3은 6개의 심장비대증 특이적 miRNA에 대하여 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 실시한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

수술 절차

압력 과부하를 실시하여 마우스에서 심장비대를 유도하였다. 간략하게 설명하면, 8-10 주령의 웅성 마우스(20-25 g)에 케타민(50 mg/kg) 및 자일라진(2.5 mg/kg) 혼합물을 복강내 투여하여 마취하였다. 계속적으로 환기하면서, 마우스을 대동맥링을 노출시키기 위해 흉골을 2-3 mm 세로 절개하였다(Harvard Apparatus). 횡근 대동맥(transverse aorta)에 뭉툭한 27-게이지 주사 바늘을 대동맥을 따라서 넣고, 결찰(7-0 실크)한 다음 주사 바늘을 빼냄으로써 대동맥 협착을 수행하였다. Sham-operation(Sham)군에는 결찰을 제외한 동일한 시술을 시행하였다. 심장비대를 유도하기 위해 마우스에 TAC 수술을 실시하고 2주 동안 유지하였다.

miRNA 마이크로어레이

총 RNA는 각 실험을 위해 4-5 좌심실로부터 준비하고(Trizol), 제조사(E-biogen, 한국)의 지시에 따라 696 miRNA를 포함하는 Agilent 마우스 miRNA 마이크로어레이에 혼성화시켰다. Agilent’s DNA 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 슬라이드를 스캔하고, Feature Extraction Software(Agilent)로 분석하였다. 도출한 데이터의 재현성은 표준화된 프로브 시그널의 스캐터-플롯 분석으로 평가하였다. 각 지점에서의 데이터 세트 가운데 최저 상관 계수를 갖는 데이터 세트를 버리고, 나머지 데이터 세트에 대하여 추가 분석을 실시하였다.

정량적 실시간 PCR

TRI 시약(Sigma)을 이용하여 마우스 심실 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 심장비대 마커 유전자의 발현 레벨을 측정하기 위해, ImProm II reverse-transcriptase (Promega)을 이용하여 올리고-dT를 프라이밍하여 역전사 반응을 실시하였다. 형광 염료로 SYBR Green(Takara)을 사용하는 TaKaRa Thermal Cycler TP 815를 이용하여 정량적 실시간 PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 실시하였다. GenoExplorerTM miRNA First-strand cDNA core kit (GenoSensor) 및 GenoExplorerTM miRNA qPCR primer set (GenoSensor)을 이용하여 qRT-PCR을 수행하여 miRNA를 정량하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다: ANF 정방향: 5’- ACCTGCTAGACCACCTAGAGG-3’, 역방향: 5’- GCTGTTATCTTCCGTACCGG-3’; β-MHC 정방향: 5’- CAGACATAGAGACCTA CCTTC-3’, 역방향: 5’-CAGCATGTCTAGAAGCTCAGG-3’; GAPDH 정방향: 5’- CTCTACCCACGGCAAGTTC-3’, 역방향: 5’-GCCAGTAGACTCCACGACATA-3’.

통계

모든 테이터는 평균 ± 표준편차로 기재하였다. 통계적 유의성은 Student's t test 또는 Bonferroni post-hoc 분석을 포함하는 one-way ANOVA(Statview 5.0, SAS)를 사용하여 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

실험결과

심장비대

심장비대를 유도하기 위해 14일간 가로 대동맥 수축(transverse aortic constriction, TAC)을 실시하였다. 심장비대의 진행은 체중에 대한 심장 무게 비율(sham 심장과 비교하여 TAC14 심장에서 48% 증가; 도 1A) 및 ANF(atrial natriuretic factor) 발현 레벨(sham 심장과 비교하여 15.7% 증가; 도 1B)을 측정하여 확인하였다. 이러한 결과를 통해 TAC-수술 마우스 모델에서 심장비대가 잘 유도되었음을 확인하였다.

심장비대에 특이적인 miRNA의 식별

총 RNA를 준비한 다음, 696 miRNA를 포함하는 Agilent 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 각 그룹에 대한 miRNA 발현 레벨의 평균값을 클러스터링한 다음, 도식화하였다(도 2A). 계층 클러스터링은 비대해진 심장에서만 발현 증가되는 miRNA 클러스터를 나타낸다(검정색 선). 전체적으로 38개 miRNA가 이 클러스터에 속한다(도 2B). 이 miRNA 가운데 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706은 비대해진 심장에서 통계적으로 유의(p<0.05)하게 상향 조절되는 것으로 나타났다.

심장비대에 특이적인 miRNA 발현 변화 확인

miRNA 마이크로어레이 데이터의 유효성을 확인하기 위해 6개의 심장비대증 특이적 miRNA에 대하여 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 실시하였다. qRT-PCR을 통해 발현 변화를 측정한 결과, miRNA 마이크로어레이로 확인한 발현 변화와 유사한 결과를 확인하였다(도 3).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for Diagnosis of Cardiac Hypertrophy <130> PN160183 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> miR-363 <400> 1 aauugcacgg uauccaucug ua 22 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> miR-493 <400> 2 uuguacaugg uaggcuuuc 19 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> miR-434-5p <400> 3 gcucgacuca ugguuugaac ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> miR-471 <400> 4 uacguaguau agugcuuuuc ac 22 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> miR-425 <400> 5 aaugacacga ucacucccgu uga 23 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> miR-706 <400> 6 agagaaaccc ugucucaaaa aa 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> ANF Forward Primer <400> 7 acctgctaga ccacctagag g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> ANF Reverse Primer <400> 8 gctgttatct tccgtaccgg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Beta-MHC Forward Primer <400> 9 cagacataga gacctacctt c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Beta-MHC Reverse Primer <400> 10 cagcatgtct agaagctcag g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> GAPDH Forward Primer <400> 11 ctctacccac ggcaagttc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> GAPDH Reverse Primer <400> 12 gccagtagac tccacgacat a 21

Claims

miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 심장비대증 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제는 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplification reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 프로브는 마이크로어레이(microarray)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 심장비대증으로 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 대해 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 요액, 혈액, 혈청, 혈장, 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 심장비대증 진단용 키트.
miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA를 포함하는 심장비대증 진단용 바이오마커.
분리된 생물학적 시료에서 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 심장비대증
다음의 단계를 포함하는 심장비대증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 마이크로 RNA의 발현 양을 분석하는 단계; 상기 마이크로 RNA가 상향-조절(up-regulation) 되는 경우에 심장비대증으로 판정한다.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 마이크로 RNA의 발현은 마이크로어레이를 실시하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질(drug candidate)의 스크리닝 방법:
(a) 심장 세포에 분석시료를 접촉하는 단계; 및
(b) 상기 심장 세포의 miRNA 발현 수준을 측정하여 분석시료를 판정하는 단계; miR-363, miR-493, miR-434-5p, miR-471, miR-425 및 miR-706로 구성된 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA가 하향-조절(down-regulation)되는 경우에 상기 분석시료는 심장비대증의 예방 또는 치료용 의약 후보물질로 판정한다.