KR20170114261A - 혈중 순환 종양세포의 다중 바이오마커 및 이의 항체를 이용한 난소암 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난소암 진단용 다중 바이오마커에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는, 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 난소암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양 한 후, EpCAM과 HE 4로 선택되는 2개의 다중 바이오마커에 대한 항체를 복합적으로 사용함으로써, 난소암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 난소암을 진단하는 이점이 있다.

Description

혈중 순환 종양세포의 다중 바이오마커 및 이의 항체를 이용한 난소암 진단방법 {Multiple biomarkers of the circulating tumor cells and diagnosis method of the ovarian cancer using the antibody of the same}

본 발명은 혈중 순환 종양세포(CTC; circulating tumor cell)의 다중 바이오마커(biomarker) 및 이의 항체를 이용한 난소암 진단방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는, 희소 세포 분리장치를 활용하여 난소암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)과 HE 4(human epididymis protein 4)로 선택되는 2개의 다중 바이오마커에 대한 항체를 복합적으로 사용함으로써, 난소암을 진단하는 임상 진단법에 관한 것이다.

난소암은 여성 암 발생에 있어서 발병빈도가 4번째를 차지하며 산부인과 악성 종양 중에서도 높은 사망 원인에 속한다. 난소암은 발생빈도가 낮지만, 골반 깊숙한 곳에 위치하기 때문에 난소암이 크고 넓게 퍼지기 전까지 전혀 증상을 야기하지 않기 때문에 대부분 진행 단계에서 발견되며, 적극적인 외과수술과 화학요법 치료에도 불구하고 5년 생존율이 30% 미만에 불과한 매우 심각한 질병 중 하나이다. 난소암의 치료율을 높이기 위해서는 조기에 발견하는 것이 무엇보다 중요하다. 난소암이 2기 이내에 진단될 경우 5년 생존율은 85% 수준인 반면, 3기 진단 시 5년 생존율은 50% 이하로 떨어지고, 4기 진단 시 생존율은 급격히 낮아지는 것으로 알려져 있다. 따라서 효과적인 암 치료를 위해서는 적절한 진단 마커(표지물질)를 이용한 조기진단이 필수적이다.

악성종양의 진단, 치료 결과의 평가 및 추적관찰 등에서 종양 바이오마커의 측정은 임상적으로 매우 유용한 검사법 중의 하나이다. 이상적인 종양 바이오마커는 종양 세포에서 생성되어 체액 내에 쉽게 유리되어야 하고, 악성과 양성을 구별할 수 있는 높은 특이도를 지녀야 하며, 조기 발견에 도움이 되어야 한다. 또한 집단 검사 시 유용해야 하며 종양의 진행 정도 및 치료 결과를 반영할 수 있어야 한다.

현재까지 난소암을 진단하기 위한 다양한 바이오마커가 제안되어 왔으며, 다양한 기술 기반(platform) 및 데이터 분석을 통해 연구가 진행되어 왔다. 난소암 진단을 위해서 주로 이용되고 있는 바이오마커로는 CA(carcinoma antigen)-125, CA19-9, CEA(carcinoembryonic antigen) 등이 있으며, 이중 CA-125는 스크리닝, 진단, 모니터링, 추적 검사 시 널리 이용되고 있다. 하지만, 이러한 단일 바이오마커의 사용은 악성 종양 세포에 대한 민감도 및 특이도가 떨어지기 때문에 난소암 진단에 한계가 있어, 이에 대한 대안이 필요한 실정이다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제 10-2008-0044801호 (발명의 명칭: 난소암 및 자궁내막암에 대한 바이오마커: 헵시딘, 이하 종래기술 1이라고 한다.)는 헵시딘을 바이오마커로 사용하여 남소암 및 자궁내막암을 진단하는 방법을 개시한 바 있다. 그러나, 상기 종래기술 1는 난소암 및 자궁내막암 양자에 대한 특이도를 가지는 바이오마커를 사용함으로써 난소암 진단에 대한 민감도 및 특이도가 떨어져 진단의 정확성을 증대시키기에는 한계가 있다.

상기 종래기술1은 헵시딘을 바이오마커로 사용하여 남소암 및 자궁내막암을 진단하는 방법을 개시하고 있으나, 난소암 및 자궁내막암 양자에 대한 특이도를 가지는 바이오마커를 사용함으로써 난소암 진단에 대한 민감도 및 특이도가 떨어져 진단의 정확성을 증대시키기에는 한계가 있다.

따라서, 상기 종래기술의 문제점을 해소하고자 안출된 본 발명은 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 활용하여 난소암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, EpCAM과 HE 4로 선택되는 2개의 다중 바이오마커에 대한 항체를 복합적으로 사용함으로써, 난소암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 난소암을 진단하는 임상진단법에 관한 기술을 제공하고자 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 난소암 진단 방법은

난소암 환자의 시료에서 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 분리하는 단계;

상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계; 및

상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포를 다중 바이오마커(biomarker)에 대한 항체로 염색하는 단계를 포함하고,

상기 시료는 혈액인 것을 포함하고,

상기 혈중 순환 종양세포는 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 이용하여 분리되는 것을 포함하고,

상기 사이즈 선택성 칩은 상기 시료의 반복 통과가 가능하며,

상기 단기 배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어진 것을 특징으로 하는 것을 포함하고,

상기 항체로 염색하는 단계는,

슬라이드에 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계,

상기 혈중 순환 종양세포에 1차 항체를 반응시키는 단계,

상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 반응시키는 단계

상기 2차 항체를 반응시키는 단계 이후, 형광 염색된 세포를 분석하는 단계,

를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 인슐린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 트랜스페린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 상피성장인자는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 3 내지 30μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 단기 배양하는 단계는 세포접착을 막아주는 표면을 가진 배양플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 배양플레이트는 히드로겔층이 표면에 코팅되어 비특이적 결합을 막아주는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 히드로겔층은 중성전하를 가지면서 친수성인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5 μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따르면, 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 난소암 진단 방법을 이용하여 환자의 시료로부터 난소암 여부를 판단할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 난소암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한다는 제 1효과, 난소암 진단을 위해 EpCAM과 HE 4로 선택되는 2개의 다중 바이오마커에 대한 항체를 복합적으로 사용한다는 제 2효과, 난소암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 난소암 진단의 정확성을 증가시킨다는 제 3효과, 난소암의 조기 진단 및 예후 예측 모니터링을 가능하게 한다는 제 4효과, 난소암에 특이적인 항암제를 선별하기 위해, 난소암 환자의 혈중 암세포의 강도를 조절하여 항암제 반응 분석에 응용이 가능하다는 제 5효과를 갖는다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 난소암 환자의 혈액으로부터 분리한 혈중 순환 종양세포를 단기배양한 후, 다중 바이오마커에 대한 항체를 이용하여 난소암을 진단하는 프로세스를 보여주는 나타내는 도면이다.
도 2는 난소암 세포주에 따른 EpCAM의 형광 염색 사진이다.
도 3은 난소암 세포주에 따른 CK와 CA-125의 형광 염색 사진이다.
도 4는 난소암 세포주에 따른 EpCAM 과 HE 4의 형광 염색 사진이다.
도5는 사이즈 선택성 칩에 의해 분리된 혈중 순환 종양세포를 찍은 사진이다.
도6은 본 발명에 따른 배양액에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양액에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도7은 본 발명에 따른 배양액을 이용하여, 본 발명에서 사용된 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.

이하에서는 화학식, 반응식, 구체적인 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결 (접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 활용하여 난소암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, EpCAM과 HE 4로 선택되는 2개의 다중 바이오마커에 대한 항체를 복합적으로 사용함으로써, 난소암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 난소암을 진단하는 임상진단법에 관한 것이다.

본 발명의 실시예에서 난소암 진단방법은 난소암 환자의 시료에서 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 분리하는 단계, 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계 및 상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포를 다중 바이오마커(biomarker)에 대한 항체로 염색하는 단계를 포함할 수 있다. 순환 종양세포는 암 환자의 혈액으로부터 분리되는 순환 종양세포로 암종의 전이에 중요한 역할을 하며, 암 진단을 위한 새로운 진단방법으로 활용될 수 있다.

시료로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 단계는 일정한 비중을 가지는 피콜(ficoll) 용액을 사용하는데, 이 피콜 용액의 사용은 부유 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 적혈구(RBC; red blood cell)와 백혈구(WBC; white blood cell)가 제거된 혈중 순환 종양세포를 분리할 수 있게 한다.

난소암 환자의 혈액을 채혈한 후, 피콜 용액을 사용하여 말초혈액 단핵세포를 분리하기 전, 전처리 과정을 수행할 수 있다. 전처리 방법의 일 예는 혈액에 백혈구 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계, 또는 혈액의 적혈구를 용해하는 단계일 수 있으나, 이 전처리 과정은 생략할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 시료가 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서 상기 혈중 순환 종양세포는 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 이용하여 분리될 수 있다. 이 칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 순환 종양세포를 포착할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5 μm이 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5 μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5 μm보다 작을 경우 백혈구와 적혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5 μm보다 클 경우에는 기공의 크기가 암 세포의 크기보다 커서 암세포가 칩을 통과하여 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 모양은 원형, 사각형 또는 타원 모양일 수 있으며, 바람직하게는 사각형일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩의 기공은 규칙적인 패턴으로 배열될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩은 구체적으로 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리를 소재로 제작될 수 있다. 상기 기공들은 멤스(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)기술을 이용한 에칭(etching)에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩에서 상기 시료가 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중 순환 종양세포가 상기 사이즈 선택성 칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 다시 한번 상기 사이즈 선택성 칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩을 통한 혈중 순환 종양세포 분리는 혈중 순환 종양세포가 포함된 용액을 사이즈 선택성 칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중 순환 종양세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 사이즈 선택성 칩을 통한 혈중 순환 종양세포 분리는 혈중 순환 종양세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩은, 혈중 순환 종양세포가 분리될 때 상기 사이즈 선택성 칩에 의한 혈중 순환 종양세포 데미지를 최소화시키거나 상기 사이즈 선택성 칩이 반복사용이 더 효율적으로 되도록 하기 위해, 또는 혈중 순환 종양세포 회수율을 보다 더 효율적으로 하기 위해 특정 물질로 코팅될 수 있다. 상기 특정 물질은, 구체적으로 혈중 순환 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 세포에 물리적 또는 화학적으로 데미지를 주지 않는 생체재료이면 가능하다.

본 발명의 실시예에서 상기 항체로 염색하는 단계는, 슬라이드에 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계, 상기 혈중 순환 종양세포에 1차 항체를 반응시키는 단계, 상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 반응시키는 단계 및 상기 2차 항체를 반응시키는 단계 이후, 형광 염색된 세포를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

세포나 조직의 형태학적 관찰을 원활하게 하기 위해서는 고정 과정이 가장 중요하다. 고정이 잘된 세포는 소기관이 잘 유지되지만, 고정이 부족하면 형태학적 구조가 불완전하게 되고, 고정이 너무 지나치면 항원의 소실과 비특이적인 반응이 나타날 수 있기 때문이다. 본 발명의 실시예에서 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계는 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 세포를 고정시켰으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스퍼린, EGF(Epidermal Growth Factor) 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어질 수 있다.

상기 인슐린은 인간의 물질대사 체계의 호르몬 중 하나이며 이자 (기관)의 랑게르한스 섬 베타 세포에서 분비되어, 혈액 속의 포도당 수치인 혈당량을 일정하게 유지시키는 역할을 한다. 혈당량이 일정 이상으로 높아지면 인슐린이 분비되며, 혈액내의 포도당을 세포 내로 유입해 다시 다당류(글리코겐)의 형태로 저장하는 작용을 촉진시킨다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 인슐린을 포함함으로써 혈중 순환 종양세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인슐린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40ng/ml, 3~30ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 트랜스페린은 β글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2분자의 3가철이온과 결합하여 세포증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린수용체를 매개로 하여 세포 내로 공급하는 철운반단백질이다. 혈청 속의 철 99% 이상은 트랜스페린과 결합하며 정상적으로는 트랜스페린의 약 1/3이 철과 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 트랜스페린을 포함함으로써 혈중 순환 종양세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 트랜스페린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40 ng/ml, 3~30 ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 상피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 상피성장인자 수용체에 결합하여 세포의 성장 및 분열을 촉진시키는 폴리펩티드성 성장인자이다. 또한, 상기 상피성장인자는 단백질합성이나 RNA합성을 촉진하는 것 외에 오르니틴 탈카르복실효소를 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 상피성장인자를 포함함으로써 혈중 순환 종양세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 상피성장인자는 0.5~10ng/ml, 0.5~9 ng/ml, 0.5~8ng/ml, 0.5~7ng/ml, 0.5~6ng/ml, 0.5~5ng/ml, 0.7~10ng/ml, 0.7~9ng/ml, 0.7~8ng/ml, 0.7~7ng/ml, 0.7~6ng/ml, 0.7~5ng/ml, 1~10ng/ml, 1~9ng/ml, 1~8ng/ml, 1~7ng/ml, 1~6ng/ml 또는 1~5ng/ml 일 수 있다.

상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho 키나제(ROCK)를 타겟으로 하여그 기능을 억제시키거나 저하시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 여기서, Rho키나제는 세린-트레오닌 키나제의 AGC패밀리(PKA/PKG/PKC)에 속하는 키나제이다. 상기 Rho 키나제는 사이토스켈레톤에 작용함으로써 세포의 운동 및 형태를 제어하는 과정에 관련되어 있다. 구체적으로는 상기 Rho 키나제는 세포의 이동 및 액틴 조직화의 조절인자로 작용할 수 있다. 상기 Rho 키나제는 당뇨병, 출혈성 뇌혈관질환, 파킨스씨 병 같은 신경변성 질환에 관련되어 있고, 상기 Rho 키나제 억제제 가 상기 Rho 키나제관련 질병들에 대한 치료 및 억제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 파수딜은 ROCK 억제제의 하나로서, 뇌혈관경련 치료를 위해 사용될 수 있으며 폐고혈압 치료에도 효과를 나타낼 수 있다. 상기 리파수딜은 상기 파수딜의 유도체로서 ROCK 억제제로 작용할 수 있으며 녹내장 또는 고안압증 치료에도 사용될 수 있다. 상기 RKI-1447은 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 상기 Y27632은 세포를 통과하여 효소의 촉매부위 결합을 위해 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 3~30μm, 3~27μm, 3~24μm, 3~21μm, 4~20μm, 4~30μm, 4~27μm, 4~24μm, 4~21μm, 4~20μm, 5~30μm, 5~27μm, 5~24μm, 5~21μm 또는 5~20μm일 수 있다.

본 발명에 따른 단기 배양에서 사용되는 상기 배양플레이트는 세포 접착을 막아주는 표면을 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중 순환 종양세포는 부유상태에서 배양을 시킬 수 있으므로 상기 배양플레이트의 표면이 세포 접착을 막아주도록 코팅이 될 수 있다. 상기 배양플레이트의 표면 코팅은 히드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 히드로겔은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하며, 히드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성된다. 구체적으로 보면, 상기 히드로겔은 공유 결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 이렇게 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 비슷한 거동을 보인다. 상기 히드로겔은 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할수 있으며 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 상기 배양플레이트에 공유결합으로 코팅되어 혈중 순환 종양세포가 배양플레이트 표면에 접착되는 것을 막아줄 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 중성전하를 가지면서 친수성을 가질 수 있다. 상기 중성전하를 가진다는 것은 전하가 플러스도 아니고 마이너스도 아닌 상태를 가진다는 것을 의미하며, 상기 친수성이란, 물에 대한 강한 친화력을 말하는 것으로서 물에 잘 용해될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 실시예에서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1내지15일동안 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는 5내지 15일일수 있으며 바람직하게는 10 내지 15일일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 12내지 15일일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 1차 항체는 1:50 내지 1:200 비율로 희석하여 처리하고, 20 내지 37℃ 온도에서 45 내지 120분 동안 반응시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 1:30내지 1:100비율로 희석하여 처리하고, 22 내지 28℃ 온도에서 80 내지 100분 동안 반응시킬 수 있다. 희석 비율, 온도 및 시간 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우, 1차 항체 반응이 감소되어 세포 염색 과정이 정상적으로 수행되지 않을 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 형광표지된 2차 항체는 1:200 내지 1:400 비율로 희석하여 처리하고, 20 내지 37℃ 온도에서 45 내지 90분 동안 반응시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 1:100내지 1:200비율로 희석하여 처리하고, 22 내지 28℃ 온도에서 50 내지 70분 동안 반응시킬 수 있다. 희석 비율, 온도 및 시간 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우, 2차 항체 반응이 감소되어 세포 염색 과정이 정상적으로 수행되지 않을 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 1차 항체 반응은 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역 블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서 상기 형광 염색된 세포를 분석하는 단계는 형광현미경에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서 상기 형광 염색된 세포를 분석하는 단계는 흡광도 또는 형광의 세기로 측정하여 정량화할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 혈중 순환 종양세포는 2개의 다중 바이오마커에 대한 항체에 의해 염색되는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)+/HE 4(human epididymis protein 4)+ 세포 일 수 있다. EpCAM은 상피세포결합분자로 상피성종양로부터 유래된 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었으며, HE 4는 상피성 난소암의 종양세포의 마커로 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었다. 즉, 상기 2개의 다중 바이오 마커 조합은 혈중 순환 종양세포를 탐지하는데 있어서, 다른 바이오마커 조합보다 더욱 효과적일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 난소암세포 검출방법을 이용하여 환자의 시료로부터 난소암 여부를 판단할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1. 사이즈 선택성을 가지는 칩 제작 단계

실험에서 사용되는 사이즈 선택성을 가지는 칩은 기공의 크기(pore-size)가 5.5~8.5μm로 형성되어 있어, 상기 5.5μm보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 5.5μm보다 큰 사이즈의 암 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.

참고로, 사이즈 선택성을 가지는 칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	스파이킹 세포 수	회수 된 세포 수	세포 회수율(%)
1	10	9	90
2	100	86	86
3	1000	850	85

칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.

실시예 2. 혈중 순환 종양세포 준비 단계

<난소암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포의 분리방법(S10)>

1. 난소암 환자의 말초혈액 1ml을 추출한다.

2. 말초혈액과 동일 볼륨의 피콜(ficoll) 용액을 새로운 튜브에 담고, PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)로 희석시킨 말초혈액을 피콜 층 위로 조심스럽게 옮긴다.

3. 400xg의 스피드로 상온에서 30분간 원심분리 한다.

4. 원심분리 후, 형성된 말초혈액 단핵세포 층을 새로운 튜브로 옮겨 담고, 2배 볼륨의 제 2 버퍼를 넣어 희석시킨다.

5. 사이즈 선택성을 가지는 칩을 고정대에 고정시킨 후, 제 4 버퍼를 이용하여 칩을 미리 적셔 놓는다.

6. 위 실험방법 5에서, 제 2 버퍼로 희석된 말초혈액 단핵세포를 칩으로 통과시킨다.

7. 세포의 회수율을 높이기 위해, 튜브에 남아있는 세포들을 제 3 버퍼로 헹군 후, 칩으로 통과시키는 과정을 반복 수행한다.

8. 칩으로부터 세포를 회수한다.

실시예3. 혈중 순환 종양세포의 단기배양 방법(S11)

본 발명에 따른 사이즈 선택성 칩에 의해 분리된 혈중 순환 종양세포를 중성전하를가지면서 친수성을 띄는 히드로겔로 코팅된 Ultra low attachment 배양플레이트에 seeding을 했다. 상기 배양플레이트는 11ng/ml 인슐린, 22ng/ml 트랜스페린, 2ng/ml EGF 및 8μm ROCK 억제제를 포함하고 있는 배양액이 들어 있으며 상기 단기 배양은 배양한 시점부터 14일동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5~10% CO2 조건하에서 배양을 실시했다.

실시예 4. 혈중 순환 종양세포의 다중 바이오마커 항체를 이용한 염색 단계(S12)

1. dynabead 20ul를 회수된 혈중 순환 종양세포에 넣고 상온에서 30분간 인큐베이션(incubation) 시킨다.

마그네틱 거치대에 컬럼(column)을 고정하고 dynabead와 반응시킨 혈중 순환 종양세포를 통과시킨다. 상기 dynabead는 백혈구에 특이적인 항체를 가지고 자성을 띠는 물질이 결합되어 있어, 혈액 속 백혈구는 dynabead와 결합되어 마그네틱 거치대에 의해 포획된다.

3. 컬럼을 통과한 혈중 순환 종양세포를 새로운 튜브에 옮기고, 나머지는 제거한다.

4. 800xg의 스피드로 상온에서 30분간 원심분리 한다.

5. 상층액 약 200ul을 남겨놓고 모두 제거한다.

6. 상층액과 동일 볼륨의 4% 파라포름알데하이드(PFA; paraformaldehyd solution)를 넣고 5분간 반응시킨다.

7. 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 회수된 세포들을 염색용 슬라이드에 고정시킨다.

8. 1차 항체를 상온에서 90분간 인큐베이션 시킨다.

9. PBS로 워싱(washing)과정을 5분씩 3번 반복 수행한다.

10. 2차 항체를 상온에서 60분간 인큐베이션 시킨다.

11. PBS로 워싱 과정을 5분씩 3번 반복 수행한다.

12. 최종적으로 세포 핵을 염색하기 위해, DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution을 넣은 후 커버글라스를 덮고 상온에서 10분간 인큐베이션 시킨다.

13. 형광 현미경을 이용하여 염색된 세포들을 관찰하면서 염색된 비율 및 회수율을 매뉴얼로 계산한다.

비교예 1. 배양액에 따른 혈중 순환 종양세포의 배양된 세포수 변화

일반적으로 세포 배양에 사용되는 세포 배양액과 본 발명에 따른 배양액에서 혈중 순환 종양세포의 분열 및 성장 정도를 비교실험하였다. 일반적으로 세포 배양에 사용되는 배양액은 25 nM sodium selenite, 50 nM Hydrocortisone, 0.01 mM ethanolamine, 0.01 mM phosphorylethanolamine, 100 pM triiodothyronine, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 10 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, 4.5mM L-glutamine 및 1X antibiotic-antimycotic 을 포함하고 있으며, 본 발명의 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다. 또한 배양 조건은 일반적인 플레이트를 이용한 점을 제외하고는 실시예3과 동일하다.

도6를 보면, CD45-는 배양되는 혈중 순환 종양세포에 대한 바이오마커이며, Normal growth media는 일반적인 세포 배양액, CG growth media는 본 발명에 따른 배양액을 의미한다. 도5는 본 발명에 따른 배양액에서 혈중 순환 종양세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 본 발명에 따른 배양액이 일반적인 배양액보다 혈중 순환 종양세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.

비교예 2. 히드로겔이 코팅된 배양플레이트에서 배양액에 따른 혈중 순환 종양세포의 배양된 세포수 변화

본 발명에 따른 배양액이 사용된 상황에서, 혈중 순환 종양세포의 세포 성장 및 분열에 대한 히드로겔 코팅된 배양플레이트 효과를 측정하기 위해 일반적인 배양플레이트와 비교배양을 실시하였다. 본 발명에 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다.

도7을 보면, Normal culture type은 일반적인 세포 배양플레이트(세포가 배양플레이트 표면이 붙음)를 나타낸 것이고, Low attachment type은 본 발명에서 사용된 히드로겔이 코팅된 배양플레이트이다. 도6은 본 발명에 따른 배양액을 이용하여 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 종양세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서의 배양이 혈중 순환 종양세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

비교예 3. 바이오마커(EpCAM) 항체를 이용한 난소암 진단

상기 실시예 2 및 실시예 3과 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 난소암 환자의 혈중 순환 종양세포를 분리한 한 후, 바이오마커 항체를 이용하여 세포를 염색하였다. 난소암 세포주에 따른 EpCAM바이오마커의 민감도 및 특이도를 분석하기 위해, 난소암 세포주의 종류를 달리하였고, 이의 결과를 도 2에 나타내었다.

난소암 세포주인 OVCAR3, SKOV3, SNU-251 및 SNU-8를 이용하여, 기존에 알려져 있는 혈중 암세포의 마커인 EpCAM을 염색한 결과, OVCAR3와 SKOV3에서는 EpCAM의 발현이 나타났으나, SNU-251과 SNU-8에서는 EpCAM 발현이 나타나지 않았다. 따라서 EpCAM 바이오마커는 모든 난소암 세포주 타입을 커버하지 못하는 것으로 확인하였다.

비교예 4. 바이오마커(CK, CA-125) 항체를 이용한 난소암 진단

상기 실시예 2 및 실시예 3과 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 난소암 환자의 혈중 순환 종양세포를 분리한 한 후, 바이오마커 항체를 이용하여 세포를 염색하였다. 난소암 세포주에 따른 CK와 CA-125 바이오마커의 민감도 및 특이도를 분석하기 위해, 난소암 세포주의 종류를 달리하였고, 이의 결과를 도 3에 나타내었다.

난소암 세포주인 OVCAR3, SKOV3, SNU-251 및 SNU-8를 이용하여, 기존에 알려져 있는 혈중 암세포의 마커인 CK와 CA-125를 염색한 결과, CK 와 CA-125는 다양한 난소암 세포주 타입을 커버하지 못하고 세포주마다 각각 다른 발현율을 보여 난소암에 대한 민감도 및 특이도가 떨어지는 것을 확인하였다.

실험예 1. 바이오마커(EpCAM, HE 4) 항체를 이용한 난소암 진단

상기 실시예 2 및 실시예 3과 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 난소암 환자의 혈중 순환 종양세포를 분리 및 배양한 후, 바이오마커 항체를 이용하여 세포를 염색하였다. 난소암 세포주에 따른 EpCAM 과 HE 4 바이오마커의 민감도 및 특이도를 분석하기 위해, 난소암 세포주의 종류를 달리하였고, 이의 결과를 도 4에 나타내었다.

난소암 세포주인 OVCAR3, SKOV3, SNU-251 및 SNU-8를 이용하여, 기존에 알려져 있는 혈중 암세포의 마커인 EpCAM 과 HE 4를 염색한 결과, EpCAM 과 HE 4는 다양한 난소암 세포주 타입을 커버하는 것으로 나타나 혈중 난소암세포를 검출하기 위한 바이오마커로 선정되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

1. 난소암 환자의 시료에서 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 분리하는 단계;
   상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계; 및
   상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포를 다중 바이오마커(biomarker)에 대한 항체로 염색하는 단계를 포함하고,
   상기 시료는 혈액인 것을 포함하고,
   상기 혈중 순환 종양세포는 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 이용하여 분리되는 것을 포함하고,
   상기 사이즈 선택성 칩은 상기 시료의 반복 통과가 가능하며,
   상기 단기 배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어진 것을 특징으로 하는 것을 포함하고,
   상기 항체로 염색하는 단계는,
   슬라이드에 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계,
   상기 혈중 순환 종양세포에 1차 항체를 반응시키는 단계,
   상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 반응시키는 단계
   상기 2차 항체를 반응시키는 단계 이후, 형광 염색된 세포를 분석하는 단계,
   를 더 포함하는 난소암세포 검출방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 인슐린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 트랜스페린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 상피성장인자는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 ROCK 억제제는 3 내지 30μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 단기 배양하는 단계는 세포접착을 막아주는 표면을 가진 배양플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 배양플레이트는 히드로겔층이 표면에 코팅되어 비특이적 결합을 막아주는 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 히드로겔층은 중성전하를 가지면서 친수성인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5 μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 난소암세포 검출방법.
12. 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 제1항에 따른 난소암세포 검출방법을 이용하여 환자의 시료로부터 난소암 여부를 판단하는 방법.

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