KR20170095216A

KR20170095216A - 알칼로이드 함유 조성물의 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170095216A
Application number: KR1020177015531A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 이안 셀우드; 제이슨 레슬리 존 라이언; 로엘오프 반 긴켈
Original assignee: 신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2017-08-22
Also published as: AU2015359424A1; AU2015359424B2; BR112017012240A2; US10820593B2; JP2017538703A; TW201639458A; UY36426A; WO2016091987A1; AR102962A1; CN106998690A; US20170332641A1; CL2017001454A1; EP3229594A1; MX2017007221A

Abstract

본 발명은 롤린 알칼로이드의 제조 방법, 롤린 알칼로이드 함유 살해충 조성물을 포함하는 조성물, 및 생물학적 제어제로서의 용도를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 식물 또는 동물 해충을 포함하는 해충의 제어 방법, 및 식물 성장 또는 번식의 증강 방법, 및 예를 들어 식물 및 동물에서 곤충 감염 및 만연의 치료 및 방지 방법이 또한 제공된다.

Description

알칼로이드 함유 조성물의 제조 방법 및 이의 용도{METHODS OF PREPARING ALKALOID CONTAINING COMPOSITIONS AND USES THEREOF}

본 발명은 일반적으로 생물학 분야, 보다 구체적으로 롤린 알칼로이드의 제조 방법, 롤린 알칼로이드 함유 살해충 조성물을 포함하는 조성물, 및 생물학적 제어제로서의 용도를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 식물 또는 동물 해충을 포함하는 해충의 제어 방법, 및 식물 성장 또는 번식의 증강, 및 예를 들어 식물 및 동물에서의 곤충 감염 및 만연의 치료 및 방지 방법이 또한 제공된다.

롤린 알칼로이드는 내생 식물, 구체적으로 에피클로에(Epichlo ё) 내생 식물(명명법 재정립 이후 현재는 이전의 별도 변성체인 네오타이포디움(Neotyphodium) spp. 포함)에 의한 풀의 감염 동안 공생적으로 제조된다. 이들 내생 식물은 생물보호성이어서 이들이 일부를 형성하는 공생체에 대해 해충, 그리고 가능하게는 가뭄 및 질환 보호를 제공하는 것으로 여겨진다.

그러나, 전원 농업에서 일반적으로 이용되는 풀의 내생 식물 감염은 또한 김의털 중독, 잔디 회선병, 및 맥각중독을 포함하는 동물에서의 독성과 연관된다. 이들 중독은 다양한 식물 성장 조건 하에 내생 식물/풀 공생체에서 제조되는 다양한 알칼로이드에 대한 동물의 복잡한 반응으로부터 야기되는 것으로 믿어진다. 이들 동물 중독은 직접적으로는 가축의 손실, 그리고 간접적으로는 구제와 연관되는 비용을 통해 모두 상당한 경제적 손실에 관여된다.

예를 들어 현재 이용 가능하지 않은 곤충 해충의 제어를 위한 조성물을 제공하기 위해, 제분 초본, 또는 종자와 같은 식물/내생 식물 공생체로부터의 식물 재료로부터 롤린 알칼로이드를 제조하기 위한 강력하고/하거나 확장 가능한 방법이 요구된다.

전형적으로 실험실 규모로 수행되는 기존 방법은 모두 제분, 연마 또는 가공 식물 또는 종자 재료를 롤린의 제조를 위한 원료로서 이용하지만, 보고된 회수는 비경제적이다.

본 출원인의 지식 범위에서는, 예를 들어 전체 종자로부터의 규모로 롤린의 성공적인 제조 또는 추출에 대한 보고는 없다.

본 발명의 목적은 상기 언급된 일부 단점을 극복하거나 적어도 완화하는, 또는 적어도 공중에게 유용한 선택을 제공하는, 식물 재료로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 제조하는 방법, 및/또는 내생 식물/식물 공생에서 롤린 알칼로이드의 존재와 연관된 하나 이상의 생물보호 효과를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단지 예로서 제공되는 하기 설명으로부터 자명해질 수 있다.

본 명세서에서, 특허 명세서 및 다른 문헌을 포함하는 외부 정보 출처에 대해 참조된 경우, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 맥락의 제공 목적을 위한 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 이러한 정보 출처에 대한 참조는 모든 관할에서, 이러한 정보 출처가 선행 기술이거나 당분야의 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.

제1 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

a) 적어도 하나의 내생 식물로 감염되거나 되었던 식물로부터 유도되는 식물 재료를 제공하는 단계,

b) 식물 재료 및 수용액을 혼합하는 단계,

c) 적어도 약 50℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드 화합물을 포함하는 추출물을 제공하는 단계,

d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하여 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 적어도 일부 식물 재료가 제분된다. 예를 들어, 모든 식물 재료가 제분된다.

하나의 구현예에서, 제분 식물 재료는 종자를 포함하지 않는다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

a) 하나 이상의 내생 식물로 감염되거나 되었던 식물로부터 유도되는 전체 종자를 제공하는 단계,

b) 종자 및 수용액을 혼합하는 단계,

c) 적어도 약 50℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 추출물을 제공하는 단계,

d) 추출물/상청액을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

b) 종자 및 적어도 약 65℃의 온도를 갖는 수용액을 혼합하는 단계,

c) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 추출물을 제공하기에 충분한 기간 동안 약 65℃ 내지 약 100℃의 온도에서 혼합물을 유지하는 단계,

d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

b) 종자 및 적어도 약 85℃의 온도를 갖는 수용액을 혼합하는 단계,

c) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 추출물을 제공하기에 충분한 기간 동안 약 85℃ 내지 약 100℃의 온도에서 혼합물을 유지하는 단계,

하나의 예에서, 혼합물은 적어도 약 15분의 기간 동안 유지된다. 예를 들어, 혼합물은 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 또는 적어도 약 1시간의 기간 동안 유지된다.

하나의 예에서, 추출물을 제공하기에 충분한 기간은 약 1시간 내지 약 6시간이다.

제2 양태에서, 본 발명은 종자로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 추출 방법으로서,

b) 종자 및 수용액을 혼합하는 단계,

d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

제3 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

b) 식물 재료 및 물을 혼합하는 단계,

c) 적어도 약 65℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드 화합물을 포함하는 추출물을 제공하는 단계,

d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하여 조성물을 형성하는 단계를 포함하며,

식물 재료는 종자를 포함하지 않는 방법을 제공한다.

제4 양태에서, 본 발명은 식물 재료로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 추출 방법으로서,

b) 식물 재료 및 물을 혼합하는 단계,

d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하는 단계를 포함하며,

식물 재료는 종자를 포함하지 않는 방법을 제공한다.

제5 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

a) 적어도 하나의 내생 식물로 감염되거나 되었던 식물로부터 유도되는 제분 식물 재료를 제공하는 단계,

b) 식물 재료 및 수용액을 혼합하는 단계,

c) 적어도 약 15분의 기간 동안 적어도 약 50℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드 화합물을 포함하는 추출물을 제공하는 단계,

d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조되는 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 조성물 또는 추출물을 제공한다.

제7 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

본 발명의 방법에 의해 제조되는 추출물을 제공하는 단계,

a) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 담체와 조합하는 단계, 또는

b) 상청액 또는 추출물 또는 이로부터의 분획을 담체와 조합하는 단계, 또는

c) 상청액으로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 분리하고, 선택적으로 상기 분리된 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 담체와 조합하는 단계, 또는

d) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 적어도 부분적으로 정제하거나 단리하고, 선택적으로 상기 정제되거나 단리된 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 담체와 조합하는 단계, 또는

e) (a) 내지 (e)의 2 이상의 임의 조합 단계를 포함함으로써,

조성물을 제공하는 방법을 제공한다.

제8 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 수용액을 포함하는 원료 물질로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 농축 방법으로서,

a) 유기 분자에 결합할 수 있는 크로마토그래피 정지상을 제공하는 단계,

b) 정지상이 하나 이상의 롤린 알칼로이드에 결합할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 원료 물질을 정지상과 접촉시키는 단계,

c) 크로마토그래피에 의해 정지상에 결합된 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 용출함으로써 용출액을 제공하는 단계, 및

d) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 농축 방법은 용매 부피에 대한 농축이며, 하나 이상의 다른 화합물에 대한 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 상대 농도 증가가 관여될 수도 있고 관여되지 않을 수도 있다.

하기 구현예는 본원의 임의의 양태에 관한 것일 수 있다.

다양한 구현예에서, 롤린 알칼로이드는 하기 화학식 I의 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함한다:

[화학식 I]

식에서,

R = H 또는 CH₃이고

R' = H, CH₃, CHO, COCH₃이다.

보다 구체적으로, 화학식 I에는

R = CH₃이고 R' = H인 롤린;

R = H이고 R' = H인 노르롤린;

R = CH₃이고 R' = CH₃인 N-메틸롤린;

R = CH₃이고 R' = CHO인 N-포르밀롤린;

R = H이고 R' = CHO인 N-포르밀노르롤린;

R = CH₃이고 R' = COCH₃인 N-아세틸롤린;

R = H이고 R' = COCH₃인 N-아세틸노르롤린이 포함된다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 롤린 알칼로이드는 롤린, N-아세틸롤린(NAL), N-포르밀롤린(NFL), N-아세틸노르롤린(NANL), 및 N-메틸롤린(NML)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, 내생 식물은 적어도 하나의 롤린 알칼로이드 화합물의 제조를 특징으로 한다. 보다 바람직하게는, 내생 식물에는 에피클로에(Epichlo ё)(네오타이포디움(Neotyphodium)으로도 알려져 있음) 속의 것들이 포함된다.

하나 이상의 네오타이포디움(Neotyphodium) 또는 에피클로에(Epichlo ё) 내생 식물은 식물/내생 식물 공생체로서 존재하는 경우 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 제조할 수 있는 하나 이상의 단리체임이 이해될 것이다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 네오타이포디움(Neotyphodium) 또는 에피클로에(Epichloё) 내생 식물은 네오타이포디움 운시나툼(Neotyphodium uncinatum) 단리체이다. 하나의 구현예에서, 네오타이포디움 운시나툼(Neotyphodium uncinatum) 단리체는 본원에 기재되는 단리체로부터 선택된다.

전체 종자는 실질적으로 온전한 종자이며, 제분되거나, 연마되거나, 예를 들어 표면적을 증가시키기 위해 또는 예를 들어 종자 큐티클을 제거하거나 뚫거나 완결성을 손상시켜서 다르게 물리적으로 변형되지 않은 종자임이 이해될 것이다. 하나의 구현예에서, 전체 종자는 발아가 가능한 종자이다.

하나의 구현예에서, 종자 또는 식물 재료는 페스투카(Festuca) 속으로부터 유도된다. 바람직하게는, 식물 또는 이의 일부는 볏과 목초(meadow fescue) 또는 긴 김의털(tall fescue) 종의 풀이다.

다양한 구현예에서, 식물 재료는 전체 식물, 뿌리, 잎, 꽃, 줄기, 가(pseudo)-줄기 등을 포함한다. 하나의 구현예에서, 식물 재료는 식물의 초본을 포함한다.

하나의 구현예에서, 식물 재료는 건조된다, 예를 들어, 동결-건조된다. 하나의 구현예에서, 식물 재료는 제분된다.

하나의 구현예에서, 수용액은 물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 수용액은 산 또는 염기, 예를 들어, 암모늄 하이드록사이드 또는 아세트산을 포함한다. 다른 구현예에서, 수용액은 유기 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 프로판올 또는 2-프로판올을 포함한다. 하나의 구현예에서, 수용액은 아세트산을 포함한다. 추가 구현예에서, 수용액은 암모니아를 포함한다.

하나의 구현예에서, 수용액 또는 물은 종자 또는 식물 재료와의 혼합 전에 추출 온도까지 가열된다. 다른 구현예에서, 수용액 또는 물은 종자 또는 식물 재료 및 물 또는 수용액의 혼합 후에 추출 온도까지 가열된다.

다양한 구현예에서, 종자 또는 식물 재료는 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99, 100, 105, 110, 115 또는 약 120℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 99, 약 50 내지 약 95, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 85, 약 50 내지 약 80, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 99, 약 60 내지 약 95, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 85, 약 60 내지 약 80, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 99, 약 70 내지 약 98, 약 70 내지 약 95, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 85, 약 70 내지 약 80, 약 75 내지 약 120, 약 75 내지 약 110, 약 75 내지 약 100, 약 75 내지 약 99, 약 75 내지 약 98, 약 75 내지 약 95, 약 75 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 75 내지 약 80, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 99, 약 80 내지 약 98, 약 80 내지 약 95, 약 80 내지 약 90, 약 85 내지 약 120, 약 85 내지 약 110, 약 85 내지 약 100, 약 85 내지 약 99, 약 85 내지 약 98, 약 85 내지 약 95, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 99, 약 90 내지 약 98, 약 95 내지 98, 또는 약 90 내지 약 95℃).

특히 고려되는 구현예에서, 제분 종자를 포함하지 않는 제분 식물 재료는 적어도 약 50℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합된다.

다른 특히 고려되는 구현예에서, 전체 종자는 적어도 약 50℃, 예를 들어, 약 50℃ 내지 약 75℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합된다.

제분 식물 재료가 제분 종자이거나 이를 포함하는 다른 특히 고려되는 구현예에서, 식물 재료 또는 제분 종자는 적어도 약 90℃, 예를 들어, 약 90℃ 내지 약 98℃, 또는 약 95℃ 내지 약 98℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합된다.

예를 들어, 제분 식물 재료가 제분 종자이거나 이를 포함하는 하나의 구현예에서,

a) 제분 식물 재료는 적어도 약 90℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나,

b) 혼합물은 적어도 약 15분의 기간 동안 적어도 약 90℃의 온도에서 유지되거나,

c) 상기 a) 및 b) 둘 다이다.

제분 식물 재료가 제분 종자이거나 이를 포함하는 다른 구현예에서,

a) 제분 식물 재료는 적어도 약 95℃ 내지 약 98℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나,

b) 혼합물은 적어도 약 15분의 기간 동안 약 95℃ 내지 약 98℃의 온도에서 유지되거나,

c) 상기 a) 및 b) 둘 다이다.

다양한 구현예에서, 수용액의 pH는 약 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 약 pH 10의 pH로 조정되거나 여기에서 유지되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 6 내지 약 10, 약 6 내지 약 9.5, 약 6 내지 약 9, 약 7 내지 약 10, 약 7 내지 약 9.5, 약 7 내지 약 9, 약 8 내지 약 10, 약 8 내지 약 9.5, 또는 약 8 내지 약 9). 다양한 구현예에서, 물의 pH는 약 7의 pH에서 유지된다.

하나의 예에서, 수용액은 7 초과의 pH를 갖는다. 하나의 예에서, 수용액은 적어도 7 내지 약 9의 pH를 갖는다. 다른 예에서, 수용액은 적어도 약 7.5 내지 약 9의 pH를 갖는다.

하나의 예에서, 수용액은 7 미만의 pH를 갖는다. 하나의 예에서, 수용액은 약 4.5 내지 약 7의 pH를 갖는다. 다른 예에서, 수용액은 약 4.5 내지 약 6.5의 pH를 갖는다.

하나의 구현예에서, 수용액 또는 물은 약 50 L 초과의 부피를 갖는다. 하나의 구현예에서, 수용액 부피는 약 100 L 초과, 약 150 L 초과, 약 200 L 초과, 약 300 L 초과, 약 400 L 초과, 약 500 L 초과, 또는 약 1000 L 초과이다.

하나의 구현예에서, 수용액 또는 물은 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 1 L의 부피를 갖는다. 하나의 구현예에서, 수용액 부피는 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 2 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 3 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 4 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 5 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 7.5 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 10 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 12.5 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 15 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 17.5 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 20 L 초과, 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 25 L 초과, 또는 식물 재료 또는 종자 1 kg 당 약 30 L 초과이다.

다양한 구현예에서, 혼합물은 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100℃의 온도에서 유지되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 50 내지 약 99, 약 50 내지 약 95, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 85, 약 50 내지 약 80, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 99, 약 60 내지 약 95, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 85, 약 60 내지 약 80, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 99, 약 70 내지 약 98, 약 70 내지 약 95, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 85, 약 70 내지 약 80, 약 75 내지 약 100, 약 75 내지 약 99, 약 75 내지 약 98, 약 75 내지 약 95, 약 75 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 75 내지 약 80, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 99, 약 80 내지 약 98, 약 80 내지 약 95, 약 80 내지 약 90, 약 85 내지 약 100, 약 85 내지 약 99, 약 85 내지 약 98, 약 85 내지 약 95, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 99, 약 90 내지 약 98, 또는 약 90 내지 약 95℃).

특히 고려되는 구현예에서, 종자를 포함하지 않는 제분 식물 재료를 포함하거나 이로 구성되는 혼합물은 적어도 약 50℃의 온도에서 유지된다.

다른 특히 고려되는 구현예에서, 전체 종자를 포함하거나 이로 구성되는 혼합물은 적어도 약 50℃, 예를 들어, 약 50℃ 내지 약 75℃의 온도에서 유지된다.

제분 식물 재료가 제분 종자이거나 이를 포함하는 다른 특히 고려되는 구현예에서, 혼합물은 적어도 약 90℃, 예를 들어, 약 90℃ 내지 약 98℃, 또는 약 95℃ 내지 약 98℃의 온도에서 유지된다.

하나의 구현예에서, 혼합물은 약 1 대기압에서 유지된다. 다른 구현예에서, 혼합물은 1 대기압 초과에서 유지된다. 다양한 구현예에서, 혼합물은 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 또는 약 2 bar의 압력에서 유지되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 1.1 bar 내지 약 1.5 bar, 또는 약 1.2 bar 내지 약 1.5 bar, 또는 약 1.2 bar 내지 약 1.4 bar). 다른 구현예에서, 혼합물은 약 2 bar, 또는 2 bar 초과의 압력에서 유지된다).

하나의 구현예에서, 예를 들어 전체 종자를 이용하는 구현예에서, 혼합물은 하나 이상의 롤린 알칼로이드가 또는 적어도 약 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 또는 2 mg/mL의 농도로 존재할 때까지 유지된다. 다른 구현예에서, 예를 들어 식물 초본을 이용하는 구현예에서, 혼합물은 전체 롤린 알칼로이드 농도가 적어도 약 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 또는 2 mg/mL일 때까지 유지된다.

하나의 구현예에서, 혼합물은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 추출하기에 충분한 기간 동안 유지된다. 다양한 구현예에서, 혼합물은 적어도 약 2, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 또는 60분 또는 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 약 24시간의 기간 동안 유지되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 5 내지 60, 5 내지 45, 5 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 15, 10 내지 60, 10 내지 45, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 60, 15 내지 45, 15 내지 30, 20 내지 60, 30 내지 45, 또는 약 20 내지 30분, 또는 약 0.5 내지 12, 0.5 내지 6, 0.5 내지 3, 1 내지 12, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 내지 12, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 3, 2.5 내지 12, 2.5 내지 6, 2.5 내지 5, 2.5 내지 4, 또는 약 2.5 내지 3시간).

하나의 구현예에서, 혼합물은 NAL의 농도가 적어도 약 10 ㎍/mL일 때까지 유지된다. 예를 들어, 혼합물은 NAL의 농도가 적어도 약 20 ㎍/mL, 적어도 약 25 ㎍/mL, 적어도 약 30 ㎍/mL, 적어도 약 35 ㎍/mL, 적어도 약 40 ㎍/mL, 적어도 약 45 ㎍/mL, 적어도 약 50 ㎍/mL, 적어도 약 60 ㎍/mL, 적어도 약 70 ㎍/mL, 적어도 약 75 ㎍/mL, 적어도 약 100 ㎍/mL, 적어도 약 200 ㎍/mL, 적어도 약 300 ㎍/mL, 또는 적어도 약 400 ㎍/mL일 때까지 유지된다.

하나의 구현예에서, 혼합물은 NANL의 농도가 적어도 약 5 ㎍/mL일 때까지 유지된다. 예를 들어, 혼합물은 NANL의 농도가 적어도 약 10 ㎍/mL, 적어도 약 15 ㎍/mL, 적어도 약 20 ㎍/mL, 적어도 약 25 ㎍/mL, 적어도 약 30 ㎍/mL, 적어도 약 40 ㎍/mL, 적어도 약 50 ㎍/mL, 적어도 약 60 ㎍/mL, 적어도 약 70 ㎍/mL, 적어도 약 80 ㎍/mL, 적어도 약 90 ㎍/mL, 적어도 약 100 ㎍/mL, 적어도 약 110 ㎍/mL, 적어도 약 120 ㎍/mL, 적어도 약 130 ㎍/mL, 또는 적어도 약 140 ㎍/mL 또는 적어도 약 150 ㎍/mL일 때까지 유지된다.

하나의 구현예에서, 혼합물은 NFL의 농도가 적어도 약 100 ㎍/mL일 때까지 유지된다. 예를 들어, 혼합물은 NFL의 농도가 적어도 약 125 ㎍/mL, 적어도 약 150 ㎍/mL, 적어도 약 175 ㎍/mL, 적어도 약 200 ㎍/mL, 적어도 약 225 ㎍/mL, 적어도 약 250 ㎍/mL, 적어도 약 300 ㎍/mL, 적어도 약 350 ㎍/mL, 적어도 약 400 ㎍/mL, 적어도 약 450 ㎍/mL, 적어도 약 500 ㎍/mL, 적어도 약 550 ㎍/mL, 적어도 약 600 ㎍/mL, 적어도 약 650 ㎍/mL, 적어도 약 700 ㎍/mL, 또는 적어도 약 750 ㎍/mL일 때까지 유지된다.

하나의 구현예에서, 우세한 롤린 알칼로이드는 NFL이다.

다양한 구현예에서, 예를 들어 전체 종자를 이용하는 구현예에서, 조성물 또는 추출물 중 [NAL]:[NFL]의 비는 약 1:10, 약 1:8, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3 또는 약 1:2 초과이다. 하나의 예시적 구현예에서, [NAL]:[NFL]의 비는 약 1:3이다.

다양한 구현예에서, 예를 들어, 초본을 이용하는 구현예에서, 조성물 또는 추출물 중 [NAL]:[NFL]의 비는 약 1:8, 약 1:6, 약 1:4, 약 3:11, 약 1:3, 또는 약 1:2 초과이다. 하나의 예시적 구현예에서, [NAL]:[NFL]의 비는 약 3:11이다.

다양한 구현예에서, 예를 들어 전체 종자를 이용하는 구현예에서, 조성물 또는 추출물 중 [NANL]:[NFL]의 비는 약 1:12, 약 1:10, 약 1:8.5, 약 1:8, 약 1:7.5, 약 1:7, 약 1:6 또는 약 1:5 초과이다. 하나의 예시적 구현예에서, [NAL]:[NFL]의 비는 약 1:7.5이다.

다양한 구현예에서, 예를 들어 초본을 이용하는 구현예에서, 조성물 또는 추출물 중 [NANL]:[NFL]의 비는 약 3:4, 약 2:3, 약 1:2, 약 6:11, 또는 약 1:1 초과이다. 하나의 예시적 구현예에서, [NAL]:[NFL]의 비는 약 6:11이다.

다양한 구현예에서, 예를 들어, 전체 종자를 이용하는 구현예에서, 조성물 또는 추출물 중 [NANL]:[NFL]의 비는 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 2:3, 약 4:5 또는 약 5:6 초과이다. 하나의 예시적 구현예에서, [NAL]:[NFL]의 비는 약 2:3이다.

다양한 구현예에서, 예를 들어 초본을 이용하는 구현예에서, 조성물 또는 추출물 중 [NANL]:[NAL]의 비는 약 6:5, 약 5:4, 약 3:2, 약 2:1, 약 3:1 또는 약 4:1 초과이다. 하나의 예시적 구현예에서, [NAL]:[NFL]의 비는 약 2:1이다.

하나의 구현예에서, 추출물은 하나 이상의 적어도 부분적인 정제 단계를 거친다.

다양한 구현예에서, 추출물의 pH는 약 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 약 pH 10의 pH로 조정되거나 여기에서 유지되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 6 내지 약 10, 약 6 내지 약 9.5, 약 6 내지 약 9, 약 7 내지 약 10, 약 7 내지 약 9.5, 약 7 내지 약 9, 약 8 내지 약 10, 약 8 내지 약 9.5, 또는 약 8 내지 약 9).

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 추출물에 존재하는 고체를 침전시키기 위해 추출물을 냉각하는 단계 및 추출물로부터 침전된 고체를 분리하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 추출물은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18 또는 약 20℃의 온도까지 냉각되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 2 내지 20, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 3 내지 20, 3 내지 15, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 4 내지 20, 4 내지 15, 4 내지 10, 4 2 9, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 5 내지 9, 또는 약 5 내지 8℃). 특히 바람직한 구현예에서, 상청액은 약 2 내지 약 8℃의 온도까지 냉각된다.

다양한 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 여과, 예를 들어, 나노여과, 초여과, 또는 마이크로여과에 의한 분리 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 여액을 제조하기 위해 하나 이상의 침강 필터를 이용하여 추출물을 여과하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 추출물은 여과 전에 약 pH 9까지 조정된다. 다양한 구현예에서, 침강 필터는 약 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 20, 25 또는 30 ㎛의 포어 크기를 갖는다. 다양한 구현예에서, 상이한 포어 크기의 2개 이상의 침강 필터가 일렬로 이용된다. 다양한 구현예에서, 필터는 유입 상에서의 더 큰 포어 크기 등급에서부터 유출 상에서의 더 작은 포어 크기 등급으로 감소하는 등급화된 밀도를 갖는다. 예를 들어, 필터는 75 ㎛ ~ 25 ㎛의 등급화된 밀도의 포어 크기이거나, 50 ㎛ ~ 5 ㎛의 등급화된 밀도의 포어 크기, 또는 25 ㎛ ~ 1 ㎛의 등급화된 밀도의 포어 크기이다.

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 여액을 제조하기 위해 2개 이상의 필터를 이용하는 순차적 여과 단계를 포함한다. 하나의 예에서, 적어도 부분적인 정제는 2개 이상의 필터를 통한 순차적 여과를 포함하며, 여기서 각각의 필터는 이전 필터보다 작은 포어 크기를 갖는다. 하나의 예에서, 적어도 부분적인 정제는 2개 이상의 등급화된-밀도의 필터를 이용하는 순차적 여과 단계를 포함한다.

다양한 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 건조 또는 증발, 예컨대 분무 건조, 또는 침전 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 초임계 추출에 의한 분리 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 액체-액체 분할(액체-액체 추출 또는 용매 추출)에 의한 분리 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 크로마토그래피에 의한 분리 단계를 포함한다.

예를 들어, 하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 정지상이 하나 이상의 롤린 알칼로이드에 결합할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 추출물 또는 여액을 하나 이상의 크로마토그래피 정지상과 접촉시키는 단계, 정지상에 결합된 하나 이상의 롤린 알칼로이드로부터 하나 이상의 오염물질을 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계, 또는 정지상에 결합된 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 크로마토그래피에 의해 농축하는 단계, 및 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 회수하는 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 정지상은 역상 크로마토그래피 정지상, 예를 들어, 소수성 매트릭스를 포함하는 역상 크로마토그래피 정지상이다. 하나의 구현예에서, 정지상은 비-선택적 흡착제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 정지상은 적어도 중등도로 극성 화합물에 결합하기에 적합한 중합체성 흡착제이다. 하나의 구현예에서, 정지상은 칼럼에 보유된다.

하나의 구현예에서, 정지상은 스티렌-디비닐벤젠 중합체 수지, 예를 들어, Strata-X™ SPE 수지, Sepabeads^® SP-207 수지, Sepabeads^® SP-70 수지 또는 Diaion^® HP-20 수지를 포함한다.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 롤린 알칼로이드는 극성 유기 용매, 또는 혼합 수성 유기 용매, 예를 들어 에탄올을 이용하여 회수되어 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액을 제공한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 2개 이상의 분획이 회수되고 조합되어 용출액을 형성한다.

하나의 예시적인 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 정지상이 하나 이상의 롤린 알칼로이드에 결합할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 극성 용매 중 추출물 또는 여액을 스티렌-디비닐벤젠 중합체 수지와 접촉시키는 단계, 약 5% 내지 약 99% 에탄올, 바람직하게는 약 96% 에탄올을 포함하는 용액을 이용하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 용출하여 용출액을 제조하는 단계, 및 용출액을 수집하는 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 추출물 또는 여액의 pH는 추출물이 정지상과 접촉되기 전에 적어도 약 pH 9의 pH까지 조정된다. 예를 들어, 추출물의 pH는 추출물이 여과되기 전에 적어도 약 pH 9의 pH까지 조정된다.

하나의 구현예에서, 추출물 또는 여액의 pH는 추출물 또는 여액이 정지상과 접촉되기 전에 약 pH 10 내지 약 pH 12의 pH까지 조정된다.

하나의 구현예에서, 용매는 용매의 증발에 의해, 예를 들어, 회전 증발, 또는 와이핑 또는 낙하 필름 증발에 의해 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액으로부터 제거될 수 있다.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 롤린 알칼로이드 및 수용액을 포함하는 용출액은 용출액 및 용매, 예를 들어, 아세토니트릴, 에탄올 또는 메탄올을 혼합하여 용출액 중 하나 이상의 불순물 또는 오염물질을 침전시킴으로써 추가 정제된다. 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용매상은 경사분리에 의해 침전으로부터 분리될 수 있다.

하나의 구현예에서, 적어도 부분적인 정제는 추출물, 여액 또는 용출액을 탄소원, 예를 들어, 활성탄과 접촉시키는 단계, 및 정제된 분획을 회수하는 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 용매는 용매의 증발에 의해, 예를 들어 회전 증발, 및 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 건조 산물의 회수에 의해, 추출물, 여액, 용출액 또는 정제 분획으로부터 제거된다.

하나의 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법 또는 종자로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 추출 방법으로서,

a) 적어도 하나의 내생 식물로 감염된 식물로부터 유도되는 전체 종자를 제공하는 단계,

c) 약 1 내지 약 6시간의 기간 동안 약 85℃ 내지 약 100℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 추출물을 제공하는 단계,

d) 추출물을 회수하는 단계,

e) 추출물을 크로마토그래피 정지상과 접촉시켜 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 정지상에 결합시키는 단계,

f) 용매를 이용해서 정지상으로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 용출하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액을 회수하는 단계,

g) 용출액을 용매와 혼합하여 하나 이상의 불순물을 침전시키고 용출액으로부터 침전 고체를 분리하여 용매-정제 추출물을 제조하는 단계,

h) 용매-정제 추출물을 여과하고 정제 추출물을 회수하는 단계, 및

i) 정제 추출물로부터 용매를 증발시키고 건조된 정제 추출물을 회수하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법 또는 종자로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 추출 방법으로서,

d) 추출물을 회수하는 단계,

e) 추출물을 냉각하여 상청액에 존재하는 고체를 침전시키고 추출물로부터 침전 고체를 분리하여 냉각 추출물을 제조하는 단계,

f) 하나 이상의 침강 필터를 이용해서 냉각 추출물을 여과하여 여과 추출물을 제조하는 단계,

g) 여과 추출물을 크로마토그래피 정지상과 접촉시켜 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 정지상에 결합시키는 단계,

h) 용매를 이용해서 정지상으로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 용출하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액을 회수하는 단계,

i) 용출액으로부터 용매를 증발시켜 농축 용출액을 제조하는 단계,

j) 용출액을 수용액 및 용매, 바람직하게는 아세토니트릴과 혼합하여 하나 이상의 불순물을 침전시키고 용출액으로부터 침전 고체를 분리하여 용매-정제 추출물을 제조하는 단계,

k) 용매-정제 추출물을 활성탄과 접촉시키고 정제 추출물을 회수하는 단계, 및

l) 정제 추출물로부터 용매를 증발시키고 건조 정제 추출물을 회수하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 예시적 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

b) 식물 재료 및 물을 혼합하는 단계,

c) 약 15 내지 약 60분의 기간 동안 적어도 약 65℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드 화합물을 포함하는 추출물을 제공하는 단계,

식물 재료는 종자를 포함하지 않는 방법을 제공한다.

b) 제분 식물 재료 및 수용액을 혼합하는 단계,

b) 제분 식물 재료 및 적어도 7의 pH를 갖는 수용액을 혼합하는 단계,

d) 추출물을 여과하여 여액을 제공하는 단계,

e) 여액의 pH를 7 초과, 예를 들어, 약 8, 약 9, 약 10, 또는 약 11의 pH까지 조정하는 단계,

f) pH-조정된 여액을 적어도 7의 pH에서 하나 이상의 롤린 알칼로이드와 결합할 수 있는 크로마토그래피 정지상과 접촉시키는 단계,

g) 크로마토그래피 정지상을 유기 용매와 접촉시켜 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 용출하는 단계, 및

h) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액을 회수하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 방법은 식물 재료를, 예를 들어 20 mm 천공 메쉬를 통해 통과할 수 있는 크기까지 제분하는 예비 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 조성물 또는 추출물은 하나 이상의 곤충의 제어에서 이용하기에 적합하다. 예를 들어, 조성물 또는 추출물은 살충 조성물 또는 추출물이다.

하나의 구현예에서, 추출물 중 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 순도는 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99%이다.

하나의 구현예에서, 추출물 중 종자 또는 식물 재료로부터의 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 수율은 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%이다.

본 발명은 추가로 해충, 특히 식물 및 인간 또는 비-인간 동물 해충, 예컨대 곤충, 선충, 및 유제류의 제어에서의 조성물의 이용 방법에 관한 것이다.

예를 들어, 해충 집단의 제어 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 방법에는 일반적으로 집단을 본원에 기재되는 조성물의 살해충-유효량과 접촉시키는 단계가 관여된다. 이러한 방법은 주어진 영역에서 표적 해충을 사멸시키거나 수를 감소시키기 위해 이용될 수도 있고, 또는 환경 영역과 같은 장소에 예방적으로 적용되어 취약 해충에 의한 만연을 방지할 수도 있다.

본 발명은 추가로 하나 이상의 곤충 또는 선충 해충, 예컨대 하나 이상의 병원성 곤충 해충, 예를 들어, 하나 이상의 식물병원성 곤충 또는 선충 또는 하나 이상의 동물 종의 하나 이상의 곤충 또는 선충 해충을 포함하는 하나 이상의 해충을 제어하기 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 병원성 곤충, 예를 들어, 하나 이상의 동물 종의 하나 이상의 곤충 해충을 포함하는 하나 이상의 곤충의 제어 방법으로서, 하나 이상의 곤충을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

하나 이상의 해충의 제어를 위한 조성물의 제조에서 본 발명의 방법에 의해 제조되는 혼합물, 추출물, 분획, 용출액의 용도가 유사하게 고려된다.

대상체에서 해충 또는 기생충 감염의 치료 또는 방지를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 방법에 의해 제조되는 혼합물, 추출물, 분획, 용출액 또는 본 발명의 조성물의 용도가 유사하게 고려된다.

본 발명은 추가로 하나 이상의 기생충 또는 병원성 곤충 또는 식물병원성 곤충을 포함하는 하나 이상의 곤충과 같은 하나 이상의 해충의 제어 방법으로서, 본 발명의 조성물을 식물 또는 그 주변과 같은 장소에 적용하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 방법은 또한 본 발명의 조성물을 기생충 또는 병원성 곤충 해충에 의해 감염된 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 전체적으로 또는 부분적으로, 하나 이상의 살해충제 또는 하나 이상의 병원성 제제에 대한 해충의 내성을 역전시키는 방법으로서, 곤충을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

선택적으로, 방법은 해충을 하나 이상의 살해충제 또는 하나 이상의 병원성 제제, 또는 이의 임의의 조합과 함께 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

다양한 구현예에서, 투여되는 하나 이상의 살해충제 또는 하나 이상의 병원성 제제는 해충이 내성이 있거나 있게 되는 또는 이렇게 예상되는 것과 동일하다.

추가 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 해충을 제어하기 위해 효과적인 살해충제 또는 병원성 제제의 양의 본 발명의 조성물과 접촉된 하나 이상의 해충의 제어 방법을 제공한다.

하나 이상의 살해충제 또는 하나 이상의 병원성 제제는 본 발명의 조성물의 투여 전에, 이와 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 조성물 및 하나 이상의 살해충제 또는 하나 이상의 병원성 제제의 투여는 동시적, 순차적, 또는 개별적일 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 식물의 성장 또는 번식의 증강 방법으로서, 식물을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 방법은 심각한 식물독성 또는 식물독성의 증상 없이 식물의 성장 또는 번식을 증강시킨다.

하나의 구현예에서, 식물은 생물적 또는 비생물적 스트레스의 존재 하에 있다.

하나의 구현예에서, 비생물적 스트레스는 물 결핍, 영양소 결핍, 열 스트레스, 염 독성, 미네랄 또는 금속 독성, 및 냉동 온도로 구성되는 군으로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, 생물적 스트레스는 곤충 만연, 선충 만연, 및 유제류 방목으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 생물적 스트레스는 곤충, 선충, 및 유제류로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유기체에 의해 유도되는 스트레스이다.

하나의 구현예에서, 조성물은 본 발명의 방법을 이용해서 제조되는 혼합 추출물을 포함한다.

하나의 구현예에서, 조성물은 혼합물, 또는 혼합물로부터 또는 상술된 추출물로부터의 용출액, 분획 또는 추출물을 포함한다.

하나의 구현예에서, 조성물에는 생활성 내생 식물이 실질적으로 없다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 식물과 같은 장소가 해충 집단, 예컨대 곤충 또는 곤충 집단에 의해 감염되거나 노출되기 전에 예방적으로 적용된다. 다른 구현예에서, 조성물은 감염이 확립되거나 병원체가 존재하는 경우, 예를 들어, 식물과 같은 장소가 곤충에 의해 감염되거나 이에 노출되는 경우, 또는 곤충이 장소 상이나 내에 존재하는 경우 적용된다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장소에 직접 적용된다, 예를 들어, 식물 또는 그 주변에 직접 적용된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 용매와 혼합되거나 유화되고 본원에 기재된 바와 같이 적용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장소에 간접적으로, 예컨대 예를 들어 이후 장소에 적용되는 기재에 대한 적용에 의해 적용된다. 하나의 구현예에서, 조성물은 관개 시스템 또는 케미게이션(chemigation) 시스템을 이용해서 장소에 적용된다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장소, 예를 들어 들판 또는 목초지에, 식재 또는 파종 전에 적용된다.

하나의 구현예에서, 조성물은 적용 전에 100 L 당 약 2 g, 2.5 g, 5 g, 7.5 g, 10 g, 15 g, 20 g, 25 g, 50 g, 75 g, 100 g, 125 g, 150 g, 175 g, 또는 약 200 g의 롤린 알칼로이드의 최종 농도까지 물과 혼합된다.

하나의 구현예에서, 건조 보호제, 예컨대 비-이온성 계면활성제는 적용 전에 약 1 mL/L의 최종 농도로 혼합된다.

하나의 구현예에서, 조성물은 적용 전에 물과 혼합된다. 하나의 구현예에서, 조성물은 물과 혼합되어 적어도 약 100 L 물/Ha, 적어도 약 200 L/Ha, 적어도 약 250 L/Ha, 적어도 약 300 L/Ha, 적어도 약 400 L/Ha, 적어도 약 500 L/Ha, 적어도 약 750 L/Ha, 적어도 약 800 L/Ha, 적어도 약 850 L/Ha, 적어도 약 900 L/Ha, 적어도 약 950 L/Ha, 적어도 약 1000 L/Ha, 적어도 약 1250 L/Ha 적어도 약 1500 L/Ha, 적어도 약 1750 L/Ha, 또는 적어도 약 2000 L/Ha로 적용된다.

다양한 구현예에서, 조성물은 적어도 약 25 g 롤린/헥타르, 적어도 약 50 g 롤린/헥타르, 적어도 약 100 g 롤린/헥타르, 적어도 약 150 g 롤린/헥타르, 적어도 약 200 g 롤린/헥타르, 적어도 약 250 g 롤린/헥타르, 적어도 약 300 g 롤린/헥타르, 적어도 약 350 g 롤린/헥타르, 적어도 약 400 g 롤린/헥타르, 적어도 약 500 g 롤린/헥타르, 적어도 약 550 g 롤린/헥타르, 적어도 약 600 g 롤린/헥타르, 적어도 약 650 g 롤린/헥타르, 적어도 약 700 g 롤린/헥타르 또는 적어도 약 750 g 롤린/헥타르 또는 적어도 약 1000 g 롤린/헥타르의 비율로 적용된다. 일반적으로, 약 100 g 내지 약 500 g 롤린/헥타르의 적용 비율이 표적화된다.

하나의 구현예에서, 상기 적용은 분사에 의한다. 다른 구현예에서, 적용은 케미게이션에 의한다.

다른 구현예에서, 조성물은 종자 코팅으로 제형화된다.

농업 및 원예 적용에서, 본 발명은 임의의 식물 또는 그 주변에 대해 적용 가능하다. 특정 구현예에서 예시적인 식물은 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물, 예컨대 알팔파, 보리, 유채, 옥수수, 면실, 아마, 케이폭, 땅콩, 감자, 귀리, 쌀, 호밀, 수수, 대두, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 담배, 토마토, 밀, 잔디 풀, 목초지 풀, 베리, 과일, 콩, 야채, 장식용 식물, 관목, 선인장, 다즙식물, 및 나무이다.

추가적인 예시적 구현예에서, 식물은 콘볼불라세애(Convolvulaceae), 하이드로레아세애(Hydroleaceae), 몬티니아세애(Montiniaceae), 솔라나세애(Solanaceae), 및 스페노클레아세애(Sphenocleaceae) 과로부터의 식물을 포함하는 솔라날레스(Solanales) 목으로부터 선택되는 식물 및 아마릴리다세애(Amaryllidaceae), 아스파라가세애(Asparagaceae), 아스텔리아세애(Asteliaceae), 블란드포르디아세애(Blandfordiaceae), 보리아세애(Boryaceae), 도리안타세애(Doryanthaceae), 하이폭시다세애(Hypoxidaceae), 이리다세애(Iridaceae), 익시올리리아세애(Ixioliriaceae), 라나리아세애(Lanariaceae), 오르키다세애(Orchidaceae), 테코필래아세애(Tecophilaeaceae), 잔토로애세애(Xanthorrhoeaceae), 및 제로네마타세애(Xeronemataceae) 과로부터의 식물을 포함하는 아스파라갈레스(Asparagales) 목으로부터의 식물을 포함하는 임의의 식물일 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 해충, 기생충 또는 곤충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지 방법으로서, 대상체가 인간 또는 비-인간 동물 대상체이고, 대상체에 본 발명의 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한, 예를 들어, 해충, 기생충 또는 곤충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지에서 사용하기 위한 조성물 또는 약제의 제조에서, 본 발명의 조성물, 예를 들어 추출물 또는 용출액의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 조성물은 국소, 경구 또는 비경구 투여된다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 약학적 또는 수의학적 제형물을 제공한다.

하나의 구현예에서, 방법은 체외기생충 감염 또는 만연, 예를 들어 빈대, 벼룩, 파리, 각다귀, 진드기, 이, 예컨대 머릿니, 또는 응애에 의한 감염 또는 만연의 치료 또는 방지를 위한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 체내기생충 감염 또는 만연, 예를 들어 원생동물 기생충 또는 기생충 벌레, 예컨대 연충의 감염 또는 만연의 치료 또는 방지 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 조성물은 샴푸, 칼라, 크림, 겔, 물약(drench), 푸어-온(pour-on) 또는 스팟-온(spot-on) 제형물, 현탁액, 로션, 연고, 분사, 드레싱, 피부 패치, 정제, 캡슐, 볼루스, 엘릭서, 또는 주사제의 형태로 투여된다.

다양한 구현예에서, 조성물은 피부 1 cm² 당 적어도 약 5 ㎍ 롤린 알칼로이드, 피부 1 cm² 당 적어도 약 10 ㎍, 적어도 약 20 ㎍, 적어도 약 25 ㎍, 적어도 약 30 ㎍, 적어도 약 40 ㎍, 적어도 약 45 ㎍, 적어도 약 50 ㎍, 적어도 약 55 ㎍, 적어도 약 60 ㎍, 적어도 약 70 ㎍, 적어도 약 75 ㎍, 적어도 약 80 ㎍, 적어도 약 90 ㎍ 또는 적어도 약 100 ㎍ 롤린 알칼로이드를 전달하기에 충분한 양으로 적용되며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 피부 1 cm² 당 약 5 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 롤린 알칼로이드, 피부 1 cm² 당 약 25 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 75 ㎍, 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 롤린 알칼로이드).

다양한 구현예에서, 예를 들어, 국소 적용을 위한, 약학적 또는 수의학적 제형물 중 롤린 알칼로이드의 농도는 1 mL 당 적어도 약 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 25 ㎍, 30 ㎍, 40 ㎍, 45 ㎍, 50 ㎍, 55 ㎍, 60 ㎍, 70 ㎍, 75 ㎍, 80 ㎍, 90 ㎍, 100 ㎍, 125 ㎍, 150 ㎍, 175 ㎍ 또는 1 mL 당 적어도 약 200 ㎍이며 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 1 mL 당 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 75 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 75 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 또는 1 mL 당 약 100 ㎍ 내지 약 200 ㎍).

약학적 또는 수의학적 적용에서, 본 발명은 인간 대상체 또는 임의의 비-인간 동물 대상체, 예를 들어, 농업용 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 사슴, 및 염소; 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 및 기니아픽 및 말 그리고 조류, 예컨대 타조, 에뮤, 닭, 거위, 칠면조, 및 오리; 및 담수 또는 염수 어류에 적용 가능하다.

본 발명의 다른 양태는 단지 예로서 그리고 첨부 도면을 참조로 제공되는 하기 설명으로부터 자명해질 수 있다.

본원에 개시된 수치 범위에 대한 언급(예를 들어, 1 내지 10)은 또한 해당 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 또한 해당 범위 내의 임의 범위의 유리수(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급을 포함하며, 이에 따라 본원에서 명시적으로 개시된 모든 범위의 모든 하위 범위는 본원에 명시적으로 개시되는 것이다. 이들은 단지 구체적으로 의도되는 예일 뿐이고 열거된 최저값 및 최고값 사이 수치값의 모든 가능한 조합은 유사한 방식으로 본 출원에서 명시적으로 언급되는 것으로 간주되어야 한다.

본 명세서에서, 특허 명세서, 다른 외부 문헌, 또는 다른 정보 출처에 대해 참조된 경우, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 맥락의 제공 목적을 위한 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이러한 외부 문헌에 대한 참조는 모든 관할에서, 이러한 문헌, 또는 이러한 정보 출처가 선행 기술이거나 당분야의 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정으로 간주되어서는 안 된다.

본 명세서에서 이용되는 "포함하는"이라는 용어는 "적어도 부분적으로 이로 구성되는"을 의미한다. 해당 용어를 포함하는 본 명세서 내 진술의 해석 시, 각각의 진술 또는 청구범위에서 해당 용어가 서두가 되는 특징은 모두 존재해야 하지만, 다른 특징이 또한 존재할 수 있다. "포함한다" 및 "포함되는"과 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다.

본 발명은 또한 개별적으로 또는 종합적으로, 본 출원의 명세서에서 언급되거나 시사되는 부분, 요소 및 특징, 및 임의의 둘 이상의 상기 부분, 요소 또는 특징의 임의의 또는 모든 조합으로 구성되는 것으로 광범위하게 언급될 수 있고, 본 발명이 관련된 분야에서 공지된 균등부를 갖는 구체적 정수가 본원에서 언급되는 경우, 이러한 공지된 균등부는 개별적으로 나타낸 것과 마찬가지로 본원에 포함되는 것으로 간주된다.

이제 본 발명은 오직 예로서 그리고 하기 도면을 참조하여 기재될 것이다:
도 1은 제분 볏과 목초 풀로부터 다양한 추출 온도에서 추출되는 NANL, NFL, NAL, 롤린 및 전체 롤린 알칼로이드의 양을 나타낸다.
도 2는 400분에 걸친 시간 경과에서 제분 볏과 목초 풀로부터 수득되는 2개 추출물에서의 전체 롤린 농도를 나타낸다.
도 3은 70℃의 온도에서 수침 또는 패킹된 층 방법에 의해 수득되는 미제분 볏과 목초 풀로부터의 추출물 중 전체 롤린 농도를 나타낸다.
도 4는 400분에 걸쳐 70℃의 온도에서 제분 및 미제분 볏과 목초 풀로부터의 추출물의 전체 롤린 농도를 나타낸다.

본 발명은 부분적으로 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법 및 내생 식물로 감염된 식물로부터 유도되는 식물 재료로부터의 롤린 알칼로이드의 추출 또는 정제 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 해충 및 해충 집단의 제어, 식물 성장 또는 번식의 증강, 및 인간 또는 비-인간 동물에서 해충, 곤충 및/또는 기생충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지를 위한 본 발명의 조성물의 용도에 대한 것이다.

1. 정의

"및/또는"이라는 용어는 "및" 또는 "또는"을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "포함하는"이라는 용어는 "적어도 부분적으로 이로 구성되는"을 의미한다. "포함하는"이라는 용어를 포함하는 본 명세서 내의 각 진술의 해석 시, 해당 용어가 서두가 되는 것 또는 것들 이외의 특징이 또한 존재할 수 있다. "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다.

본원에서 이용되는 "제어한다" 또는 "제어하는"이라는 용어는 일반적으로 집단[의 하나 이상의 구성원]의 증가 방지, 감소, 또는 박멸, 또는 하나 이상의 해충 또는 병원체에 의한 감염 또는 만연, 예컨대 하나 이상의 식물병원체 또는 인간 또는 비-인간 동물을 감염시키는 해충 또는 곤충에 의한 감염의 방지, 감소 또는 박멸, 또는 이러한 감염의 비율 및 정도의 저해, 예컨대 장소, 예를 들어 식물 또는 그 주변 내 또는 상의 해충 집단의 감소, 또는 인간 또는 비-인간 동물에서 해충 또는 곤충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지로 이해되며, 여기서 감염(들) 또는 집단(들)에서의 이러한 방지 또는 감소는 미치료 감염(들) 또는 집단(들)에 대해 통계적으로 유의미하다. 근치적 치료도 고려된다. 바람직하게는, 이러한 제어는 해충 또는 병원체 집단에서의 증가된 사망률에 의해 달성된다.

제어는 길항작용을 통할 수 있음이 이해될 것이며, 이는 여러 형태를 취할 수 있다. 하나의 형태에서, 본 발명의 조성물은 퇴치제로서 단순 작용할 수 있다. 다른 형태에서, 본 발명의 조성물은 환경을 병원체에 대해 비우호적으로 만들 수 있다. 추가적인 바람직한 형태에서, 본 발명의 조성물은 해충 또는 병원체를 기생, 무능화, 불임화, 그 성장을 방해, 그 확산 또는 분포를 방해, 및/또는 사멸시킬 수 있다. 따라서, 길항작용 기구에는 비제한적으로 항생작용, 기생작용, 부동화, 불임, 및 독성이 포함된다. 따라서, 하나 이상의 해충의 길항제로서 작용하는 조성물은 살해충 활성을 갖는 것으로 언급될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 곤충의 길항제로서 작용하는 조성물은 살충 유효성을 갖는 것으로 언급될 수 있다. 또한, 해충의 길항제이거나 이를 포함하는 제제 또는 조성물은 살해충제 또는 살해충 조성물로 언급될 수 있다, 예를 들어, 동물 또는 식물의 곤충 해충을 포함하는 곤충의 길항제인 제제는 살충제로 언급될 수 있다. 마찬가지로, 동물 또는 식물의 곤충 해충을 포함하는 곤충의 길항제이거나 이를 포함하는 조성물은 살충 조성물로 언급될 수 있다.

따라서 본원에서 이용되는 바와 같이, "살해충 조성물"은 살해충 유효성을 갖는 적어도 하나의 제제를 포함하거나 함유하는 조성물이다.

다양한 구현예에서, 상기 살해충 유효성은 바람직하게는 곤충과의 접촉 14일 이내, 보다 바람직하게는 7일 이내에, 곤충, 선충, 및 유제류를 포함하는 하나 이상의 해충을 퇴치하거나, 무능화하거나, 불임화하거나, 그 성장을 방해하거나, 사멸시키는 능력, 보다 바람직하게는 7일 이내에 하나 이상의 식물독성 곤충을 더 사멸시키는 능력이다.

따라서 본원에서 이용되는 바와 같이, "살충 조성물"은 살충 유효성을 갖는 적어도 하나의 제제를 포함하거나 함유하는 조성물이다.

본원에서 이용되는 "추출물"이라는 용어는 원료 물질로부터의 추출에 의해 수득되는 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 포괄하며, 여기서 추출물은 원료 물질에 존재하는 화합물의 하위세트를 포함하거나 이로 구성된다. 전형적으로, 추출물은 결정 가능하고 식별 가능한 조성, 예를 들어 특징적인 크로마토그래피 프로필 또는 질량 분광학적 프로필을 가질 것이다.

본원에서 이용되는 "분획"이라는 용어는 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 포괄하며, 여기서 분획은 분획화되지 않은 원료 물질에 존재하는 화합물의 하위세트를 포함하거나 이로 구성된다. 전형적으로, 분획은 결정 가능하고 식별 가능한 조성, 예를 들어 특징적인 크로마토그래피 프로필 또는 질량 분광학적 프로필을 가질 것이다.

하나 이상의 롤린 알칼로이드에 관해, 예를 들어 실시예에서 본원에 예시되는 바와 같은 하나 이상의 롤린 알칼로이드에 대해 본원에서 이용되는 "기능적 변이형"이라는 용어는 구체적으로 확인되는 대상체와 상이한 롤린 알칼로이드를 나타내며, 예를 들어 하나 이상의 기가 결실되거나 치환되거나 부가되지만 적어도 부분적으로 구체적으로 확인되는 대상체의 하나 이상의 생물학적 활성, 예컨대 구체적으로 확인되는 롤린 알칼로이드에 의해 야기되는 하나 이상의 생물학적 효과를 야기하는 능력을 보유한다.

본 발명의 경우에서, 기능적 변이형은 바람직하게는 구체적으로 확인되는 롤린 알칼로이드 또는 본 발명의 조성물의 살해충 유효성 또는 활성의 적어도 일부를 보유할 것이다.

본 발명의 롤린 알칼로이드에 의해 야기되는 하나 이상의 생물학적 효과, 예컨대 살충 유효성을 결정하기 위한 방법 및 검정은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 이러한 방법 및 검정은 본 발명의 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 하나 이상의 기능적 변이형을 식별하거나 확인하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 본 발명의 롤린 알칼로이드 또는 조성물이 표적 해충, 예컨대 실시예에서 본원에 기재되는 것들을 사멸시키거나 달리 그 성장을 길항하는 능력의 검정은 본 발명의 롤린 알칼로이드 또는 조성물의 하나 이상의 기능적 변이형의 식별에 적합하다.

본원에서 이용되는 "식물"이라는 용어는 전체 식물을 포괄할 뿐만 아니라 식물 부분, 절단부뿐만 아니라 뿌리, 잎, 꽃, 종자, 줄기, 캘루스 조직, 열매 및 과일, 구근, 덩이줄기, 구경, 낟알, 절단부, 뿌리 스톡, 또는 접가지를 포함하는 식물 산물로 확장되며, 식재-전, 성장 중, 및 수확 중이거나 후인지 여부와 무관하게 임의의 식물 재료가 포함된다. 본 발명의 적용에서 이익을 얻을 수 있는 식물은 광범위한 농업 및 원예 작물을 포괄한다. 또한 본 발명의 조성물은 유기 제조 시스템에서의 적용에 특히 적합하다.

특히 본원에 기재된 제조 방법에 대해, 본원에서 이용되는 "식물 재료"라는 용어는 전체 식물을 포괄할 뿐만 아니라 식물 부분, 절단부뿐만 아니라 뿌리, 잎, 꽃, 종자, 줄기, 캘루스 조직, 열매 및 과일, 구근, 덩이줄기, 구경, 낟알, 절단부, 뿌리 스톡, 또는 접가지를 포함하는 식물 산물로 확장된다. 본 명세서의 독서 시 식물 재료가 여러 방식으로, 예를 들어, 제분에 의해, 예를 들어 수용액과의 혼합 전에 가공될 수 있거나, 예를 들어, 식물 재료가 전체 종자로 구성되는 경우 거의 또는 전혀 가공 없이 이용될 수 있음이 이해된다. 따라서, 본원에서 이용되는 "제분 식물 재료"라는 용어는 식물 재료 조각의 크기를 감소시키기 위해, 예를 들어 절단, 분쇄, 칩화, 과립화, 연마 등에 의해 가공된 식물 재료를 고려한다. 제분 식물 재료의 예가 본원에 제공된다.

살해충제, 예컨대 본 발명의 살해충 조성물에 대해 이용되는 경우, "살해충 유효성을 보유하는"이라는 어구 및 이의 문법적 균등부 및 유도체는 제제가 여전히 유용한 살해충 활성을 가짐을 의미하려는 것이다. 바람직하게는, 보유되는 활성은 원래 활성의 적어도 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%이며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 35 내지 약 100%, 약 50 내지 약 100%, 약 60 내지 약 100%, 약 70 내지 약 100%, 약 80 내지 약 100%, 및 약 90 내지 약 100%). 예를 들어, 본원에 기재된 롤린 알칼로이드의 바람직한 기능적 변이형은 살해충 활성을 보유한다, 즉 특정된 모체 롤린 알칼로이드의 살해충 활성의 적어도 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%를 보유한다. 유사하게, 본 발명의 바람직한 조성물은 이들이 포함하는 살해충제(들)의 유용한 살해충 활성의 유지를 지지할 수 있고, 이상적으로는 본원에서 고려되는 방법을 이용해서 적용될 때까지, 살해충 활성을 보유하는 것으로 언급될 수 있다.

유사하게, 살충제, 예컨대 살충 조성물에 대해 이용되는 경우, "살충 유효성을 보유하는"이라는 어구 및 이의 문법적 균등부 및 유도체는 제제가 여전히 유용한 살충 활성을 가짐을 의미하려는 것이다. 바람직하게는, 보유되는 활성은 원래 활성의 적어도 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%이며, 유용한 범위는 임의의 이러한 값 사이에서 선택될 수 있다(예를 들어, 약 35 내지 약 100%, 약 50 내지 약 100%, 약 60 내지 약 100%, 약 70 내지 약 100%, 약 80 내지 약 100%, 및 약 90 내지 약 100%). 예를 들어, 본 발명의 바람직한 기능적 변이형은 살충 활성을 보유한다, 즉 특정된 모체 롤린 알칼로이드 또는 이를 포함하는 분획의 살충 활성의 적어도 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%를 보유한다. 유사하게, 본 발명의 바람직한 조성물은 이들이 포함하는 살충제(들)의 유용한 살충 활성의 유지를 지지할 수 있고, 이상적으로는 본원에서 고려되는 방법을 이용해서 적용될 때까지, 살충 활성을 보유하는 것으로 언급될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물의 대상이 되는 식물에 대해 이용되는 경우, "주변"이라는 용어에는 식물 또는 뿌리, 덩이줄기 등의 근처 또는 주위의 토양, 물, 한 배 잎, 및/또는 성장 배지, 근처 식물, 상기 식물의 절단물, 지지체, 식물에 투여될 물, 및 종자 코팅을 포함하는 코팅이 포함된다. 추가로 저장, 패키징 또는 가공 재료, 예컨대 보호 코팅, 상자 및 포장물, 및 식재, 유지 또는 수확 설비가 포함된다.

"경구 투여"라는 용어에는 경구, 구강, 장 및 위내 투여가 포함된다.

"비경구 투여"라는 용어에는 비제한적으로 국소(임의의 진피, 표피 또는 점막 표면에 대한 투여 포함), 피하, 정맥내, 복강내, 근육내 및 종양내(종양에 대한 임의의 직접 투여 포함) 투여가 포함된다.

명사에 뒤따르는 "(들)"이라는 용어는 단수 또는 복수 형태, 또는 둘 다를 고려한다.

"대상체"라는 용어는 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 포유류 반려 동물 또는 인간을 나타내려는 것이다. 바람직한 반려 동물에는 고양이, 개 및 말이 포함된다. 다른 포유류 대상체에는 말, 돼지, 양, 염소, 소, 사슴, 또는 가금을 포함하는 농업용 동물, 또는 원숭이, 래트, 마우스, 토끼 또는 기니아픽을 포함하는 실험실 동물이 포함된다. 다른 대상체에는 조류, 예컨대 타조, 에뮤, 닭, 거위, 칠면조, 및 오리; 및 담수 또는 염수 어류가 포함된다.

"치료하다"라는 용어 및 그 유도체는 이의 가장 광의의 가능한 맥락에서 해석되어야 한다. 이 용어는 대상체가 완전 회복까지 치료됨을 시사하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 따라서, "치료하다"에는 광의적으로 대상체의 질환 진행 또는 증상의 실질적으로 정적 수준으로의 유지, 대상체의 회복 속도 증가, 특정 상태의 증상 개시 또는 중증도의 완화 및/또는 방지, 또는 환자의 삶의 질 연장이 포함된다. "치료하다"라는 용어에는 또한 광의로 민감한 개인에 있어서 우수한 건강의 유지 및 질환, 감염 또는 만연 방지를 위한 스태미너의 구축이 포함된다.

본원에서 이용되는 "기생충 감염"이라는 용어는 대상체 내의 또는 상의 외부 기생충(체외기생충) 또는 내부 기생충(체내기생충)의 감염 또는 만연을 의미한다.

2. 롤린 알칼로이드의 제조, 추출 및/또는 정제 방법

하나의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법, 또는 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 추출 방법으로서,

b) 종자 및 수용액을 혼합하는 단계,

본 발명의 예시적인 방법은 하기 단계를 포함한다.

내생 식물-감염된 풀 종자로부터 유도되는 전체 종자가 추출 용기에 놓인다. 비등수가 가열 용기로부터 추출 용기의 상부 내로 펌핑된다. 재순환 시스템이 작동함으로써 물이 추출 용기의 저부로부터 배액되고 가열 용기로 복귀된다. 추출 용기 내의 물 수준은 항상 종자 위로 유지된다.

종자층의 온도는 공정을 통해 모니터링된다. 종자층이 90~95℃에 도달하면, 3시간 동안 상기 온도에서 재순환을 계속한다.

대안적 구현예에서, 추출은 더 긴 기간 동안 더 낮은 온도에서 수행된다.

추출물이 추출 용기로부터 회수된다.

하나의 구현예에서, 수용액은 산성화되거나 염기성화된 물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 적합한 양의 아세트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 불화수소산, 시안화수소산, 하이드로겐 설피드 또는 황산을 수성 용매 또는 물에 첨가함으로써 물이 산성화된다. 다른 구현예에서, 적합한 양의 암모니아, 트리메틸 암모니아, 피리딘, 암모늄 하이드록사이드, 나트륨 하이드록사이드 또는 칼륨 하이드록사이드를 수성 용매 또는 물에 첨가함으로써 물이 염기성화된다.

하나의 구현예에서, 수용액의 pH는 약 pH 6 내지 약 pH 9이다. 극산성 pH 또는 약 9 초과의 pH에서의 추출은 추출물 중 NFL의 가수분해를 유도할 수 있다.

추출물이 대략 2~8℃의 온도까지 냉각되어 추출물 중 고체를 침전시킨다. 추출물의 pH는 10 M 나트륨 하이드록사이드 또는 칼륨 하이드록사이드를 이용하여 pH 9까지 조정된다. 추출물이 일렬로 연결된 20 및 5 ㎛ 침강 필터를 통해 여과되어 침전 고체를 제거한다. 대안적 구현예에서, 침전 고체는 원심분리에 의해 추출물로부터 제거된다.

여과 추출물은 10 M 나트륨 하이드록사이드 또는 칼륨 하이드록사이드를 이용하여 pH 11~12까지 조정된다. 대안적 구현예에서, pH는 여과 단계 전에 pH 11~12까지 조정된다.

pH-조정 여과 추출물은 수중 역상 크로마토그래피 수지가 충전된 칼럼에 적용된다. 특히 바람직한 구현예에서, 역상 크로마토그래피 수지는 Supelco^® Sepabeads SP-207 수지를 포함한다.

추출물에 존재하는 롤린 알칼로이드가 칼럼에 결합한다. 역삼투(RO)수가 칼럼을 통해 펌핑된다. 칼럼에 결합된 분자가 용매 용액을 이용하여 용출되고 용출액 분획이 수집된다. 롤린 알칼로이드를 포함하는 모든 분획이 조합되어 용출액을 형성한다.

비교적 작은 포어 크기를 갖는 역상 크로마토그래피 수지가 이용되는 경우, 추가적인 전-여과가 요구될 수 있을 것이다. 더 큰 포어 크기를 갖는 수지가 이용되는 경우, 칼럼 로딩이 더 느릴 것이고 더 긴 칼럼이 요구될 수 있을 것이다. 다양한 구현예에서, 용매 용액은 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 96% 에탄올을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 칼럼에 결합된 분자는 96% 에탄올을 이용하여 용출된다. 다른 유기 용매, 바람직하게는 물과 혼화성인 용매, 예를 들어 메탄올이 이용될 수 있다.

하나의 구현예에서, 용매 용액은 산성화된다. 산성화된 용매 용액이 이용되는 경우, 칼럼으로부터 롤린 알칼로이드를 용출하기 위해 더 낮은 용매 농도가 이용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 산성화된 용매 용액은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 약 30% 에탄올을 포함한다.

에탄올은 회전 증발에 의해 용출액으로부터 제거되어 진한 유성 잔류물을 제조한다. 잔류물은 수중 용해된다. 아세토니트릴이 연속 교반하며 느리게 첨가되어 불순물을 침전시킨다. 혼합물은 적어도 12 내지 18시간의 기간 동안 유지되어 롤린 알칼로이드를 포함하는 아세토니트릴로부터 불순물을 포함하는 진한 유성 잔류물을 분리한다. 아세토니트릴상은 경사분리에 의해 잔류물로부터 분리된다.

대안적 구현예에서, 불순물은 물/메탄올 또는 물/에탄올 용액을 이용해서 침전된다.

아세토니트릴상은 카본 칼럼으로 적용된다. 롤린 알칼로이드는 카본에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 칼럼은 수중 90% 아세토니트릴로 사전 컨디셔닝된 Darco ^® 활성탄(20~40 메쉬, 과립)을 포함한다. 칼럼은 추가적인 수중 90% 아세토니트릴로 세척된다. 칼럼에 결합된 롤린 알칼로이드는 용매로 용출된다.

용매는 회전 증발에 의해 탄소 정제 롤린 추출물로부터 제거되어 롤린 알칼로이드의 건조 추출물을 제조한다.

선택적으로, 아세토니트릴이 건조 추출물에 첨가되어 -20℃에서 하룻밤 동안 소량 불순물을 침전시킨다. 아세토니트릴은 경사분리되고 회전 증발에 의해 건조되어 약 90% 초과 순도의 롤린의 건조 추출물을 산출한다.

추가 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법, 또는 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 추출 방법으로서,

b) 식물 재료 및 물을 혼합하는 단계,

식물 재료는 종자를 포함하지 않는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가적인 예시적 방법은 하기 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 식물 재료는 20 mm 스크린을 통해 통과된 기계적으로 절단된 신선 풀을 포함하며, 여기서 풀은 내생 식물로 감염되거나 감염되었다. 다른 구현예에서, 식물 재료는 제분되지 않는다.

pH 11의 물은 약 70℃의 온도까지 가열된다. 풀은 1:10 w/v의 비로 가열된 물에 첨가되고, 적어도 약 16 내지 약 24시간의 기간 동안 유지되어 추출물을 제조한다. 추출물이 회수된다.

추출물이 여과되어 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 여과 추출물을 제조한다.

본 발명의 예시적인 방법은 하기 단계를 포함한다.

내생 식물-감염 풀로부터의 초본이 연타 밀 및 20 mm 메쉬 플레이트가 장착된 목재 칩화장치(chipper)(예를 들어, Pallmann 이중 스트림 밀 PSKM 또는 PPSM)에서 제분되며, 선택적으로 필요한 경우 관목을 해체하기 위해 초본을 조(coarse) 절단장치를 통해 통과시키는 단계가 선행된다.

제분 풀은 추출 용기에 놓인다. 물(50℃, 10:1 w/w 물:풀)은 가열 용기로부터 추출 용기의 상부 내로 펌핑된다. 재순환 시스템이 작동함으로써 물이 추출 용기의 저부로부터 배액되고 가열 용기로 복귀된다. 추출 용기 내의 물 수준은 항상 제분 풀 위로 유지된다.

물:풀 혼합물의 온도는 50℃에서 유지되며, 재순환은 적어도 1시간 동안 상기 온도에서 계속된다.

추출물은 추출 용기로부터 회수되며, 선택적으로 샘플(들)이 분석(예를 들어, 살해충제, 독성 알칼로이드, 롤린 농도)을 위해 취해진다.

추출물이 냉각되며, 추출물의 pH는 10 M 나트륨 하이드록사이드 또는 칼륨 하이드록사이드를 이용하여 pH 9까지 조정된다. 추출물은 일렬로 연결된 50 ㎛ ~ 5 ㎛, 이어서 25 ㎛ ~ 1 ㎛의 등급-밀도 침강 필터를 통해 여과되어 미립자를 제거한다.

여과 추출물(여액)은 표준 교반 탱크에서 10 M 나트륨 하이드록사이드 또는 칼륨 하이드록사이드를 이용해서 pH 11까지 조정된다. 선택적으로, 샘플은 pH의 결정을 포함하여, 분석을 위해 다시 취해진다.

pH 11의 여과 추출물은 Supelco^® Sepabeads SP-207 수지가 패킹된 칼럼으로 적용된다.

추출물에 존재하는 롤린 알칼로이드는 칼럼에 결합한다. 역삼투(RO)수가 칼럼을 통해 펌핑된다. 칼럼에 결합된 분자가 공비 혼합물 에탄올(~96%)을 이용하여 용출되고 용출액 분획이 수집된다. 롤린 알칼로이드를 포함하는 모든 분획이 조합되어 용출액을 형성한다.

에탄올은 회전 증발 또는 낙하 필름 증발에 의해 용출액으로부터 제거되어 진한 유성 잔류물을 제조한다. 잔류물은 수중 용해된다.

선택적으로, 아세토니트릴이 연속 교반하며 느리게 첨가되어 불순물을 침전시킨다. 혼합물은 적어도 12 내지 18시간의 기간 동안 유지되어 롤린 알칼로이드를 포함하는 아세토니트릴로부터 불순물을 포함하는 진한 유성 잔류물을 분리한다. 아세토니트릴상은 경사분리에 의해 잔류물로부터 분리된다.

아세토니트릴상은 카본 칼럼으로 적용된다. 롤린 알칼로이드는 카본에 결합된다. 바람직한 구현예에서, 칼럼은 수중 90% 아세토니트릴로 사전 컨디셔닝된 Darco ^® 활성탄(20~40 메쉬, 과립)을 포함한다. 칼럼은 추가적인 수중 90% 아세토니트릴로 세척된다. 칼럼에 결합된 롤린 알칼로이드는 용매로 용출된다.

용매가 회전 증발에 의해 탄소 정제 롤린으로부터 제거되어 롤린 알칼로이드의 건조 추출물을 제조한다.

식물 재료로부터 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 수율은 적어도 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.75, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.25, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.75, 약 1.8, 약 1.9 또는 적어도 약 2 mg/g이다.

본원에서의 방법의 특정 구현예의 구체적 장점은 추출 전에 종자를 제분하거나, 연마하거나, 달리 가공할 필요 없이 전체 종자로부터 롤린 알칼로이드가 추출될 수 있다는 것이다. 본원에 기재된 방법의 특정 구현에의 추가 장점, 특히 원료로서 전체(미제분) 종자를 이용하는 것의 장점은 하나 이상의 롤린의 추출 동안 하나 이상의 지질 오염물질, 단백질 오염물질, 또는 다당류 오염물질의 감소이다.

본 발명의 추가 장점은 이것이 고순도이고 비교적 불순물 또는 오염물질이 없는 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조를 제공한다는 것이다.

롤린 알칼로이드의 분석 방법

본원에 기재된 추출물, 분획, 여액 또는 조성물 중 롤린 알칼로이드의 농도 확인 및 결정 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.

하나의 이러한 방법은 액체 크로마토그래피 일렬 질량 분광측정(LC MS/MS) 분석을 이용한다. 이러한 방법의 하나의 예가 본원에 제공되는 실시예에서 이용되었으며, 여기서 샘플은 적절한 교정 범위까지 0.1% 암모늄 하이드록사이드 용액 중에 희석된다. 샘플은, 예를 들어, 0.1% 암모늄 하이드록사이드부터 100% 아세토니트릴까지의 구배를 이용하여, Acquity UPLC BEH 페닐 1.0x50 mm, 1.7 ㎛ 수지를 이용하여, 정지상에서 HPLC에 의해 분리된다. 용출 분획이 MS/MS에 의해 분석되어 존재하는 롤린 알칼로이드를 확인한다.

다른 적합한 방법론은 명세서의 독서 시 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 다른 크로마토그래피 방법론, 예컨대 기체 크로마토그래피가 이용될 수 있다.

3. 해충의 제어

해충, 예컨대 곤충에 대해 효과적이고, 본 발명에 따라 이용하기에 적합한 본 발명의 조성물은 본 발명의 조성물이 비교되는 대조군 치료에 대해 통계적으로 유의미한 양만큼 표적 해충 종 집단의 감소에서 효과적인 것으로 확인된다. 이러한 조성물은 살해충 유효성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 표적 해충 집단의 감소는 다양한 길항 기구에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 해충을 무능화, 불임화, 그 성장 또는 발생의 저해, 및/또는 바람직하게는 사멸할 수 있거나, 또는 또한 존재하는 하나 이상의 다른 살해충제, 예컨대 본 발명의 롤린 알칼로이드와 함께 조성물에 존재하는 살진균제(개별적으로, 동시적으로, 또는 순차적으로 여부와 무관하게)의 성장 및 살해충 유효성을 지지하거나 촉진할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 조성물은 살해충제가 해충을 기생, 무능화, 불임화, 및/또는 바람직하게는 사멸시키는 능력을 가능케 하거나 지지할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 환경, 예를 들어 조성물이 적용되는 식물 또는 그 주변을 해충에 대해 선호되지 않도록 함으로써 표적 해충 집단을 감소시킬 수 있다. 상기 구현예에서, 조성물은 퇴치제로서 작용하고, 장소 인근, 예컨대 식물 또는 그 주변에서 표적 해충의 유효 집단을 감소시키는 것으로 간주될 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 적합한 롤린 알칼로이드, 또는 본 발명의 조성물은 대조군 치료에 비해 관련 곤충 종 집단의 감소 백분율로 표현되는 약 5% 살해충 유효성, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 살해충 유효성을 나타낸다.

살해충 유효성이 본 발명의 조성물, 예컨대 살해충제로서 이용하기에 적합한 것으로 간주될 식물 원료 물질로부터 유도되는 롤린 알칼로이드 함유 추출물에 대한 기본 요건이지만, 조성물은 생물학적 제어제로서 이용하기에 적합한 추가 특징을 가질 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물은 궁극적으로 이것이 표적 장소, 예컨대 식물 또는 그 주변에 생물학적 제어제로서 효과적인 형태 및 농도로 적용될 수 있도록 하기 위해, 합리적인 기간 동안 효과적인 형태로 보관될 수 있어야 한다.

당업자는 본 발명의 롤린 알칼로이드 및 조성물이 본원에 예시된 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 하나 이상의 기능적 변이형을 포함할 수 있거나 본 발명의 방법이 이를 이용할 수 있음을 인식할 것이다. 롤린 알칼로이드 및 이의 기능적 변이형의 조합도 본원에서 유용하다.

본 발명자들은 본원에 개시된 조성물이 광범위한 농업적, 원예적, 의학적 또는 수의학적 해충, 곤충 및/또는 병원체 및 광범위한 환경에 대해 국소 및/또는 전신 적용을 위한 생물학적 제어 조성물로서 특히 유용성을 가질 것임을 고려한다.

농업적 및 원예적 용도

본 발명은, 예를 들어 미합중국, 뉴질랜드, 유럽의 여러 주를 포함하는 여러 국가의 농업 및 원예 섹터가 식물 해충 중에서 살해충제 내성의 증가 문제에 직면하고 있음을 인식한다. 이는 규제 장벽으로 인해 신규 화학적 살충제의 이용 가능성 감소에 의해 일부 규제 방식 하에서 복잡해진다.

본 발명에 의해 이용 가능해지는 살해충 롤린 알칼로이드의 이용은 이러한 문제에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명자들은 본원에 개시된 조성물이 원예 및 농업 산업에서 국소 및/또는 전신 적용을 위해, 예컨대 들판 작물, 풀, 과일 및 야채, 잔디, 나무, 및/또는 장식용 식물에 대한 적용에 의해, 생물학적 제어 조성물로서 특히 유용성을 가질 것임을 고려한다. 본원에 개시된 조성물은 해충의 사멸, 또는 해충 집단의 제어를 위해 분사, 분진, 분말, 또는 다른 수성, 분무화 또는 에어로졸로서 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 예방적으로 이용될 수도 있고, 또는 대안적으로 표적 해충이 치료될 특정 환경에서 확인되었을 때 환경에 투여될 수도 있다. 조성물은 개별 롤린 알칼로이드를 포함할 수도 있고 또는 본원에 개시된 롤린 알칼로이드의 다양한 조성물을 함유할 수도 있다.

적용 방법과 무관하게, 활성 성분(들)의 양은 살해충 유효량으로 적용되며, 이는, 예를 들어, 제어될 특정한 표적 해충, 특정한 환경 또는 위치, 예를 들어 치료될 식물, 작물, 또는 농업 부지, 환경 조건, 및 살해충 활성 조성물의 적용 방법, 비율, 농도, 안정성, 및 양과 같은 요인에 따라 변할 것이다. 제형물은 또한 기후 조건, 환경 고려사항, 및/또는 적용 빈도 및/또는 해충 만연의 중증도에 대해 변할 수 있다.

기재되는 조성물은 선택적으로 하나 이상의 다른 제제와 함께, 하나 이상의 롤린 알칼로이드, 추출물, 배양 또는 배양 배지 등을 원하는 농업적으로 허용 가능한 담체와 제형화하여 제조될 수 있다. 조성물은 적절한 수단 중, 예컨대 동결건조, 냉동 건조, 건조, 또는 수성 담체, 배지 또는 적합한 희석제, 예컨대 식염수 또는 다른 완충액 중 투여 전에 제형화될 수 있다. 제형화된 조성물은 분진 또는 과립 재료, 또는 오일(식물성 또는 미네랄) 중 현탁액, 또는 물 또는 오일/물 에멀젼의 형태로, 또는 수화성 분말로서, 또는 농업적 적용에 적합한 임의의 다른 담체 재료와의 조합일 수 있다. 적합한 농업적 담체는 고체 또는 액체일 수 있고 당분야에 널리 공지되어 있다. "농업적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 살충제 제형 기술에서 일반적으로 이용되는 모든 보강제, 불활성 성분, 분산제, 계면활성제, 증점제, 결합제 등을 포괄한다; 이들은 살충제 제형의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 제형물은 하나 이상의 고체 또는 액체 보강제와 혼합되고 다양한 수단, 예를 들어, 통상적 제형화 기법을 이용하여 적합한 보강제와 살충 조성물의 균질 혼합, 배합 및/또는 연마에 의해 제조될 수 있다.

수분산성 과립

다른 중요한 예시적 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수분산성 과립을 포함한다. 상기 과립은 선택적으로 하나 이상의 다른 제제와 함께, 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함한다.

분말, 분진, 및 포자 제형물

제3의 중요한 예시적 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수화성 분말, 분진, 포자 제형물, 세포 펠렛, 또는 콜로이드성 농축물을 포함한다. 상기 분말은 선택적으로 하나 이상의 다른 제제와 함께, 본 발명의 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함한다. 본 발명의 조성물의 이러한 건조 형태는 수화 시 즉시 용해되도록, 또는 대안적으로 제어-방출, 지속-방출, 또는 다른 시간-의존적 방식으로 용해되도록 제형화될 수도 있다. 이러한 조성물은, 표적 해충에 적용되거나, 이에 의해 섭취될 수 있고, 이와 같이, 해충의 수, 또는 주어진 환경에서 이러한 해충의 확산을 제어하기 위해 이용될 수 있다.

수성 현탁액 및 배양 여액 또는 용해액

제4의 중요한 예시적 구현예에서, 본 발명의 조성물은 선택적으로, 예를 들어 배양 여액, 배양 상청액, 배양 배지 또는 추출물 또는 이로부터의 분획을 포함하는, 본원에 개시된 본 발명의 롤린 알칼로이드의 제조에 이용되는 하나 이상의 내생 식물 세포를 포함하는, 하나 이상의 용해되거나 달리 사멸되거나 비-생육성인 내생 식물 세포와 함께, 본 발명의 하나 이상의 롤린 알칼로이드의 수성 현탁액을 포함한다. 이러한 수성 현탁액은 적용 전에 희석되는 농축 스톡 용액으로서, 또는 대안적으로 즉시 적용 가능한 희석된 용액으로서 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 온전하지만 죽은 세포를 포함하는 경우, 이러한 조성물은 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 이들은 다양한 불활성 재료, 예컨대 무기 미네랄(필로실리케이트, 카보네이트, 설페이트, 포스페이트 등) 또는 식물성 재료(분말화된 옥수수 속대, 쌀겨, 호두 껍질 등)와의 혼합에 의해 수화성 분말, 과립 또는 분진으로서 채용될 수 있다. 제형물에는 확산제-점착제 보강제, 안정화제, 다른 살해충 첨가제, 또는 계면활성제가 포함될 수 있다. 액체 제형물은 수계 또는 비수성일 수 있고, 발포체, 현탁액, 유화성 농축물 등으로서 채용될 수 있다. 성분에는 유동화제, 계면활성제, 유화제, 분산제, 또는 중합체가 포함될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 하나의 구현예에서 조성물은 롤린 알칼로이드를 제조할 수 있는 배양물을 포함하며, 활성 조성물로서 이러한 조성물의 용액, 현탁액, 또는 콜로이드성 조제물을 이용한다.

다기능성 제형물

특정 구현예에서, 예를 들어 다중 해충종의 제어가 바람직한 경우, 본원에 기재된 제형물은 또한 하나 이상의 다른 제제, 예컨대 하나 이상의 화학적 살해충제(예컨대 화학적 살해충제, 살선충제, 살진균제, 살바이러스제, 살미생물제, 살아메바제, 살충제 등), 및/또는 본원에서 확인되는 살충 롤린 알칼로이드와 동일하거나 상이한 살충 활성 또는 살충 특이성을 갖는 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 다른 치료, 예컨대 제형물의 단회 적용 후 표적 영역의 장기 투여를 허용하는 비료, 잡초 사멸제, 동결보호제, 계면활성제, 세제, 살충 비누, 동면 오일, 중합체, 및/또는 시간-방출성 또는 생분해성 담체 제형물과 함께 이용될 수 있다. 마찬가지로, 제형물은 조성물의 표적 해충에 의한 공급 또는 섭취를 허용하기 위해 식용 "미끼"로 제조되거나 해충 "트랩"으로의 방식일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 단독으로 또는 하나 이상의 살충제, 살해충제, 화학물질, 비료, 또는 다른 화합물을 포함하는 하나 이상의 추가 제제와 조합되어 환경 부지에 연속적 또는 동시적 적용에서 이용될 수 있다.

유사하게, 필요한 경우, 본원에 기재된 바와 같이 제조되는 하나 이상의 롤린 알칼로이드는 당분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 분획화, 여과 또는 침강 방법론(예로, 원심분리)에 의해, 하나 이상의 세포-용해 단계(예를 들어, 세포내 롤린 알칼로이드에 있어서)와 조합되건 조합되지 않건(예를 들어, 성장 배지 내로 분비되는 롤린 알칼로이드에 있어서) 무관하게 내생 식물로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 또한, 하나 이상의 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 하나 이상의 담체가 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 담체, 예컨대 농업적으로 허용 가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 본원에서 유용한 담체에는 농업적 조성물을 제형화하기 위해 전형적으로 이용되는 임의의 물질이 포함된다.

하나의 구현예에서, 농업적으로 허용 가능한 담체는 충전제, 용매, 부형제, 계면활성제, 현탁화제, 확산제/점착제(접착제), 소포제, 분산제, 수화제, 드리프트 감소제, 보조제, 보강제 또는 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 예를 들어, 농축물, 용액, 분사, 에어로졸, 침윤조, 딥, 에멀젼, 수화성 분말, 가용성 분말, 현탁 농축물, 분진, 과립, 수분산성 과립, 마이크로캡슐, 페이스트, 겔 및 널리 확립된 절차에 의한 다른 제형물 유형으로 제형화될 수 있다.

이들 절차에는 활성 성분과 농업적으로 허용 가능한 담체 물질, 예컨대 충전제, 용매, 부형제, 계면활성제, 현탁화제, 확산제/점착제(접착제), 소포제, 분산제, 수화제, 드리프트 감소제, 보조제 및 보강제의 혼합 및/또는 제분이 포함된다.

하나의 구현예에서, 고체 담체에는 비제한적으로 미네랄 토, 예컨대 규산, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 카올린, 아타풀거스 점토, 석회석, 석회, 초크, 교회 점토, 황토, 점토, 백운석, 규조토, 알루미나 칼슘 설페이트, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 옥사이드, 분쇄 플라스틱, 비료, 예컨대 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 니트레이트, 및 요소, 그리고 식물성 산물, 예컨대 낟알 밀(meal), 나무껍질 밀, 목재 밀, 및 견과피 밀, 셀룰로스계 분말 등이 포함된다. 과립용 고체 담체로서, 분쇄되거나 분획화된 천연 암, 예컨대 방해석, 대리석, 질석, 해포석 및 백운석; 무기 또는 유기 밀의 합성 과립; 유기 재료, 예컨대 톱밥, 코코넛 껍질, 옥수수 속대, 옥수수 껍질 또는 담배 자루의 과립; 규조토, 트리칼슘 포스페이트, 분말화된 코르크, 또는 흡착성 카본 블랙; 수용성 중합체, 수지, 왁스; 또는 고체 비료가 적합하다. 이러한 고체 조성물은, 원하는 경우 하나 이상의 상용성 수화제, 분산제, 유화제 또는 착색제를 함유할 수 있고, 이것은 고체인 경우 또한 희석제로서 작용할 수 있다.

하나의 구현예에서, 담체는 또한 액체, 예를 들어, 물; 알코올, 특히 부탄올 또는 글리콜뿐만 아니라 이의 에테르 또는 에스테르, 특히 메틸글리콜 아세테이트; 케톤, 특히 아세톤, 사이클로헥사논, 메틸에틸 케톤, 메틸이소부틸케톤, 또는 이소포론; 석유 분획, 예컨대 파라핀계 또는 방향족 탄화수소, 특히 자일렌 또는 알킬 나프탈렌; 미네랄 또는 식물성 오일; 지방족 염소화 탄화수소, 특히 트리클로로에탄 또는 메틸렌 클로라이드; 방향족 염소화 탄화수소, 특히 클로로벤젠; 수용성 또는 강 극성 용매, 예컨대 디메틸포름아마이드, 디메틸 설폭사이드, 또는 N-메틸피롤리돈; 액화 가스 등이나 이의 혼합물일 수 있다.

하나의 구현예에서, 계면활성제에는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및/또는 양쪽성 계면활성제가 포함되며, 응집물이 분사 동안 용액 중에 유지되는 능력을 촉진한다.

확산제/점착제는 본 발명의 조성물이 식물 표면에 부착하는 능력을 촉진한다. 계면활성제, 확산제/점착제의 예에는 비제한적으로 Tween 및 Triton(Rhom and Hass Company), Deep Fried™, Fortune®, Pulse, C. Daxoil™, Codacide 오일®, D-C. Tate™, Supamet 오일, Bond®, Penetrant, Glowelt® 및 Freeway, Citowett™, Fortune Plus™, Fortune Plus Lite, Fruimec, Fruimec lite, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 방향족 설폰산, 예를 들어, 리그닌설폰산, 페놀설폰산, 나프탈렌설폰산 및 디부틸나프탈렌설폰산, 및 지방산의 암모늄 염, 알킬 및 알킬아릴 설포네이트, 및 알킬, 라우릴 에테르 및 지방 알코올 설페이트, 및 황산화 헥사데칸올, 헵타데칸올, 및 옥타데칸올의 염, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 설폰화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데하이드의 축합 산물, 나프탈렌 또는 나프탈렌설폰산과 페놀 및 포름알데하이드의 축합 산물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸페놀, 에톡실화 옥틸페놀 및 에톡실화 노닐페놀, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴 폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올 에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 에톡실화 폴리옥시프로필렌 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세탈, 소르비탈 에스테르, 리그닌-설파이트 폐액 및 메틸 셀룰로스가 포함된다. 도입을 위해 선택되는 경우, 하나 이상의 농업용 계면활성제, 예컨대 Tween이 공지된 프로토콜에 따라 조성물에 바람직하게 포함된다.

수화제는 조성물에서 물의 표면 장력을 감소시키고 이에 따라 주어진 양의 조성물이 적용될 수 있는 표면적을 증가시킨다. 수화제의 예에는 비제한적으로 폴리아크릴산의 염, 리그노설폰산의 염, 페놀설폰산 또는 나프탈렌설폰산의 염, 에틸렌 옥사이드와 지방 알코올 또는 지방산 또는 지방 에스테르 또는 지방 아민의 다중 축합물, 치환 페놀(특히 알킬페놀 또는 아릴페놀), 설폰숙신산 에스테르의 염, 타우린 유도체(특히 알킬 타우레이트), 알코올의 인산 에스테르 또는 에틸렌 옥사이드와 페놀의 다중축합물의 인산 에스테르, 지방산과 폴리올의 에스테르, 또는 상기 화합물의 설페이트, 설포네이트 또는 포스페이트 기능성 유도체가 포함된다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물의 바람직한 적용 방법은 핸드건 또는 상업적 에어블라스트에 의해 희석 또는 농축 용액을 분사하는 것이다.

상술된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 살해충제, 살충제, 살진드기제, 살진균제 또는 살균제(이러한 살진균제 또는 살균제가 조성물에 존재하는 임의의 진균 또는 박테리아에 유해하거나 독성이 아닌 경우), 제초제, 항생제, 항미생물제, 항미생물제, 살선충제, 살설치류제, 곤충 병원체, 페로몬, 유인제, 식물 성장 조절제, 식물 호르몬, 곤충 성장 조절제, 화학소독제, 미생물 해충 제어제, 퇴치제, 바이러스, 식포작용 자극제, 식물 영양소, 식물 비료 및 생물학적 제어를 포함하는 하나 이상의 다른 농업용 제제와의 조합으로 이용될 수 있다. 다른 농업용 제제와의 조합으로 이용되는 경우, 2가지 제제의 투여는 개별적이거나, 동시적이거나, 순차적일 수 있다. 이러한 농업용 제제의 구체예는 당업자에게 공지되어 있으며, 다수가 쉽게 상업적으로 이용 가능하다.

식물 영양소의 예에는 비제한적으로 질소, 마그네슘, 칼슘, 붕소, 칼륨, 구리, 철, 인, 망간, 몰리브덴, 코발트, 붕소, 구리, 실리콘, 셀레늄, 니켈, 알루미늄, 크롬 및 아연이 포함된다.

항생제의 예에는 비제한적으로 옥시테트라사이클린 및 스트렙토마이신이 포함된다.

살진균제의 예에는 비제한적으로 다음 클래스의 살진균제: 카복사마이드, 벤즈이미다졸, 트리아졸, 하이드록시피리딘, 디카복사마이드, 페닐아마이드, 티아디아졸, 카바메이트, 시아노-옥심, 신남산 유도체, 모르폴린, 이미다졸, 베타-메톡시 아크릴레이트 및 피리딘/피리미딘이 포함된다.

살진균제의 추가 예에는 비제한적으로 천연 살진균제, 유기 살진균제, 황계 살진균제, 구리/칼슘 살진균제 및 식물 숙주 방어 유발제가 포함된다.

천연 살진균제의 예에는 비제한적으로 전유, 유장, 지방산 또는 에스테르화 지방산이 포함된다.

유기 살진균제의 예에는 비제한적으로 유기 인증 표준을 통과하는 임의의 살진균제, 예컨대 생물제어제, 천연 산물, 유발제(일부는 또한 천연 산물로 분류될 수 있음), 그리고 황 및 구리 살진균제(한정된 용도로 제한됨)가 포함된다.

황계 살진균제의 예는 Kumulus™ DF(BASF, Germany)이다.

구리 살진균제의 예는 Kocide^TM 2000 DF(Griffin Corporation, USA)이다.

유발제의 예에는 비제한적으로 키토산, Bion™, BABA(DL-3-아미노-n-부탄산, β-아미노부티르산) 및 Milsana™(Western Farm Service, Inc., USA)가 포함된다.

일부 구현예에서, 비-유기 살진균제가 채용될 수 있다. 비-유기 살진균제의 예에는 비제한적으로 Bravo™(표주박 상의 PM 제어를 위해); Supershield™(Yates, NZ) (장미 상의 보트리티스 및 PM 제어를 위해); Topas™ 200EW(포도 및 표주박 상의 PM 제어를 위해); Flint™(사과 및 표주박 상의 PM 제어를 위해); Amistar™ WG(곡류 상의 녹병 및 PM 제어를 위해); 및 Captan™, Dithane™, Euparen™, Rovral™, Scala™, Shirlan™, Switch™ 및 Teldor™(포도 상의 보트리티스 제어를 위해)가 포함된다.

살해충제의 예에는 비제한적으로 아족시스트로빈, 비테르타놀, 카복신, Cu₂O, 사이목사닐, 사이프로코나졸, 사이프로디닐, 디클로플루아미드, 디페노코나졸, 디니코나졸, 에폭시코나졸, 펜피클로닐, 플루디옥소닐, 플루퀴코나졸, 플루실라졸, 플루트리아폴, 푸랄락실, 구아자틴, 헥사코나졸, 하이멕사졸, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 입코나졸, 크레속심-메틸, 만코젭, 메탈락실, R-메탈락실, 메트코나졸, 옥사딕실, 페푸라조에이트, 펜코나졸, 펜사이쿠론, 프로클로라즈, 프로피코나졸, 피로퀼론, SSF-109, 스피록사민, 테부코나졸, 티아벤다졸, 톨리플루아미드, 트리아족사이드, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리플루미졸, 트리티코나졸 및 유니코나졸이 포함된다.

본원에 기재된 진균 균주 이외의 생물학적 제어제의 예는 울로클라디움 아우데만시이(Ulocladium oudemansii)를 포함하는 BotryZen™ 생물학적 제어제이다.

본 발명의 조성물은 광범위한 첨가제, 예컨대 활성 성분을 증강시키기 위해 이용되는 안정화제 및 침투제를 또한 포함할 수 있다. 첨가제에는 또한 장기 저장에서 안정성 유지를 보조하는 조성물, 예를 들어 비제련 옥수수 오일 및 외부에 오일 및 왁스 그리고 내부에 물, 나트륨 알기네이트 및 활성제의 혼합물을 함유하는 소위 반전 에멀젼이 포함될 수 있다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, 이용되는 임의의 첨가제가 생물학적 제어제의 효과를 방해하지 않는 양으로 존재하는 것이 중요하다.

조성물은 여러 형태로 제조될 수 있다. 하나의 조제물은 식물 또는 그 주변 상에 분진화될 수 있는 본 발명의 조성물의 분말화된 형태를 포함한다. 추가 형태에서, 조성물은 분사, 발포체, 겔 또는 딥을 형성하기 위해 물과 같은 희석제와 혼합되고 공지된 프로토콜을 이용해서 적절히 적용된다. 현재 바람직한 구현예에서, 상술된 바와 같이 제형화된 조성물은 1 ha 당 100 L, 대략 300 내지 약 2000 L 당 약 5 g 내지 약 350 g의 롤린 알칼로이드로 가압화된 분사장치를 이용해서 물과 혼합된다. 일반적으로, 조성물은 100 L 당 약 5 g 내지 약 170 g의 롤린 알칼로이드로 제형화된다.

실제로 임의의 공지된 당분야의 방법일 수 있는 다른 적용 방법, 예컨대 주입, 문지르기 또는 브러싱을 위해 제형화된 조성물이 또한 이용될 수 있다. 식물 주변 또는 환경, 예컨대 토양, 물에 대한, 또는 종자 코팅으로서의, 조성물의 간접적 적용이 고려된다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 조성물이 적용될 농도는 최종 용도, 식물의 생리 상태; 해충 감염의 유형(곤충 종 포함), 농도 및 정도; 온도, 계절, 습도, 식물의 성장기 단계 및 연령; 통상적인 살충제 또는 다른 치료(살진균제 포함)의 수 및 유형; 및 식물 치료(예컨대 잎 당김 및 전지)에 따라 변할 수 있다.

분진화, 살수, 토양 침지, 토양 주입, 종자 코팅, 묘목 코팅, 엽면 분사, 통기, 연무, 분무, 훈증, 에어로졸화 등을 포함하는 다른 적용 기법도 타당하며, 예를 들어 뿌리 또는 자루 만연을 유도하는 해충과 같은 특정 상황 하에, 또는 민감한 생장 또는 장식용 식물에 대한 적용을 위해 요구될 수 있다. 이들 적용 절차도 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 또한 영역에 대한 방지적 또는 예방적 적용을 위해 제형화될 수 있고, 특정 상황에서, 애완동물, 가축, 동물 잠자리에, 또는 농장 설비, 외양간, 거주지, 또는 농업적 또는 산업적 시설 등의 내에 및 주위에 적용될 수 있다.

환경, 전신, 국소, 또는 엽면 적용을 위해 이용되는 조성물의 농도는 특정 제형물의 성질, 적용 수단, 환경 조건, 및 활성 정도에 따라 폭넓게 변할 것이다.

상술된 살충 제형물은 필요에 따라 하나 이상의 적용에서 특정 식물 또는 표적 영역에 투여될 수 있고, 약 25 g의 활성제/헥타르 내지 약 500 g의 활성제/헥타르, 또는 대안적으로 약 500 g의 활성제/헥타르 내지 약 1000 g의 활성제/헥타르 수준 범위의 헥타르 당 전형적 현장 적용 비율이 이용될 수 있다. 약 25 g의 활성제/헥타르 내지 약 1,000 g의 활성제/헥타르 범위의 모든 적용 비율이 이러한 살충 제형물을 이용하는 표적 곤충 해충의 관리, 제어, 및 사멸에서 유용한 것으로 고려된다. 이와 같이, 약 100 g/헥타르, 약 125 g/헥타르, 약 150 g/헥타르, 약 200 g/헥타르, 약 250 g/헥타르, 약 300 g/헥타르, 약 350 g/헥타르, 약 400 g/헥타르, 약 450 g/헥타르, 약 500 g/헥타르, 약 600 g/헥타르, 약 700 g/헥타르, 약 800 g/헥타르, 약 900 g/헥타르, 또는 약 1 kg/헥타르 또는 그 초과 비율의 활성제가 본원에서 상술된 살해충 제형물의 특정한 농업, 산업, 및 가정 적용에서 이용될 수 있다. 일반적으로, 약 100 g 내지 약 500 g의 활성제/헥타르의 적용 비율이 표적화된다.

액체 조성물에 대한 대표적인 적용 비율에는 약 50 mL의 활성제/헥타르 내지 약 20 L의 활성제/헥타르 범위의 적용 비율이 포함됨이 고려된다. 이와 같이, 약 100 mL/헥타르, 약 200 mL/헥타르, 약 300 mL/헥타르, 약 400 mL/헥타르, 약 500 mL/헥타르, 약 600 mL/헥타르, 약 700 mL/헥타르, 약 800 mL/헥타르, 약 900 mL/헥타르, 약 1 L/헥타르, 약 1.1 L/헥타르, 약 1.2 L/헥타르, 약 1.3 L/헥타르, 약 1.4 L/헥타르, 약 1.5 L/헥타르, 약 1.6 L/헥타르, 약 1.7 L/헥타르, 약 1.8 L/헥타르, 약 1.9 L/헥타르, 약 2.0 L/헥타르, 약 2.5 L/헥타르, 약 3.0 L/헥타르, 약 3.5 L/헥타르, 약 4.0 L/헥타르, 또는 약 4.5 L/헥타르 또는 그 초과 비율의 활성제가 이용될 수 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 해충의 제어 방법으로서, 본원에 기재되는 본 발명의 조성물을 식물 또는 그 주변에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

어린 묘목은 전형적으로 해충으로부터의 손상에 가장 취약하다. 따라서, 출현 전에, 새로 식재된 작물에 대한 본 발명의 조성물의 적용이 출현 시 적용과 마찬가지로 고려된다.

작물 사이클에서 동일하거나 상이한 시점에서의 반복 적용이 또한 고려된다. 본 발명의 조성물은 계절에서 조기에 또는 후기에 적용될 수 있다. 이는 개화에 걸쳐 또는 성과 동안일 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수확 직전에, 또는 수확 후, 예를 들어 해충 집락을 방지하기 위해 신속히 집락하는 괴사성 또는 노화성 잎, 과일, 줄기, 기계 수확 자루 등에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 동면 조직 상에서 해충 성장을 늦추고, 성장 증강을 제공하기 위해, 겨울에 동면 식물에 적용될 수 있다.

적용은 발아 이전 또는 이후 및 수확 이전 및 이후 시점일 수 있다. 그러나, 치료는 바람직하게는 개화 및 수확 사이에 일어난다. 유효성을 증가시키기 위해, 본 발명의 조성물의 다회 적용(예를 들어, 개화부터 성과까지의 단계에 걸쳐 2 내지 6회 적용)이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 재적용은 강우 후에 또한 고려되어야 한다. 해충 감염성 예측 모델 또는 감염 분석 데이터를 이용해서, 또한 해충 감염 위험기에 대해 대처하기 위해 BCA를 적용할 시점일 수 있다.

다양한 예시적 구현예에서, 본 발명의 롤린 알칼로이드 및 이러한 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물은 이들이 유효성, 예컨대 살해충 유효성을 달성할 수 있는 투여량 비율로 적용되는 식물 또는 식물 주변에 유해하지 않다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 용액 중에, 예를 들어 상술된 바와 같이, 가압된 분사장치를 이용해서 적용된다. 식물 부분은 이상적으로는 철저한 커버를 보장하기 위해, 떨어지기 직전에 가볍게 분사되어야 한다. 식물 및/또는 그 주변의 임의 부분으로, 예를 들어 전체 식물 캐노피로, 꽃 및 발달 중인 과일이 집중된 캐노피 내 영역으로, 또는 식물 줄기 및/또는 뿌리, 덩이줄기 등의 근처 또는 주변의 토양, 물 또는 성장 배지로 적용될 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 식물병원성 곤충을 제어하기 위해 이용된다. 식물병원성 곤충은 식물 부분을 공격하고 성장 속도, 개화, 성과, 생산을 감소시키는 여러 수확-전 및 수확-후 질환에 관여되며 이환 식물의 사망을 유도할 수 있다. 본원에서 이용되는 식물병원성 곤충에는 자체가 식물 병원체인 곤충, 및 다른 식물 병원체, 예를 들어, 식물병원성 진균 및 박테리아에 대한 벡터로서 작용할 수 있는 곤충이 포함된다. 다른 식물병원체에 대한 벡터로서 작용하는 숙주 곤충의 제어에 의해, 식물 질환의 발생률 및/또는 중증도가 최소화될 수 있음이 이해될 것이다.

뉴질랜드에서 키우는 여러 중요 원예 작물에 피해를 주는 주요 식물병원성 곤충의 예가 아래에 제시된다.

주요 곤충 해충

본 발명의 방법은 특히 수확-전 또는 수확-후, 식물 및 식물 산물에 대해 적용된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 과일, 야채, 꽃가지 및 종자를 포함하는 상기 기재된 유형의 저장 산물에 적용될 수 있다. 적합한 적용 기법은 상기 확인된 것들, 특히 분사를 포괄한다.

본 발명의 조성물은 잠재적으로 식물에 대한 직접 적용과 배치되어, 토양 또는 종자를 처리하거나 사전 처리하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 식물 가공 재료, 예컨대 보호 코팅, 상자 및 포장물에서의 용도를 갖는다.

또한 본 발명의 조성물로 직접 처리된 식물, 식물 산물, 토양 및 종자가 본 발명에 포괄된다.

약학적 및 수의학적 용도

본 발명은 인간 또는 동물 대상체에서 해충, 기생충 또는 곤충 감염의 치료 또는 방지 방법으로서, 본 발명의 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

해충, 기생충 또는 곤충 감염은 임의의 인간 또는 비-인간 동물 체내기생충 또는 체외기생충으로의 감염 또는 만연을 포함할 수 있다.

외부 기생충 또는 체외기생충에는 비제한적으로 빈대, 벼룩, 파리, 각다귀, 진드기, 이, 및 응애, 예컨대 보비콜라 오비스(Bovicola ovis)(양 이); 보비콜라 보비스(Bovicola bovis); 해마토피너스 유리스테르누스(Haematopinus eurysternus)(짧은-코 소 이); 하이포더마(Hypoderma) spp.; 해마토비아 이리탄스 엑시구아(Haematobia irritans exigua); 크테노세팔리데스(Ctenocephalides) spp, 예컨대 크테노세팔리데스 펠리스(Ctenocephalides felis)(고양이 벼룩) 및 크테노세팔리데스 카니스(Ctenocephalides canis)(개 벼룩), 코클리오미아(Cochliomyia) spp.; 크리소미아(Chrysomya) spp.; 리노그나투스 비툴리(Linognathus vituli)(긴-코 소 이); 페디쿨러스 휴마누스 카피티스(Pediculus humanus capitis)(인간 머릿니), 페디쿨러스 휴마누스 휴마누스(Pediculus humanus humanus)(인간 몸 이), 프티루스 푸비스(Pthirus pubis)(게 이), 풀렉스 이리탄스(Pulex irritans)(인간 벼룩), 솔레노포테스 카필라투스( Solenopotes capillatus)(결절-보유 이); 사르콥테스(Sarcoptes) spp.(옴 응애), 예컨대 사르콥테스 스카비에이 캄스(Sarcoptes scabiei cams), 사르콥테스 스카비에이 수이스(Sarcoptes scabiei suis), 사르콥테스 스카비에이 보비스(Sarcoptes scabiei bovis), 사르콥테스 스카비에이 변종 휴마니(Sarcoptes scabiei var. humani); 프소로프테스(Psoroptes) spp., 예컨대 프소로프테스 오비스(Psoroptes ovis) 및 더마토프고이데스(Dermatophgoides) spp.; 부필러스 마이크로필러스(Boophilus microplus); 및 다말리니아보비스(Damaliniabovis)가 포함된다.

내부 기생충 또는 체내기생충에는 비제한적으로 원생동물 기생충, 예컨대 플라스모디움(Plasmodium) spp.; 트립파노소마(Trypanosoma) spp. 및 에이메리아(Eimeria) spp., 및 기생충 벌레(연충)가 포함된다. 연충에는 비제한적으로 촌충(와충), 선충(회충), 및 흡충, 예컨대 트리코스트롱길로이데아(Trichostrongyloidea), 예컨대 해몬쿠스 콘토르투스(Haemonchus contortus); 트리코스트롱길러스(Trichostrongylus) spp.; 딕티오카울러스(Dictyocaulus) spp.; 아스카리도이데아(Ascaridoidea), 예컨대 톡소카라(Toxocara) spp.; 스트롱길러스(Strongylus) spp.; 필라리오이데아(Filarioidea), 예컨대 디로필라리아임미티스(Dirofilariaimmitis) 및 온코세르카(Onchocerca) spp: 트레마토다(Trematoda), 예컨대 파시올라헤파티카(Fasciolahepatica) 및 스키스토소마(Schistosoma) spp.; 태니아(Taenia) spp.; 및 모니에지아(Moniezia) spp.; 오스테르타기아(Ostertagia) spp.; 네마토디루스(Nematodirus) spp.; 쿠페리아(Cooperia) spp.; 부노스토뭄(Bunostomum) spp.; 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum) spp.; 샤베르티아(Chabertia) spp, 트리쿠리스(Trichuris) spp.; 트리코네마(Trichonema) spp.; 카필라리아(Capillaria) spp.; 헤테라키스(Heterakis) spp.; 톡소카라(Toxocara) spp.;, 옥시우리스(Oxyuris) spp.; 안실로스토마(Ancylostoma) spp.; 운시나리아(Uncinaria) spp.; 톡사스카리스(Toxascaris) spp.; 및 파라스카리스(Parascaris) spp.가 포함된다.

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 의도되는 투여 경로 및 표준 약학적 또는 수의학적 관례에 대해 선택되는 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제와의 혼합물로 투여될 수 있다.

"약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 비제한적으로 본 발명의 조성물의 성분으로서 대상체에 투여될 수 있는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 담체를 나타내려는 것이다. 바람직한 담체는 본 발명의 방법에 의해 제조되는 조성물의 유효량을 전달하기에 충분한 용량으로 투여되는 경우 이의, 또는 투여되는 경우 다른 살해충제의 조성물의 활성을 감소시키지 않고 독성이 아니다.

본 발명의 조성물은 국소적으로, 경구로 또는 비경구로 투여될 수 있다.

예를 들어, 조성물은 설하를 포함하는 경구로, 예를 들어, 결장 또는 십이지장에서 용해되도록 제형화된 캡슐, 정제, 엘릭서, 용액, 현탁액, 또는 볼루스 형태로 투여될 수 있다. 제형물은 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스 또는 풍미제 또는 착색제를 포함할 수 있다.

조성물은 비경구로, 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 선택적으로 다른 성분, 예컨대 염 또는 글루코스를 포함하는 멸균 수용액 또는 현탁액 중에 제형화될 수 있다.

조성물은 국소로, 멸균 크림, 겔, 푸어-온 또는 스팟-온 제형물, 현탁액, 로션, 연고, 분진화 분말, 분사, 약물-도입 드레싱, 샴푸, 칼라 또는 피부 패치의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 또는 액체 파라핀의 수성 또는 유성 에멀젼을 포함하는 크림; 백색 왁스 연질 파라핀 기재를 포함하는 연고; 셀룰로스 또는 폴리아크릴레이트 유도체 또는 다른 적합한 점도 개질제를 포함하는 하이드로겔; 건조 분말; 액체 분사; 부탄, 프로판, HFA, 또는 CFC 추진제를 포함하는 에어로졸; 백색 연질 파라핀 또는 폴리에틸렌 글리콜 함침 거즈 드레싱 또는 하이드로겔, 하이드로콜로이드, 또는 알기네이트 필름 드레싱을 포함하는 드레싱, 예컨대 튈 드레싱 내로 포함될 수 있다. 조성물은 또한 적절한 완충액, 점도 개질제(예를 들어, 셀룰로스 유도체), 및 보존제(예를 들어, 벤잘코늄 클로라이드)를 포함하는 점안제로서 안내 투여될 수 있다.

푸어-온 또는 스팟-온 제형물은 활성 성분을 허용 가능한 액체 담체 비히클, 예컨대 부틸 디골, 액체 파라핀 또는 비-휘발성 에스테르 중에 휘발성 성분, 예컨대 이소프로판올을 첨가하고 또는 첨가하지 않고 용해시켜 제조될 수 있다. 제형물은 침투 증강제, 예컨대 테르펜, 용매, 예컨대 지방산 에스테르, 트리글리세라이드, 글리세롤 에스테르, 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 제형물은 직접 적용에 적합한 형태 또는 적용 전에 적합한 양의 물 또는 다른 희석제를 이용한 희석을 필요로 하는 농축물의 형태일 수 있다. 푸어-온, 스팟-온 또는 분사 제형물은 캡슐화에 의해 동물의 표면 상에 활성제 잔류물을 남기도록 제조될 수 있다.

경구 투여를 위해, 본 발명의 조성물을 추가로 붕해제 및/또는 결합제, 예컨대 전분, 락토스, 활석, 또는 마그네슘 스테아레이트를 함유하는 적합하게 미분된 희석제 또는 담체와 혼합하여 캡슐, 볼루스, 또는 정제가 제조될 수 있다. 물약 제형물은 활성 성분을 분산제 또는 수화제와 함께 수용액 중 분산시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 예를 들어, 사료 또는 수중 조성물 또는 제형물을 용해, 현탁, 또는 분산시켜 동물 사료 또는 동물 음용수와 함께 투여될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 주사제 제형물이 멸균 용액 또는 에멀젼의 형태로 제조될 수 있다.

조성물은 활성 스펙트럼을 넓히기 위해 또는 내성 축적을 방지하기 위해, 다른 항기생충제와 함께 이용될 수 있다. 다른 적합한 항-기생충제의 예에는 매크로사이클계 락톤, 예컨대 에버멕틴 및 밀베마이신, 예컨대 아바멕틴, 사이덱틴, 도라멕틴, 에프리노멕틴, 목시덱틴, 이베르멕틴, 및 밀베마이신; 벤즈이미다졸, 예컨대 알벤다졸, 캄벤다졸, 펜벤다졸, 플루벤다졸, 메벤다졸, 옥스펜다졸, 파르벤다졸, 및 옥시벤다졸; 프로-벤즈이미다졸, 예컨대 페반텔, 티오파네이트, 및 네토비민; 살리실아닐라이드, 예컨대, 클로산텔 및 니클로스아마이드; 이미다조티아졸, 예컨대 부타미솔, 메트로니다졸, 티니다졸, 레바미졸, 파이란텔 파모에이트, 또는 테트라미솔; 테트라하이드로피리미딘, 예컨대 모란텔; 및 헥사하이드로피라지노이소퀴놀린, 예컨대 프라지콴텔이 포함된다. 조성물은 다른 항기생충제와 개별적으로, 동시적으로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

당업자는 기생충 감염된 동물의 치료를 위한 적절한 투여량 및 투여 빈도를 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

정확한 투여량은 투여 빈도 및 방식, 치료되는 동물의 성별, 연령, 체중 및 일반 상태, 치료되는 상태의 성질 및 중증도 그리고 치료될 임의의 동반 질환 및 당업자에게 자명한 다른 요인에 의존할 것이다.

본 발명은 상기 내용으로 구성되며, 또한 하기 구성이 단지 예를 제공하고 결코 이의 범위를 제한하지 않으려는 것이다.

실시예

실시예 1

본 실시예는 상이한 용매 조합을 이용하는 식물 재료로부터의 롤린 추출의 효율을 연구한다.

1 g의 제분 풀 종자 분말을 15분 동안 9 ml의 상이한 용매 조합으로 추출하였다. 이어서 추출 샘플을 원심분리하고, LC MS/MS에 의해 롤린 함량에 대해 분석하였다. 간략하게, 샘플을 0.1% 암모늄 하이드록사이드 용액으로 적절한 교정 범위 내로 희석하고 0.1% 암모늄 하이드록사이드 용액으로부터 아세토니트릴까지의 구배로 수행하는 Acquity UPLC BEH 페닐 1.0x50 mm, 1.7 ㎛ 칼럼 상에서 분리하였다. 용출 분획을 MS/MS로 분석하여 공지된 표준물질과의 비교에 의해 롤린 함량을 확인하고 정량하였다.

[표 1] 상이한 용매 조합을 이용한 종자 g 당 추출된 롤린(㎍)의 양

아세트산으로 산성화된 물을 이용한 추출이 표 1에 나타낸 바와 같이 종자 g 당 가장 높은 롤린 수율을 생성하였다. 유기 용매를 이용한 추출은 산을 이용한 것보다 염기가 첨가된 것이 더 효율적인 것으로 나타났다.

본 실시예는 본 발명의 방법에서 산성화된 물 및 다른 수성 용매를 이용하여 식물 재료로부터 롤린 알칼로이드의 효과적인 추출을 나타낸다.

실시예 2

본 실시예는 상이한 용매를 이용하는 식물 재료로부터의 롤린 추출을 연구한다.

풀 종자를 미세 분말로 제분하였다. 1 g의 샘플을 초음파 처리로 15분 동안 9 ml의 상이한 용매(하기 표 2 참고)로 추출하였다. 이어서 추출 샘플을 원심분리하고, LC MS/MS에 의해 롤린 함량에 대해 분석하였다. 간략하게, 샘플을 0.1% 암모늄 하이드록사이드 용액으로 적절한 교정 범위 내로 희석하고 0.1% 암모늄 하이드록사이드 용액으로부터 아세토니트릴까지의 구배로 수행하는 Acquity UPLC BEH 페닐 1.0x50 mm, 1.7 ㎛ 칼럼 상에서 분리하였다. 용출 분획을 MS/MS로 분석하여 공지된 표준물질과의 비교에 의해 롤린 함량을 확인하고 정량하였다.

[표 2] 상이한 용매를 이용한 종자 g 당 추출된 롤린(㎍)의 양

본 실시예에서, 알칼리성 수성 용매(암모니아가 첨가된 물)를 이용한 추출이 표 2에 나타낸 바와 같이 종자 g 당 가장 높은 전체 롤린 수율을 생성하였으며, 또한 측정된 각각의 특정한 롤린 알칼로이드의 최고 수율을 일으켰다. 유기 용매를 이용한 추출은 산을 이용한 것보다 염기가 첨가된 것이 더 효율적으로 나타났다.

본 실시예는 알칼리성 용매, 특히 알칼리성 수성 용매, 예컨대 염기성화된 물을 이용하는 식물 재료로부터의 롤린 알칼로이드의 효과적인 추출을 나타낸다.

실시예 3

본 실시예는 식물 재료로부터의 추출물로부터 롤린 알칼로이드의 정제를 위한 크로마토그래피 분리의 이용을 연구한다.

100 g의 J219 종자를 제분하고 10분 동안 900 ml의 물과 함께 끓였다. 냉각 후, 혼합물을 원심분리하고 상청액을 경사분리하였다. 수득되는 액체 추출물의 전체 부피는 750 ml였고 이를 3.7 ml의 진한 암모니아의 첨가에 의해 염기성화하였다.

25 g의 Strata-X 역상 크로마토그래피 칼럼을 메탄올에 이어 수중 0.5% 진한 암모니아로 세척하였다. 수득된 750 ml 액체 추출물의 300 ml 분취물을 칼럼 상으로 로딩하였다. 일단 모든 추출물이 로딩되면, 칼럼을 200 ml의 0.5% 진한 암모니아로 세척하였다. 이어서 롤린을 4×50 ml의 MeOH/0.5% 암모니아(50:50 v/v)로 용출하였다.

추출물 및 용출 분획의 롤린 함량을 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 칼럼에 적용되는 추출물은 총 198 mg의 롤린 알칼로이드를 포함하였다. 로딩 및 세척 분획에서 대략 1 mg의 손실을 가정하면, 총 192 mg이 용출 분획에서 확인되어, 97% 회수를 나타낸다.

본 실시예는 역상 크로마토그래피에 의해 분리된 종자 추출물로부터의 롤린 알칼로이드의 효과적인 회수를 나타낸다.

실시예 4

본 실시예는 추출물 중 롤린의 정제를 위한 탄소원 및 후속 용매 추출을 이용하는 분리의 유효성을 연구한다.

조정제 추출물 1 리터 당 5 ml의 진한 암모니아를 첨가하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 동일한 조정제 액체 추출물을 이용하여 소규모 실험을 수행하였다. 탄소(Darco ^® 활성탄 100 메쉬)를 액체 추출물에 첨가하였다(액체/탄소 비 10/1). 추출물 중 99%의 롤린이 탄소에 흡착되었다.

후속 실험에서, 1 g 또는 1.5 g의 탄소를 50 ml의 추출물에 첨가하였다. 각각 1 g 및 1.5 g의 샘플에 대해 60% 및 93%의 롤린 흡착이 달성되었다.

1.5 g 샘플에 대해 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 경사분리하고, 추가 0.5% 진한 암모니아를 첨가하고, 혼합하고, 원심분리하고, 상청액을 경사분리하였다. 물 분획을 분석하였고, 원래 존재하는 롤린의 3%만을 함유하였다.

상기 절차를 1.5 g의 탄소로 2회 더 반복하여, 탄소 상에 로딩된 3개의 유사한 롤린 샘플을 산출하였다. 탄소 상으로의 롤린 흡착 후, 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴을 이용하여 롤린의 탄소 샘플을 추출하였다. 추출물의 건조 중량에 대한 비교에 의한 추출 수율 및 순도를 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 결정하였다.

[표 3] 액체 종자 추출물로부터 수득되는 롤린의 수율 및 순도에 대한 추출 용매의 효과

아세토니트릴을 이용한 추출은 액체 종자 추출물로부터 수득된 롤린의 가장 높은 수율 및 순도를 생성하였고, 45% 순도로 77%의 롤린이 추출되었다(상기 표 3 참고).

본 실시예는 탄소가 롤린을 효과적으로 흡착하며 효과적인 부분 정제 단계로서 이용될 수 있음을 나타낸다. 본 실시예는 추가적인 부분 정제 단계로서의 용매 추출의 유효성을 추가로 나타낸다.

실시예 5

본 실시예는 전체 종자의 대규모 추출 타당성을 평가하고 이러한 공정으로부터 단리된 롤린의 순도를 연구한다.

200 g의 풀 종자를 30분 동안 1.8 L의 수중에서 끓였다. 혼합물을 냉각하고, 조정제 필터를 통해 여과하였다. 탄소(2% w/v)를 액체 추출물과 혼합하였다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 경사분리하였다. 탄소 펠렛을 추가 1 L의 물로 세척하고 혼합물을 원심분리하였다. 이어서 상청액을 상기와 같이 경사분리하였다.

탄소 펠렛을 1 L 아세토니트릴과 혼합하고 혼합물을 원심분리하였다. 롤린을 함유하는 상청액을 경사분리하고 건조하였다. 상기 추출 절차를 200 g 풀 종자의 20개 배치 상에서 수행하였다.

아세토니트릴 추출로부터 수득된 조합 잔여물을 수중에 취하고 여과하여 탄소 미세물질을 제거하였다. 액체의 전체 부피는 약 90 ml였고 10 ml의 에탄올을 여기에 첨가하여 박테리아 성장을 방지하였다. 샘플 분석은 이것이 9.0% 롤린을 함유함을 나타내었다.

본 실시예는 롤린이 본 발명의 방법을 이용하여 전체 종자로부터 효과적으로 추출되고 정제됨을 나타낸다.

실시예 6

본 실시예는 본원에 기재된 방법을 이용하여 전체 종자로부터 롤린 알칼로이드의 추출을 연구한다.

1 g의 전체 풀 종자를 10, 20 또는 30분 동안 수용액(물, 0.5% 암모니아 또는 0.5% 아세트산) 중에 끓였다. 샘플을 원심분리하고 추출물의 롤린 함량을 결정하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

롤린을 평가된 모든 수용액 중 전체 종자로부터 추출하였다. 롤린 알칼로이드의 수율은 물 또는 0.5% 아세트산을 이용한 것보다 0.5% 암모니아를 이용하여 추출된 샘플에서 모든 시점에 유의미하게 더 컸다.

본 실시예는 전체 종자로부터 롤린 알칼로이드의 효율적인, 고수율 추출을 나타낸다.

[표 4] 상이한 수용액 중 전체 종자로부터 추출된 롤린 알칼로이드의 수율.

실시예 7

본 실시예는 본원에 기재된 방법을 이용하여 식물 재료로부터 롤린 알칼로이드의 추출을 연구한다.

볏과 목초 풀을 절단 표면으로 도리깨를 가지고 제분 재료가 통과할 수 있도록 20 mm 메쉬 플레이트가 장착된 Rover 장치(모델 98117; 4.1 kW)를 이용하여 제분하였다. 생성된 제분 풀을 매트처럼 함께 유지하였다. 1 kg의 초본을 표 5에 기재된 조건 하에 10 kg 수중에 추출하였다. 추출물의 롤린 함량을 실시예 1에 대해 상술된 바와 같이 결정하였다.

50℃ 내지 95℃ 범위의 추출 온도를 연구하였다(표 5에서의 샘플 1~6). 전체 롤린의 최대량을 도 1 및 표 6에 나타낸 바와 같이 70℃의 온도에서 추출하였다. 추출이 중성 pH(샘플 1 및 3)에 비해 pH 11(샘플 2 및 4)에서 수행된 경우 롤린 수율에서는 차이가 관찰되지 않았다.

[표 5] 추출 조건

[표 6] 다양한 추출 온도에서 제분 풀로부터 추출된 전체 롤린 알칼로이드

경시적으로 70℃의 추출 온도에서 롤린 추출 효율의 추가 연구를 수행하였다(샘플 7~10). 16 또는 24시간에 걸쳐 다양한 시점에 샘플링을 수행하였다. 도 2는 시간 경과의 최초 단계 동안 샘플 7 및 8로 수득된 데이터(표 5)를 나타낸다. 추출물의 전체 롤린 농도는 도 2에 나타낸 바와 같은 추출 기간에 걸쳐 약간 감소하였다. 시간 경과에 걸쳐 NFL 농도는 감소하였고 롤린 농도는 증가하였다(데이터는 나타내지 않음).

롤린 추출의 시간 경과를 미제분 볏과 목초 풀로 24시간에 걸쳐 수행하였고, 최적 추출 시간을 확인하기 위해 다양한 시점에 샘플링을 수행하였다. 추출 방법이 볏과 목초로부터 롤린의 회수를 개선하였는지를 확인하기 위해, 2가지 방법, 회분식(수침, 샘플 9) 및 패킹된 층(순환, 샘플 10)을 미제분 풀 상에서 수행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이 미제분 풀을 이용하는 추출 방법 간에는 롤린 농도의 유의미한 차이가 없었다.

미제분 풀 대비 제분 풀로부터 수침 방법 추출을 이용하는 롤린 추출을 직접 비교하였다(샘플 11 및 12). 제분 풀로부터의 롤린 추출은 도 4에 나타낸 바와 같이 미제분 풀에 비해 더 신속하게 일어났다. 더 초기 시점에(0~120분), 유의미하게 더 높은 농도의 전체 롤린이 제분된 풀 추출물에서 관찰되었다.

본 실시예는 본원에 기재된 방법을 이용하여 식물 재료로부터 롤린 알칼로이드의 추출을 나타낸다. 본 실시예는 수침 또는 패킹된 층 추출을 이용하여 그리고 제분 또는 미제분 풀을 이용하여 효율적인 추출이 본원에 기재된 방법을 이용하여 달성될 수 있음을 추가로 나타낸다.

상기 기재로부터 자명할 바와 같이, 본 발명은 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법 및 이러한 조성물의 용도를 제공한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 광범위한 농업적, 원예적, 의학적 및 수의학적 적용에서 유용성을 갖는다, 예컨대 식물 해충의 유용한 제어 수단을 원예자에게 제공하며, 인간 또는 비-인간 동물에서 곤충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지를 위한 치료법을 제공한다.

Claims

하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
a) 적어도 하나의 내생 식물로 감염되거나 되었던 식물로부터 유도되는 식물 재료를 제공하는 단계,
b) 식물 재료 및 수용액을 혼합하는 단계,
c) 적어도 약 15분의 기간 동안 적어도 약 50℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드 화합물을 포함하는 추출물을 제공하는 단계,
d) 추출물을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하는 단계를 포함하여,
하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 형성하는 방법.
하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
a) 하나 이상의 내생 식물로 감염되거나 되었던 식물로부터 유도되는 전체 종자를 제공하는 단계,
b) 종자 및 수용액을 혼합하는 단계,
c) 적어도 약 50℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 추출물을 제공하는 단계,
d) 추출물/상청액을 회수하고, 선택적으로 추출물을 추가 정제하는 단계를 포함하여,
하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
적어도 일부 식물 재료가 제분되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
혼합물이 약 1시간 내지 약 6시간 동안 유지되는 방법.
제3항에 있어서,
방법이
a) 적어도 하나의 내생 식물로 감염되거나 되었던 식물로부터 유도되는 제분 식물 재료를 제공하는 단계,
b) 제분 식물 재료 및 수용액을 혼합하는 단계,
c) 적어도 약 15분의 기간 동안 적어도 약 50℃의 온도에서 혼합물을 유지하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드 화합물을 포함하는 추출물을 제공하는 단계,
d) 추출물을 여과하여 여액을 제공하는 단계,
e) 여액의 pH를 7 초과의 pH까지 조정하는 단계,
f) pH-조정된 여액을 적어도 7의 pH에서 하나 이상의 롤린 알칼로이드에 결합할 수 있는 크로마토그래피 정지상과 접촉시키는 단계,
g) 크로마토그래피 정지상과 유기 용매를 접촉시켜 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 용출하는 단계, 및
h) 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 용출액을 회수하여 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
수용액이 적어도 7의 pH를 갖는 방법.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제분 식물 재료가 종자를 포함하지 않는 방법.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제분 식물 재료가 제분 종자를 포함하지 않는 방법.
제3항에 있어서,
제분 식물 재료가 제분 종자이거나 이를 포함하며,
a) 제분 식물 재료가 적어도 약 90℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나,
b) 혼합물이 적어도 약 15분의 기간 동안 적어도 약 90℃의 온도에서 유지되거나,
c) 상기 a) 및 b) 둘 다인 방법.
제3항에 있어서,
제분 식물 재료가 제분 종자이거나 이를 포함하며,
a) 제분 식물 재료가 약 95℃ 내지 약 98℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나,
b) 혼합물이 적어도 약 15분의 기간 동안 약 95℃ 내지 약 98℃의 온도에서 유지되거나,
c) 상기 a) 및 b) 둘 다인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
롤린 알칼로이드가 화학식 I의 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 방법:
[화학식 I]

식에서,
R = H 또는 CH₃이고
R' = H, CH₃, CHO, COCH₃이다.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 롤린 알칼로이드가 롤린, N-아세틸롤린(NAL), N-포르밀롤린(NFL), N-아세틸노르롤린(NANL), 및 N-메틸롤린(NML)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
종자 또는 식물 재료가 페스투카(Festuca) 속으로부터 유도되는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
수용액이 물을 포함하며 7 초과의 pH를 갖는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
수용액이 물을 포함하며 적어도 약 7 내지 약 9의 pH를 갖는 방법.
제2항에 있어서,
종자가 적어도 약 65℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나, 혼합물이 적어도 약 65℃의 온도에서 유지되거나, 또는 둘 다인 방법.
제16항에 있어서,
종자가 적어도 약 70℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나, 혼합물이 적어도 약 70℃의 온도에서 유지되거나, 또는 둘 다인 방법.
제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
제분 식물 재료가 적어도 약 60℃의 온도를 갖는 수용액 또는 물과 혼합되거나, 혼합물이 적어도 약 60℃의 온도에서 유지되거나, 또는 둘 다인 방법.
제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제15항, 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
혼합물이 적어도 약 65℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 80℃ 또는 적어도 약 90℃의 온도에서 유지되는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
추출물이 하나 이상의 적어도 부분적 정제 단계를 거치는 방법.
제20항에 있어서,
추출물이 여과되어 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하는 여액을 제공하는 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서,
적어도 부분적인 정제가 정지상이 하나 이상의 롤린 알칼로이드에 결합할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 추출물 또는 여액을 하나 이상의 크로마토그래피 정지상과 접촉시키는 단계, 정지상에 결합된 하나 이상의 롤린 알칼로이드로부터 하나 이상의 오염물질을 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계, 또는 정지상에 결합된 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 크로마토그래피에 의해 농축하는 단계, 및 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
제22항에 있어서,
정지상이 역상 크로마토그래피 정지상인 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서,
정지상이 스티렌-디비닐벤젠 중합체 수지를 포함하는 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 롤린 알칼로이드의 회수가 유기 용매를 이용한 용출에 의하는 방법.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
추출물 또는 여액의 pH는 추출물이 정지상과 접촉되기 전에 적어도 약 pH 9의 pH까지 조정되는 방법.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
추출물 또는 여액과 하나 이상의 크로마토그래피 정지상을 7 초과의 pH에서 접촉시키는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 하나 이상의 롤린 알칼로이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 조성물 또는 추출물.
해충 집단의 제어 방법으로서, 집단을 제28항의 조성물 또는 추출물의 살해충 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
식물의 성장 또는 번식의 증강 방법으로서, 식물을 제28항의 조성물 또는 추출물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
이를 필요로 하는 대상체에서 해충, 기생충 또는 곤충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지 방법으로서, 대상체가 인간 또는 비-인간 동물 대상체이고, 대상체에 제28항의 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
해충, 기생충 또는 곤충 감염 또는 만연의 치료 또는 방지용 조성물 또는 약제의 제조에서, 제28항의 조성물의 용도.
제28항의 조성물 및 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 약학적 또는 수의학적 제형물.