KR20170127794A - 고발광 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구조의 단단함 증가와 에너지 전이를 통하여 발광 특성 및 안정성이 크게 향상된 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법을 개시한다. 본 발명의 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 금(Au)을 포함하고, 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Au22(SG)18-R1x-R2y
상기 화학식 1에서, SG는 글루타싸이온(glutathione)이고, R1은 방향족 고리를 함유하며 상기 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이고, R2는 아미노 말단기 함유 화합물이며, x는 1 내지 18의 정수이고, y는 1 내지 18의 정수이다.

Description

고발광 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법{HIGH LUMINOUS GOLD NANOCLUSTERS AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}
본 발명은 고발광 특성 및 안정성이 우수한 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
금속 클러스터는 특정 개수의 금속 원자와 리간드로 이루어져 수 나노미터의 크기를 가진다. 금속 나노 클러스터는 금속 양자점 또는 금속 나노 파티클에 비하여 안정하고, 금속적인 성질보다 분자적인 성질이 나타나며, 금속 원자의 개수, 즉 클러스터의 크기에 따라 특징적인 광학적, 전기적 및 촉매적 성질을 가진다.
금속 나노 클러스터 형성하는 방법에는 역 미셀(reversed micelle) 합성 방법, 극성 유기 용매에서 금속염의 환원을 이용하여 리간드로 안정화된 클러스터를 형성 방법 및 열적으로 불안정한 금속 유기 선구물질을 분해하여 비수용액에서 합성하는 방법 등이 있다.
한편, 발광(luminescence) 특성을 가진 나노 물질은 유기/무기 발광 디스플레이, 광전자 기기, 광학센서, 의료영상 및 진단 분야에서 응용될 가능성이 높아 큰 관심을 받고 있다. 이러한 나노 물질의 성공적인 응용을 위해서는 우수한 광안정성과 낮은 독성, 그리고 높은 광 발광(photoluminescence; PL) 효율이 필수적인 요인이다. 최근까지는 반도체 양자점이 이 분야의 연구에서 주요 초점이었으며 상당한 진전이 이루어졌으나, 반도체 양자점은 비교적 크기가 크고 독성이 있는 경우가 많아 응용 면에서 제약이 따른다.
최근 다수의 기술적 응용 분야에서 중금속 등으로 이루어진 염료를 대체할 크기가 작고 안정하며 독성이 낮아 인체에 무해한 발광성 금속 나노 클러스터를 이용한 연구가 많이 진행되고 있다. 그러나 현재까지의 금속 나노 클러스터는 양자점과 비교했을 경우 실용화되기에 아직 발광 양자수율(quantum yield; QY)이 낮아 응용 면에서 제약이 따른다.
J.Am.Chem.Soc., 2015, 137, 8244-8250
본 발명의 실시예는 발광 특성 및 안정성이 우수한 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 실시예는 특히, 체내안정성 및 생체적합성이 우수한 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 금(Au)을 포함하고, 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]
Au22(SG)18-R1x-R2y
상기 화학식 1에서, SG는 글루타싸이온(glutathione)이고, R1은 방향족 고리를 함유하며 상기 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이고, R2는 아미노 말단기 함유 화합물이며, x는 1 내지 18의 정수이고, y는 1 내지 18의 정수이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 아미노기 보호 화합물은, 벤질 클로로포르메이트, 4-메톡시벤질 클로로포르메이트, 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드, 트리틸 클로라이드, 트리틸 브로마이드, 무수 프탈산 및 토실기 함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 아미노 말단기 함유 화합물은, 1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민, 단실 아마이드, 엽산 및 아미노쿠마린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 1에서 Au22(SG)18는, 금 원자로 이루어진 코어(core)와, 상기 코어를 둘러싸며 금-글루타싸이온 복합체로 이루어진 쉘(shell)로 구성되는 코어-쉘 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 수용성일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 진단용 조성물은 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터를 포함한다.
상기 생체 진단용 조성물은, 암세포 표지 진단용, CT 조영제 또는 약물 전달 시스템(DDS)용 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터의 제조방법은, 금(Au)을 포함하고 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과, 방향족 고리를 함유하며 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물과, 아미노 말단기 함유 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.
[화학식 1]
Au22(SG)18-R1x-R2y
[화학식 2]
Au22(SG)18
[화학식 3]
Au22(SG)18-R1x
(상기 화학식 1 내지 3에서, SG는 글루타싸이온(glutathione)이고, R1은 방향족 고리를 함유하며 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이며, R2는 아미노 말단기 함유 화합물이고, x는 1 내지 18의 정수이며, y는 1 내지 18의 정수이다.)
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터의 제조방법에 있어서, 상기 아미노기 보호 화합물은, 벤질 클로로포르메이트, 4-메톡시벤질 클로로포르메이트, 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드, 트리틸 클로라이드, 트리틸 브로마이드, 무수 프탈산 및 토실기 함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터의 제조방법에 있어서, 상기 아미노 말단기 함유 화합물은, 1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민, 단실 아마이드, 엽산 및 아미노쿠마린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 발광 특성이 우수한 Au22(SG)18 나노 클러스터에 다양한 물질들(R1, R2)을 결합시켜줌으로써 Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터 구조의 단단함을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 결합된 물질(R2)에서의 에너지를 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터가 전이 받아(Energy transfer) 더 높은 발광 양자 수율을 가지는 Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터는 생체적합성이 우수한 글루타싸이온(SG) 리간드를 포함하고 있어, 상기 글루타싸이온 리간드에 다양한 세포 표지 물질을 결합하여 생체 진단에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터는 독성이 매우 낮아 다른 금속 양자점 또는 나노 파티클에 비하여 체내안정성 및 생체적합성이 뛰어나, 바이오이미징(bioimaging), 암세포 표지 진단, CT 조영제 또는 약물전달시스템(drug delivery system; DDS)과 같은 응용 분야에 사용될 수 있다.
도 1은 제조예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 반응 메커니즘을 나타낸 반응식을 도시한 것이다.
도 3 본 발명의 일 실시예에 따른 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 개략적인 분자 구조를 도시한 것이다.
도 4는 제조예 2의 Au22(SG)18-R1x(R1=CBz) 나노 클러스터의 핵자기공명(NMR) 분광분석 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 실시예 1의 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6은 520 nm에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 7은 350 nm와 520 nm의 다른 파장에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 8은 350 nm에서 여기시킨 (a) Au22(SG)18-R1x와 (b) Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py)의 디지털 사진을 도시한 것이다.
도 9는 520 nm에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 10은 350 nm와 520 nm의 다른 파장에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 11은 KB 세포와 MDA-MB-231 세포에 대한 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 독성 실험을 도시한 것이다.
도 12는 KB 세포에 대한 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 생체외(in vitro) 실험을 도시한 것이다.
이하에서 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐리는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 당업계의 관례에 따라 달라질 수 있으므로, 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
본 발명은 발광 특성 및 안정성이 우수한 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법을 개시한다. 본 발명은 특히, 체내안정성 및 생체적합성이 우수한 금 나노 클러스터 및 그의 제조방법을 개시한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]
Au22(SG)18-R1x-R2y
상기 화학식 1에서, SG는 글루타싸이온(glutathione)이고, R1은 방향족 고리를 함유하며 상기 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이고, R2는 아미노 말단기 함유 화합물이며, x는 1 내지 18의 정수이고, y는 1 내지 18의 정수이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 1~2㎚의 극소형의 크기(직경)를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 1에서 Au22(SG)18는, 금(Au) 원자로 이루어진 코어(core)와, 상기 코어를 둘러싸며 금-글루타싸이온 복합체(complex)로 이루어진 쉘(shell)로 구성되는 코어-쉘 구조를 가질 수 있다.
이하 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에서 Au22(SG)18의 구조 및 특성에 대하여 보다 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 제조예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터의 구조를 도시한 것이다. Au22(SG)18 나노 클러스터는 후술하는 제조예 1에 의해 합성될 수 있다.
도 1을 참조하면, Au22(SG)18 나노 클러스터는 금(Au) 원자 8개가 코어(핵)로 중심에 있고, 상기 코어의 주위에는 [SG-Au-SG-Au-SG-Au-SG]와 같이 반복적으로 복합체를 이루는 긴 사슬(chain) 2개와 [SG-Au-SG-Au-SG-Au-SG-Au-SG]와 같이 반복적으로 복합체를 이루는 긴 사슬 2개가 서로 고리 형태를 이루어 상기 코어를 감싸는(쉘) 구조로 클러스터를 형성하고 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, Au22(SG)18 나노 클러스터는 금 원자 다수개가 코어를 이루고, 상기 코어를 중심으로 금-글루타싸이온이 반복적으로 이루어진 금-글루타싸이온 복합체가 둘러싸인 코어-쉘 구조를 가지며, 다른 나노 클러스터들에 비하여 긴 금-글루타싸이온 복합체 사슬을 가져, 발광(형광) 특성을 나타내게 된다. 이러한 긴 복합체 사슬로 인해 사슬 주변 환경을 조절하여 구조를 단단하게 함으로써 다양한 형광 증가 현상을 관찰할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 수용성(water solubility)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 리간드(ligand)로서 물에 녹는 성질, 즉 수용성을 가진 글루타싸이온(SG)을 포함하고 있어, 금 나노 클러스터 자체가 수용성을 가질 수 있다.
참고로, 금 나노 클러스터에 포함되는 리간드가 수용성인 글루타싸이온이 아닌 지용성(유기 용매에 녹는 성질)인 헥산싸이올로 이루어질 경우, 금 나노 클러스터 자체는 지용성을 가질 것이다. 즉, 금 나노 클러스터에 있어서 리간드를 다양하게 변화시켜 클러스터 자체의 성질을 쉽게 조절할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 글루타싸이온(SG) 리간드는 하기 화학식 4에 표시되는 바와 같이 말단기에 2개의 카르복시기(-COOH)와 1개의 아미노기(-NH2)를 가져, 상기 카르복시기와 아미노기를 이용하여 다양한 물질들과 결합이 가능하다.
[화학식 4]
Figure pat00001
구체적으로, EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide) 커플링 반응을 통하여, 글루타싸이온의 카르복시기에 아미노기를 가지는 물질을 결합시킬 수 있고, 글루타싸이온의 아미노기에 카르복시기를 가지는 물질을 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 글루타싸이온(SG) 리간드는 전술한 바와 같이 쉘을 이루는 금-글루타싸이온 복합체에 포함되어 금 코어를 둘러싸도록 형성되어 있어 금(Au)의 구조를 안정적으로 잡아줄 수 있다. 또한, EDC/NHS 커플링 반응을 이용하여 금 나노 클러스터의 금-글루타싸이온 복합체의 단단함(rigidity)을 높여 줄 수 있는 다양한 물질을 결합시켜 줌으로써 금 나노 클러스터의 발광 수율을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터는 독성이 매우 낮아, 다른 금속 양자점 또는 나노 파티클에 비하여 체내안정성 및 생체적합성이 뛰어나 바이오이미징(bioimaging), 암세포 표지 진단용, CT 조영제 또는 약물전달시스템(drug delivery system; DDS)과 같은 응용 분야에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 금 나노 클러스터의 글루타싸이온 리간드에 다양한 물질을 결합시킴으로써 금 코어를 둘러싸고 있는 금-글루타싸이온 복합체의 구조에 영향을 주어 발광 세기(발광 수율)를 증가시킬 수 있다. 상기 다양한 물질은 상기 화학식 1의 R1 및 R2를 의미하고, 이하에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 1에서 R1은 방향족 고리를 함유하며, 상기 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물(이하, '아미노기 보호 화합물'이라 함)이다.
구체적으로, 아미노기 보호 화합물(R1)은 글루타싸이온(SG)의 아미노기(-NH2)를 보호하는 작용을 한다. 보다 구체적으로, R1은 상기 화학식 1에서 글루타싸이온(SG)에 함유된 아미노기(-NH2)의 수소 원자 하나를 치환함으로써 Au22(SG)18 나노 클러스터에 결합되어 글루타싸이온(SG)의 아미노기(-NH2)를 보호하게 된다. 이 과정에서 금 코어를 둘러싸고 있던 금-글루타싸이온 복합체 구조가 단단(rigid)해져 발광 효율이 상기 R1을 포함하지 않을 경우보다 약 3.2배 증가하게 된다(도 6, 도 10 참조).
또한, 아미노기 보호 화합물(R1)은 방향족 고리를 함유하고 있어, 파이-파이 스태킹(π-π stacking) 현상으로 인하여 방향족 고리 간의 상호작용(interaction)이 발생하고 이로 인하여 금-글루타싸이온 복합체 구조가 더욱 단단해진다.
아미노기 보호 화합물(R1)은 예를 들어, 벤질 클로로포르메이트(Benzyl chloroformate), 4-메톡시벤질 클로로포르메이트(4-Methoxybenzyl chloroformate), 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride; Fmoc chloride), 트리틸 클로라이드(Trityl chloride), 트리틸 브로마이드(Trityl bromide), 무수 프탈산(Phthalic anhydride) 또는 토실기(Tosyl group) 함유 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, R1은 하기 화학식 5-1 내지 화학식 11-1로 표시되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노기 보호 화합물일 수 있다.
[화학식 5-1]
Figure pat00002
[화학식 6-1]
Figure pat00003
[화학식 7-1]
Figure pat00004
[화학식 8-1]
Figure pat00005
[화학식 9-1]
Figure pat00006
[화학식 10-1]
Figure pat00007
[화학식 11-1]
Figure pat00008
보다 구체적으로, 상기 화학식 5-1 내지 화학식 11-1로 표시되는 화합물은 각각 벤질 클로로포르메이트(화학식 5-1), 4-메톡시벤질 클로로포르메이트(화학식 6-1), 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드(화학식 7-1), 트리틸 클로라이드(화학식 8-1), 트리틸 브로마이드(화학식 9-1), 무수 프탈산(화학식 10-1) 및 토실기를 함유한 4-톨루엔설퍼닐 클로라이드(화학식 11-1)을 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 5-1 내지 화학식 11-1로 표시되는 화합물은 Au22(SG)18 나노 클러스터 중 글루타싸이온(SG)의 아미노기(-NH2)와 결합될 경우, 하기 화학식 5-2 내지 화학식 11-2로 표시되는 기로 결합될 수 있다.
[화학식 5-2]
Figure pat00009
[화학식 6-2]
Figure pat00010
[화학식 7-2]
Figure pat00011
[화학식 8-2]
Figure pat00012
[화학식 9-2]
Figure pat00013
[화학식 10-2]
Figure pat00014
[화학식 11-2]
Figure pat00015
구체적으로, 아미노기 보호 화합물(R1)은 상기 화학식 5-1 내지 화학식 11-1로 표시되는 화합물에서 수소 원자(H), 염소 원자(Cl) 또는 브롬 원자(Br)가 제거되어 결합 후 상기 화학식 5-2 내지 화학식 11-2로 표시되는 기를 가지게 되며, 결합시 글루타싸이온(SG)의 아미노기(-NH2)에서의 수소 원자(H)와 반응하면서 Au22(SG)18 나노 클러스터와 결합하게 된다.
아미노기 보호 화합물(R1)은 다른 결합처리 없이, Au22(SG)18 나노 클러스터와 단순 교반시킴으로써 Au22(SG)18 나노 클러스터에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 1에서 R2는 아미노 말단기 함유 화합물이다. 구체적으로, 아미노 말단기 함유 화합물(R2)은 아미노 말단기를 갖는 화합물을 의미한다.
아미노 말단기 함유 화합물(R2)은 글루타싸이온(SG)의 카르복시기(-COOH)에서의 -OH(산소 및 수소)를 치환하여 결합된다.
아미노 말단기 함유 화합물(R2)은, 말단기로서 아미노기(-NH2)를 갖는 화합물이면 제한 없이 사용 가능하나, 예를 들어, 1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민 또는 단실 아마이드와 같은 염료(dye)이거나, 예를 들어, 엽산 또는 아미노쿠마린과 같은 세포 표지 물질일 수 있다.
아미노 말단기 함유 화합물(R2)은 1-아미노피렌(1-Aminopyrene), 1-(1-피렌일)메탄아민(1-(1-Pyrenyl)methanamine), 단실 아마이드(Dansyl amide), 엽산(Folic acid) 또는 아미노쿠마린(Aminocoumarin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, R2는 하기 화학식 12 내지 화학식 16로 표시되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노 말단기 함유 화합물일 수 있다.
[화학식 12]
Figure pat00016
[화학식 13]
Figure pat00017
[화학식 14]
Figure pat00018
[화학식 15]
Figure pat00019
[화학식 16]
Figure pat00020
보다 구체적으로, 상기 화학식 12 내지 화학식 16으로 표시되는 화합물은 각각 1-아미노피렌(화학식 12), 1-(1-피렌일)메탄아민(화학식 13), 단실 아마이드(화학식 14), 엽산(화학식 15) 또는 아미노쿠마린(화학식 16)을 나타낸다.
상기 화학식 12 내지 화학식 16에 표시된 바와 같이, 1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민, 단실 아마이드, 엽산 및 아미노쿠마린은 모두 말단기로서 아미노기를 포함하고 있는 것을 알 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 12 내지 화학식 16으로 표시되는 화합물은 Au22(SG)18 나노 클러스터 중 글루타싸이온(SG)의 카르복시기(-COOH)와 결합될 경우, 각각 화학식 내에 함유하고 있던 아미노기(-NH2)에서의 수소 원자(H)를 방출하며 결합될 수 있다.
일례로, 상기 화학식 12로 표시되는 1-아미노피렌은 아미노 말단기의 수소 원자(H) 한 개가 제거될 경우 하기 화학식 17의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 17]
Figure pat00021
이하에서는, 상기 화학식 1에서 R1이 벤질 클로로포르메이트(화학식 5-1)이고, R2가 1-아미노피렌(화학식 12)일 경우를 예를 들어 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터를 보다 상세하게 설명하기로 한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 반응 메커니즘을 나타낸 반응식을 도시한 것이다.
구체적으로, 일 실시예에 따라, 상기 화학식 1에서 R1이 벤질 클로로포르메이트고, R2가 1-아미노피렌일 경우, 도 2에 도시된 반응식과 같은 반응 메커니즘을 나타낸다.
도 2에서, (a)로 표시되는 Au22(SG)18 나노 클러스터는 편의상 1개의 카르복시기(-COOH)와 1개의 아미노기(-NH2)를 포함하는 Au로 표시된 노란 원으로 표현하였다.
도 2를 참조하면, (a)로 표시되는 Au22(SG)18 나노 클러스터와 벤질 클로로포르메이트가 반응하여 (b)로 표시되는 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터가 합성될 수 있고, 이후 합성된 (b) Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터와 1-아미노피렌이 반응하여 (c)로 표시되는 Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터가 합성될 수 있다.
도 3 본 발명의 일 실시예에 따른 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 개략적인 분자 구조를 도시한 것이다.
도 3을 참조하면, 도 2의 (a)로 표시되는 Au22(SG)18 나노 클러스터에 R1과, R2로서 각각 상기 화학식 5-2로 표시되는 작용기(이하, 화학식 1에서 'CBz'이라 함)와, 상기 화학식 17로 표시되는 작용기(이하, 화학식 1에서 'Py'이라 함)가 결합되어 도 2의 (c)로 표시되는 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py, x=8, y=8) 나노 클러스터의 개략적인 분자 구조식을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, 상기 화학식 1에서 x는 1 내지 18의 정수이고, y는 1 내지 18의 정수이다. 구체적으로, R1은 본 발명의 실시예에 따른 금 나노 클러스터 내에 1 내지 18개로 포함될 수 있고, R2는 1 내지 18개로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터에 있어서, Au22(SG)18 나노 클러스터가 18개의 글루타싸이온 리간드(SG)로 이루어져 있어, R1의 경우 1 내지 18개의 범위로 Au22(SG)18 나노 클러스터에 결합될 수 있다.
R2는 글루타싸이온 리간드 1개 당 카르복시기가 2개이므로, Au22(SG)18 나노 클러스터에 총 36개의 R2가 결합될 수 있으나, 바람직하게는 1 내지 18개의 범위로 Au22(SG)18 나노 클러스터에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 발광 특성이 우수한 Au22(SG)18 나노 클러스터에 다양한 물질들(R1, R2)을 결합시켜줌으로써 Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터 구조의 단단함을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 결합된 물질(R2)에서의 에너지를 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터가 전이 받아(Energy transfer) 더 높은 발광 양자 수율을 가지는 Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 진단용 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 금 나노 클러스터를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터는 생체적합성이 우수한 글루타싸이온(SG) 리간드를 포함하고 있어, 상기 글루타싸이온 리간드에 다양한 세포 표지 물질(R1, R2)을 결합하여 암세포 표지 진단, CT 조영제 또는 약물 전달 시스템(DDS)과 같은 생체 진단에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터는 독성이 매우 낮아, 다른 금속 양자점 또는 나노 파티클에 비하여 체내안정성 및 생체적합성이 뛰어나 바이오이미징(bioimaging)과 같은 응용 분야에 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 높은 발광 수율, 낮은 독성 및 나노 클러스터 자체의 안정성으로 인하여, 바이오 이미징 및 CT 조영제로 사용이 되는 고가의 염료를 대체하는 물질로 진단 분야에서의 사용이 가능하고, 다양한 작용기로 인하여 필요에 따른 약물을 결합시켜 체내에 주입함으로써 암세포 표시 진단 및 약물 전달 시스템(DDS)과 같은 치료 분야에서도 사용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터의 제조방법은 금(Au)을 포함하고 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과, 방향족 고리를 함유하며 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물과, 아미노 말단기 함유 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.
[화학식 1]
Au22(SG)18-R1x-R2y
[화학식 2]
Au22(SG)18
[화학식 3]
Au22(SG)18-R1x
(상기 화학식 1 내지 3에서, SG는 글루타싸이온(glutathione)이고, R1은 방향족 고리를 함유하며 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이며, R2는 아미노 말단기 함유 화합물이고, x는 1 내지 18의 정수이며, y는 1 내지 18의 정수이다.)
본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 클러스터의 제조방법에 있어서, 상기 아미노기 보호 화합물은, 벤질 클로로포르메이트, 4-메톡시벤질 클로로포르메이트, 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드, 트리틸 클로라이드, 트리틸 브로마이드, 무수 프탈산 또는 토실기 함유 화합물일 수 있다.
또한, 상기 아미노 말단기 함유 화합물은, 1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민, 단실 아마이드, 엽산 또는 아미노쿠마린일 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한, 이하에서 제시되는 실험 결과는 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
이하 실시예 및 시험예에서 사용된 재료 및 기구는 다음과 같다.
[재료 및 기구 ]
4염화금산 3수화물(HAuCl4·3H2O, ACS시약 등급), 글루타싸이온(GSH, ≥98%), 수소화붕소나트륨(NaBH4, 99%), 테트라옥틸암모늄 브로마이드(TOABr, 98%), 1-아미노피렌(98%), 인산이수소칼륨(≥ 99%), 인산수소칼륨(≥ 98%), 벤질 클로로포르메이트(Benzyl chloroformate; CBzCl)(= 98%), N-수소화석신이미드(98%), N-EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride; EDC, ≥ 98%), 트리즈마베이스(≥ 99%), 글리신(전기영동, ≥ 99%), 아크릴아미드(바이오등급, 40%). 로다민 B는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 수산화나트륨(NaOH, 98%), 염산(HCl, 35~37%), 이소 프로필알코올(IPA, 99%), 테트라하이드로퓨란(THF, ≥ 99.9%), PBS 완충 용액 (phosphate buffered saline, ≥ 99%, pH 7.2). 그리고 ACS 등급 톨루엔, 아세토니트릴, 에탄올 및 메탄올은 Burdick and Jackson에서 구입하였다. 물은 Millipore Milli-Q 시스템(18.2 MΩcm)으로 정제하여 사용하였다. 모든 화학물질은 더 이상의 정제 없이 구입한 그대로 사용하였다.
제조예 1
[ Au 22 (SG) 18 나노 클러스터의 합성]
12.50 mL의 물에 용해된 0.25 mmol의 HAuCl43H2O와 7.50 mL의 물에 용해된 0.37 mmol의 GSH를 230 mL의 물에 교반시키면서 차례대로 넣고, 2분 동안 격렬하게 교반시킨 후, 용액의 색상이 탁한 노란색으로 변하면 1 M의 NaOH를 넣어 주어 pH를 12로 높여준다. 상기 용액에 3.5 mM 농도의 NaBH4 0.15 mL를 용액에 한 방울씩 천천히 넣어 준 후 30분 동안 교반시켰다. 이후, 1 M의 HCl을 이용하여 용액의 pH를 2.5로 낮추고, 상온에서 6시간 동안 더 교반시켰다.
반응이 완결되면 회전 증발시켜 용매를 완전히 제거하고, 10 mL의 물에 녹여 팔콘 튜브에 옮긴다. 12 mL의 IPA를 넣어 생성되는 고체를 원심분리기를 이용하여 침전시키는 재결정과정 통해 Au22(SG)18 나노 클러스터를 분리해내었다. 가라앉지 않는 용액에 추가로 2mL의 IPA를 넣어 생성되는 고체를 원심분리기를 이용하여 분리하였고, 이 과정은 가라앉지 않는 용액이 투명해질 때까지 진행 되었다.
처음에 분리되는 고체에서 Au22(SG)18의 수득률이 높다. 이렇게 분리된 고체를 과량의 IPA와 메탄올로 씻어내어 반응하지 않고 남아 있는 불순물을 제거하여 Au22(SG)18 나노 클러스터를 얻었다.
제조예 2
[ Au 22 (SG) 18 - R1 x (R1= CBz ) 나노 클러스터의 제조]
아미노기 보호 화합물(R1=CBz)에 의해 글루타싸이온 리간드의 아민기가 보호된 Au22(SG)18(Au22(SG)18-R1x)를 다음과 같이 제조하였다.
제조예 1에서 제조된 10 mg의 Au22(SG)18를 20 mL의 바이알에 담긴 1 mL의 증류수에 녹인 후, 1 mg의 NaHCO3을 첨가하였다. 이후, 20 μL의 CBz(CBz/Au22=180; SG 1개 당 CBz 10배의 조성비를 의미함)를 1 mL의 THF에 녹인 용액을 첨가하여 3시간 동안 격렬하게 교반시켰고, 반응하지 않은 CBz는 3kDa의 탈이온 컬럼(desalting column)을 통해 제거하여 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터를 얻었다.
도 4는 제조예 2의 Au22(SG)18-R1x(R1=CBz) 나노 클러스터의 핵자기공명(NMR) 분광분석 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4를 참조하면, Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터에 있어서, R1인 상기 화학식 5-2로 표시되는 벤질 클로로포르메이트 잔기는 18개의 글루타싸이온 리간드 중 11개(x=11)의 글루타싸이온 리간드와 결합되었음을 확인할 수 있다. 결합된 11개의 R1은 금-글루타싸이온 리간드 복합체의 단단함을 증가시켜, 클러스터의 진동 또는 회전 운동을 방해하여 비복사 완화(nonradiative relaxation)를 감소시키게 된다.
실시예 1
[ Au 22 (SG) 18 - R1 x - R2 y (R1= CBz , R2= Py ) 나노 클러스터의 제조]
아미노피렌(R2=Py)과 결합한 Au22(SG)18-R1x(이하, Au22(SG)18-R1x-Pyy이라 함)를 다음과 같이 제조하였다.
우선, 제조예 2에서 제조된 10 mg의 Au22(SG)18-R1x를 2 mL의 PBS 완충용액(pH 6.8)에 녹인 후, 43 mg의 EDC(EDC/Au22=36)와 32 mg의 (NHS/EDC=36)를 첨가하여 300 rpm 에서 20분 동안 교반시켰다. 이후, 38 mg의 1-아미노피렌(Py/Au22=36)을 2mL의 아세톤에 녹여 첨가하였다. 200 rpm에서 16시간 동안 교반시킨 후, Au22(SG)18-R1x-Pyy을 반응하지 않은 1-아미노피렌(Py)과 분리하기 위하여 아세톤을 회전 증발시켰다. 반응하지 않은 Py은 물에 녹지 않기 때문에 아세톤이 증발하면서 재결정이 일어나게 되어, 쉽게 0.2 um 공극 크기의 시린지 필터로 제거가 가능하다.
또한, 회전 증발로 다시 한 번 확실하게 용매를 완벽하게 증발시킨 후 과량의 THF 용매를 이용하여 반응하지 않은 Py을 추출해내었다. Au22(SG)18-R1x는 유기용매에 녹지 않기 때문에 Py만 추출되어 나오므로, UV 램프로 확인하여 THF 용매에서 Py의 푸른빛이 나오지 않을 때까지 이 과정을 반복하였다.
마지막으로, 전기영동을 통하여 반응하지 않은 Au22(SG)18-R1x와 Au22(SG)18-R1x-Pyy를 분리하고 추출하였다.
도 5는 실시예 1의 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다.
여기서, Au22(SG)18 나노 클러스터, Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터 및 Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터의 흡수 스펙트럼을 각각 검정색, 빨간색 및 파란색 그래프로 도시하였고, 각각 및 Au22 , Au22-CBz 및 Au22-Py로 표기하였다.
도 5를 참조하면, Au22(SG)18 나노 클러스터 및 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터에 비하여 Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터가 흡수가 증가하는 경향이 큰 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 5에서 큰 그래프에 삽입된 작은 그래프에는 1-아미노피렌(Pyrene으로 표시)의 흡수 스펙트럼을 연두색 그래프로 나타내었고, Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터의 흡수에서 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터의 흡수를 뺀 값을 파란색 그래프로 나타내었다([Au22-Py]-[Au22-CBz]으로 표시). 연두색 그래프(Pyrene)와 파란색 그래프([Au22-Py]-[Au22-CBz])의 경향을 통하여 1-아미노피렌이 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터와 잘 결합되어 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2
[ Au 22 (SG) 18 - R1 x - R2 y (R1= CBz , R2= FA) 나노 클러스터의 제조]
엽산(Folic acid, FA)(R2=FA)과 결합한 Au22(SG)18-R1x(이하, Au22(SG)18-R1x- FAy이라 함)를 다음과 같이 제조하였다.
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1-아미노피렌(Py)대신 엽산(FA)을 사용하여 Au22(SG)18-R1x-FAy를 제조하였다.
비교예 1
제조예 1에서 제조된 Au22(SG)18 나노 클러스터를 비교예 1로 하였다.
비교예 2
제조예 2에서 제조된 Au22(SG)18-R1x(R1=CBz) 나노 클러스터를 비교예 2로 하였다.
비교예 3
10 mL의 물에 제조예 1에서 제조된 10 mg의 Au22(SG)18를 녹이고, 1 mL의 톨루엔에 10 mg의 TOABr을 용해시킨 용액을 더해준 후, 1 M의 NaOH를 이용하여 pH를 9로 높여주고 전체 용액을 교반한 후, 상온에 보관하여 물 층과 톨루엔 층으로 분리하였다. 물에 녹아 있던 Au22(SG)18은 TOA와 강하게 이온 결합하여 모두 톨루엔 층으로 상 이동을 하였다.
이후, 톨루엔 층을 바이알에 분리하고 깨끗한 물 15 mL를 첨가하여 반응하지 않은 과량의 TOABr와 다른 불순물들을 제거하여 Au22(SG)18-TOA 나노 클러스터를 제조하였다.
기존에 알려진 바에 의하면, Au22(SG)18 나노 클러스터는 다른 나노 클러스터들과는 다르게 코어 주변의 금-리간드 복합체의 길이가 길어 주변 환경의 영향을 많이 받는다고 한다.
예를 들어, 테트라옥틸암모늄 양이온(TOA+)와 같은 벌키(bulky)한 물질을 글루타싸이온의 카르복시기 말단에 이온 페어링(ion-pairing)하면 금-글루타싸이온 복합체의 구조의 단단함 정도가 증가하여 분자 자체의 진동, 회전 등이 줄어듦에 따라 비복사 완화가 감소하여 발광 세기가 증가하게 된다(선행기술문헌 참조).
시험예 1
[ Au 22 (SG) 18 - R1 x - R2 y (R1= CBz , R2= Py ) 나노 클러스터의 발광 특성 분석]
이하에서는 실시예 1에 의해 제조된 Au22(SG)18-R1x-R2y(R2=Py) 나노 클러스터의 발광 특성을 도 6 내지 도 8를 참조하여 설명하기로 한다.
도 6은 520 nm에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6을 참조하면, 비교예 2의 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터는 비교예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터 보다 발광 세기가 약 3.2배 증가하는 것을 확인할 수 있고, 실시예 1의 Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터는 비교예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터 보다 발광 세기가 약 5.3배 증가하는 것을 확인할 수 있다.
여기서, Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터의 발광 세기가 증가하게 되는 이유는 1-아미노피렌 잔기(Py)가 파이-파이 결합(π-π stacking)에 용이한 구조를 가져 금-글루타싸이온 복합체 구조의 단담함을 증가시키는 것으로 이해된다.
또한, 비교예 2의 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터 보다 라이프타임(lifetime)이 증가하는 것을 알 수 있다. 이때, 라이프타임의 측정은 분광 형광계(spectrofluorimeter)를 이용하여 503 nm에서 다이오드레이저로 여기시켜 측정하였다.
도 7은 350 nm와 520 nm의 다른 파장에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=Py) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
구체적으로, 350 nm에서 Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터를 여기시켜 나타나는 발광 세기와, 도 6에 도시된 520 nm에서 Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터를 여기시켜 나타나는 발광 세기를 비교할 수 있다.
도 7을 참조하면, 350 nm 파장에서, Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터에 포함된 염료인 Py에서 여기된 에너지가 Au22(SG)18 나노 클러스터로 에너지 전이가 되어, 제조예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터에 비하여 발광 세기가 약 8배 증가하였다.
구체적으로, 실시예 1과 같이 1-아미노피렌을 이용하여 Au22(SG)18-R1x와 결합하였을 때(Au22(SG)18-R1x-Pyy), Au22(SG)18 나노 클러스터만 여기되는 520 nm의 파장에서 여기하는 경우, 발광 세기가 Au22(SG)18 나노 클러스터 보다 약 5배 증가하였다.
그러나 피렌이 여기되는 350 nm에서 여기하는 경우, Au22(SG)18 나노 클러스터 자체의 흡광 증가에 의한 발광 세기의 증가도 있지만, 여기된 피렌의 에너지가 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터로 전이가 됨에 따라 피렌의 발광은 급격하게 감소하고, Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터는 520 nm 파장에서 여기하여 얻은 결과보다 약 1.8배 증가하였다. 520nm에서의 증가는 구조 단단함 증가에 의한 정도로 볼 수 있고, 350nm에서 여 한 증가 정도는 에너지 전이에 의한 것으로 볼 수 있다.
도 7에서 비교한 글루타싸이온-피렌(SG-Py)의 발광은, 도 5의 흡광 스펙트럼에서 350 nm에서의 Au22(SG)18-R1x-Pyy과 Au22(SG)18-R1x의 흡광 차이를 계산하여, 그만큼 글루타싸이온(SG)에 결합한 피렌(Py) 발광을 측정하여 비교한 것이다.
도 8은 350 nm에서 여기시킨 (a) Au22(SG)18-R1x와 (b) Au22(SG)18-R1x-R2y(R2=Py)의 디지털 사진을 도시한 것이다.
도 8을 참조하면, 350 nm의 UV 램프 아래에서 (a) Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터 보다 (b) Au22(SG)18-R1x-Pyy 나노 클러스터가 육안상으로 더 밝은 것을 확인할 수 있다.
시험예 2
[ Au 22 (SG) 18 - R1 x - R2 y (R1= CBz , R2= FA) 나노 클러스터의 발광 특성 분석]
이하에서는 실시예 2에 의해 제조된 Au22(SG)18-R1x-R2y(R2=FA) 나노 클러스터의 발광 특성을 도 9 및 도 10을 참조하여 설명하기로 한다.
도 9는 520 nm에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 9를 참조하면, 도 6에서 설명한 바와 같이, 비교예 2의 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터는 520 nm에서 여기시키는 경우, 비교예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터 보다 발광 세기가 약 3.2배 증가하는 것을 확인할 수 있고, 실시예 2의 Au22(SG)18-R1x-FAy 나노 클러스터는 비교예 1의 Au22(SG)18 나노 클러스터 보다 발광 세기가 약 5.7배 증가하며 최대 6배까지 증가하는 것을 확인할 수 있다.
구체적으로, 엽산(FA)은 다른 염료들과 비교하여 물에 잘 녹기 때문에 엽산과 결합한 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터(Au22(SG)18-R1x-FAy)는 생체 적합성이 뛰어나다. Au22(SG)18-R1x-FAy 나노 클러스터는 시험예 1에서와 같이, 화학식 1로 표시되는 작용기인 R1과 엽산(R2=FA)에 의해 금-글루타싸이온 복합체 구조가 단단해짐에 따라 발광 세기의 증가가 일어났다.
한편, 엽산은 현재 바이오 마커 시장에서 가장 많이 이용되고 있는 암세포 표지 물질 중 하나이다. 암세포에는 엽산 수용체(Folate Receptor)가 다른 건강한 세포들 보다 많기 때문에 생체 내에 주입하기 위해서 특정 염료에 엽산을 결합시킨 후 주입하여 확인하는 방법을 이용하고 있다.
하지만 특정 농도 이상에서는 독성을 가져 다른 건강한 세포에 영향을 주고 몸 안에 축적이 되며, 발광 세기가 적어 확인이 힘든 단점으로 인하여 이용이 제한되고 있었다.
그러나 본 발명의 실시예에 따르면, 독성이 없는 Au22(SG)18-R1x 나노 클러스터에 엽산(FA)과 같은 암세포 표지 물질을 결합시킴으로써 보다 밝고 안정하며 선택성이 좋은 암세포 표지 물질을 제공할 수 있다.
도 10은 350 nm와 520 nm의 다른 파장에서 여기시킨 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
구체적으로, 350 nm에서 Au22(SG)18-R1x-FAy 나노 클러스터를 여기시켜 나타나는 발광 세기와, 도 9에 도시된 520 nm에서 Au22(SG)18-R1x-FAy 나노 클러스터를 여기시켜 나타나는 발광 세기를 비교할 수 있다.
도 10을 참조하면, 350 nm에서 여기시키는 경우, 양자 수율이 높은 피랜(Py) 보다는 적지만 발광 세기가 증가하는 현상을 확인할 수 있었다. 엽산(FA)에서 보여준 에너지 전이의 결과는 염료가 아니더라도 EDC/NHS반응을 통하여 결합이 된 구조의 금 나노 클러스터에서 일어날 수 있는 현상임을 한 번 더 확인하였다.
또한, Au22(SG)18-R1x-FAy 나노 클러스터에 대하여 520 nm에서 보다 350 nm에서 여기하는 경우, 발광 세기가 약 1.8배 증가하는 것을 확인할 수 있고, 520 nm에서 여기된 Au22(SG)18 나노 클러스터 보다는 발광 세기가 약 7배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3
[ Au 22 (SG) 18 - R1 x - R2 y (R1= CBz , R2=FA) 나노 클러스터의 독성 분석]
이하에서는 실시예 2에 의해 제조된 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 독성을 도 11 및 도 12를 참조하여 설명하기로 한다.
도 11은 KB 세포(KB cells, 암세포)와 MDA-MB-231 세포에 대한 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 독성 실험을 도시한 것이다.
구체적으로, 도 11은 세포 내에서의 독성 실험에 관한 것으로, Au22 나노 클러스터(Au cluster로 표시) 및 엽산(FA)과 결합된 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA)(FA-Au cluster로 표시)를 각각 KB 세포 및 MDA-MB-231 세포와 함께 배양하였다. 배양은 약 24시간 동안 인큐베이터에서 이루어졌다.
이때, Au22(SG)18 또는 Au22(SG)18-R1x-R2y 나노 클러스터의 농도를 최대 104 ㎍/mL까지 늘려서 금(Au)의 농도가 높아질수록 독성이 생기는지에 대한 실험을 세포의 생존 정도(%)로 확인하였다.
도 11을 참조하면, Au22(SG)18-R1x-FAy 나노 클러스터의 경우, KB 세포 안에서 안정하게 존재하고, 진한 농도에서도 세포가 생존해 있음을 확인할 수 있다.
도 12는 KB 세포에 대한 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터의 생체외(in vitro) 실험을 도시한 것이다.
구체적으로, 도 12에서 (a)는 암세포(KB cells)에 아무것도 첨가하지 않은 상태이고, (b)는 암세포(KB cells)에 Au22(SG)18를 주입한 상태이며, (c) 암세포(KB cells)에 Au22(SG)18-R1x-R2y(R1=CBz, R2=FA) 나노 클러스터를 주입한 상태에서 약 4시간 동안 배양한 후 각각에 대한 발광(형광)을 확인한 생체외(in vitro) 실험이다.
도 12를 참조하면, (b)의 경우, Au22 나노 클러스터의 생존력을 확인할 수 있고, (c)와 같이 FA가 있는 Au22(SG)18 나노 클러스터(Au22(SG)18-CBzx-FAy)의 경우, (b) Au22(SG)18 보다 더 생존력이 높고 형광이 크며, 암세포 내에서 발광하는 것으로 보아, 선택적인 암세포 표지가 가능함을 확인할 수 있다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (10)

  1. 금(Au)을 포함하고, 하기 화학식 1로 표시되는 금 나노 클러스터.
    [화학식 1]
    Au22(SG)18-R1x-R2y
    상기 화학식 1에서,
    SG는 글루타싸이온(glutathione)이고,
    R1은 방향족 고리를 함유하며 상기 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이고,
    R2는 아미노 말단기 함유 화합물이며,
    x는 1 내지 18의 정수이고,
    y는 1 내지 18의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노기 보호 화합물은,
    벤질 클로로포르메이트, 4-메톡시벤질 클로로포르메이트, 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드, 트리틸 클로라이드, 트리틸 브로마이드, 무수 프탈산 및 토실기 함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 금 나노 클러스터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아미노 말단기 함유 화합물은,
    1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민, 단실 아마이드, 엽산 및 아미노쿠마린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 금 나노 클러스터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1에서 Au22(SG)18는,
    금 원자로 이루어진 코어(core)와,
    상기 코어를 둘러싸며 금-글루타싸이온 복합체로 이루어진 쉘(shell)로 구성되는 코어-쉘 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 금 나노 클러스터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노 클러스터는 수용성인 것을 특징으로 하는 금 나노 클러스터.
  6. 제1항에 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 금 나노 클러스터를 포함하는 생체 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 생체 진단용 조성물은,
    암세포 표지 진단용, CT 조영제 또는 약물 전달 시스템(DDS)용 조성물인 것을 특징으로 하는 생체 진단용 조성물.
  8. 금(Au)을 포함하고 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과, 방향족 고리를 함유하며 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
    상기 화학식 3으로 표시되는 화합물과, 아미노 말단기 함유 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계
    를 포함하는 금 나노 클러스터의 제조방법.
    [화학식 1]
    Au22(SG)18-R1x-R2y
    [화학식 2]
    Au22(SG)18
    [화학식 3]
    Au22(SG)18-R1x
    (상기 화학식 1 내지 3에서, SG는 글루타싸이온(glutathione)이고, R1은 방향족 고리를 함유하며 글루타싸이온의 아미노기를 보호하는 아미노기 보호 화합물이며, R2는 아미노 말단기 함유 화합물이고, x는 1 내지 18의 정수이며, y는 1 내지 18의 정수이다.)
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아미노기 보호 화합물은,
    벤질 클로로포르메이트, 4-메톡시벤질 클로로포르메이트, 플루오렌일메틸옥시카르보닐 클로라이드, 트리틸 클로라이드, 트리틸 브로마이드, 무수 프탈산 및 토실기 함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 금 나노 클러스터의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 아미노 말단기 함유 화합물은,
    1-아미노피렌, 1-(1-피렌일)메탄아민, 단실 아마이드, 엽산 및 아미노쿠마린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 금 나노 클러스터의 제조방법.
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