KR20170089014A

KR20170089014A - 서열 변이체

Info

Publication number: KR20170089014A
Application number: KR1020177019784A
Authority: KR
Inventors: 요한 홀츠만; 미카엘 푹스; 클레멘스 아흐뮐러; 한스외르크 톨
Original assignee: 산도즈 아게
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-08-02
Also published as: HRP20170589T2; LT3237612T; LT3037530T; HRP20201992T1; SI3037530T1; HUE032749T2; SI3237612T1; HUE053256T2; WO2016102372A1; CN108064299A; US10711276B2; CA2968486A1; EP3037530A1; US20170342422A1; KR102471368B1; EP3037530B1; HRP20170589T1; EP3237612A1; EP3237612B1

Abstract

전사 및/또는 번역 동안 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 코돈 내에서의 하나 이상의 염기 미스매치로부터 초래되어, 발현된 폴리펩티드와 혼합된 저농도 서열 변이체에서 아미노산 잔기 오혼입이 필수적으로 발견된다. 본 발명은 적어도 하나의 코돈이 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 공지된 코딩 서열과 상이한 미지의 코딩 서열을 역조작하는데 사용될 수 있다. 추가로 이러한 방법은 발현된 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 변경시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 조작하는데 유용하다.

Description

서열 변이체{SEQUENCE VARIANTS}

발명의 분야

본 발명은 적어도 하나의 코돈이 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 공지된 코딩 서열과 상이한 제2의 미지의 코딩 서열의 적어도 하나의 코돈을 역조작하는데 사용될 수 있다. 추가로 본 발명의 방법은 발현된 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 변경시키는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 조작하는 방법을 또한 포함한다.

배경

다양한 상태의 치료에서 단백질 치료제가 점점 더 통상적이다. 이러한 제품들이 안전하고, 재현가능하며, 환자에서 효과적이기 위해, 소정의 폴리뉴클레오티드 서열이 "정확한" 아미노산 폴리펩티드 생성물로 높은 정확도로 전사 및 번역되어 높은 균질성의 생성물이 산출되는 것이 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 효모, 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하는 임의의 발현 시스템 또는 숙주 세포에서의 인간 단백질의 제약 생산에서 중요하다.

발현에 사용된 폴리뉴클레오티드의 각각의 코딩 영역에 의해 코딩되는 것과 상이한 아미노산 1차 서열을 갖는 낮은 존재비(abundance)의 단백질 서열 변이체가 본질적으로 모든 발현된 단백질에서 발견되고, 단백질 치료제 내의 제품-의존적 불순물의 원인이 될 수 있다. 이러한 낮은 존재비의 서열 변이체는 전사 및/또는 번역 동안의 뉴클레오티드 미스매치로 인한 아미노산 잔기 오혼입의 결과이다. 전사 및/또는 번역 수준에서의 뉴클레오티드 미스매치가 오혼입에 의한 상이한 아미노산 잔기의 교환, 예를 들어, Gly→Glu, 또는 Gly→Asp에 이르는지 여부는 코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 수준에서의 상기 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 유형에 주로 의존적이다.

폴리펩티드 생성물의 "정확한" 또는 천연인 코딩된 아미노산 서열로부터의 임의의 이질성 또는 이탈은 더 낮은 품질, 정제 노력 증가, 치료 효능 변경 및/또는 면역원성 변경, 예를 들어, 면역원성 증가를 포함하는 의미 있는 단점에 이를 수 있다. 임의의 발현 시스템에서의 발현에 의해 수득가능한 2개의 단백질 생성물은, 심지어 이들의 각각의 코딩 서열이 고도로 유사하거나 거의 동일하지만, 단백질의 동일한 각각의 위치에서 동일한 아미노산을 코딩하는 적어도 하나의 코돈이 상이한 경우에도, 상기 언급된 특징 면에서 실질적으로 상이할 수 있다. 따라서, 정확하게 동일한 코딩 서열의 발현에 의해 수득되지 않은 단백질 생성물들은 상이한 면역학적 성질, 예를 들어, 상기 단백질에 대해 지시된 항체 형성의 유도, 및/또는 상이한 약리학적 성질, 예를 들어, 상이한 반감기 또는 상이한 약동학을 나타낼 수 있다.

이러한 이유로, 아미노산 오혼입의 경향이 더 많은 또는 더 적은 코딩 서열을 제공하는데, 또는 공지된 제품의 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 정확하게 매칭되기 위해, 이전에 특성화되었고/되었거나 판매되는 공지된 단백질 제품의 미지의 코딩 서열을 제공하는데 사용될 수 있는 방법을 입수가능한 것이 바람직하다. 이같은 방법의 후자의 측면은 제품의 단백질의 서열은 완전히 공지되어 있거나 또는 일상적인 방법에 의해 실험적으로 쉽게 결정될 수 있지만, 코딩 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분은 독점적이거나, 개시되지 않았거나 또는 다른 방식으로 공지되지 않은 경우에, 바이오시밀러 제약학의 개발에서 특히 관련된다. 저수준 서열 변이체에 의한 불순물의 정도 또는 유형은 원본 단백질 치료제 및/또는 상응하는 바이오시밀러 치료제에서 고도로 의미가 있을 수 있다.

문헌 [Yu et al., Anal. Chem. 2009, 81, 9282-9290]에 오혼입된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 저수준 서열 변이체가 형성되는 것을 초래하는 분자적 메커니즘 및 질량 분광법-기반 분석학이 기술되어 있다. 유(Yu) 등은 적어도 하나의 오혼입된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 저수준 서열 변이체 중 대다수가 전사 또는 번역 동안의 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로부터 초래된다고 설명한다. 그런, 유 등은, 예를 들어, 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 적어도 하나의 코돈에서 상이한 미지의 제2 폴리뉴클레오티드의 상기의 적어도 하나의 코돈의 확인 및 선택에 의해, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 것을 교시하지 않는다. 달리 말하면, 유 등은 미지의 코딩 서열의 적어도 하나의 코돈의 역조작을 구상하지 않는다.

더욱 일반적으로, 임의의 살아 있는 생물 내의 유전 정보의 흐름에 관한 분자 생물학의 중심원리 및 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 코딩된 단백질 서열로부터의 코딩 RNA 또는 DNA 서열의 추론은 지금까지 가능한 것으로 간주되지 않았다.

따라서, 공지된 단백질 제품을 코딩하는 미지의 코딩 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분의 적어도 하나의 코돈의 역조작에 의해 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 최적화하는 방법이 생물제약 산업에서 요구된다.

추가로, 생물의약품, 특히 단백질 치료제의 면역원성 활성이 생물공학 산업에서 통상적으로 부딪히는 문제이다. 구체적으로, 생물의약품 내의 T-세포 에피토프의 존재 및 항-약물 항체 (ADA)의 발생이 다수의 단백질 약물에 대해 기술되어 있어, T 세포 에피토프 함량이 항원성에 기여하는 유의한 인자임을 나타낸다 (Shankar et al. Nat Biotechnol 2007, 25(5):555-61; Nechansky & Kircheis Expert Opin. Drug Discov 2010, 5(11):1067-1079; Harding et al. MAbs 2010, 2(3):256-65). T-세포 활성화 (T-헬퍼 세포; CD4+ 세포)의 한 주요 결정인자는 주요 조직적합성 복합체 (제II형의 MHC 또는 HLA) 분자에 대한 T 세포 에피토프의 결합 강도이다 (Weber et al. Adv Drug Deliv Rev. 2009, 30;61(11):965-76). 인 실리코(in silico) 툴을 사용하여 잠재적인 T-세포 에피토프를 예측함으로써 단백질 치료제의 면역원성 잠재력을 추정하고 감소시키기 위해 상당한 노력이 이루어졌다 (Roque-Navarro et al. Hybrid Hybridomics 2003, 22(4):245-57; Tangri et al. Current Medicinal Chemistry 2002, 9:2191-9; Mateo et al. Hybridoma 2000, 19(6):463-71; De Groot et al. Vaccine 2009, 27:5740-7). 펩티드 서열의 예측된 MHC II 결합 강도를 기초로, 펩티드 서열이 면역 반응을 일으킬 가능성에 관하여 정보에 근거한 결정을 내리는 것이 가능하다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 폴리펩티드 의약품의 면역원성 잠재력의 예측, 변경 또는 감소는 발현 및/또는 정제 절차에 의해 수득가능한 "주요" 또는 천연 폴리펩티드, 즉 이같은 폴리펩티드를 발현하는 생물 또는 숙주 생물이 사용하는 유전자 코드에 따라 폴리뉴클레오티드의 각각의 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제한되었다.

그러나, 상기에 인용된 종래 기술은 주요 또는 천연 폴리펩티드의 저수준 서열 변이체 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 오혼입(들)을 초래하는 오전사 및/또는 오번역 이벤트로 인해 폴리펩티드의 총량의 상당 부분에서 1차 아미노산 서열이 다를 수 있다는 문제를 인식하거나 다루지 않았다. 이같은 아미노산 잔기 오혼입(들)이 각각의 폴리펩티드 의약품의 면역원성 잠재력에 유의하게 영향을 미칠 수 있다는 것 또한 관련 기술 분야에서 인지되지 않았다. 동시에, 오혼입된 아미노산 (및 초래된 펩티드 서열)의 면역원성 잠재력을 기초로 하는 코돈 선택이 지금까지 수행되거나 제안되지 않았다. 더욱 구체적으로, 단백질 약물 내의 아미노산 오혼입의 면역원성 잠재력이 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 변경하려는, 즉 감소 또는 증가시키려는 종래 기술의 시도, 예를 들어, ADA의 형성을 감소시키는 것에 또한 포함되지 않았다.

결론적으로, 면역원성 잠재력이 변경된, 특히 감소된 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 제공하는 개선된 방법이 일반적으로 요구된다. 특히, 대상체 내로 도입되었을 때 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드에 비교하여 감소된 ADA 반응을 유발하는 폴리펩티드 약물을 코딩하는 최적화된 코딩 서열을 수득하는데 유용한 방법이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 (a) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하는 단계; (b) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 이러한 적어도 하나의 코돈에 대한 대안 코돈을 선택하는 단계; (c) 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 대안 코돈으로 변화시키고, 여기서 상기의 적어도 하나의 코돈은 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 단계; 또는 (d) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 상기 코돈을 대안 코돈으로 변화시키는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기의 적어도 하나의 코돈은 세포 내에서의 폴리뉴클레오티드의 발현 시 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성이다. 한 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포 또는 진핵생물 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 박테리아 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포이다.

한 측면에서, 본 발명의 방법은 (a) 상기의 최적화될 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득되는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록, 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 상기 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록, 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화된다.

적어도 하나의 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계는 폴리펩티드 혼합물 내에 포함된 폴리펩티드 내의 적어도 하나의 오혼입된 아미노산 잔기를 검출하는데 적절한 임의의 검출 방법을 일반적으로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계는 질량 분광법을 포함한다. 아미노산 잔기 오혼입의 검출에 적절한 종래 기술에 공지되어 있는 질량 분광법 중 임의의 방법을 사용할 수 있다. 탠덤(tandem) 질량 분광법에 이어서 추출 이온 크로마토그램(Extracted Ion Chromatogram) (EIC)을 사용하여 정량하는 것에 의한 오혼입을 함유하는 펩티드의 시퀀싱이 이와 관련하여 특히 바람직하다.

또 다른 측면에서, 아미노산 잔기 오혼입은 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 변경, 감소 또는 증가를 초래한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 대안 코돈을 선택하거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈을 변화시키는 단계 각각은 면역원성 잠재력의 변경, 즉 증가 또는 감소를 초래한다. 바람직하게는, 상기 대안 코돈을 선택하거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈을 변화시키는 단계 각각은 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 감소를 초래한다. 한 실시양태에서, 면역원성 잠재력은 인 실리코로, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 결정된다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 잠재력은 종래 기술, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 상기 인용된 바와 같은 문헌 [Shankar et al., 2007]; [Nechansky & Kircheis, 2010]; [Harding et al., 2010]의 방법에 의해 결정되는 바와 같은, 폴리펩티드 내의 T-세포 에피토프의 존재를 지칭한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역원성 잠재력은 폴리펩티드 투여 시의 대상체에서의 T-세포 활성화 (예를 들어 T-헬퍼 세포; CD4+ 세포) 및/또는 항-약물 항체 (ADA)의 발생을 지칭한다.

본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입은 발현되는 폴리펩티드의 총 몰량의 10％ 미만, 5％ 미만, 1％ 미만, 0.5％ 미만, 0.1％ 미만, 또는 0.02％ 미만으로 존재한다. 바람직하게는, 아미노산 잔기 오혼입은 발현되는 폴리펩티드의 총 몰량의 0.5％ 미만, 더욱 바람직하게는 0.1％ 미만으로 존재한다.

본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입은 전사 또는 번역 동안의 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치의 결과이다. 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치는 바람직하게는 (a) DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 시토신-아데닌 (C*A) 미스매치; (b) 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 구아닌-우라실 (G*U) 미스매치; (c) DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 아데닌-시토신 (A*C) 미스매치; (d) 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 우라실-구아닌 (U*G) 미스매치; (e) DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 아데닌-아데닌 (A*A) 미스매치; 또는 (f) 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 우라실-우라실 (U*U) 미스매치로 이루어진 군으로부터 선택된다

번역 또는 전사 동안의 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치는 유전자 코드에 따라 상기의 적어도 하나의 코돈 내에서의 염기 차이를 초래한다. 따라서, 본 발명의 모든 측면의 일부 실시양태에서, 염기 차이는 A→C, A→G, C→A, C→U, G→A, G→C, G→U, U→A, U→C, 및 U→G, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 염기 차이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 염기 차이는 G→A, U→C, 및 U→A, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 염기 차이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 염기 차이는 적어도 하나의 코돈의 제1, 제2 또는 제3 위치에서 발견된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈 내의 위치와 관련된 염기 차이는 G1→A, G2→A, U1→A, U1→C, U2→A, U2→C, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 염기 차이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 모든 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 RNA 수준에서의 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, AUG, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GCA, GCC, GCG, GCU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UAC, UAU, UCA, UCC, UCG, UCU, UGC, UGG, UGU, UUA, UUC, UUG, 및 UUU, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 RNA 수준에서의 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GCA, GCC, GCG, GCU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UAC, UAU, UCA, UCC, UCG, UCU, UGC, UGU, UUA, UUC, UUG, 및 UUU, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 Gly, Ala, Ser, Arg, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Cys, Trp로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 Gly, Ser, Arg, Val, Ile, Leu 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 코딩한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 Gly, Ser, Arg, Val, Ile 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 코딩한다.

본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GGC 또는 GGU이고, 아스파르테이트가 글리신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GGG 또는 GGA이고, 글루타메이트가 글리신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GGG 또는 GGA이고, 아르기닌이 글리신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GGC 또는 GGU이고, 세린이 글리신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 AGC 또는 AGU이고, 아스파라긴이 세린 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 CGG 또는 CGA이고, 글루타민이 아르기닌 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 CGU 또는 CGC이고, 히스티딘이 아르기닌 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 AGG 또는 AGA이고, 리신이 아르기닌 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GUA, GUU, 또는 GUC이고, 이소류신이 발린 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GUG이고, 메티오닌이 발린 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 UUA 또는 UUG이고, 세린이 류신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 UCU, UCC, UCA 또는 UCG이고, 프롤린이 세린 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GUG 또는 GUA이고, 글루타메이트가 발린 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 GUC 또는 GUU이고, 아스파르테이트가 발린 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 AUA이고, 리신이 이소류신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 AUC 또는 AUA이고, 아스파라긴이 이소류신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 AUG이고, 리신이 메티오닌 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 CUU 또는 CUC이고, 히스티딘이 류신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 CUA 또는 CUG이고, 글루타민이 류신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 코돈은 UUA이고, 이소류신이 류신 대신 오혼입된다. 본 발명의 모든 측면의 또 다른 실시양태에서, 또는 적어도 하나의 코돈은 UUG이고, 메티오닌이 류신 대신 오혼입된다.

본 발명의 모든 측면의 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계는 질량 분광법 (MS)의 사용을 포함한다. 구체적 실시양태에서, MS는 LC-MS/MS, HPLC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS, 또는 나노HPCL-MS/MS를 포함한다.

본 발명의 모든 측면의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 제약상 활성인 폴리펩티드이다. 구체적 실시양태에서, 상기의 제약상 활성인 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 융합 단백질이다.

본 발명은 (a) 본원에서 기술 및/또는 청구된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법 중 어느 하나에 따라 코딩 서열을 최적화하는 단계; (b) 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드(들)를 최적화된 코딩 서열의 상응하는 뉴클레오티드(들)로 치환하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조작하는 방법을 추가로 제공한다.

도 1. RNA 수준에서의 표준 유전자 코드의 도식이고, 안쪽에서 바깥쪽으로 읽을 때 각각의 코돈의 염기가 센스 방향으로 제시된다.
도 2. (A) DNA의 주형 가닥과 전사되는 mRNA 사이의 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성으로 인한 C*A 미스매치 또는 mRNA 코돈과 tRNA 안티코돈 사이의 G*U 미스매치로부터 각각 초래되는 유전자 코드에서의 G→A 염기 차이가, 번역되는 폴리펩티드 내에 Glu가 Gly 대신 오혼입되는 것 (Gly→Glu)에 이른다는 것을 나타내는 도식. (B) DNA의 주형 가닥과 전사되는 mRNA 사이의 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성으로 인한 A*C 미스매치 또는 mRNA 코돈과 tRNA 안티코돈 사이의 U*G 미스매치로부터 각각 초래되는 유전자 코드에서의 U→C 염기 차이가, 번역되는 폴리펩티드 내에 예를 들어 Pro가 Leu 대신 오혼입되는 것 (Leu→Pro)에 이른다는 것을 나타내는 도식. (C) DNA의 주형 가닥과 전사되는 mRNA 사이의 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성으로 인한 A*A 미스매치 또는 mRNA 코돈과 tRNA 안티코돈 사이의 U*U 미스매치로부터 각각 초래되는 유전자 코드에서의 U→A 염기 차이가, 번역되는 폴리펩티드 내에 예를 들어 His가 Leu 대신 오혼입되는 것 (Leu→His)에 이른다는 것을 나타내는 도식.
도 3. 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성으로 인한 표준 유전자 코드의 수준에서의 G→A 염기 차이의 도식. 코돈에 따라, 이같은 염기 차이는 단백질 수준에서 Gly→Glu 또는 Gly→Asp의 아미노산 잔기 오혼입을 초래한다. 따라서, 어느 한쪽의 아미노산 잔기 오혼입의 존재가 적어도 하나의 코돈이 아미노산 오혼입에 대해 감수성이라는 것을 가리킨다.
도 4. 역조작의 도식적인 작업 흐름.
도 5. Val→Met 또는 Val→Ile 오혼입을 포함하는 저수준 서열 변이체의 검출.
도 6. 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 감소시키기 위한 코돈 최적화의 도식적 서술.

발명의 상세한 설명

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술 분야 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학)의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미이다. 본 발명의 실행에서, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA에서의 다수의 통상적인 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, & III, 1997 (F. M. Ausubel ed.)]; [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I & II, 1985 (D. N. Glover ed.)]; [Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.)]; [Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins)]; [Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.)]; [Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.)]; [Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press)]; [Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning]; [Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.)] 총서; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory)]; 및 [Methods in Enzymology Vol. 154 (Wu & Grossman eds.) & Vol. 155 (Wu ed.)]에 설명되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 수치 (예를 들어, pH 값 또는 백분율 값)과 함께 사용되는 경우의 용어 "약"은 이러한 값의 20％, 바람직하게는 10％, 더욱 바람직하게는 5％, 더욱 더 바람직하게는 2％, 가장 바람직하게는 1％의 편차를 포함하도록 의도된다. 수치와 함께 사용되는 경우, 동시에 이는 이러한 정확한 수치를 본 발명에 따른 바람직한 실시양태로서 개별적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)" 및 "~로 이루어지는" 양쪽 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 하고, 양쪽 모두의 의미는 구체적으로 의도되고, 따라서 개별적으로 개시되는 본 발명에 따른 실시양태이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 (-(C=O)-NH-) 및/또는 디술피드 (-S-S-) 결합을 통해 아미노산 잔기들이 공유결합으로 함께 연결된 중합체를 지칭한다. 구체적으로 달리 지시되지 않는 한, "아미노산 잔기"는 본원에서 "아미노산"으로 짧게 지칭되기도 한다. 본 발명의 맥락에서의 용어 "폴리펩티드"는 단량체성 또는 다량체성, 또는 동종다량체성 또는 이종다량체성 폴리펩티드 분자를 지칭할 수 있다. "폴리펩티드"는 전장의 천연 발생 아미노산 쇄 또는 "이의 단편" 또는 "펩티드", 예컨대 폴리펩티드의 선택된 관심 영역, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 비-천연인 아미노산 중합체 또는 이의 단편 또는 펩티드를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 폴리펩티드는 특히 임의 유형의 항체 또는 이의 단편을 또한 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "펩티드"는 약 4개 이하의 아미노산의 짧은 아미노산 쇄일 수 있다. 펩티드는 약 70개 이상의 아미노산의 더 긴 아미노산 쇄일 수도 있다. 바람직하게는, 펩티드는 약 4개 내지 약 70개의 아미노산의 길이이다. 폴리펩티드의 "단편"은 전장 폴리펩티드의 일부분인 아미노산 서열을 지칭한다.

폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터의 발현에 의해 수득될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 폴리펩티드" 또는 "재조합 단백질"은 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 재조합 발현에 의해 수득가능하다.

바람직한 본 발명에 따른 재조합으로 발현되는 폴리펩티드는 제약적 관심 대상인 단백질을 포함한다. 예는 비제한적으로 Epo, 응고 인자 예컨대 제VIII 인자 및 제IX 인자, 응고제 예컨대 히루딘, 호르몬 (인슐린, 인간 및 동물 성장 호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬 포함), 면역글로불린 및 이의 단편, 특히 항체 및 이의 항원-결합 단편 및 이의 융합 단백질, 알파-글로빈, 베타-글로빈, 감마-글로빈, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 비만 세포 성장 인자, 종양 억제인자 p53, 망막모세포종, 인터페론, 흑색종 연관 항원 또는 B7, 및 발현, 특히 다량의 발현이 요망되는 임의의 다른 단백질을 포함한다. 항체, 이의 항원-결합 단편 및 융합 단백질이 바람직한 폴리펩티드이다. 항원은 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합물, 및 이의 항원-결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 융합 단백질은 인간, 마우스, 래트, 낙타류 또는 토끼를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 Fab, 디아바디(diabody), Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체 및 단일쇄 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 융합 단백질은 또 다른 폴리펩티드에 융합된 항체의 임의의 일부분, 예를 들어, Fc 융합 단백질을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드를 코딩하는 "폴리뉴클레오티드"는 하나 이상의 코돈을 포함하고, A, C, G, 또는 U 염기를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA), 또는 A, C, G, T 염기를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 I 염기 (이노신 또는 하이포크산틴), 또는 A, C, G, U, T, I의 임의의 변형된 변이체를 또한 포함할 수 있고, 공유결합으로 변형된 뉴클레오티드 잔기, 예컨대 메틸화, 또는 탈메틸화 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "코돈"은 폴리뉴클레오티드의 리딩 프레임과 관련하여 제1, 제2 및 제3 염기 위치가 있는 뉴클레오티드의 트리플릿(triplet)이고, 이러한 코돈은 유전자 코드에 따라 아미노산 잔기를 코딩한다. 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선택된 발현 시스템에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열, 특히 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 제어 서열은 세포 내에서 사용되도록 발현 시스템이 디자인되는 숙주 세포와 상용성이도록 선택될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "발현"은 임의의 천연 발생 세포, 숙주 세포, 및/또는 무세포 전사 및/또는 번역 시스템에서 발생하는 바와 같은 코딩 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역 프로세스를 지칭한다. 따라서, 발현은 전형적으로는 코딩 서열의 전사 및/또는 번역에 의해, 폴리뉴클레오티드 코딩 서열로부터 폴리펩티드 생성물이 생산되는 것이다. 바람직하게는, 발현은 세포에서 발생한다. 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 분비될 수 있거나, 또는 세포 내에 축적될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발현은 폴리펩티드가 세포로부터 분비되는 것을 포함한다. 발현 수준은 다양할 수 있지만, 유리하게는 높다; 세포가 생산하는 총 단백질의 약 1％, 바람직하게는 10％, 25％ 또는 50％ 또는 심지어 이를 초과하는 값이 발현된 관심 폴리펩티드일 수 있다. 관련 기술 분야에 널리 공지된 발현 시스템을 포함하는 유전자 조작 숙주 세포를 사용하는 방법에 의해 재조합 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

다양한 시험관-내 또는 세포성 진핵생물 또는 원핵생물 발현 시스템 또는 벡터가 관련 기술 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 염색체, 에피솜 및 바이러스-유래 발현 시스템, 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스 예컨대 배큘로바이러스, 파포바 바이러스, 예컨대 SV40, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 조류 폭스 바이러스, 거짓광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래되는 벡터, 및 이들의 조합물로부터 유래되는 벡터, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소로부터 유래되는 것, 예컨대 코스미드 및 파지미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 시험관 내에서 또는 숙주 세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현시킬 수 있는 임의의 시스템 또는 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오티드 서열을 다양한 널리 공지되고 일상적인 기술, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 것에 의해 발현 시스템 내로 삽입할 수 있다. 적합한 분비 신호를 원하는 폴리펩티드 내로 혼입하여, 번역된 단백질이 세포질 세망의 내강, 원형질막 주위공간 또는 세포외 환경 내로 분비되게 할 수 있다. 이러한 신호는 폴리펩티드에 대해 내인성일 수 있거나, 또는 이종성 신호일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 발현 시스템, 벡터 또는 이의 일부분이 혼입되어 있고 재조합 기술에 의한 단백질 또는 폴리펩티드의 생산에 적절한 유전자 조작 세포이다. 적절한 숙주 세포의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예컨대 스트렙토코쿠스(Streptococci), 스타필로코쿠스(Staphylococci), 이. 콜라이, 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 진균 세포, 예컨대 효모 세포 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포; 곤충 세포 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포, 기타 동물 세포, 또는 식물 세포를 포함한다. 특히 바람직한 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 바람직한 기타 동물 세포는 CHO (차이니즈 햄스터 난소), COS-7 (세르코피테쿠스 아에티옵스(Cercopithecus aethiops), 기원-결손 SV-40), BHK-21 (베이비 햄스터 신장 섬유모세포), HEK-293 (인간 배아 신장), HeLa ("헨리에타 랙스(Henrietta Lacks)"), HL-60 (인간 백혈병), HUVEC (인간 제대 정맥 내피 세포), 유캣(Jurkat), MCF-7 (미시건 캔서 파운데이션(Michigan Cancer Foundation)-7), NIH-3T3 (NIH, 3일 이동 접종물 3×10⁵ 세포), RenCa (신장 암종), U937, 및 Vero 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CHO 세포 또는 CHO 유래 세포 (예를 들어, CHO-DXB11 또는 CHO-DG55)가 이와 관련하여 특히 바람직하고, 이들은 생물제약상 유용한 단백질, 예컨대 항체 및 이의 항원-결합 단편 또는 이의 융합 단백질을 발현하도록 관련 기술 분야에서 널리 사용된다. 표준 실험실 교재, 예컨대 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, & III, 1997 (F. M. Ausubel ed.)]; [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기술된 방법에 의해 발현 시스템을 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

단백질 또는 폴리펩티드를 이러한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 생산하는데 무세포 전사 및/또는 번역 시스템을 또한 사용할 수 있고, 여기서 일반적으로 DNA가 커플링된 무세포 전사/번역 시스템의 주형으로서 사용되고, RNA가 무세포 번역 시스템에서 주형으로 사용된다.

일반적으로, 단백질 발현 동안, 관심 코딩 서열이 먼저 메신저 RNA (mRNA)로 전사되고, 임의적으로 전사 후 변형이 있은 후, 전사 인자, 및 아미노아실-전달 RNA (tRNA) 세트를 사용하여 리보솜에 의해 번역된다. 일반적인 환경 하에서는, 원형생물 또는 진핵생물 리보솜 내에서, 상기 정의된 바와 같이, 아미노아실-tRNA의 안티코돈 루프 내의 3개의 염기의 트리플릿이 이의 상보적인 코돈의 3개의 염기와 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성한다. 4³=64개의 가능한 코돈 트리플릿 각각이 이에 의해 유전자 코드에 따라 아미노산 잔기 (개시 코돈 포함) 또는 번역 정지 신호로 번역된다. 표준 유전자 코드는 통상적으로 공지되어 있고, 하기 표 및 도 1에 도시된 도식에 의해 본원에서 정의된다.

<표 1>

표준 유전자 코드와 약간 상이한 다른 유전자 코드, 예컨대 척추동물 미토콘드리아 코드, 효모 미토콘드리아 코드, 뿐만 아니라 다른 미토콘드리아, 핵 및 색소체 유전자 코드가 관련 기술 분야에 또한 공지되어 있고, 문헌 [Osawa et al. Microbiol Rev. 1992, 56(1):229-64]; [Jukes and Osawa, Comp Biochem Physiol B. 1993, 106(3):489-94]를 참조한다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 표준 유전자 코드를 사용하지만, 이같은 변종 유전자 코드에 맞춰질 수도 있다.

전사 메커니즘, 뿐만 아니라 번역 메커니즘은 오류가 없지 않다. 예를 들어, 광범위한 교정으로 인해 염기 당 약 10^-8 내지 10^-10의 오류율을 일반적으로 나타내는 고-정확도의 진핵생물의 DNA-의존적 폴리머라제 DNA 복제 기구에 비교하여 (Kunkel and Bebenek, Annu Rev Biochem. 2000; 69:497-529), 전사 및 번역의 오류율은 몇 자릿수가 더 높다. 전사 오류율은 염기 당 약 10^-5인 것으로 보고된다 (Sydow and Cramer, Curr Opin Struct Biol. 2009, 19(6):732-9). 리보솜-의존적 번역은 아미노산 잔기 당 약 10^-3 내지 10^-4의 오류율로 일어난다 (Loftfield and Vanderjagt, Biochem. J. 1972, 128, 1353-1356; Parker et al., Proc Natl Acad Sci USA 1978, 75(3):1091-5). 이같은 빈도에서, 적어도 하나의 오혼입된 아미노산 잔기를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드가 최신식 분석 방법, 예를 들어, 질량 분광법에 의해 검출가능하다.

전사 오류는 DNA/RNA 수준에서의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치의 결과이고, 전사체 mRNA 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 또는 염기 차이에 이른다. 이러한 하나 이상의 염기 차이가 mRNA 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역 내에서 발생하고 교정 메커니즘 (문헌 [Sydow and Cramer, Curr Opin Struct Biol. 2009, 19(6):732-9]에서 리뷰됨)에 의해 수정되지 않으면, mRNA 전사체 내의 잘못된 코돈이 번역 동안 비-천연 아미노산을 보유하는 "틀린" aa-tRNA와 쌍을 형성할 수 있다. 전사 오류가 발현에 의해 수득되는 폴리펩티드에서 오혼입된 아미노산 잔기로 번역될 것인지 여부는 코돈 내의 이같은 전사 오차의 정확한 위치, 즉 코돈의 제1, 제2 또는 제3 위치에 좌우된다. 중요하게, 코돈의 제3 위치 ("워블(wobble)" 위치로도 명명됨)는 본질적으로 유전자 코드의 축퇴성을 설명한다. 표준 유전자 코드에 따르면, Gly, Ala, Val, Thr, Arg, Pro, Leu, Ser에 대한 코돈의 제3 (또는 워블) 위치에서의 전사 오류는 번역 수준에서 침묵적일 것이다.

번역 오류는 아미노아실-tRNA (리보솜-결합 상태)의 안티코돈과 번역될 mRNA 전사체의 코돈 사이의 RNA/RNA 비-왓슨-크릭 염기-염기 미스매치의 결과이다. 아미노아실-tRNA가 이의 아미노실 잔기에서 유전자 코드에 따른 미스매칭된 코돈의 번역과 상이하면, 아미노산 잔기 오혼입이 발생한다.

"왓슨-크릭 염기 쌍"은 G-C, A-T 또는 A-U 염기 쌍이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비-왓슨-크릭 염기 미스매치"는 왓슨-크릭 염기 쌍이 아닌 임의의 염기 쌍을 일반적으로 지칭한다. 이같은 미스매칭된 염기 쌍은 "N*N" ("N"은 임의의 뉴클레오티드임)으로 표기된다. 가장 통상적이고, 따라서 바람직한 비-왓슨-크릭 염기 미스매치는 하기와 같다:

a. 문헌 [Gautheret et al. RNA 1995, 1(8):807-14]에 기술된 바와 같은, DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 C*A 미스매치; 또는 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 G*U 미스매치. 이러한 미스매치는 유전자 코드 내에서 G에서 A로의 염기 차이 (G→A)를 초래한다.

b. 문헌 [Gautheret et al. RNA 1995, 1(8):807-14]에 기술된 바와 같은, DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 A*C 미스매치; 또는 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 U*G 미스매치. 이러한 미스매치는 유전자 코드 내에서 U에서 C로의 염기 차이 (U→C)를 초래한다.

c. 문헌 [Baeyens et al. Nat Struct Biol 1995, 2(1):56-62]에 기술된 바와 같은, DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 A*A 미스매치; 또는 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 U*U 미스매치. 이러한 미스매치는 유전자 코드 내에서 U에서 A로의 염기 차이 (U→A)를 초래한다.

비-왓슨-크릭 염기 미스매치는 폴리펩티드 생성물의 품질에 지대한 영향을 미쳐, 생성물 내에 하기에 추가로 기술되는 바와 같이 고도로 민감한 분석 기술, 예컨대 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (LC-MS)에 의해 검출가능한 저수준 서열 변이체를 초래할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "저수준 서열 변이체(들)"는 유전자 코드에 따라 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 하나 이상의 변이체를 지칭하고, 여기서 변이체(들)는 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로부터 초래되는 아미노산 잔기 오혼입으로 인해 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 코딩되는 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열과 상이하다. 저수준 서열 변이체는 폴리펩티드의 길이 및 1차 서열, 또는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열 내의 아미노산 잔기 오혼입(들)에 대해 감수성인 코돈의 발생 및/또는 빈도 각각에 따라 1개의 아미노산 잔기 오혼입, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 이를 초과하는 개수의 오혼입을 포함할 수 있다. 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득되는 폴리펩티드 혼합물 내의 저수준 서열 변이체의 농도는 코딩되는 폴리펩티드에 비해 일반적으로 낮다. 전형적으로, 소정의 아미노산 잔기 오혼입은 발현되는 폴리펩티드의 총 몰량의 10％ 미만, 5％ 미만, 1％ 미만, 0.5％ 미만, 0.1％ 미만, 또는 0.02％ 미만으로 존재한다. 바람직하게는, 아미노산 잔기 오혼입은 발현되는 폴리펩티드의 총 몰량의 0.5％ 미만, 더욱 바람직하게는 0.1％ 미만으로 존재한다. 저수준 서열 변이체에 대조적으로, 어떠한 아미노산 잔기 오혼입도 포함하지 않는 "코딩되는 폴리펩티드"는 또한 "정확한", "주요" 또는 "천연" 폴리펩티드로 본원에서 명명된다.

본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 잔기 오혼입"은 유전자 코드에 따른 코딩 폴리뉴클레오티드의 상응하는 위치에서의 코돈에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기가 폴리펩티드 내로 혼입되는 것을 일반적으로 지칭한다. 코돈 의존적 아미노산 오혼입에 이르는 분자적 메커니즘(들)에 관한 지식은 최근에서야 나타났다 (Yu et al., Anal. Chem. 2009, 81, 9282-9290). 아미노산 잔기 오혼입은 코딩 폴리뉴클레오티드 내의 적어도 하나의 코돈의 제1, 제2 또는 제3 위치 중 하나 이상에서의 전사 또는 번역 동안의 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치의 결과이다. 일부 아미노산 잔기 또는 이들의 하나 이상의 가능한 코돈은 다른 것들보다 아미노산 잔기 오혼입에 대해 더욱 감수성이다. 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 코돈이 본 발명의 방법의 목표이다.

일반적으로, "아미노산 잔기 오혼입(들)에 대해 감수성"인 코돈은 전사 또는 번역 동안 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로 인한 적어도 하나의 염기 차이에 의해 변경되면 또 다른 아미노산 잔기를 코딩할 코돈이다. 바람직하게는, 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성인 코돈은 제1 또는 제2 염기 위치에서의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로 인한 적어도 하나의 염기 차이에 의해 변경되면 또 다른 아미노산 잔기를 코딩할 코돈이다. 표 2 및 3은 아미노산 잔기 오혼입(들)에 대해 감수성인 특히 바람직한 코돈을 열거한다. 따라서, 표 2 및 3은 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성인 코돈이 코딩하는 바람직한 아미노산 잔기를 열거한다. 상기 정의된 바와 같은, 임의의 적합한 발현 시스템 (임의의 세포에 도입됨), 숙주 세포 또는 시험관 내 전사 및/또는 번역 시스템에서 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성인 코돈을 적어도 하나 포함하는 폴리뉴클레오티드가 발현되면, 적어도 상기 코돈이 코딩하는 아미노산 잔기에서 상이한, 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드의 저수준 서열 변이체가 본원에 기술되고 종래 기술로부터 공지된 바와 같은 적합한 검출 방법에 의해 검출가능할 것이다.

아미노산 오혼입의 "정도"는 폴리펩티드 내의 아미노산 위치 당 상기 아미노산 잔기 오혼입이 발생하는 비율 또는 빈도를 지칭한다.

아미노산 오혼입의 "유형"은 유전자 코드에 따라 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 천연 아미노산 대신에 오혼입되는 아미노산 잔기의 신원을 지칭한다.

일반적으로, 환자에서의 요법에 사용되는 임의의 폴리펩티드는 이의 면역원성 잠재력에 따라 더 높은 정도로 또는 더 적은 정도로 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "면역원성 잠재력"은 폴리펩티드가 이러한 폴리펩티드에 대해 지시된 면역 반응을 유발하는 능력을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "면역 반응"은 폴리펩티드가 제시하는 항원을 (외인성으로) 인식하는 대상체 (숙주)의 세포성 또는 체액성 면역 반응을 일반적으로 지칭한다. 구체적으로, 면역원성 잠재력은 MHC 제II형 / HLA 복합체가 결합하는, 폴리펩티드 내의 T-세포 에피토프의 존재에 있다. 따라서, 폴리펩티드 내에 포함된 항원에 대해 특이적인 항체의 형성을 유발하는 폴리펩티드의 능력에 의해 면역원성 잠재력이 결정될 수 있다. 폴리펩티드가 생물제약 폴리펩티드이면, 이같은 항체는 관련 기술 분야에서 항-약물 항체 (ADA)로 또한 공지된다. 폴리펩티드 또는 이의 단편의 면역원성 잠재력을 시험관 내에서, 생체 내에서, 또는 인 실리코로 평가할 수 있다. 폴리펩티드 또는 이의 단편의 면역원성 잠재력을 결정하기 위한 인 실리코 툴이 종래 기술, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Roque-Navarro et al. Hybrid Hybridomics 2003, 22(4):245-57]; [Tangri et al. Current Medicinal Chemistry 2002, 9, 2191-2199]; [Mateo et al. Hybridoma 2000, 19(6):463-71]; [De Groot et al. Vaccine 2009, 27 5740-5747]에 기술되어 있다. 전체 단백질 또는 잠재적인 에피토프를 나타내는 펩티드의 면역원성 잠재력을 테스트하기 위한 적절한 시험관 내 검정법은 MHC II 결합 검정법 또는 T-세포 검정법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전체 단백질 또는 잠재적인 에피토프를 나타내는 펩티드의 면역원성 잠재력을 테스트하기 위한 적절한 생체 내 방법은, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [De Groot & Moise Curr Opin Drug Discov Devel 2007, 10(3):332-40]에 개시된 바와 같은, 이의 면역원성 잠재력을 테스트하는 트랜스제닉(transgenic) (예를 들어, 인간 HLA 유전자 생성물을 발현함) 동물 모델을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, 발현된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드를 일상적인 관행에 따라 숙주 세포의 배양물로부터 또는 시험관 내 발현 시스템으로부터 정제할 수 있다. 그러나, 현재의 정제 프로토콜 및 최신식 설비에도 불구하고, 이렇게 정제된 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같은 저수준 서열 변이체를 함유할 수 있다. 이같은 저수준 서열 변이체 내의 아미노산 잔기 오혼입(들)의 정도 및 유형을, 예를 들어, 질량 분광법에 의해 결정할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 방법은 본원에서 "LC-MS", 또는 "HPLC-MS"로 지칭되는 액체 크로마토그래피-질량 분광법, 또는 고압 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 특히, LC-MS는 "LC-MS/MS"로도 지칭되는 탠덤 LC-MS를 포함한다. 바람직하게는, LC-MS는 역상 나노-LC-MS (RP-나노-LC-MS) 기술을 사용하여 수행된다. 이는 소형 샘플 부피의 사용, 및 높은 처리량으로, 예컨대 96-웰 플레이트 샘플 제제에서 작업할 가능성을 허용한다. 이는 또한 높은 감도를 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "나노-LC" 또는 나노-HPLC (RP-나노-LC 또는 RP-나노-HPLC 포함)는 통상적인 LC 또는 HPLC 각각과 비교하여 LC에 사용되는 칼럼의 내부 직경 감소 (10-150 ㎛) 및 더 작은 유속 (10-1000 nl/분)을 특징으로 한다. 이러한 규모 축소는 나노-LC 시스템의 높은 플레이트 수, 및 펨토몰 및 펨토몰 미만의 낮은 범위에서 단백질성 샘플을 분석하는 능력을 초래한다 (전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Chervet et al., Analytical Chemistry 1996, 68:1507-12]). 액체 크로마토그래피 분야에서의 이해 및 통상적인 일반 지식에 부합하여, 본 발명에 따라 나노-LC 및 나노-HPLC가 각각 본 발명의 목적을 위한 적절하고 의도되는 형태의 LC 및 HPLC라는 것과 RP-나노-LC 및 RP-나노-HPLC가 각각 적절하고 의도되는 형태, 심지어 바람직한 형태의 RP-LC 및 RP-HPLC라는 것이 이해될 것이다. 이는 마이크로-LC 및 모세관-LC, 또는 RP-마이크로-LC 및 RP-모세관-LC의 마찬가지로 널리 공지되고 확립된 기술에 동일하게 적용되고, 이들은 본 발명의 목적을 위해 각각 적절하고 의도되는 형태의 LC 및 RP-LC이다. 용어 LC, HPLC, LC-MS 또는 HPLC-MS가 본원에서 사용되는 경우에, 이는 이들의 바람직한 실시양태인 나노-LC, 나노-HPLC, 나노-LC-MS 또는 나노-HPLC-MS 및 이들의 역상 형태를 또한 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, 바람직하게는 "RP-LC 또는 RP-HPLC의 이동상은 pH 및 이온화 상태를 제어하거나 이온 쌍 형성 시약으로서 작용하는 이온성 개질제가 있는, 물 내의 유기 개질제 (예를 들어, 아세토니트릴 또는 메탄올)의 구배이다. 음이온성 이온-쌍 시약 (예를 들어, 트리플루오로아세트산 (TFA))은 펩티드의 양성자화된 염기성 기에 결합한다. 0.1％ TFA의 첨가는 용리제를 산성화시키고, 이는 펩티드 및 단백질의 카르복실 기가 양성자화되게 하여, 분자의 더 큰 소수성을 초래한다. 양이온성 이온-쌍형성 시약 (예를 들어, 트리에틸암모늄 이온)은 펩티드의 이온화된 카르복실 기에 결합한다 (전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 ["Protein Liquid Chromatography", Journal of Chromatography Library, vol. 61, Kastner M ed., Elsevier Science B.V., 2000, p153]). 디에틸아민 (DEA) 또한 이온 쌍형성 시약으로서 사용될 수 있다 (Melmer et al., Journal of Chromatography A (2011), Volume: 1218(1): 118-123). 순상 또는 HILIC 크로마토그래피의 경우, 적절한 이동상은 예를 들어 75％ 아세토니트릴 내의 60 mM 포름산암모늄 (이동상 A) 및 54％ 아세토니트릴 내의 115 mM 포름산암모늄 (이동상 B)로 이루어진다 (전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Melmer et al., Anal Bioanal Chem (2010), Volume 398: 905-914]).

본원에서 사용된 바와 같이, "이온 트랩 질량 분광법"은 먼저 원하는 범위의 질량/전하 비의 이온을 고주파 사중극자 전기장의 효과 하에 안정적인 경로를 기술하도록 만든 후, 이들의 각각의 질량/전하 비에 따라 선택적으로 경로 불안정성을 유도하도록 전기장을 조정함으로써 분리하여 검출기에 제시하는 배열, 예를 들어, 사중극자 이온 트랩이다. 더욱 민감한 나노 ESI 소스를 사용함으로써 본 발명의 방법의 감도가 개선될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "추출 이온 크로마토그래피"는 본질적으로 전체 질량 범위의 관심 분석물 / 이온에 대한 데이터를 수집하고, 이어서 하나 이상의 분석물의 하나 이상의 m/z 값을 스펙트로그램으로부터 회수 ('추출')함으로써, "추출 이온 크로마토그램" (EIC)을 제공하는 LC-MS 실험을 지칭한다. EIC는 체류 시간의 함수로서 기록된 일련의 질량 스펙트럼에서 선택된 m/z 값 또는 값 세트에서 관찰된 신호의 강도를 플롯팅함으로써 생성된다.

코딩 서열을 최적화하는 방법

(a) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하는 단계; (b) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 이러한 적어도 하나의 코돈에 대한 대안 코돈을 선택하는 단계; (c) 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 대안 코돈으로 변화시키고, 여기서 상기의 적어도 하나의 코돈은 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 단계; 또는 (d) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 상기 코돈을 대안 코돈으로 변화시키는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법이 본 발명에 따라 본원에서 기술 및 청구된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입은 상기 정의된 바와 같이 전사 또는 번역 동안의 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치의 결과이다. 번역 또는 전사 동안의 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치는 유전자 코드에 따라 상기의 적어도 하나의 코돈 내에서의 염기 차이를 초래한다. 따라서, 본 발명의 모든 측면의 일부 실시양태에서, 염기 차이는 A→C, A→G, C→A, C→U, G→A, G→C, G→U, U→A, U→C, 및 U→G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 염기 차이는 G→A, U→C, 및 U→A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기의 적어도 하나의 코돈 내의 위치에 관련된 염기 차이는 G1→A, G2→A, U1→A, U1→C, U2→A, U2→C로 이루어진 군으로부터 선택된다.

표 2는 단백질 서열 내로 혼입될 의도된 "천연" 아미노산을 코딩하는 각각의 코돈(들)로부터 어떤 아미노산 오혼입(들)이 초래될 수 있는지를 요약한다.

<표 2>

표 2로부터, 일부 아미노산의 경우, 상이한 코돈이 상이한 아미노산이 폴리펩티드 서열 내로 혼입되는 것을 일으켜서, 코딩되는 (즉, 의도된 / 천연) 서열과 서열이 상이한 다수의 단백질 서열 (본원에서 저수준 서열 변이체로 칭해짐)을 초래한다고 결론지을 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 표 2에 열거된 천연 아미노산 잔기는 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 바람직하게는 RNA 수준에서의 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, AUG, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GCA, GCC, GCG, GCU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UAC, UAU, UCA, UCC, UCG, UCU, UGC, UGG, UGU, UUA, UUC, UUG, 및 UUU, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 RNA 수준에서의 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GCA, GCC, GCG, GCU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UAC, UAU, UCA, UCC, UCG, UCU, UGC, UGU, UUA, UUC, UUG, 및 UUU, 또는 DNA 수준에서의 이의 상응하는 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 Gly, Ala, Ser, Arg, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Cys, 및 Trp로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, AUG, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UCA, UCC, UCG, UCU, UUA, UUG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UCA, UCC, UCG, UCU, UUA, UUG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 Gly, Ser, Arg, Val, Ile, Leu 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 코딩한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈은 Gly, Ser, Arg, Val, Ile 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 코딩한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 적어도 하나의 코돈이 코딩하는 폴리펩티드의 천연 잔기에 상응하는 위치에서, Asp가 Gly 대신 오혼입되거나; Glu가 Gly 대신 오혼입되거나; Arg가 Gly 대신 오혼입되거나; Ser이 Gly 대신 오혼입되거나; Asp가 Ser 대신 오혼입되거나; Gln이 Arg 대신 오혼입되거나; His가 Arg 대신 오혼입되거나; Lys가 Arg 대신 오혼입되거나; Ile가 Val 대신 오혼입되거나; Met가 Val 대신 오혼입되거나; Ser이 Leu 대신 오혼입되거나; Pro가 Ser 대신 오혼입되거나; Glu가 Val 대신 오혼입되거나; Asp가 Val 대신 오혼입되거나; Lys가 Ile 대신 오혼입되거나; Asp가 Ile 대신 오혼입되거나; Lys가 Met 대신 오혼입되거나; His가 Leu 대신 오혼입되거나; Gln이 Leu 대신 오혼입되거나; Ile가 Leu 대신 오혼입되거나; 또는 Met가 Leu 대신 오혼입된다.

더욱 바람직한 실시양태에서, (a) 적어도 하나의 코돈이 GGC 또는 GGU이고, 아스파르테이트가 글리신 대신 오혼입되거나; (b) 적어도 하나의 코돈이 GGG 또는 GGA이고, 글루타메이트가 글리신 대신 오혼입되거나; (c) 적어도 하나의 코돈이 GGG 또는 GGA이고, 아르기닌이 글리신 대신 오혼입되거나; (d) 적어도 하나의 코돈이 GGC 또는 GGU이고, 세린이 글리신 대신 오혼입되거나; (e) 적어도 하나의 코돈이 AGC 또는 AGU이고, 아스파라긴이 세린 대신 오혼입되거나; (f) 적어도 하나의 코돈이 CGG 또는 CGA이고, 글루타민이 아르기닌 대신 오혼입되거나; (g) 적어도 하나의 코돈이 CGU 또는 CGC이고, 히스티딘이 아르기닌 대신 오혼입되거나; (h) 적어도 하나의 코돈이 AGG 또는 AGA이고, 리신이 아르기닌 대신 오혼입되거나; (i) 적어도 하나의 코돈이 GUA, GUU, 또는 GUC이고, 이소류신이 발린 대신 오혼입되거나; (j) 적어도 하나의 코돈이 GUG이고, 메티오닌이 발린 대신 오혼입되거나; (k) 적어도 하나의 코돈이 UUA 또는 UUG이고, 세린이 류신 대신 오혼입되거나; (l) 적어도 하나의 코돈이 UCU, UCC, UCA 또는 UCG이고, 프롤린이 세린 대신 오혼입되거나; (m) 적어도 하나의 코돈이 GUG 또는 GUA이고, 글루타메이트가 발린 대신 오혼입되거나; (n) 적어도 하나의 코돈이 GUC 또는 GUU이고, 아스파르테이트가 발린 대신 오혼입되거나; (o) 적어도 하나의 코돈이 AUA이고, 리신이 이소류신 대신 오혼입되거나; (p) 적어도 하나의 코돈이 AUC 또는 AUA이고, 아스파라긴이 이소류신 대신 오혼입되거나; (q) 적어도 하나의 코돈이 AUG이고, 리신이 메티오닌 대신 오혼입되거나; (r) 적어도 하나의 코돈이 CUU 또는 CUC이고, 히스티딘이 류신 대신 오혼입되거나; (s) 적어도 하나의 코돈이 CUA 또는 CUG이고, 글루타민이 류신 대신 오혼입되거나; (t) 적어도 하나의 코돈이 UUA이고, 이소류신이 류신 대신 오혼입되거나; 또는 (u) 적어도 하나의 코돈이 UUG이고, 메티오닌이 류신 대신 오혼입된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 상기의 적어도 하나의 코돈 중 임의의 것이 폴리뉴클레오티드 내에서 확인되면, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화된다. 일부 실시양태에서, 대안 코돈은 그 자체가 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성이다. 일부 실시양태에서, 대안 코돈은 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성이지 않다.

일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입은 폴리펩티드의 총 몰량의 약 1％ 미만, 약 0.5％ 미만, 약 0.2％ 미만, 약 0.1％ 미만 또는 약 0.01％ 미만으로 존재한다. 달리 말하면, 적어도 하나의 코돈 내에서의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로 인한 아미노산 오혼입의 정도 또는 비율은 약 1％ 미만, 약 0.5％ 미만, 약 0.2％ 미만, 약 0.1％ 미만 또는 약 0.02％ 미만이다. 전형적으로, 아미노산 오혼입의 정도 또는 비율은 약 0.5％ 이하이다. 가장 전형적으로, 아미노산 잔기 위치 당 오혼입의 정도 또는 비율은 약 0.2％ 이하이다.

이해될 바와 같이, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이의 전체 길이에 걸쳐 정확히 1개의 아미노산 오혼입을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 길이 및 코딩 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 이를 초과하는 개수의 오혼입을 포함한다.

역조작

본 발명가들은, 고도로 민감한 분석 기술을 사용하여, 번역 및/또는 전사 동안 아미노산 잔기 오혼입으로 인해 발생하는 저수준 서열 변이체가 이같은 적어도 하나의 오혼입된 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈을 확인하는 역할을 할 수 있다는 것을 알아냈다. 따라서, 본 발명은 역조작에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법은 상기의 최적화될 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득되는 폴리펩티드; 및/또는 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계를 일반적으로 포함한다. 본 발명에 따르면, 제2 폴리뉴클레오티드 내의 적어도 하나의 상이한 코돈은 본 발명의 방법이 실행되기 전에 알려져 있지 않다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드 내의 모든 코돈이 본 발명의 방법이 실행되기 전에 알려져 있지 않다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 또는 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열은 입수가능하지 않거나 또는 완전히 입수가능하지 않고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드만이 입수가능하고, 예를 들어 시판되며, 여기서 이러한 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 오혼입을 포함하는 저수준 서열 변이체를 포함한다.

폴리펩티드의 저수준 서열 변이체 내의 아미노산 잔기 오혼입의 존재 또는 부재, 정도 또는 유형을 결정함으로써, 이러한 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈을 확인할 수 있는데 (역조작), 이는 특정 아미노산 오혼입이 이같은 코돈에 대해 특이적이기 때문이다. 바람직하게는, Gly, Ser, Arg, Val, Ile 및 Leu를 코딩하는 적어도 하나의 코돈이 저수준 서열 변이체 내의 오혼입의 정도 또는 유형이 결정되었을 때 확인될 수 있다.

한 실시양태에서, 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록, 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 상기 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록, 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법은 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 상기 코돈을 대안 코돈으로 변화시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 확인 단계는 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 것을 포함하고, 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 상기 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록, 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화된다.

따라서, 미지의 (즉, 제2) 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈을 역조작하고, 공지된 서열을 상기의 적어도 하나의 코돈을 변화시키거나 상기 대안 코돈을 선택하는 것에 의해 최적화하여, 이렇게 최적화된 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드가 상기 오혼입과 관련하여 미지의 제2 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드와 상이하지 않거나 또는 실질적으로 상이하지 않을 것이 가능하다. 일부 실시양태에서, 대안 코돈은 그 자체가 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성이다. 일부 실시양태에서, 대안 코돈은 아미노산 오혼입(들)에 대해 감수성이지 않다. 이러한 방법은 최적화될 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임 내의 아미노산 오혼입에 대해 감수성인 각각의 코돈에 대해 독립적으로 수행될 수 있다. 그 후, 이렇게 최적화된 폴리뉴클레오티드의 조작 및 발현 시스템 내로의 전달이 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에서의 폴리펩티드의 발현을 발현되는 폴리펩티드의 동반되는 저수준 서열 변이체의 패턴 또는 "지문"이 미지의 제2 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드의 것과 유사하거나 동일한 방식으로 달성하는 것을 허용한다.

적어도 하나의 코돈의 확인은 "역조작 매트릭스"로 명명되는 하기 표에 따라 쉽게 행해질 수 있다.

<표 3>

따라서, 통상의 기술자는 표 3으로부터 본 발명의 방법에 따라 어떤 코돈이 변화되어야 할지 및/또는 어떤 대안 코돈이 선택되어야 할지를 이해할 것이다. 예를 들어, 적어도 하나의 Gly→Asp 오혼입의 존재가 소정의 폴리펩티드 (미지의 제2 폴리뉴클레오티드로부터 발현됨)의 저수준 서열 변이체 내에서 결정되면, 표 3의 제3행으로부터, 발현 시 Gly→Asp 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록 GGC 또는 GGU가, 최적화될 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈에 대한 대안 코돈으로서 선택되어야 한다고 이해할 수 있다.

대안적인 예에서, 적어도 하나의 Gly→Glu 오혼입의 존재가 소정의 폴리펩티드 (미지의 제2 폴리뉴클레오티드로부터 발현됨)의 저수준 서열 변이체 내에서 결정되면, 표 3의 제3행으로부터, 발현 시 Gly→Glu 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록 GGG 또는 GGA가, 최적화될 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈에 대한 대안 코돈으로서 선택되어야 한다고 이해할 수 있다.

표 3으로부터 이해될 바와 같이, 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시양태에서, 선택될 대안 코돈, 또는 변화될 상기의 적어도 하나의 코돈은 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, AUG, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UCA, UCC, UCG, UCU, UUA, UUG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 변화될 적어도 하나의 코돈은 AGA, AGC, AGG, AGU, AUA, AUC, CGA, CGC, CGG, CGU, CUA, CUC, CUG, CUU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG, GUU, UCA, UCC, UCG, UCU, UUA, UUG로 이루어진 군으로부터 바람직하게 선택된다.

역조작의 원리가 실시예 1에서 추가로 예시된다.

코돈 최적화

이해될 바와 같이, 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산 오혼입은 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 변경시킬 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 코돈 최적화 방법은 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 임의의 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 변경시키는데 사용될 수 있다.

본 발명가들은 발현되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 이의 1차 서열의 상당 부분에서 바뀌어서, 오전사 및/또는 오번역 이벤트로부터 초래되는 적어도 하나의 아미노산 오혼입을 포함하는 저수준 서열 변이체를 일으킬 수 있다는 것을 인지하였다. 이같은 저수준 서열 변이체는 어떠한 아미노산 잔기 오혼입도 포함하지 않는 천연 폴리펩티드에 비교하여 변경된 면역원성 잠재력을 나타낼 수 있다. 오혼입된 아미노산의 면역원성 잠재력을 기초로 하는 코돈 선택은 단백질 약물의 면역원성 잠재력을 추가로 저하시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 코돈 최적화가 생물의약품의 면역원성 잠재력을 감소시키는데 사용된다 (CORIP: codon optimization to reduce the immunogenic potential). 본 발명의 이러한 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기 오혼입은 상기 정의된 바와 같이 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 증가를 초래한다. 이러한 폴리펩티드가 대상체에서의 요법에서 사용되면, 면역원성 잠재력의 증가가, 예를 들어, 항-약물 항체의 형성을 초래할 수 있다. 치료 폴리펩티드의 반복 투여 후에 항-약물 항체 (ADA)가 형성되는 것은 영향 면에서 효능 상실에서 생명을 위협하는 상태까지의 범위에 이르는, 대상체에 대한 중대한 결과를 초래할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 코돈 최적화 방법은 각각 대안 코돈을 선택하거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈을 변화시킴으로써, 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 감소를 초래하는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 이러한 측면에서, 방법은 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 상기 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록 상기 코돈을 대안 코돈으로 변화시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 대안 코돈의 선택, 또는 상기의 적어도 하나의 코돈의 변화는 각각 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 감소를 초래한다. 이는 폴리펩티드의 면역원성 잠재력 감소가 요망되는 용도에서, 예를 들어, 치료 폴리펩티드를 개발할 때, 및 원본적으로 제공된 폴리펩티드가 허용불능성인 면역원성 및/또는 면역원성 잠재력을 나타내는 경우에 유용하다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기 오혼입은 상기 정의된 바와 같이 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 감소를 초래한다. 이러한 실시양태에서, 본 발명의 코돈 최적화 방법은 각각 대안 코돈을 선택하거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈을 변화시킴으로써, 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 증가를 초래하는 것을 포함한다. 이는 대상체에서의 강화 또는 증가된 면역 반응이 실제로 요망되는 용도에서, 예를 들어, 재조합으로 생산된 백신에서 유용하다.

한 실시양태에서, 표 2에 열거된 각각의 아미노산을 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로 인한 각각의 오혼입으로 개별적으로 변화시키고, 생성된 폴리펩티드 서열을 종래 기술, 예컨대 상기 정의된 바와 같은 문헌 [Bryson et al., 2010]; [De Groot & Moise, 2007]; [Perry et al., 2008,]에 기술된 컴퓨터 툴을 사용하여 T 헬퍼 세포 에피토프의 인 실리코 예측에 적용하고, 임의적으로는 동일한 툴을 사용하여 변경되지 않은 천연 폴리펩티드 서열에 비교함으로써, 적어도 하나의 아미노산 오혼입을 포함하는 폴리펩티드의 면역원성 잠재력이 평가된다. 폴리펩티드 내에서 변화되었을 때 최소의 면역원성 잠재력을 나타내는 변화된 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화하기 위해 선택된다. 추가 실시양태에서, T 헬퍼 세포 에피토프의 인 실리코 예측이 MHC II 결합 검정법을 포함하는 시험관 내 검정법, 또는 T 세포 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 생체 내 검정법에 의해 확증된다.

또 다른 실시양태에서, 표준 분자 생물학 기술에 의해 표 2에 열거된 각각의 아미노산을 비-왓슨-크릭 염기 미스매치로 인한 각각의 오혼입으로 개별적으로 돌연변이시키고, 생성된 폴리펩티드를 상기 정의된 바와 같은 적절한 시험관 내 검정법에 적용하고, 임의적으로는 동일한 툴을 사용하여 변경되지 않은 천연 폴리펩티드 서열에 비교함으로써, 적어도 하나의 아미노산 오혼입을 포함하는 폴리펩티드의 면역원성 잠재력이 평가된다. 폴리펩티드 내에서 돌연변이되었을 때 최소의 면역원성 잠재력을 나타내는 돌연변이된 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화하기 위해 선택된다. CORIP이 실시예 3에서 상세하게 예시된다.

본원에서 인용된 바와 같은 모든 출판물은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명이 하기의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이들은 본 출원의 청구범위에 의해 부여되는 보호 범주에 대해 제한적인 것으로 고려되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1 - 저수준 서열 변이체

표준 관행에 따른 소정의 폴리펩티드의 LC-MS/MS 분석이 천연 펩티드 STSGGTAALGCLVK 및 3개의 저수준 서열 변이체를 나타낸다. 천연 펩티드의 3개의 Gly 위치에서, Gly에서 Glu로 (G→E), 또는 Gly에서 Asp로 (G→D)의 아미노산 오혼입을 각각 포함하는 서열 변이체들이 표 4에 나타난 바와 같이 펩티드의 총량의 약 0.02％의 상대적 존재비로 확인된다.

<표 4>

서열 변이체 1은 표 4에서 강조된 바와 같이 아미노산 위치 4에 Gly 잔기 대신 Glu 잔기를 포함한다. Gly 대신 오혼입된 Glu 잔기는 도 2A에 나타난 바와 같이 전사 동안의 C*A 미스매치 또는 번역 동안의 G*U 미스매치에 의해 설명될 수 있다. 양쪽 모두의 미스매치가 유전자 코드에서의 G에서 A로의 염기 차이에 이를 수 있다. 상기 개시된 역조작 매트릭스 (표 3)에 따라, 코딩 폴리뉴클레오티드 내의 각각의 위치의 코돈이 GGG 또는 GGA인 것으로 확인될 수 있는데, 도 3에 도식적으로 도시된 바와 같이, 대안 코돈 GGC 또는 GGU는 상기 예시적인 펩티드의 위치 4에 Asp를 포함하는 또 다른 서열 변이체에 이를 것이기 때문이다.

서열 변이체 2 또는 3 각각은 표 4에서 강조된 바와 같이 아미노산 위치 5 또는 아미노산 위치 10에 Gly 잔기 대신 Asp 잔기 오혼입을 각각 포함한다.

도 3에 도시된 도식에 따라, 이러한 위치의 아미노산을 코딩하는 코돈은 GGC 또는 GGU이어야 하는데, 이러한 코돈들만이 각각 위치 5 또는 10에 Asp를 포함하는 서열 변이체에 이를 것이기 때문이다.

역조작에 의해 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 작업 흐름이 도 4에 도식적으로 도시된다. 표 3에 개시된 바와 같은 역조작 매트릭스가 이러한 작업 흐름의 핵심이고, 임의의 확인된 서열 변이체와 각각의 적어도 하나의 코돈 사이의 연계를 제공한다.

상기에서 사용된 LC-MS/MS 분석은 관련 기술 분야의 기술자의 일상에 속한다. 간략하게, 예를 들어 역상 LC에 의해, 폴리펩티드 샘플의 트립신 소화물을 분리한다. 최신식 질량 분광계, 예를 들어, Q 이그잭티브™ 하이브리드 쿼드러폴-오비트랩(Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap) 질량 분광계 (써모피셔(ThermoFisher))에서 검출을 수행한다. 저수준 서열 변이체는 천연 펩티드에 비해 0.001％ 내지 0.1％의 존재비로 존재한다. 따라서, 사용되는 질량 분광계는 감도가 충분하여야 한다. 데이터 획득 후, 종래 기술에서 널리 입수가능한 바와 같은 적합한 MS 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어, 엑스캘리버(Xcalibur)™ 소프트웨어 패키지 (써모피셔)를 사용하여 데이터를 평가한다.

실시예 2 - 역조작

역조작에 의해 최적화될 폴리뉴클레오티드로부터의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드를 인 실리코로, 예를 들어, 트립신에 의해 소화시킨다. 아미노산 잔기 Gly, Ser, Arg, Val, Ile, Leu 및 Met를 표 3에 개시된 바와 같은 역조작 매트릭스에 따라 이들의 각각의 서열 변이체로 교체하고, 바람직하게는 추출 이온 크로마토그램 (EIC)을 사용하여, 획득된 MS 데이터에서 이들의 존재에 대해 테스트한다. 특정 유형의 아미노산 잔기가 펩티드 내에 1회를 초과하여 존재하면, 도 5에 예시적으로 나타난 바와 같이, MS/MS 실험을 사용하여 이의 위치를 결정하여야 한다.

예시적인 펩티드인 VVSVLTVLHQDWLNGK는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 코돈을 역조작하기 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 아미노산 잔기 Gly, Ser 및 Val을 함유한다. 도 5는 Val에서 Met로 (V→M) 및 Val에서 Ile (V→I)의 아미노산 잔기 오혼입의 분석을 나타낸다. 표 3의 역조작 매트릭스에 따라, Val을 코딩하는 코돈은 저수준 서열 변이체 내에서의 아미노산 잔기 오혼입, 즉 V→I, V→M, V→D, 또는 V→K에 대해 감수성이다.

상기 아미노산 잔기 오혼입을 포함하는 각각의 가능한 펩티드의 이론적 질량을 계산하고, EIC를 추출한다. 도 5에 나타난 바와 같이, 아미노산 오혼입 V→I에 대해 3개의 피크가 확인되고, 아미노산 오혼입 V→M에 대해 1개의 피크가 확인되어, 폴리펩티드 내에 포함된 4개의 Val 잔기로 합계된다. 각각의 저수준 서열 변이체의 피크는 크로마토그래피에서 천연 펩티드의 피크에 바로 인접하여 확인된다 (± 5분). 아미노산 오혼입(들)의 위치를 결정하기 위해, 적절한 MS/MS 스펙트로그램을 획득하여야 한다. 본 실시예에서, V→M 위치의 결정이 충분한데, 표 3의 역조작 매트릭스로부터, 하기를 추론할 수 있기 때문이다:

a. 위치 1의 제1 Val이 코돈 GUG에 의해 코딩된다;

b. 위치 2, 4 및 7의 제2, 제3 및 제4 Val이 각각 GUA, GUC 또는 GUU에 의해 코딩된다 (도 5 참조).

추가적으로, 펩티드를 저수준 서열 변이체 V→D 및 V→K (U*U 미스매치에 기인함)에 대해서 또한 테스트할 수 있고, 이는 위치 2, 4 및 7의 제2, 제3 및 제4 Val을 코딩하는 각각의 코돈의 결정이 좁혀지게 한다.

상기 방법에 따라 결정된 적어도 하나의 코돈을 (부분적인) 역조작에 의해 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화하는데 사용할 수 있다. 상기 방법에 따라 코딩 폴리뉴클레오티드 서열 내의 적어도 하나의 코돈이 최적화되었으면, 폴리뉴클레오티드를 완전 합성, 또는 유전자 조작 및 분자 클로닝 기술에 의해 쉽게 제공할 수 있다.

이러한 방식으로, 코딩 서열이 공지되어 있지 않거나 완전히 공지되어 있지 않은 폴리펩티드, 예를 들어, 원본 생물제약 폴리펩티드와 비교하여 동일한 서열 변이체 패턴을 나타내는 바이오시밀러를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이 가능하다.

실시예 3 - 면역원성 잠재력을 감소시키기 위한 코돈 최적화 ( CORIP )

Gly는 GGA, GGG, GGC 및 GGU, 또는 DNA 상응물에 의해 각각 코딩될 수 있고, 표 2를 참조한다. 상기 표 2에 따라, 하기의 아미노산 오혼입이 발생할 수 있다:

a. Gly→Asp 또는 Gly→ Ser (코돈: GGC 또는 GGU); 또는

b. Gly→Glu 또는 Gly→Arg (코돈: GGG 또는 GGA).

상응하는 폴리펩티드의 면역원성 잠재력을 감소시키기 위해 어떤 코돈이 개별적인 위치에서 글리신을 코딩하도록 선택되어야 하는지를 결정하기 위해, 각각의 Gly 잔기를 상기 언급된 4개의 잠재적으로 오혼입되는 아미노산 잔기 각각으로 개별적으로 인 실리코로 치환한다. 예를 들어, 10개의 글리신 잔기를 함유하는 소정의 폴리펩티드 서열에 대해, 총 50개의 가설 단백질 서열이 생성될 것이다; 천연 단백질에 대한 10개, 및 서열 내의 1개의 Gly 잔기가 Asp, Ser, Glu 또는 Arg로 치환된 각각의 10개.

다음으로, 수득된 단백질 서열을 문헌에 기술된 바와 같은 컴퓨터 툴 (예를 들어 상기 기술된 바와 같은 NetMHCIIpan)을 사용하여 T 헬퍼 세포 에피토프의 인 실리코 예측에 적용한다. 그 후, 각각의 부위에 대해, 예측되는 MHC II 친화력에 따라 어떤 코돈이 사용될 것인지를 결정한다. 인 실리코 예측을 증명하기 위해 시험관 내 또는 생체 내 연구가 선택적이다 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같은, 합성된 펩티드의 MHC II 결합; T 세포 활성화 검정법 또는 MAPPS 검정법).

도 6에 도시된 도식이 이러한 절차를 추가로 예시한다: 이러한 예에서, 5개의 Gly 잔기를 포함하는 아미노산 서열 GRGLEWIGAIYPGNG를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 도 6은 각각 Arg 또는 Ser로 변화된 Gly 잔기 중 3개를 강조한다. 면역원성 잠재력의 인 실리코 예측을 6개의 대표적인 MHC II 대립유전자 (Southwood et al., J Immunol 1998, 160(7):3363-73)에 대해 NetMHCIIpan 서버를 사용하여 수행하였다. 면역원성 잠재력의 인 실리코 예측은 MHC II 결합 (IC₅₀ 값)이 양쪽 모두의 치환에 의해, 그러나 Gly→Arg 오혼입 (GGA 또는 GGG 코돈 내에서의 전사 및/또는 번역 미스매치로부터 초래됨)에 의해 더 큰 정도로 음성적으로 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 동일한 실험 방식으로, Asp (GGC 또는 GGU 코돈 내에서의 전사 및/또는 번역 미스매치로부터 초래됨) 및 Glu (GGG 또는 GGA 코돈 내에서의 전사 및/또는 번역 미스매치로부터 초래됨) 오혼입을 사용하여 면역원성 잠재력의 인 실리코 예측이 생성되었다.

요약하면, Gly→Ser 오혼입에 비교하여 Gly→Arg 오혼입의 MHC II 복합체에 대한 증가된 친화력은 잠재적으로 T 헬퍼 세포 에피토프를 반영한다. 따라서, 코돈 GGC 또는 GGU을 기술된 위치에서 Gly를 코딩하도록 선택하는 것을 추천할 수 있다.

표 2는 다수의 아미노산 잔기의 경우에, 모든 이용가능한 코돈이 동일한 오혼입에 이른다 (예를 들어, Y에 대한 2개의 코돈 모두가 H 또는 N 오혼입에 이른다)는 것을 또한 나타낸다. 이같은 시나리오에서는, 인 실리코 예측이 수행될 수 없다. 그러나, 필요하다면, 관심 유전자를 양쪽 모두의 코돈으로 디자인할 수 있고, 이어서 상기 언급된 바와 같은 시험관 내 또는 생체 내 검정법이 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 감소, 예를 들어, MHC II 결합에서의 감소 또는 T 세포 활성화에서의 감소를 초래하는 적어도 하나의 코돈을 확인 및 선택하는 것을 도울 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Sandoz AG <120> Sequence variants <150> EP 14 199 893.0 <151> 2014-12-22 <160> 7 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 1 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 2 Ser Thr Ser Glu Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 3 Ser Thr Ser Gly Asp Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 4 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Asp Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 5 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 6 Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment <400> 7 Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr 1 5 10 15

Claims

(a) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하는 단계;
(b) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 이러한 적어도 하나의 코돈에 대한 대안 코돈을 선택하는 단계;
(c) 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 대안 코돈으로 변화시키고, 여기서 상기의 적어도 하나의 코돈은 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인 단계; 또는
(d) 코돈에 상응하여 코딩되는 폴리펩티드 내의 위치에서의 아미노산 잔기 오혼입에 대해 감수성인, 코딩 서열 내의 적어도 하나의 코돈을 확인하고, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 변화시키도록, 상기 코돈을 대안 코돈으로 변화시키는 단계
를 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 최적화하는 방법.
제1항에 있어서,
(a) 상기의 최적화될 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득되는 폴리펩티드; 및/또는
(b) 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드
에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록, 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계를 포함하고,
여기서 동일한 폴리펩티드를 코딩하지만 상기의 적어도 하나의 코돈에서 최적화될 폴리뉴클레오티드와 상이한 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 수득가능한 상기 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형에 매칭되도록 각각 상기 대안 코돈이 선택되거나 또는 상기의 적어도 하나의 코돈이 변화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 아미노산 잔기 오혼입이 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 증가를 초래하는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 대안 코돈의 선택 또는 상기의 적어도 하나의 코돈의 변화가 각각 상기 폴리펩티드의 면역원성 잠재력의 감소를 초래하는 것인 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 면역원성 잠재력이 인 실리코(in silico)로, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 결정되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기 오혼입이 발현된 폴리펩티드의 총 몰량의 약 1％ 미만, 약 0.5％ 미만, 약 0.2％ 미만, 약 0.1％ 미만, 또는 약 0.02％ 미만으로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기 오혼입이 전사 또는 번역 동안의 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치의 결과인 방법.
제9항에 있어서, 적어도 하나의 비-왓슨-크릭 염기 미스매치가
(a) DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 C*A 미스매치;
(b) 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 G*U 미스매치;
(c) DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 A*C 미스매치;
(d) 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 U*G 미스매치;
(e) DNA 주형 가닥과 상기 DNA 주형 가닥으로부터 전사되는 mRNA 사이의 A*A 미스매치; 또는
(f) 번역 동안의 mRNA 코돈과 아미노-아실 tRNA의 안티코돈 사이의 U*U 미스매치
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 코돈이 글리신, 세린, 아르기닌, 발린, 이소류신, 류신 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 코딩하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 적어도 하나의 코돈이 GGC 또는 GGU이고, 아스파르테이트가 글리신 대신 오혼입되거나;
(b) 적어도 하나의 코돈이 GGG 또는 GGA이고, 글루타메이트가 글리신 대신 오혼입되거나;
(c) 적어도 하나의 코돈이 GGG 또는 GGA이고, 아르기닌이 글리신 대신 오혼입되거나;
(d) 적어도 하나의 코돈이 GGC 또는 GGU이고, 세린이 글리신 대신 오혼입되거나;
(e) 적어도 하나의 코돈이 AGC 또는 AGU이고, 아스파라긴이 세린 대신 오혼입되거나;
(f) 적어도 하나의 코돈이 CGG 또는 CGA이고, 글루타민이 아르기닌 대신 오혼입되거나;
(g) 적어도 하나의 코돈이 CGU 또는 CGC이고, 히스티딘이 아르기닌 대신 오혼입되거나;
(h) 적어도 하나의 코돈이 AGG 또는 AGA이고, 리신이 아르기닌 대신 오혼입되거나;
(i) 적어도 하나의 코돈이 GUA, GUU, 또는 GUC이고, 이소류신이 발린 대신 오혼입되거나;
(j) 적어도 하나의 코돈이 GUG이고, 메티오닌이 발린 대신 오혼입되거나;
(k) 적어도 하나의 코돈이 UUA 또는 UUG이고, 세린이 류신 대신 오혼입되거나;
(l) 적어도 하나의 코돈이 UCU, UCC, UCA 또는 UCG이고, 프롤린이 세린 대신 오혼입되거나;
(m) 적어도 하나의 코돈이 GUG 또는 GUA이고, 글루타메이트가 발린 대신 오혼입되거나;
(n) 적어도 하나의 코돈이 GUC 또는 GUU이고, 아스파르테이트가 발린 대신 오혼입되거나;
(o) 적어도 하나의 코돈이 AUA이고, 리신이 이소류신 대신 오혼입되거나;
(p) 적어도 하나의 코돈이 AUC 또는 AUU이고, 아스파라긴이 이소류신 대신 오혼입되거나;
(q) 적어도 하나의 코돈이 AUG이고, 리신이 메티오닌 대신 오혼입되거나;
(r) 적어도 하나의 코돈이 CUU 또는 CUC이고, 히스티딘이 류신 대신 오혼입되거나;
(s) 적어도 하나의 코돈이 CUA 또는 CUG이고, 글루타민이 류신 대신 오혼입되거나;
(t) 적어도 하나의 코돈이 UUA이고, 이소류신이 류신 대신 오혼입되거나; 또는
(u) 적어도 하나의 코돈이 UUG이고, 메티오닌이 류신 대신 오혼입되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기 오혼입의 정도 또는 유형을 결정하는 단계가 질량 분광법 (MS), 임의적으로는 LC-MS/MS, HPLC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS, 또는 나노HPCL-MS/MS를 포함하는 MS의 사용을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 제약상 활성 폴리펩티드인 방법.
(a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 코딩 서열을 최적화하는 단계;
(b) 조작될 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드(들)를 최적화된 코딩 서열의 상응하는 뉴클레오티드(들)로 치환하는 단계
를 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조작하는 방법.