KR20170133719A

KR20170133719A - Nrf2 활성화제, Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20170133719A
Application number: KR1020160064859A
Authority: KR
Inventors: 이충근; 도기환; 이용걸; 송홍수
Original assignee: (주)리치케미칼
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2017-12-06
Also published as: KR101857526B1

Abstract

본 발명은 활성산소 소거 활성도가 높은 Nrf2 활성화제, 이를 이용한 화장품, 세럼 타입의 화장품 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, Nrf2 활성화제로서 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 함께 도입하고, 이를 이용하여 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제조함으로써, 피부 표피층 내 분포되어 있는 Nrf2의 활성을 도와서 피부 내 활성산소 제거성능을 크게 향상시켜서 피부탄력향상 및 항산화 효과가 우수한 화장품을 제공할 수 있는 발명에 관한 것이다.

Description

Nrf2 활성화제, Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법{Nrf2 activator, Nrf2 induction revitalizing agent, Revitalizing cosmetics containing the same and Manufacturing method thereof}

본 발명은 활성산소 소거 활성도가 높은 Nrf2 활성화제, 스트레스 받고 지친 피부를 효과적으로 회복시켜주는 상기 Nrf2 활성화제를 포함하는 제제, 이를 이용한 화장품, 세럼 타입의 화장품 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

선복화는 뿌리줄기로서 원반상, 원주상 등으로 그 형태가 고르지 않으며, 원반상의 것은 지름 3~10cm, 두께 0.5~3cm이고 가는 것은 거의 원주상이며, 지름 1~3cm, 길이 5~8cm이나 때로 세로로 쪼개진 것도 있다. 횡단면은 회갈색 내지 황갈색이고, 형성층 부근은 갈색을 띤 환층이 명확한 특징이 있다. 그리고, 측면은 어두운 갈색이며, 가로 주름이 있고 껍질을 벗긴 것은 황갈색이며, 목부의 지름은 피부의 약 3~4배이고, 바깥 면은 매우 단단하나 섬유성이 아니다. 그리고, 특유한 냄새가 약간 있고 맛은 떫고 쓰며 씹으면 가는 모래를 씹는 것 같고 침을 노랗게 물들이는 특징이 있는 약재이다. 이러한 선복화의 추출물을 이용한 당뇨병 예방, 치료용 조성물(대한민국 공개번호 2005-0003669호), 식물병해 방제 활성제(대한민국 공개번호 2010-0048351호), 변비치료(대한민국 등록번호 1286467호) 등으로 이용된 기술이 공지된 바 있으나, 선복화 추출물을 이용한 피부개선제에 대한 기술은 공지된 바가 없다.

종대황은 뿌리줄기로서 원반상, 원주상 등으로 그 형태가 고르지 않으며, 원반상의 것은 지름 3~10cm, 두께 0.5~3cm이고 가는 것은 거의 원주상이며, 지름 1~3cm, 길이 5~8cm이나 때로 세로로 쪼개진 것도 있다. 횡단면은 회갈색 내지 황갈색이고, 형성층 부근은 갈색을 띤 환층이 명확한 특징이 있다. 그리고, 측면은 어두운 갈색이며, 가로 주름이 있고 껍질을 벗긴 것은 황갈색이며, 목부의 지름은 피부의 약 3~4배이고, 바깥 면은 매우 단단하나 섬유성이 아니다. 그리고, 특유한 냄새가 약간 있고 맛은 떫고 쓰며 씹으면 가는 모래를 씹는 것 같고 침을 노랗게 물들이는 특징이 있는 약재이다. 이러한 종대황의 추출물을 이용한 당뇨병 예방, 치료용 조성물(대한민국 공개번호 2005-0003669호), 식물병해 방제 활성제(대한민국 공개번호 2010-0048351호), 변비치료(대한민국 등록번호 1286467호) 등으로 이용된 기술이 공지된 바 있으나, 종대황 추출물을 이용한 피부개선제에 대한 기술은 공지된 바가 없다.

활성산소는 정상적인 인체의 대사과정에서 끊임 없이 만들어지는 물질로, 통상 우리가 호흡하는 산소의 2 ~ 5% 정도는 활성산소로 바뀐다. 이러한 활성산소가 위험한 이유는 강력한 산화작용 때문이다. 몸 안의 과량의 유해활성 산소는세포와 단백질, DNA를 손상시켜 세포구조나 기능, 신호전달체계에 이상을 일으키게 되어 최종적으로는 체내에서 염증을 일으키거나 노화를 유도하기도 한다. 이러한 활성산소의 생성 원인 중 하나인 태양의 자외선은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 유발하여 홍반, 수종, 자외선화상, 광노화 및 피부암 같은 질병을 일으킨다. Superoxide anion (O2·-), H2O2(hydrogen peroxide), 그리고 ·OH(hydroxy radical) 등을 포함하는 ROS는 호흡 및 대사과정을 통해 지속적으로 생성되는 것으로, 체내에서는 SOD(superoxide dismutase), Gpxes(glutathione peroxidase), 카타라제(catalase)와 같은 효소를 이용하여 ROS에 의한 손상을 막는다. 그러나, 태양 광선에 의한 과량의 ROS 발생은 생체 내의 항산화적 방어 능력을 초과하게 되어 산화적 스트레스가 발생한다. 즉, DNA, 세포막 및 단백질 등과 반응하여 세포나 조직에 손상을 유발하고, 이는 각종 염증질환, 파킨슨병, 광노화, 암 발생 등을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 피부의 표피층에 분포하고 있는 Nrf2는 인체 내 및 외부로부터 발생한 활성산소 제거에 작용하는 전사인자인데, 이를 활성화시키면 피부 노화, 피부 세포, 피부 조직의 손상을 방지할 수 있다.

본 발명자들은 끊임없이 연구한 결과, 선복화 추출물 및/또는 종대황 추출물이 피부 노화를 유발시키는 활성산소를 제거하는 Nrf2의 활성을 촉진시킴으로서, 피부를 보호하고 개선할 수 있으며, 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 적정량 혼합하여 사용하면 이들의 시너지 효과로 활성산소 제거능이 증가함을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 즉, 본 발명은 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 Nrf2 활성화제로 이용하고, 이를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 이용한 화장품, 세럼, 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 포함하는 Nrf2의 활성화제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 Nrf2의 활성화제를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 포함하는 화장품, 바람직하게는 세럼 타입의 화장품을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 피부 표피층 내 분포되어 있는 Nrf2의 활성을 도와서 피부 내 활성산소 제거성능을 크게 향상시킴으로써, 피부탄력향상과 뛰어난 항산화 효과가 우수하여, 거칠고 칙칙한 피부의 생기를 되찾아 피부에 은은한 광택과 윤기를 부여할 수 있으며, 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 도입한 화장품은 사용시간에 구애 없이 피부에 언제든지 적용이 가능하다.

도 1a 및 도 1b 각각은 실험예 1-1 및 실험예 1-2에서 실시한 양성대조군 Trolox 농도별 RFU 변화 그래프이다.
도 2a 및 도 2b 각각은 실험예 1-1 및 실험예 1-2에서 실시한 양성대조군 Trolox 농도별 netAUC 스탠다드 커브 그래프이다.
도 3a는 실험예 1-1 에서 실시한 선복화 추출물의 농도별 RFU 변화 그래프이다.
도 3b는 실험예 1-2 에서 실시한 종대황 추출물의 농도별 RFU 변화 그래프이다.
도 4a는 실험예 1-1 에서 실시한 선복화 추출물의 농도별 산소라디칼 소거활성(netAUC)측정 결과이다.
도 4b는 실험예 1-2 에서 실시한 종대화 추출물의 농도별 산소라디칼 소거활성(netAUC)측정 결과이다.
도 5는 실험예 2에서 실시한 루시퍼라제 활성도 측정 결과로서, 도 5a는 선복화 추출물에 대한 측정 결과이고, 도 5b는 종대황 추출물에 대한 측정 결과이다.
도 6은 실험예 3에서 실시한 세포독성 측정 결과로서, 도 6a은 선복화 추출물의 세포독성 측정 결과이고, 도 6b는 종대황 추출물의 세포독성 측정 결과이다.
도 7은 실험예 4에서 실시한 웨스턴 블롯(Western Blot)을 통해 단백질을 정량한 결과로서, 도 7a는 선복화 추출물의 정량결과이고, 도 7b는 종대황 추출물의 정량결과이다.
도 8a ~ 도 8c 각각은 실험예 5에서 실시한 PCR(Real Time PCR)을 통한 선복화 추출물의 Nrf2, HO-1 및 NQ01의 mRNA(messenger RNA) 레벨 측정 결과이고, 도 8d ~ 도 8f 각각은 종대황 추출물의 Nrf2, HO-1 및 NQ01의 mRNA(messenger RNA) 레벨 측정 결과이다.
도 9는 선복화 추출물 및 종대황 추출물의 산화적 스트레스 방어 테스트 측정 결과로서, 도 9a(선복화 추출물) 및 도 9c(종대황 추출물) 각각은 실험예 6에서 실시한 세포내 8-OH-dG(8-hydroxy deoxyguanosine) 레벨 측정한 것이고, 도 9b(선복화 추출물) 및 도 9d(종대황 추출물)는 각각은 세포내 4-HNE(4-hydroxynonenal)울 측정한 광학현미경 측정 사진이다.
도 10은 실험예 7에서 실시한 종대황 추출물의 활성산소 제거 여부를 측정한 광학현미경 측정 사진이다.
도 11은 실험예 8에서 실시한 선복화 추출물 및 종대황 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과로서, 도 11a는 선복화 추출물 농도별 측정결과이고, 도 11b는 종대황 추출물 농도별 측정 결과이다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 자세하게 설명을 하겠다.

본 발명의 Nrf2의 활성화제는 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 포함한다.

상기 선복화 추출물은 정제수 100 중량부에 대하여 선복화 4 ~ 10중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 90℃ ~ 100℃ 하에서, 4 ~ 8시간 동안 열수추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 단계; 상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올 및 에틸헥실글리세린을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 선복화 추출물을 제조하는 단계;의 공정을 수행하여 제조한 것을 사용할 수 있다.

상기 선복화 추출물 제조시, 상기 1차 필터링은 평균기공 20㎛ ~ 30㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있고, 바람직하게는 평균기공 23㎛ ~ 27㎛인 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

그리고, 상기 2차 필터링은 평균기공 8㎛ ~ 15㎛ 필터막으로, 바람직하게는 8㎛ ~ 12㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

상기 선복화 추출물만을 단독으로 적용한 Nrf2의 활성화제는 활성산소 소거 활성도를 대조군인 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 당량으로 환산하여 측정시, 0.025% 농도의 선복화 추출물의 ORAC(Oxygen Radical Antioxidant Capacity) 값이 90 ~ 110 mM TE/g를, 바람직하게는 92 ~ 105 mM TE/g를, 더욱 바람직하게는 95 ~ 102 mM TE/g를 가질 수 있다.

본 발명의 Nrf2의 활성화제 성분 중 상기 종대황 추출물은 정제수 100 중량부에 대하여 종대황 4 ~ 10 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 90℃ ~ 100℃ 하에서, 4 ~ 8시간 동안 열수추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 단계; 상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올 및 에틸헥실글리세린을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 종대황 추출물을 제조하는 단계;의 공정을 수행하여 제조한 것을 사용할 수 있다.

상기 종대황 추출물 제조시, 상기 1차 필터링은 평균기공 20㎛ ~ 30㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있고, 바람직하게는 평균기공 23㎛ ~ 27㎛인 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

그리고, 상기 종대황 추출물만을 단독으로 적용한 Nrf2의 활성화제는 활성산소 소거 활성도를 대조군인 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 당량으로 환산하여 측정시, 0.00625% 농도의 종대황 추출물의 ORAC(Oxygen Radical Antioxidant Capacity) 값이 580 ~ 650 mM TE/g 를, 바람직하게는 600 ~ 640 mM TE/g 를, 더욱 바람직하게는 610 ~ 635 mM TE/g 를 가질 수 있다.

본 발명의 Nrf2 활성화제는 이의 성분으로서, 선복화 추출물을 단독으로 포함하고, 선복화 추출물 농도가 0.027%(용매 정제수)일 때, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성값이 50%((IC50)을 가질 수 있다. 또한, Nrf2 활성화제 성분으로서 상기 종대황 추출물을 단독으로 포함하는 경우, 종대황 추출물 농도가 0.174%(용매 정제수)일 때, DPPH 라디칼 소거 활성값이 50%(IC50)을 가질 수 있다.

그런데, Nrf2 활성화제 성분으로서 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 혼합하여 사용하면, DPPH 라디칼 소거 활성능이 크게 증대를 한다. 구체적인 일례를 들면, Nrf2 활성화제는 농도 0.027%(용매 정제수)의 선복화 추출물 및 농도 0.174%(용매 정제수)인 종대황 추출물을 1 : 1 중량비로 포함할 때, DPPH 라디칼 소거 활성값이 60% ~ 65%를 가질 수 있으며, 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 개별적으로 사용하는 경우 보다 추출물 합 총 사용량이 같은 경우, 더 높은 DPPH 라디칼 소거 활성값을 가질 수 있는 것이다.

본 발명의 Nrf2 활성화제는 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 1 : 0.5 ~ 2 중량비로, 바람직하게는 1 : 0.8 ~ 1.8 중량비로, 더욱 바람직하게는 1 : 1 ~ 1.5 중량비로 포함할 수 있으며, 이때, 종대황 추출물을 0.5 중량비 미만으로 사용시, 추출물을 각각 사용시 보다 DPPH 라디칼 소거능 제거 향상 효과 증대가 미비할 수 있고, 종대황 추출물을 2 중량비 초과하여 사용하더라도 혼합 사용으로 인한 DPPH 라디칼 소거능 제거 증대 효과가 더 이상 없으므로, 상기 범위 내의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 선복화 추출물은 농도가 0.005 ~ 0.30%(용매인 물에 대한 부피%임)이고, 종대황 추출물은 농도가 0.01 ~ 0.4%(용매인 물에 대한 부피%임)인 것이 활성산소 소거 활성도 및 DPPH 라디칼 소거 활성 측면에서 바람직하다.

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 상기 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 포함하는 Nrf2의 활성화제를 이용하며, 수상액; 유상액; 상기 활성화제; 향료; 및 정제수;를 포함한다.

그리고, 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 상기 수상액 15 ~ 20 중량%, 상기 유상액 18 ~ 25 중량%, 상기 Nrf2의 활성화제 1 ~ 7 중량%, 상기 향료 0.05 ~ 1 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하며, 바람직하게는 상기 수상액 16 ~ 19.5 중량%, 상기 유상액 18.5 ~ 23 중량%, 상기 Nrf2의 활성화제 3.5 ~ 7 중량%, 상기 향료 0.1 ~ 0.5 중량% 및 잔량의 정제수를 포함한다.

그리고, 상기 유상액이 18 중량% 미만이면 유분 미달로 피부 보습 유지에 문제가 있을 수 있고, 25 중량%를 초과하면 과도한 오일성분이 함유되어 피부호흡 방해나 지성피부의 뽀루지 등의 문제를 일으킬 수 있다. 또한, Nrf2의 활성화제가 1 중량% 미만이면 그 함량이 너무 적어서 활성산소 제거 효과를 볼 수 없을 수 있고, 7 중량%를 초과하면 과다 사용으로 인핸 다른 성분들과의 상용성이 떨어져서 제품의 질이 오히려 떨어질 수 있으며, 과다 사용으로 인한 Nrf2 활성화 효과 증대도 거의 미비하므로 비경제적이다.

Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 상기 향료는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 일례를 들면, Perfume 85147, Perfume 25399 등을 사용할 수 있다.

[수상액]

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 상기 수상액은 피부컨디셔닝제, 금속이온봉쇄제, 증점제, 보습제, 점도감소제, 살균보존제 및 용제를 포함한다.

수상액 성분 중 상기 피부컨디셔닝제로는 소듐하이알루로네이트, 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산(hyaluronic acid), 감초가루 및 하이드롤라이트(hydrolite) 중에서 선택된 2종 이상을, 더욱 바람직하게는 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트를 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트를 혼합하여 사용시 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트를 1 : 0.01 ~ 0.2 : 1 ~ 3 중량비로, 바람직하게는 하이드롤라이트를 1 : 0.02 ~ 0.15 : 1.2 ~ 2.7 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

수상액 성분 중 상기 금속이온봉쇄제는 제제에 함유할 수 있는 금속이온에 의해 변질을 방지하는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 상기 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 0.1 ~ 2 중량부를, 바람직하게는 0.2 ~ 1.5 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 금속이온봉쇄제의 사용량이 0.1 중량부 미만이면 금속이온 봉쇄 효과가 떨어질 수 있고, 2 중량부를 초과하여 사용하면 금속이온 봉쇄 증대 효과가 없으므로 비경제적인 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 상기 금속이온봉쇄제는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디소듐이디티에이(disodium EDTA), 디포타슘이디티에이(dipotassium EDTA), 트리소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 및 라이스피테이트(rice phytate) 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 증점제는 제제에 적절한 점성과 끈적임을 부여하여 피부 밀착성을 증가시키는 역할을 하는 것으로서, 증점제 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 0.5 ~ 2 중량부를, 바람직하게는 0.5 ~ 1.7 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 잔탄검의 사용량이 0.5 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 이를 사용하는 효과가 미비하고, 2 중량부를 초과하여 사용하면 제제의 점도가 너무 높아져서 피부에 대한 끈쩍임이 너무 증가하여 상품성이 떨어지는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 증점제로는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잔탐검, 구아하이드록시 트리모니움 클로라이드 및 하이드록시 에틸 셀룰로오스 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 보습제는 유상액의 수분증발차단제와 함께 피부 보습을 증대시키는 역할을 하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 40 ~ 80 중량부를, 바람직하게는 42 ~ 70 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 보습제의 사용량이 40 중량부 미만이면 피부 보습 효과가 떨어질 수 있고, 80 중량부를 초과하여 사용하더라도 보습 증대 효과가 없으므로 비경제적인 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 보습제로는 메틸프로판디올 및 글리세린 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 점도감소제는 적정 점도를 유지하여 피부와의 점착력, 피부 흡수력을 증대시키기 위해 사용하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 45 ~ 90 중량부를, 바람직하게는 50 ~ 85 중량부를, 더욱 바람직하게는 52 ~ 80 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 점도감소제 사용량이 45 중량부 미만이거나 90 중량부를 초과하면 제제의 점도가 너무 높거나 낮아져서 피부와의 점착력이 너무 낮거나 끈적임이 너무 증대하여 사용감이 떨어지는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 상기 점도감소제로는 당업계에서 사용하는 일반적인 점도감소제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디(C2 ~ C5 알킬렌)글라이콜을, 더욱 바람직하게는 디프로필렌글라이콜을 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 살균보존제는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제가 미생물 등에 의해 오염되는 것을 방지하기 위해 사용하는 것으로서 화장품 소재로서 사용이 금지되지 않은 살균보존제라면 특별히 한정 없이 사용이 가능하며, 구체적인 일례로 클로페네신 등을 사용할 수 있다. 그리고, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 4 ~ 8 중량부를 사용할 수 있으며, 그 사용량이 2 중량부 미만이면 미생물에 의한 오염 방지 효과가 미비할 수 있고, 10 중량부를 초과하여 사용하는 것은 과도한 사용으로서 피부 트러블을 유발할 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 용제로는 헥산디올, 프로필렌글라이콜, 부틸렌글라이콜 및 펜틸렌 클라이콜 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 헥산디올 및 부틸렌글라이콜을 혼합하여 사용하거나, 더욱 바람직하게는 1,2-헥산디올 및 1,3-부틸렌글라이콜을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 용제 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 30 ~ 60 중량부를, 바람직하게는 35 ~ 50 중량부를 사용할 수 있으며, 30 중량부 미만으로 사용시 수상액 성분간 용해 및 혼합이 잘 되지 않을 수 있고, 60 중량부를 초과하여 사용하는 것은 비경제적이다.

[유상액]

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 상기 유상액은 수분증발차단제, 토코페릴아세테이트, 피부컨디셔닝제, 유화제, 피부유연화제, 비이온계면활성제 및 피막형성제를 포함한다.

유상액 성분 중 수분증발차단제는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 적정 수분 유지 및 제조된 제제를 피부에 적용시, 보습제와 함께 적정 수분 함량을 유지시키는 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 오일(Caprylic/Capric Triglyceride oil), MCT 오일 및 스쿠알란 중에서 선택된 1종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 MCT 오일 및 스쿠알란을 5 ~ 10 : 1 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 토코페릴아세테이트는 제제가 시간이 지남에 따라 산화하여 변질되는 것을 막는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 수분증발차단제 100 중량부에 대하여, 0.1 ~ 5 중량부를, 바람직하게는 0.4 ~ 2 중량부를 사용할 수 있다. 이때, 토코페릴아세테이트 사용량이 0.1 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 산화방지 효과를 볼 수 없을 수 있고, 그 함량이 5 중량부를 초과하면 피부에 자극을 초래하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 피부컨디셔닝제는 피부에 영양분을 공급하는 역할을 하는 것으로서, 쉐어지방(shea butter) 및 코코넛 오일, 마카다미아넛 오일, 호호바 오일 중에서 선택된 단종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 쉐어지방 및 코코넛 오일을 1 : 0.4 ~ 0.8 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다. 피부컨디셔닝제의 사용량은 수분증발차단제 100 중량부에 대하여, 10 ~ 35 중량부를, 바람직하게는 13 ~ 30 중량부를 사용하는 것이 좋으며, 이때, 피부컨디셔닝제 함량이 10 중량부 미만이면 피부 영양공급 효과가 미미할 수 있는 문제가 있을 수 있고, 그 함량이 35 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 일정부분 피부흡수 후 피부표면에 남아 번들거리게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 유화제는 유상액 조성물들간 상용성 향상 및 유화력을 증대시키기 위한 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세테아릴 글루코사이드-세테아릴 알코올(cetearyl glucoside and cetearyl alcohol), 세테아릴알코올, 글리세릴스테아레이트, 피이지-6 소르비탄스테아레이트, 피이지-20 스테아레이트, 피이지-40 스테아레이트 및 피이지-100 스테아레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세테아릴 글루코사이드-세테아릴 알코올 및 세테아릴알코올 중에서 선택된 종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 유화제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 30 ~ 60 중량부를, 바람직하게는 40 ~ 55 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 유화제 사용량이 30 중량부 미만이면 유상액 간 혼합, 용해가 잘 되지 않을 수 있으며, 60 중량부를 초과하여 사용하는 것은 비경제적이다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 피부유연화제는 거친 피부를 부드럽게 하는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 3 ~ 7.5 중량부를 사용하는 것이 좋으며, 이때, 피부유연화제 사용량이 2 중량부 미만이면 효과가 미미 할 수 있는 문제가 있을 수 있고, 그 함량이 10 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 사용시 끈적거림이 심할 수 있는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 피부유연화제는 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 유상제, 글리세릴카프레이트, 폴리글리세릴-2-라우레이트 및 폴리글리세릴-10-라우레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 유상제 및 폴리글리세릴-10-라우레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 상기 유상제의 구체적인 일례로는 알콜라인 MCM(AKOLINE MCM) 등이 있다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 비이온계면활성제는 유화제와 함께 조성물들에 대한 용해 보조제 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 비이온 계면활성제를 사용할 수 있으며, 구체적인 일례로는 Tween 20, Tween 40 및 Tween 60 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 비이온계면활성제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 7 ~ 20 중량부를, 바람직하게는 10 ~ 15 중량부를 사용할 수 있다.

다음으로, 유상액 성분 중 피막형성제는 제제가 피부에 적용 후, 외부의 불필요한 오염 물질 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 일례로는 세피플러스 400(sepiplus 400) 등을 사용할 수 있다. 그리고, 피막형성제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 피막형성제 1.5 ~ 8 중량부를, 바람직하게는 2.5 ~ 7 중량부를 사용할 수 있으며, 그 사용량이 1.5 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 이를 사용하는 효과를 볼 수 없고, 8 중량부를 초과하여 사용하면 유상액 성분 내 고형분이 발생할 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

또한, 유상액은 증점안정제를 더 포함할 수 있다. 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 1 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 2 ~ 8 중량부를 사용할 수 있으며, 10 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 이루고자 하는 점도를 초과하여 사용하기에 불편할 수 있는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 상기 증점안정화제로는 소듐폴리아크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리이소부텐, 카보머, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 50, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리아크릴레이트, 폴리이소부텐 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

이하에서는 앞서 설명한 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제조하는 방법에 대하여 설명을 한다.

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 유상액 및 수상액을 각각 제조한 후, 이들을 특정 조건 온도 하에서 유화시켜 제조한 것으로서, 수상액 및 유상액을 각각 제조하는 1단계; 상기 유상액에 수상액을 첨가한 다음 교반시켜서 혼합물을 제조하는 2단계; 40℃ ~ 50℃ 하에서 상기 혼합물, 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 포함하는 상기 Nrf2 활성화제, 향료 및 정제수를 혼합 및 2,000 ~ 3,000 rpm의 교반속도로 교반시키는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.

그리고, 상기 1단계의 유상액은 피부컨디셔닝제, 토코페릴아세테이트, 유화제, 피부유연화제, 수분증발차단제 및 비이온계면활성제를 혼합한 후, 60℃ ~ 75℃, 바람직하게는 65℃ ~ 72℃의 온도가 되도록 가열 및 교반시켜서 용해액을 제조한 다음, 상기 용액에 피막형성제를 분산 및 교반시켜서 제조할 수 있다.

또한, 1단계의 수상액은 피부컨디셔닝제, 금속이온봉쇄제, 증점제, 보습제, 점도감소제, 살균보존제 및 용제를 혼합한 후, 50℃ ~ 60℃가 되도록 가열 및 교반시켜서 제조할 수 있다.

상기 유상액 및 수상액에 사용되는 성분 및 이의 사용량은 앞서 설명한 바와 동일하다.

2단계는 유상액에 수상액을 첨가한 다음 70℃ ~ 80℃ 하에서 2,000 ~ 3,000 rpm의 교반 속도로 1분 ~ 4분간 유화를 수행하여 혼합물을 제조할 수 있다.

그리고, 3단계의 선복화 추출물 및 종대황 추출물은 앞서 설명한 방법으로 제조한 것일 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 pH 5.4 ~ 6.2, 바람직하게는 pH 5.8 ~ 6.0, 더욱 바람직하게는 pH 5.85 ~ 5.95일 수 있다.

앞서 설명한 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 사용하여 다양한 타입의 화장품을 제조할 수 있으며, 일례를 들면, 크림 타입, 세럼 타입 등의 화장품을 제조할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 자세하게 설명을 한다. 그러나, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위를 한정하여 해석해서는 안된다.

[실시예]

실시예 1 : 선복화 추출물의 제조

정제수 100 중량부에 대하여 선복화 5중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 준비하였다.

다음으로, 상기 원료를 90 ~ 100에서 4~8시간 동안 열수 추출하여 추출물을 얻었다.

다음으로, 상기 추출물을 평균기공 25㎛인 필터막으로 필터링하여 1차 여과액을 얻었다.

다음으로 상기 여과액 여과액 94.9 ml에 1,2-헥산디올 5 ml 및 에틸헥실글리세린 0.1 ml을 첨가한 다음 충분하게 교반한 후, 교반액을 평균기공 10㎛인 필터막으로 2차 필터링을 수행하여 선복화 추출물을 제조하였다.

실시예 2 : 종대황 추출물의 제조

정제수 100 중량부에 대하여 종대황 5중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 준비하였다.

다음으로 상기 여과액 여과액 94.9 ml에 1,2-헥산디올 5 ml 및 에틸헥실글리세린 0.1 ml을 첨가한 다음 충분하게 교반한 후, 교반액을 평균기공 10㎛인 필터막으로 2차 필터링을 수행하여 종대황 추출물을 제조하였다.

실험예 1-1 : 선복화 추출물의 항산화 및 산소라디칼 소거활성 측정

(주)대한피부과학연구소에 의뢰하여 실시예 1에서 제조한 선복화 추출물의 항산화 및 산소라디칼 소거활성을 측정하였다(시험기간 2015.11.27 ~ 2016.1.14.).

항산화 활성(ORAC-FL assay, Oxygen Radical Antioxidant Capacity) 시험방법은 플루오레세인(Fluoresein), 시험물질과 페록시라디칼(peroxyl radical)인 AAPH를 반응시켜 형광 세기를 측정했다(Excitation:485nm, Emmision:525nm). 구체적으로는 시료인 선복화 추출물을 최종 농도 0.0007813% ~ 0.125% 범위로 희석하여 진행하였으며, 대조군으로 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 사용하였다.

그리고, 각 시험 물질을 black 96well plate에 25 ㎕씩 분주한 다음, Fluoresein 150㎕를 넣고 30분간 37℃에서 반응시켰다. 다음으로 AAPH(2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)를 25㎕씩 각 well에 분주하고 Excitation 485, Emission 528nm 조건에서 형광도를 측정하였다(60 분, 간격 3분).

결과 계산은 시간에 따른 형광도를 모두 더한 값에서 blank 형광도를 뺀 값으로 blank와 시료 그래프 사이 면적에 해당하는 net AUC로 나타내었다. 그리고, Trolox 당량(mM TE/g)은 Trolox standard curve를 이용하여 해당 농도의 Trolox 당량(net AUC값)을 계산하였다. 또한, ORAC 값(value)은 시료 1g 당 Trolox 당량 값으로 변환하여 측정하였다.

양성대조군인 Trolox를 대상으로 5 ~ 50 uM 농도 범위에서 net AUC(area under the curve)를 측정하였으며(도 1a 참조), 농도별 net AUC 표준 곡선을 작성하였다(도 2a 참조).

그리고, 선복화 추출물의 net AUC 측정 그래프를 도 3a에 나타내었고, 선복화 추출물의 산소라디칼 소거 활성 측정 결과를 하기 표 1 및 도 4a에 나타내었다.

선복화 추출물 처리농도(%)	Trolox 당량(mM TE/g)
선복화 추출물 처리농도(%)	1차	2차	3차	평균	표준편차
0.0125	113.87	111.09	107.34	110.77	3.28
0.0250	99.69	96.41	97.14	97.75	1.72
0.0500	87.21	86.21	80.03	84.49	3.89
0.1000	66.06	66.15	64.48	65.57	0.94

상기 표 1 및 도 4-1의 의 측정 결과를 살펴보면 선복화 추출물은 0.025% 농도처리시97.75 mM TE/g의ORAC value를 나타내며, 우수한 항산화 활성(페록실 라디칼 소거활성)이 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1-2 : 종대황 추출물의 항산화 및 산소라디칼 소거활성 측정

(주)대한피부과학연구소에 의뢰하여 실시예 2에서 제조한 종대황 추출물의 항산화 및 산소라디칼 소거활성을 측정하였다(시험기간 2016.2.15 ~ 2016.2.26.).

항산화 활성(ORAC-FL assay, Oxygen Radical Antioxidant Capacity) 시험방법은 플루오레세인(Fluoresein), 시험물질과 페록시라디칼(peroxyl radical)인 AAPH를 반응시켜 형광 세기를 측정했다(Excitation:485nm, Emmision:525nm). 구체적으로는 시료인 종대황 추출물을 최종 농도 0.0007813% ~ 0.125% 범위로 희석하여 진행하였으며, 대조군으로 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 사용하였다.

양성대조군인 Trolox를 대상으로 2.5 ~ 50 uM 농도 범위에서 net AUC(area under the curve)를 측정하였으며(도 1b 참조), 농도별 net AUC 표준 곡선을 작성하였다(도 2b 참조).

그리고, 종대황 추출물의 net AUC 측정 그래프를 도 3b에 나타내었고, 종대황 추출물의 산소라디칼 소거 활성 측정 결과를 하기 표 2 및 도 4b에 나타내었다.

종대황 추출물 처리농도(%)	Trolox 당량(mM TE/g)
종대황 추출물 처리농도(%)	1차	2차	3차	평균	표준편차
0.00078	567.08	877.76	688.24	711.03	156.59
0.00156	600.76	599.16	452.49	550.80	85.15
0.00313	678.48	643.87	621.37	647.90	28.77
0.00625	636.92	621.71	608.41	622.35	14.27
0.01250	518.80	491.23	471.35	493.79	23.83

상기 표 1 및 도 4b의 측정 결과를 살펴보면 종대황 추출물은 0.00625% 농도처리시 622.35 mM TE/g의ORAC value를 나타내며, 우수한 항산화 활성(페록실 라디칼 소거활성)이 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 선복화 추출물의 루시퍼라아제 활성도 측정

(1) 인간피부 세포주인 HaCaT 세포에 ARE(antioxidant response element)로 루시퍼라아제를 삽입하여 HaCaT reporter cell(HaCaT-ARE-GFP-luciferase cell)을 만들었고, 이 세포주는 이용하여 루시퍼라아제 활성도를 측정하였다. 이 세포주는 Nrf2에 의하여 ARE가 활성화 되면 GFP 또는 루시퍼라아제(luciferase)가 발현되므로 Nrf2의 활성을 빠르게 감지할 수 있는 측정이다.

루시퍼라아제 활성도 측정은 HaCaT-ARE-GFP-luciferase cell에 RPMI1640 media 0ug/ml(control), 실시예 1의 선복화 추출물(20 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml) 및 브로콜리 추출물인 설포라페인(sulforaphane, Positive Control)으로 각각 10Um의 농도로 처리 한 후, 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 세포(cell)의 용해물(Lysate)를 단백질 정량한 값과 루시퍼라아제 활성도(Luciferase activity)의 값을 측정하여 데이터 처리하였다.

측정 결과, 선복화 추출물이 동량 비교시 70% 이상의 활성 유도 효과를 갖는 천연물을 확인할 수 있었다(도 5a 참조).

(2) 동일한 방법으로 실시예 2의 종대황 추출물(20 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml)을 이용하여 루시퍼라아제 활성도 측정은 하였으며, 측정 결과, 종대황 추출물이 동량 비교시 70% 이상의 활성 유도 효과를 갖는 천연물을 확인할 수 있었다(도 5b 참조).

실험예 3 : 선복화 추출물 및 종대황 추출물의 세포 독성 측정

실시예 1의 선복화 추출물 및 실시예 2의 종대황 추출물 각각의 농도를 높였을 때의 세포 독성을 확인하기 위해서 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였으며, HaCaT cell에 24 시간, 48 시간 동안 종대황 추출물을 처리하고 테트라졸륨(tetrazolium)에 4시간 동안 인큐베이션(incubation)한 후, 흡광도(570nm) 값을 측정하였으며, 선복화 추출물의 결과를 도 6a에 나타내었고, 종대황 추출물의 결과를 도 6b에 나타내었다. 도 6a 및 도 6b를 살펴보면 선복화 추출물 및 종대황 추출물 모두 세포독성이 전혀 없음을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : 웨스턴 블랏 측정

Nrf2에 의하여 전자가 조절된다고 알려진 HO-1, NQO1을 폴리클로날 항체(polyclonal antibodies)를 이용하여 실시예 1의 선복화 추출물 및 실시예 2의 종대황 추출물 각각에 대한 웨스털 블랏(Western blot)을 시행하였고, 그 결과를 도 7a(선복화 추출물) 및 도 7b(종대황 추출물)에 나타내었다. 이때, 선복화 추출물 및 종대황 추출물 각각의 농도는 200 ug/ml였다.

Phase II 대사조절에 관련된 단백질의 증가가 전사단계에서 조절되는 것을 확인하는 실험으로서, 이를 조절하는 스위치가 Nrf2(NF-E2-related factor-2) 전사인자인데 Phase II 반응에 관련된 단백질은 모두 프로모터(promoter)에 ARE 시퀀스(sequence)를 가지고 있다. 따라서 Nrf2는 ARE 결합을 통해 활성산소를 제거하는 Phase II 단백질의 발현을 전사레벨에서 증가시키고 이를 통하여 활성산소로부터 보호하는데, 도 7-2의 웨스턴 블랏 측정 결과를 살펴보면, 시간이 지남에 따라 전사인자들이 유도됨을 알 수 있다.

실험예 5 : real time RT PCR 측정

활성산소가 발생하였을 때 Phase II대사 시스템에 관련된 효소들이 이 활성산소에 반응하여 그 레벨이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다. 이때 이 Phase II 대사 조절에 관련된 단백질의 증가는 전사단계에서 조절되고, 이를 조절하는 전사인자들은 Nrf2, HO-1, NQO-1 등이 있다.

이에 mRNA 레벨이 증가되는지 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time RT PCR)으로 측정하였다. HaCaT cell에 선복화 추출물(20 ug/ml) 또는 종대황 추출물(20 ug/ml)를 처리(시간별로 인큐베이션함)하여 RNA를 뽑고, 뽑아낸 RNA를 다시 cDNA로 합성한 후에 Real Time RT PCR로 mRNA 레벨을 측정하였다.

선대황 추출물에 대한 결과를 8a(Nrf2), 도 8b(HO-1) 및 도 8c(NQ01)에 각각 나타내었다. 도 8a ~ 도 8c를 보면, 시간에 따라 Nrf2, HO-1, NQO-1의 Phase II mRNA 레벨이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 종대황 추출물에 대한 결과를 도 8d(Nrf2), 도 8e(HO-1) 및 도 8f(NQ01)에 각각 나타내었다. 도 8d ~ 도 8f를 보면, 시간에 따라 Nrf2, HO-1, NQO-1의 Phase II mRNA 레벨이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6 : 산화적 스트레스 방어 테스트 측정

HaCaT cell(control), HaCaT cell 에 TPA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)만 처리한 경우 및 HaCaT cell 에 TPA와 실시예 1의 선복화 추출물(SBH, 20 ug/ml) 또는 실시예 2의 종대황 추출물(JDH, 20 ug/ml)를 처리한 경우의 HaCaT cell 내 산화적 스트레스 방어 여부를 측정하였다.

선복화 추출물에 대한 측정 결과를 도 9a 및 도 9b에 각각 나타내었고, 종대황 추출물에 대한 측정 결과를 도 9c 및 도 9d에 각각 나타내었다.

도 9a 및 도 9c는 산화적 스트레스에 의하여 DNA 손실(damage)이 일어나는지를 알아보기 위해 HaCaT cell에 DNA 염색을 하여 세포 내 8-OH-dG(8-hydroxy deoxyguanosine) 레벨을 측정한 것이고, 도 9b 및 도 9d는 지질 과산화 반응(lipid peroxidation)이 일어나는지 알아보기 위해 HaCaT cell에 DNA 염색을 하여 세포 내 4-HNE(4-hydroxynonenal)레벨을 측정한 것이다.

도 9a 및 도 9b를 살펴보면, TPA만으로 처리한 것과 TPA와 함께 선복화 추출물(SBH)로 처리한 경우가 산화적 스트레스 방어를 하고 있음을 확인할 수 있다.

또한, 도 9c 및 도 9d를 살펴보면, TPA만으로 처리한 것과 TPA와 함께 종대황 추출물(JDH)로 처리한 경우가 산화적 스트레스 방어를 하고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 7 : 종대황추출물 항산화 측정

HaCaT cell에 TPA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 처리하여 활성산소(ROS :Reactive Oxygen Species)를 유도시킨 후, 실시예 2의 종대황 추출물(JDH, 20 ug/ml)로 처리하여 항산화 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 이때, DCFDA(Cellular Reactive Oxygen Species Detection assay) 로 활성산소 값을 측정하였으며, DCFDA 자체는 세포막(cell membrane)을 통과할 수 있고, DCFDA가 활성산소 종류를 만나면 DA가 잘리고 DCF는 세포 내부에 트래픽킹(trafficking )되므로, 종대황 추출물이 활성산소를 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 도 10을 살펴보면, TPA 만으로 처리한 경우, 형광물질이 빛나는 바, 활성산소 억제 효과가 없음을 확인할 수 있었다. 이에 반해 TPA+JDH의 경우, 형광물질이 빛을 발하지 않았으며 이를 통해서 종대황 추출물이 활성산소를 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 8 : 선복화 추출물 및 종대황 추출물 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

(주)대한피부과학연구소에 의뢰하여 실시예 1에서 제조한 선복화 추출물 및 실시예 2에서 제조한 종대황 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 소거활성을 측정하였다(시험기간 2016.1.25 ~ 2016.2.5.).

시료를 최종 농도 예비 실험을 통해 50% 정도의 자유라디칼(free radical) 소거 활성을 나타낼 수 있는 적절한 농도 범위로 희석하여 준비하였고, 대조군으로 아스코르빈산(Ascorbic acid)을 사용하였다.

각 시험 물질 50㎕에 0.1mM DPPH 250㎕, EtOH 200㎕을 넣고 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 520nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼의 농도를 확인하여 하기 수학식 1에 의거하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다.

[수학식 1]

DPPH 소거활성도(%)=100(%)-(시험물질 첨가군 흡광도/무첨가 흡광도)*100(%)

IC50: DPPH 라디칼 50%를 소거하는 데 필요한 시료의 농도

(1) 양성 대조군 아스코르빈산의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

항산화 활성을 가지는 것으로 알려진 ascorbic acid를 양성대조군으로 한 DPPH radical 소거 활성 시험 결과를 표 3에 나타내었다. 그 결과, 시험농도 범위에서 농도의존적인 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어(IC50 : 3.72 ug/ml), 본 시험 과정에 문제가 없음을 확인할 수 있었다.

Free radical scavenging(% of control)
농도(ng/ml)	1차평균	2차평균	3차평균	평균	표준편차
0	0	0	0	0	0
0.078125	3.78	0.67	1.41	1.95	1.62
0.15625	4.09	-1.51	4.08	2.22	3.23
0.3125	8.35	3.02	6.12	5.83	2.68
0.625	14.80	8.72	13.19	12.24	3.15
1.25	28.66	24.16	27.63	26.82	2.36
2.5	42.99	39.43	45.53	42.65	3.06
5	56.69	52.18	59.18	56.02	3.55

(2) 선복화 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

선복화 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성 시험을 통해 확인하였다(하기 표 4) 그 결과, 선복화 추출물은 0.00156% 내지 0.05% 범위에서 농도의존적이고(도 11a 참조), IC50 0.027%의 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

Free radical scavenging(% of control)
농도(ng/ml)	1차평균	2차평균	3차평균	평균	표준편차
0	0	0	0	0	0
0.00156	9.38	6.53	8.27	8.06	1.44
0.00313	15.94	10.44	15.62	14.00	3.09
0.00625	28.28	23.49	28.79	26.85	2.92
0.0125	41.25	36.87	42.11	40.08	2.81
0.025	52.66	48.61	54.52	51.93	3.02
0.05	56.41	54.81	58.50	56.57	1.85
0.1	55.47	53.18	54.98	54.54	1.20

(3) 종대황 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

종대황 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성 시험을 통해 확인하였다(하기 표 5 참조) 그 결과, 종대황 추출물이 0.00313% ~ 0.25% 범위에서 농도의존적이고(도 11b 참조), IC50 0.174%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

Free radical scavenging(% of control)
농도(ng/ml)	1차평균	2차평균	3차평균	평균	표준편차
0	0	0	0	0	0
0.00156	2.83	-0.49	1.69	1.34	1.69
0.00313	3.62	-1.97	3.38	1.68	3.16
0.00625	6.60	0.82	6.62	4.68	3.34
0.0125	13.84	5.91	11.38	10.38	4.06
0.025	20.75	17.08	20.62	19.48	2.08
0.05	32.70	28.24	33.54	31.50	2.85
0.1	44.81	38.26	45.54	42.87	4.01
0.125	48.00	50.23	49.25	49.16	1.12
0.25	54.46	56.43	57.01	55.97	1.34

(4) 선복화 추출물 및 종대황 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

상기 선복화 추출물 및 종대황 추출물 각각에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성을 통해 선복화 추출물은 IC50 0.027%이고, 종대황 추출물은 IC50 0.174%임을 확인하였었다.

따라서, 0.027% 농도의 선복화 추출물 및 0.174% 농도의 종대황 추출물을 1:0.1 ~ 2.5중량비로 혼합한 후, 이의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

선복화 추출물:종대황 추출물 중량비	Free radical scavenging(% of control)
1 : 0.2	50.53
1 : 0.35	51.83
1 : 0.5	58.04
1 : 0.8	62.84
1 : 1.0	66.53
1 : 1.5	67.25
1 : 2.0	68.02
1 : 2.5	66.35

상기 표 6의 측정결과를 살펴보면, 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 1 : 0.5 중량비 이상으로 사용했을 때부터 DPPH 라디칼 소거 활성이 크게 증가하였고, 종대황 추출물을 2 중량비 초과하여 사용하더라도 DPPH 라디칼 소거 활성 증대가 더 이상 없음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 1 : 0.5 ~ 2.0 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 DPPH 소거 활성 측면에서 유리함을 확인할 수 있었다.

제조예 1 : Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조

(1) 수상액의 제조

하기 표 7의 성분들을 용제에 완전 분산시킨 후, 정제수를 투입한 다음, 56℃ ~ 57℃로 가열 및 교반하여 완전 용해시켜서 수상액을 제조하였다.

수상액	구분	종류	중량부
	피부컨디셔닝	히알루론산(1% 농도)	39.2
		감초분말	2
		하이드롤라이트-5	58.8
	금속이온봉쇄제	EDTA-2NA	0.39
	증점제	잔탄검(Keltrol F)	0.98
	보습제	글리세린	49.06
	점도감소제	디프로필렌 글라이콜	58.83
	용제	1,2-헥산디올	19.61
	용제	1,3-부틸렌글라이콜	19.61
	살균보존제	클로페네신	5.88

(2) 유상액의 제조

하기 표 8의 성분들을 혼합한 후, 68℃에서 아지믹서로 저어주면서 혼합 및 용해시킨 다음, 피막형성제를 투입하여 골고루 분산 및 혼합하여 유상액을 제조하였다.

유상액	구분	종류	사용량(중량부)
	피부증발차단제	MCT 오일	87.5
	피부증발차단제	스쿠알란	12.5
	토코페릴아세테이트	Vit-E Acetate	0.625
	피부컨디셔닝	쉐어버터	12.50
	피부컨디셔닝	코코넛 오일	6.25
	유화제	세테아릴글루코시드 및 세테아릴알코올(Emulgade PL 68/50)	18.75
	유화제	세테아릴알코올(KALCOL 6850)	25
	피부유연화제	하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 포함 유상(AKOLINE MCM)	5
	비이온계면활성제	Tween 60	12.5
	피막형성제	SEPIPLUS 400	3.75

(3) 앞서 제조한 유상액에 수상액을 천천히 첨가한 후, 호모믹서를 이용하여 이들의 혼합물을 74~75℃ 하에서 2,500 rpm의 교반 속도로 2분간 교반한 후, 45℃에서 실시예 2의 종대황 추출물 및 향료(Perfume 85147)를 첨가하고, 천천히 교반시켜서 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 제조하였다. 제조된 제제는 세럼 타입이었으며, pH는 5.91이였다.

그리고, 제조된 제제는 전체 중량 중 수상액 17.90 중량%, 유상액 20.70 중량%, 선복화 추출물(농도 0.027%) 1.94 중량% 및 종대황 추출물(농도 0.174%) 1.94 중량%, 향료 0.28 중량% 및 잔량의 물을 포함하도록 제조하였다.

Claims

선복화 추출물 및 종대황 추출물을 포함하는 Nrf2 활성화제.
제1항에 있어서, 상기 선복화 추출물 및 종대황 추출물을 1 : 0.5 ~ 2 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 활성화제.
제1항에 있어서, 상기 선복화 추출물은 농도가 0.005 ~ 0.30%이고, 종대황 추출물은 농도가 0.01 ~ 0.4%인 것을 특징으로 하는 Nrf2 활성화제.
제1항에 있어서, 활성산소 소거 활성도를 대조군인 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 당량으로 환산하여 측정시, 0.025% 농도의 선복화 추출물의 ORAC(Oxygen Radical Antioxidant Capacity) 값이 90 ~ 110 mM TE/g이고, 0.00625% 농도의 종대황 추출물의 ORAC 값이 580 ~ 650 mM TE/g인 것을 특징으로 하는 Nrf2 활성화제.
제1항에 있어서, 상기 선복화 추출물은 농도가 0.027%(용매 정제수)일 때, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성값이 50%((IC50)이고,
상기 종대황 추출물은 농도가 0.174%(용매 정제수)일 때, DPPH 라디칼 소거 활성값이 50%(IC50)인 것을 특징으로 하는 Nrf2 활성화제.
제1항에 있어서, 농도 0.027%(용매 정제수)의 선복화 추출물 및 농도 0.174%(용매 정제수)인 종대황 추출물을 1 : 0.5 ~ 2 중량비로 포함할 때, DPPH radical 소거 활성값이 58% ~ 67%인 것을 특징으로 하는 Nrf2 활성화제.
수상액; 유상액; 제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 Nrf2의 활성화제; 향료; 및 정제수;를 포함하며,
상기 수상액은 피부컨디셔닝제, 금속이온봉쇄제, 증점제, 보습제, 점도감소제, 살균보존제 및 용제를 포함하고,
상기 유상액은 수분증발차단제, 토코페릴아세테이트, 피부컨디셔닝제, 유화제, 피부유연화제, 비이온계면활성제 및 피막형성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제7항에 있어서,
상기 수상액 15 ~ 20 중량%, 상기 유상액 18 ~ 25 중량%, 상기 Nrf2의 활성화제 1 ~ 7 중량%, 상기 향료 0.05 ~ 1 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제7항에 있어서, 상기 수상액은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 금속이온봉쇄제 0.1 ~ 2 중량부, 증점제 0.5 ~ 2 중량부, 보습제 40 ~ 80 중량부, 점도감소제 45 ~ 90 중량부, 살균보존제 2 ~ 10 중량부 및 용제 30 ~ 60 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제7항에 있어서,
상기 유상액은 수분증발차단제 100 중량부에 대하여, 토코페릴아세테이트 0.1 ~ 5 중량부, 피부컨디셔닝제 10 ~ 35 중량부, 유화제 30 ~ 60 중량부, 피부유연화제 2 ~ 10 중량부, 비이온계면활성제 7 ~ 20 중량부 및 피막형성제 1.5 ~ 8 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제7항에 있어서, pH 5.8 ~ 6.0인 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제7항의 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품.
제7항의 제제를 포함하는 세럼(serum).
수상액 및 유상액을 각각 제조하는 1단계;
상기 유상액에 수상액을 첨가한 다음 교반시켜서 혼합물을 제조하는 2단계;
40℃ ~ 50℃ 하에서 상기 혼합물, 제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 Nrf2의 활성화제, 향료 및 정제수를 혼합 및 2,000 ~ 3,000 rpm의 교반속도로 교반시키는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조방법.