KR20170097078A - 고암모니아혈증과 관련된 질병을 치료하기 위해 공학처리된 박테리아 - Google Patents

고암모니아혈증과 관련된 질병을 치료하기 위해 공학처리된 박테리아 Download PDF

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Abstract

유전적으로 공학처리된 박테리아, 이의 약학적 조성물, 및 고암모니아혈증과 관련된 질병을 조절하고 치료하는 방법이 기재된다.

Description

고암모니아혈증과 관련된 질병을 치료하기 위해 공학처리된 박테리아{BACTERIA ENGINEERED TO TREAT DISEASES ASSOCIATED WITH HYPERAMMONEMIA}
본 출원은 2014년 12월 5일 출원된 미국 가특허 출원 62/087,854호; 2015년 6월 10일 출원된 미국 가특허 출원 62/173,706호; 2015년 11월 16일 출원된 미국 가특허 출원 62/256,041호; 2015년 1월 14일 출원된 미국 가특허 출원 62/103,513호; 2015년 4월 21일 출원된 미국 가특허 출원 62/150,508호; 2015년 6월 10일 출원된 미국 가특허 출원 62/173,710호; 2015년 11월 16일 출원된 미국 가특허 출원 62/256,039호; 2015년 6월 25일 출원된 미국 가특허 출원 62/184,811호; 2015년 6월 24일 출원된 미국 가특허 출원 62/183,935호; 및 2015년 12월 4일 출원된 미국 가특허 출원 62/263,329호의 이익을 주장하고, 이들은 설명의 연속성을 제공하기 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 과도한 암모니아를 감소시키고 암모니아 및/또는 질소를 대안적인 부산물로 전환시키기 위한 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은, 특히 저산소 조건에서, 예컨대 포유동물의 장에서 과도한 암모니아를 감소시킬 수 있는 유전적으로 공학처리된 박테리아에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 고암모니아혈증과 관련된 질병, 예컨대, 우레아 회로 질환 및 간 뇌병증을 조절하거나 치료하는데 이용될 수 있다.
암모니아는 매우 독성이고 모든 기관에서 대사 동안 생성된다(Walker, 2012). 고암모니아혈증은 감소된 탈독화 및/또는 증가된 암모니아 생산에 의해 야기된다. 포유동물에서, 우레아 회로는 암모니아를 우레아로 효소적으로 전환시킴에 의해 암모니아를 탈독화시키고, 그 후 소변으로 제거한다. 감소된 암모니아 탈독화는 우레아 회로 효소에 결함이 있는 우레아 회로 질환(UCD), 예컨대 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바모일포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 및 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍에 의해 초래될 수 있다(Haberle et al., 2012). 국립 우레아 회로 질환 재단은 UCD의 유병율을 8,500명의 출생 중 1명으로 추산한다. 또한, 여러 비-UCD 질병, 예컨대 간 뇌병증, 문맥전신 션트, 및 유기산 질환도 고암모니아혈증을 일으킬 수 있다. 고암모니아혈증은 신경학적 징후, 예컨대, 발작, 실조, 뇌졸중-유사 병변, 혼수, 정신병, 시력 상실, 급성 뇌병증, 뇌 부종, 뿐만 아니라 구토, 호흡성 알칼리혈증, 저체온증, 또는 사망을 가져올 수 있다(Haberle et al., 2012; Haberle et al., 2013).
암모니아는 또한 다양한 생합성 경로에 의해 합성되는 아미노산에 대한 질소 공급원이다. 예를 들어, 아르기닌 생합성은 한 질소 원자를 포함하는 글루타메이트를 4개의 질소 원자를 포함하는 아르기닌으로 전환시킨다. 아르기닌 생합성 경로에서 형성된 중간 대사산물, 예컨대 시트룰린도 질소를 포함한다. 따라서, 아르기닌 생합성의 향상은 신체의 과도한 질소를 무독성 분자에 혼입시켜 고암모니아혈증과 관련된 병태를 조절하거나 치료하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 히스티딘 생합성, 메티오닌 생합성, 리신 생합성, 아스파라긴 생합성, 글루타민 생합성, 및 트립토판 생합성도 과도한 질소를 혼입시킬 수 있고, 그러한 경로의 향상을 이용하여 고암모니아혈증과 관련된 병태를 조절하거나 치료할 수 있다.
고암모니아혈증 및 UCD에 대한 현행 요법은 암모니아 과잉을 줄이는 것을 목표로 하지만, 차선책으로 널리 간주된다(Nagamani et al., 2012; Hoffmann et al., 2013; Torres-Vega et al., 2014). 대부분의 UCD 환자는 단백질 제한으로 구성된 실질적으로 변형된 식이를 필요로 한다. 그러나, 저-단백질 식이는 신중하게 모니터되어야 한다; 단백질 섭취가 지나치게 제한적일 때, 몸은 근육을 분해하여 결과적으로 암모니아를 생산한다. 또한, 많은 환자는 암모니아 제거 약물, 예컨대 소듐 페닐부티레이트, 소듐 벤조에이트, 및 글리세롤 페닐부티레이트의 보충을 필요로 하고, 이러한 약물 중 하나 이상은 하루에 3 내지 4회 투여되어야 한다(Leonard, 2006; Diaz et al., 2013). 이러한 약물의 부작용은 구역, 구토, 과민성, 식욕부진, 및 여성에서 월경 장애를 포함한다(Leonard, 2006). 소아에서, 음식 및 약물의 전달은 위에 외과적으로 이식된 위루형성술 튜브 또는 코를 통해 위 내로 수동으로 삽입된 코위 튜브를 필요로 할 수 있다. 이러한 치료 옵션이 실패하면, 간 이식이 필요할 수 있다(국립 우레아 회로 질환 재단). 따라서, 우레아 회로 질환을 포함하는 고암모니아혈증과 관련된 질병에 대한 효과적이고, 신뢰할만하며, 및/또는 장기적인 치료에 대한 충족되지 않은 현저한 요구가 있다.
본 발명은 과도한 암모니아를 감소시키고 암모니아 및/또는 질소를 대안적인 부산물로 전환시킬 수 있는 유전적으로 공학처리된 박테리아를 제공한다. 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 과도한 암모니아를 감소시키고 저산소 환경, 예컨대 장에서 선택적으로 암모니아 및/또는 질소를 대안적인 부산물로 전환시킨다. 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 비병원성이고 독성 암모니아를 감소시키기 위해 장으로 도입될 수 있다. 고암모니아혈증 환자에서 과도한 암모니아의 70% 정도는 위장관에 축적된다. 본 발명의 또 다른 양태는 암모니아의 증가된 수준 및/또는 질소 소비, 또는 무독성 부산물, 예컨대, 아르기닌 또는 시트룰린의 생산에 기반하여 유전적으로 공학처리된 박테리아를 선택하거나 표적화하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 유전적으로 공학처리된 박테리아를 포함하는 약학적 조성물, 및 고암모니아혈증과 관련된 질병, 예컨대, 우레아 회로 질환 및 간 뇌병증을 조절하고 치료하는 방법을 제공한다.
도 1a 및 1b는 비유도성(도 1a) 및 유도성(도 1b) 조건 하에 본 발명의 ArgR 결실 박테리아의 한 구체예에서 아르기닌 레굴론의 상태를 묘사한다. 도 1a는 ArgA 활성을 억제하기 위해("X"로 표시됨) ArgA(스퀴글
Figure pct00001
)와 상호작용하는 아르기닌(타원형 안의 "Arg")으로 인한 호기성 조건 하에 비교적 낮은 아르기닌 생산을 묘사하며, 그 동안 산소(O2)는 FNR(점으로 된 박스 안의 FNR)이 FNR 프로모터(회색 FNR 박스) 및 argAfbr 유전자를 이의 제어 하에 이합체화하고 활성화시키는 것을 막는다("X"로 표시됨). 도 1b는 아르기닌에 의한 억제에 저항성인, FNR 이합체화(2개의 점으로 된 박스 안의 FNR) 및 ArgAfbr의 유도성 FNR 프로모터(회색 FNR 박스)-매개된 발현(argAfbr 위의 스퀴글
Figure pct00002
)으로 인한 혐기성 조건 하에 상향-조절된 아르기닌 생산을 묘사한다. 이는 ArgA(argA를 묘사하는 박스 위의 스퀴글
Figure pct00003
)와 상호작용하는 아르기닌(타원형 안의 "Arg")에 의해 초래된 야생형 ArgA의 억제를 극복한다(곡선 화살표). 아르기닌 레굴론의 각 유전자는 유전자 명칭을 함유하는 직사각형으로 묘사된다. 직사각형 중 하나 또는 무리에 인접한 각 화살표는, 화살표 방향으로, 그러한 유전자(들)의 전사의 유도를 담당하는 프로모터를 묘사한다. 하나 또는 일련의 직사각형에 인접한 더 두꺼운 선은 ArgR 결합 부위를 묘사하며, 이는 이러한 박테리아의 argR 결실 때문에 활용되지 않는다. 각 직사각형 위의 화살표는 각 유전자의 발현 생성물을 묘사한다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 대안적인 예시적인 구체예를 묘사한다. 도 2a는 호기성 조건 하에, 산소의 존재 하에, FNR 단백질(FNR 박스)이 단량체로서 남아 있고 아르기닌 피드백 내성 argAfbr 유전자의 발현을 유도하는 FNR 프로모터("FNR")에 결합하여 이를 활성화시킬 수 없는 구체예를 묘사한다. 야생형 ArgA 단백질은 기능성이지만, 아르기닌에 대한 결합에 의해 음성 피드백 억제를 받기 쉬우므로, 아르기닌 수준을 정상 또는 그 미만으로 유지한다. 각 아르기닌 생합성 유전자(argA, argE, argC, argB, argH, argD, argI, argG, carA, 및 carB)의 프로모터 영역에서 모든 아르기닌 억제인자(ArgR) 결합 부위는 ArgR에 대한 결합을 감소시키거나 제거하도록 돌연변이되었다(검정색 막대; 검정색 "X"). 도 2b는 혐기성 조건 하에, 산소의 부재 하에, FNR 단백질(FNR 박스)이 이합체화되고 FNR 프로모터("FNR")에 결합하여 이를 활성화시키는 동일한 구체예를 묘사한다. 이는 아르기닌(타원형 안의 "Arg")에 의한 피드백 억제에 저항성인, 아르기닌 피드백 내성 argAfbr 유전자(검정색 스퀴글(
Figure pct00004
)=argAfbr 유전자 발현 생성물)의 발현을 유도시킨다. 각 아르기닌 생합성 유전자(argA, argE, argC, argB, argH, argD, argI, argG, carA, 및 carB)의 프로모터 영역에서 모든 아르기닌 억제인자(ArgR) 결합 부위는 ArgR에 대한 결합을 감소시키거나 제거하도록(검정색 "X") 돌연변이되어(검정색 막대), 이에 따라 아르기닌-ArgR 복합체에 의한 억제를 방지한다. 이는 아르기닌의 높은 수준 생산을 가능하게 한다. 도 1a 및 1b에서 아르기닌 생합성 유전자의 편성은 E. 콜라이 균주 Nissle에서 발견된 것이 대표적이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 구체예를 묘사한다. 이러한 구체예에서, tetR 유전자로부터 Tet 억제인자(TetR)의 발현을 유도시키는 프로모터에 ArgR 결합 부위(검정색 막대)를 포함하는 작제물은 유전자 X의 발현을 유도시키는 TetR 결합 부위(TetR과 X 사이의 검정색 막대)를 포함하는 제2 프로모터에 연결된다. 낮은 아르기닌 농도 하에, TetR이 발현되어 유전자 X의 발현을 억제한다. 높은 아르기닌 농도에서, ArgR은 아르기닌과 회합하고 argR 결합 부위에 결합하여, tetR 유전자로부터 TetR의 발현을 억제한다. 이는, 결국, TetR에 의한 억제를 제거하여 유전자 X 발현을 허용한다(검정색 스퀴글(
Figure pct00005
)).
도 4는 본 발명의 또 다른 구체예를 묘사한다. 이러한 구체예에서, tetR 유전자로부터 Tet 억제인자(TetR)의 발현을 유도시키는 프로모터에 ArgR 결합 부위 (검정색 막대)를 포함하는 작제물은 그린 형광 단백질("GFP")의 발현을 유도시키는 TetR 결합 부위(타원형 TetR에 결합된 검정색 막대)를 포함하는 제2 프로모터에 연결된다. 낮은 아르기닌 농도 하에, TetR이 발현되어 GFP의 발현을 억제한다. 높은 아르기닌 농도에서, ArgR은 아르기닌과 회합하고 ArgR 결합 부위에 결합하여, tetR 유전자로부터 TetR의 발현을 억제한다. 이는, 결국, TetR에 의한 억제를 제거하여 GFP 발현을 허용한다. 이러한 작제물을 함유하는 숙주를 돌연변이시킴에 의해, GFP 발현을 기초로 하여 형광-활성화 세포 분류("FACS")를 이용하여 높은 아르기닌 생산자가 선택될 수 있다.
도 5는 본 발명의 또 다른 구체예를 묘사한다. 이러한 구체예에서, tetR 유전자로부터 Tet 억제인자(도시되지 않음)의 발현을 유도시키는 프로모터에 ArgR 결합 부위(ArgR-Arg 복합체에 결합된 검정색 막대)를 포함하는 작제물은 숙주 생존에 필수적인 영양요구성 단백질("AUX")의 발현을 유도시키는 TetR 결합 부위(검정색 막대)를 포함하는 제2 프로모터에 연결된다. 높은 아르기닌 농도 하에, ArgR-아르기닌 복합체는 ArgR 결합 부위에 결합하여, tetR 유전자로부터 TetR의 발현을 억제한다. 이는, 결국, AUX의 발현을 허용하여, 숙주가 생존할 수 있게 한다. 낮은 아르기닌 농도 하에, TetR은 tetR 유전자로부터 발현되고 AUX의 발현을 억제하여, 숙주를 사멸시킨다. 도 5의 작제물은 AUX 발현을 제어함으로써 이를 숙주 세포 생존에 필요하게 만듦으로써 높은 아르기닌("Arg") 생산을 강제한다.
도 6은 E. 콜라이 Nissle의 각 아르기닌 생합성 오페론에 대해 ArgR 결합 부위를 포함하는 야생형 유전체 서열 및 이의 돌연변이체를 묘사한다. 각 야생형 서열에 대해, Arg 박스는 이탤릭체로 표시되고, 각 유전자의 시작 코돈은
Figure pct00006
로 표시된다. RNA 중합효소 결합 부위는 밑줄로 표시된다(Cunin, 1983; Maas, 1994). ArgR 결합 동안 DNA 메틸화로부터 보호된 염기는
Figure pct00007
되고, ArgR 결합 동안 하이드록실 라디칼 공격으로부터 보호된 염기는 굵게 표시된다(Charlier et al., 1992).
Figure pct00008
되고 굵게 표시된 염기는 ArgR 결합을 파괴하기 위한 돌연변이에 대한 주요 표적이다.
도 7은 FNR-반응성 프로모터 서열을 포함하는 예시적인 조절 영역 서열의 핵산 서열을 묘사한다. 밑줄로 표시된 서열은 예상되는 리보솜 결합 부위이고, 굵게 표시된 서열은 클로닝에 이용된 제한 부위이다. FNR 프로모터를 포함하는 예시적인 서열은 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, nirB1 프로모터(SEQ ID NO: 18), nirB2 프로모터(SEQ ID NO: 19), nirB3 프로모터(SEQ ID NO: 20), ydfZ 프로모터(SEQ ID NO: 21), 강력한 리보솜 결합 부위에 융합된 nirB 프로모터(SEQ ID NO: 22), 강력한 리보솜 결합 부위에 융합된 ydfZ 프로모터(SEQ ID NO: 23), fnrS1 (SEQ ID NO: 24) 및 fnrS2 (SEQ ID NO: 25)로부터 선택되는 혐기적으로 유도된 작은 RNA 유전자 fnrS 프로모터, CRP 결합 부위에 융합된 nirB 프로모터(SEQ ID NO: 26), 및 CRP 결합 부위에 융합된 fnrS 프로모터(SEQ ID NO: 27)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
도 8a는 예시적인 argAfbr 서열의 핵산 서열을 묘사한다. 도 8b는 예시적인 FNR 프로모터-유도된 argAfbr 플라스미드의 핵산 서열을 묘사한다. FNR 프로모터 서열은 굵게 표시되고, argAfbr 서열은
Figure pct00009
로 표시된다.
도 9는 예시적인 FNR 프로모터-유도된 argAfbr 서열의 핵산 서열을 묘사한다. FNR 프로모터 서열은 굵게 표시되고, 리보솜 결합 부위는
Figure pct00010
되며, argAfbr 서열은
Figure pct00011
로 표시된다.
도 10은 강력한 리보솜 결합 부위에 융합된 예시적인 FNR 프로모터(fnrS)의 제어 하에 argAfbr 유전자의 개략도를 묘사한다.
도 11은 강력한 리보솜 결합 부위에 융합된 예시적인 FNR 프로모터(nirB)의 제어 하에 argAfbr 유전자의 또 다른 개략도를 묘사한다. 다른 조절성 요소가 또한 존재할 수 있다.
도 12는 약한 리보솜 결합 부위에 융합된 예시적인 FNR 프로모터(nirB)의 제어 하에 argAfbr 유전자의 개략도를 묘사한다.
도 13a 및 13b는 CRP 결합 부위에 융합된 FNR-반응성 프로모터의 예시적인 구체예를 묘사한다. 도 13a는 굵게 도시된 제한 부위를 갖는, FNR-CRP 프로모터 영역의 맵을 묘사한다. 도 13b는 CRP 결합 부위 및 리보솜 결합 부위 둘 모두에 융합된, 예시적인 FNR 프로모터(nirB 프로모터)의 제어 하에 argAfbr 유전자의 개략도를 묘사한다. 다른 조절성 요소가 또한 존재할 수 있다.
도 14a 및 14b는 CRP 결합 부위에 융합된 FNR-반응성 프로모터의 대안적인 예시적인 구체예를 묘사한다. 도 14a는 굵게 도시된 제한 부위를 갖는, FNR-CRP 프로모터 영역의 맵을 묘사한다. 도 14b는 CRP 결합 부위 및 리보솜 결합 부위 둘 모두에 융합된, 예시적인 FNR 프로모터(fnrS 프로모터)의 제어 하에 argAfbr 유전자의 개략도를 묘사한다.
도 15는 E. 콜라이 Nissle에서 조절 영역의 야생형 유전체 서열 및 argG 유전자의 5' 부분, 및 이의 항시적 돌연변이체를 묘사한다. 각 서열의 프로모터 영역은 밑줄로 표시되고, argG 유전자의 5' 부분은
Figure pct00012
로 표시된다. 야생형 서열에서, ArgR 결합 부위는 대문자이고 밑줄로 표시된다. 돌연변이체 서열, 5' 비번역된 영역은 대문자이고 밑줄로 표시된다. 항시적 프로모터의 제어 하에 argG를 발현시키는 박테리아는 아르기닌을 생산할 수 있다. 야생형, ArgR-억제성 프로모터의 제어 하에 argG를 발현시키는 박테리아는 시트룰린을 생산할 수 있다.
도 16은 E. 콜라이 Nissle에서 항시적으로 발현되는 argG 작제물의 예시적인 구체예를 묘사한다. 항시적 프로모터는 회색 박스 안에 있는 BBa_J23100이다. 클로닝에 사용하기 위한 제한 부위는 굵게 표시된다.
도 17은 야생형 argG 오페론 E. 콜라이 Nissle, 및 이의 항시적으로 발현되는 돌연변이체의 맵을 묘사한다. ARG 박스는 야생형 오페론에는 존재하지만, 돌연변이체에는 부재한다. ArgG는 BBa_J23100 프로모터의 제어 하에 항시적으로 발현된다.
도 18은 예시적인 BAD 프로모터-유도된 argAfbr 작제물의 핵산 서열을 묘사한다. 굵게 표시된 모든 서열은 Nissle 유전체 DNA이다. araC 유전자의 부분은 굵게 밑줄로 표시되고, argAfbr 유전자는
Figure pct00013
로 표시되고, 그 사이의 굵게 표시된 서열은 아라비노스의 존재에 의해 활성화되는 프로모터이다. 리보솜 결합 부위는 이탤릭체로 표시되고, 종료인자 서열은
Figure pct00014
되고, FRT 부위는 박스 안에 있다. araD 유전자의 부분은 점선으로 된 로 표시된다.
도 19는 예시적인 BAD 프로모터-유도된 argAfbr 작제물의 개략도를 묘사한다. 이러한 구체예에서, argAfbr 유전자는 araC 및 araD 유전자 사이에 삽입된다. ArgAfbr은 리보솜 결합 부위, FRT 부위, 및 하나 이상의 전사 종료인자 서열의 측면에 있다.
도 20은 pSC101 플라스미드의 맵을 묘사한다. 제한 부위는 굵게 도시된다.
도 21a는 pSC101 플라스미드의 핵산 서열을 묘사한다. 도 21b는 fnrS 프로모터-유도된 argAfbr pSC101 플라스미드의 뉴클레오티드 서열을 묘사한다. argAfbr 서열은 박스 안에 있고, 리보솜 결합 부위는 강조 표시되고, fnrS 프로모터는 대문자로 굵게 표시된다.
도 22는 E. 콜라이 1917 Nissle 염색체 내의 예시적인 통합 부위의 맵을 묘사한다. 이러한 부위는 회로 구성요소가 필수 유전자 발현을 방해하지 않고 염색체 내에 삽입될 수 있는 영역을 나타낸다. 역 슬래시(/)는 삽입이 발산적 또는 수렴적으로 발현된 유전자 사이에서 일어날 것임을 보여주기 위해 사용된다. 영양소 영양요구성을 생성하기 위해 thyA와 같은 생합성 유전자 내 삽입이 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 개개의 회로 구성요소는 하나를 초과하는 지시된 부위에 삽입된다.
도 23은 레드 형광 단백질(RFP)을 항시적으로 발현시키는 3개의 박테리아의 균주를 묘사한다. 균주 1-3에서, rfp 유전자는 박테리아의 염색체 내 상이한 부위에 삽입되었고, 형광 하에 다양한 밝기 정도를 발생시킨다. 변형되지 않은 E. 콜라이 Nissle(균주 4)은 비형광성이다.
도 24는 유도성(+ATC) 및 비유도성(-ATC) 조건 하에 스트렙토마이신-내성 대조군 Nissle(SYN-UCD103), SYN-UCD201, SYN-UCD202, 및 SYN-UCD203에 의해 생산된 시험관내 아르기닌 수준의 막대 그래프를 묘사한다. SYN-UCD201은 ΔArgR을 포함하고 argAfbr을 포함하지 않는다. SYN-UCD202는 고-복사체 플라스미드 상에 ΔArgR 및 테트라사이클린-유도성 argAfbr을 포함한다. SYN-UCD203은 저-복사체 플라스미드 상에 ΔArgR 및 테트라사이클린-유도된 argAfbr을 포함한다.
도 25는 유도성 조건 하에 스트렙토마이신-내성 대조군 Nissle(SYN-UCD103), SYN-UCD104, SYN-UCD204, 및 SYN-UCD105에 의해 생산된 아르기닌 및 시트룰린의 시험관내 수준의 막대 그래프를 묘사한다. SYN-UCD104는 야생형 ArgR, 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 argAfbr, 테트라사이클린-유도성 argG, 및 argG를 제외한 각 아르기닌 생합성 오페론에 대해 각 ARG 박스에 돌연변이를 포함한다. SYN-UCD204는 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 발현된 argAfbr 및 ΔArgR을 포함한다. SYN-UCD105는 야생형 ArgR, 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 argAfbr, 항시적으로 발현되는 argG(BBa_J23100 항시적 프로모터), 및 argG를 제외한 각 아르기닌 생합성 오페론에 대해 각 ARG 박스에 돌연변이를 포함한다.
도 26은 유도성(+ATC) 및 비유도성(-ATC) 조건 하에, 산소의 존재(+O2) 또는 부재(-O2) 하에 스트렙토마이신-내성 Nissle(SYN-UCD103), SYN-UCD205, 및 SYN-UCD204에 의해 생산된 시험관내 아르기닌 수준의 막대 그래프를 묘사한다. SYN-UCD103은 대조군 Nissle 작제물이다. SYN-UCD205는 저-복사체 플라스미드 상에 FNR-유도성 프로모터(fnrS2)의 제어 하에 발현된 argAfbr 및 ΔArgR을 포함한다. SYN204는 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 발현된 argAfbr 및 ΔArgR을 포함한다.
도 27은 생체내 Nissle 체류의 그래프를 묘사한다. 스트렙토마이신-내성 Nissle은 항생제 전처리 없이 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여되었다. 총 6마리의 마우스로부터의 대변 펠렛을 투여 후 모니터하여 마우스의 위장관 내에 여전히 존재하는 투여된 Nissle의 양을 결정하였다. 막대는 마우스에 투여된 박테리아의 수를 나타낸다. 선은 연속 10일 동안 매일 대변 샘플로부터 회수된 Nissle의 수를 나타낸다.
도 28a, 28b, 및 28c는 고암모니아혈증 TAA 마우스에서 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한다. 도 28a는 변형되지 않은 대조군 Nissle, 또는 Arg 억제인자 유전자가 결실되고 argAfbr 유전자가 고-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전적으로 공학처리된 균주인 SYN-UCD202로 처리된 고암모니아혈증 마우스에서 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한다. 총 96마리의 마우스가 시험되었고, 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 4일 및 5일에 SYN-UCD202로 처리된 마우스의 암모니아 수준은 변형되지 않은 대조군 Nissle로 처리된 마우스의 암모니아 수준보다 낮았다. 도 28b는 스트렙토마이신-내성 대조군 Nissle (SYN-UCD103) 및 비히클-단독 대조군에 비해, 간 뇌병증의 TAA 마우스 모델에서 SYN-UCD204의 생체내 효능(암모니아 소비)를 보여주는 막대 그래프를 묘사한다. 도 28c는 TAA 처리한지 24-48시간 후에 혈중 암모니아 농도의 변화 퍼센트의 막대 그래프를 묘사한다.
도 29는 고암모니아혈증 spfash 마우스에서 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한다. 56마리의 spfash 마우스를 4개 그룹으로 분리시켰다. 그룹 1에 표준 사료를 공급하였고, 그룹 2-4에 초기 채혈 후 70% 단백질 사료를 공급하였다. 그룹들은 물, 스트렙토마이신-내성 Nissle 대조군(SYN-UCD103), 또는 SYN-UCD204로 매일 2회 위관영양공급되었고, 처음 위관영양한지 4시간 후에 채혈하였다. 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 발현된 argAfbr 및 ΔArgR을 포함하는 SYN-UCD204는 혈중 암모니아를 고암모니아혈증 임계 미만의 수준으로 현저하게 감소시켰다.
도 30은 우레아 회로 효소의 예시적인 도식을 묘사한다.
도 31은 암모니아 소비 동역학 및 투약의 차트를 묘사한다. 이러한 정보를 이용하여 UCD 환자에서 치료적으로 적절한 양의 암모니아를 흡수하기 위해 생산되어야 할 아르기닌의 양을 결정할 수 있다. 유사한 계산이 시트룰린 생산을 위해 수행될 수 있다.
도 32는 암모니아의 요망되는 생성물, 예컨대 시트룰린 또는 아르기닌으로의 전환을 통해, UCD 및 고암모니아혈증을 특징으로 하는 질병을 치료하기 위한 합성 유전자 회로의 예시적인 도식을 묘사한다.
도 33a 및 33b는 양성 피드백 영양요구균주를 생산하고 높은 아르기닌 생산을 위해 선택하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 작제물의 다이아그램을 묘사한다. 도 33a는 thyA의 발현을 유도하는 astC 프로모터의 맵을 묘사한다. 도 33b는 astC 프로모터의 제어 하에 thyA 유전자의 개략도를 묘사한다. 조절 영역은 CRP에 대한 결합 부위, ArgR, 및 RNA 중합효소(RNAP)를 포함하고, 추가적인 조절성 요소도 포함할 수 있다.
도 34는 영양요구성 균주를 생산하기 위해 파괴되거나 결실될 수 있는 예시적인 박테리아의 유전자의 표를 묘사한다. 이에는 비제한적으로 올리고뉴클레오티드 합성, 아미노산 합성, 및 세포벽 합성을 위해 요구되는 유전자가 표함된다.
도 35는 위관영양 후 24시간 및 48시간에 검출된, 마우스 장에서 다양한 아미노산 영양요구균주의 생존을 예시하는 표를 묘사한다. 이러한 영양요구균주는 E. 콜라이의 비-Nissle 균주인 BW25113을 이용하여 생성되었다.
도 36은 외인성 환경 조건 또는 하나 이상의 환경 신호가 유도성 프로모터 또는 유도성 프로모터들로부터 이종성 유전자 및 적어도 하나의 재조합효소의 발현을 활성화시키는 본 발명의 한 비제한적인 구체예를 묘사한다. 그 후 재조합효소는 독소 유전자를 활성화된 입체형태로 플립핑시키고, 재조합효소의 자연 동역학은 독소의 발현에 시간 지연을 일으켜, 이종성 유전자가 충분히 발현되게 한다. 일단 독소가 발현되면, 이는 세포를 사멸시킨다.
도 37은 외인성 환경 조건 또는 하나 이상의 환경 신호가 유도성 프로모터 또는 유도성 프로모터들로부터 이종성 유전자, 항-독소, 및 적어도 하나의 재조합효소의 발현을 활성화시키는 본 발명의 또 다른 비제한적인 구체예를 묘사한다. 그 후 재조합효소는 독소 유전자를 활성화된 입체형태로 플립핑시키지만, 축적된 항-독소의 존재는 독소의 활성을 억제한다. 외인성 환경 조건 또는 신호(들)가 더 이상 존재하지 않으면, 항-독소의 발현은 꺼진다. 독소는 항시적으로 발현되고, 계속하여 축적되며, 박테리아의 세포를 사멸시킨다.
도 38은 외인성 환경 조건 또는 하나 이상의 환경 신호가 유도성 프로모터 또는 유도성 프로모터들로부터 이종성 유전자 및 적어도 하나의 재조합효소의 발현을 활성화시키는 본 발명의 또 다른 비제한적인 구체예를 묘사한다. 그 후 재조합효소는 적어도 하나의 절제 효소를 활성화된 입체형태로 플립핑시킨다. 그 후 적어도 하나의 절제 효소는 하나 이상의 필수 유전자를 절제하여, 노화, 및 궁극적인 세포 사멸을 발생시킨다. 재조합효소 및 절제 유전자의 자연 동역학은 시간 지연을 초래하는데, 그 동역학은 절제되는 필수 유전자의 수 및 선택에 따라 변경되고 최적화되어, 수 시간 또는 수 일 내에 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 다중 중첩된 재조합효소(도 60에 도시된 바와 같음)의 존재를 이용하여 세포 사멸 시점을 추가로 제어할 수 있다.
도 39는 항-독소가 항시적 프로모터로부터 발현되고, 이종성 유전자의 발현이 외인성 환경 신호에 의해 활성화되는 본 발명의 비제한적인 구체예를 묘사한다. 아라비노스의 부재 하에, AraC 전사 인자는 전사를 억제하는 입체형태를 채택한다. 아라비노스의 존재 하에, AraC 전사 인자는 AraBAD 프로모터에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 입체형태 변화를 겪고, 이는 TetR의 발현을 유도하므로, 독소의 발현을 막는다. 그러나, 아라비노스가 존재하지 않을 때, TetR은 발현되지 않고, 독소는 발현되며, 결국 항-독소를 극복하고 세포를 사멸시킨다. 항-독소의 발현을 조절하는 항시적 프로모터는 독소의 발현을 유도시키는 프로모터보다 약한 프로모터여야 한다. AraC는 이러한 회로에서 항시적 프로모터의 제어 하에 있다.
도 40은 이종성 유전자의 발현이 외인성 환경 신호에 의해 활성화되는 본 발명의 또 다른 비제한적인 구체예를 묘사한다. 아라비노스의 부재 하에, AraC 전사 인자는 전사를 억제하는 입체형태를 채택한다. 아라비노스의 존재 하에, AraC 전사 인자는 AraBAD 프로모터에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 입체형태 변화를 겪고, 이는 TetR(tet 억제인자) 및 항-독소의 발현을 유도한다. 항-독소는 재조합체 박테리아의 세포에서 축적되고, 한편 TetR은 독소의 발현을 막는다(TetR 결합 부위를 갖는 프로모터의 제어 하에 있다). 그러나, 아라비노스가 존재하지 않을 때, 항-독소 및 TetR 둘 모두는 발현되지 않는다. TetR이 독소의 발현을 억제하기 위해 존재하지 않으므로, 독소가 발현되어 세포를 사멸시킨다. AraC는 이러한 회로에서 항시적 프로모터의 제어 하에 있다.
도 41은 argR 유전자에 대해 결실되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 아르기닌 생산에 유용하다.
도 42는 argR 유전자에 대해 결실되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 염색체 상에 하나 이상의 영양요구성 변형을 추가로 포함한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 아르기닌 생산에 유용하다.
도 43은 argR 및 argG 유전자에 대해 결실되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 아르기닌 생산에 유용하다.
도 44는 argR 및 argG 유전자에 대해 결실되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 염색체 상에 하나 이상의 영양요구성 변형을 추가로 포함한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 시트룰린 생산에 유용하다.
도 45는 ArgR 결합 부위가 결여되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 아르기닌 생산에 유용하다.
도 46은 ArgR 결합 부위가 결여되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 염색체 상에 하나 이상의 영양요구성 변형을 추가로 포함한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 아르기닌 생산에 유용하다.
도 47은 argG를 제외한 모든 아르기닌 생합성 오페론에서 ArgR 결합 부위가 결여되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 시트룰린 생산에 유용하다.
도 48은 argG를 제외한 모든 아르기닌 생합성 오페론에서 ArgR 결합 부위가 결여되고 피드백-내성 argAfbr 유전자를 발현시키는 공학처리된 박테리아의 균주의 예시적인 구체예를 묘사한다. 이러한 균주는 염색체 상에 하나 이상의 영양요구성 변형을 추가로 포함한다. 이러한 균주는 암모니아 소비 및 시트룰린 생산에 유용하다.
도 49a는 야생형 clbA 작제물의 개략도를 묘사한다. 도 49b는 clbA 녹아웃 작제물의 개략도를 묘사한다.
도 50은 야생형 clbA 작제물 및 clbA 녹아웃 작제물의 예시적인 서열을 묘사한다.
도 51은 기준선, 2시간, 및 4시간에 SYN-UCD101, SYN-UCD102, 및 블랭크 대조군으로부터 배양 배지 중 시험관내 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한다. SYN-UCD101 및 SYN-UCD102 둘 모두는 시험관내 암모니아를 소비할 수 있다.
도 52는 기준선, 2시간, 및 4시간에 SYN-UCD201, SYN-UCD203, 및 블랭크 대조군으로부터 배양 배지 중 시험관내 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한다. SYN-UCD201 및 SYN-UCD203 둘 모두는 시험관내 암모니아를 소비할 수 있다.
도 53은 공학처리된 안전성 구성요소로서 GeneGuard의 이용을 묘사한다. 공학처리된 모든 DNA는 조건적으로 파괴될 수 있는 플라스미드 상에 존재한다. 예컨대, 문헌[Wright et al., "GeneGuard: A Modular Plasmid System Designed for Biosafety," ACS Synthetic Biology (2015) 4: 307-316]을 참조하라.
도 54는 예시적인 L-호모세린 및 L-메티오닌 생합성 경로를 묘사한다. 원은 MetJ에 의해 억제된 유전자를 나타내고, metJ의 결실은 이러한 유전자의 항시적 발현 및 경로의 활성화로 이어진다.
도 55는 예시적인 히스티딘 생합성 경로를 묘사한다.
도 56은 예시적인 리신 생합성 경로를 묘사한다.
도 57은 예시적인 아스파라긴 생합성 경로를 묘사한다.
도 58은 예시적인 글루타민 생합성 경로를 묘사한다.
도 59는 예시적인 트립토판 생합성 경로를 묘사한다.
도 60은 외인성 환경 조건 또는 하나 이상의 환경 신호가 유도성 프로모터 또는 유도성 프로모터들로부터 이종성 유전자 및 제1 재조합효소의 발현을 활성화시키는 본 발명의 한 비제한적인 구체예를 묘사한다. 그 후 재조합효소는 제2 재조합효소를 역 배향으로부터 활성 입체형태로 플립핑시킨다. 활성화된 제2 재조합효소는 독소 유전자를 활성화된 입체형태로 플립핑시키고, 재조합효소의 자연 동역학은 독소의 발현에 있어서 시간 지연을 초래하여, 이종성 유전자가 충분히 발현되게 한다. 독소가 발현되면, 이는 세포를 사멸시킨다.
도 61은 도 60에 기재된 사멸-전환 구체예를 갖는 우레아 회로 질환(UCD)을 표적화하도록 공학처리된 합성 바이오틱을 묘사한다. 이 예에서, Int 재조합효소 및 Kid-Kis 독소-항-독소 시스템이 UCD를 치료하기 위한 재조합체 박테리아의 세포에 이용된다. 재조합체 박테리아의 세포는 환자 결과를 개선시키기 위해 유익한 부산물을 생산하기 위해 과도한 암모니아를 소비하도록 공학처리된다. 재조합체 박테리아의 세포는 또한 안전성을 보장하기 위해 고도로 제어가능한 사멸 전환을 포함한다. 낮은 산소 환경에 반응하여(예컨대, 장에서 발견되는 것과 같은), FNR 프로모터는 Int 재조합효소의 발현을 유도하고 또한 Kis 항-독소의 발현을 유도한다. Int 재조합효소는 Kid 독소 유전자가 활성화된 입체형태로 플립핑되게 하지만, 축적된 Kis 항-독소의 존재는 발현된 Kid 독소의 활성을 억제한다. 산소의 존재 하에(예컨대, 장의 외부에서), 항-독소의 발현은 꺼진다. 독소는 항시적으로 발현되고, 계속하여 축적되며, 박테리아의 세포를 사멸시킨다.
도 62는 이종성 유전자의 발현이 외인성 환경 신호에 의해 활성화되는 본 발명의 또 다른 비제한적인 구체예를 묘사한다. 아라비노스의 부재 하에, AraC 전사 인자는 전사를 억제하는 입체형태를 채택한다. 아라비노스의 존재 하에, AraC 전사 인자는 AraBAD 프로모터에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 입체형태 변화를 겪고, 이는 TetR(tet 억제인자) 및 항-독소의 발현을 유도한다. 항-독소는 재조합체 박테리아의 세포에서 축적되고, 한편 TetR은 독소의 발현을 막는다(TetR 결합 부위를 갖는 프로모터의 제어 하에 있다). 그러나, 아라비노스가 존재하지 않을 때, 항-독소 및 TetR 둘 모두는 발현되지 않는다. TetR이 독소의 발현을 억제하기 위해 존재하지 않으므로, 독소가 발현되어 세포를 사멸시킨다. 도 62는 또한 재조합체 박테리아에서 발견되지 않는 필수 유전자의 발현이 외인성 환경 신호에 의해 활성화되는 본 발명의 또 다른 비제한적인 구체예를 묘사한다. 아라비노스의 부재 하에, AraC 전사 인자는 araBAD 프로모터의 제어 하에 필수 유전자의 전사를 억제하는 입체형태를 채택하고 박테리아의 세포는 생존할 수 없다. 아라비노스의 존재 하에, AraC 전사 인자는 AraBAD 프로모터에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 입체형태 변화를 겪고, 이는 필수 유전자의 발현을 유도하고 박테리아 세포의 생육성을 유지한다.
도 63은 항-독소가 항시적 프로모터로부터 발현되고, 이종성 유전자의 발현이 외인성 환경 신호에 의해 활성화되는 본 발명의 비제한적인 구체예를 묘사한다. 아라비노스의 부재 하에, AraC 전사 인자는 전사를 억제하는 입체형태를 채택한다. 아라비노스의 존재 하에, AraC 전사 인자는 AraBAD 프로모터에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 입체형태 변화를 겪고, 이는 TetR의 발현을 유도하므로, 독소의 발현을 막는다. 그러나, 아라비노스가 존재하지 않을 때, TetR은 발현되지 않고, 독소는 발현되며, 결국 항-독소를 극복하고 세포를 사멸시킨다. 항-독소의 발현을 조절하는 항시적 프로모터는 독소의 발현을 유도시키는 프로모터보다 약한 프로모터여야 한다.
도 64는 재조합체 박테리아의 고유 안전성, 뿐만 아니라 공학처리된 안전성-폐기물 관리(사멸 전환 및/또는 영양요구성 포함)를 포함하는, 본 발명의 재조합체 박테리아의 안전성 설계의 개요를 묘사한다.
구체예의 설명
본 발명은 유전적으로 공학처리된 박테리아, 이의 약학적 조성물, 및 고암모니아혈증과 관련된 질환, 예컨대, 우레아 회로 질환 및 간 뇌병증을 조절 또는 치료하는 방법을 포함한다. 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 특히 저산소 조건에서, 예컨대 포유동물의 장에서 과도한 암모니아를 감소시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 신체의 과도한 질소를 무독성 분자, 예컨대, 아르기닌, 시트룰린, 메티오닌, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 또는 트립토판에 혼입시킴에 의해 과도한 암모니아를 감소시킨다.
설명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어들을 먼저 정의한다. 이러한 정의는 본 발명의 나머지 부분을 고려하여 당업자에게 이해되는 바와 같이 판독되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 추가의 정의는 상세한 설명을 통틀어 개시된다.
"고암모니아혈증", "고암모니아혈증성" 또는 "과도한 암모니아"는 신체에서 암모니아의 증가된 농도를 언급하는데 이용된다. 고암모니아혈증은 암모니아의 감소된 탈독화 및/또는 증가된 생산에 의해 야기된다. 감소된 탈독화는 우레아 회로 질환(UCD), 예컨대 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바모일포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 및 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍; 또는 간의 우회로, 예컨대, 개방 간관(open ducts hepaticus)으로부터; 및/또는 글루타민 합성효소의 결핍(Hoffman et al., 2013; Haberle et al., 2013)으로부터 초래될 수 있다. 암모니아의 증가된 생산은 감염, 약물, 신경인성 방광, 및 장내 박테리아 과증식(Haberle et al., 2013)으로부터 초래될 수 있다. 고암모니아혈증과 관련된 다른 질병 및 병태는 간 질환, 예컨대 간 뇌병증, 급성 간부전, 또는 만성 간부전; 유기산 질환; 이소발레르산뇨증; 3-메틸크로토닐글리신뇨증; 메틸말론산혈증; 프로피온산뇨증; 지방산 산화 결함; 카르니틴 회로 결함; 카르니틴 결핍; β-산화 결핍; 리신뇨 단백질 불내성; 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 탄산 탈수효소 결핍; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 미토콘드리아 질환; 발프로에이트 요법; 아스파라기나제 요법; 완전 비경구 영양; 글리신-함유 용액에 의한 방광경검사; 폐/골수 이식 후; 문맥전신 션트; 요로 감염; 요관 확장; 다발성 골수종; 및 화학요법(Hoffman et al., 2013; Haberle et al., 2013; Pham et al., 2013; Lazier et al., 2014)을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 건강한 대상체에서, 혈장 암모니아 농도는 전형적으로 약 50 μmol/L 미만이다(Leonard, 2006). 일부 구체예에서, 고암모니아혈증의 진단 신호는 적어도 약 50 μmol/L, 적어도 약 80 μmol/L, 적어도 약 150 μmol/L, 적어도 약 180 μmol/L, 또는 적어도 약 200 μmol/L의 혈장 암모니아 농도이다(Leonard, 2006; Hoffman et al., 2013; Haberle et al., 2013).
"암모니아"는 기체상 암모니아(NH3), 이온성 암모니아 (NH4 +), 또는 이의 혼합물을 언급하는데 이용된다. 체액에서, 기체상 암모니아 및 이온성 암모늄은 평형을 이루어 존재한다:
NH3 + H+ ↔ NH4 +
일부 임상 실험실 검사는 총 암모니아(NH3 + NH4 +)를 분석한다(Walker, 2012). 본 발명의 임의의 구체예에서, 달리 지시되지 않는 한, "암모니아"는 기체상 암모니아, 이온성 암모니아, 및/또는 총 암모니아를 언급할 수 있다.
암모니아의 "탈독화"는 독성 암모니아가 제거되고/거나 비제한적으로 아르기닌, 시트룰린, 메티오닌, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 트립토판, 또는 우레아를 포함하는 하나 이상의 무독성 분자로 전환되는 자연적 또는 합성 공정 또는 공정들을 언급하는데 이용된다. 우레아 회로는, 예를 들어, 소변 중에 신체로부터의 제거를 위해 암모니아를 우레아로 효소적으로 전환시킨다. 암모니아는 수많은 생화학적 경로를 통해 합성되는 다수의 아미노산에 대한 질소 공급원이므로, 그러한 아미노산 생합성 경로 중 하나 이상의 증대를 이용하여 과도한 질소를 무독성 분자에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 아르기닌 생합성은 하나의 질소 원자를 포함하는 글루타메이트를 4개의 질소 원자를 포함하는 아르기닌으로 전환시켜, 과도한 질소를 무독성 분자에 혼입시킨다. 인간에서, 아르기닌은 대장으로부터 재흡수되지 않고, 결과적으로, 대장의 과도한 아르기닌은 유해하지 않은 것으로 간주된다. 유사하게, 시트룰린은 대장으로부터 재흡수되지 않으며, 결과적으로, 대장의 과도한 시트룰린은 유해하지 않은 것으로 간주된다. 아르기닌 생합성은 또한 시트룰린을 최종 생성물로서 생산하도록 변형될 수 있다; 시트룰린은 3개의 질소 원자를 포함하므로 변형된 경로는 또한 과도한 질소를 무독성 분자에 혼입시킬 수 있다.
"아르기닌 레굴론", "아르기닌 생합성 레굴론" 및 "arg 레굴론"은 아르기닌 생합성 경로에서 글루타메이트를 아르기닌 및/또는 중간 대사산물, 예컨대, 시트룰린으로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 주어진 박테리아의 종에서의 오페론의 컬렉션을 언급하기 위해 상호교환적으로 이용된다. 아르기닌 레굴론은 또한 오퍼레이터, 프로모터, ARG 박스, 및/또는 이러한 오페론과 관련된 조절 영역을 포함한다. 아르기닌 레굴론은 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 합성효소, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론, 이의 오퍼레이터, 이의 프로모터, 이의 ARG 박스, 및/또는 이의 조절 영역을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 아르기닌 레굴론은, N-아세틸글루타메이트 합성효소 및/또는 N-아세틸오르니티나제에 추가하여 또는 이를 대신하여, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 오페론 및 관련된 오퍼레이터, 프로모터, ARG 박스, 및/또는 조절 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 아르기닌 레굴론의 하나 이상의 오페론 또는 유전자는 박테리아의 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 박테리아는 아르기닌 레굴론에 임의의 유전자 또는 오페론의 다중 복사체를 포함할 수 있고, 하나 이상의 복사체는 돌연변이되거나 본원에 기재된 대로 달리 변경될 수 있다.
한 유전자는 한 효소, 예컨대, N-아세틸글루타메이트 합성효소(argA)를 인코딩할 수 있다. 2개 이상의 유전자는 한 효소의 별개의 서브유닛, 예컨대, 카르바모일포스페이트 신타제의 서브유닛 A 및 서브유닛 B(carA 및 carB)를 인코딩할 수 있다. 일부 박테리아에서, 2개 이상의 유전자는 각각 독립적으로 동일한 효소, 예컨대, 오르니틴 트랜스카르바밀라제(argF 및 argI)를 인코딩할 수 있다. 일부 박테리아에서, 아르기닌 레굴론은 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 argA; N-아세틸글루타메이트 키나제를 인코딩하는 argB; N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소를 인코딩하는 argC; 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩하는 argD; N-아세틸오르니티나제를 인코딩하는 argE; 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 argG; 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 argH; argF 및 argI 중 하나 또는 둘 모두, 각각은 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 독립적으로 인코딩함; 카르바모일포스페이트 신타제의 작은 서브유닛을 인코딩하는 carA; 카르바모일포스페이트 신타제의 큰 서브유닛을 인코딩하는 carB; 이의 오페론; 이의 오퍼레이터; 이의 프로모터; 이의 ARG 박스; 및/또는 이의 조절 영역을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 아르기닌 레굴론은 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(N-아세틸글루타메이트 합성효소 및/또는 N-아세틸오르니티나제에 추가하여 또는 이를 대신하여)를 인코딩하는 argJ, 이의 오페론, 이의 오퍼레이터, 이의 프로모터, 이의 ARG 박스, 및/또는 이의 조절 영역을 포함한다.
"아르기닌 오페론", "아르기닌 생합성 오페론" 및 "arg 오페론"은 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 ARG 박스를 포함하는 공유된 조절 영역의 제어 하에 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 유전자 중 하나 이상의 클러스터를 언급하기 위해 상호교환적으로 이용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 유전자는 공동-전사되고/거나 공동-번역된다. 아르기닌 생합성을 담당하는 효소를 인코딩하는 유전자의 임의의 조합이, 자연적으로 또는 합성에 의해, 오페론에 편성될 수 있다. 예를 들어, B. 서브틸리스에서, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸오르니티나제, N-아세틸글루타메이트 키나제, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, 카르바모일포스페이트 신타제, 및 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하는 유전자는, 프로모터 및 ARG 박스를 포함하는 공유된 조절 영역의 제어 하에, 단일 오페론, argCAEBD-carAB-argF로 편성된다(예컨대, 표 2를 참조하라). E. 콜라이 K12 및 Nissle에서, N-아세틸오르니티나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, N-아세틸글루타메이트 키나제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자는 2개의 2극성 오페론, argECBH로 편성된다. 아르기닌 생합성을 담당하는 효소를 인코딩하는 오페론은 염색체를 가로질러 상이한 유전자좌에 분포될 수 있다. 변형되지 않은 박테리아에서, 각각의 오페론은 ArgR을 통해 아르기닌에 의해 억제될 수 있다. 일부 구체예에서, 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생산은 본원에 제공된 대로 아르기닌 생합성 오페론에 의해 인코딩된 효소의 발현을 변형시킴에 의해 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 변경될 수 있다. 각각의 아르기닌 오페론은 플라스미드 또는 박테리아의 염색체 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 아르기닌 오페론의 다중 복사체, 또는 아르기닌 오페론 내의 유전자 또는 조절 영역이 박테리아에 존재할 수 있고, 이 때 오페론의 하나 이상의 복사체 또는 유전자 또는 조절 영역은 돌연변이되거나 본원에 기재된 대로 달리 변경될 수 있다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 생성물의 다중 복사체를 포함하여(예컨대, 오페론 또는 유전자 또는 조절 영역) 복사체 수를 향상시키거나 많은 상이한 기능을 수행하는 오페론의 많은 상이한 구성요소를 포함하도록 공학처리된다.
"ARG 박스 컨센서스 서열"은 ARG 박스 핵산 서열을 언급하고, 이의 핵산은 argR, argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG, argH, argI, argJ, carA, 및/또는 carB의 조절 영역 중 하나 이상에서 높은 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다. 상기 기재된 대로, 각각의 arg 오페론은 프로모터와 중첩되고 억제인자 단백질이 결합하는, ARG 박스라 불리는, 적어도 하나의 18-뉴클레오티드 불완전 팔린드롬 서열을 포함하는 조절 영역을 포함한다(Tian et al., 1992). ARG 박스의 뉴클레오티드 서열은 각 오페론마다 다를 수 있고, 컨센서스 ARG 박스 서열은 A/T nTGAAT A/T A/T T/A T/A ATTCAn T/A이다(Maas, 1994). 아르기닌 억제인자는 하나 이상의 ARG 박스에 결합하여, 그 하나 이상의 ARG 박스에 작동적으로 연결된 아르기닌 생합성 효소(들)의 전사를 능동적으로 억제한다.
"돌연변이체 아르기닌 레굴론" 또는 "돌연변이된 아르기닌 레굴론"은, 돌연변이체 아르기닌 레굴론이 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 변형되지 않은 레굴론보다 더 많은 아르기닌 및/또는 중간 부산물을 생산하도록, 아르기닌 생합성 경로에서 글루타메이트를 아르기닌 및/또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린으로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 인코딩하는 각각의 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 아르기닌 레굴론을 언급하기 위해 이용된다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr, 및 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하여, 레굴론을 탈억제하고 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성을 향상시키는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 억제인자를 포함하여, 아르기닌 억제인자 기능이 감소하거나 비활성이 되게 하거나, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 억제인자를 갖지 않아서(예컨대, 아르기닌 억제인자 유전자가 결실되었다), 레굴론의 탈억제 및 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성의 향상을 발생시킨다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각각의 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론, 및/또는 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr 및 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각각의 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr 및 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론 및 상기 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론 및 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(N-아세틸글루타메이트 합성효소 및/또는 N-아세틸오르니티나제에 추가하여 또는 이를 대신하여)를 인코딩하는 오페론 및 상기 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다.
ARG 박스는 각 아르기닌 생합성 오페론의 조절 영역에서 프로모터와 중첩된다. 돌연변이체 아르기닌 레굴론에서, 하나 이상의 아르기닌 생합성 오페론의 조절 영역은 팔린드롬 ARG 박스 서열을 파괴하고 ArgR 결합을 감소시키기에 충분할 정도로 돌연변이되지만, 여전히 비-돌연변이체 조절 영역의 프로모터가 천연 오페론-특이적 프로모터로서 인지될 정도로 충분히 높은 상동성을 포함한다. 오페론은 오페론의 ARG 박스 및 조절 영역에 결합하는 ArgR이 감소하거나 제거되도록 적어도 하나의 ARG 박스에 적어도 하나의 핵산 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, ArgR 결합 동안 DNA 메틸화로부터 보호된 염기 및 하이드록실 라디칼 공격으로부터 보호된 염기가 ArgR 결합을 파괴하기 위한 돌연변이의 주요 표적이다(예컨대, 도 6을 참조하라). 돌연변이된 조절 영역의 프로모터는 비-돌연변이체 조절 영역의 프로모터와 충분히 높은 상동성을 유지하여, RNA 중합효소가 충분한 친화성으로 여기에 결합하여 작동적으로 연결된 아르기닌 생합성 효소(들)의 전사를 촉진하도록 한다. 일부 구체예에서, 돌연변이체의 프로모터의 G/C:A/T 비는 야생형 프로모터의 G/C:A/T 비와 10% 이하만큼 상이하다.
일부 구체예에서, 하나 초과의 ARG 박스가 단일 오페론에 존재할 수 있다. 이러한 구체예의 한 양태에서, 오페론의 ARG 박스들 중 적어도 하나는 오페론의 조절 영역에 대한 필수적으로 감소된 ArgR 결합을 생산하도록 변경된다. 이러한 구체에의 대안적인 양태에서, 오페론의 ARG 박스들 각각은 오페론의 조절 영역에 대한 필수적으로 감소된 ArgR 결합을 생산하도록 변경된다.
"감소된" ArgR 결합은 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 박테리아의 변형되지 않은 ARG 박스 및 조절 영역에 대한 억제인자 결합에 비해, 오페론에서 ARG 박스에 대한 억제인자 결합의 감소 또는 상기 오페론의 조절 영역에 대한 총 억제인자 결합의 감소를 언급하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 오페론의 돌연변이체 ARG 박스 및 조절 영역에 대한 ArgR 결합은 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 박테리아의 변형되지 않은 ARG 박스 및 조절 영역에 대한 ArgR 결합보다 적어도 약 50% 미만, 적어도 약 60% 미만, 적어도 약 70% 미만, 적어도 약 80% 미만, 적어도 약 90% 미만, 또는 적어도 약 95% 미만이다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 ARG 박스 및 조절 영역에 대한 감소된 ArgR 결합은 오페론에서 하나 이상의 유전자의 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 600배, 적어도 약 700배, 적어도 약 800배, 적어도 약 900배, 적어도 약 1,000배, 또는 적어도 약 1,500배 증가된 mRNA 발현을 발생시킨다.
"ArgR" 또는 "아르기닌 억제인자"는 아르기닌 레굴론에서 아르기닌 생합성 유전자의 전사를 조절함에 의해 아르기닌 생합성을 억제할 수 있는 단백질을 언급하는데 이용된다. 아르기닌 억제인자 단백질("argR")을 인코딩하는 유전자의 발현이 야생형 박테리아에서 증가할 때, 아르기닌 생합성은 감소한다. argR의 발현이 야생형 박테리아에서 감소하거나, argR이 결실되거나 돌연변이되어 아르기닌 억제인자 기능이 불활성화되는 경우, 아르기닌 생합성은 증가한다.
"임의의 기능성 ArgR이 결여된" 박테리아 및 "ArgR 결실 박테리아"는 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 박테리아로부터의 변형되지 않은 아르기닌 억제인자에 비해, 각 아르기닌 억제인자가 현저하게 감소되거나 제거된 활성을 갖는 박테리아를 언급하는데 이용된다. 감소되거나 제거된 아르기닌 억제인자 활성은, 예를 들어, 아르기닌 생합성 유전자의 증가된 전사 및/또는 아르기닌 및/또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린의 증가된 농도를 발생시킬 수 있다. 아르기닌 억제인자 활성이 감소되거나 제거된 박테리아는 박테리아의 argR 유전자를 변형시키거나 argR 유전자의 전사를 변형시킴에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 염색체 argR 유전자는 결실될 수 있거나, 돌연변이될 수 있거나, argR 유전자는 야생형 억제인자 활성을 나타내지 않는 argR 유전자로 대체될 수 있다.
"작동적으로 연결된"은 핵산 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 영역 서열에 연결된, 예컨대, 시스로(in cis)로 작용하는 핵산 서열, 예컨대, 피드백 내성 ArgA를 인코딩하는 유전자를 언급한다.
"유도성 프로모터"는 하나 이상의 유전자에 작동적으로 연결된 조절 영역을 언급하고, 유전자(들)의 발현은 상기 조절 영역의 유도인자의 존재 하에 증가한다.
"외인성 환경 조건(들)"은 상기 기재된 프로모터가 유도되는 설정(들) 또는 환경(들)을 언급한다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 장에 특이적이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 상부 위장관에 특이적이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 하부 위장관에 특이적이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 소장에 특이적이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 장 환경과 같은 저산소, 미호기성, 또는 혐기성 조건이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 장에 특이적인 분자 또는 대사산물, 예컨대, 프로피오네이트이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 산소 수준-의존성 프로모터를 포함한다. 박테리아는 산소 수준을 감지할 수 있는 전사 인자를 진화시켰다. 상이한 신호전달 경로는 상이한 산소 수준에 의해 촉발될 수 있고 상이한 동역학으로 발생한다. "산소 수준-의존성 프로모터" 또는 "산소 수준-의존성 조절 영역"은 하나 이상의 산소 수준-감지 전사 인자가 결합할 수 있는 핵산 서열을 언급하고, 상응하는 전사 인자의 결합 및/또는 활성화는 다운스트림 유전자 발현을 활성화시킨다.
산소 수준-의존성 전사 인자의 예는 비제한적으로 FNR, ANR, 및 DNR을 포함한다. 상응하는 FNR-반응성 프로모터, ANR-반응성 프로모터, 및 DNR-반응성 프로모터는 당 분야에 공지되어 있고(예컨대, Castiglione et al., 2009; Eiglmeier et al., 1989; Galimand et al., 1991; Hasegawa et al., 1998; Hoeren et al., 1993; Salmon et al., 2003을 참조하라), 비제한적인 예는 표 1에 도시된다.
표 1. 전사 인자 및 반응성 유전자 및 조절 영역의 예
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본원에서 사용되는 "비천연" 핵산 서열은 일반적으로 박테리아에 존재하지 않는 핵산 서열, 예컨대, 내인성 서열의 여분의 복사체, 또는 이종성 서열, 예컨대 박테리아의 상이한 종, 균주, 또는 서브균주로부터의 서열, 또는 동일한 서브타입의 박테리아로부터의 변형되지 않은 서열에 비해 변형되고/거나 돌연변이된 서열을 언급한다. 일부 구체예에서, 비천연 핵산 서열은 합성의, 비자연 발생 서열일 수 있다(예컨대, Purcell et al., 2013을 참조하라). 비천연 핵산 서열은 조절 영역, 프로모터, 유전자, 및/또는 유전자 카세트의 하나 이상의 유전자일 수 있다. 일부 구체예에서, "비천연"은 자연에서 서로 동일한 관계에 있지 않은 2개 이상의 핵산 서열을 언급한다. 비천연 핵산 서열은 플라스미드 또는 염색체 상에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 자연에서 유전자 카세트와 관련이 없는 유도성 프로모터에 직접접으로 또는 간접적으로 작동적으로 연결된 유전자 카세트를 포함하고, 예컨대, FNR-반응성 프로모터는 부티로제닉 유전자 카세트에 작동적으로 연결된다.
"항시적 프로모터"는 프로모터의 제어 하에 코딩 서열 또는 유전자의 연속 전사를 촉진할 수 있고/거나 이에 작동적으로 연결되는 프로모터를 언급한다. 항시적 프로모터 및 변이체는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로 BBa_J23100, 항시적 에스체리치아 콜라이 σS 프로모터(예컨대, osmY 프로모터 (International Genetically Engineered Machine (iGEM) Registry of Standard Biological Parts Name BBa_J45992; BBa_J45993)), 항시적 에스체리치아 콜라이 σ32 프로모터(예컨대, htpG 열 충격 프로모터(BBa_J45504)), 항시적 에스체리치아 콜라이 σ70 프로모터(예컨대, lacq 프로모터(BBa_J54200; BBa_J56015), E. 콜라이 CreABCD 포스페이트 감지 오페론 프로모터(BBa_J64951), GlnRS 프로모터(BBa_K088007), lacZ 프로모터(BBa_K119000; BBa_K119001); M13K07 유전자 I 프로모터(BBa_M13101); M13K07 유전자 II 프로모터(BBa_M13102), M13K07 유전자 III 프로모터(BBa_M13103), M13K07 유전자 IV 프로모터(BBa_M13104), M13K07 유전자 V 프로모터(BBa_M13105), M13K07 유전자 VI 프로모터(BBa_M13106), M13K07 유전자 VIII 프로모터(BBa_M13108), M13110(BBa_M13110)), 항시적 바실루스 서브틸리스 σA 프로모터(예컨대, 프로모터 veg(BBa_K143013), 프로모터 43(BBa_K143013), PliaG(BBa_K823000), PlepA(BBa_K823002), Pveg(BBa_K823003)), 항시적 바실루스 서브틸리스 σB 프로모터(예컨대, 프로모터 ctc(BBa_K143010), 프로모터 gsiB(BBa_K143011)), 살모넬라(Salmonella) 프로모터(예컨대, 살모넬라로부터의 Pspv2(BBa_K112706), 살모넬라로부터의 Pspv(BBa_K112707)), 박테리오파지 T7 프로모터(예컨대, T7 프로모터(BBa_I712074; BBa_I719005; BBa_J34814; BBa_J64997; BBa_K113010; BBa_K113011; BBa_K113012; BBa_R0085; BBa_R0180; BBa_R0181; BBa_R0182; BBa_R0183; BBa_Z0251; BBa_Z0252; BBa_Z0253)), 및 박테리오파지 SP6 프로모터(예컨대, SP6 프로모터 (BBa_J64998))를 포함한다.
본원에서 사용되는, 아르기닌 또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린을 "과생산"하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 박테리아를 언급한다. 예를 들어, 공학처리된 박테리아는 ArgA의 피드백 내성 형태를 포함할 수 있고, 아르기닌 피드백 내성 ArgA가 발현될 때, 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 더 많은 아르기닌 및/또는 중간 부산물을 생산할 수 있다. 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각각의 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 대안적으로 또는 추가로 포함할 수 있다. 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자를 대안적으로 또는 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 600배, 적어도 약 700배, 적어도 약 800배, 적어도 약 900배, 적어도 약 1,000배, 또는 적어도 약 1,500배 더 많은 아르기닌을 생산한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 600배, 적어도 약 700배, 적어도 약 800배, 적어도 약 900배, 적어도 약 1,000배, 또는 적어도 약 1,500배 더 많은 시트룰린 또는 다른 중간 부산물을 생산한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 아르기닌 생합성 유전자 중 하나 이상의 mRNA 전사체 수준은 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아에서의 mRNA 전사체 수준보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 600배, 적어도 약 700배, 적어도 약 800배, 적어도 약 900배, 적어도 약 1,000배, 또는 적어도 약 1,500배 더 높다. 특정 구체예에서, 변형되지 않은 박테리아는 그러한 오페론에서 아르기닌, 중간 부산물, 및/또는 유전자(들)의 전사의 검출가능한 수준을 갖지 않을 것이다. 그러나, 단백질 및/또는 아르기닌 및/또는 중간 부산물의 전사 수준은 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 갖는 상응하는 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 검출가능할 것이다. 전사 수준은 유전자의 mRNA 수준을 직접 측정함에 의해 검출될 수 있다. 아르기닌 및/또는 중간 부산물 수준, 뿐만 아니라 아르기닌 생합성 유전자로부터 발현된 전사체의 수준을 측정하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 아르기닌 및 시트룰린은, 예를 들어, 질량 분광분석법에 의해 측정될 수 있다.
"장"은 음식의 이동 및 소화, 영양소 흡수, 및 폐기물 배설을 담당하는 기관, 샘, 관, 및 시스템을 언급한다. 인간에서, 장은 입에서 시작하여 항문에서 끝나는 위장관을 포함하고, 식도, 위, 소장, 및 대장을 추가로 포함한다. 장은 또한 비장, 간, 담낭, 및 췌장과 같은 부속 기관 및 샘을 포함한다. 상부 위장관은 식도, 위, 및 소장의 십이지장을 포함한다. 하부 위장관은 소장의 나머지, 즉, 공장 및 회장, 및 대장의 전부, 즉, 맹장, 결장, 직장, 및 항문관을 포함한다. 박테리아는 장의 전체에 걸쳐, 예컨대, 위장관에서, 및 특히 장에서 발견될 수 있다.
"비병원성 박테리아"는 숙주에서 질병이나 유해 반응을 일으킬 수 없는 박테리아를 언급한다. 일부 구체예에서, 비병원성 박테리아는 상주 박테리아이다. 비병원성 박테리아의 예는 바실루스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 예컨대, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이데스 프라질리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 서브틸리스(Bacteroides subtilis), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인펀티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 락토바실루스 액시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 및 사카로마이세스 보울라디이(Saccharomyces boulardii)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다(Sonnenborn et al., 2009; Dinleyici et al., 2014; U.S. Patent No. 6,835,376; U.S. Patent No. 6,203,797; U.S. Patent No. 5,589,168; U.S. Patent No. 7,731,976). 자연 병원성 박테리아는 감소되거나 제거된 병원성을 제공하도록 유전적으로 공학처리될 수 있다.
"프로바이오틱"은 적절한 양의 미생물을 함유하는 숙주 유기체에 건강상 이익을 줄 수 있는 살아 있는 비병원성 미생물, 예컨대, 박테리아를 언급하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 숙주 유기체는 포유동물이다. 일부 구체예에서, 숙주 유기체는 인간이다. 비병원성 박테리아의 일부 종, 균주, 및/또는 서브타입은 현재 프로바이오틱 박테리아로서 인지된다. 프로바이오틱 박테리아의 예는 비제한적으로 비피도박테리움, 에스체리치아 콜라이, 락토바실루스, 및 사카로마이세스, 예컨대, 비피도박테리움 비피둠, 엔테로코쿠스 파에시움, 에스체리치아 콜라이 균주 Nissle, 락토바실루스 액시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 플란타룸, 및 사카로마이세스 보울라디이를 포함한다(Dinleyici et al., 2014; U.S. Patent No. 5,589,168; U.S. Patent No. 6,203,797; U.S. Patent 6,835,376). 프로바이오틱은 박테리아의 변이체 또는 돌연변이체 균주일 수 있다(Arthur et al., 2012; Cuevas-Ramos et al., 2010; Olier et al., 2012; Nougayrede et al., 2006). 비병원성 박테리아는 요망되는 생물학적 특성, 예컨대, 생존성을 향상시키거나 개선시키도록 유전적으로 공학처리될 수 있다. 비병원성 박테리아는 프로바이오틱 특성을 제공하도록 유전적으로 공학처리될 수 있다. 프로바이오틱 박테리아는 프로바이오틱 특성을 향상시키거나 개선시키도록 유전적으로 공학처리될 수 있다.
본원에서 사용되는 "안정하게 유지된" 또는 "안정한" 박테리아는, 비천연 유전 물질이 보유, 발현, 및 증식하도록, 비천연 유전 물질, 예컨대, 피드백 내성 argA 유전자, 돌연변이체 아르기닌 억제인자, 및/또는 숙주 유전체에 혼입되거나 자기-복제 염색체외 플라스미드 상에서 증식하는 다른 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 갖는 박테리아의 숙주 세포를 언급하는데 이용된다. 안정한 박테리아는 시험관내, 예컨대, 배지에서, 및/또는 생체내, 예컨대, 장에서 생존 및/또는 성장할 수 있다. 예를 들어, 안정한 박테리아는 argAfbr이 박테리아에서 발현될 수 있고, 박테리아가 시험관내 및/또는 생체내에서 생존 및/또는 성장할 수 있도록, argAfbr 유전자를 갖는 플라스미드 또는 염색체가 박테리아에서 안정하게 유지된, argAfbr 유전자를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 및 이의 관련어는 질환 또는 질병, 또는 이의 적어도 하나의 식별할 수 있는 증상의 개선을 언급한다. 다른 구체예에서, "치료하다"는, 반드시 환자가 식별할 수 있는 것은 아니지만, 적어도 하나의 측정가능한 물리적 파라미터의 개선을 언급한다. 다른 구체예에서, "치료하다"는 신체적으로(예컨대, 식별할 수 있는 증상의 안정화), 생리학적으로(예컨대, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 모두에 있어서 질환 또는 질병의 진행을 억제하는 것을 언급한다. 다른 구체예에서, "치료하다"는 질환 또는 질병의 진행을 늦추거나 역행시키는 것을 언급한다. 본원에서 사용되는, "예방하다" 및 이의 관련어는 발병을 지연시키거나 주어진 질환 또는 질병을 가질 위험을 줄이는 것을 언급한다.
치료가 필요한 사람들은 이미 특정 의학적 장애가 있는 개인들, 뿐만 아니라 장애를 가지거나 궁극적으로 장애를 가질 위험이 있는 사람들을 포함할 수 있다. 치료에 대한 필요는, 예를 들어, 발병과 관련된 하나 이상의 위험 인자의 존재, 장애의 존재 또는 진행, 또는 장애가 있는 대상체의 치료에 대한 수용 가능성에 의해 평가된다. 주요 고암모니아혈증은 어떠한 알려진 치료법이 없는 보통염색체 열성 또는 X-연관 선천 대사 장애인 UCD에 의해 초래된다. 고암모니아혈증은 또한 우레아 회로의 다른 파괴, 예컨대, 독성 대사산물, 감염, 및/또는 기질 결핍에 부수적인 것일 수 있다. 고암모니아혈증의 치료는 과도한 암모니아 및/또는 관련 증상을 감소시키거나 제거하는 것을 포함할 수 있고, 반드시 근본적인 고암모니아혈증-관련 질병의 제거를 포함하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 "약학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 부형제와 같은 다른 구성요소와 함께 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아이 제조물을 언급한다.
상호교환적으로 사용될 수 있는 어구 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 상당한 자극을 일으키지 않고 투여된 박테리아의 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐지하지 않는 담체 또는 희석제를 언급한다. 애쥬번트가 이러한 어구에 포함된다.
용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 추가로 촉진하기 위해 약학적 조성물에 첨가된 비활성 물질을 언급한다. 예는, 비제한적으로, 칼슘 바이카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성유, 폴리에틸렌 글리콜 및, 예를 들어, 폴리소르베이트 20을 포함하는 계면활성제를 포함한다.
용어 "치료적으로 효과적인 용량" 및 "치료적 유효량"은 병태, 예컨대, 고암모니아혈증의 예방, 증상의 개시 지연, 또는 증상의 개선을 발생시키는 화합물의 양을 언급하는데 이용된다. 치료적 유효량은, 예를 들어, 상승된 암모니아 농도와 관련된 질병의 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 중증도 감소, 개시 지연, 및/또는 발생 위험을 감소시키기에 충분할 수 있다. 치료적 유효량, 뿐만 아니라 치료적으로 효과적인 투여 빈도는 당 분야에 공지되고 하기 논의된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 명확하게 반대로 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
목록의 요소들 간에 사용될 때 어구 "및/또는"은 (1) 단 하나의 나열된 요소만이 존재하거나, (2) 목록 중 하나를 초과하는 요소가 존재하는 것을 의미하고자 한다. 예를 들어, "A, B, 및/또는 C"는 선택이 A 단독; B 단독; C 단독; A 및 B; A 및 C; B 및 C; 또는 A, B, 및 C일 수 있음을 나타낸다. 어구 "및/또는"은 목록의 요소들 중 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"과 상호교환적으로 이용될 수 있다.
박테리아
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 과도한 암모니아를 감소시키고 암모니아 및/또는 질소를 대안적인 부산물로 전환시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 비병원성 박테리아이다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 상주 박테리아이다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 프로바이오틱 박테리아이다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 병원성을 감소시키거나 제거하도록 변형되거나 돌연변이된 자연 병원성 박테리아이다. 예시적인 박테리아는 바실루스, 박테로이데스, 비피도박테리움, 브레비박테리움, 클로스트리듐, 엔테로코쿠스, 에스체리치아 콜라이, 락토바실루스, 락토코쿠스, 사카로마이세스, 및 스타필로코쿠스, 예컨대, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 서브틸리스, 박테로이데스 프라질리스, 박테로이데스 서브틸리스, 박테로이데스 테타이오타오미크론, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 인펀티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱굼, 클로스트리듐 부티리쿰, 엔테로코쿠스 파에시움, 락토바실루스 액시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 류테리, 락토바실루스 람노수스, 락토코쿠스 락티스, 및 사카로마이세스 보울라디이를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 박테로이데스 프라질리스, 박테로이데스 테타이오타오미크론, 박테로이데스 서브틸리스, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 인펀티스, 비피도박테리움 락티스, 클로스트리듐 부티리쿰, 에스체리치아 콜라이 Nissle, 락토바실루스 액시도필루스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 류테리, 및 락토코쿠스 락티스로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 가장 잘 특성화된 프로바이오틱 중 하나로 진화된" 장내세균 패밀리의 그램-음성 박테리아인 에스체리치아 콜라이 균주 Nissle 1917(E. 콜라이 Nissle)이다(Ukena et al., 2007). 균주는 이의 완전한 무해성을 특징으로 하고(Schultz, 2008), GRAS(일반적으로 안전한 것으로 인지된) 상태를 갖는다(Reister et al., 2014, 강조됨). 유전체 시퀀싱은 E. 콜라이 Nissle에 현저한 발병력 인자(예컨대, E. 콜라이 α-용혈소, P-섬모 부착소)가 없음을 확인하였다(Schultz, 2008). 또한, E. 콜라이 Nissle은 병원성 부착 인자를 갖지 않고, 임의의 장독소 또는 세포독소를 생산하지 않으며, 침습성이 아니고, 요로병원성이 아닌 것으로 밝혀졌다(Sonnenborn et al., 2009). 일찍이 1917년에, E. 콜라이 Nissle은 치료용으로 뮤타플로라고 불리는 의약 캡슐에 포장되었다. E. 콜라이 Nissle은 이후 인간에서 생체내 궤양성 대장염을 치료하고(Rembacken et al., 1999), 인간에서 염증성 장 질환, 크론병, 및 생체내 낭염을 치료하고(Schultz, 2008), 시험관내 장침투성 살모넬라, 레지오넬라(Legionella), 예르시니아(Yersinia), 및 시겔라(Shigella)를 억제하는데(Altenhoefer et al., 2004) 이용되어 왔다. E. 콜라이 Nissle의 치료 효능 및 안전성은 설득력 있게 입증된 것으로 일반적으로 받아들여진다(Ukena et al., 2007).
당업자는 본원에 기재된 유전자 변형이 박테리아의 다른 종, 균주, 및 서브타입에 대해 변형되고 적합화될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 아르기닌-매개된 조절은 매우 다른 박테리아, 즉, 그램-음성 박테리아, 예컨대, E. 콜라이, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피무리움, 서모토가(Thermotoga), 및 모리텔라 프로푼다(Moritella profunda), 및 그램-양성 박테리아, 예컨대 B. 서브틸리스, 지오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 및 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus), 뿐만 아니라 다른 박테리아에서 현저하게 잘 보존됨이 공지되어 있다(Nicoloff et al., 2004). 더욱이, 아르기닌 억제인자는 박테리아의 유전체에서 보편적으로 보존되고 이의 인지 신호(ARG 박스), 약한 팔린트롬도 유전체 간에 보존된다(Makarova et al., 2001).
변형되지 않은 E. 콜라이 Nissle 및 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예컨대, 장 또는 혈청에서의 방어 인자에 의해 파괴될 수 있다(Sonnenborn et al., 2009). 박테리아의 생체내 체류 시간은 실시예 19에 기재된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 체류 시간은 인간 대상체에 대해 계산된다. 야생형 ArgR 및 야생형 아르기닌 레굴론을 포함하는 스트렙토마이신-내성 E. 콜라이 Nissle을 이용한 비제한적인 예가 제공된다(도 27을 참조하라). 일부 구체예에서, 생체내 체류 시간은 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아에 대해 계산된다.
과도한 암모니아의 감소
아르기닌 생합성 경로
에스체리치아 콜라이(E. 콜라이)와 같은 박테리아에서, 아르기닌 생합성 경로는 효소 N-아세틸글루타메이트 합성효소, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 수반하는 8단계 효소적 공정으로 글루타메이트를 아르기닌으로 전환시킬 수 있다(Cunin et al., 1986). 처음 5단계는 오르니틴 전구체를 생성하기 위한 N-아세틸화를 포함한다. 여섯 번째 단계에서, 오르니틴 트랜스카르바밀라제(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제로도 공지됨)는 시트룰린의 형성을 촉매화한다. 마지막 두 단계는 시트룰린으로부터 아르기닌을 생성하기 위해 카르바모일포스페이트 활용을 수반한다.
일부 박테리아, 예컨대, 바실루스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) 및 네이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae)에서, 아르기닌 생합성의 첫 번째 및 다섯 번째 단계는 이기능성 효소 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제에 의해 촉매화될 수 있다. 이러한 이기능성은 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(argJ)가 E. 콜라이에서 N-아세틸글루타메이트 합성효소(argA) 및 N-아세틸오르니티나제(argE) 영양요구성 유전자 돌연변이 둘 모두를 보충하는 것으로 밝혀졌을 때 처음 확인되었다(Mountain et al., 1984; Crabeel et al., 1997).
ArgA는 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하고, argB는 N-아세틸글루타메이트 키나제를 인코딩하고, argC는 N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소를 인코딩하고, argD는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩하고, argE는 N-아세틸오르니티나제를 인코딩하고, argF는 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하고, argI도 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하고, argG는 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하고, argH는 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하고, argJ는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩한다. CarA는 글루타미나제 활성을 갖는 카르바모일포스페이트 신타제의 작은 A 서브유닛을 인코딩하고, carB는 암모니아로부터 카르바모일포스페이트 합성을 촉매화하는 카르바모일포스페이트 신타제의 큰 B 서브유닛을 인코딩한다. 이러한 아르기닌 생합성 유전자들(즉, argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG, argH, argI, argJ, carA, 및 carB) 중 하나 이상의 상이한 조합이, 자연적으로 또는 합성에 의해, 하나 이상의 오페론으로 편성될 수 있고, 그러한 편성은 박테리아의 종, 균주, 및 서브타입 간에 다를 수 있다(예컨대, 표 2를 참조하라). 각 오페론의 조절 영역은 적어도 하나의 ARG 박스를 함유하고, 조절 영역 당 ARG 박스의 수는 오페론 및 박테리아 간에 다를 수 있다.
이러한 효소를 인코딩하는 모든 유전자는 아르기닌과 ArgR의 상호작용을 통해 아르기닌에 의해 억제되어, 각 유전자의 조절 영역에 결합하여 전사를 억제하는 복합체를 형성한다. N-아세틸글루타메이트 합성효소는 또한 단백질 수준에서 아르기닌 단독에 의해 알로스테리 피드백 억제된다(Tuchman et al., 1997; Caldara et al., 2006; Caldara et al., 2008; Caldovic et al., 2010).
박테리아에서 아르기닌 생합성을 조절하는 유전자는 염색체를 가로질러 산란되어, Maas and Clark(1964)이 "레굴론"이라고 명명한, 단일 억제인자에 의해 제어되는 다수의 오페론으로 편성된다. 각 오페론은 프로모터와 중첩되고 억제인자 단백질이 결합하는, ARG 박스라고 불리는, 적어도 하나의 18-뉴클레오티드 불완전 팔린드롬 서열을 포함하는 조절 영역에 의해 조절된다(Tian et al., 1992; Tian et al., 1994). argR 유전자는 하나 이상의 ARG 박스에 결합하는 억제인자 단백질을 인코딩한다(Lim et al., 1987). 아르기닌은 아르기닌 억제인자를 활성화시키는 보조억제인자로서 기능한다. 각 오페론을 조절하는 ARG 박스는 동일하지 않을 수 있고, 컨센서스 ARG 박스 서열은 A/T nTGAAT A/T A/T T/A T/A ATTCAn T/A이다(Maas, 1994). 또한, argR의 조절 영역은 2개의 프로모터를 함유하고, 그 중 하나는 2개의 ARG 박스와 중첩되고 자가조절된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하고 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 더 많은 아르기닌 및/또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린을 생산한다, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 아르기닌 생합성 경로에서 글루타메이트를 아르기닌으로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상의 아르기닌-매개된 억제 - ARG 박스에 대한 ArgR 결합 및/또는 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 대한 아르기닌 결합을 통해 - 를 감소 또는 방지하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하여, 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성을 향상시킨다.
대안적인 구체예에서, 박테리아는 또 다른 대사 경로, 예컨대, 히스티딘 생합성 경로, 메티오닌 생합성 경로, 리신 생합성 경로, 아스파라긴 생합성 경로, 글루타민 생합성 경로, 및 트립토판 생합성 경로를 통해 과도한 암모니아를 소비하도록 유전적으로 공학처리된다.
히스티딘 생합성 경로
히스티딘 생합성은, 예를 들어, E. 콜라이의 단일 오페론 내에 위치한 8개 유전자에 의해 수행된다. 오페론의 8개 유전자 중 3개(hisD, hisB, 및 hisI)는 이기능성 효소를 인코딩하고, 2개(hisH 및 hisF)는 총 10개의 효소적 반응에 대해, 단일 단계를 촉매화하는 한 효소를 함께 형성하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩한다(Alifano et al., 1996). hisG 유전자의 생성물인 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 단백질 수준에서 히스티틴에 의해 억제된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 피드백-내성 hisG를 포함한다. 박테리아는 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 돌연변이유발되고/거나 피드백-내성 hisG 돌연변이체에 대해 스크리닝될 수 있다. 피드백-내성 hisG를 포함하도록 공학처리된 박테리아는 상승된 수준의 히스티딘 생산을 가져서, 암모니아 소비를 증가시키고 고암모니아혈증을 감소시킬 것이다. 대안적으로, 히스티딘 생합성에 필요한 하나 이상의 유전자는 FNR-유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있고, 속도-제한적인 효소의 생산을 증가시킬 수 있었다. 히스티딘 생합성 경로에 대한 임의의 다른 적합한 변형(들)을 이용하여 암모니아 소비를 증가시킬 수 있다.
메티오닌 생합성 경로
박테리아의 메티오닌 레굴론은 호모세린으로부터 메티오닌의 3단계 합성을 제어한다(즉, 아실화, 황산화, 및 메틸화). metJ 유전자는 메티오닌 또는 이의 유도체와 조합될 때, 전사 수준에서 메티오닌 레굴론 내 유전자의 억제를 야기하는 조절 단백질을 인코딩한다(Saint-Girons et al., 1984; Shoeman et al., 1985). 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 결실, 파괴 또는 돌연변이된 metJ를 포함한다. metJ를 결실, 파괴, 또는 돌연변이시키도록 공학처리된 박테리아는 상승된 수준의 메티오닌 생산을 가져서, 암모니아 소비를 증가시키고 고암모니아혈증을 감소시킬 것이다. 메티오닌 생합성 경로에 대한 임의의 다른 적합한 변형(들)을 이용하여 암모니아 소비를 증가시킬 수 있다.
리신 생합성 경로
미생물은 두 경로 중 하나에 의해 리신을 합성한다. 디아미노피멜레이트(DAP) 경로를 이용하여 아스파르테이트 및 피루베이트로부터 리신을 합성하고(Dogovski et al., 2012), 아미노아디프산 경로를 이용하여 알파-케토글루타레이트 및 아세틸 보조효소 A로부터 리신을 합성한다. 디하이드로디피콜리네이트 신타제(DHDPS) 효소는 DAP 경로의 첫 번?? 단계를 촉매화하고, 리신에 의해 피드백 억제된다(Liu et al., 2010; Reboul et al., 2012). 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 피드백-내성 DHDPS를 포함한다. 피드백-내성 DHDPS를 포함하도록 공학처리된 박테리아는 상승된 수준의 히스티딘 생산을 가져서, 암모니아 소비를 증가시키고 고암모니아혈증을 감소시킬 것이다. 대안적으로, 리신 생산은 리신 생합성에 필요한 하나 이상의 유전자를 FNR-유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 두어 최적화될 수 있었다. 리신 생합성 경로에 대한 임의의 다른 적합한 변형(들)을 이용하여 암모니아 소비를 증가시킬 수 있다.
아스파라긴 생합성 경로
아스파라긴은 옥살로아세테이트 및 아스파르트산으로부터 각각 옥살로아세테이트 트랜스아미나제 및 아스파라긴 합성효소 효소를 통해 직접 합성된다. 이러한 경로의 두 번째 단계에서, L-글루타민 또는 암모니아는 아미노기 제공자로서 기능한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아에 비해 아스파라긴을 과생산하여, 과도한 암모니아를 소비하고 고암모니아혈증을 감소시킨다. 대안적으로, 아스파라긴 합성은 이러한 유전자 중 하나 또는 둘 모두를 FNR-유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 둠으로써 최적화될 수 있다. 아스파라긴 생합성 경로에 대한 임의의 다른 적합한 변형(들)을 이용하여 암모니아 소비를 증가시킬 수 있다.
글루타민 생합성 경로
암모니아 및 옥소글루타레이트로부터 글루타민 및 글루타메이트의 합성은 3개의 효소에 의해 엄격하게 조절된다. 글루타메이트 데하이드로게나제는 옥소글루타레이트의 환원성 아민화를 촉매화하여 단일 단계로 글루타메이트를 생성한다. 글루타민 합성효소는 글루타메이트 및 암모니아의 ATP-의존성 축합을 촉매화하여 글루타민을 형성한다(Lodeiro et al., 2008). 글루타민 합성효소는 또한 사이클릭 반응에서 글루타민-옥소글루타레이트 아미노 트랜스퍼라제(글루타메이트 신타제로도 공지됨)와 작용하여 글루타민 및 옥소글루타레이트로부터 글루타메이트를 생산한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아에 비해 상승된 수준의 글루타민 합성효소를 발현시킨다. 글루타민 합성효소의 증가된 발현을 갖도록 공학처리된 박테리아는 상승된 수준의 글루타민 생산을 가져서, 암모니아 소비를 증가시키고 고암모니아혈증을 감소시킬 것이다. 대안적으로, 글루타메이트 데하이드로게나제 및/또는 글루타민-옥소글루타레이트 아미노 트랜스퍼라제의 발현은 암모니아의 소비에 유리하도록 변형될 수 있었다. 글루타민 합성효소의 생산이 전사 수준에서 질소에 의해 조절되므로(Feng et al., 1992; van Heeswijk et al., 2013), 글루타민 합성효소 유전자를 FNR-유도성 프로모터와 같은 상이한 유도성 프로모터의 제어 하에 두는 것이 또한 글루타민 생산을 개선시키는데 이용될 수 있다. 글루타민 및 글루타메이트 생합성 경로에 대한 임의의 다른 적합한 변형(들)을 이용하여 암모니아 소비를 증가시킬 수 있다.
트립토판 생합성 경로
대부분의 박테리아에서, 코리스메이트 전구체로부터 트립토판의 합성에 요구되는 유전자는 단일 전사 단위인 trp 오페론으로서 편성된다. trp 오페론은 높은 수준의 트립토판이 존재할 때 트립토판 억제인자(TrpR)에 의해 억제되는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. trp 오페론의 전사는 또한 높은 수준의 하전된 트립토판 tRNA의 존재 하에 종료될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 결실, 파괴, 또는 돌연변이된 trpR 유전자를 포함한다. trpR 유전자의 결실, 파괴, 또는 돌연변이, 및 결과적으로 TrpR 기능의 불활성화는 트립토판 생산 및 암모니아 소비 둘 모두의 상승된 수준을 발생시킬 것이다. 대안적으로, 트립토판 생합성에 필요한 하나 이상의 효소를 FNR-유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 둘 수 있었다. 트립토판 생합성 경로에 대한 임의의 다른 적합한 변형(들)을 이용하여 암모니아 소비를 증가시킬 수 있다.
돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 공학처리된 박테리아
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 경로를 포함하고 과도한 암모니아를 감소시킬 수 있다. 보다 특수한 양태에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소(들)를 인코딩하는 하나 이상의 오페론이 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 더 많은 아르기닌 또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린을 생산하도록 탈억제된 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌을 과생산한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 시트룰린을 과생산한다; 이는 추가로 유리할 수 있는데, 그 이유는 시트룰린이 특정 우레아 회로 질환에 대한 치료제로서 현재 이용되기 때문이다(국립 우레아 회로 질환 재단). 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 경로에서 본원에 기재된 중간체 중 어느 하나와 같은 대안적인 중간 부산물을 과생산한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 많은 아르기닌, 시트룰린, 및/또는 다른 중간 부산물을 생산함에 의해 과도한 암모니아를 소비한다. 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성의 향상을 이용하여 신체의 과도한 질소를 무독성 분자에 혼입시킴으로써, 우레아 회로 질환 및 간 뇌병증을 포함하는 고암모니아혈증과 관련된 병태를 치료할 수 있다.
당업자는 오페론 내 아르기닌 생합성 유전자의 편성이 박테리아의 종, 균주, 및 서브타입, 예컨대, E. 콜라이 K12의 2극성 argECBH, B. 서브틸리스의 argCAEBD-carAB-argF, 및 L. 플란타룸의 2극성 carAB-argCJBDF에 걸쳐 다름을 인지할 것이다. 상이한 박테리아로부터 오페론 편성의 비제한적인 예는 표 2에 도시되어 있다(일부 예에서, 유전자는 추정된 것이고/거나 에스체리치아 콜라이에서 공지된 서열에 대한 서열 상동성에 의해 확인된다; 일부 예에서, 아르기닌 레굴론의 유전자 중 전부가 공지되고/거나 하기 도시된 것은 아니다). 특정 예에서, 아르기닌 생합성 효소는 박테리아의 종, 균주, 및 서브타입에 걸쳐 다르다.
표 2: arg 오페론 편성의 예
Figure pct00017
각 오페론은 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 ARG 박스를 포함하는 조절 영역에 의해 조절되고, 이는 상기 오페론에서 아르기닌 생합성의 억제 및 발현을 제어한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 경로에서 글루타메이트를 아르기닌 및/또는 중간 부산물로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상의 아르기닌-매개된 억제를 감소하거나 제거하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 아르기닌 레굴론을 포함한다. 아르기닌-매개된 억제를 감소하거나 제거하는 것은 ArgR 억제인자 결합의 감소 또는 제거(예컨대, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 아르기닌 억제인자를 돌연변이 또는 결실시키거나 적어도 하나의 ARG 박스를 돌연변이시킴에 의해) 및/또는 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 대한 아르기닌 결합의 감소 또는 제거(예컨대, N-아세틸글루타메이트 합성효소를 돌연변이시켜 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 생산함에 의해)에 의해 달성될 수 있다.
ARG 박스
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하여, 레굴론을 탈억제하고 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 억제인자를 포함하여, 아르기닌 억제인자 기능이 감소하거나 비활성이 되게 하거나, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 억제인자를 갖지 않아서(예컨대, 아르기닌 억제인자 유전자가 결실되었다), 레굴론의 탈억제 및 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성의 향상을 발생시킨다. 이러한 구체예 중 어느 하나에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론, 및/또는 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자를 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제를 인코딩하고 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 카르바모일포스페이트 신타제, 및 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 추가로 포함하여, ArgR 결합을 감소 또는 제거함으로써, 레굴론을 탈억제하고 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성을 향상시킨다.
일부 구체예에서, 아르기니노석시네이트 신타제(argG)를 인코딩하는 오페론의 경우 ARG 박스는 ArgR에 결합하는 능력을 유지하여, 시트룰린 생합성을 유도시킨다. 예를 들어, 아르기니노석시네이트 신타제(argG)를 인코딩하는 오페론의 조절 영역은 항시적일 수 있어서, 아르기닌 생합성을 유도시킨다. 대안적인 구체예에서, 하나 이상의 대안적인 오페론의 조절 영역은 항시적일 수 있다. 그러나, 특정 박테리아에서, 다중 효소를 인코딩하는 유전자는 2극성 오페론에 또는 공유된 조절 영역의 제어 하에 편성될 수 있다; 이러한 예에서, 조절 영역은 항시적으로 활성인 조절 영역을 공학처리하기 위해 데콘볼루션(deconvolution)될 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이 K12 및 Nissle에서, argE 및 argCBH는 2개의 2극성 오페론, argECBH에 편성되고, 이러한 조절 영역은 argE 및/또는 argCBH의 항시적 버젼을 생성하기 위해 데콘볼루션될 수 있다.
일부 구체예에서, 아르기닌 생합성 유전자를 포함하는 하나 이상의 오페론에서 모든 ARG 박스는 ArgR 결합을 감소 또는 제거하도록 돌연변이된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 하나 이상의 오페론에서 모든 ARG 박스는 ArgR 결합을 감소 또는 제거하도록 돌연변이된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 생합성 유전자를 포함하는 각 오페론에서 모든 ARG 박스는 ArgR 결합을 감소 또는 제거하도록 돌연변이된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각 오페론에서 모든 ARG 박스는 ArgR 결합을 감소 또는 제거하도록 돌연변이된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 ArgR-억제성 조절 영역에 의해 유도된 아르기니노석시네이트 신타제인 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제를 인코딩하고, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 카르바모일포스페이트 신타제, 및 임의로, 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 추가로 포함하여, ArgR 결합을 감소 또는 제거함으로써, 레굴론을 탈억제하고 시트룰린 생합성을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 시트룰린을 생산할 수 있는 유전적으로 공학처리된 박테리아가 특히 유리한데, 그 이유는 시트룰린이 특정 우레아 회로 질환의 치료에 치료적으로 효과적인 보조제로서 추가로 기능하기 때문이다(국립 우레아 회로 질환 재단).
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항시적 프로모터에 의해 유도된 아르기니노석시네이트 신타제인 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제를 인코딩하고, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 리아제, 카르바모일포스페이트 신타제, 및 임의로, 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 추가로 포함하여, ArgR 결합을 감소 또는 제거함으로써, 레굴론을 탈억제하고 시트룰린 생합성을 향상시킨다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 피드백 내성 ArgA를 포함하고, 아르기닌 피드백 내성 ArgA가 발현될 때, 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 많은 아르기닌 및/또는 중간 부산물을 생산할 수 있다.
아르기닌 억제인자 결합 부위(ARG 박스)
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 레굴론이 탈억제되고 아르기닌 및/또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린의 생합성이 향상되도록, 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 오페론 및 상기 오페론에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다. 하나 이상의 핵산 돌연변이는 팔린드롬 ARG 박스 서열의 파괴를 발생시켜, 그 ARG 박스 및 오페론의 조절 영역에 대한 ArgR 결합이 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 박테리아의 변형되지 않은 ARG 박스 및 조절 영역에 대한 ArgR 결합에 비해 감소 또는 제거되도록 한다. 일부 구체예에서, ArgR 결합 동안 DNA 메틸화 및 하이드록실 라디칼 공격으로부터 보호된 핵산은 ArgR 결합을 파괴하기 위한 돌연변이에 대한 주요 표적이다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 상기 기재된 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 하나 이상의 ARG 박스에 적어도 3개의 핵산 돌연변이를 포함한다. ARG 박스는 프로모터와 중첩되고, 돌연변이체 아르기닌 레굴론에서, 돌연변이체 프로모터 영역의 G/C:A/T 비는 야생형 프로모터 영역의 G/C:A/T 비로부터 10% 이하만큼 상이하다(도 6). 프로모터는 RNA 중합효소가 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 결합하도록 비-돌연변이체 프로모터에 충분히 높은 상동성을 유지한다.
E. 콜라이 Nissle에서 각 아르기닌 생합성 오페론에 대해 ARG 박스 및 이의 돌연변이체를 포함하는 야생형 유전체 서열이 도 6에 도시되어 있다. 예시적인 야생형 서열에 대해, ARG 박스는 이탤릭체로 표시되고, 각 유전자의 시작 코돈은
Figure pct00018
로 표시된다. RNA 중합효소 결합 부위는 밑줄로 표시된다(Cunin, 1983; Maas, 1994). 일부 구체예에서, 밑줄친 서열은 변경되지 않는다. ArgR 결합 동안 DNA 메틸화로부터 보호된 염기는
Figure pct00019
되고, ArgR 결합 동안 하이드록실 라디칼 공격으로부터 보호된 염기는 굵게 표시된다(Charlier et al., 1992).
Figure pct00020
되고 굵게 표시된 염기는 ArgR 결합을 파괴하기 위한 돌연변이에 대한 주요 표적이다.
일부 구체예에서, 하나를 초과하는 ARG 박스가 단일 오페론에 존재할 수 있다. 이러한 구체예의 한 양태에서, 오페론의 ARG 박스 중 적어도 하나는 돌연변이되어 오페론의 조절 영역에 대한 필요한 감소된 ArgR 결합을 생산한다. 이러한 구체예의 대안적인 양태에서, 오페론의 각 ARG 박스는 돌연변이되어 오페론의 조절 영역에 대한 필요한 감소된 ArgR 결합을 생산한다. 예를 들어, E. 콜라이 Nissle의 carAB 오페론은 2개의 ARG 박스를 포함하고, 하나 또는 둘 모두의 ARG 박스 서열은 돌연변이될 수 있다. E. 콜라이 Nissle의 argG 오페론은 3개의 ARG 박스를 포함하고, 1, 2 또는 3개의 ARG 박스 서열은 돌연변이, 파괴, 또는 결실될 수 있다. 일부 구체예에서, 3개 모두의 ARG 박스 서열은 돌연변이, 파괴, 또는 결실되고, 항시적 프로모터, 예컨대, BBa_J23100은 argG 오페론의 조절 영역에 삽입된다. 당업자는 조절 영역 당 RG 박스의 수가 박테리아에 걸쳐 다를 수 있고, ARG 박스의 뉴클레오티드 서열아 각 오페론에 대해 다를 수 있음을 인지할 것이다.
일부 구체예에서, 오페론의 돌연변이체 ARG 박스 또는 조절 영역에 대한 ArgR 결합 친화성은 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 박테리아에서 변형되지 않은 ARG 박스 및 박테리아의 조절 영역에 대한 ArgR 결합 친화성보다 적어도 약 50% 미만, 적어도 약 60% 미만, 적어도 약 70% 미만, 적어도 약 80% 미만, 적어도 약 90% 미만, 또는 적어도 약 95% 미만이다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 ARG 박스 및 조절 영역에 대한 감소된 ArgR 결합은 관련된 오페론의 유전자(들)의 mRNA 발현을 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 600배, 적어도 약 700배, 적어도 약 800배, 적어도 약 900배, 적어도 약 1,000배, 또는 적어도 약 1,500배만큼 증가시킨다.
일부 구체예에서, 정량적 PCR(qPCR)을 이용하여 아르기닌 생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 증폭, 검출, 및/또는 정량한다. 아르기닌 생합성 유전자, 예컨대, argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG, argH, argI, argJ, carA, 및 carB에 특이적인 프라이머를 설계하고 당 분야에 공지된 방법에 따라 샘플 중 mRNA를 검출하는데 이용할 수 있다(Fraga et al., 2008). 일부 구체예에서, 형광단을 arg mRNA를 함유할 수 있는 샘플 반응 혼합물에 첨가하고, 열 순환기를 이용하여 샘플 반응 혼합물을 특정 파장의 빛으로 조명하고 형광단에 의한 후속 방출을 검출한다. 반응 혼합물을 소정 기간 동안 소정의 온도로 가열하고 냉각시킨다. 특정 구체예에서, 가열 및 냉각은 소정 횟수의 사이클 동안 반복된다. 일부 구체예에서, 반응 혼합물을 소정 횟수의 사이클 동안 가열시키고 90-100℃, 60-70℃, 및 30-50℃로 냉각시킨다. 특정 구체예에서, 반응 혼합물을 소정 횟수의 사이클 동안 가열시키고 93-97℃, 55-65℃, 및 35-45℃로 냉각시킨다. 일부 구체예에서, 누적 앰플리콘은 각 사이클의 qPCR 후에 정량된다. 형광성이 임계를 초과하는 사이클의 수가 임계 사이클(CT)이다. 각 샘플에 대한 적어도 하나의 CT 결과가 생성되고, CT 결과(들)를 이용하여 아르기닌 생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 결정할 수 있다.
일부 구체예에서, 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 ArgA의 피드백 내성 형태, 뿐만 아니라 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상의 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 ArgA의 피드백 내성 형태, ArgR-억제성 조절 영역에 의해 유도된 아르기니노석시네이트 신타제, 뿐만 아니라 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 리아제, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 각 오페론의 각각의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다. 이러한 구체예에서, 박테리아는 시트룰린을 생산할 수 있다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 ArgA의 피드백 내성 형태, 항시적 프로모터로부터 발현된 아르기니노석시네이트 신타제, 뿐만 아니라 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 각 오페론의 각각의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다. 이러한 구체예에서, 박테리아는 아르기닌을 생산할 수 있다.
표 3은 하나 이상의 핵산 돌연변이가 아르기닌 오페론 각각의 아르기닌-매개된 억제를 감소 또는 제거시키는 돌연변이체 작제물의 예를 도시한다. 돌연변이체 작제물은 산소-수준 의존성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터에 의해 유도된 ArgA의 피드백 내성 형태를 포함한다. 각각의 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 카르바모일포스페이트 신타제, 및 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하여, ArgR 결합을 감소 또는 제거함으로써, 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성을 향상시킨다. 돌연변이체 아르기닌 레굴론 작제물의 비제한적인 예는 표 3에 제시된다.
표 3: ARG 박스 돌연변이체 작제물의 예
Figure pct00021
돌연변이는 플라스미드 또는 염색체 상에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 아르기닌 레굴론은 단일 억제인자 단백질에 의해 조절된다. 박테리아의 특정 종, 균주, 및/또는 서브타입에서, 아르기닌 레굴론은 2개의 추정상 억제인자에 의해 조절될 수 있는 것으로 제안되었다(Nicoloff et al., 2004). 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 아르기닌 레굴론은 하나를 초과하는 억제인자 단백질에 의해 조절된다.
특정 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 유전적으로 공학처리된 박테리아의 한 종, 균주, 또는 서브타입에서 발현된다. 대안적인 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 유전적으로 공학처리된 박테리아의 2개 이상의 종, 균주, 및/또는 서브타입에서 발현된다.
아르기닌 억제인자(ArgR)
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 경로에서 글루타메이트를 아르기닌 및/또는 중간 부산물로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상의 아르기닌-매개된 억제를 감소하거나 제거하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 아르기닌 레굴론을 포함한다. 일부 구체예에서, 아르기닌-매개된 억제를 감소하거나 제거하는 것은 ArgR 억제인자 결합을 감소하거나 제거함으로써, 예컨대, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 중 하나 이상에 대해 적어도 하나의 ARG 박스를 돌연변이시키거나(상기 논의됨), 아르기닌 억제인자를 돌연변이 또는 결실시킴에 의해(상기 논의됨), 및/또는 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 대한 아르기닌 결합을 감소하거나 제거함으로써(예컨대, N-아세틸글루타메이트 합성효소를 돌연변이시켜 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 생산함에 의해) 달성될 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아에는 기능성 ArgR 억제인자가 결여되어 있으므로 아르기닌 생합성 오페론 각각의 ArgR 억제인자-매개된 전사 억제가 감소하거나 제거된다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 아르기닌 억제인자 기능이 감소하거나 비활성이 되게 하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 억제인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 억제인자를 갖지 않아서(예컨대, 아르기닌 억제인자 유전자가 결실되었다), 레굴론의 탈억제 및 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성의 향상을 발생시킨다. 일부 구체예에서, 상응하는 야생형 박테리아에 일반적으로 존재하는 기능성 argR 유전자의 각 복사체는 독립적으로 결실되거나 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입, 또는 치환에 의해 비활성이 된다. 일부 구체예에서, 상응하는 야생형 박테리아에 일반적으로 존재하는 기능성 argR 유전자의 각 복사체는 결실된다.
일부 구체예에서, 아르기닌 레굴론은 단일 억제인자 단백질에 의해 조절된다. 박테리아의 특정 종, 균주, 및/또는 서브타입에서, 아르기닌 레굴론은 두 별개의 추정상 억제인자에 의해 조절될 수 있는 것으로 제안되었다(Nicoloff et al., 2004). 따라서, 특정 구체예에서, 각각 상이한 아미노산 서열을 포함하는 두 별개의 ArgR 단백질은 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 돌연변이되거나 결실된다.
일부 구체예에서, 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자를 포함하는 유전적으로 번형된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 ArgA의 피드백 내성 형태를 포함하고, 어떤 기능성 아르기닌 억제인자도 없으며, 아르기닌을 생산할 수 있다. 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 추가로 기능성 ArgG가 없고 시트룰린을 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, argR 유전자는 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 결실된다. 일부 구체예에서, argR 유전자는 돌연변이되어 ArgR 기능을 비활성화시킨다. 일부 구체예에서, argG 유전자는 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 결실된다. 일부 구체예에서, argG 유전자는 돌연변이되어 ArgR 기능을 비활성화시킨다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 argAfbr 및 결실된 ArgR을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 argAfbr, 결실된 ArgR, 및 결실된 argG를 포함한다. 일부 구체예에서, 결실된 ArgR 및/또는 결실된 argG는 박테리아의 유전체로부터 결실되고 argAfbr은 플라스미드에 존재한다. 일부 구체예에서, 결실된 ArgR 및/또는 결실된 argG는 박테리아의 유전체로부터 결실되고 argAfbr은 염색체에 의해 통합된다. 한 특수한 구체예에서, 유전적으로 변형된 박테리아는 염색체에 의해 통합된 argAfbr, 결실된 유전체 ArgR, 및 결실된 유전체 argG를 포함한다. 또 다른 특수한 구체예에서, 유전적으로 변형된 박테리아는 플라스미드 상에 존재하는 argAfbr, 결실된 유전체 ArgR, 및 결실된 유전체 argG를 포함한다. argG가 결실된 임의의 구체예에서, 아르기닌보다 시트룰린이 생산된다.
일부 구체예에서, ArgA의 피드백 내성 형태가 발현되는 조건 하에, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아에 비해 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 600배, 적어도 약 700배, 적어도 약 800배, 적어도 약 900배, 적어도 약 1,000배, 또는 적어도 약 1,500배 더 많은 아르기닌, 시트룰린, 다른 중간 부산물, 및/또는 오페론의 유전자(들)의 전사체를 생산한다.
일부 구체예에서, 정량적 PCR(qPCR)을 이용하여 아르기닌 생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 증폭, 검출, 및/또는 정량한다. 아르기닌 생합성 유전자, 예컨대, argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG, argH, argI, argJ, carA, 및 carB에 특이적인 프라이머를 설계하고, 당 분야에 공지된 방법에 따라 샘플 중 mRNA를 검출하는데 이용할 수 있다(Fraga et al., 2008). 일부 구체예에서, 형광단을 arg mRNA를 함유할 수 있는 샘플 반응 혼합물에 첨가하고, 열 순환기를 이용하여 샘플 반응 혼합물을 특정 파장의 빛으로 조명하고 형광단에 의한 후속 방출을 검출한다. 반응 혼합물을 소정 기간 동안 소정의 온도로 가열하고 냉각시킨다. 특정 구체예에서, 가열 및 냉각은 소정 횟수의 사이클 동안 반복된다. 일부 구체예에서, 반응 혼합물을 소정 횟수의 사이클 동안 가열시키고 90-100℃, 60-70℃, 및 30-50℃로 냉각시킨다. 특정 구체예에서, 반응 혼합물을 소정 횟수의 사이클 동안 가열시키고 93-97℃, 55-65℃, 및 35-45℃로 냉각시킨다. 일부 구체예에서, 누적 앰플리콘은 각 사이클의 qPCR 후에 정량된다. 형광성이 임계를 초과하는 사이클의 수가 임계 사이클(CT)이다. 각 샘플에 대한 적어도 하나의 CT 결과가 생성되고, CT 결과(들)를 이용하여 아르기닌 생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 결정할 수 있다.
피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 ArgA를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하고, 아르기닌 피드백 내성 ArgA가 발현될 때, 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 변형되지 않은 박테리아보다 많은 아르기닌 및/또는 중간 부산물을 생산할 수 있다. 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 단백질(argAfbr)는 피드백 민감성 모 균주로부터의 효소보다 L-아르기닌에 현저하게 덜 민감하다(예컨대, Eckhardt et al., 1975; Rajagopal et al., 1998을 참조하라). 피드백 내성 argA 유전자는 플라스미드 또는 염색체 상에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 플라스미드로부터의 발현은 argAfbr 발현을 증가시키는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 염색체로부터의 발현은 argAfbr 발현의 안정성을 증가시키는데 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 임의의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 박테리아의 염색체에 하나 이상의 통합 부위에서 통합된다. 예를 들어, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제를 인코딩하는 서열의 하나 이상의 복사체는 박테리아의 염색체에 통합될 수 있다. 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제의 다중 복사체를 염색체에 통합시키는 것은 N-아세틸글루타메이트 신타제의 더 큰 생산을 가능하게 하고 발현 수준의 미세-조정을 또한 허용한다. 대안적으로, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 외에, 임의의 사멸-전환 회로와 같은 본원에 기재된 상이한 회로가 하나 이상의 상이한 통합 부위에서 박테리아의 염색체에 통합되어 다수의 상이한 기능을 수행할 수 있었다.
여러 별개의 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 단백질이 당 분야에 공지되어 있고 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, argAfbr 유전자는 항시적 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 구체예에서, argAfbr 유전자는 외인성 환경 조건에 의해 유도되는 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 장에 특이적이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 포유동물의 장에 특이적인 분자 또는 대사사물, 예컨대, 프로피오네이트 또는 빌리루빈이다. 일부 구체예에서, 외인성 환경 조건은 저산소 또는 혐기성 조건, 예컨대 포유동물의 장의 환경이다.
박테리아는 산소 수준을 감지할 수 있는 전사 인자를 진화시켰다. 상이한 신호전달 경로는 상이한 산소 수준에 의해 촉발될 수 있고 상이한 동역학으로 발생한다. 산소 수준-의존성 프로모터는 하나 이상의 산소 수준-감지 전사 인자가 결합할 수 있는 핵산 서열이고, 상응하는 전사 인자의 결합 및/또는 활성화는 다운스트림 유전자 발현을 활성화시킨다. 한 구체예에서, argAfbr 유전자는 산소 수준-의존성 프로모터의 제어 하에 있다. 보다 특수한 양태에서, argAfbr 유전자는 저산소 또는 혐기성 환경, 예컨대 포유동물의 장의 환경 하에 활성화되는 산소 수준-의존성 프로모터의 제어 하에 있다.
특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 푸마레이트 및 니트레이트 환원효소 조절인자(FNR) 프로모터의 제어 하에 발현된 argAfbr을 포함한다. E. 콜라이에서, FNR은 호기성에서 혐기성 대사로의 전환을 제어하는 주요 전사 활성인자이다(Unden et al., 1997). 혐기성 상태에서, FNR은 혐기성 성장에 적응하는 것을 담당하는 수 백개의 유전자를 활성화시키는 활성 DNA 결합 단백질로 이합체화된다. 호기성 상태에서, FNR은 산소에 의한 이합체화를 방지하고 비활성화된다. 대안적인 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 대안적인 산소 수준-의존성 프로모터의 제어 하에, 예컨대, 아르기닌 데이미니아제 및 니트레이트 환원 ANR 프로모터(Ray et al., 1997), 이화적 니트레이트 호흡 조절인자 DNR 프로모터(Trunk et al., 2010)의 혐기성 조절 하에 발현된 argAfbr을 포함한다. 이러한 구체예에서, 아르기닌 생합성 경로는 장에서와 같은 저산소 또는 혐기성 환경에서 특히 활성화된다.
P. 에어루기노사(P. aeruginosa)에서, 아르기닌 데이미니아제 및 니트레이트 환원 (ANR) 전사 조절인자의 혐기성 조절은 "산소-제한적 또는 혐기성 조건 하에 유도될 수 있는 생리적 기능의 발현에 요구"된다(Winteler et al., 1996; Sawers 1991). P. 에어루기노사 ANR은 E. 콜라이 FNR과 상동이고, "컨센서스 FNR 부위(TTGAT----ATCAA)는 ANR 및 FNR에 의해 효율적으로 인지되었다"(Winteler et al., 1996). FNR과 같이, 혐기성 상태에서, ANR은 혐기성 성장에 적응하는 것을 담당하는 수많은 유전자를 활성화시킨다. 호기성 상태에서, ANR은 비활성이 된다. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 시린자에(Pseudomonas syringae), 및 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)는 모두 ANR의 기능성 유사체를 갖는다(Zimmermann et al., 1991). ANR에 의해 조절되는 프로모터는 당 분야에 공지되어 있고, 예컨대, arcDABC 오페론의 프로모터이다(예컨대, Hasegawa et al., 1998을 참조하라).
FNR 패밀리는 또한 "슈도모나스 에어루기노사의 혐기성 니트레이트 호흡"(Hasegawa et al., 1998)을 위해 ANR과 함께 요구되는 전사 조절인자인 이화적 니트레이트 호흡 조절인자(DNR)(Arai et al., 1995)를 포함한다. 특정 유전자의 경우, FNR-결합 모티프는 "아마도 DNR에 의해서만 인지된다"(Hasegawa et al., 1998). 외인성 환경 조건 및 상응하는 조절 영역에 의해 제어되는 임의의 적합한 전사 조절인자가 이용될 수 있다. 비제한적인 예는 ArcA/B, ResD/E, NreA/B/C, 및 AirSR을 포함하고, 다른 것들은 당 분야에 공지되어 있다.
일부 구체예에서, argAfbr은 포유동물의 장과 같은 환경에서 특수한 분자 또는 대사산물에 반응성인 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 예를 들어, 단쇄 지방산 프로피오네이트는 장에 국한된 주요 미생물 발효 대사산물이다(Hosseini et al., 2011). 한 구체예에서, argAfbr 유전자 발현은 프로피오네이트-유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 보다 특수한 구체예에서, argAfbr 유전자 발현은 포유동물의 장에서 프로피오네이트의 존재에 의해 활성화되는 프로피오네이트-유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 건강하고/거나 질병 상태인 포유동물의 장에서 발견되는 임의의 분자 또는 대사산물을 이용하여 argAfbr 발현을 유도할 수 있다. 비제한적인 예는 프로피오네이트, 빌리루빈, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 혈액 응고 인자 II, VII, IX, 및 X, 알칼리 포스파타제, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, 간염 항원 및 항체, 알파 태아단백질, 항-미토콘드리아, 평활근, 및 및 항-핵 항체, 철, 트랜스페린, 페리틴, 구리, 세룰로플라스민, 암모니아, 및 망간을 포함한다. 대안적인 구체예에서, argAfbr 유전자 발현은 당 아라비노스의 존재 하에 활성화되는 pBAD 프로모터의 제어 하에 있다(예컨대, 도 18을 참조하라).
간 뇌병증(HE) 및 다른 간 질환 또는 질병을 갖는 대상체는 이들의 혈액 및 창자에 높은 암모니아 수준을 발생시키는 만성 간 손상을 갖는다. 암모니아 외에, 이들 환자는 또한 이들의 혈액 및 창자에 상승된 수준의 빌리루빈, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 혈액 응고 인자 II, VII, IX, 및 X, 알칼리 포스파타제, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, 간염 항원 및 항체, 알파 태아단백질, 항-미토콘드리아, 평활근, 및 항-핵 항체, 철, 트랜스페린, 페리틴, 구리, 세룰로플라스민, 암모니아, 및 망간을 갖는다. 이러한 HE-관련 분자 또는 이들의 대사산물 중 하나에 반응하는 프로모터를 이용하여 HE 환자의 창자에서 argAfbr을 발현하기 위해서만 유도될 본 발명의 박테리아를 공학처리할 수 있다. 이러한 프로모터는 UCD 환자에서는 유도되지 않을 것으로 예상된다.
일부 구체예에서, argAfbr 유전자는 테트라사이클린으로의 노출에 의해 유도되는 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 구체예에서, 유전자 발현은 당 분야에 공지된 방법에 의해, 예컨대, 리보솜 결합 부위의 최적화, 전사 조절인자의 조작, 및/또는 mRNA 안정성의 증가에 의해 추가로 최적화된다.
일부 구체예에서, N-아세틸글루타메이트 합성효소의 아르기닌 피드백 억제는, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소가 활성일 때, 동일한 조건 하에 동일한 서브타입의 박테리아로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해, 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 argAfbr 유전자를 지니는 안정하게 유지된 플라스미드 또는 염색체를 포함하여, argAfbr이 숙주 세포에서 발현될 수 있게 하고, 숙주 세포가 시험관내, 예컨대, 배지에서, 및/또는 생체내, 예컨대, 장에서 생존 및/또는 성장할 수 있게 한다. 일부 구체예에서, 박테리아는 피드백 내성 argA 유전자의 다중 복사체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 저-복사체 플라스미드 상에서 발현된다. 일부 구체예에서, 저-복사체 플라스미드는 발현의 안정성을 증가시키는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 저-복사체 플라스미드는 비유도성 조건 하에 누출 발현을 감소시키는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 고-복사체 플라스미드 상에서 발현된다. 일부 구체예에서, 고-복사체 플라스미드는 argAfbr 발현을 증가시키는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 염색체 상에서 발현된다. 일부 구체예에서, 박테리아는 동일한 생성물의 다중 복사체를 생산하는 회로 또는 다수의 상이한 기능을 수행하는 회로와 같은 다중 작용 메커니즘(MOA)을 포함하도록 유전적으로 공학처리된다. 삽입 부위의 예는 비제한적으로 malE/K, insB/I, araC/BAD, lacZ, dapA, cea, 및 도 22에 도시된 다른 것들을 포함한다. 예를 들어, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 4개의 상이한 삽입 부위, 예컨대, malE/K, insB/I, araC/BAD, 및 lacZ에서 삽입된 argAfbr의 4개의 복사체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 3개의 상이한 삽입 부위, 예컨대, malE/K, insB/I, 및 lacZ에서 삽입된 argAfbr의 3개의 복사체, 및 3개의 상이한 삽입 부위 dapA, cea, 및 araC/BAD에서 삽입된, 시트룰린을 생산하는 2개 및 아르기닌을 생산하는 1개와 같은 3개의 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 플라스미드 또는 염색체는 또한 야생형 ArgR 결합 부위, 예컨대, ARG 박스를 포함한다. 일부 예에서, 기능성 ArgR의 존재 및/또는 축적은 ARG 박스 이외의 부위에서 오프-타겟 결합을 발생시킬 수 있고, 이는 유전자 발현에서 오프-타겟 변화를 초래할 수 있다. 기능성 ARG 박스를 추가로 포함하는 플라스미드 또는 염색체를 이용하여, 즉 ArgR 싱크 역할을 함으로써, 오프-타겟 ArgR 결합을 감소시키거나 제거할 수 있다. 일부 구체예에서, 플라스미드 또는 염색체는 기능성 ArgR 결합 부위를 포함하지 않고, 예컨대, 플라스미드 또는 염색체는 변형된 ARG 박스를 포함하거나 ARG 박스를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 플라스미드 상에 존재하고 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 염색체에 존재하고 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 플라스미드 상에 존재하고 포유동물의 장에 특이적인 분자 또는 대사산물에 의해 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 염색체 상에 존재하고 포유동물의 장에 특이적인 분자 또는 대사산물에 의해 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 염색체 상에 존재하고 테트라사이클린으로의 노출에 의해 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 피드백 내성 argA 유전자는 플라스미드 상에 존재하고 테트라사이클린으로의 노출에 의해 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 동일한 생성물의 다중 복사체를 생산하는 회로(복사체 수를 향상시킴) 또는 다수의 상이한 기능을 수행하는 회로와 같은 다중 작용 메커니즘(MOA)을 포함한다. 삽입 부위의 예는 malE/K, insB/I, araC/BAD, lacZ, dapA, cea, 및 도 22에 도시된 다른 것들을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 상응하는 산소 수준-의존성 프로모터 외에, 변이체 또는 돌연변이된 산소 수준-의존성 전사 조절인자, 예컨대, FNR, ANR, 또는 DNR을 포함한다. 변이체 또는 돌연변이된 산소 수준-의존성 전사 조절인자는 저산소 또는 혐기성 환경에서 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 상응하는 야생형 전사 조절인자는 야생형 활성을 보유한다. 대안적인 구체예에서, 상응하는 야생형 전사 조절인자는 야생형 활성을 감소시키거나 제거하도록 결실되거나 돌연변이된다. 특정 구체예에서, 돌연변이체 산소 수준-의존성 전사 조절인자는 이합체화 및 FNR 활성을 향상시키는 아미노산 치환을 포함하는 FNR 단백질이다(예컨대, Moore et al., 2006을 참조하라).
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 저산소 또는 혐기성 환경에서 암모니아를 감소시키고/거나 소비하는 상이한 박테리아의 종으로부터의 산소 수준-의존성 전사 조절인자를 포함한다. 특정 구체예에서, 돌연변이체 산소 수준-의존성 전사 조절인자는 N. 고노르호에아에로부터의 FNR 단백질이다(예컨대, Isabella et al., 2011을 참조하라). 일부 구체예에서, 상응하는 야생형 전사 조절인자는 무손상인 채로 남겨지고 야생형 활성을 보유한다. 대안적인 구체예에서, 상응하는 야생형 전사 조절인자는 야생형 활성을 감소시키거나 제거하도록 결실되거나 돌연변이된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 산소 수준-의존성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터의 제어 하에 발현된 argAfbr, 뿐만 아니라 상기 논의된 대로 하나 이상의 ARG 박스 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 조절 영역의 제어 하에 발현된 야생형 argA를 포함한다. 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 산소 수준-의존성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터의 존재 하에 발현된 argAfbr을 포함하고 야생형 argA를 포함하지 않는다. 또한 다른 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 산소 수준-의존성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터의 제어 하에 발현된 argAfbr을 포함하고, 임의의 ARG 박스 돌연변이가 없는 야생형 argA를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 플라스미드 및/또는 염색체로부터 ArgAfbr을 발현시킨다. 일부 구체예에서, argAfbr 유전자는 항시적 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 구체예에서, argAfbr 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, argAfbr은 저산소 또는 혐기성 환경에서 활성화되는 산소 수준-의존성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터의 제어 하에 발현된다. FNR 프로모터-유도된 argAfbr 플라스미드의 핵산 서열은 도 8에 도시되며, FNR 프로모터 서열은 굵게 표시되고 argAfbr 서열은
Figure pct00022
로 표시된다.
FNR 프로모터 서열은 당 분야에 공지되어 있고, 임의의 적합한 FNR 프로모터 서열(들)이 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아에 이용될 수 있다. 임의의 적합한 FNR 프로모터(들)는 임의의 적합한 피드백-내성 ArgA(예시적인 서열, SEQ ID NO: 8A)와 조합될 수 있다. 비제한적인 FNR 프로모터 서열은 도 7에서 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, nirB1 프로모터(SEQ ID NO: 18), nirB2 프로모터(SEQ ID NO: 19), nirB3 프로모터(SEQ ID NO: 20), ydfZ 프로모터(SEQ ID NO: 21), 강력한 리보솜 결합 부위에 융합된 nirB 프로모터(SEQ ID NO: 22), 강력한 리보솜 결합 부위에 융합된 ydfZ 프로모터(SEQ ID NO: 23), fnrS, 혐기적으로 유도된 작은 RNA 유전자(fnrS1 프로모터 SEQ ID NO: 24 또는 fnrS2 프로모터 SEQ ID NO: 25), crp 결합 부위에 융합된 nirB 프로모터(SEQ ID NO: 26), 및 crp 결합 부위에 융합된 fnrS(SEQ ID NO: 27) 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 SEQ ID NO: 28의 핵산 서열 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 유전 부호의 중복이 아니라면, SEQ ID NO: 28과 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 SEQ ID NO: 28의 DNA 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 상동인 핵산 서열, 또는 유전 부호의 중복이 아니라면, SEQ ID NO: 28과 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, argAfbr은 전사 활성인자, 예컨대, CRP에 대한 결합 부위에 융합된 산소 수준-의존성 프로모터의 제어 하에 발현된다. CRP(사이클릭 AMP 수용체 단백질 또는 분해대사산물 활성인자 단백질 또는 CAP)는 신속하게 대사가능한 탄수화물, 예컨대 글루코스가 존재할 때 덜 바람직한 탄소원의 흡수, 대사 및 동화를 담당하는 유전자를 억제함에 의해 박테리아에서 주요 조절 임무를 수행한다(Wu et al., 2015). 글루코스에 대한 이러한 선호는 글루코스 억제, 뿐만 아니라 탄소 분해대사산물 억제로 명명되었다(Deutscher, 2008; Gorke and Stulke, 2008). 일부 구체예에서, argAfbr 발현은 CRP 결합 부위에 융합된 산소 수준-의존성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구체예에서, argAfbr 발현은 CRP 결합 부위에 융합된 FNR 프로모터에 의해 제어된다. 이러한 구체예에서, 글루코스가 환경에 존재하지 않을 때 사이클릭 AMP는 CRP에 결합한다. 이러한 결합은 CRP에서 입체형태 변화를 초래하고, CRP가 이의 결합 부위에 단단하게 결합하도록 한다. 그 후 CRP 결합은 직접적인 단백질-단백질 상호작용을 통해 RNA 중합효소를 FNR 프로모터로 동원함으로써 argAfbr 유전자의 전사를 활성화시킨다. 글루코스의 존재 하에, 사이클릭 AMP는 CRP에 결합하지 않고 argAfbr 유전자 전사는 억제된다. 일부 구체예에서, 전사 활성인자에 대한 결합 부위에 융합된 산소 수준-의존성 프로모터(예컨대, FNR 프로모터)를 이용하여, argAfbr이, 예컨대 글루코스를 시험관내에서 성장 배지에 첨가함에 의해 충분한 양의 글루코스가 존재할 때 혐기성 조건 하에 발현되지 않도록 보장한다.
아르기닌 분해대사
본 발명을 실시함에 있어서 중요한 고려사항은 암모니아가 아르기닌 및/또는 시트룰린 분해대사의 부산물로서 과생산되지 않도록 보장하는 것이다. 우레아 사이클의 마지막 효소적 단계에서, 아르기나제는 아르기닌의 오르니틴 및 우레아로의 가수분해 절단을 촉매화한다(Cunin et al., 1986). 장 박테리아에 의해 생산될 수 있는 우레아제는 우레아의 이산화탄소 및 암모니아로의 절단을 촉매화한다(Summerskill, 1966; Aoyagi et al., 1966; Cunin et al., 1986). 따라서, 우레아제 활성은 "인간 조직에 독성"일 수 있는 암모니아를 생성할 수 있다(Konieczna et al., 2012). E. 콜라이 Nissle을 포함하는 일부 박테리아에서, 유전자 arcD는 암모니아를 또한 유리시킬 수 있는 아르기닌/오르니틴 역수송체를 인코딩한다(Vander Wauven et al., 1984; Gamper et al., 1991; Meng et al., 1992).
AstA는 아르기닌에서 석시네이트로의 전환에 관여하는 효소이고, 이는 암모니아를 유리시킨다. SpeA는 아르기닌에서 아그마틴으로의 전환에 관여하는 효소이고, 이는 더 분해대사되어 암모니아를 생산할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 아르기닌의 분해를 막는 것이 유리할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 분해대사를 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 추가로 포함하여, 추가 암모니아 생산을 감소시키거나 제거한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 ArcD 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, ArcD는 결실된다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 AstA 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, AstA는 결실된다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 SpeA 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, SpeA는 결실된다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 아르기나제 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 아르기나제는 결실된다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 우레아제 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 우레아제는 결실된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 분해대사에 관여하는 하나 이상의 다른 유전자가 돌연변이되거나 결실된다.
필수 유전자 및 영양요구균주
본원에서 사용되는 용어 "필수 유전자"는 세포 성장 및/또는 생존에 필수적인 유전자를 언급한다. 박테리아의 필수 유전자는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 유전자의 지정 결실 및/또는 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, Zhang and Lin, 2009, DEG 5.0, a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes, Nucl. Acids Res., 37:D455-D458 and Gerdes et al., Essential genes on metabolic maps, Curr. Opin. Biotechnol., 17(5):448-456을 참조하라. 각각의 전체 내용은 명백하게 참조로서 본원에 포함됨).
"필수 유전자"는 유기체가 사는 배경 및 환경에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 필수 유전자의 돌연변이, 변형, 또는 절제는 영양요구균주가 되는 본 설명의 재조합체 박테리아를 발생시킬 수 있다. 영양요구성 변형은 박테리아가 필수 영양소를 생산하는데 필요한 유전자(들)가 부족하므로 생존 또는 성장에 필수적인 외인성 첨가된 영양소의 부재 하에 박테리아를 죽이려는 의도이다.
영양요구성 변형은 박테리아가 필수 영양소를 생산하는데 필요한 유전자(들)가 부족하므로 생존 또는 성장에 필수적인 외인성 첨가된 영양소의 부재 하에 박테리아를 죽이려는 의도이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 세포 생존 및/또는 성장에 요구되는 유전자의 결실 또는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 필수 유전자는 DNA 합성 유전자, 예를 들어, thyA이다. 다른 구체예에서, 필수 유전자는 세포벽 합성 유전자, 예를 들어, dapA이다. 또한 다른 구체예에서, 필수 유전자는 아미노산 유전자, 예를 들어, serA 또는 MetA이다. 비제한적으로 cysE, glnA, ilvD, leuB, lysA, serA, metA, glyA, hisB, ilvA, pheA, proA, thrC, trpC, tyrA, thyA, uraA, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, flhD, metB, metC, proAB, 및 thi1을 포함하는 세포 생존 및/또는 성장에 요구되는 임의의 유전자는, 상응하는 야생형 유전자 생성물이 박테리아에서 생산되지 않는 한, 표적화될 수 있다. 예를 들어, 티민은 박테리아의 세포 성장에 요구되는 핵산이다; 이의 부재 하에, 박테리아는 세포 사멸을 겪는다. thyA 유전자는 dUMP를 dTMP로 전환시킴에 의해 티민 합성의 첫 번째 단계를 촉매화하는 효소인 티미딜레이트 합성효소를 인코딩한다(Sat et al., 2003). 일부 구체예에서, 본 발명의 박테리아의 세포는 thyA 유전자가 결실되고/거나 비관련 유전자로 대체된 thyA 영양요구균주이다. thyA 영양요구균주는, 예컨대, 티민을 성장 배지에 시험관내 첨가함에 의해 충분한 양의 티민이 존재할 때에만, 또는 생체내 인간 장에서 자연적으로 발견되는 높은 티민 수준의 존재 하에, 성장할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 박테리아의 세포는 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되는 유전자에서 영양요구성이다. 충분한 양의 티민이 없으면, thyA 영양요구균주는 죽는다. 일부 구체예에서, 영양요구성 변형을 이용하여 박테리아의 세포가 영양요구성 유전자 생성물의 부재 하에(예컨대, 장의 외부에서) 생존하지 않도록 보장한다.
디아미노피멜산(DAP)은 리신 생합성 경로 내에서 합성된 아미노산이고 박테리아의 세포벽 성장에 요구된다(Meadow et al., 1959; Clarkson et al., 1971). 일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 dapD가 결실되고/거나 비관련 유전자로 대체된 dapD 영양요구균주이다. dapD 영양요구균주는, 예컨대, DAP를 성장 배지에 시험관내 첨가함에 의해 충분한 양의 DAP가 존재할 때에만 성장할 수 있다. 충분한 양의 DAP가 없으면, dapD 영양요구균주는 죽는다. 일부 구체예에서, 영양요구성 변형을 이용하여 박테리아의 세포가 영양요구성 유전자 생성물의 부재 하에(예컨대, 장의 외부에서) 생존하지 않도록 보장한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 uraA가 결실되고/거나 비관련 유전자로 대체된 uraA 영양요구균주이다. uraA 유전자는 피리미딘 우라실의 흡수 및 후속 대사를 촉진하는 막-결합 수송체인 UraA를 코딩한다(Andersen et al., 1995). uraA 영양요구균주는, 예컨대, 우라실을 성장 배지에 시험관내 첨가함에 의해 충분한 양의 우라실이 존재할 때에만 성장할 수 있다. 충분한 양의 우라실이 없으면, uraA 영양요구균주는 죽는다. 일부 구체예에서, 영양요구성 변형을 이용하여 박테리아가 영양요구성 유전자 생성물의 부재 하에(예컨대, 장의 외부에서) 생존하지 않도록 보장한다.
복합체 집단에서, 박테리아는 DNA를 공유할 수 있다. 매우 드문 경우에, 영양요구성 박테리아의 균주는 비-영양요구성 균주로부터 DNA를 받을 수 있고, 이는 유전체 결실을 복구하고 영양요구균주를 영구적으로 구제한다. 따라서, 박테리아의 균주를 하나를 초과하는 영양요구균주로 공학처리하는 것은 DNA 이동이 영양요구성을 구제하기에 충분한 시간 동안 발생할 가능성을 크게 낮출 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 세포 생존 및/또는 성장에 요구되는 2개 이상의 유전자에 결실 또는 돌연변이를 포함한다.
필수 유전자의 다른 예는 yhbV, yagG, hemB, secD, secF, ribD, ribE, thiL, dxs, ispA, dnaX, adk, hemH, lpxH, cysS, fold, rplT, infC, thrS, nadE, gapA, yeaZ, aspS, argS, pgsA, yefM, metG, folE, yejM, gyrA, nrdA, nrdB, folC, accD, fabB, gltX, ligA, zipA, dapE, dapA, der, hisS, ispG, suhB, tadA, acpS, era, rnc, ftsB, eno, pyrG, chpR, lgt, fbaA, pgk, yqgD, metK, yqgF, plsC, ygiT, pare, ribB, cca, ygjD, tdcF, yraL, yihA, ftsN, murI, murB, birA, secE, nusG, rplJ, rplL, rpoB, rpoC, ubiA, plsB, lexA, dnaB, ssb, alsK, groS, psd, orn, yjeE, rpsR, chpS, ppa, valS, yjgP, yjgQ, dnaC, ribF, lspA, ispH, dapB, folA, imp, yabQ, ftsL, ftsI, murE, murF, mraY, murD, ftsW, murG, murC, ftsQ, ftsA, ftsZ, lpxC, secM, secA, can, folK, hemL, yadR, dapD, map, rpsB, infB, nusA, ftsH, obgE, rpmA, rplU, ispB, murA, yrbB, yrbK, yhbN, rpsI, rplM, degS, mreD, mreC, mreB, accB, accC, yrdC, def, fmt, rplQ, rpoA, rpsD, rpsK, rpsM, entD, mrdB, mrdA, nadD, hlepB, rpoE, pssA, yfiO, rplS, trmD, rpsP, ffh, grpE, yfjB, csrA, ispF, ispD, rplW, rplD, rplC, rpsJ, fusA, rpsG, rpsL, trpS, yrfF, asd, rpoH, ftsX, ftsE, ftsY, frr, dxr, ispU, rfaK, kdtA, coaD, rpmB, dfp, dut, gmk, spot, gyrB, dnaN, dnaA, rpmH, rnpA, yidC, tnaB, glmS, glmU, wzyE, hemD, hemC, yigP, ubiB, ubiD, hemG, secY, rplO, rpmD, rpsE, rplR, rplF, rpsH, rpsN, rplE, rplX, rplN, rpsQ, rpmC, rplP, rpsC, rplV, rpsS, rplB, cdsA, yaeL, yaeT, lpxD, fabZ, lpxA, lpxB, dnaE, accA, tilS, proS, yafF, tsf, pyrH, olA, rlpB, leuS, lnt, glnS, fldA, cydA, infA, cydC, ftsK, lolA, serS, rpsA, msbA, lpxK, kdsB, mukF, mukE, mukB, asnS, fabA, mviN, rne, yceQ, fabD, fabG, acpP, tmk, holB, lolC, lolD, lolE, purB, ymfK, minE, mind, pth, rsA, ispE, lolB, hemA, prfA, prmC, kdsA, topA, ribA, fabI, racR, dicA, ydfB, tyrS, ribC, ydiL, pheT, pheS, yhhQ, bcsB, glyQ, yibJ, 및 gpsA를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 필수 유전자는 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 합성 리간드-의존성 필수 유전자(SLiDE) 박테리아의 세포이다. SLiDE 박테리아의 세포는 특정 리간드의 존재 하에서만 성장할 수 있는 하나 이상의 필수 유전자에 돌연변이를 갖는 합성 영양요구균주이다(Lopez and Anderson "Synthetic Auxotrophs with Ligand-Dependent Essential Genes for a BL21 (DE3 Biosafety Strain, "ACS Synthetic Biology (2015) DOI: 10.1021/acssynbio.5b00085을 참조하라. 이의 전체 내용은 명백하게 참조로서 본원에 포함됨).
일부 구체예에서, SLiDE 박테리아의 세포는 필수 유전자에 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 pheS, dnaN, tyrS, metG 및 adk로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 dnaN이다: H191N, R240C, I317S, F319V, L340T, V347I, 및 S345C. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 돌연변이 H191N, R240C, I317S, F319V, L340T, V347I, 및 S345C를 포함하는 dnaN이다. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 pheS이다: F125G, P183T, P184A, R186A, 및 I188L. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 돌연변이 F125G, P183T, P184A, R186A, 및 I188L을 포함하는 pheS이다. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 tyrS이다: L36V, C38A 및 F40G. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 돌연변이 L36V, C38A 및 F40G를 포함하는 tyrS이다. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 metG이다: E45Q, N47R, I49G, 및 A51C. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 돌연변이 E45Q, N47R, I49G, 및 A51C를 포함하는 metG이다. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 adk이다: I4L, L5I 및 L6G. 일부 구체예에서, 필수 유전자는 돌연변이 I4L, L5I 및 L6G를 포함하는 adk이다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 리간드에 의해 보충된다. 일부 구체예에서, 리간드는 벤조티아졸, 인돌, 2-아미노벤조티아졸, 인돌-3-부티르산, 인돌-3-아세트산, 및 L-히스티딘 메틸 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, metG에 돌연변이(E45Q, N47R, I49G, 및 A51C)를 포함하는 박테리아의 세포는 벤조티아졸, 인돌, 2-아미노벤조티아졸, 인돌-3-부티르산, 인돌-3-아세트산 또는 L-히스티딘 메틸 에스테르에 의해 보충된다. dnaN에 돌연변이(H191N, R240C, I317S, F319V, L340T, V347I, 및 S345C)를 포함하는 박테리아의 세포는 벤조티아졸, 인돌 또는 2-아미노벤조티아졸에 의해 보충된다. pheS에 돌연변이(F125G, P183T, P184A, R186A, 및 I188L)를 포함하는 박테리아의 세포는 벤조티아졸 또는 2-아미노벤조티아졸에 의해 보충된다. tyrS에 돌연변이(L36V, C38A, 및 F40G)를 포함하는 박테리아의 세포는 벤조티아졸 또는 2-아미노벤조티아졸에 의해 보충된다. adk에 돌연변이(I4L, L5I 및 L6G)를 포함하는 박테리아의 세포는 벤조티아졸 또는 인돌에 의해 보충된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 이것이 리간드에 대해 영양요구성이 되게 하는 하나를 초과하는 돌연변이체 필수 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 박테리아의 세포는 2개의 필수 유전자에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 박테리아의 세포는 tyrS(L36V, C38A, 및 F40G) 및 metG(E45Q, N47R, I49G, 및 A51C)에 돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 박테리아의 세포는 3개의 필수 유전자에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 박테리아의 세포는 tyrS(L36V, C38A, 및 F40G), metG(E45Q, N47R, I49G, 및 A51C), 및 pheS(F125G, P183T, P184A, R186A, 및 I188L)에 돌연변이를 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 필수 유전자(들)가 도 39, 49, 62, 및 63에 도시된 아라비노스 시스템을 이용하여 대체된 조건 영양요구균주이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 영양요구균주이고 또한 본원에 기재된 임의의 사멸-전환 구성요소 및 시스템과 같은 사멸-전환 회로를 포함한다. 예를 들어, 재조합체 박테리아는 세포 생존 및/또는 성장에 필요한 필수 유전자, 예를 들어, DNA 합성 유전자, 예를 들어, thyA, 세포벽 합성 유전자, 예를 들어, dapA 및/또는 아미노산 유전자, 예를 들어, serA 또는 MetA에 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있고 또한 환경 조건(들) 및/또는 신호(들)(예컨대, 기재된 아라비노스 시스템)에 반응하여 발현되는 하나 이상의 전사 활성인자에 의해 조절되거나 외인성 환경 조건(들) 및/또는 신호(들)(예컨대, 본원에 기재되고 도 39, 40, 및 50의 재조합효소 시스템) 감지시 발현되는 하나 이상의 재조합효소에 의해 조절되는 독소 유전자를 포함할 수 있다. 다른 구체예는 문헌[Wright et al., "GeneGuard: A Modular Plasmid System Designed for Biosafety," ACS Synthetic Biology (2015) 4: 307-16, 이의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로서 포함됨]에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 영양요구균주이고, 또한 본원에 기재된 임의의 사멸-전환 구성요소 및 시스템과 같은 사멸-전환 회로, 뿐만 아니라 또 다른 생물보안 시스템, 예컨대, 조건적인 복제 기점을 포함한다(Wright et al.을 참조하라, 상술됨).
다른 구체예에서, 영양요구성 변형은 또한 과도한 암모니아를 소비하는 돌연변이체 박테리아에 대한 스크리닝에 이용될 수 있다. 보다 특수한 양태에서, 영양요구성 변형은 아르기닌을 과생산함에 의해 과도한 암모니아를 소비하는 돌연변이체 박테리아에 대한 스크리닝에 이용될 수 있다. 본원에 기재된 대로, 아르기닌 대사에 수반된 많은 유전자는 아르기닌과 ArgR의 상호작용을 통해 아르기닌에 의해 억제된다. astC 유전자 프로모터는, 아르기닌-ArgR 복합체가, 전사 억제인자와 반대로, 전사 활성인자로서 작용한다는 점에서 독특하다. AstC는 암모니아-생산 아르기닌 석시닐트랜스퍼라제(AST) 경로의 세 번째 효소이고 E. 콜라이에서 astCADBE 오페론 중 처음인 석시닐오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩한다(Schneider et al., 1998). 특정 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 유전자에 대해 영양요구성이고, astC 프로모터의 제어 하에 영양요구성 유전자 생성물을 발현시킨다. 이러한 구체예에서, 영양요구성은 양성 피드백 메커니즘의 대상이고 아르기닌을 과생산함에 의해 과도한 암모니아를 소비하는 돌연변이체 박테리아를 선택하는데 이용된다. 양성 피드백 영양요구균주의 비제한적인 예는 도 33a 및 33b에 도시된다.
유전자 조절성 회로
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 본원에 기재된 작제물을 발현시키기 위한 다층화된 유전자 조절성 회로를 포함한다(예컨대, 미국 가특허 출원 62/184,811호를 참조하라. 이의 전문은 본원에 참조로서 포함됨).
특정 구체예에서, 본 발명은 아르기닌을 과생산하는 유전적으로 공학처리된 박테리아를 선택하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 대안적인 대사 경로, 예컨대, 히스티딘 생합성 경로, 메티오닌 생합성 경로, 리신 생합성 경로, 아스파라긴 생합성 경로, 글루타민 생합성 경로, 및 트립토판 생합성 경로를 통해 과도한 암모니아를 소비하는 유전적으로 공학처리된 박테리아를 선택하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 ArgR-조절된 2개-억제인자 활성화 유전자 조절성 회로를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아를 제공한다. 2개-억제인자 활성화 유전자 조절성 회로는 암모니아를 감소시키거나 영양요구균주를 구제하는 돌연변이체 박테리아에 대한 스크리닝에 유용하다. 일부 작제물에서, 높은 수준의 아르기닌 및 아르기닌에 의한 ArgR의 결과적인 활성화는 검출가능한 표지 또는 세포 생존에 요구되는 필수 유전자의 발현을 초래할 수 있다.
2개-억제인자 활성화 조절성 회로는 제1 ArgR 및 제2 억제인자, 예컨대, Tet 억제인자를 포함한다. 이러한 구체예의 한 양태에서, ArgR은 제2 억제인자의 전사를 억제하고, 이는 과도한 암모니아를 소비하는 돌연변이체에 대해 스크리닝하는데 이용될 수 있는 관심 특정 유전자, 예컨대, 검출가능한 생성물, 및/또는 세포 생존에 요구되는 필수 유전자의 전사를 억제한다. 임의의 검출가능한 생성물이 이용될 수 있고, 이는 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 및 형광 단백질, 예컨대 GFP를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 제2 억제인자는 Tet 억제인자 단백질(TetR)이다. 이러한 구체예에서, 야생형 ARG 박스를 포함하는 ArgR-억제성 프로모터는 TetR의 발현을 유도시키고, TetR-억제성 프로모터는 적어도 하나의 관심 유전자, 예컨대, GFP의 발현을 유도시킨다. ArgR 결합의 부재 하에(낮은 아르기닌 농도에서 발생함), tetR은 전사되고, TetR은 GFP 발현을 억제한다. ArgR 결합의 존재 하에(높은 아르기닌 농도에서 발생함), tetR 발현은 억제되고, GFP가 생성된다. 이러한 구체예에 유용한 다른 제2 억제인자의 예는 ArsR, AscG, LacI, CscR, DeoR, DgoR, FruR, GalR, GatR, CI, LexA, RafR, QacR, 및 PtxS를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다(US20030166191). 일부 구체예에서, 전환을 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 돌연변이유발을 겪고, 아르기닌을 과생산함에 의해 암모니아를 감소시키는 돌연변이체는 검출가능한 생성물의 수준에 기반하여, 예컨대, 유세포계수법, 검출가능한 생성물이 형광을 낼 때 형광-활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 선택된다,
일부 구체예에서, 관심 유전자는 박테리아의 생존 및/또는 성장에 요구되는 것이다. 상응하는 야생형 유전자가 ArgR의 제어 하에 있을 때를 제외하고는 유전자 생성물을 생산하지 않도록 제거되거나 돌연변이되는 한, 임의의 그러한 유전자가 이용될 수 있고, 이는 비제한적으로 cysE, glnA, ilvD, leuB, lysA, serA, metA, glyA, hisB, ilvA, pheA, proA, thrC, trpC, tyrA, thyA, uraA, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, flhD, metB, metC, proAB, 및 thi1을 포함한다. 일부 구체예에서, 야생형 ARG 박스를 포함하는 ArgR-억제성 프로모터는 TetR 단백질의 발현을 유도시키고, TetR-억제성 프로모터는 박테리아의 생존 및/또는 성장에 필요한 적어도 하나의 유전자, 예컨대, thyA, uraA의 발현을 유도시킨다(Sat et al., 2003). 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되지 않는 유전자에서 영양요구성이고, 상기 유전자는 박테리아에 존재하는 제2 유도성 유전자에 의해 보충되고; 제2 유전자의 전사는 ArgR-억제성이고 충분히 높은 아르기닌 농도의 존재 하에 유도된다(이에 따라 영양요구성 유전자를 보충함). 일부 구체예에서, 2개-억제인자 활성화 회로를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 돌연변이유발을 겪고, 과도한 암모니아를 감소시키는 돌연변이체가 생존 및/또는 성장에 필요한 유전자 생성물의 부재 하에서의 성장에 의해 선택된다. 일부 구체예에서, 2개-억제인자 활성화 회로를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 이용하여 박테리아가 높은 수준의 아르기닌의 부재 하에(예컨대, 장의 외부에서) 생존하지 않도록 보장한다.
숙주-플라스미드 상호 의존성
일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 숙주-플라스미드 상호 의존성을 생성하도록 변형된 플라스미드를 포함한다. 특정 구체예에서, 상호 의존적인 숙주-플라스미드 플랫폼은 GeneGuard이다(Wright et al., 2015). 일부 구체예에서, GeneGuard 플라스미드는 (i) 필수 복제 개시제 단백질이 트랜스로(in trans) 제공되는, 조건적인 복제 기점; (ii) 유전체 전위를 통해 숙주에 의해 구제되고 또한 풍부한 배지에 사용하기 위해 상용성인 영양요구성 변형; 및/또는 (iii) 광범한-스펙트럼 독소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 독소 유전자는 플라스미드 DNA 자체를 항-독소를 발현하지 않는 균주(예컨대, 야생형 박테리아)에 불리하게 만듦에 의해 플라스미드 확산을 도태시키는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, GeneGuard 플라스미드는 항생제 선택 없이 적어도 100세대 동안 안정하다. 일부 구체예에서, GeneGuard 플라스미드는 숙주의 성장을 파괴하지 않는다. GeneGuard 플라스미드를 이용하여 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 의도하지 않은 플라스미드 증식을 크게 감소시킨다.
상호 의존적인 숙주-플라스미드 플랫폼은 단독으로 또는 본원에 기재된 것들과 같은 다른 생물안전 메커니즘(예컨대, 사멸 전환, 영양요구성)과 함께 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 GeneGuard 플라스미드를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 GeneGuard 플라스미드 및/또는 하나 이상의 사멸 전환을 포함한다. 다른 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 GeneGuard 플라스미드 및/또는 하나 이상의 영양요구성을 포함한다. 또한 다른 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 GeneGuard 플라스미드, 하나 이상의 사멸 전환, 및/또는 하나 이상의 영양요구성을 포함한다.
사멸 전환
일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 사멸 전환을 포함한다(예컨대, 전문이 본원에 참조로서 포함되는 미국 가특허 출원 62/183,935호 및 62/263,329호를 참조하라). 사멸 전환은 외부 자극에 반응하여 공학처리된 미생물을 능동적으로 사멸시키기 위한 것이다. 박테리아에 생존을 위한 필수 영양소가 없기 때문에 죽는 영양요구성 돌연변이와 반대로, 사멸 전환은 세포 사멸을 야기시키는 미생물 내 독성 분자의 생산을 유도하는 환경의 특정 인자에 의해 촉발된다.
사멸 전환을 갖도록 공학처리된 박테리아는 시험관내 연구 목적으로, 예컨대 실험실 환경 외부에서 바이오연료-생산 미생물의 확산을 제한하도록 공학처리되었다. 질환 또는 질병을 치료하기 위해 생체내 투여용으로 공학처리된 박테리아는 또한, 치료 유전자(들)와 같은 이종성 유전자 또는 유전자들의 발현 및 전달 후, 또는 대상체가 치료 효과를 경험한 후, 특정 시간에 죽도록 프로그래밍될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 사멸 전환은 argAfbr의 산소 수준-의존성 발현 후 소정의 시간이 지난 후에 박테리아를 사멸시키기 위해 활성화된다. 일부 구체예에서, 사멸 전환은 argAfbr의 산소 수준-의존성 발현 후, 예를 들어, 아르기닌 또는 시트룰린의 생산 후 지연된 양상으로 활성화된다. 대안적으로, 박테리아는 박테리아가 질병 부위 밖으로 퍼졌을 때 죽도록 공학처리될 수 있다. 구체적으로, 미생물에 의한 대상체의 장기 콜로니화, 대상체 내의 관심 영역 밖으로(예를 들어, 장의 외부) 미생물의 확산, 또는 대상체 외부의 환경으로의 미생물의 확산(예를 들어, 대상체의 대변을 통해 환경으로 확산)을 막는 것이 유용할 수 있다. 사멸-전환에 이용될 수 있는 그러한 독소의 예는 비제한적으로 박테리오신, 리신, 및 세포 막을 용해시켜 세포의 DNA를 분해함에 의해 세포 사멸을 초래하는 다른 분자, 또는 다른 메커니즘을 포함한다. 그러한 독소는 개별적으로 또는 함께 이용될 수 있다. 이들의 생산을 제어하는 전환은, 예를 들어, 전사 활성화(토글 전환(toggle switches); 예컨대, Gardner et al., 2000을 참조하라), 번역(리보조절인자), 또는 DNA 재조합 (재조합효소-기반 전환)에 기반할 수 있고, 혐기생활 또는 반응성 산소 종과 같은 환경적 자극을 감지할 수 있다. 이러한 전환은 단일 환경적 인자에 의해 활성화될 수 있거나 세포 사멸을 유도하기 위한 AND, OR, NAND 및 NOR 논리적 구조에서 여러 활성인자를 요구할 수 있다. 예를 들어, AND 리보조절인자 전환은 테트라사이클린, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 및 리신의 발현을 유도하는 아라비노스에 의해 활성화되며, 이들은 세포막을 투과하여 세포를 사멸시킨다. IPTG는 엔돌리신 및 홀린(holin) mRNA의 발현을 유도하고, 이는 그 후 아라비노스 및 테트라사이클린의 첨가에 의해 탈억제된다. 3개 모두의 유도인자는 세포 사멸을 초래할 정도로 존재하여야 한다. 사멸 전환의 예는 당 분야에 공지되어 있다(Callura et al., 2010). 일부 구체예에서, 사멸 전환은 argAfbr의 산소 수준-의존성 발현 후 소정의 시간이 지난 후에 박테리아를 사멸시키기 위해 활성화된다. 일부 구체예에서, 사멸 전환은 argAfbr의 산소 수준-의존성 발현 후 지연된 양상으로 활성화된다.
사멸-전환은 독소가 환경 조건 또는 외부 신호에 반응하여 생산되도록 설계될 수 있거나(예컨대, 박테리아는 외부 신호에 반응하여 사멸된다), 대안적으로 환경 조건이 더 이상 존재하지 않거나 외부 신호가 중지되면 독소가 생산되도록 설계될 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예를 들어, 낮은 산소 환경에서, 외인성 환경 신호를 감지한 후 죽도록 추가로 프로그래밍된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아, 예컨대, argAfbr 및 억제인자 ArgR을 발현시키는 박테리아는 하나 이상의 재조합효소(들)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는데, 이의 발현은 환경 조건 또는 신호에 반응하여 유도되고 궁극적으로 세포를 사멸시키는 독소의 발현으로 이어지는 하나 이상의 재조합 사건을 초래한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 재조합 사건은 박테리아의 독소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 te 플립핑(te flipping)이고 그 후 제1 재조합효소에 의한 플립핑 후 항시적으로 발현된다. 한 구체예에서, 박테리아의 독소의 항시적 발현은 유전적으로 공학처리된 박테리아를 사멸시킨다. 이러한 유형의 사멸-전환 시스템에서, 일단 공학처리된 박테리아의 세포가 외인성 환경 조건을 감지하여 관심 이종성 유전자를 발현시키면, 재조합체 박테리아의 세포는 더 이상 생존할 수 없다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아, 예컨대, argAfbr 및 억제인자 ArgR을 발현시키는 박테리아가 적어도 하나의 재조합 사건을 일으키는 환경 조건 또는 신호에 반응하여 하나 이상의 재조합효소(들)를 발현시키는 다른 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 외인성 환경 조건 또는 신호에 반응하여 항-독소를 인코딩하는 이종성 유전자를 추가로 발현시킨다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재조합 사건은 제1 재조합효소에 의해 박테리아의 독소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑이다. 한 구체예에서, 박테리아의 독소를 인코딩하는 역 이종성 유전자는 제1 정방향 재조합효소 인지 서열 및 제1 역방향 재조합효소 인지 서열 사이에 위치한다. 한 구체예에서, 박테리아의 독소를 인코딩하는 이종성 유전자는 이것이 제1 재조합효소에 의해 플립핑된 후 항시적으로 발현된다. 한 구체예에서, 항-독소는 독소의 활성을 억제함으로써, 유전적으로 공학처리된 박테리아의 죽음을 지연시킨다. 한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항-독소를 인코딩하는 이종성 유전자가 외인성 환경 조건이 더 이상 존재하지 않는 조건 하에 더 이상 발현되지 않을 때 박테리아의 독소에 의해 사멸된다.
다른 구체예에서, 적어도 하나의 재조합 사건은 제1 재조합효소에 의한 제2 재조합효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑 후, 제2 재조합효소에 의한 박테리아의 독소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑이다. 한 구체예에서, 제2 재조합효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자는 제1 정방향 재조합효소 인지 서열 및 제1 역방향 재조합효소 인지 서열 사이에 위치한다. 한 구체예에서, 박테리아의 독소를 인코딩하는 역 이종성 유전자는 제2 정방향 재조합효소 인지 서열 및 제2 역방향 재조합효소 인지 서열 사이에 위치한다. 한 구체예에서, 제2 재조합효소를 인코딩하는 이종성 유전자는 이것이 제1 재조합효소에 의해 플립핑된 후 항시적으로 발현된다. 한 구체예에서, 박테리아의 독소를 인코딩하는 이종성 유전자는 이것이 제2 재조합효소에 의해 플립핑된 후 항시적으로 발현된다. 한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 박테리아의 독소에 의해 사멸된다. 한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 외인성 환경 조건에 반응하여 항-독소를 인코딩하는 이종성 유전자를 추가로 발현시킨다. 한 구체예에서, 항-독소는 외인성 환경 조건이 존재할 때 독소의 활성을 억제함으로써, 유전적으로 공학처리된 박테리아의 죽음을 지연시킨다. 한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항-독소를 인코딩하는 이종성 유전자가 외인성 환경 조건이 더 이상 존재하지 않는 조건 하에 더 이상 발현되지 않을 때 박테리아의 독소에 의해 사멸된다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 재조합 사건은 제1 재조합효소에 의한 제2 재조합효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑 후, 제2 재조합효소에 의한 제3 재조합효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑 후, 제3 재조합효소에 의한 박테리아 독소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑이다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 재조합 사건은 제1 재조합효소에 의한 제1 절제 효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자의 플립핑이다. 한 구체예에서, 제1 절제 효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자는 제1 정방향 재조합효소 인지 서열과 제1 역방향 재조합효소 인지 서열 사이에 위치된다. 한 구체예에서, 제1 절제 효소를 인코딩하는 이종성 효소는 제1 재조합효소에 의해 플립핑된 후에 항시적으로 발현된다. 한 구체예에서, 제1 절제 효소는 제1 필수 유전자를 절제한다. 한 구체예에서, 프로그램화된 재조합 박테리아 세포는 제1 필수 유전자가 절제된 후에 생존할 수 없다.
한 구체예에서, 제1 재조합효소는 제2 절제 효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자를 추가로 플립핑시킨다. 한 구체예에서, 제2 절제 효소를 인코딩하는 역 이종성 유전자는 제2 정방향 재조합효소 인지 서열과 제2 역방향 재조합효소 인지 서열 사이에 위치된다. 한 구체예에서, 제2 절제 효소를 인코딩하는 이종성 유전자는 제1 재조합효소에 의해 플립핑된 후 항시적으로 발현된다. 한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 제1 필수 유전자 및 제2 필수 유전자 둘 모두가 절제되는 경우 사멸하거나 더 이상 생존할 수 없다. 한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 제1 재조합효소에 의해 제1 필수 유전자가 절제되거나, 제2 필수 유전자가 절제되는 경우에 사멸하거나 더 이상 생존할 수 없다.
한 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 적어도 하나의 재조합 사건이 발생한 후에 사멸한다. 또 다른 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 적어도 하나의 재조합 사건이 발생한 후에 더 이상 생존할 수 없다.
이들 구체예 중 임의의 구체예에서, 재조합효소는 BxbI, PhiC31, TP901, BxbI, PhiC31, TP901, HK022, HP1, R4, Int1, Int2, Int3, Int4, Int5, Int6, Int7, Int8, Int9, Int10, Int11, Int12, Int13, Int14, Int15, Int16, Int17, Int18, Int19, Int20, Int21, Int22, Int23, Int24, Int25, Int26, Int27, Int28, Int29, Int30, Int31, Int32, Int33, 및 Int34, 또는 이들의 생물학적 활성 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합효소일 수 있다.
상기 기재된 사멸-전환 회로에서, 독소는 환경 요인 또는 신호의 존재하에서 생성된다. 사멸-전환 회로의 또 다른 양태에서, 독소는 환경 요인의 존재하에서 억제될 수 있고(생성되지 않음), 이후 환경 조건 또는 외부 신호가 더 이상 존재하지 않으면 생성될 수 있다. 독소가 외부 요인 또는 신호의 존재하에서 억제되는(외부 신호가 제거되면 활성화됨) 예시적인 사멸-전환이 도 39, 40, 62 및 63에 제시되어 있다. 본 발명의 개시는 외인성 환경에서 아라비노스 또는 다른 당의 감지시 하나 이상의 이종성 유전자(들)를 발현하는 재조합 박테리아 세포를 제공한다. 이러한 양태에서, 재조합 박테리아 세포는 AraC 전사 인자를 인코딩하는 araC 유전자 뿐만 아니라 araBAD 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 아라비노스의 부재하에서, AraC 전사 인자는 araBAD 프로모터의 조절하에 있는 유전자의 전사를 억제하는 형태를 채택한다. 아라비노스의 존재하에서, AraC 전사 인자는 AraBAD 프로모터에 결합하여 이를 활성화시켜 바람직한 유전자의 발현을 유도하도록 하는 형태적 변화를 겪는다.
따라서, 하나 이상의 이종성 유전자(들)가 외인성 환경에서 아라비노스 감지시 발현되는 일부 구체예에서, 하나 이상의 이종성 유전자는 직접적 또는 간접적으로 araBAD 프로모터의 조절하에 있다. 일부 구체예에서, 발현된 이종성 유전자는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 이종성 치료 유전자, 항독소를 인코딩하는 이종성 유전자, 억제인자 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어, TetR 억제인자를 인코딩하는 이종성 유전자, 박테리아 세포에서 발견되지 않는 필수 단백질을 인코딩하는 이종성 유전자, 및/또는 조절 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 이종성 유전자.
Para, ParaB, ParaC, 및 ParaBAD를 포함하는 아라비노스 유도성 프로모터가 당 분야에 공지되어 있다. 한 구체예에서, 아라비노스 유도성 프로모터는 E. 콜라이로부터 유래된다. 일부 구체예에서, ParaC 프로모터 및 ParaBAD 프로모터는 양방향성 프로모터로 작동하며, ParaBAD 프로모터는 한 방향으로 이종성 유전자(들)의 발현을 조절하고, ParaC(ParaBAD 프로모터와 근접하여 반대 가닥에 존재함)는 다른 방향으로 이종성 유전자(들)의 발현을 조절한다. 아라비노스의 존재하에서, 둘 모두의 프로모터로부터의 둘 모두의 이종성 유전자의 전사가 유도된다. 그러나, 아라비노스의 부재하에서, 둘 모두의 프로모터로부터의 둘 모두의 이종성 유전자의 전사가 유도되지 않는다.
본 발명의 개시의 한 예시적인 구체예에서, 본 발명의 개시의 공학처리된 박테리아는 적어도 하기 서열을 갖는 사멸-전환을 함유한다: 테트라사이클린 억제인자 단백질(TetR)을 인코딩하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 ParaBAD 프로모터, AraC 전사 인자를 인코딩하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 ParaC 프로모터, 및 테트라사이클린 억제인자 단백질에 의해 억제되는 프로모터(PTetR)에 작동적으로 연결된 박테리아 독소를 인코딩하는 이종성 유전자. 아라비노스의 존재하에서, AraC 전사 인자는 ParaBAD 프로모터를 활성화시키고, 이는 TetR 단백질의 전사를 활성화시키고, 이는 차례로 독소의 전사를 억제한다. 그러나, 아라비노스의 부재하에서, AraC는 ParaBAD 프로모터로부터의 전사를 억제하며, TetR 단백질은 발현되지 않는다. 이러한 경우, 이종성 독소 유전자의 발현은 활성화되며, 독소가 발현된다. 독소는 재조합 박테리아 세포에 축적되고, 재조합 박테리아 세포가 사멸된다. 한 구체예에서, AraC 전사 인자를 인코딩하는 AraC 유전자는 항시적 프로모터의 조절하에 있으며, 따라서 항시적으로 발현된다.
본 발명의 개시의 한 구체예에서, 재조합 박테리아 세포는 항시적 프로모터의 조절하에 있는 항독소를 추가로 포함한다. 이러한 상황에서, 아라비노스의 존재하에서, 독소는 TetR 단백질에 의한 억제로 인해 발현되지 않고, 항독소 단백질이 세포 내에 축적된다. 그러나, 아라비노스의 부재하에서, TetR 단백질은 발현되지 않고, 독소의 발현이 유도된다. 독소는 재조합 박테리아 세포 내에 축적되기 시작한다. 독소 단백질이 세포 내의 항-독소 단백질의 양과 동등하거나 더 많은 양으로 존재하면 재조합 박테리아 세포는 더 이상 생존할 수 없으며, 재조합 박테리아 세포는 독소에 의해 사멸될 것이다.
본 발명의 개시의 또 다른 구체예에서, 재조합 박테리아 세포는 ParaBAD 프로모터의 조절하에 있는 항독소를 추가로 포함한다. 이러한 상황에서, 아라비노스의 존재하에서, TetR 및 항-독소가 발현되고, 항-독소는 세포 내에 축적되고, 독소는 TetR 단백질에 의한 억제로 인해 발현되지 않는다. 그러나, 아라비노스의 부재하에서, TetR 단백질 및 항-독소 둘 모두는 발현되지 않고, 독소의 발현이 유도된다. 독소는 재조합 박테리아 세포 내에 축적되기 시작한다. 독소 단백질이 발현되면 재조합 박테리아 세포는 더 이상 생존할 수 없으며, 재조합 박테리아 세포는 독소에 의해 사멸될 것이다.
본 발명의 개시의 또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명의 개시의 공학처리된 박테리아는 적어도 하기 서열을 갖는 사멸-전환을 함유한다: 재조합 박테리아 세포에서 발견되지 않는(그리고 생존에 필요한) 필수 폴리펩티드를 인코딩하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 ParaBAD 프로모터, 및 AraC 전사 인자를 인코딩하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 ParaC 프로모터. 아라비노스의 존재하에서, AraC 전사 인자는 ParaBAD 프로모터를 활성화시키고, 이는 필수 폴리펩티드를 인코딩하는 이종성 유전자의 전화를 활성화시켜, 재조합 박테리아 세포가 생존하도록 한다. 그러나, 아라비노스의 부재하에서, AraC는 ParaBAD 프로모터로부터의 전사를 억제하며, 생존에 필요한 필수 단백질이 발현되지 않는다. 이러한 경우, 재조합 박테리아 세포는 아라비노스의 부재하에서 사멸한다. 일부 구체예에서, 재조합 박테리아 세포에서 발견되지 않는 필수 폴리펩티드를 인코딩하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 ParaBAD 프로모터의 서열은 상기 직접 기재된 TetR/독소 사멸-전환 시스템과 함께 박테리아 세포에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 박테리아 세포에서 발견되지 않는 필수 폴리펩티드를 인코딩하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 ParaBAD 프로모터의 서열은 상기 직접 기재된 TetR/독소/항-독소 사멸-전환 시스템과 함께 박테리아 세포에 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 개시의 공학처리된 박테리아, 예를 들어, argAfbr 및 억제인자 ArgR을 발현하는 박테리아는 상기 기재된 사멸-전환 회로 중 임의의 것의 성분을 인코딩하는 유전자(들)을 추가로 포함한다.
상기 기재된 구체예 중 임의의 구체예에서, 박테리아 독소는 리신, Hok, Fst, TisB, LdrD, Kid, SymE, MazF, FlmA, Ibs, XCV2162, dinJ, CcdB, MazF, ParE, YafO, Zeta, hicB, relB, yhaV, yoeB, chpBK, hipA, 마이크로신 B, 마이크로신 B17, 마이크로신 C, 마이크로신 C7-C51, 마이크로신 J25, 마이크로신 ColV, 마이크로신 24, 마이크로신 L, 마이크로신 D93, 마이크로신 L, 마이크로신 E492, 마이크로신 H47, 마이크로신 I47, 마이크로신 M, 콜리신 A, 콜리신 E1, 콜리신 K, 콜리신 N, 콜리신 U, 콜리신 B, 콜리신 Ia, 콜리신 Ib, 콜리신 5, 콜리신 10, 콜리신 S4, 콜리신 Y, 콜리신 E2, 콜리신 E7, 콜리신 E8, 콜리신 E9, 콜리신 E3, 콜리신 E4, 콜리신 E6; 콜리신 E5, 콜리신 D, 콜리신 M, 및 클로아신(cloacin) DF13, 또는 이들의 생물학적 활성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 구체예 중 임의의 구체예에서, 항-독소는 항-리신, Sok, RNAII, IstR, RdlD, Kis, SymR, MazE, FlmB, Sib, ptaRNA1, yafQ, CcdA, MazE, ParD, yafN, Epsilon, HicA, relE, prlF, yefM, chpBI, hipB, MccE, MccECTD, MccF, Cai, ImmE1, Cki, Cni, Cui, Cbi, Iia, Imm, Cfi, Im10, Csi, Cyi, Im2, Im7, Im8, Im9, Im3, Im4, ImmE6, 클로아신 면역 단백질(Cim), ImmE5, ImmD, 및 Cmi, 또는 이들의 생물학적 활성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 박테리아 독소는 유전적으로 공학처리된 박테리아에 대해 살균성이다. 한 구체예에서, 박테리아 독소는 유전적으로 공학처리된 박테리아에 대해 정균성이다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 경로에서 글루타메이트를 아르기닌 및/또는 중간 부산물, 예컨대, 시트룰린으로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 인코딩하는 오페론 각각의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 아르기닌 레굴론을 가져, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 동일 조건하에서 동일한 박테리아 서브타입으로부터의 변형되지 않은 레굴론보다 많은 아르기닌 및/또는 중간 부산물을 생성한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체, 예컨대, argAfbr을 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 아르기니노석시네이트 리아제, 및 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 적어도 하나의 ARG 박스 내에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하며, 이에 의해 레굴론을 억제하고, 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체는 산소 수준-의존성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체는 저산소 또는 혐기성 조건 하에서 유도되는 프로모터에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 프로모터는 푸마레이트 및 니트레이트 환원효소 조절인자(FNR) 프로모터, 아르기닌 데이미니아제 및 니트레이트 환원(ANR) 프로모터, 및 이화 니트레이트 호흡 조절인자(DNR) 프로모터로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체는 argAfbr이다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대한 적어도 하나의 ARG 박스 내에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하고, 박테리아는 동일 조건하에서 동일한 박테리아 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소와 비교하여 아르기닌 피드백 억제를 감소시키도록 돌연변이된 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 저산소 또는 혐기성 조건하에서 유도되는 프로모터에 의해 조절되고, 돌연변이체 아르기닌 레굴론은 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 오페론을 포함하고, 각각의 오페론은 ArgR 억제인자 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키고, 오페론 내의 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성을 갖는 RNA 중합효소 결합을 보유하는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)을 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대한 적어도 하나의 ARG 박스 내에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 영양요구균주이다. 한 구체예에서, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대한 적어도 하나의 ARG 박스 내에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 cysE, glnA, ilvD, leuB, lysA, serA, metA, glyA, hisB, ilvA, pheA, proA, thrC, trpC, tyrA, thyA, uraA, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, flhD, metB, metC, proAB, 및 thi1 영양요구균주로부터 선택되는 영양요구균주이다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 하나 초과의 영양요구성을 가지며, 예를 들어, 이들은 ΔthyA 및 ΔdapA 영양요구균주일 수 있다.
일부 구체예에서, 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 적어도 하나의 ARG 박스 내에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 사멸-전환 회로, 예를 들어, 본원에 제공된 사멸-전환 회로 중 임의의 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 유도성 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 재조합효소(들)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 역 독소 서열을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 유도성 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 재조합효소(들)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 하나 이상의 역 절제 유전자를 추가로 포함하며, 절제 유전자(들)은 필수 유전자를 삭제하는 효소를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 TetR 억제인자 결합 부위를 갖는 프로모터의 조절하에 있는 독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 ParaBAD와 같은 아라비노스에 의해 유도되는 유도성 프로모터의 조절하에 있는 TetR을 인코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 오페론 각각에 대해 적어도 하나의 ARG 박스 내에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 레굴론 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 영양요구균주이며, 이는 사멸-전환 회로, 예를 들어, 본원에 기재된 사멸-전환 회로 중 임의의 것을 추가로 포함한다.
상기 기재된 유전적으로 공학처리된 박테리아의 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자는 박테리아 내의 플라스미드에 존재하며, 이는 플라스미드에서 저산소 또는 혐기성 조건하에서 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 다른 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자는 박테리아 염색체에 존재하며, 이는 염색체에서 저산소 또는 혐기성 조건하에서 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 억제인자 기능이 감소되거나 비활성화되거나, 유전적으로 공학처리된 박테리아가 아르기닌 억제인자를 갖지 않도록(예컨대, 아르기닌 억제인자 유전자를 결실시킴) 하여, 레굴론의 탈억제 및 아르기닌 및/또는 중간 부산물 생합성의 향상을 발생시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 아르기닌 억제인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체는 산소 수준-의존성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체는 저산소 또는 혐기성 조건 하에서 유도되는 프로모터에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 프로모터는 푸마레이트 및 니트레이트 환원효소 조절인자(FNR) 프로모터, 아르기닌 데이미니아제 및 니트레이트 환원(ANR) 프로모터, 및 이화 니트레이트 호흡 조절인자(DNR) 프로모터로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체는 argAfbr이다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 아르기닌 레굴론을 포함하고, 박테리아는 동일 조건하에서 동일한 박테리아 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소와 비교하여 감소된 아르기닌 피드백 억제를 갖는 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 외인성 환경 조건에 의해 유도되는 프로모터에 의해 조절되고, 박테리아는 기능성 ArgR 억제인자가 결여되도록 유전적으로 공학처리된 것이다.
일부 구체예에서, 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 영양요구균주이다. 한 구체예에서, 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 cysE, glnA, ilvD, leuB, lysA, serA, metA, glyA, hisB, ilvA, pheA, proA, thrC, trpC, tyrA, thyA, uraA, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, flhD, metB, metC, proAB, 및 thi1 영양요구균주로부터 선택되는 영양요구균주이다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 하나 초과의 영양요구성을 가지며, 예를 들어, 이들은 ΔthyA 및 ΔdapA 영양요구균주일 수 있다.
일부 구체예에서, 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 사멸-전환 회로, 예를 들어, 본원에 제공된 사멸-전환 회로 중 임의의 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 유도성 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 재조합효소(들)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자, 및 역 독소 서열을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 유도성 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 재조합효소(들)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 하나 이상의 역 절제 유전자를 추가로 포함하며, 절제 유전자(들)은 필수 유전자를 삭제하는 효소를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 공학처리된 박테리아는 TetR 억제인자 결합 부위를 갖는 프로모터의 조절하에 있는 독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 ParaBAD와 같은 아라비노스에 의해 유도되는 유도성 프로모터의 조절하에 있는 TetR을 인코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 항독소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 돌연변이체 또는 결실된 아르기닌 억제인자 및 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 신타제 돌연변이체를 포함하는 영양요구균주이며, 이는 사멸-전환 회로, 예를 들어, 본원에 기재된 사멸-전환 회로 중 임의의 것을 추가로 포함한다.
상기 기재된 유전적으로 공학처리된 박테리아의 일부 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자는 박테리아 내의 플라스미드에 존재하며, 이는 플라스미드에서 저산소 또는 혐기성 조건하에서 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 다른 구체예에서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자는 박테리아 염색체에 존재하며, 이는 염색체에서 저산소 또는 혐기성 조건하에서 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
암모니아 수송
암모니아 수송체는 세포로의 암모니아 수송을 향상시키기 위해 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아에서 발현되거나 변형될 수 있다. AmtB는 암모니아를 박테리아 세포로 수송하는 막 수송 단백질이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 천연 amtB 유전자의 다수의 복사체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 또한 다양한 박테리아 종으로부터의 amtB 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 다양한 박테리아 종으로부터의 amtB 유전자의 다수의 복사체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 이의 천연 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 천연 프로모터보다 강한 프로모터, 예컨대, GlnRS 프로모터, P(Bla) 프로모터, 또는 항시적 프로모터에 의해 조절되는 amtB 유전자를 포함한다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며, 천연 amtB 유전자의 하나 이상의 추가 복사체는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 유전체로 삽입된다. 대안적 구체예에서, 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며, 다양한 박테리아 종으로부터의 비천연 amtB 유전자의 복사체는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 유전체로 삽입된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며, 천연 amtB 유전자의 하나 이상의 추가 복사체는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 플라스미드 상에서 박테리아 내에 존재한다. 대안적 구체예에서, 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며, 다양한 박테리아 종으로부터의 비천연 amtB 유전자의 복사체는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 플라스미드 상에서 박테리아 내에 존재한다.
일부 구체예에서, 천연 amtB 유전자가 돌연변이화되고, 증가된 암모니아 수송을 나타내는 돌연변이체가 선택되고, 돌연변이화된 amtB 유전자가 분리되고, 유전적으로 공학처리된 박테리아로 삽입된다. 일부 구체예에서, 천연 amtB 유전자가 돌연변이화되고, 증가된 암모니아 수송을 나타내는 돌연변이체가 선택되고, 이러한 돌연변이체는 본 발명의 박테리아를 생성시키기 위해 사용된다. 본원에 기재된 암모니아 수송체 변형은 플라스미드 또는 염색체 상에 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 E. 콜라이 Nissle이고, E. 콜라이 Nissle의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며; 하나 이상의 추가의 복사체의 천연 E. 콜라이 Nissle amtB 유전자는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 E. 콜라이 Nissle 유전체로 삽입된다. 대안적 구체예에서, E. 콜라이 Nissle의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며, 다양한 박테리아, 예컨대, 락토바실루스 플란타룸으로부터의 비천연 amtB 유전자의 복사체는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 E. 콜라이 Nissle 유전체로 삽입된다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 E. 콜라이 Nissle이고, E. 콜라이 Nissle의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며; 하나 이상의 추가의 복사체의 천연 E. 콜라이 Nissle amtB 유전자는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 플라스미드 상에서 박테리아 내에 존재한다. 대안적 구체예에서, E. 콜라이 Nissle의 천연 amtB 유전자는 변형되지 않으며, 다양한 박테리아, 예컨대, 락토바실루스 플란타룸으로부터의 비천연 amtB 유전자의 복사체는 argAfbr의 발현을 조절하는 동일한 유도성 프로모터, 예컨대, FNR 프로모터, 또는 argAfbr의 발현을 조절하는 것과 상이한 유도성 프로모터 또는 항시적 프로모터의 조절하에서 플라스미드 상에서 박테리아 내에 존재한다.
약학적 조성물 및 제형
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아를 포함하는 약학적 조성물은 고암모니아혈증과 관련된 장애 또는 고암모니아혈증과 관련된 증상(들)을 치료하고/하거나, 관리하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 예방하는데 사용될 수 있다. 단독이거나 예방제, 치료제, 및/또는 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 하나 이상의 유전적으로 공학처리된 박테리아를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물이 제공된다.
특정 구체예에서, 약학적 조성물은 본원에 기재된 유전적 변형, 예컨대 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하도록 공학 처리된 박테리아의 한 종, 균주 또는 서브타입을 포함한다. 대안적 구체예에서, 약학적 조성물은 본원에 기재된 유전적 변형, 예컨대 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하도록 각각 공학처리된 박테리아의 2개 이상의 종, 균주, 및/또는 서브타입을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분의 약학적 사용을 위한 조성물로의 가공을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 약학적 조성물을 제형화시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예컨대, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA] 참조). 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 정제화, 동결건조, 직접 압착, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 분말화, 유화, 캡슐화, 엔트래핑(entrapping), 또는 분무 건조에 적용되어 정제, 과립, 나노입자, 나노캡슐, 마이크로캡슐, 마이크로정제, 펠렛, 또는 분말을 형성하며, 이들은 장용 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다. 적절한 제형은 투여 경로에 좌우된다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 임의의 적합한 투여 형태(예컨대, 액체, 캡슐, 샤세(sachet), 경질 캡슐, 연질 캡슐, 정제, 장용 코팅된 정제, 현탁 분말, 과립, 또는 경구 투여용 매트릭스 지속 방출 제형) 및 임의의 적합한 투여 유형(예컨대, 경구, 국소, 즉시-방출, 박동-방출, 지연-방출, 또는 지속 방출)의 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 유전적으로 공학처리된 박테리아에 대한 적합한 투여량은 약 105 내지 1012개의 박테리아 범위일 수 있다. 조성물은 매일, 매주, 또는 매월 1회 이상 투여될 수 있다. 유전적으로 공학처리된 박테리아는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 표면 활성제, 중성 또는 양이온성 지질, 지질 복합체, 리포솜, 투과 향상제, 담체 화합물, 및 다른 약학적으로 허용되는 담체 또는 작용제를 포함하는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 국소적으로 투여될 수 있고, 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼의 형태, 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 형태로 제형화될 수 있다. 예컨대, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA]을 참조한다. 한 구체예에서, 분무 가능하지 않은 국소 투여 형태에 대해, 국소 적용과 양립되고, 물보다 큰 동적 점도를 갖는 하나 이상의 부형제 또는 담체를 포함하는 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 이용된다. 적합한 제형은 다양한 특성, 예컨대, 삼투압에 영향을 주기 위해 멸균되거나 보조제(예컨대, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제, 또는 염)와 혼합될 수 있는 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 리니멘트(liniment), 고약 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 국소 투여 형태는 고체 또는 액체 비활성 담체와 조합된 활성 성분이 가압된 휘발성 물질(예컨대, 기체상 추진제, 예를 들어, 프레온)과의 혼합물 또는 스퀴즈 보틀(squeeze bottle) 내에 패키징되는 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 보습제 또는 습윤제가 또한 약학적 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 상기 추가 성분의 예는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 경구 투여될 수 있으며, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있다. 경구 사용을 위한 약리학적 조성물은 고체 부형제를 이용하여, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 요망시 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 획득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 충전제, 예를 들어, 당, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨; 셀룰로스 조성물, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔쓰(gum tragacanth), 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카르보메틸셀룰로스; 및/또는 생리학적으로 허용되는 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 폴리에틸레 글리콜(PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 붕해제, 예를 들어, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 이의 염, 예를 들어, 소듐 알기네이트가 또한 첨가될 수 있다.
정제 또는 캡슐은 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 결합제(예컨대, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 수크로스, 글루코스, 소르비톨, 전분, 검, 카올린, 및 트래거캔쓰); 충전제(예컨대, 락토스, 미정질 셀룰로스, 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트); 윤활제(예컨대, 칼슘, 알루미늄, 아연, 스테아르산, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 전분, 소듐 벤조에이트, L-류신, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 또는 실리카); 붕해제(예컨대, 전분, 감자 전분, 소듐 전분 글리콜레이트, 당, 셀룰로스 유도체, 실리카 분말); 또는 습윤제(예컨대, 소듐 라우릴 설페이트)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 정제는 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 코팅 쉘이 존재할 수 있고, 통상적인 막은 폴리락티드, 폴리글리콜산, 폴리언하이드라이드, 다른 생물분해성 중합체, 알기네이트-폴리리신-알기네이트(APA), 알기네이트-폴리메틸렌-코-구아니딘-알기네이트(A-PMCG-A), 하이드로이메틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(HEMA-MMA), 다층화된 HEMA-MMA-MAA, 폴리아크릴로니트릴비닐클로라이드(PAN-PVC), 아크릴로니트릴/소듐 메탈릴설포네이트(AN-69), 폴리에틸렌 글리콜/폴리 펜타메틸사이클로펜타실록산/폴리디메틸실록산(PEG/PD5/PDMS), 폴리 N,N-디메틸 아크릴아미드(PDMAAm), 규산질 캡슐, 셀룰로스 설페이트/소듐 알기네이트/폴리메틸렌-코-구아니딘(CS/A/PMCG), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 칼슘 알기네이트, k-카라기난-로커스트 빈 검 젤 비드, 젤란-잔탄 비드, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 카라기난, 전분 폴리-언하이드라이드, 전분 폴리메타크릴레이트, 폴리아미노산, 및 장용 코팅 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 장 또는 장의 특정 부위, 예를 들어, 대장으로의 방출을 위해 장용 코팅된다. 위로부터 결장까지의 통상적인 pH 프로파일은 약 1-4(위), 5.5-6(십이지장), 7.3-8.0(회장), 및 5.5-6.5(결장)이다. 일부 질병에서, pH 프로파일은 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 코팅은 방출 부위를 특정하기 위해 특정 pH 환경에서 분해된다. 일부 구체예에서, 적어도 2개의 코팅이 사용된다. 일부 구체예에서, 외부 코팅 및 내부 코팅이 상이한 pH 수준에서 분해된다.
경구 투여를 위한 액체 제조물은 용액, 시럽, 현탁액, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 구성하기 위한 건조 생성물의 형태를 취할 수 있다. 상기 액체 제조물은 약학적으로 허용되는 작용제, 예를 들어, 현탁제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예컨대, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분획화된 식물성 오일); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 제조물은 또한 완충 염, 착향제, 착색제, 및 감미제를 적절하게 함유할 수 있다. 경구 투여용 제조물은 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아의 느린 방출, 조절 방출, 또는 지속 방출을 위해 적합하게 제형화될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예를 들어, 비활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나, 정제로 압착되거나, 대상체의 식이에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여가 아닌 투여에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물의 비활성화를 방지하기 위한 물질로 화합물을 코팅하거나, 이와 화합물을 동시 투여하는 것이 필요할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 장용 코팅되거나 코팅되지 않는 나노입자, 나노캡슐, 마이크로캡슐, 또는 마이크로정제를 통해 장내 투여, 공장내 투여, 십이지장내 투여, 회장내 투여, 위 션트(shunt) 투여, 또는 결장내 투여용으로 제형화된다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한, 예컨대, 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 이용하여 좌약 또는 정체 관장제와 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액, 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 비내 투여될 수 있고, 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트, 또는 점적 형태로 제형화될 수 있고, 적합한 분사제(예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체)의 사용과 함께 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제공 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예컨대, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지)는 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예를 들어, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 데포(depot) 제조물로 투여 및 제형화될 수 있다. 상기 장기 작용 제형은 이식 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예컨대, 허용가능한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화되거나, 거의 용해성이 없는 유도체(예컨대, 거의 용해성이 없는 염)로 제형화될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 단일 투여 형태의 약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 단일 투여 형태는 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 단일 투여 형태는 변형 없이 환자에게 직접 투여될 수 있거나, 투여 전에 희석되거나 재구성될 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 투여 형태는 볼루스 형태, 예컨대, 단일 주사, 단일 경구 용량, 예를 들어, 다수의 정제, 캡슐, 환약 등을 포함하는 경구 용량으로 투여될 수 있다. 대안적 구체예에서, 단일 투여 형태는, 예컨대, 주입에 의해 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 단일 투여 형태는 약학적 조성물을 장용 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있는 더 작은 분취량, 단일 용량 용기, 단일 용량 액체 형태, 또는 단일 용량 고체 형태, 예를 들어, 정제, 과립, 나노입자, 나노캡슐, 마이크로캡슐, 마이크로정제, 펠렛, 또는 분말로 나눔으로써 제조될 수 있다. 고체 형태의 단일 용량은 환자로의 투여 전에 액체, 통상적으로 멸균수 또는 염수 용액을 첨가함으로써 재구성될 수 있다.
투여 요법은 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 한번에 투여될 수 있거나, 여러 나누어진 용량이 소정의 기간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황에 의해 지시되는 바에 따라 감소되거나 증가될 수 있다. 투여량에 대한 명세는 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성되는 특정한 치료 효과에 의해 지정된다. 투여량 값은 경감되는 질환의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여 요법은 개별적 필요성 및 치료 의사의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 조절 방출 또는 지속 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 조절 또는 지속 방출을 달성하기 위해 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 개시의 요법의 조절 또는 지속 방출을 달성하기 위해 중합성 물질이 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 5,989,463호 참조). 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리언하이드라이드, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체는 비활성이고, 침출가능한 불순물이 없고, 저장 안정적이고, 멸균되고, 생물분해성일 수 있다. 일부 구체예에서, 조절 또는 지속 방출 시스템은 예방 또는 치료 표적 근처에 위치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 단지 일부만 필요로 한다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 기술이 이용될 수 있다.
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 중성 또는 염 형태로 투여 및 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 음이온과 함께 형성된 염, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 염, 및 양이온과 함께 형성된 염, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 염을 포함한다.
성분은 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 샤세와 같은 기밀적으로 밀봉된 용기 중에 단위 투여 형태, 예를 들어, 건성의 동결 건조된 분말 또는 물 비함유 농축물로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있는 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 작용제의 양을 표시하는 기밀적으로 밀봉된 용기, 예를 들어, 앰풀 또는 샤세 내에 패키징될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물 중 하나 이상은 기밀적으로 밀봉된 용기 중에 건조 멸균된 동결건조된 분말 또는 물 비함유 농축물로 공급되며, 이는 대상체로의 투여에 적절한 농도로 재구성(예컨대, 물 또는 염수를 이용함)될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약학적 조성물 중 하나 이상은 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관되는 기밀적으로 밀봉된 용기 중에 건조 멸균 동결건조 분말로 공급되고, 재구성된 후 1시간 이내, 3시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내, 48시간 이내, 72시간 이내, 또는 1주일 이내에 투여된다. 동결건조된 투여 형태에 대해 주로 0-10% 수크로스(최적으로는, 0.5-1.0%)의 동해방지제가 포함될 수 있다. 다른 적합한 동해방지제는 트레할로스 및 락토스를 포함한다. 다른 적합한 증량제는 0-0.05%의 농도로 포함될 수 있는 글리신 및 아르기닌, 및 폴리소르베이트-80(최적으로는, 0.005-0.01%의 농도로 포함됨)을 포함한다. 추가 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약학적 조성물은 주사가능한 용액으로 제조될 수 있고, 애쥬번트로서 유용한 작용제, 예를 들어, 흡수 또는 분산을 증가시키기 위해 사용되는 작용제, 예컨대 히알루로니다제를 추가로 포함할 수 있다.
투여는 질병의 중증도 및 반응성, 투여 경로, 치료의 시간 경과(수일 내지 수개월 내지 수년), 및 질병의 개선까지의 시간을 포함하는 여러 요인에 좌우될 수 있다. 본원에 제공된 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 동물 모델에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, LD50, ED50, EC50, 및 IC50이 결정될 수 있고, 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비(LD50/ED50)가 치료 지수로서 계산될 수 있다. 부작용을 감소시키기 위해 잠재적 손상을 최소화하도록 하는 주의 깊은 변형과 함께 독성 부작용을 나타내는 조성물이 사용될 수 있다. 투여는 세포 배양 검정 및 동물 모델로부터 먼저 추정될 수 있다. 시험관내 및 생체내 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 광범위한 투여량을 제형화시키는데 이용될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 또 다른 양태는 고암모니아혈증과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 상기 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상(들)을 감소시키거나, 개선시키거나, 제거하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 장애는 우레아 회로 질환, 예를 들어, 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바모일포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 및 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍이다. 대안적 구체예에서, 장애는 간 질환, 예를 들어, 간 뇌병증, 급성 간부전, 또는 만성 간부전; 유기산 질환; 이소발레르산뇨증; 3-메틸크로토닐글리신뇨증; 메틸말론산혈증; 프로피온산뇨증; 지방산 산화 결함; 카르니틴 회로 결함; 카르니틴 결핍; β-산화 결핍; 리신뇨 단백질 불내성; 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 탄산 탈수효소 결핍; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 미토콘드리아 질환; 발프로에이트 요법; 아스파라기나제 요법; 완전 비경구 영양; 글리신-함유 용액을 이용한 방광경검사; 폐/골수 이식 후; 문맥전신 션트; 요로 감염; 요관 확장; 다발성 골수종; 화학요법; 감염; 신경인성 방광; 또는 장내 박테리아 과증식이다. 일부 구체예에서, 이의 관련된 증상(들)은 발작, 실조, 뇌졸중-유사 병변, 혼수, 정신병, 시력 상실, 급성 뇌병증, 뇌 부종, 뿐만 아니라 구토, 호흡성 알칼리혈증, 및 저체온증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 방법은 본원에 기재된 박테리아의 적어도 하나의 유전적으로 공학처리된 종, 균주, 또는 서브타입으로 약학적 조성물을 제조하는 단계, 및 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예컨대, 액체 현탁액으로 경구 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 겔 캡에서 동결건조되고, 경구 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 공급 튜브 또는 위 션트를 통해 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예컨대, 관장제에 의해 직장 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 국소, 장내, 공장내, 십이지장내, 회장내, 및/또는 결장내 투여된다.
특정 구체예에서, 대상체로 약학적 조성물을 투여하는 것은 대상체에서 암모니아 농도를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명의 개시의 방법은 미처리 또는 대조군 대상체에서의 수준에 비해 대상체의 암모니아 농도를 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상만큼 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 약학적 조성물의 투여 전 및 후에 대상체의 암모니아 농도를 비교함으로써 측정된다. 일부 구체예에서, 고암모니아혈증을 치료하거나 개선시키는 방법은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상만큼 개선시킨다.
약학적 조성물의 투여 전, 투여 동안, 및 투여 후, 대상체의 암모니아 농도는 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 배설물, 복수, 장 점막 찰과표본, 조직으로부터 수거된 샘플, 및/또는 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 및 항문관 중 하나 이상의 내용물로부터 수거된 샘플에서 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 대상체의 암모니아 농도를 검출가능하지 않은 수준, 또는 처리 전의 대상체의 암모니아 농도의 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 80% 미만으로 감소시키기 위한 본 발명의 조성물의 투여를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아는 E. 콜라이 Nissle이다. 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예컨대, 장 또는 혈청 내의 방어 인자(Sonnenborn et al., 2009)에 의해 또는 사멸 전환의 활성화에 의해 투여 수시간 또는 수일 후에 파괴될 수 있다. 따라서, 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 약학적 조성물은 치료적 유효 용량 및 빈도로 재투여될 수 있다. 마우스에서의 생체내 Nissle 체류 기간은 도 27에 제시되어 있다. 대안적 구체예에서, 유전적으로 공학처리된 박테리아는 투여 수시간 또는 수일 이내에 파괴되지 않고, 장에서 증식하고 집락화될 수 있다.
약학적 조성물은 단독으로 또는 소듐 페닐부티레이트, 소듐 벤조에이트, 및 글리세롤 페닐부티레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제의 선택에서 중요한 고려사항은 작용제(들)이 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아와 양립되어야 하고, 예컨대, 작용제(들)이 박테리아를 사멸시키지 않아야 한다는 것이다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 음식과 함께 투여된다. 대안적 구체예에서, 약학적 조성물은 음식을 섭취하기 전 또는 후에 투여된다. 약학적 조성물은 하나 이상의 식이 변형, 예컨대, 저단백질 식이 및 아미노산 보충과 조합하여 투여될 수 있다. 약학적 조성물의 투여량 및 투여 빈도는 증상의 중증도 및 장애의 진행을 기초로 하여 선택될 수 있다. 적절한 치료적 유효 용량 및/또는 투여 빈도는 치료 의사에 의해 선택될 수 있다.
생체내 처리
본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 생체내, 예컨대, 동물 모델에서 평가될 수 있다. 고암모니아혈증과 관련된 질병 또는 질환의 임의의 적합한 동물 모델, 예를 들어, 급성 간부전 및 고암모니아혈증의 마우스 모델이 이용될 수 있다(예컨대, 문헌[Deignan et al., 2008; Nicaise et al., 2008] 참조). 이러한 급성 간부전 및 고암모니아혈증은 티올 아세트아미드(TAA) 처리에 의해 유도될 수 있다(Nicaise et al., 2008). 또 다른 예시적인 동물 모델은 오르니틴 트랜스카르바밀라제 유전자에서의 미스센스 돌연변이로 인해 혈장 암모니아의 상승된 수준을 나타내는 spfash(sparse fur with abnormal skin and hair) 마우스이다(Doolittle et al., 1974; Hodges and Rosenberg, 1989). 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는, 예컨대, 경구 위관영양에 의해 동물에 투여될 수 있고, 치료 효능이, 예컨대, 혈액 샘플 내의 암모니아 및/또는 대변 샘플 내의 아르기닌, 시트룰린, 또는 다른 부산물을 측정함으로써 결정될 수 있다.
예시적인 구체예
1. 아르기닌 레굴론을 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아로서,
박테리아가 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해 감소된 아르기닌 피드백 억제를 지닌 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 외인성 환경 조건에 의해 유도되는 프로모터에 의해 제어되고;
박테리아에 기능성 ArgR이 없도록 유전적으로 공학처리된, 박테리아.
2. 구체예 1에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소의 발현을 제어하는 프로모터가 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 박테리아.
3. 구체예 1 또는 2 중 어느 한 구체예에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argR 유전자의 각 복사체가 독립적으로 결실되었거나 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 비활성이 된 박테리아.
4. 구체예 3에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argR 유전자의 각 복사체가 결실된 박테리아.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 한 구체예에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argG 유전자의 각 복사체가 독립적으로 결실되었거나 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 비활성이 된 박테리아.
6. 구체예 5에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argG 유전자의 각 복사체가 결실된 박테리아.
7. 구체예 1 내지 7 중 어느 한 구체예에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소의 발현을 제어하는 프로모터를 유도하는 조건 하에, 기능성 ARG 박스를 포함하는 오페론에 존재하고 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각 유전자의 전사가 동일한 조건 하에 야생형 박테리아의 상응하는 유전자에 비해 증가된 박테리아.
8. 구체예 2 내지 7 중 어느 한 구체예에 있어서, 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터가 FNR 프로모터인 박테리아.
9. 구체예 2 내지 7 중 어느 한 구체예에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 유전자가 하기로부터 선택되는 DNA 서열을 갖는 박테리아:
a) SEQ ID NO:28,
b) 유전 부호의 중복이 아니라면, SEQ ID NO:28에 의해 인코딩된 것과 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열, 및
c) a) 또는 b)의 DNA 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 DNA 서열.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 비병원성 박테리아인 박테리아.
11. 구체예 10에 있어서, 박테리아가 프로바이오틱 박테리아인 박테리아.
12. 구체예 10에 있어서, 박테리아가 박테로이데스, 비피도박테리움, 클로스트리듐, 에스체리치아, 락토바실루스, 및 락토코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아.
13. 구체예 12에 있어서, 박테리아가 에스체리치아 콜라이 균주 Nissle인 박테리아.
14. 구체예 2 내지 13 중 어느 한 구체예에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 플라스미드 상에 존재하고, 플라스미드 상에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
15. 구체예 2 내지 13 중 어느 한 구체예에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 염색체에 존재하고, 염색체에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
16. 구체예 1 내지 15 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되는 유전자에서 박테리아가 영양요구균주인 박테리아.
17. 구체예 16에 있어서, 포유동물의 장이 인간 장인 박테리아.
18. 구체예 1 내지 17 중 어느 한 구체예의 박테리아; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물.
19. 구체예 18에 있어서, 조성물이 경구 또는 직장 투여를 위해 제형화된 약학적으로 허용되는 조성물.
20. 구체예 19의 약학적으로 허용되는 조성물을 생산하는 방법으로서,
a) 구체예 1 내지 17 중 어느 한 구체예의 박테리아를 성장 배지 배양액에서 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소의 발현을 제어하는 프로모터를 유도하지 않는 조건 하에 성장시키는 단계;
b) 생성된 박테리아를 성장 배지로부터 분리시키는 단계; 및
c) 분리된 박테리아를 약학적으로 허용되는 담체에 현탁시키는 단계를 포함하는, 방법.
21. 구체예 18의 조성물을 고암모니아혈증-관련 질병의 중증도를 완화시키기에 충분한 기간 동안 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)의 치료가 필요한 대상체에서 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)을 치료하는 방법.
22. 구체예 21에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 우레아 회로 질환인 방법.
23. 구체예 22에 있어서, 우레아 회로 질환이 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바밀포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 또는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍인 방법.
24. 구체예 21에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 간 질환; 유기산 질환; 이소발레르산뇨증; 3-메틸크로토닐글리신뇨증; 메틸말론산혈증; 프로피온산뇨증; 지방산 산화 결함; 카르니틴 회로 결함; 카르니틴 결핍; β-산화 결핍; 리신뇨 단백질 불내성; 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 탄산 탈수효소 결핍; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 미토콘드리아 질환; 발프로에이트 요법; 아스파라기나제 요법; 완전 비경구 영양; 글리신-함유 용액에 의한 방광경검사; 폐/골수 이식 후; 문맥전신 션트; 요로 감염; 요관 확장; 다발성 골수종; 화학요법; 감염; 신경인성 방광; 또는 장내 박테리아 과증식인 방법.
25. 구체예 24에 있어서, 간 질환이 간 뇌병증, 급성 간부전, 또는 만성 간부전인 방법.
26. 구체예 25에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병의 증상이 발작, 실조, 뇌졸중-유사 병변, 혼수, 정신병, 시력 상실, 급성 뇌병증, 뇌 부종, 뿐만 아니라 구토, 호흡성 알칼리혈증, 및 저체온증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
27. 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아로서,
박테리아가 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해 아르기닌 피드백 억제를 감소시키도록 돌연변이된 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 의해 제어되고;
돌연변이체 아르기닌 레굴론이 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 오페론을 포함하고,
아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 오페론을 제외한 각 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 오페론에서 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하는, 유전적으로 공학처리된 박테리아.
28. 구체예 27에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 아르기니노석시네이트 신타제 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하는 유전적으로 공학처리된 박테리아.
29. 구체예 27에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 오페론이 아르기니노석시네이트 신타제 유전자의 전사를 조절하는 항시적으로 활성인 프로모터를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아.
30. 구체예 27 내지 29 중 어느 한 구체예에 있어서, 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해 아르기닌 피드백 억제를 감소시키도록 돌연변이된 박테리아.
31. 구체예 27 내지 30 중 어느 한 구체예에 있어서, ArgR 결합이 동일한 조건 하에 야생형 아르기닌 레굴론을 포함하는 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 박테리아에 비해 감소된 박테리아.
32. 구체예 27에 있어서, ArgR 결합을 통해 감소된 아르기닌-매개된 억제가 동일한 조건 하에 상응하는 야생형 박테리아에 비해 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자 각각의 전사를 증가시키는 박테리아.
33. 구체예 28에 있어서, ArgR 결합을 통해 감소된 아르기닌-매개된 억제가 동일한 조건 하에 상응하는 야생형 박테리아에 비해 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자 각각의 전사를 증가시키는 박테리아.
34. 구체예 27에 있어서, 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 오페론 각각이 오페론의 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 박테리아.
35. 구체예 28에 있어서, 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 오페론 각각이 오페론의 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 박테리아.
36. 구체예 27 내지 35항 중 어느 한 구체예에 있어서, 야생형 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 하나 이상의 오페론을 추가로 포함하고, 야생형 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 각각의 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 오페론에서 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하는 박테리아.
37. 구체예 27 내지 36 중 어느 한 구체예에 있어서, 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터가 FNR 프로모터인 박테리아.
38. 구체예 27 내지 37 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 하나 이상의 오페론을 추가로 포함하고, 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 각각의 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 오페론에서 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하며; 유전적으로 공학처리된 박테리아가 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소 프로모터를 포함하지 않는 박테리아.
39. 구체예 27 내지 39 중 어느 한 구체예에 있어서, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자가 에스체리치아 콜라이 Nissle에 존재하는 오페론으로 그룹화되는 박테리아.
40. 구체예 27 내지 39 중 어느 한 구체예에 있어서, 각각의 오페론이 프로모터 영역을 포함하고, 돌연변이체 아르기닌 레굴론의 각각의 프로모터 영역이 상응하는 야생형 프로모터 영역에서 발견되는 G/C:A/T 비와 10% 이하만큼 상이한 G/C:A/T 비를 갖는 박테리아.
41. 구체예 27 내지 40 중 어느 한 구체예에 있어서, 각각의 돌연변이된 ARG 박스가 상응하는 야생형 ARG 박스에 비해 적어도 3개의 뉴클레오티드 돌연변이를 특징으로 하는 박테리아.
42. 구체예 27 내지 41 중 어느 한 구체예에 있어서, 돌연변이체 N-아세틸글루타메이트 합성효소 유전자가 하기로부터 선택되는 DNA 서열을 갖는 박테리아:
a) SEQ ID NO: 28,
b) 유전 부호의 중복이 아니라면, SEQ ID NO:28과 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열, 및
c) a) 또는 b)의 DNA 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 DNA 서열.
43. 구체예 27 내지 42 중 어느 한 구체예에 있어서, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 단일 오페론을 포함하고, 단일 오페론이 SEQ ID NO:5의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 37, 38, 45, 46, 47 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 55, 56, 57, 67, 68, 69 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
44. 구체예 43에 있어서, 단일 오페론이 SEQ ID NO:6의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
45. 구체예 27 내지 44 중 어느 한 구체예에 있어서, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:11의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 20, 21, 29, 30, 31 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 41, 42, 50, 52 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
46. 구체예 45에 있어서, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:12의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
47. 구체예 27 내지 46항 중 어느 한 구체예에 있어서, N-아세틸오르니티나제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:7의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 92, 93, 94, 104, 105, 106 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 114, 115, 116, 123, 124 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
48. 구체예 46에 있어서, N-아세틸오르니티나제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:8의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
49. 구체예 27 내지 48 중 어느 한 구체예에 있어서, 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:3의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 12, 13, 14, 18, 20 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 34, 35, 36, 45, 46 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
50. 구체예 49에 있어서, 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:4의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
51. 구체예 27 내지 50 중 어느 한 구체예에 있어서, 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론의 돌연변이된 프로모터 영역이 SEQ ID NO:9의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 33, 34, 35, 43, 44, 45 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 51, 52, 53, 60, 61, 62 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
52. 구체예 51에 있어서, 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:10의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
53. 구체예 27 내지 52 중 어느 한 구체예에 있어서, N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론의 돌연변이된 프로모터 영역이 SEQ ID NO:1의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 12, 13, 14, 21, 22, 23 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 33, 34, 35, 42, 43, 44 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
54. 구체예 53에 있어서, N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:2의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
55. 구체예 28에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 오페론의 돌연변이된 프로모터 영역이 SEQ ID NO:13의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 9, 11, 19, 21 중 하나 이상; SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 129, 130, 131, 140, 141, 142 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 150, 151, 152, 161, 162, 163 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
56. 구체예 27에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:31의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
57. 구체예 28에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:32의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
58. 구체예 27 내지 57 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 박테로이데스, 비피도박테리움, 클로스트리듐, 에스체리치아, 락토바실루스, 및 락토코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아.
59. 구체예 27 내지 58 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 에스체리치아 콜라이 Nissle인 박테리아.
60. 구체예 27 내지 59 중 어느 한 구체예에 있어서, 오페론 중 적어도 하나가 박테리아의 플라스미드 상에 존재하고, 플라스미드 상의 것들에 상응하는 아르기닌 레굴론 유전자의 모든 염색체 복사체가 활성 효소를 인코딩하는 것은 아닌 박테리아.
61. 구체예 60에 있어서, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 플라스미드 상에 존재하고, 플라스미드 상에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
62. 구체예 27 내지 59 중 어느 한 구체예에 있어서, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 염색체에 존재하고, 염색체에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
63. 구체예 27 내지 62 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되는 제1 유전자에서 박테리아가 영양요구균주인 박테리아.
64. 구체예 63에 있어서, 포유동물의 장이 인간 장인 박테리아.
65. 구체예 27 내지 64 중 어느 한 구체예에 있어서,
a) 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되지 않는 제2 유전자에서 박테리아가 영양요구성이고;
b) 제2 유전자가 박테리아에 존재하는 유도성 제3 유전자에 의해 보충되고;
c) 제3 유전자의 전사가 충분히 높은 농도의 아르기닌의 존재 하에 유도되어 재2 유전자의 영양요구성을 보충하는 박테리아.
66. 구체예 65에 있어서,
a) 제3 유전자의 전사가 제2 억제인자에 의해 억제되고;
b) 제2 억제인자의 전사가 아르기닌-아르기닌 억제인자 복합체에 의해 억제되는 박테리아.
67. 구체예 66에 있어서, 제3 유전자 및 제2 억제인자가 각각 플라스미드 상에 존재하는 박테리아.
68. 구체예 27 내지 67 중 어느 한 구체예의 박테리아; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물.
69. 구체예 68의 약학적으로 허용되는 조성물을 생산하는 방법으로서,
a) 구체예 27 내지 67 중 어느 한 구체예의 박테리아를 성장 배지 배양액에서 호기성 조건 하에 성장시키는 단계;
b) 생성된 박테리아를 성장 배지로부터 분리시키는 단계; 및
c) 분리된 박테리아를 약학적으로 허용되는 담체에 현탁시키는 단계를 포함하는, 방법.
70. 구체예 68의 조성물을 고암모니아혈증-관련 질병의 중증도를 완화시키기에 충분한 기간 동안 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)의 치료가 필요한 대상체에서 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)을 치료하는 방법.
71. 구체예 70에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 우레아 회로 질환인 방법.
72. 구체예 71에 있어서, 우레아 회로 질환이 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바밀포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 또는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍인 방법.
73. 구체예 70에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 간 질환; 유기산 질환; 이소발레르산뇨증; 3-메틸크로토닐글리신뇨증; 메틸말론산혈증; 프로피온산뇨증; 지방산 산화 결함; 카르니틴 회로 결함; 카르니틴 결핍; β-산화 결핍; 리신뇨 단백질 불내성; 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 탄산 탈수효소 결핍; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 미토콘드리아 질환; 발프로에이트 요법; 아스파라기나제 요법; 완전 비경구 영양; 글리신-함유 용액에 의한 방광경검사; 폐/골수 이식 후; 문맥전신 션트; 요로 감염; 요관 확장; 다발성 골수종; 화학요법; 감염; 신경인성 방광; 또는 장내 박테리아 과증식인 방법.
74. 구체예 73에 있어서, 간 질환이 간 뇌병증, 급성 간부전, 또는 만성 간부전인 방법.
75. 구체예 70에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병의 증상이 발작, 실조, 뇌졸중-유사 병변, 혼수, 정신병, 시력 상실, 급성 뇌병증, 뇌 부종, 뿐만 아니라 구토, 호흡성 알칼리혈증, 및 저체온증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
76. 구체예 27 내지 75 중 어느 한 구체예에 있어서, 박테리아가 검출가능한 생성물을 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하고, 검출가능한 생성물을 코딩하는 DNA 서열의 전사가 아르기닌의 존재 하에 유도되는 박테리아.
77. 구체예 76에 있어서,
a) 검출가능한 생성물을 코딩하는 DNA 서열의 전사가 제3 억제인자에 의해 억제되고;
b) 제3 억제인자의 전사가 아르기닌-아르기닌 억제인자 복합체에 의해 억제되는 박테리아.
78. a) 구체예 77의 박테리아를 제공하고;
b) 박테리아를 제1 기간 동안 배양시키고;
c) 배양액이 돌연변이유발되게 하고;
d) 돌연변이유발된 배양액을 제2 기간 동안 배양시키고;
e) 검출가능한 생성물을 발현시키는 박테리아를 선택하여, 높은 수준의 아르기닌을 생산하는 박테리아를 선택하는 것을 포함하는, 높은 수준의 아르기닌을 생산하는 박테리아를 선택하는 방법.
79. 구체예 78에 있어서, 검출가능한 생성물이 형광 단백질이고, 선택이 형광-활성화 세포 분류기의 사용을 포함하는 방법.
명세서 전반에 걸쳐 인용된 참고문헌의 전체 인용은 하기를 포함한다:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 예시적인 구체예들을 제공한다. 당업자는 본 발명의 사상 또는 범위를 변경하지 않으면서 수행될 수 있는 여러 수정 및 변형을 인식할 것이다. 이러한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하지 않는다.
아르기닌 억제인자 결합 부위(ARG 박스)
실시예 1. ARG 박스 돌연변이
E. 콜라이 Nissle에서의 각 아르기닌 생합성 오페론에 대한 ArgR 결합 부위를 포함하는 야생형 유전체 서열들은 도 6에 도시되어 있다. 그러한 서열들에 대한 변형은 하기 파라미터들에 따라 설계된다. 각 야생형 서열에 대하여, ARG 박스는 이탤릭체(italics)로 나타낸다. 아르기닌 레굴론의 ARG 박스는 각 오페론의 프로모터 영역과 중첩한다. 밑줄로 표시된 서열들은 RNA 중합효소 결합 부위를 나타내며, 그러한 서열들은 변경되지 않았다. ArgR 결합 동안 DNA 메틸화로부터 보호된 염기들은 강조 표시되었으며, ArgR 결합 동안 하이드록실 라디칼 공격으로부터 보호된 염기들은 굵게 표시되었다. 강조 표시되고 굵게 표시된 염기들은 ArgR 결합을 파괴시키기 위한 돌연변이에 대한 주요 표적이다.
실시예 2. 람다 레드 재조합(Lambda red recombination)
염색체 변형, 예컨대, ARG 박스 돌연변이를 만들기 위하여 람다 레드 재조합을 이용하였다. 람다 레드(Lambda red)는 한 조각의 주문형 DNA(custom DNA)를 E. 콜라이의 염색체에 삽입하기 위해 박테리오파지 람다로부터의 재조합 효소를 사용하는 절차이다. pKD46 플라스미드를 E. 콜라이 Nissle 숙주 균주로 형질전환시켰다. E. 콜라이 Nissle 세포를 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양물(overnight culture)을 5 mL의 LB 배지 중에서 1:100의 비율로 희석시키고, 0.4 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. 모든 튜브, 용액, 및 큐벳을 4℃로 사전-냉각시켰다. E. 콜라이 세포를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리시키고, 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리시키고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.5 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리시키고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. 전기천공기를 2.5 kV로 설정하였다. 1 ng의 pKD46 플라스미드 DNA를 E. 콜라이 세포에 첨가하고, 피펫팅(pipetting)에 의해 혼합하고, 냉각된 멸균 큐벳으로 피펫팅하였다. 건조 큐벳을 샘플 챔버에 넣고, 전기 펄스를 가하였다. 1 mL의 실온 SOC 배지를 바로 첨가하고, 혼합물을 배양 튜브로 옮기고, 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 선택적 배지 플레이트(selective media plate) 상에 펼치고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
도 6에 도시된 요망되는 ARG 박스 서열을 포함하는 DNA 서열을 유전자 합성 회사로부터 주문하였다. argA 오페론에 대하여, 돌연변이체 조절 영역은 하기 핵산 서열 (SEQ ID NO: 2)를 포함한다:
gcaaaaaaacaCTTtaaaaaCTTaataatttcCTTtaatcaCTTaaagaggtgtaccgtg.
동종 재조합(homologous recombination)을 통해 이러한 작제물을 E. 콜라이 Nissle의 유전체에 삽입하기 위해 람다 효소를 사용하였다. 작제물을 이의 DNA 서열을 기초로 하여 E. 콜라이 Nissle의 유전체 중의 특정 부위에 삽입하였다. 작제물을 특정 부위에 삽입하기 위하여, 작제물 측면에 있는 동종 DNA 서열을 동정하였다. DNA의 동종 서열은 돌연변이된 서열의 어느 한 측면 상에 대략 50개의 염기를 포함한다. 동종 서열을 합성된 유전자의 일부로서 주문하였다. 대안적으로, 동종 서열은 PCR에 의해 첨가될 수 있다. E. 콜라이 Nissle 유전체에서 argA의 업스트림에 천연 서열을 대체하기 위해 작제물을 사용하였다. 작제물은 재조합에 의해 제거될 수 있는 항생제 내성 마커를 포함한다. 얻어진 돌연변이체 argA 작제물은 argA의 업스트림에 상동성의 대략 50개의 염기, 재조합에 의해 제거될 수 있는 카나마이신 내성 마커, gcaaaaaaacaCTTtaaaaaCTTaataatttcCTTtaatcaCTTaaagaggtgtaccgtg, 및 argA에 대해 상동성의 대략 50개의 염기를 포함한다.
일부 구체예에서, ARG 박스를 상술된 바와 같이 argG 조절 영역에서 돌연변이시켰고, BBa_J23100 항시적 프로모터(constitutive promotor)를 람다 레드 재조합을 이용하여 조절 영역에 삽입하였다(SYN-UCD105). 이러한 박테리아는 아르기닌을 생산할 수 있다. 대안적인 구체예에서, argG 조절 영역 (SEQ ID NO: 31)은 여전히 ArgR-억제성 (SYN-UCD104)이었으며, 박테리아는 시트룰린을 생산할 수 있다.
실시예 3. E. 콜라이 Nissle을 형질전환시킴
돌연변이된 ARG 박스 작제물을 pKD46을 포함하는 E. 콜라이 Nissle로 형질전환시켰다. 모든 튜브, 용액, 및 큐벳을 4℃로 사전-냉각시켰다. 밤새 배양물을 암피실린을 함유한 5 mL의 LB 배지에서 1:100의 비율로 희석시키고, 0.1의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. 0.05 mL의 100X L-아라비노스 모액을 첨가하여 pKD46 람다 레드 발현을 유도하였다. 배양물을 0.4 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. E. 콜라이 세포를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.5 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. 전기천공기를 2.5 kV로 설정하였다. 0.5 ㎍의 돌연변이된 ARG 박스 작제물을 세포에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 냉각된 멸균 큐벳에 피펫팅하였다. 건조 큐벳을 샘플 챔버에 넣고, 전기 펄스를 가하였다. 1 mL의 실온 SOC 배지를 바로 첨가하고, 혼합물을 배양 튜브로 옮기고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 카나마이신을 함유한 LB 플레이트 상에 펼치고, 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 4. 돌연변이체를 확인함
돌연변이의 존재를 콜로니 PCR에 의해 확인하였다. 콜로니를 피펫 첨단(pipette tip)으로 채집하고, 위아래로 피펫팅함으로써 20 ㎕의 차가운 ddH2O에 재현탁시켰다. 3 ㎕의 현탁액을 이후에 사용하기 위해 적절한 항생제를 갖는 인덱스 플레이트(index plate) 상에 피펫팅하였다. 인덱스 플레이트를 37℃에서 밤새 성장시켰다. 5 ㎕의 10X PCR 완충제, 0.6 ㎕의 10 mM dNTP, 0.4 ㎕의 50 mM Mg2SO4, 6.0 ㎕의 10X 인헨서, 및 3.0 ㎕의 ddH2O를 사용하여 PCR 마스터 혼합물을 제조하였다(PCR 반응 당 15 ㎕의 마스터 혼합물). 16 ㎕의 ddH2O에 argA 돌연변이체 작제물(100 μM 모액)에 대해 독특한 2 ㎕의 프라이머를 혼합함으로써 10 μM 프라이머 혼합물을 제조하였다. 각 20 ㎕ 반응을 위하여, 15 ㎕의 PCR 마스터 혼합물, 2.0 ㎕의 콜로니 현탁액(주형(template)), 2.0 ㎕의 프라이머 혼합물, 및 1.0 ㎕의 Pfx Platinum DNA Pol을 RCR 튜브에서 혼합하였다. PCR 써모사이클러(PCR thermocycler)를 하기와 같이 프로그램하였으며, 단계 2 내지 단계 4는 34회 반복하였다: 1) 5:00 분에 94℃, 2) 0:15 분에 94℃, 3) 0:30 분에 55℃, 4) 2:00 분에 68℃, 5) 7:00 분에 68℃, 및 이후 4℃로 냉각됨. PCR 생성물을 10 ㎕의 각 앰플리콘 및 2.5 ㎕ 5X 염료를 사용하여 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 돌연변이가 유전체에 삽입된 경우에, PCR 생성물이 유일하게 형성한다.
실시예 5. 선택 마커를 제거함
항생제 내성 유전자를 pCP20으로 제거하였다. 돌연변이된 ARG 박스를 갖는 각 균주를 0.4 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지, 37℃에서 항생제를 함유한 LB 배지에서 성장시켰다. 모든 튜브, 용액, 및 큐벳을 4℃로 사전-냉각시켰다. 세포를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.5 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. 전기천공기를 2.5 kV로 설정하였다. 1 ng의 pCP20 플라스미드 DNA를 세포에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 냉각된 멸균 큐벳에 피펫팅하였다. 건조 큐벳을 샘플 챔버에 넣고, 전기 펄스를 가하였다. 1 mL의 실온 SOC 배지를 바로 첨가하고, 혼합물을 배양 튜브로 옮기고, 30℃에서 1 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 카나마이신을 함유한 LB 플레이트 상에 펼치고, 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 충분한 OD600까지 성장하지 못한 콜로니를 추가 24시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 200 ㎕의 세포를 암피실린 플레이트 상에 펼치고, 200 ㎕의 세포를 카나마이신 플레이트 상에 펼치고, 둘 모두를 37℃에서 밤새 성장시켰다. 암피실린 플레이트는 pCP20를 갖는 세포를 함유한다. 카나마이신 플레이트는 다수의 세포가 전기 천공에서 얼마나 생존하였는지의 지표(indication)를 제공한다. 암피실린 플레이트로부터의 형질전환체를 43℃에서 비-선택적으로 정제하고, 밤새 성장시켰다.
실시예 6. 형질전환체를 확인함
정제된 형질전환체를 암피실린 및 카나마이신에 대한 민감성에 대해 시험하였다. 43℃에서 성장된 플레이트로부터의 콜로니를 채집하고, 10 ㎕의 LB 배지에 재현탁시켰다. 3 ㎕의 세포 현탁액을 세 개의 플레이트 각각 상에 피펫팅하였다: 1) 37℃에서 인큐베이션된 카나마이신을 갖는 LB 플레이트로서, 숙주 균주의 유전체에서 KanR 유전자의 존재 또는 부재에 대해 시험함; 2) 30℃에서 인큐베이션된 암피실린을 갖는 LB 플레이트로서, pCP20 플라스미드로부터 AmpR 유전자의 존재 또는 부재에 대해 시험함; 및 3) 37℃에서 인큐베이션된 항생제가 없는 LB 플레이트. 카나마이신 또는 암피실린 플레이트 상에서 특정 콜로니에 대한 성장이 관찰되지 않는 경우에, KanR 유전자 및 pCP20 플라스미드 둘 모두를 상실하였고, 추가 분석을 위하여 콜로니를 저장하였다. 저장된 콜로니를 LB 플레이트 상에서 다시 스트리킹하여 단일 콜로니들을 수득하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 돌연변이된 유전체 ARG 박스의 존재를 유전체의 argA 영역을 시퀀싱함으로써 확인하였다.
E. 콜라이 Nissle을 형질전환시키고, 돌연변이를 확인하고, 선택 마커를 제거하고, 형질전환체를 확인/시퀀싱하는, 람다 레드 재조합을 위한 방법은 ARG 박스 돌연변이 및 도 6에 도시된 오페론 각각에 대해 반복되었다. 얻어진 박테리아는 아르기닌 생합성 효소를 엔코딩하는 하나 이상의 오페론에 대한 각 ARG 박스에 돌연변이를 포함하며, 이에 따라, ARG 박스에 대한 ArgR 결합이 감소되며 상기 오페론의 조절 영역에 대한 전체 ArgR 결합이 감소되게 한다.
실시예 7. 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 (argA fbr )
상술된 ARG 박스 돌연변이 이외에, E. 콜라이 Nissle 박테리아는 하기 프로모터들 각각의 제어 하에서 발현된 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 (argAfbr, SEQ ID NO: 28) 유전자를 추가로 포함한다: 테트라사이클린-유도성 프로모터, SEQ ID NO: 16-27로부터 선택된 FNR 프로모터. 본원에 논의된 바와 같이, 다른 프로모터들이 사용될 수 있다.
argAfbr 유전자를 고-복사체 플라스미드, 저-복사체 플라스미드, 또는 염색체 상에서 발현시켰다. SYN-UCD101은 야생형 ArgR, 야생형 ArgA, 플라스미드 상의 테트라사이클린-유도성 argAfbr, 및 각 아르기닌 생합성 오페론에 대한 각 ARG 박스에서의 돌연변이를 포함한다. 플라스미드는 기능성 ArgR 결합 부위, 즉, ARG 박스를 포함하지 않는다. SYN-UCD102를 발생시키기 위해 SYN-UCD101을 사용하였으며, 이는 야생형 ArgR, 야생형 ArgA, 플라스미드 상의 테트라사이클린-유도성 argAfbr, 및 각 아르기닌 생합성 오페론에 대한 각 ARG 박스에서의 돌연변이를 포함한다. 플라스미드는 기능성 ArgR 결합 부위, 즉, ARG 박스를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 기능성 ArgR의 존재 및/또는 보강은 ARG 박스 이외의 부위에서 오프-표적 결합을 야기시킬 수 있다. 이러한 플라스미드에 기능성 ARG 박스의 도입은 즉, ArgR 싱크(sink)로서 작용시킴으로써, 오프-표적 ArgR 결합을 감소시키거나 제거하는데 유용할 수 있다. SYN-UCD104는 야생형 ArgR, 야생형 ArgA, 저-복사체 플라스미드 상의 테트라사이클린-유도성 argAfbr, 테트라사이클린-유도성 argG, 및 argG를 제외하고 각 아르기닌 생합성 오페론에 대한 각 ARG 박스에서의 돌연변이를 포함한다. SYN-UCD105는 야생형 ArgR, 야생형 ArgA, 저-복사체 플라스미드 상의 테트라사이클린-유도성 argAfbr, 항시적으로 발현된 argG (BBa_J23100 항시적 프로모터를 포함한 SEQ ID NO: 31), 및 각 아르기닌 생합성 오페론에 대한 각 ARG 박스에서의 돌연변이를 포함한다. SYN-UCD103은 대조군 Nissle 작제물이다.
argAfbr 유전자를 E. 콜라이 Nissle에서 하기 삽입 부위 중 하나 이상에서 박테리아의 유전체에 삽입하였다: malE/K, araC/BAD, lacZ, thyA, malP/T. 임의 적합한 삽입 부위를 사용할 수 있다[예컨대, 도 22 참조]. 삽입 부위는 유전체에서의 어디엔가에, 예컨대, 생존 및/또는 성장을 위해 요구되는 유전자, 예를 들어, thyA(영양요구균주를 생성시키기 위함)에서; 유전체의 활성 구역에서, 예를 들어, 유전체 복제의 부위 가까이에; 및/또는 아라비노스 오페론의 AraB와 AraC 사이와 같은, 의도되지 않은 전사의 위험을 감소시키기 위해 다른 프로모터들 사이에 존재할 수 있다. 삽입 부위에서, 삽입 부위에 그리고 argAfbr 작제물에 대해 동종인 DNA 프라이머를 설계하였다. 표적 부위에 대해 상동성을 갖는 작제물을 함유한 선형 DNA 단편을 PCR에 의해 생성시키고, 람다 레드 재조합을 상술한 바와 같이 수행하였다.
N-아세틸글루타메이트 합성효소에 대한 ArgR 결합 및 아르기닌 결합을 통해, 아르기닌 생합성 효소를 엔코딩하는 오페론들 중 하나 이상의 아르기닌-매개된 억제를 감소시켜 이에 의해 아르기닌 및/또는 시트룰린 생합성을 향상시키는(도 25) 핵산 돌연변이를 포함시키도록 얻어진 E. 콜라이 Nissle 박테리아를 유전적으로 공학처리하였다.
아르기닌 억제인자 (ArgR)
실시예 8. ArgR 서열
E. 콜라이 Nissle에서의 야생형 argR 뉴클레오티드 서열 및 argR 결실 후 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00028
실시예 9. ArgR 결실
pKD46 플라스미드를 E. 콜라이 Nissle 숙주 균주로 형질전환시켰다. E. 콜라이 Nissle 세포를 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양물을 5 mL의 LB 배지에서 1:100 비율로 희석시키고, 0.4 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. 모든 튜브, 용액, 및 큐벳을 4℃로 사전-냉각시켰다. E. 콜라이 세포를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.5 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. 전기천공기를 2.5 kV로 설정하였다. 1 ng 의 pKD46 플라스미드 DNA를 E. 콜라이 세포에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 냉각된 멸균 큐벳에 피펫팅하였다. 건조 큐벳을 샘플 챔버에 넣고, 전기 펄스를 가하였다. 1 mL의 실온 SOC 배지를 바로 첨가하고, 혼합물을 배양 튜브로 옮기고, 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 선택적 배지 플레이트 상에 펼치고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
argR 유전자의 업스트림 및 다운스트림에 상동성의 대략 50개의 염기를 PCR에 의해 pKD4 플라스미드에서의 카나마이신 내성 유전자에 첨가하여 하기 KanR 작제물을 생성시켰다: (ArgR의 업스트림에 ~50개 염기)(종료인자)(pKD4로부터의 FRT 부위 측면에 위치한 KanR 유전자)(ArgR의 다운스트림의 DNA).
일부 구체예에서, argR 유전자 및 argG 유전자 둘 모두를 상술된 바와 같은 람다 레드 재조합을 이용하여 결실시켰으며, 박테리아는 시트룰린을 생산할 수 있다.
실시예 10. E. 콜라이 Nissle을 형질전환시킴
ArgR을 결실시키기 위하여 KanR 작제물을 pKD46을 포함하는 E. 콜라이 Nissle로 형질전환시켰다. 모든 튜브, 용액, 및 큐벳을 4℃로 사전-냉각시켰다. 밤새 배양물을 암피실린을 함유한 5 mL의 LB 배지에서 1:100의 비율로 희석시키고, 0.1의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. 0.05 mL의 100X L-아라비노스 모액을 첨가하여 pKD46 람다 레드 발현을 유도하였다. 배양물을 0.4 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. E. 콜라이 세포를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.5 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. 전기천공기를 2.5 kV로 설정하였다. 0.5 ㎍의 KanR 작제물을 세포에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 냉각된 멸균 큐벳에 피펫팅하였다. 건조 큐벳을 샘플 챔버에 넣고, 전기 펄스를 가하였다. 1 mL의 실온 SOC 배지를 바로 첨가하고, 혼합물을 배양 튜브로 옮기고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 카나마이신을 함유한 LB 플레이트 상에 펼치고, 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 11. 돌연변이체를 확인함
돌연변이의 존재를 콜로니 PCR에 의해 확인하였다. 콜로니를 피펫 첨단으로 채집하고, 위아래로 피펫팅함으로써 20 ㎕의 차가운 ddH2O에 재현탁시켰다. 3 ㎕의 현탁액을 이후에 사용하기 위해 적절한 항생제를 갖는 인덱스 플레이트 상에 피펫팅하였다. 인덱스 플레이트를 37℃에서 밤새 성장시켰다. 5 ㎕의 10X PCR 완충제, 0.6 ㎕의 10 mM dNTP, 0.4 ㎕의 50 mM Mg2SO4, 6.0 ㎕의 10X 인헨서, 및 3.0 ㎕의 ddH2O를 사용하여 PCR 마스터 혼합물을 제조하였다(PCR 반응 당 15 ㎕의 마스터 혼합물). 16 ㎕의 ddH2O에 KanR 유전자(100 μM 모액)에 대해 독특한 2 ㎕의 프라이머를 혼합함으로써 10 μM 프라이머 혼합물을 제조하였다. 각 20 ㎕ 반응을 위하여, 15 ㎕의 PCR 마스터 혼합물, 2.0 ㎕의 콜로니 현탁액(주형), 2.0 ㎕의 프라이머 혼합물, 및 1.0 ㎕의 Pfx Platinum DNA Pol을 RCR 튜브에서 혼합하였다. PCR 써모사이클러를 하기와 같이 프로그램하였으며, 단계 2 내지 단계 4는 34회 반복하였다: 1) 5:00 분에 94℃, 2) 0:15 분에 94℃, 3) 0:30 분에 55℃, 4) 2:00 분에 68℃, 5) 7:00 분에 68℃, 및 이후 4℃로 냉각됨. PCR 생성물을 10 ㎕의 각 앰플리콘 및 2.5 ㎕ 5X 염료를 사용하여 겔 전기영동에 의해 분석하였다. KanR 유전자가 유전체에 삽입된 경우에, PCR 생성물이 유일하게 형성한다.
실시예 12. 선택 마커를 제거함
항생제 내성 유전자를 pCP20로 제거하였다. ArgR이 결실된 균주를 0.4 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지, 37℃에서 항생제를 함유한 LB 배지에서 성장시켰다. 모든 튜브, 용액, 및 큐벳을 4℃로 사전-냉각시켰다. 세포를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.5 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. E. 콜라이를 4℃에서, 5분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 0.1 mL의 4℃ 물에 재현탁시켰다. 전기천공기를 2.5 kV로 설정하였다. 1 ng의 pCP20 플라스미드 DNA를 세포에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 냉각된 멸균 큐벳에 피펫팅하였다. 건조 큐벳을 샘플 챔버에 넣고, 전기 펄스를 가하였다. 1 mL의 실온 SOC 배지를 바로 첨가하고, 혼합물을 배양 튜브로 옮기고, 30℃에서 1 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 200 ㎕의 세포를 암피실린 플레이트 상에 펼치고, 200 ㎕의 세포를 카나마이신 플레이트 상에 펼치고, 둘 모두를 37℃에서 밤새 성장시켰다. 암피실린 플레이트는 pCP20를 갖는 세포를 함유한다. 세포를 밤새 인큐베이션하였고, 밤새 충분한 OD600까지 성장하지 못한 콜로니를 추가 24시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 카나마이신 플레이트는 다수의 세포가 전기 천공에서 얼마나 생존하였는지의 지표를 제공한다. 암피실린 플레이트로부터의 형질전환체를 43℃에서 비-선택적으로 정제하고, 밤새 성장시켰다.
실시예 13. 형질전환체를 확인함
정제된 형질전환체를 암피실린 및 카나마이신에 대한 민감성에 대해 시험하였다. 43℃에서 성장된 플레이트로부터의 콜로니를 채집하고, 10 ㎕의 LB 배지에 재현탁시켰다. 3 ㎕의 세포 현탁액을 세 개의 플레이트 각각 상에 피펫팅하였다: 1) 37℃에서 인큐베이션된 카나마이신을 갖는 LB 플레이트로서, 숙주 균주의 유전체에서 KanR 유전자의 존재 또는 부재에 대해 시험함; 2) 30℃에서 인큐베이션된 암피실린을 갖는 LB 플레이트로서, pCP20 플라스미드로부터 AmpR 유전자의 존재 또는 부재에 대해 시험함; 및 3) 37℃에서 인큐베이션된 항생제가 없는 LB 플레이트. 카나마이신 또는 암피실린 플레이트 상에서 특정 콜로니에 대한 성장이 관찰되지 않는 경우에, KanR 유전자 및 pCP20 플라스미드 둘 모두를 상실하였고, 추가 분석을 위하여 콜로니를 저장하였다. 저장된 콜로니를 LB 플레이트 상에서 다시 스트리킹하여 단일 콜로니들을 수득하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. ArgR의 결실을 유전체의 argA 영역을 시퀀싱함으로써 확인하였다.
실시예 14. 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 (argA fbr )
상술된 argR 결실 이외에, E. 콜라이 Nissle 박테리아는 하기 프로모터들 각각의 제어 하에서 발현된 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 (argAfbr, SEQ ID NO: 28) 유전자를 추가로 포함한다: 테트라사이클린-유도성 프로모터, SEQ ID NO: 16-27로부터 선택된 FNR 프로모터. 본원에 논의된 바와 같이, 다른 프로모터들이 사용될 수 있다.
argAfbr 유전자를 고-복사체 플라스미드, 저-복사체 플라스미드, 또는 염색체 상에서 발현시켰다. ArgR을 SYN-UCD201, SYN-UCD202, 및 SYN-UCD203 각각에서 결실시켰다(ΔArgR). SYN-UCD201은 야생형 argA를 추가로 포함하지만, 유도성 argAfbr이 없는 것이다. SYN-UCD202는 고-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에서 발현된 ΔArgR 및 argAfbr을 포함한다. SYN-UCD203은 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에서 발현된 ΔArgR 및 argAfbr을 포함한다. SYN-UCD204는 저-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에서 발현된 ΔArgR 및 argAfbr을 포함한다. SYN-UCD205는 저-복사체 플라스미드 상에 FNR-유도성 프로모터 (fnrS2)의 제어 하에서 발현된 ΔArgR 및 argAfbr을 포함한다.
argAfbr 유전자를 E. 콜라이 Nissle에서 하기 삽입 부위들 중 하나 이상에서 박테리아의 유전체에 삽입하였다: malE/K, araC/BAD, lacZ, thyA, malP/T. 임의 적합한 삽입 부위를 사용할 수 있다[예컨대, 도 22 참조]. 삽입 부위는 유전체에서의 어디엔가에, 예컨대, 생존 및/또는 성장을 위해 요구되는 유전자, 예를 들어, thyA(영양요구균주를 생성시키기 위함)에서; 유전체의 활성 구역에서, 예를 들어, 유전체 복제의 부위 가까이에; 및/또는 아라비노스 오페론의 AraB와 AraC 사이와 같은, 의도되지 않은 전사의 위험을 감소시키기 위해 다른 프로모터들 사이에 존재할 수 있다. 삽입 부위에서, 삽입 부위에 그리고 argAfbr 작제물에 대해 동종인 DNA 프라이머를 설계하였다. 표적 부위에 대해 상동성을 갖는 작제물을 함유한 선형 DNA 단편을 PCR에 의해 생성시키고, 람다 레드 재조합을 상술한 바와 같이 수행하였다. 얻어진 E. 콜라이 Nissle 박테리아는 결실된 ArgR 및 삽입된 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 가지고, 이에 의해 아르기닌 또는 시트롤린 생합성을 증가시켰다.
실시예 15. 암모니아를 정량화함
상술된 유전적으로 공학처리된 박테리아를 5 mL LB에서 밤새 성장시켰다. 다음날에, 세포를 펠렛화하고, M9 + 글루코스에서 세척하고, 펠렛화하고, 3 mL M9 + 글루코스에서 재현탁시켰다. 세포 배양물을 4시간 동안 흔들어주면서(250 rpm) 인큐베이션하고, 37℃에서 코이(Coy) 혐기성 챔버(90% N2, 5% CO2, 5% H2를 공급함)에서 호기성으로 또는 혐기성으로 인큐베이션하였다. 기준선(t=0), 2시간, 및 4시간에, 각 세포의 상대 존재비(relative abundance)를 결정하기 위해 각 세포 배양물의 OD600을 측정하였다.
t=0, 2시간, 및 4시간에, 배지 중의 암모니아의 농도를 결정하기 위하여, 각 세포 배양물의 1 mL 분취액을 Nova Biomedical Bioprofile Analyzer 300 상에서 분석하였다. SYN-UCD101 및 SYN-UCD102 둘 모두는 시험관 내에서 암모니아를 소비할 수 있었다. 도 28a, 도 28b, 및 도 28c는 SYN-UCD202, SYN-UCD204, SYN-UCD103, 및 블랭크 대조군(blank control)을 사용한 암모니아 농도의 막대 그래프를 묘사한 것이다.
실시예 16. 아르기닌 및 시트룰린을 정량화함
일부 구체예에서, 상술된 유전적으로 공학처리된 박테리아를 흔들어주면서 37℃에서 LB 중에서 밤새 성장시켰다. 박테리아를 5 mL LB에서 1:100의 비율로 희석시키고, 1.5시간 동안 흔들어주면서 37℃에서 성장시켰다. 박테리아 배양물을 하기와 같이 유도하였다: (1) FNR-유도성 argAfbr을 포함하는 박테리아를 37℃에서 코이 혐기성 챔버(90% N2, 5% CO2, 5%H2, 및 20 mM 니트레이트가 공급됨)에서 혐기성 조건 하에서 최대 4시간 동안 37℃에서 LB 중에서 유도하였다; (2) 테트라사이클린-유도성 argAfbr을 포함하는 박테리아를 언하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)으로 유도하였다; (3) 아라비노스-유도성 argAfbr을 포함하는 박테리아를 글루코스가 결여된 배지 중에서 1% 아라비노스로 유도하였다. 유도 후에, 박테리아 세포를 인큐베이터로부터 꺼내고, 최대 속도에서 5분 동안 스핀 다운하였다. 세포를 1 mL M9 글루코스에서 재현탁시키고, OD600을 측정하였다. OD600이 0.6 내지 0.8일 때까지 세포를 희석시켰다. M9 글루코스 중 재현탁된 세포를 37℃에서 흔들어주면서 호기성으로 성장시켰다. 100 ㎕의 세포 재현탁액을 제거하고, OD600을 시간=0에서 측정하였다. 100 ㎕ 분취액을 질량 분광분석법 분석(LC-MS/MS)을 위한 둥근-바닥 96-웰 플레이트에서 -20℃에서 냉동시켰다. 각 후속 시점에, 100 ㎕의 세포 현탁액을 제거하고, OD600을 측정하였다. 100 ㎕ 분취액을 질량 분광분석법 분석을 위해 둥근-바닥 96-웰 플레이트에서 -20℃에서 냉동시켰다. 샘플을 아르기닌 및/또는 시트룰린 농도에 대해 분석하였다. 각 시점에, 질량 분광분석법에 의해 결정된 일반화된 농도 대 OD600를 사용하여 단위 시간 당 세포 당 아르기닌 및/또는 시트룰린 생산속도를 결정하였다.
일부 구체예에서, 상술된 유전적으로 공학처리된 박테리아를 아가 상의 단일 콜로니에 대하여 글리세롤 모액으로부터 스트리킹하였다. 콜로니를 채집하고, 4시간 동안 또는 밤새 3 mL LB 중에서 성장시키고, 이후에, 2,500 rcf에서 5분 동안 원심분리하였다. 배양물을 0.5% 글루코스를 함유한 M9 배지에서 세척하였다. 배양물을 0.5% 글루코스를 함유한 3 mL의 M9 배지에서 재현탁시키고, OD600을 측정하였다. 배양물을 0.5% 글루코스를 함유하고 ATC (100 ng/mL)를 함유하거나 함유하지 않고 20 mM 글루타민을 함유하거나 함유하지 않은 M9 배지에서 희석시켰으며, 이에 따라, 모든 OD600이 0.4 내지 0.5이도록 하였다. 각 샘플의 0.5 mL 분취액을 제거하고, 5분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 저장하였다. 상청액을 -80℃에서 냉동시키고, 세포 펠렛을 -80℃에서 냉동시켰다(t=0). 나머지 세포를 흔들어주면서(250 rpm) 4 내지 6시간 동안 성장시키고, 37℃에서 코이 혐기성 챔버(90% N2, 5% CO2, 5% H2가 공급됨)에서 호기성으로 또는 혐기성으로 인큐베이션하였다. 하나의 0.5 mL 분취액을 2시간 마다 각 샘플로부터 제거하고, OD600을 측정하였다. 분취액을 5분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 상청액을 -80℃에서 냉동시키고, 세포 펠렛을 -80℃에서 냉동시켰다(t=2, 4, 및 6시간). 샘플을 얼음 상에 놓고, 아르기닌 및 시트룰린 수준을 질량 분광분석법을 이용하여 결정하였다.
박테리아 배양물 상청액에 대하여, 수중 500, 100, 20, 4, 및 0.8 ㎍/mL 아르기닌 및 시트룰린 표준물의 샘플을 제조하였다. 둥근-바닥 96-웰 플레이트에서, 20 ㎕의 샘플(박테리아 상청액 또는 표준물)을 L-아르기닌-13C6,15N4 (Sigma) 및 L-시트룰린-2,3,3,4,4,5,5-d7 (CDN 동위원소) 내부 표준물을 갖는 80 ㎕의 물에 2 ㎍/mL 농도로 첨가하였다. 플레이트를 PierceASeal 호일로 가열-시일링하고, 잘 혼합하였다. V-바닥 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서, 5 ㎕의 희석된 샘플을 95 ㎕의 유도체화 혼합물(85 ㎕ 10 mM NaHCO3 pH 9.7 및 10 ㎕ 10 mg/mL 단실-클로라이드(dansyl-chloride)(아세토니트릴 중에 희석됨))에 첨가하였다. 플레이트를 ThermASeal 호일로 가열-시일링하고, 잘 혼합하였다. 샘플을 유도체화를 위하여 60℃에서 45분 동안 인큐베이션하고, 5분 동안 4000 rpm으로 원심분리하였다. 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서, 20 ㎕의 유도체화된 샘플을 0.1% 포름산을 함유한 180 ㎕의 물에 첨가하였다. 플레이트를 ClearASeal 시트로 가열-시일링하고, 잘 혼합하였다.
Thermo TSQ Quantum Max 삼중 사극 질량 분광법을 이용하여 탠뎀 질량 분광분석법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 아르기닌 및 시트룰린을 측정하였다. 하기 표는 LC-MS/MS 방법의 요약을 제공한 것이다.
Figure pct00029
도 51은 기준선, 2시간 및 4시간에서의 SYN-UCD101, SYN-UCD102, 및 블랭크 대조군으로부터 배양 배지 중 시험관내 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다. SYN-UCD101 및 SYN-UCD102 둘 모두는 시험관내에서 암모니아를 소비할 수 있다.
도 52는 유도(+ATC) 및 비-유도(-ATC) 조건 하에서 변형되지 않은 Nissle, SYN-UCD201, SYN-UCD202 및 SYN-UCD203에 의해 생산된 시험관내 아르기닌 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다. SYN-UCD202 및 SYN-UCD203 둘 모두는 변형되지 않은 Nissle 및 SYN-UCD201와 비교하여 시험관내에서 아르기닌을 생산할 수 있었다. SYN-UCD203은 SYN-UCD202와 비교하여, 비-유도 조건 하에서 보다 낮은 아르기닌 생산 수준을 나타내었다.
도 24는 유도(+ATC) 및 비-유도(-ATC) 조건 하에서 SYN-UCD103, SYN-UCD201, SYN-UCD202, 및 SYN-UCD203에 의해 생산된 시험관내 아르기닌 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다. SYN-UCD201은 ΔArgR을 포함하지만 argAfbr을 포함하지 않는다. SYN-UCD202는 고-복사체 플라스미드 상에 ΔArgR 및 테트라사이클린-유도성 argAfbr을 포함한다. SYN-UCD203은 저-복사체 플라스미드 상에 ΔArgR 및 테트라사이클린-유도된 argAfbr을 포함한다.
도 25는 유도 조건 하에서 SYN-UCD103, SYN-UCD104, SYN-UCD204, 및 SYN-UCD 105에 의해 생산된 아르기닌 및 시트룰린의 시험관내 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다.
도 26은 유도(+ATC) 및 비-유도(-ATC) 조건 하에, 산소의 존재(+O2) 또는 부재(-O2) 하에서 SYN-UCD103, SYN-UCD205, 및 SYN-UCD204에 의해 생산된 시험관내 아르기닌 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다.
도 27은 생체내 Nissle 체류의 그래프를 묘사한 것이다. 스트렙토마이신-내성 Nissle을 항생제 전처리 없이 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하였다. 총 6마리의 마우스로부터의 대변 펠렛을 투여 후 모니터링하여 마우스 위장관 내에 여전히 존재하는 투여된 Nissle의 양을 결정하였다. 막대는 마우스에 투여된 박테리아의 수를 나타낸 것이다. 선은 연속 10일 동안 매일 대변 샘플로부터 회수된 Nissle의 수를 나타낸 것이다.
도 28a는 변형되지 않은 대조군 Nissle, 또는 Arg 억제인자 유전자가 결실되고 argAfbr 유전자가 고-복사체 플라스미드 상에 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전적으로 공학처리된 균주인 SYN-UCD202로 처리된 고암모니아혈증 마우스에서 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다. 도 28b는 스트렙토마이신-내성 대조군 Nissle(SYN-UCD103) 및 비히클-단독 대조군에 비해, 간 뇌병증의 TAA 마우스 모델에서 SYN-UCD204의 생체내 효능(암모니아 소비)을 나타낸 막대 그래프를 묘사한 것이다. 도 28c는 TAA 처리한지 24 내지 48시간 후에 혈액 암모니아 농도 변화 퍼센트의 막대 그래프를 묘사한 것이다.
도 29는 스트렙토마이신-내성 Nissle 대조군(SYN-UCD103) 또는 SYN-UCD204로 처리된 고암모니아혈증 spfash 마우스에서의 암모니아 수준의 막대 그래프를 묘사한 것이다.
ATC 또는 혐기성 유도인자의 존재 또는 부재 하에 유전적으로 공학처리된 박테리아에서의 세포내 아르기닌 및 분비된 (상청액) 아르기닌 생산을 측정하였고, 동일한 조건 하에서 동일한 균주의 대조군 박테리아와 비교하였다.
ATC 또는 혐기성 유도인자의 존재 또는 부재 하에 유전적으로 공학처리된 박테리아에서의 6시간 동안의 아르기닌 총 생산을 측정하고, 동일한 조건 하에서 동일한 균주의 대조군 박테리아와 비교하였다.
실시예 17. 고암모니아혈증 및 급성 간부전의 마우스 모델에서 유전적으로 공학처리된 박테리아의 효능
야생형 C57BL6/J 마우스를 급성 간부전 및 고암모니아혈증을 야기시키는(Nicaise et al., 2008) 티올 아세트아미드(TAA)로 처리하였다. 마우스를 변형되지 않은 대조군 Nissle 박테리아로 처리하거나, 상술된 바와 같이 높은 수준의 아르기닌 또는 시트룰린을 생산하기 위해 공학처리된 Nissle 박테리아로 처리하였다.
1일째에, 50 mL의 박테리아 배양물을 밤새 성장시키고, 펠렛화하였다. 펠렛을 5 mL의 PBS 중에, 대략 1011 CFU/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 마우스에서 혈액 암모니아 수준을 하악 출혈(mandibular bleed)에 의해 측정하였고, 암모니아 수준을 PocketChem Ammonia Analyzer (Arkray)에 의해 결정하였다. 마우스를 100 ㎕의 박테리아(대략 1010 CFU)로 위관영양공급하였다. 마우스를 위한 음료수를 기호성을 위해 0.1 mg/mL 언하이드로테트라사이클린 (ATC) 및 5% 수크로스를 함유하도록 교체하였다.
2일째에, 박테리아 위관영양 용액을 상술한 바와 같이 제조하였고, 마우스를 100 ㎕의 박테리아로 위관영양공급하였다. 마우스가 0.1 mg/mL ATC 및 5% 수크로스를 함유한 음료수를 계속 수용하도록 하였다.
3일째에, 박테리아 위관영양 용액을 상술한 바와 같이 제조하였고, 마우스를 100 ㎕의 박테리아로 위관영양공급하였다. 마우스가 0.1 mg/mL ATC 및 5% 수크로스를 함유한 음료수를 계속 수용하도록 하였다. 마우스에 100 ㎕의 TAA(0.5% NaCl 중 250 mg/kg 체중)를 복강내(IP) 주사하였다.
4일째에, 박테리아 위관영양 용액을 상술한 바와 같이 제조하였고, 마우스를 100 ㎕의 박테리아로 위관영양공급하였다. 마우스가 0.1 mg/mL ATC 및 5% 수크로스를 함유한 음료수를 계속 수용하도록 하였다. 마우스에 100 ㎕의 TAA(0.5% NaCl 중 250 mg/kg 체중)를 또한 IP 주사하였다. 마우스에서의 혈액 암모니아 수준을 하악 출혈에 의해 측정하고, 암모니아 수준을 PocketChem Ammonia Analyzer (Arkray)에 의해 결정하였다.
5일째에, 마우스에서의 혈액 암모니아 수준을 하악 출혈에 의해 측정하였고, 암모니아 수준을 PocketChem Ammonia Analyzer (Arkray)에 의해 결정하였다. 대변 펠렛을 마우스로부터 수집하여 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC-MS)에 의해 아르기닌 함량을 결정하였다. 유전적으로 공학처리된 Nissle 및 변형되지 않은 대조군 Nissle로 처리된 마우스에서의 암모니아 수준들을 비교하였다.
실시예 18. 고암모니아혈증 및 UCD의 마우스 모델에서의 유전적으로 공학처리된 박테리아의 효능
오르니틴 트랜스카르바밀라제는 우레아 회로 효소이며, spf-ash 돌연변이를 포함하는 마우스는 부분 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍을 나타내는데, 이는 인간 UCD에 대한 모델의 역할을 한다. 마우스를 변형되지 않은 대조군 Nissle 박테리아 또는 상술된 바와 같이 높은 수준의 아르기닌 또는 시트룰린을 생산하기 위해 공학처리된 Nissle 박테리아로 처리하였다.
60 spf-ash 마우스를 100 ㎕ PO QD: H2O 대조군, 일반 식사(normal chow) (n=15); H2O 대조군, 고단백질 식사(n=15); SYN-UCD103, 고단백질 식사(n=15); SYN-UCD204, 고단백질 식사(n=15)에서 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아(SYN-UCD103, SYN-UCD204) 또는 H2O 대조군으로 처리하였다. 1일째에, 마우스를 계량하고, 케이지 당 마우스 체중의 변화를 최소화하기 위해 그룹들로 분류하였다. 마우스를 위관영양공급하고, 20 mg/L ATC를 함유한 물을 케이지에 추가하였다. 2일째에, 마우스를 아침 및 점심에 위관영양공급하였다. 3일째에, 마우스를 아침에 위관영양공급하고, 계량하고, 투여하고 4시간 후에 혈액을 채혈하여 기준선 암모니아 수준을 얻었다. 마우스를 점심에 위관영양공급하고, 식사를 70% 단백질 식사로 변경하였다. 4일째에, 마우스를 아침 및 점심에 위관영양공급하였다. 5일째에, 마우스를 아침에 위관영양공급하고, 계량하고, 투여하고 4시간 후에 혈액을 채혈하여 암모니아 수준을 얻었다. 6일 및 7일째에, 마우스를 아침에 위관영양공급하였다. 8일째에, 마우스를 아침에 위관영양공급하고, 계량하고, 투여하고 4시간 후에 혈액을 채혈하여 암모니아 수준을 얻었다. 9일째에, 마우스를 아침 및 점심에 위관영양공급하였다. 10일째에, 마우스를 아침에 위관영양공급하고, 계량하고, 혈액을 투여하고 4시간 후에 채혈하여 암모니아 수준을 얻었다. 12일째에, 마우스를 아침 및 점심에 위관영양공급하였다. 13일째에, 마우스를 아침에 위관영양공급하고, 계량하고, 혈액을 투여하고 4시간 후에 채혈하여 암모니아 수준을 얻었다. 혈액 암모니아 수준, 체중, 및 생존율을 분석하였다(도 29).
실시예 19. Nissle 체류
변형되지 않은 E. 콜라이 Nissle 및 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아는 소화관 또는 혈청에서 방어 인자들에 의해 파괴될 수 있다. 생체내에서 박테리아의 체류 시간이 계산될 수 있다. E. 콜라이 Nissle의 스트렙토마이신-내성 균주를 사용한 비제한적인 예가 하기에 기술된다. 대안적인 구체예에서, 체류 시간은 본 발명의 유전적으로 공학처리된 박테리아에 대해 계산된다.
C57BL/6 마우스를 1주일 동안 동물 시설에서 순응시켰다. 1주일의 순응후(즉 0일), 스트렙토마이신-내성 Nissle (SYN-UCD103)을 1일 내지 3일째에 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하였다. 마우스는 항생제로 처리되지 않았다. 투여된 박테리아, 즉 접종원(inoculant)의 양은 표 4에 나타내었다. 접종원의 CFU를 결정하기 위하여, 접종원을 연속적으로 희석시키고, 스트렙토마이신(300 ㎍/ml)을 함유한 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 콜로니를 계수하였다.
표 4: 경구 위관영양을 통해 투여된 CFU
Figure pct00030
2일 내지 10일째에, 최대 6마리의 마우스로부터 대변 펠렛을 수집하였다(ID NO. 1-6; 표 5). PBS를 함유한 튜브에 대변 펠렛을 계량하고, 균질화하였다. 대변 펠렛에서 Nissle의 CFU를 결정하기 위하여, 균질화된 대변 펠렛을 연속적으로 희석시키고, 스트렙토마이신(300 ㎍/ml)을 함유한 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 콜로니를 계수하였다.
1일째의 대변 펠렛을 또한 수집하고, 스트렙토마이신(300 ㎍/ml)을 함유한 LB 플레이트 상에 플레이팅하여 스트렙토마이신 내성인 마우스 위장관에 고유한 임의 균주인지의 여부를 결정하였다. 시간 과정(time course) 및 마우스 위장관 내에 여전히 존재하는 투여된 Nissle의 양은 표 5에 나타내었다.
도 27은 생체내에서 Nissle 체류의 그래프를 묘사한 것이다. 스트렙토마이신-내성 Nissle를 항생제 전처리 없이 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하였다. 총 6마리의 마우스로부터의 대변 펠렛을 투여 후 모니터링하여 마우스 위장관 내에 여전히 존재하는 투여된 Nissle의 양을 결정하였다. 막대는 마우스에 투여된 박테리아의 수를 나타낸 것이다. 선은 연속 10일 동안 날마다 대변 샘플로부터 회수된 Nissle의 수를 나타낸 것이다.
표 5: 생체내 Nissle 체류
Figure pct00031
SEQUENCE LISTING <110> SYNLOGIC, INC. <120> BACTERIA ENGINEERED TO TREAT DISEASES ASSOCIATED WITH HYPERAMMONEMIA <130> 12671.0006-00304 <140> PCT/US2015/064140 <141> 2015-12-04 <150> 62/263,329 <151> 2015-12-04 <150> 62/256,041 <151> 2015-11-16 <150> 62/256,039 <151> 2015-11-16 <150> 62/184,811 <151> 2015-06-25 <150> 62/183,935 <151> 2015-06-24 <150> 62/173,710 <151> 2015-06-10 <150> 62/173,706 <151> 2015-06-10 <150> 62/150,508 <151> 2015-04-21 <150> 62/103,513 <151> 2015-01-14 <150> 62/087,854 <151> 2014-12-05 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 gcaaaaaaac agaataaaaa tacaataatt tcgaataatc atgcaaagag gtgtaccgtg 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 gcaaaaaaac actttaaaaa cttaataatt tcctttaatc acttaaagag gtgtaccgtg 60 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 agacttgcaa atgaataatc atccatatag 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tgtgggtatc tgtaaattct 1800 gctagacctt tgctggaaaa cttgtaaatt ctgctagacc ctctgtaaat tccgctagac 1860 ctttgtgtgt tttttttgtt tatattcaag tggttataat ttatagaata aagaaagaat 1920 aaaaaaagat aaaaagaata gatcccagcc ctgtgtataa ctcactactt tagtcagttc 1980 cgcagtatta caaaaggatg tcgcaaacgc tgtttgctcc tctacaaaac agaccttaaa 2040 accctaaagg cttaagtagc accctcgcaa gctcgggcaa atcgctgaat attccttttg 2100 tctccgacca tcaggcacct gagtcgctgt ctttttcgtg acattcagtt cgctgcgctc 2160 acggctctgg cagtgaatgg gggtaaatgg cactacaggc gccttttatg gattcatgca 2220 aggaaactac ccataataca agaaaagccc gtcacgggct tctcagggcg ttttatggcg 2280 ggtctgctat gtggtgctat ctgacttttt gctgttcagc agttcctgcc ctctgatttt 2340 ccagtctgac cacttcggat tatcccgtga caggtcattc agactggcta atgcacccag 2400 taaggcagcg gtatcatcaa caggcttacc cgtcttactg tcttttctac ggggtctgac 2460 gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 2520 ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 2580 taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 2640 ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 2700 ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 2760 gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 2820 ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 2880 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 2940 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 3000 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 3060 gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 3120 tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 3180 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 3240 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 3300 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 3360 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 3420 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 3480 tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 3540 aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 3600 accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 3660 gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 3720 gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 3780 ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 3840 catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 3900 tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 3960 cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcg 3995 <210> 35 <211> 5660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 35 ggtaccagtt gttcttattg gtggtgttgc tttatggttg catcgtagta aatggttgta 60 acaaaagcaa tttttccggc tgtctgtata caaaaacgcc gcaaagtttg agcgaagtca 120 ataaactctc tacccattca gggcaatatc tctcttggat ccaaagtgaa ctctagaaat 180 aattttgttt aactttaaga aggagatata catatggtaa aggaacgtaa aaccgagttg 240 gtcgagggat tccgccattc ggttccctgt atcaataccc accggggaaa aacgtttgtc 300 atcatgctcg gcggtgaagc cattgagcat gagaatttct ccagtatcgt taatgatatc 360 gggttgttgc acagcctcgg catccgtctg gtggtggtct atggcgcacg tccgcagatc 420 gacgcaaatc tggctgcgca tcaccacgaa ccgctgtatc acaagaatat acgtgtgacc 480 gacgccaaaa cactggaact ggtgaagcag gctgcgggaa cattgcaact ggatattact 540 gctcgcctgt cgatgagtct caataacacg ccgctgcagg gcgcgcatat caacgtcgtc 600 agtggcaatt ttattattgc ccagccgctg ggcgtcgatg acggcgtgga ttactgccat 660 agcgggcgta tccggcggat tgatgaagac gcgatccatc gtcaactgga cagcggtgca 720 atagtgctaa tggggccggt cgctgtttca gtcactggcg agagctttaa cctgacctcg 780 gaagagattg ccactcaact ggccatcaaa ctgaaagctg aaaagatgat tggtttttgc 840 tcttcccagg gcgtcactaa tgacgacggt gatattgtct ccgaactttt ccctaacgaa 900 gcgcaagcgc gggtagaagc ccaggaagag aaaggcgatt acaactccgg tacggtgcgc 960 tttttgcgtg gcgcagtgaa agcctgccgc agcggcgtgc gtcgctgtca tttaatcagt 1020 tatcaggaag atggcgcgct gttgcaagag ttgttctcac gcgacggtat cggtacgcag 1080 attgtgatgg aaagcgccga gcagattcgt cgcgcaacaa tcaacgatat tggcggtatt 1140 ctggagttga ttcgcccact ggagcagcaa ggtattctgg tacgccgttc tcgcgagcag 1200 ctggagatgg aaatcgacaa attcaccatt attcagcgcg ataacacgac tattgcctgc 1260 gccgcgctct atccgttccc ggaagagaag attggggaaa tggcctgtgt ggcagttcac 1320 ccggattacc gcagttcatc aaggggtgaa gttctgctgg aacgcattgc cgctcaggct 1380 aagcagagcg gcttaagcaa attgtttgtg ctgaccacgc gcagtattca ctggttccag 1440 gaacgtggat ttaccccagt ggatattgat ttactgcccg agagcaaaaa gcagttgtac 1500 aactaccagc gtaaatccaa agtgttgatg gcggatttag ggtaaggaag tttgtctaga 1560 tctcaggcgt ggatggcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 1620 atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 1680 cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 1740 gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 1800 gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 1860 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg tagtacgggt tttgctgccc gcaaacgggc 1920 tgttctggtg ttgctagttt gttatcagaa tcgcagatcc ggcttcaggt ttgccggctg 1980 aaagcgctat ttcttccaga attgccatga ttttttcccc acgggaggcg tcactggctc 2040 ccgtgttgtc ggcagctttg attcgataag cagcatcgcc tgtttcaggc tgtctatgtg 2100 tgactgttga gctgtaacaa gttgtctcag gtgttcaatt tcatgttcta gttgctttgt 2160 tttactggtt tcacctgttc tattaggtgt tacatgctgt tcatctgtta cattgtcgat 2220 ctgttcatgg tgaacagctt taaatgcacc aaaaactcgt aaaagctctg atgtatctat 2280 cttttttaca ccgttttcat ctgtgcatat ggacagtttt ccctttgata tctaacggtg 2340 aacagttgtt ctacttttgt ttgttagtct tgatgcttca ctgatagata caagagccat 2400 aagaacctca gatccttccg tatttagcca gtatgttctc tagtgtggtt cgttgttttt 2460 gcgtgagcca tgagaacgaa ccattgagat catgcttact ttgcatgtca ctcaaaaatt 2520 ttgcctcaaa actggtgagc tgaatttttg cagttaaagc atcgtgtagt gtttttctta 2580 gtccgttacg taggtaggaa tctgatgtaa tggttgttgg tattttgtca ccattcattt 2640 ttatctggtt gttctcaagt tcggttacga gatccatttg tctatctagt tcaacttgga 2700 aaatcaacgt atcagtcggg cggcctcgct tatcaaccac caatttcata ttgctgtaag 2760 tgtttaaatc tttacttatt ggtttcaaaa cccattggtt aagcctttta aactcatggt 2820 agttattttc aagcattaac atgaacttaa attcatcaag gctaatctct atatttgcct 2880 tgtgagtttt cttttgtgtt agttctttta ataaccactc ataaatcctc atagagtatt 2940 tgttttcaaa agacttaaca tgttccagat tatattttat gaattttttt aactggaaaa 3000 gataaggcaa tatctcttca ctaaaaacta attctaattt ttcgcttgag aacttggcat 3060 agtttgtcca ctggaaaatc tcaaagcctt taaccaaagg attcctgatt tccacagttc 3120 tcgtcatcag ctctctggtt gctttagcta atacaccata agcattttcc ctactgatgt 3180 tcatcatctg agcgtattgg ttataagtga acgataccgt ccgttctttc cttgtagggt 3240 tttcaatcgt ggggttgagt agtgccacac agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg 3300 ttaagtcata gcgactaatc gctagttcat ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac 3360 atctcaattg gtctaggtga ttttaatcac tataccaatt gagatgggct agtcaatgat 3420 aattactagt ccttttcctt tgagttgtgg gtatctgtaa attctgctag acctttgctg 3480 gaaaacttgt aaattctgct agaccctctg taaattccgc tagacctttg tgtgtttttt 3540 ttgtttatat tcaagtggtt ataatttata gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa 3600 gaatagatcc cagccctgtg tataactcac tactttagtc agttccgcag tattacaaaa 3660 ggatgtcgca aacgctgttt gctcctctac aaaacagacc ttaaaaccct aaaggcttaa 3720 gtagcaccct cgcaagctcg ggcaaatcgc tgaatattcc ttttgtctcc gaccatcagg 3780 cacctgagtc gctgtctttt tcgtgacatt cagttcgctg cgctcacggc tctggcagtg 3840 aatgggggta aatggcacta caggcgcctt ttatggattc atgcaaggaa actacccata 3900 atacaagaaa agcccgtcac gggcttctca gggcgtttta tggcgggtct gctatgtggt 3960 gctatctgac tttttgctgt tcagcagttc ctgccctctg attttccagt ctgaccactt 4020 cggattatcc cgtgacaggt cattcagact ggctaatgca cccagtaagg cagcggtatc 4080 atcaacaggc ttacccgtct tactgtcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 4140 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 4200 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 4260 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 4320 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 4380 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 4440 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 4500 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 4560 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 4620 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 4680 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 4740 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 4800 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 4860 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 4920 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 4980 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 5040 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 5100 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 5160 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 5220 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 5280 acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 5340 gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 5400 gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 5460 tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 5520 ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 5580 cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 5640 gggggatgtg ctgcaaggcg 5660 <210> 36 <211> 967 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 36 caaatatcac ataatcttaa catatcaata aacacagtaa agtttcatgt gaaaaacatc 60 aaacataaaa tacaagctcg gaatacgaat cacgctatac acattgctaa caggaatgag 120 attatctaaa tgaggattga tatattaatt ggacatacta gtttttttca tcaaaccagt 180 agagataact tccttcacta tctcaatgag gaagaaataa aacgctatga tcagtttcat 240 tttgtgagtg ataaagaact ctatatttta agccgtatcc tgctcaaaac agcactaaaa 300 agatatcaac ctgatgtctc attacaatca tggcaattta gtacgtgcaa atatggcaaa 360 ccatttatag tttttcctca gttggcaaaa aagatttttt ttaacctttc ccatactata 420 gatacagtag ccgttgctat tagttctcac tgcgagcttg gtgtcgatat tgaacaaata 480 agagatttag acaactctta tctgaatatc agtcagcatt tttttactcc acaggaagct 540 actaacatag tttcacttcc tcgttatgaa ggtcaattac ttttttggaa aatgtggacg 600 ctcaaagaag cttacatcaa atatcgaggt aaaggcctat ctttaggact ggattgtatt 660 gaatttcatt taacaaataa aaaactaact tcaaaatata gaggttcacc tgtttatttc 720 tctcaatgga aaatatgtaa ctcatttctc gcattagcct ctccactcat cacccctaaa 780 ataactattg agctatttcc tatgcagtcc caactttatc accacgacta tcagctaatt 840 cattcgtcaa atgggcagaa ttgaatcgcc acggataatc tagacacttc tgagccgtcg 900 ataatattga ttttcatatt ccgtcggtgg tgtaagtatc ccgcataatc gtgccattca 960 catttag 967 <210> 37 <211> 424 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 37 ggatgggggg aaacatggat aagttcaaag aaaaaaaccc gttatctctg cgtgaaagac 60 aagtattgcg catgctggca caaggtgatg agtactctca aatatcacat aatcttaaca 120 tatcaataaa cacagtaaag tttcatgtga aaaacatcaa acataaaata caagctcgga 180 atacgaatca cgctatacac attgctaaca ggaatgagat tatctaaatg aggattgatg 240 tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag 300 gaacttcgga ataggaacta aggaggatat tcatatgtcg tcaaatgggc agaattgaat 360 cgccacggat aatctagaca cttctgagcc gtcgataata ttgattttca tattccgtcg 420 gtgg 424 <210> 38 <211> 471 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 38 atgcgaagct cggctaagca agaagaacta gttaaagcat ttaaagcatt acttaaagaa 60 gagaaattta gctcccaggg cgaaatcgtc gccgcgttgc aggagcaagg ctttgacaat 120 attaatcagt ctaaagtctc gcggatgttg accaagtttg gtgctgtacg tacacgcaat 180 gccaaaatgg aaatggttta ctgcctgcca gctgaactgg gtgtaccaac cacctccagt 240 ccattgaaga atctggtact ggatatcgac tacaacgatg cagttgtcgt gattcatacc 300 agccctggtg cggcgcagtt aattgctcgc ctgctggact cactgggcaa agcagaaggt 360 attctgggca ccatcgctgg cgatgacacc atctttacta cccctgctaa cggtttcacc 420 gtcaaagagc tgtacgaagc gattttagag ctgttcgacc aggagcttta a 471 <210> 39 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 39 atgcgaagct cggctaagca agaagagagc tgttcgacca ggagctttaa 50 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 40 wntgaatwww wattcanw 18

Claims (77)

  1. 아르기닌 레굴론을 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아로서,
    박테리아가 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해 감소된 아르기닌 피드백 억제를 지닌 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 외인성 환경 조건에 의해 유도되는 프로모터에 의해 제어되고;
    박테리아에 기능성 ArgR이 없도록 유전적으로 공학처리된, 박테리아.
  2. 제 1항에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소의 발현을 제어하는 프로모터가 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 박테리아.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argR 유전자의 각 복사체가 독립적으로 결실되었거나 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 비활성이 된 박테리아.
  4. 제 3항에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argR 유전자의 각 복사체가 결실된 박테리아.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argG 유전자의 각 복사체가 독립적으로 결실되었거나 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 비활성이 된 박테리아.
  6. 제 5항에 있어서, 상응하는 야생형 박테리아에 정상적으로 존재하는 기능성 argG 유전자의 각 복사체가 결실된 박테리아.
  7. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소의 발현을 제어하는 프로모터를 유도하는 조건 하에, 기능성 ARG 박스를 포함하는 오페론에 존재하고 아르기닌 생합성 효소를 인코딩하는 각 유전자의 전사가 동일한 조건 하에 야생형 박테리아의 상응하는 유전자에 비해 증가된 박테리아.
  8. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터가 FNR 프로모터인 박테리아.
  9. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소 유전자가 하기로부터 선택되는 DNA 서열을 갖는 박테리아:
    a) SEQ ID NO:28,
    b) 유전 부호의 중복이 아니라면, SEQ ID NO:28에 의해 인코딩된 것과 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열, 및
    c) a) 또는 b)의 DNA 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 DNA 서열.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 비병원성 박테리아인 박테리아.
  11. 제 10항에 있어서, 박테리아가 프로바이오틱 박테리아인 박테리아.
  12. 제 10항에 있어서, 박테리아가 박테로이데스, 비피도박테리움, 클로스트리듐, 에스체리치아, 락토바실루스, 및 락토코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아.
  13. 제 12항에 있어서, 박테리아가 에스체리치아 콜라이 균주 Nissle인 박테리아.
  14. 제 2항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 플라스미드 상에 존재하고, 플라스미드 상에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
  15. 제 2항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 염색체에 존재하고, 염색체에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되는 유전자에서 박테리아가 영양요구균주인 박테리아.
  17. 제 16항에 있어서, 포유동물의 장이 인간 장인 박테리아.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 박테리아; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 조성물이 경구 또는 직장 투여를 위해 제형화된 약학적으로 허용되는 조성물.
  20. 제 19항의 약학적으로 허용되는 조성물을 생산하는 방법으로서,
    a) 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 박테리아를 성장 배지 배양액에서 아르기닌 피드백 내성 N-아세틸글루타메이트 합성효소의 발현을 제어하는 프로모터를 유도하지 않는 조건 하에 성장시키는 단계;
    b) 생성된 박테리아를 성장 배지로부터 분리시키는 단계; 및
    c) 분리된 박테리아를 약학적으로 허용되는 담체에 현탁시키는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제 18항의 조성물을 고암모니아혈증-관련 질병의 중증도를 완화시키기에 충분한 기간 동안 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)의 치료가 필요한 대상체에서 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)을 치료하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 우레아 회로 질환인 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 우레아 회로 질환이 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바밀포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 또는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍인 방법.
  24. 제 21항에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 간 질환; 유기산 질환; 이소발레르산뇨증; 3-메틸크로토닐글리신뇨증; 메틸말론산혈증; 프로피온산뇨증; 지방산 산화 결함; 카르니틴 회로 결함; 카르니틴 결핍; β-산화 결핍; 리신뇨 단백질 불내성; 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 탄산 탈수효소 결핍; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 미토콘드리아 질환; 발프로에이트 요법; 아스파라기나제 요법; 완전 비경구 영양; 글리신-함유 용액에 의한 방광경검사; 폐/골수 이식 후; 문맥전신 션트; 요로 감염; 요관 확장; 다발성 골수종; 화학요법; 감염; 신경인성 방광; 또는 장내 박테리아 과증식인 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 간 질환이 간 뇌병증, 급성 간부전, 또는 만성 간부전인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병의 증상이 발작, 실조, 뇌졸중-유사 병변, 혼수, 정신병, 시력 상실, 급성 뇌병증, 뇌 부종, 뿐만 아니라 구토, 호흡성 알칼리혈증, 및 저체온증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 돌연변이체 아르기닌 레굴론을 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아로서,
    박테리아가 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해 아르기닌 피드백 억제를 감소시키도록 돌연변이된 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 의해 제어되고;
    돌연변이체 아르기닌 레굴론이 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 오페론을 포함하고,
    아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 오페론을 제외한 각 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 오페론에서 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하는, 유전적으로 공학처리된 박테리아.
  28. 제 27항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 아르기니노석시네이트 신타제 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하는 유전적으로 공학처리된 박테리아.
  29. 제 27항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 오페론이 아르기니노석시네이트 신타제 유전자의 전사를 조절하는 항시적으로 활성인 프로모터를 포함하는 유전적으로 공학처리된 박테리아.
  30. 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 동일한 조건 하에 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소에 비해 아르기닌 피드백 억제를 감소시키도록 돌연변이된 박테리아.
  31. 제 27항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, ArgR 결합이 동일한 조건 하에 야생형 아르기닌 레굴론을 포함하는 동일한 박테리아의 서브타입으로부터의 박테리아에 비해 감소된 박테리아.
  32. 제 27항에 있어서, ArgR 결합을 통해 감소된 아르기닌-매개된 억제가 동일한 조건 하에 상응하는 야생형 박테리아에 비해 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자 각각의 전사를 증가시키는 박테리아.
  33. 제 28항에 있어서, ArgR 결합을 통해 감소된 아르기닌-매개된 억제가 동일한 조건 하에 상응하는 야생형 박테리아에 비해 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자 각각의 전사를 증가시키는 박테리아.
  34. 제 27항에 있어서, 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 오페론 각각이 오페론의 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 박테리아.
  35. 제 28항에 있어서, 아르기닌 생합성 효소 N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 오페론 각각이 오페론의 각 ARG 박스에 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함하는 박테리아.
  36. 제 27항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 하나 이상의 오페론을 추가로 포함하고, 야생형 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 인코딩하는 각각의 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 오페론에서 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하는 박테리아.
  37. 제 27항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터가 FNR 프로모터인 박테리아.
  38. 제 27항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 하나 이상의 오페론을 추가로 포함하고, 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 각각의 오페론이 ArgR 결합을 통해 오페론의 아르기닌-매개된 억제를 감소시키는 하나 이상의 핵산 돌연변이를 특징으로 하는 하나 이상의 돌연변이된 ARG 박스(들)를 포함하고, 오페론에서 유전자의 전사를 촉진하기에 충분한 친화성으로 RNA 중합효소 결합을 유지하며; 유전적으로 공학처리된 박테리아가 야생형 N-아세틸글루타메이트 합성효소 프로모터를 포함하지 않는 박테리아.
  39. 제 27항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타메이트 포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 카르바모일포스페이트 신타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타제, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자가 에스체리치아 콜라이 Nissle에 존재하는 오페론으로 그룹화되는 박테리아.
  40. 제 27항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 오페론이 프로모터 영역을 포함하고, 돌연변이체 아르기닌 레굴론의 각각의 프로모터 영역이 상응하는 야생형 프로모터 영역에서 발견되는 G/C:A/T 비와 10% 이하만큼 상이한 G/C:A/T 비를 갖는 박테리아.
  41. 제 27항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 돌연변이된 ARG 박스가 상응하는 야생형 ARG 박스에 비해 적어도 3개의 뉴클레오티드 돌연변이를 특징으로 하는 박테리아.
  42. 제 27항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 N-아세틸글루타메이트 합성효소 유전자가 하기로부터 선택되는 DNA 서열을 갖는 박테리아:
    a) SEQ ID NO: 28,
    b) 유전 부호의 중복이 아니라면, SEQ ID NO:28과 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열, 및
    c) a) 또는 b)의 DNA 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 DNA 서열.
  43. 제 27항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소, 및 아르기니노석시네이트 리아제를 인코딩하는 단일 오페론을 포함하고, 단일 오페론이 SEQ ID NO:5의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 37, 38, 45, 46, 47 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 55, 56, 57, 67, 68, 69 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
  44. 제 43항에 있어서, 단일 오페론이 SEQ ID NO:6의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  45. 제 27항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:11의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 20, 21, 29, 30, 31 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 41, 42, 50, 52 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
    제 45항에 있어서, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:12의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  46. 제 27항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸오르니티나제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:7의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 92, 93, 94, 104, 105, 106 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 114, 115, 116, 123, 124 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
  47. 제 46항에 있어서, N-아세틸오르니티나제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:8의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  48. 제 27항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:3의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 12, 13, 14, 18, 20 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 34, 35, 36, 45, 46 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
  49. 제 49항에 있어서, 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:4의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  50. 제 27항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론의 돌연변이된 프로모터 영역이 SEQ ID NO:9의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 33, 34, 35, 43, 44, 45 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 51, 52, 53, 60, 61, 62 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
  51. 제 51항에 있어서, 카르바모일포스페이트 신타제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:10의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  52. 제 27항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론의 돌연변이된 프로모터 영역이 SEQ ID NO:1의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 12, 13, 14, 21, 22, 23 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 33, 34, 35, 42, 43, 44 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
  53. 제 53항에 있어서, N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:2의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  54. 제 28항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 오페론의 돌연변이된 프로모터 영역이 SEQ ID NO:13의 돌연변이된 DNA 서열을 포함하고, 돌연변이가 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 9, 11, 19, 21 중 하나 이상; SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 129, 130, 131, 140, 141, 142 중 하나 이상; 및 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 150, 151, 152, 161, 162, 163 중 하나 이상에 존재하는 박테리아.
  55. 제 27항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:31의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  56. 제 28항에 있어서, 아르기니노석시네이트 신타제를 인코딩하는 오페론이 SEQ ID NO:32의 DNA 서열을 포함하는 박테리아.
  57. 제 27항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 박테로이데스, 비피도박테리움, 클로스트리듐, 에스체리치아, 락토바실루스, 및 락토코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아.
  58. 제 27항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 에스체리치아 콜라이 Nissle인 박테리아.
  59. 제 27항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 오페론 중 적어도 하나가 박테리아의 플라스미드 상에 존재하고; 플라스미드 상의 것들에 상응하는 아르기닌 레굴론 유전자의 모든 염색체 복사체가 활성 효소를 인코딩하는 것은 아닌 박테리아.
  60. 제 60항에 있어서, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 플라스미드 상에 존재하고, 플라스미드 상에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
  61. 제 27항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 인코딩하는 유전자가 박테리아의 염색체에 존재하고, 염색체에서 저산소 또는 혐기성 조건 하에 유도되는 프로모터에 작동적으로 연결되는 박테리아.
  62. 제 27항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되는 제1 유전자에서 박테리아가 영양요구균주인 박테리아.
  63. 제 63항에 있어서, 포유동물의 장이 인간 장인 박테리아.
  64. 제 27항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 박테리아가 포유동물의 장에 존재할 때 보충되지 않는 제2 유전자에서 박테리아가 영양요구성이고;
    b) 제2 유전자가 박테리아에 존재하는 유도성 제3 유전자에 의해 보충되고;
    c) 제3 유전자의 전사가 충분히 높은 농도의 아르기닌의 존재 하에 유도되어 재2 유전자의 영양요구성을 보충하는 박테리아.
  65. 제 65항에 있어서,
    a) 제3 유전자의 전사가 제2 억제인자에 의해 억제되고;
    b) 제2 억제인자의 전사가 아르기닌-아르기닌 억제인자 복합체에 의해 억제되는 박테리아.
  66. 제 66항에 있어서, 제3 유전자 및 제2 억제인자가 각각 플라스미드 상에 존재하는 박테리아.
  67. 제 27항 내지 제 67항 중 어느 한 항의 박테리아; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물.
  68. 제 68항의 약학적으로 허용되는 조성물을 생산하는 방법으로서,
    a) 제 27항 내지 제 67항 중 어느 한 항의 박테리아를 성장 배지 배양액에서 호기성 조건 하에 성장시키는 단계;
    b) 생성된 박테리아를 성장 배지로부터 분리시키는 단계; 및
    c) 분리된 박테리아를 약학적으로 허용되는 담체에 현탁시키는 단계를 포함하는, 방법.
  69. 제 68항의 조성물을 고암모니아혈증-관련 질병의 중증도를 완화시키기에 충분한 기간 동안 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)의 치료가 필요한 대상체에서 고암모니아혈증-관련 질병 또는 이의 증상(들)을 치료하는 방법.
  70. 제 70항에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 우레아 회로 질환인 방법.
  71. 제 71항에 있어서, 우레아 회로 질환이 아르기닌석신산뇨증, 아르기나제 결핍, 카르바밀포스페이트 합성효소 결핍, 시트룰린혈증, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 또는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍인 방법.
  72. 제 70항에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병이 간 질환; 유기산 질환; 이소발레르산뇨증; 3-메틸크로토닐글리신뇨증; 메틸말론산혈증; 프로피온산뇨증; 지방산 산화 결함; 카르니틴 회로 결함; 카르니틴 결핍; β-산화 결핍; 리신뇨 단백질 불내성; 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 탄산 탈수효소 결핍; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 미토콘드리아 질환; 발프로에이트 요법; 아스파라기나제 요법; 완전 비경구 영양; 글리신-함유 용액에 의한 방광경검사; 폐/골수 이식 후; 문맥전신 션트; 요로 감염; 요관 확장; 다발성 골수종; 화학요법; 감염; 신경인성 방광; 또는 장내 박테리아 과증식인 방법.
  73. 제 73항에 있어서, 간 질환이 간 뇌병증, 급성 간부전, 또는 만성 간부전인 방법.
  74. 제 70항에 있어서, 고암모니아혈증-관련 질병의 증상이 발작, 실조, 뇌졸중-유사 병변, 혼수, 정신병, 시력 상실, 급성 뇌병증, 뇌 부종, 뿐만 아니라 구토, 호흡성 알칼리혈증, 및 저체온증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  75. 제 27항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 검출가능한 생성물을 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하고, 검출가능한 생성물을 코딩하는 DNA 서열의 전사가 아르기닌의 존재 하에 유도되는 박테리아.
    제 76항에 있어서,
    a) 검출가능한 생성물을 코딩하는 DNA 서열의 전사가 제3 억제인자에 의해 억제되고;
    b) 제3 억제인자의 전사가 아르기닌-아르기닌 억제인자 복합체에 의해 억제되는 박테리아.
  76. a) 제 77항의 박테리아를 제공하고;
    b) 박테리아를 제1 기간 동안 배양시키고;
    c) 배양액이 돌연변이유발되게 하고;
    d) 돌연변이유발된 배양액을 제2 기간 동안 배양시키고;
    e) 검출가능한 생성물을 발현시키는 박테리아를 선택하여, 높은 수준의 아르기닌을 생산하는 박테리아를 선택하는 것을 포함하는, 높은 수준의 아르기닌을 생산하는 박테리아를 선택하는 방법.
  77. 제 78항에 있어서, 검출가능한 생성물이 형광 단백질이고, 선택이 형광-활성화 세포 분류기의 사용을 포함하는 방법.
KR1020177018338A 2014-12-05 2015-12-04 고암모니아혈증과 관련된 질병을 치료하기 위해 공학처리된 박테리아 KR102493174B1 (ko)

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