KR20170099804A - 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20170099804A
KR20170099804A KR1020170061224A KR20170061224A KR20170099804A KR 20170099804 A KR20170099804 A KR 20170099804A KR 1020170061224 A KR1020170061224 A KR 1020170061224A KR 20170061224 A KR20170061224 A KR 20170061224A KR 20170099804 A KR20170099804 A KR 20170099804A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bacteria
dna
gram
aptamer
selex
Prior art date
Application number
KR1020170061224A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101836042B1 (ko
Inventor
하연철
이동기
푸자 두아 차두하리
김준기
신혜수
강영규
여민영
Original Assignee
국방과학연구소
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국방과학연구소 filed Critical 국방과학연구소
Priority to KR1020170061224A priority Critical patent/KR101836042B1/ko
Publication of KR20170099804A publication Critical patent/KR20170099804A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101836042B1 publication Critical patent/KR101836042B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/204—Modifications characterised by specific length of the oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머에 관한 것으로, 다양한 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아에 높은 친화성을 갖는 DNA 압타머를 찾기 위하여 Toggle-SELEX와 Cell-SELEX라는 방법을 접목시켜 Toggl-Cell-SELEX 방법을 연속적으로 세 차례 수행하여 세 가지 박테리아에 결합력을 가지는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하였으며, 이를 유효성분으로 하여 다양한 박테리아에 대해 신속하게 검출할 수 있는 바이오센서나 특이적인 병원성 박테리아에 대한 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있는 DNA 압타머에 관한 것이다.

Description

그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도{DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO GRAM POSITIVE BACTERIA AND USE THEREOF}
본 발명은 DNA 압타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Toggle-Cell-SELEX를 이용하여 선별된 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이를 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 의해 유발되거나 이것이 원인이 되는 감염질환을 예방 또는 치료하는 항균용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
박테리아의 식별 및 탐지방법은 일반적으로 박테리아의 특성을 토대로 하는데, 생화학적, 유전적 성질이나 유전자와 환경에 의해 형성된 생물의 표현형질에 기초를 두며, 기존의 미생물학적, 생화학적 박테리아의 식별 및 탐지방법은 박테리아의 표현형을 밝히고, 다수의 실험을 통해 박테리아의 종과 아종을 밝히는 분류학적인 연구에 바탕을 두었다. 그러나 이는 오랜 시간을 필요로 하고, 박테리아를 배양하기 위한 맞춤형 배양액이 필요한 단점이 있다(Lazcka et al., 2007; McFeters et al., 1999).
가장 기본적인 박테리아 식별하기 위한 방법 중 하나로 그람 염색법(Gram staining)이 있으며, 이는 박테리아를 식별하는 데 이용된 거의 최초의 방법으로, 그람 염색법은 박테리아 세포벽의 구조적 차이에 의한 크리스탈 바이올렛 염색 시약의 색깔에 의존한다.
계속적인 연구를 통해 항체, 단백질이나 핵산 등이 항원 박테리아의 세포 바깥 표면에 있는 항원 결정부위(epitope)와 결합하여 분자 수준에서의 인식과 캡쳐(capture)가 가능하도록 하는 검출자의 역할을 할 수 있음이 밝혀졌으며, 특히 최근 10년 간 박테리아에 대해 핵산을 이용한 검출연구로 압타머(aptamer)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
압타머(aptamer)란 표적 단백질과 높은 친화성, 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 지닌 단일가닥 핵산으로 그 자체로 안정한 3차원 입체구조를 가지게 된다. 1990년 콜로라도 대학의 레리 골드(Larry Gold) 연구팀에 의해 압타머 발굴 기술인 SELEX(Systemic Enrichment of Ligands using Exponential Enrichment)가 개발되었고, 이를 이용하여 다양한 질병에 관여하는 단백질에 대한 압타머가 연구되었다.
일반적으로 다수의 압타머는 치료적 목적이나 약물 전달 또는 이미징을 위한 수단으로서 현재 임상 실험 중에 있다(Gilbert et al., 2007; Lee et al., 2006). 또한, 압타머는 살아있는 세포나 병원균과 같은 복잡한 표적 물질로부터 만들어지기도 하는데 이를 'Cell-SELEX'라고 한다(Guo et al., 2008).
기존의 SELEX 방법은 정제된 단백질을 사용하는 반면, Cell-SELEX 방법은 고순도의 단백질 정제과정 없이 세포 표면에 존재하는 단백질과 결합하는 cell-to-Aptamer 방식으로 직접 특이적 압타머를 발굴하는 방법이다. 이 방법의 장점은 세포에서 원형 그대로의 구조를 갖고 있는 표적단백질과 직접 결합할 수 있는 압타머를 발굴할 수 있는 것으로 기존의 대장균 등에서 생산하고 분리한 재조합 단백질에 대한 발굴한 압타머보다 실제 치료용 제제로서 더 가능성이 높은 압타머를 발굴할 수 있다는 장점이 있다.
일반적으로 SELEX 방법을 통해 선별된 압타머는 표적물질에 대해 높은 선택성을 지니게 된다. 예를 들어 사람의 단백질에 대해 선별된 압타머의 경우 생쥐에 존재하는 상동(homologous)의 단백질은 잘 인지하지 못 할 수도 있다. 따라서 종(species) 간의 교차반응성(cross-reactivity)을 갖는 압타머의 개발이 시도되었다.
최근 Cell-SELEX를 이용하여 살아있는 표적 박테리아에 대한 DNA, RNA 등 핵산 압타머 연구가 최근까지 진행되고 있으며(Suh et al., 2014), 이러한 연구의 일부는 박테리아에 대한 바이오센서로서 효과적으로 쓰이는 데 성공한 바 있다(Abbaspour et al., 2015).
Lazcka, O., Del Campo, F.J., Munoz, F.X. 2007. Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors. Biosens Bioelectron, 22(7), 1205-17. McFeters, G.A., Pyle, B.H., Lisle, J.T., Broadaway, S.C. 1999. Rapid direct methods for enumeration of specific, active bacteria in water and biofilms. Symp Ser Soc Appl Microbiol, 85(28), 193S-200S. Gilbert, J.C., DeFeo-Fraulini, T., Hutabarat, R.M., Horvath, C.J., Merlino, P.G., Marsh, H.N., Healy, J.M., Boufakhreddine, S., Holohan, T.V., Schaub, R.G. 2007. First-in-human evaluation of anti von Willebrand factor therapeutic aptamer ARC1779 in healthy volunteers. Circulation, 116(23), 2678-86. Lee, J.F., Stovall, G.M., Ellington, A.D. 2006. Aptamer therapeutics advance. Curr Opin Chem Biol, 10(3), 282-9. Guo, K.T., PauL, A., Schichor, C., Ziemer, G., Wendel, H.P. 2008. CELL-SELEX: Novel Perspectives of Aptamer-Based Therapeutics. Int J Mol Sci, 9(4), 668-78. Suh, S.H., Dwivedi, H.P., Choi, S.J., Jaykus, L.A. 2014. Selection and characterization of DNA aptamers specific for Listeria species. Anal Biochem, 459, 39-45. Abbaspour, A., Norouz-Sarvestani, F., Noori, A., Soltani, N. 2015. Aptamer-conjugated silver nanoparticles for electrochemical dual-aptamer-based sandwich detection of staphylococcus aureus. Biosens Bioelectron, 68, 149-55.
박테리아의 식별 및 탐지하기 위한 방법으로 그람 염색법(Gram staining)은 실험실에서 널리 이용되는 표준적인 방법이지만, 환경 미생물학에 사용하기에는 한계가 있다. 예를 들어, 그람 염색법에 의해 염색이 고르게 나타나지 않는 경우가 있어 현대의 분자적, 환경 의존적 진단 방법에서 효율성이 감소되는 문제점이 있다.
앞서 설명한 바와 같이 Cell-SELEX는 질병에 관여된 세포나 병원체에 대한 압타머를 발굴하는 기술로서, 세포 표면의 표적 물질이 무엇인지 정확하게 모르는 경우에도 세포에 결합할 수 있는 압타머를 찾을 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 표적 단백질이 세포로부터 정제된 경우 표적 단백질의 3차원 구조가 세포 내에서와 달리 변형될 가능성이 있는데, 그러므로 Cell-SELEX를 이용하면 표적 단백질이 세포 내에서 생리학적 기능을 하는 상태에서 연구가 가능하므로 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머만을 선택하는 과정에서 훨씬 많은 기능적 연구의 접근을 가능하게 된다.
한편, Toggle-SELEX라는 방법은 표적 단백질로 사람의 origin과 porcine origin을 round 별로 번갈아가며(toggling) 사용함으로써, 상동(homologous) 이종 간의 단백질에 동시에 높은 친화도로 결합할 수 있는 압타머를 선별할 수 있다.
상기와 같은 점을 감안한 본 발명의 목적은 다양한 그람 양성 박테리아 혹은 음성 박테리아에 대해 특이적이고, 광범위하게 결합하는 단일가닥 DNA 압타머에 관한 것으로, 기존의 SELEX 방법 중에서 Toggle-SELEX와 Cell-SELEX라는 방법을 접목시켜 SELEX cycle 마다 다른 종류의 박테리아에 결합하는 압타머를 선별하는 방법인 Toggle-Cell-SELEX 방법을 이용한 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 DNA 압타머는 서열번호 2 내지 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하며, 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합할 수 있는 총 염기 길이가 76개인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 DNA 압타머는 서열번호 1(5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 'N40'은 DNA 압타머의 가변 중심 서열로서 바람직하게 40개의 염기로 이루어지고, 서열번호 2 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 나타낸다.
여기서 상기 서열번호 2 내지 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열은 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하고, 상기 서열번호 4 내지 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열은 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합한다.
또한, 본 발명의 DNA 압타머는 서열번호 8 내지 13으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시되며, 구체적으로 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 서열번호 8 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시되고, 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 서열번호 11 내지 13으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시된다.
본 발명에 특이적으로 결합하는 박테리아로서 그람 음성 박테리아는 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12, Serratia marcescens, Enterobacter mori, Pseudomonas putida, Pseudomonas pictorum 및 Sphingomonas trueperi 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 아울러 그람 양성 박테리아는 Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus thermophilus, Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae 및 Enterococcus thailandicus 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 DNA 압타머의 제조 방법은 단일가닥 DNA 라이브러리(single strand DNA library)를 Toggle-Cell-SELEX 방법을 통해 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하고 서열번호 8 내지 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하는 선별 단계, 상기 선별된 단일가닥 DNA 압타머를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 증폭하는 증폭 단계, 및 상기 증폭된 DNA 압타머를 젤 정제(gel purification) 기법을 이용하여 정제하는 정제 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
여기서 상기 선별 단계는 부착(Binding) 단계, 세척(Washing) 단계 및 분리(Elution) 단계를 더 포함하여 DNA 압타머를 선별할 수 있다.
상기 젤 정제(gel purification) 방법은 바람직하게는 PAGE 겔(polyacrylamide gel electrophoresis gel)과 UREA-PAGE 겔(UREA-polyacrylamide gel electrophoresis gel)을 사용한 두 번의 PAGE 겔 전기영동을 수행하여 단일가닥 DNA 압타머를 정제한다.
본 발명의 DNA 압타머 한 종류의 박테리아에 대한 압타머가 아닌 광범위하게 그람 음성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아 전반에 걸쳐 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머로, 이를 특정 병원성 미생물의 감염 처치에 효과적으로 활용될 수 있는 항균성 조성물로 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하여, 병원성 미생물에 의해 유발되거나 이것이 원인이 되는 감염질환을 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있는 항균용 조성물을 제공한다.
여기서 병원성 미생물은 바람직하게 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12, Serratia marcescens, Enterobacter mori, Pseudomonas putida, Pseudomonas pictorum, Sphingomonas trueperi, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus thermophilus, Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae 및 Enterococcus thailandicus 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 균일 수 있다.
본 발명의 병원성 미생물에 의한 감염질환의 예로는, 이질(dysentery), 뇌수막염(meningitis), 질염(vaginosis), 폐렴(pneumonia), 장염(enteritis), 전립선염(prostatitis), 결막염(conjunctivitis), 장관 감염(intestinal infections), 피부염(dermatitis), 탄저병(anthrax), 브루셀라병(Brucellosis), 콜레라(cholerae), 살모넬라증(Salmonellosis), 기종저(blackquarter), 보툴리스중독증(botulism), 대장균증(Colibacillosis), 전염성 피부 괴사(contagious skin necrosis), 코리네박테륨증(Corynebacteriosis), 방광염(cystitis), 자궁내막염(endometritis), 내독소혈증(endotoxemia), 장성독혈증(enterotoxemia), 마비저(glanders), 렙토스피라병(leptospirosis), 리스테리아증(listeriosis), 림프절염(lymphadenitis), 유방염(mastitis), 유비저(melioidosis), 파라결핵증(paratuberculosis), 파스퇴렐라증(Pasteurellosis), 흑사병(plague), Q-발열(Q-fever), 선역(strangles), 파상풍(tetanus), 결핵(tuberculosis), 대장염(colitis), 출혈성 패혈증(hemorrhagic septicemia), 내이염(Labyrinthitis), 패혈증(septicemia), 및 식중독(food poisoning) 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 병원성 미생물에 의해 유발되는 발열, 구토, 호흡 곤란 등을 수반하는 증상을 동반하는 감염질환은 모두 본 발명의 대상 질환이 될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물에 포함되는 DNA 압타머는 상술한 바와 같이 병원성 미생물에 대해 민감하면서도 특이적으로 식별 가능하므로, 병원성 미생물에 의해 유발되는 질환의 처치에 효과를 나타낸다.
따라서 본 발명의 항균성 조성물은 항상제, 소독제, 살균제, 치료제 등으로 구현될 수 있으며, 다양한 병원성 박테리아에 의해 유발되는 감염질환 처치에 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA 압타머를 유효성분으로 포함함으로서 다양한 박테리아에 대해 신속하게 검출하는 바이오센서를 제공할 수 있다. 이와 같은 바이오센서는 통상의 바이오센서에 구비되는 측정하고자 하는 박테리아를 함유하는 시료가 주입되는 주입구 및 측정 센서부 등의 구성을 구비할 수 있다. 이는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 다양하게 변경할 수 있으며, 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 Toggle-Cell-SELEX 방법을 이용하여 선별된 DNA 압타머로서, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus thermophilus 등을 포함한 그람 양성 박테리아 또는 Eschrichia coli DH5a, Eschrichia coli K12, Serratia marcescens 등을 포함한 그람 음성 박테리아에 대하여 광범위하게 결합할 수 있는 높은 결합력을 가지는 단일가닥 DNA 압타머를 제공할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 단일가닥 DNA 압타머는 병원성 박테리아에 선택적으로 결합이 가능함으로서 바이오센서로 응용 및 개발이 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명의 병원성 박테리아에 대해 민감하면서도 특이적으로 식별 가능하다는 점은 병원성 박테리아 관련 질병을 조기에 진단하고 치료를 할 수 있는 의료용 목적으로 항균성 조성물에 응용 가능한 효과가 있다.
또한, 신속하면서도 실시간으로 분석이 가능하고 일회용으로 개발 가능하다는 강점으로 인해 생화학무기테러에 대비한 군사용 목적으로도 개발 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 표적 박테리아 세포에 특이적인 DNA 압타머를 발굴하는 Toggle-Cell-SELEX 과정의 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 정제 단계를 거친 DNA 밴드를 UV로 확인한 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 그람 음성 박테리아 Toggle-Cell-SELEX 방법을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 그람 양성 박테리아 Toggle-Cell-SELEX 방법을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 그람 음성 박테리아와 결합하는 DNA 압타머의 2차 구조이다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 그람 양성 박테리아와 결합하는 DNA 압타머의 2차 구조이다.
도 7은 그람 음성 박테리아에 대한 농축 실험(enrichment test) 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 그람 양성 박테리아에 대한 농축 실험(enrichment test) 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 그람 양성 박테리아와 결합하는 DNA 압타머인 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)의 공초점 형광 현미경 이미지이다.
도 10은 그람 음성 박테리아와 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)의 마그네틱비드 침강 방법(Magnetic Bead Pull Down Assay)결과를 나타낸 것이다.
도 11은 그람 양성 박테리아와 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)의 마그네틱비드 침강 방법(Magnetic Bead Pull Down Assay)결과를 나타낸 것이다.
도 12는 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)의 마그네틱비드 침강 방법(Magnetic Bead Pull Down Assay)결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에 대한 높은 친화성을 갖는 압타머를 찾기 위해서, 기존의 SELEX 방법 중에서 Toggle-SELEX와 Cell-SELEX라는 방법을 접목시켜 SELEX cycle 마다 다른 종류의 박테리아에 결합하는 압타머를 선별하는 방법인 Toggle-Cell-SELEX 방법을 통해 제조된 DNA 압타머 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
이하 본 발명의 실시예를 첨부된 예시도면을 참조로 상세히 설명하며, 이러한 실시예는 일례로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으므로, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
또한, 본 명세서에 대한 설명의 편의를 위하여 정의하고 있는 기술적 용어는 본 명세서에서 특별한 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 축소되거나 과도하게 포괄적인 의미로 해석되지 않아야 한다. 아울러 본 명세서에 따른 권리를 한정하는 것은 아니며, 유사한 기술적 배경을 가진 기술에 대해 동일 또는 용이한 변경에 의해 적용이 가능함은 물론이다.
이에, 본 명세서에서 "선택적"이란 용어는 특정한 두 물질이 서로 특이적으로 결합하려는 성질을 의미하며, "특이적"이란 용어와 혼용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 "처치" 또는 "치료"라는 용어는 병원성 미생물에 의해 유발된 질환의 억제 및 병원성 미생물에 의해 유발된 질환의 병적 상태를 경감하는 모든 행위를 의미한다.
실시예 1은 박테리아 배양 및 박테리아 세포 개수 계산에 관한 것으로, Toggle-Cell-SELEX 방법을 수행하기 위해 사용되는 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 균주명과 이 들의 배양조건은 하기 표 1과 표 2에 나타낸 것과 같으며, 여기서 표 1은 그람 음성 박테리아를 나타내고 표 2는 그람 양성 박테리아를 나타낸다. 이와 같은 박테리아들은 한국생명공학의 부설기관인 미생물자원센터(KCTC)로부터 분양받아 사용하였다.
박테리아 균주명 배지(Culture Media) 배양 온도(℃)
Escherichia coli DH5a Luria-Bertani Broth 37
Escherichia coli K12 Luria-Bertani Broth 37
Serratia marcescens Luria-Bertani Broth 37
Serratia ficaria Luria-Bertani Broth 28
Enterobacter cloacae Luria-Bertani Broth 30
Enterobacter mori Luria-Bertani Broth 28
Enterobacter aerogenes Nutrient Agar 30
Pseudomonas pictorum Luria-Bertani Broth 28
Pseudomonas putida Luria-Bertani Broth 25
Sphingomonas trueperi Luria-Bertani Broth 25
박테리아 균주명 배지(culture Media) 배양 온도(℃)
Bacillus subtilis Nutrient Agar 30
Bacillus megaterium Nutrient Agar 30
Staphylococcus epidermidis Luria-Bertani Broth 37
Staphylococcus pasteuri Luria-Bertani Broth 37
Streptococcus thermophilus Lactobacili MRS Broth 40
Listeria grayi Brain-Heart Infusion Broth 37
Enterococcus camelliae Lactobacili MRS Broth
+ Glucose(20g/L)		 30
Enterococcus thailandicus Lactobacili MRS Broth
+ Glucose(20g/L)		 30
Lactobacillus cypricasei Lactobacili MRS Broth 37
각각의 박테리아들은 접종(innoculation) 방법을 통해 배양하였으며, 이는 박테리아를 3mL 액체배지에 한 개의 콜로니를 채취해 넣고 12 내지 16시간 동안 각각에 세균에 맞춰 배양적정온도의 교반 배양기(shaking incubator)를 통해서 배양한다.
또한 지속적인 배양을 위해 계대배양(sub culture)은 OD600(600 nm에서의 흡광도) 값이 0.4가 될 때까지 0.1 v/v%만큼의 접종 용액을 각각의 박테리아에 맞는 액체 배지에 넣고 배양하였다. 또한 여기서 박테리아의 개수는 Neubauer improved Hemocytometer(ⓒMarienfeld-Superior, Germany)를 이용하여 계산하였다.
실시예 2는 Toggle-Cell-SELEX 방법을 이용한 단일가닥 DNA 압타머의 제조 방법에 관한 것으로, 도 1을 참고하면 본 발명의 DNA 압타머의 제조 방법은 합성된 단일가닥 DNA 라이브러리(single strand DNA library)를 Toggle-Cell-SELEX 방법을 통해 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 선별하는 선별 단계, 증폭(Amplification) 단계 및 정제(Purification) 단계의 순서대로 진행되며, 구체적으로 상기 Toggle-Cell-SELEX 방법은 단일가닥 DNA 라이브러리(single-strand DNA library)를 박테리아에 부착(Binding) 단계, 세척(Washing) 단계, 분리(Elution) 단계의 순서로 진행하여 DNA 압타머를 선별한다.
먼저, 본 발명의 Toggle-Cell-SELEX 과정을 수행을 위한 단일가닥 DNA 라이브러리(single strand DNA library)는 폴리아크릴아미드겔전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)으로 정제된 76개의 뉴클레오티드로 아데닌(adenine, A), 티민(thymine, T), 시토신(cytosine, C) 그리고 구아닌(guanine, G)의 염기로 구성된 DNA가 이용되었으며, 아래의 서열과 같이 단일가닥 DNA는 염기서열 5' 말단, 3' 말단에 각각 18개의 고정된 뉴클레오티드와 40개의 임의로 정해진 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 DNA 라이브러리(5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3'; 서열번호 1)로 구성되었다.
상기 단일 가닥 DNA 라이브러리에 대한 서열번호 1에서 'N40'은 DNA 압타머의 가변 중심 서열로서 바람직하게 40개의 염기로 이루어진 염기서열을 나타낸다.
한편, 본 발명의 실시예에서 사용되는 pH7.4의 Tris-HCl 용액은 50mM Tris-Base, 5mM MgCl2, 5mM KCl, 100mM NaCl을 3차 증류수에 넣어 녹인 후, HCl 용액을 넣어 pH를 7.4로 맞춰 제조한 것을 사용하였다.
선별 단계로 본 발명의 Toggle-Cell-SELEX 방법은 먼저 박테리아에 단일가닥 DNA 라이브러리를 부착시키는 부착(Binding) 단계로서, 상기 합성된 76개의 뉴클레오티드로 구성된 단일가닥 DNA 라이브러리(single-strand DNA library) 2500 pmol을 3차 증류수 10μL를 넣고 용해시킨 후, 95℃에서 5분 동안 변성시키고, 이를 얼음에 넣어서 5분 동안 식힌다.
그 다음 상기 얼음으로 식힌 단일가닥 DNA 라이브러리에 1mL의 세척 완충액(pH7.4의 Tris-HCl 용액, 0.05v/v% Tween 20)로 두 번 세척하는 세척(Washing) 단계를 거친 108개의 표적 박테리아 세포를 넣은 후, 200μL의 결합 완충액(pH7.4의 Tris-HCl 용액, 10μL/mL BSA, 10μL/mL Salmon sperm DNA solution(InvitrogenTM, USA), 10μL/mL yeast tRNA(InvitrogenTM, USA))을 넣고, SLRM-2M Intelli Mixer(MyLabTM, Korea)를 이용하여 F4 mode, 25rpm으로 회전시키면서 15분 동안 상온에서 배양한다. 그리고 배양액을 4℃, 6,000rpm으로 4분 동안 원심분리하여 박테리아를 모으고, 여기에 0.5X 결합 완충액 1mL를 넣어 박테리아를 세척하고, 다시 상기 동일한 조건으로 원심분리하여 박테리아를 다시 획득한다.
그 후 박테리아와 선택적으로 결합한 단일가닥 DNA를 박테리아에서 분리하기 위한 분리(Elution) 단계로 300μL의 분리 완충액(Tris-HCl 용액, 10mM EDTA, pH8.0)을 넣고 95℃에서 5분 동안 가열하고, 4℃, 13,000rpm으로 4분간 원심분리하여 박테리아와 선택적으로 결합한 단일가닥 DNA을 포함하는 상층액을 회수한다.
상기 회수된 상층액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol):클로로포름(chloroform):아이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 300μL를 첨가해 준 후 20초 동안 볼텍싱(vortexing)하여 잘 섞어 준다. 이것을 4℃, 13,000rpm으로 20분간 원심분리하면, 일반적으로 DNA는 친수성을 띠고 다른 불순물은 소수성을 띠므로 서로 섞이지 않은 친수성, 소수성 액체의 층이 분리할 수 있게 된다. 여기서, DNA의 순도를 높이기 위하여 분리된 층들 중에서 친수성을 띤 상등액만 따로 취하여 여기에 동일 부피의 클로로포름(chloroform)을 넣고 볼텍싱(vortexing)로 잘 섞은 후, 다시 10분 동안 4℃, 13,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
회수된 1.5 v/v%의 상등액에 5 v/v%의 에탄올, NH4OAc 및 글리코겐(glycogen)을 각각 넣는 에탄올 침전방법을 이용하여 DNA만을 침전시켜 추출한다. 상기와 같은 방법으로 침전시켜 추출된 DNA를 -80℃에 12시간동안 넣어두고 나서, 4℃, 13,000rpm으로 20분간 원심분리한다. 상층액을 제거하고 DNA 펠렛(pellet)을 75% 에탄올 750μL을 넣고 세척한 후 에탄올을 제거하여 상온에서 5분 정도 두어 DNA을 완전히 건조시킨다. 이렇게 건조된 DNA 펠렛에 3차 증류수를 넣고 65℃에 5분 동안 두어 DNA 펠렛을 녹여서 DNA를 추출하였다.
그 다음, 표적 박테리아에 선택적으로 결합하는 단일가닥 DNA의 양을 증가시키기 위한 증폭(Amplification) 단계로, 표적 박테리아에 결합하는 DNA 라이브러리를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 증폭하였다.
10μL의 PCR 반응혼합물은 아래와 같이 0.4μM의 N40 upstream primer(5'-AGATTGCACTTACTATCT- 3'; 서열번호 14)와 0.4μM의 poly-A-tailed downstream primer(5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SS-AGATTGCACTTACTATCT-3'; 서열번호 15)를 앞서 추출한 단일가닥 DNA 20ng에 넣고 혼합한다. 여기서 poly-A-tailed downstream primer의 서열로 서열번호 15에서 표시된 S는 iSp9(Int Spacer 9)로 트리에틸렌 글리콜 스페이서(triethylene glycol spacer)를 의미한다.
초기 DNA 변성을 위해 95℃에서 5분 동안 반응시키고, 이를 순차적으로 95℃에서 40초(denaturation), 53℃에서 40초(annealing), 72℃에서 30초(extension)의 반응조건으로 14 내지 20 cycle을 반복하며, 최종적으로 DNA 연장(extension)을 위해 72℃에서 10분 동안 유지하여 이중가닥 DNA 라이브러리(double strand library)를 제조하였다.
중합효소연쇄반응(PCR)의 생성물인 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리 정제하기 위한 정제(Purification) 단계에서는, 앞서 서술된 방법으로 제조된 중합효소연쇄반응(PCR)의 생성물로 이중가닥 DNA 라이브러리는 10 w/w% PAGE 겔(polyacrylamide gel electrophoresis gel)과 TBE 용액을 이용한 전기영동을 수행하여 분리하고 에티디움브로마이드(ethidium bromide, EtBr)을 이용하여 DNA를 염색한 후, 자외선(UV)광하에서 DNA 밴드를 확인하였다.
확인된 DNA 밴드 영역의 PAGE 겔만을 잘라내어 DNA를 겔 추출(gel extraction)한 후, 10 w/w% UREA-PAGE 겔(UREA-polyacrylamide gel electrophoresis gel) 전기영동을 수행하여 정제한다. 여기에서는 상기 중합효소연쇄반응(PCR)에서 poly-A-tailed downstream primer를 이용하였기 때문에 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 제조된 이중가닥 DNA의 각 가닥의 길이가 차이가 생겨 이를 단일가닥 DNA로 분리하는 것이 가능하다.
이와 같은 정제 단계를 거친 10 w/w% UREA-PAGE 겔(UREA-polyacrylamide gel electrophoresis gel)을 에티디움브로마이드(ethidium bromide, EtBr)을 이용하여 DNA를 염색한 후, 자외선(UV)광하에서 DNA 밴드를 확인하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 밴드 확인결과 중합효소연쇄반응(PCR)의 생성물인 단일가닥 DNA와 primer 밴드들로 구분되고, 구체적으로 poly-A-tailed downstream primer에 의한 PCR, 생성물인 96bp 크기의 downstream DNA 밴드, upstream primer에 의한 PCR, 생성물인 76bp 크기의 upstream DNA 밴드, 및 38bp의 poly-A-tailed downstream primer 밴드로 구분되며, 그 중에서 upstream DNA 밴드 영역의 UREA-PAGE 겔만을 잘라내어 100 내지 150 μL의 gel elution buffer(pH7.4의 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 750mM NH4OAc, 0.1% Sodium dodecyl sulfate)를 넣고, 65℃에서 30분 이상 반응하고, 12,000rpm으로 2분 동안 원심분리하여 상층액만 2mL tube에 옮기는 이 과정을 순서대로 3번이나 4번 정도 반복해준다.
그리고 상층액의 전체부피가 500μL정도 되면 여기에 3M 아세트산나트륨(sodium acetate) 20μL, 글리코겐(glycogen) 8μL을 넣어준다. 여기서 글리코겐(glycogen)은 아세트산나트륨(sodium acetate)이 있는 에탄올 용액에선 불용성을 띠므로, 핵산을 침전시키는 역할로 사용될 수 있다. 그리고 상기 상층액을 원심분리하여 획득한 DNA 펠렛에 최종 부피가 2mL이 되도록 100% 에탄올을 넣고, -80℃에 12시간 동안 보관한다. 그 후 4℃, 13,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 DNA를 추출하고, 이를 75% 에탄올로 세척한 후 에탄올을 제거하고 상온에서 완전히 DNA를 건조시킨다. 건조된 DNA 펠렛에 3차 증류수를 넣고 65℃에서 5분 동안 두어 DNA를 녹이게 되면, 박테리아에 특이적으로 결합할 수 있는 단일가닥 DNA 압타머를 제조하게 된다.
한편, 이와 같이 획득된 단일가닥 DNA 압타머의 양은 자외선-가시선 분광분석법으로 측정할 수 있으며, 본 발명에서는 BioSpec-nano Micro-volume UV-Vis Spectrophotometer(SHIMADZU, Japan) 장치를 이용하여 측정하였다.
실시예 3과 4는 앞서 설명한 바와 같은 Toggle-Cell-SELEX 방법을 이용하여 박테리아 세포에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머의 제조에 관한 것으로, 앞서 설명한 바와 같이 합성된 76개의 뉴클레오티드로 이루어진 단일가닥 DNA 압타머(single strand DNA aptamer)로서 상기 도 1에서처럼 무작위 부위(Random region)으로 40개의 임의로 정해진 뉴클레오티드에 의해 생기는 약 440개의 DNA 중에서 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아를 표적물질로 하는 DNA만을 Toggle-Cell-SELEX방법을 이용하여 선별하여 제조하는 것이다.
이하, 실시예 3과 4에서 3종류의 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 76개의 뉴클레오티드로 이루어진 DNA 압타머만을 제조하기 위한 방법은 다음과 같다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따른 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결함하는 DNA 압타머의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 3에 도시된 것처럼 실시예 3은 그람 음성 박테리아로 Escherichia coli DH5a를 상기 실시예 2와 동일한 Toggle-Cell-SELEX 방법을 적용하고 나서 선별된 단일가닥 DNA 라이브러리에 Escherichia coli K12와 Serratia marcescens에 대해서도 상기 실시예 2과 동일한 과정으로 Toggle-Cell-SELEX를 수행한다. 이 때 세 종류의 그람 음성 박테리아로 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12 및 Serratia marcescens에 대한 Toggle-Cell-SELEX 과정을 총 4번 반복함으로서, 상기 세 종류의 그람 음성 박테리아에 모두 높은 친화성을 갖고 특이적으로 결합 가능한 단일가닥 DNA 압타머를 제조하였다. 이렇게 제조된 단일 가닥 DNA 압타머를 본 명세서에서는 "그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)"라 명칭하였다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에 따른 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결함하는 DNA 압타머의 제조과정을 나타낸 것으로, 실시예 4는 그람 음성 박테리아 대신 그람 양성 박테리아로 Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 및 Streptococcus thermophilus를 이용하여 3번의 Toggle-Cell-SELEX 과정을 3번 반복한다는 점만 다르고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 상기 세 종류의 그람 양성 박테리아에 모두 높은 친화성을 갖고 특이적으로 결합 가능한 76개의 뉴클레오티드로 이루어진 단일가닥 DNA 압타머를 제조하였다. 이렇게 제조된 단일 가닥 DNA 압타머를 본 명세서에서는 "그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)"라 명칭하였다.
이와 같은 실시예 3과 실시예 4에 따라 제조된 단일가닥 DNA 압타머는 하기 표 3과 4에 나타낸 바와 같은 염기서열을 갖는다.
실시예 3에서 제조된 세 종류의 그람 음성 박테리아에 대한 단일가닥 DNA 압타머로 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)는 각각 GN6, GN12, GN19로 명명하였으며, 실시예 4에서 제조된 세 종류의 그람 양성 박테리아에 대한 단일가닥 DNA 압타머로 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)는 각각 GP11, GP24, GP26으로 명명하였다.
본 발명의 DNA 압타머는 염기서열 5' 말단, 3' 말단에 각각 18개의 고정된 뉴클레오티드와 40개의 임의로 정해진 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 DNA(5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3'; 서열번호 1)로 구성되며, 여기서 상기 N40에 대한 염기서열을 아래 표 3과 표 4에서 밑줄로 표시된 부분으로 서열번호 2 내지 7에 나타낸 바와 같다.
압타머 DNA 염기서열
GN6 5'-ATACCAGCTTATTCAATTGGGTGAGGGGGGGTTCACAACGTTAAAGATAGACGGGGGAAGATAGTAAGTGCAATCT-3'(서열번호 8)
GN12 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCCGAGTCCAGACTCACCGCCGCCTCCTCAAGACGTGCTGGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'(서열번호 9)
GN19 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCGTCGATAATGGCCATGAACCCAATTGTTTAACGTGAGTCAGATAGTAAGTGCAATCT-3'(서열번호 10)
압타머 DNA 염기서열
GP11 5'-ATACCAGCTTATTCAATTGCAATACCGGCATTAGTATGTTCGACGAGTTGACCCTGCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'(서열번호 11)
GP24 5'-ATACCAGCTTATTCAATTGCGAAGTACTGTATGGCCGCTACCCAGTTATATGCATGTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'(서열번호 12)
GP26 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCCAACGACCGCCCATTACCCAGACTATACTGGCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'(서열번호 13)
한편, 웹사이트(http://rna.urmc.ro.chester.ede/RNAsturctureWeb)를 이용하여 실시예 3과 4에 따라 제조된 서열번호 8 내지 13의 DNA 압타머의 2차 구조를 분석하였으며, 이는 서열번호 순서대로 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)로 도 5a 내지 5c와 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)로 도 6a 내지 6c에 나타내었다.
상기 실시예 3과 4에서의 Toggle-Cell-SELEX방법을 이용하여 제조된 단일가닥 DNA 압타머가 표적 박테리아에 어느 정도로 친화적으로 결합하는 지를 알아보기 위하여 Toggle-Cell-SELEX의 마지막 주기를 수행하고 나서, 실시간중합효소연쇄반응(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)을 이용한 농축 검정(enrichment test)을 수행하였다.
구체적으로 상기 제조된 단일가닥 DNA 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭시킨 후, 중합효소연쇄반응(PCR)의 생성물을 T-클로닝 벡터(T&A cloning vector kit, Real Biotech, Taiwan)를 이용하여 상온에 5시간 반응시키면, T-클로닝 벡터에 본 발명의 단일가닥 DNA 라이브러리가 삽입되고 이를 Blue/White screening을 통해서 단일가닥 DNA 라이브러리가 삽입된 하얀색 콜로니만을 선별한다. 그리고 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)을 이용하여 상기 선별된 콜로니에서 단일가닥 DNA를 추출하였다.
그리고 실시간중합효소연쇄반응(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)을 이용한 상대정량에서의 표준곡선을 그리기 위해서, 각각의 단일가닥 DNA 압타머에 0.2 uM 상류 프라이머(upstream primer), 0.2 uM 하류 프라이머(downstream primer)와 SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus; Takara Bio Inc, Japan)을 넣고, StepOneTM Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems®, Roster City, CA, USA)을 이용하여 정량분석을 실시하였다.
그 결과 도 7과 도 8에 나타난 바와 같이, 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에서 Toggle-Cell-SELEX 과정을 수행하기 전인 N40 라이브러리(N40 library)와 Toggle-Cell-SELEX 과정에 대한 마지막 반복 주기와 비교해 볼 때 현저하게 큰 폭으로 표적 박테리아와 높은 친화력으로 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 9는 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)를 공초점 형광 현미경 이미지를 나타낸 것으로, 가시광선 파장영역에서 안정하게 형광을 띠는 시아닌(Cyanine)염료인 Cy3를 5'말단에 표지된 서열번호 16의 염기서열을 갖는 Cy3-up primer(5'-Cy3-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 단일가닥 DNA 압타머 3'말단의 18개 뉴클레오티드와 상보적 결합을 이루도록 하여 3'-Cy3-labeled 압타머를 만들고 이 압타머 10 pmol을 1.0×107개의 박테리아 세포와 상온에서 45분 동안 배양시킨 후, 5분 동안 세척(washing)과정을 거쳐 박테리아에 붙지 않은 압타머를 제거시킨다. 그리고 Olympus사의 공초점 형광 현미경을 이용하여 20× 배율로 관찰하였다(Exposure time 10000, Low(%) 3000, High(%) 4000).
그 결과 도 9에 도시된 바와 같이, Toggle-Cell-SELEX을 하기 전인 N40 라이브러리(N40 library)의 경우는 표적 박테리아와 결합력이 아주 작아 Cy3-up primer와 상보적 결합을 할 수 있는 DNA 압타머가 거의 없으므로 형광을 띠지 않으며, 이와 달리 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)인 GP11, GP24, GP26 압타머의 경우 표적 박테리아와 결합하고, Cy3-up primer가 각각의 압타머와 상보적 결합을 하여 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 DNA 압타머들이 각각 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 광범위하게 결합할 수 있는지 알아보기 위하여 마그네틱비드 침강 방법(Magnetic Bead Pull Down Assay)을 수행하였다.
Dynabeads®M-280 Streptavidin 25uL/sample을 DynaMagTM-2를 이용하여 pH7.4의 Tris-HCl 용액 1mL로 2번의 세척 과정 후, pH7.4의 Tris-HCl 용액 50μL/sample만큼 넣어 잘 섞어주어 비드(Bead)용액을 준비한다.
상기 실시예 3과 4의 Toggle-Cell-SELEX 수행 결과 선별된 단일가닥 DNA의 3' 말단에 스트렙타아비틴(Streptavidin)과 결합하는 Biotin(Kd≒10-14M)을 붙인 압타머를 50pmol/sample만큼 넣고 총 부피가 50μL가 되도록 pH7.4의 Tris-HCl 용액을 넣어준 후, 이것을 95℃에서 3분간 처리하여 구조를 변성시키고, 그리고 바로 얼음에 2분 동안 넣어둔다.
비드(Bead)용액 50μL과 상기 구조가 변성된 단일가닥 DNA 압타머 50μL을 섞고 SLRM-2M Intelli Mixer(MyLabTM, Korea)를 이용하여 F4 mode, 25rpm에서 30분 동안 회전하면서 반응시킨 후, 여기에 50mg/mL의 BSA(bovine serum albumin) 10μL, 10mg/mL의 yeast tRNA를 5μL넣고 F2 mode, 25rpm으로 다시 30분 동안 회전시키면서 반응시켜 비드-압타머 복합체(bead-aptamer complex)를 준비한다.
본 발명의 DNA 압타머에 대한 결합 친화성 정도를 알아보고자 하는 박테리아를 각각 1.0×108cell/sample양 만큼 15mL tube에 분주하고, 4℃에서 6000rpm으로 10분 동안 원심분리 한다. 상층액은 제거하고 침전된 박테리아 펠렛(pellet)를 1.5mL Tris-HCl(pH 7.4)로 세척하여 1.5mL microcentrifuge tube에 옮겨 5분 동안 4℃, 6000rpm으로 원심분리한 후 다시 1mL의 Tris-HCl 용액으로 세척해준다. 상층액을 버리고 0.05 v/v% tween 20를 넣은 1X 부착 용액(Binding buffer)용액을 100μL/sample만큼 넣고, 부착용액에 박테리아 펠렛을 풀어주어 박테리아 용액을 준비한다.
앞선 설명에서 1시간의 반응이 끝난 비드-압타머 복합체(bead-aptamer complex)를 1mL의 Tris-HCl 용액로 세척한 후 상층액을 버리고 건조시켜 건조된 펠렛으로 만든 후, 거기에 박테리아 1.0×108cell/100μL와 0.05v/v% tween 20가 포합된 1X 부착 용액(Binding buffer)용액 900μL을 넣고 F2 mode, 25rpm, 30분 동안 회전시켜준다.
세척 용액(Washing buffer) 1mL로 3번 각각의 시료를 DynaMagTM-2를 이용하여 세척해준다. 마지막으로 1mL의 Tris-HCl 용액으로 세척을 해준 후, 상층액을 버리고 100μL의 Tris-HCl을 넣고 부유시킨 다음 박테리아에 맞는 고체 배지에 스프레딩(spreading)을 하고, 각 박테리아의 적정 배양온도에서 12 내지 16시간 정도 배양시키고 콜로니(colony)의 개수를 센다.
그 결과 도 10과 도 11, 하기 표 5와 표 6에 나타난 바와 같다.
도 10과 표 5는 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12, Serratia marcescens, Serratia ficaria, Enterobacter mori, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida, Pseudomonas pictorum 및 Sphingomonas trueperi을 포함한 그람 음성 박테리아 그룹에서 본 발명의 실시예 3를 통해 제조된 DNA 압타머인 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)에 대한 결합 친화성 정도를 나타낸 것이고, 도 10과 표 6은 Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae, Enterococcus thailandicus, Lactobacillus cypricasei 및 Listeria grayi을 포함한 그람 양성 박테리아 그룹에서 본 발명의 실시예 4를 통해 제조된 DNA 압타머인 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)에 대한 결합 친화성 정도를 나타낸 것이다.
도 10과 도 11에서 나타낸 친화도 정도는 음성 대조군으로서 N40dA에 대해서 1을 기준으로 하여 상대적인 콜로니 개수(relative colony number)를 비교하였다.
여기서 N40dA는 음성 대조군으로서, 서열번호 1과 같이 염기서열 5' 말단과 3' 말단에 각각 18개의 고정된 뉴클레오티드와 40개의 임의로 정해진 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 DNA에서 임의로 정해진 40개의 뉴클레오티드의 랜덤 서열(random sequence)을 모두 데옥시 아데닌(deoxy adenin)으로 만든 DNA(5'-ATACCAGCTTATTCAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATAGTAAGTGCAATCT-3'; 서열번호 17)로 구성된 DNA 압타머이다.
하기 표 5와 표 6에서 나타낸 기호는 상대적인 콜로니 개수를 나타낸 것으로 '-'는 <1, 1≤'-/+'<2, 2≤'+'<3, 3≤'++'<4, 4'≤'+++'<6, '++++'는 >6을 나타낸다.
박테리아 균주명 GN19 GN6 GN12
Escherichia coli DH5a ++(3.91) ++++(7.5) ++++(6.75)
Escherichia coli K12 +(2.44) -/+(1.69) -/+(1.28)
Serratia marcescens ++(3.76) -(0.95) -/+(1.80)
Serratia ficaria -/+(1.78) -/+(1.65) -/+(1.83)
Enterobacter mori +++(5.31) ++++(6.43) +++(5.0)
Enterobacter aerogenes -/+(1.03) -(0.48) -(0.38)
Enterobacter cloacae -/+(1.50) -/+(1.96) -/+(1.84)
Pseudomonas putida +++(5.00) ++++(6.43) +++(5.00)
Pseudomonas pictorum +(2.67) +(2.33) +++(5.67)
Sphingomonas trueperi ++(3.49) +(2.50) +(2.63)
박테리아 균주명 GP11 GP24 GP26
Bacillus subtilis +(2.38) +(2.42) -(0.54)
Staphylococcus epidermidis +(2.44) -/+(1.95) +(2.26)
Staphylococcus pasteuri ++++(10.77) ++++(6.56) ++++(19.26)
Enterococcus camelliae ++++(8.19) +++(5.31) ++++(18.58)
Enterococcus thailandicus +++(5.01) ++(3.10) ++++(9.53)
Lactobacillus cypricasei -(0.93) -/+(1.59) -/+(1.97)
Listeria grayi +(2.42) -(0.87) -/+(1.70)
그 결과, 앞서 설명한 바와 같이 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)들은 Escherichia coli DH5a, Enterobacter mori, Pseudomonas putida의 균주에서 가장 높은 친화력을 나타내며, 특히 Toggle-Cell-SELEX 방법에 이용된 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12, Serratia marcescens, 뿐만 아니라 Enterobacter mori, Pseudomonas putida, Pseudomonas pictorum 및 Sphingomonas trueperi의 그람 음성 박테리아에서도 음성 대조군 대비 상대적으로 높은 친화력을 보임을 알 수 있었다.
또한, 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)들은 Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae, Enterococcus thailandicus의 균주에서 가장 높은 친화력을 나타내며, 특히 Toggle-Cell-SELEX 방법에 이용된 Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 뿐만 아니라 Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae 및 Enterococcus thailandicus의 그람 양성 박테리아에서도 음성 대조군과 비교하여 상대적으로 높은 친화력을 보임을 알 수 있었다.
도 12는 그람 양성 박테리아 압타머(GP aptamer)와 그람 음성 박테리아로 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12, Enterobacter mori에 대한 결합 친화성 정도를 나타낸 교차 실험(cross-experiment) 결과로, 도시된 바와 같이 상기 도 10에서 그람 음성 박테리아 압타머(GN aptamer)를 이용하여 Escherichia coli DH5a, Escherichia coli K12, Enterobacter mori와 결합한 경우보다 상대적으로 현저히 낮은 친화력을 보임을 확인할 수 있었다.
이는 본 발명의 DNA 압타머인 그람 양성 박테리아 압타머 또는 그람 음성 박테리아 압타머는 Toggle-Cell-SELEX과정에서 사용된 박테리아와 더불어 각각의 DNA 압타머를 또 다른 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 추가적으로 결합시켰을 때에도 해당하는 박테리아 그룹에서 상대적으로 높은 친화력으로 결합할 수 있으며, 또한 이와 같은 DNA 압타머가 해당하는 박테리아 그룹이 아닌 다른 그룹의 박테리아와는 특이적으로 결합하지 않으므로, 각 해당 그룹 내의 박테리아만 광범위하게 특이적으로 결합하고 높은 결합력을 가짐을 확인하였다.
상기 실시예를 통해 살펴본 본 발명의 DNA 압타머와 결합하는 박테리아들은 직접 병원성을 나타내거나, 아니면 병원성은 낮으나 기회 감염으로 병을 일으킬 수 있는 균(opportunistic pathogens)이므로, 본 발명의 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하여 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아 그룹 내에 포함되는 광범위한 병원성 박테라아에 대해 신속하게 검출하는 바이오센서로 제품화되어 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하여, 병원성 박테리아에 의해 유발되거나 이것이 원인이 되는 감염질환을 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있는 항균용 조성물로 적용될 수 있으므로, 병원성 박테리아의 감염질환 예 방 및 처치에 크게 기여할 수 있다.
상기 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO GRAM POSITIVE OR GRAM NEGATIVE BACTERIA AND USE THEREOF <130> AD150195 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptimer sequence <400> 1 ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence(N40) of GN6 <400> 2 gggtgagggg gggttcacaa cgttaaagat agacggggga 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence(N40) of GN12 <400> 3 ccgagtccag actcaccgcc gcctcctcaa gacgtgctgg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence(N40) of GN19 <400> 4 cgtcgataat ggccatgaac ccaattgttt aacgtgagtc 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence(N40) of GP11 <400> 5 gcaataccgg cattagtatg ttcgacgagt tgaccctgcg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence(N40) of GP24 <400> 6 gcgaagtact gtatggccgc tacccagtta tatgcatgtg 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence(N40) of GP26 <400> 7 ccaacgaccg cccattaccc agactatact ggcttcatcg 40 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GN6 <400> 8 ataccagctt attcaattgg gtgagggggg gttcacaacg ttaaagatag acgggggaag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 9 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GN12 <400> 9 ataccagctt attcaattcc gagtccagac tcaccgccgc ctcctcaaga cgtgctggag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GN19 <400> 10 ataccagctt attcaattcg tcgataatgg ccatgaaccc aattgtttaa cgtgagtcag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP11 <400> 11 ataccagctt attcaattgc aataccggca ttagtatgtt cgacgagttg accctgcgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP24 <400> 12 ataccagctt attcaattgc gaagtactgt atggccgcta cccagttata tgcatgtgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 13 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP26 <400> 13 ataccagctt attcaattcc aacgaccgcc cattacccag actatactgg cttcatcgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N40 upstream primer <400> 14 agattgcact tactatct 18 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyA-tailed downstream primer <400> 15 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ssagattgca cttactatct 40 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy3-up primer <400> 16 agattgcact tactatct 18 <210> 17 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N40dA <400> 17 ataccagctt attcaattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag 60 atagtaagtg caatct 76

Claims (4)

  1. Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus thermophilus, Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae 및 Enterococcus thailandicus으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 DNA 압타머.
  2. 제1항의 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하여, 병원성 미생물에 의해 유발되거나 이것이 원인이 되는 감염질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 병원성 미생물은 Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus thermophilus, Staphylococcus pasteuri, Enterococcus camelliae 및 Enterococcus thailandicus 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 균인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  4. 제1항의 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
KR1020170061224A 2017-05-17 2017-05-17 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 KR101836042B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170061224A KR101836042B1 (ko) 2017-05-17 2017-05-17 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170061224A KR101836042B1 (ko) 2017-05-17 2017-05-17 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160022058A Division KR101835955B1 (ko) 2016-02-24 2016-02-24 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170099804A true KR20170099804A (ko) 2017-09-01
KR101836042B1 KR101836042B1 (ko) 2018-03-08

Family

ID=59923929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170061224A KR101836042B1 (ko) 2017-05-17 2017-05-17 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101836042B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143732A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 特异性识别N-cadherin的ssDNA适配体、其筛选方法及应用
EP3872959A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 LG Electronics Inc. Wireless power transmission apparatus for induction heating and control method thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143732A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 特异性识别N-cadherin的ssDNA适配体、其筛选方法及应用
EP3872959A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 LG Electronics Inc. Wireless power transmission apparatus for induction heating and control method thereof
KR20210109250A (ko) 2020-02-27 2021-09-06 엘지전자 주식회사 유도 가열 구현 가능한 무선 전력 전송 장치 및 그의 제어 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101836042B1 (ko) 2018-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shields et al. Efficacy of a marine bacterial nuclease against biofilm forming microorganisms isolated from chronic rhinosinusitis
DE102007041864B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen
Leshem et al. Incidence of biofilm formation among MRSA and MSSA clinical isolates from hospitalized patients in Israel
CN116042902A (zh) 一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
KR101836042B1 (ko) 그람 양성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도
JP2020516271A (ja) Ｉｌｖ３を使用した微生物の検出及び設計
KR101891406B1 (ko) 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
JP4241929B2 (ja) Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための組成物および方法
KR101835955B1 (ko) 그람 음성 박테리아에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도
JP3194943B2 (ja) クリプトコックス・ネオホルマンスの検出に用いる核酸プローブおよび方法
KR101152354B1 (ko) 탄저 독소 단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머와 이의 용도
Roudbary et al. Relation of ALS 1 and ALS3 genes and fluconazole resistance in Candida albicans isolated from vaginal candidacies
PL228161B1 (pl) Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR
EP1644526B1 (fr) Procede de detection et/ou d identification de bacteries de genre staphylococcus
CN114561393B (zh) 一种特异性识别鸟-胞内分枝杆菌复合群的dna适配子及其筛选方法和应用
JP2005110545A (ja) 呼吸器感染症起因菌の迅速検出法およびそのキット
JP5621992B2 (ja) カンジダ種を検出および同定するための方法
JP2004201636A (ja) 病原真菌遺伝子の検出方法及び真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド
Al-Fanharawi et al. The Role Of OprD Gene In The Carbapenems Resistance In Pseudomonas Aeruginosa Isolated From Burns Infection In Al-Najaf Province
Abuljadayel GENOMIC STUDIES AND DIVERSITY PROFILING OF INTESTINE ENTAMOEBA PARASITE IN MAKKAH REGION
Tan et al. Synthetic Peptide Nucleic Acids in Action: In Vivo Interference of the groEL Gene from Pea Aphid Endosymbiont Buchnera aphidicola
Lay Optimalizace izolace RNA z kvasinek pro následné transkripční analýzy
Al-Mohammed et al. Carbapenem Resistance Related with Phenazine Genes in Clinical Pseudomonas aeruginosa Isolates
JP4534294B2 (ja) ベロ毒素遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法
JP2023517464A (ja) 微生物を検出するためのマルチプレックスｐｃｒ方法およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right