KR20170079786A

KR20170079786A - 위암 예후 예측용 바이오 마커 조성물

Info

Publication number: KR20170079786A
Application number: KR1020150190746A
Authority: KR
Inventors: 우현구; 장규윤; 박시형; 김민재; 조유나
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2017-07-10
Also published as: KR101906657B1

Abstract

본 발명은 예후가 좋지 않은 위암 환자와 호전된 예후를 보이는 위암 환자의 PARP1 또는 FOXO3A 유전자 발현 차이를 확인한 것으로, PARP1 발현이 높은 환자의 경우 종양, 침습, 림프절 전이 및 정맥 침습과 같은 안 좋은 예후를 보였고, FOXO3A 발현이 높은 환자의 경우, 좋은 예후를 보였다. 특히 PARP+/FOXO3A- 발현을 보이는 환자의 경우 좋지 않은 예후를 보였으므로, PPAR1 또는 FOXO3A를 독립적 또는 병합으로 위암 예후 예측용 마커로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

위암 예후 예측용 바이오 마커 조성물{Biomarker composition for predicting prognosis of gastric cancer}

본 발명은 위암 예후 예측용 바이오마커 조성물, 키트, 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법 또는 위암 전이 억제용 약학 조성물에 대한 것이다.

위암은 전세계적으로 암으로 인한 사망 원인의 2위를 차지하며 한국에서도 주요 암 사망의 원인 중 하나이다. 위암의 근본적인 치료는 수술적인 제거이지만, 조기 위암을 제외하고는 수술적 절제 후에도 상당수의 환자에서 재발된다. 2기 위암의 경우는 5년 생존율이 30-70%, 3기 위암의 경우는 5-30%에 불과하다. 같은 병기의 환자들에 대한 치료적 완전절제술 후 예후를 예측하는 것은 여전히 답보 상태이다. 임상적, 병리적 분류법을 이용하여 위암의 예후를 예측하는 모델을 만들기 위한 상당한 연구가 있었음에도, 수술 후에 재발할 확률이 높아 수술 후 보조적 항암치료가 필요한 환자군과 재발 확률이 낮아 수술 후 보조적 항암치료의 필요성이 낮은 환자군을 구별하는 방법은 정립되어 있지 않다. 그렇기 때문에 현재는 수술이 가능한 위암 환자의 경우 모두 일괄적으로, 치료적 완전절제술을 받고 조기 위암인 경우를 제외하고는 대부분 추가적인 보조 항암치료를 받는다.

그러나, 수술적 병기가 같은 경우에도 수술 후 환자의 예후는 다양하게 나타나기 때문에 각 환자에 맞는 정확한 예후의 예측과 맞춤치료가 절실히 필요한 상황이다. 진행성 위암의 경우에도 마찬가지로 동일한 치료를 함에도 환자에 따라 예후가 매우 다양하게 나타나므로 정확한 예후 예측이 절실히 필요하다. 이러한 위암의 임상적 다양성은 위암의 분자생물학적인 다양성 때문이라고 할 수 있고, 이는 여러 유전자의 변화에 의한다. 그러나 이에 대한 연구는 아직 미미한 실정이며 위암의 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커로 승인되어 사용중인 것은 없는 상태이다.

1. 한국등록특허 10-1026676호.

따라서 본 발명은 위암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 위암 예후 예측용 키트를 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한 본 발명은 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한 본 발명은 위암 전이 예방 또는 억제용 약학 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물학적 시료로부터 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질을 포함하는 위암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자로 엔코딩된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 위암 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 위암 환자 시료로부터 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PARP1 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 억제제 또는 상기 PARP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 전이 예방 또는 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 FOXO3A 유전자의 mRNA 발현을 활성화하는 효능제 또는 FOXO3A 단백질의 발현 촉진 또는 활성을 활성화하는 효능제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 전이 예방 또는 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 예후가 좋지 않은 위암 환자와 호전된 예후를 보이는 위암 환자의 PARP1 또는 FOXO3A 유전자 발현 차이를 확인한 것으로, PARP1 발현이 높은 환자의 경우 종양 침습, 림프절 전이 및 정맥 침습과 같은 안 좋은 예후를 보였고, FOXO3A 발현이 높은 환자의 경우 좋은 예후를 보였다. 특히 PARP+/FOXO3A- 발현을 보이는 환자의 경우 좋지 않은 예후를 보였으므로, PPAR1 또는 FOXO3A를 독립적 또는 병합으로 위암 예후 예측용 마커로 사용할 수 있다.

도 1은 PPAR1 억제에 의한 위암 세포의 성장 억제를 확인한 결과이며,
도 2는 PARP1 억제에 의한 FOXO3A 발현 유도 및 G2/M 세포주기 정지를 확인한 결과이며,
도 3은 환자의 생존에 대한 수신기 동작 특성 곡선(receiver operating characteristic curve, ROC) 분석을 수행하여, PARP1 및 FOXO3A의 양성 면역염색의 컷오프(cutoffs)를 결정한 결과이며,
도 4는 위암 환자의 코호트(cohort)에서 임상 병리학적 특징(Clinico-pathological features)과 PARP1 또는 FOXO3A의 발현 상태를 비교 확인한 결과이며,
도 5는 PARP1 및 FOXO3A의 발현 위치(도 5A) 및 PARP1 및 FOXO3A의 발현을 통한 전체 생존율(overall survival, OS) 또는 무-재발 생존(recurrence-free survival, RFS)의 예측(도 5B)에 대한 결과이며,
도 6은 PARP1 또는 FOXO3A의 발현 상태를 기초로 분류한 서브그룹에 대해 카플란-메이어 플롯(plot) 분석을 수행하여, PARP1 또는 FOXO3A의 발현으로 독립적으로 위암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인한 결과이며,
도 7은 로렌 분류에 따른 각각의 하위 유형에 대해 카플란 메이어 플롯 분석을 수행하여, PARP1 또는 FOXO3A 발현과 위암 환자의 예후를 비교한 결과이며,
도 8은 로렌 분류에 따른 하위 유형에 있어서 올라파립(Olaparib)의 위암 세포의 성장 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 9는 PARP1의 면역염색 강도 또는 FOXO3A의 면역염색 강도를 기반으로 환자를 분류한 후, 각각의 예후를 확인한 결과이며,
도 10은 PARP1 및 FOXO3A의 면역염색 점수(immunostaining scores)의 연관성을 확인한 결과이며,
도 11은 PARP1 및 FOXO3A의 결합된 발현 상태가 위암 환자의 임상적 결과의 예측에 있어서 더 높은 신뢰성을 가지는 것을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 위암 예후를 예측할 수 있는 방법을 연구하던 중, 예후가 좋지 않은 환자와 호전된 환자의 PARP1 또는 FOXO3A 유전자 발현 차이를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 PARP1(poly(ADP-ribose)polymerase1)는 17 개의 단백질로 구성된 큰 집단을 말하며 본 발명의 PARP1은 113kDa 크기의 단백질로, 핵에 위치하고 있다. PARP1 유전자는 염색체 1(1q42.12) 번의 긴 팔에 위치하며 모두 네 개의 도메인을 가지고 있다: 촉매작용(catalytic), 자동수정(auto-modification), 카스파제 절단 (caspase-cleaved), 그리고 DNA 결합(DNA-binding) 도메인.

PARP1은 DNA break binding 및 손상 위치에 DNA 복구 단백질을 포집하여 염기 삭제 복구 경로 (base excision repair pathway) 에 중요한 역할을 한다. PARP1 은 중합효소의 일종으로 NAD⁺에서 ADP(adenosine diphosphate)를 활성화하는 대상 단백질이다. 그 주요 기능 중 하나는 단일가닥 DNA 절단 (single strand DNA breaks, SSB)을 수복하는 역할을 하며 암에서 높은 발현을 보인다.

상기 FOXO3A(Forkhead box O3A)은 포크 헤드(fork head) 클래스 'O'의 멤버 (FOXO)로 전사인자 패밀리이다. FOXO3A 유전자는 염색체 6(6q21) 번의 긴 팔에 위치하며 DNA 손상 복구, 아폽토시스, 세포주기 조절과 같은 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼을 제어한다.

FOXO3A은 종양 억제 전사 요인 유전자로 주로 세포주기 정지 및 / 또는 세포사멸에 대한 책임이 있는 p27, 빔(Bim), 파스 리간드(Fas ligands), 그리고 GADD45알파(GADD45α)와 같은 주요 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명은 생물학적 시료로부터 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질을 포함하는 위암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

더불어 본 발명은 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자로 엔코딩된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 위암 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 항체는 다클론성 항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론 항체(monoclonal antibody)이다.

상기 다클론성 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원으로 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조할 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양 또는 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.

상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 발현된 단백질을 마우스에 면역화시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 림프구를 인간 또는 마우스의 골수종(myeloma)과 융합하여 불멸화된 하이브리도마(hybridoma)를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA)을 사용하여 모노클노날 항체의 생성 여부를 확인하고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써, 단일클론 항체를 제조할 수 있다.

상기 단일클론 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 결합된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응 시킴으로써 정량분석할 수도 있고, 또는 직접 상기 단백질에 대한 단일클론 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 결합된 것을 사용하여 정량분석할 수 있다.

상기 단백질과 항체의 반응은 웨스턴 블랏(western blot), 면역침강법(Immunoprecipitation, IP), 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA) 및 면역염색법(Immunohistochemistry, IHC)등의 단백질 확인 실험을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체를 포함하는 키트는 전형적으로 동결건조 형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있으며, 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

또한 본 발명은 위암 환자 시료로부터 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 PARP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 높게 측정되거나, 상기 FOXO3A 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 낮게 측정되면 전이 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더불어 본 발명은 PARP1 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 억제제 또는 상기 PARP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 전이 예방 또는 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 올라파립(Olaparib), 벨리파립(veliparib), 니라파립(Niraparib), 탈라조파립(talazoparib) 및 으로 루카파립(Rucaparib)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 올라파립이지만 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 참고예 1> 시약

마우스 항-β-액틴 항체(Mouse anti-β-actin antibody) 및 디메틸 설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO), 글리세롤(glycerol), 글리신(glycine), 염화 나트륨(sodium chloride), 티아졸일 블루 테트라졸리움 브로마이드(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide), 트리즈마 염기(Trizma base) 및 트윈 20(Tween 20)은 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 마우스 항-PARP1(mouse anti-PARP1) 및 래빗 항-FOXO3A(Rabbit anti-FOXO3A) 항체는 산타크루즈(Santa Cruz, CA)에서 구입하였고 래빗 항-카스파제 3(Rabbit anti-caspase3) 및 래빗 항- 박스 항체(rabbit anti-Bax antibody)는 셀 시그널링(Cell Signaling, Danvers, MA)에서 구입하였다. 고트 항-마우스(Goat anti-mouse) 및 고트 항- 래빗 홀스래디쉬 페록시다아제 결합된 IgG(Goat anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated IgG)는 잭슨 면역연구소(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에서 얻었다. ECL(electrochemiluminescence) 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Western Blotting Detection Reagents)은 Genedepot(Barker, TX) 에서 구매하였으며, PARP1 저해제인 올라파립(Olaparib)은 셀렉캠(Selleckchem)에서 구매하였다.

< 실시예 1>

Ⅰ. 실험방법

1. 세포배양

인간 위암 세포주인 MKN28, MKN74, NCIN87, MKN45 및 KATOⅢ를 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 구입하였고 이를 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, NY, U.S.)와 5%(Penicillin/Streptomycin, P/S, Gibco, NY, U.S.)이 포함되어 있는 PMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640, GlutaMAX™, Gibco, NY, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다.

2. siRNA 매개성 넉-다운( siRNA mediated knock-down)

비 타겟팅 대조군 siRNA(Non-targeting control siRNA)와 인간 PARP1(siRNAs against human PARP1) 및 FOXO3A에 대한 siRNA는 산타크루즈에서 구매하였으며, 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen, CA)를 이용하여 지침서를 따라 세포에 형질주입(transfect)하였다.

3. 콜로니 형성 분석(Colony formation assay)

0.5×10³ 세포를 60Ø 배양 접시에 분주하여 18시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, DMSO를 대조군으로써 처리해 주고 올라파립(2.5μM) 또는 PARP1 siRNA(100 nM)을 지시된 농도만큼 14시간 동안 처리해주었다. 그런 후 콜로니를 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2번 세척해 주고 3.7% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)로 고정하고 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet, Aldrich, USA)가 포함된 증류수로 10분간 염색시켰다. 10분 후 PBS로 크리스탈 바이올렛의 색이 없어질 때까지 세척한 후 건조시키고 스캐너를 사용하여 올라파립을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 비교하였다.

4. 세포 수 분석(Cell counting assay)

세포(1×10⁴)를 배양접시에 분주한 후, 18시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포에 올라파립(2.5μM)을 0, 24, 72 및 90시간 처리하였다. 이때 대조군으로써 DMSO를 처리하였다. 각 시간당, 혈구계산기(hemocytometer)를 이용하여 세포의 수를 확인하였다.

5. 실시간 qPCR (Real-time qPCR )

총 RNA는 엠아이알바나^TM miRNA 추출 키트(mirVanaTM miRNA Isolation kit, Ambion)FNF 이용하여 세포로부터 준비하였다.

준비한 총 RNA의 2μg 은 고효율 cDNA 역전사 키트(High Capacity cDNA Reverse Transcription kit, Applied Biosystem)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

유전자 발현의 레벨은 CF96^TM 광학 모듈(Optics Module, BIO-RAD)와 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 결정하였다. 이때 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 발현은 대조군으로 측정하였다.

유전자	서열	방향	서열번호
PARP1	5′-CTA CTC GGT CCA AGA TCG-3′	정방향	1
PARP1	5′-TTG AAA AAG CCC TAA AGG CTC A-3′	역방향	2
FOXO3A	5′-TCT ACG AGT GGA TGG TGC GTT-3′	정방향	3
FOXO3A	5′-CGA CTA TGC AGT GAC AGG TTG TG-3′	역방향	4
GAPDH	5′-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3′	정방향	5
GAPDH	5′-TTC TAG ACG GCA GGT CAG GT-3′	역방향	6

모든 반응은 2번 반복하였으며, 정량을 위해 2- ^ΔΔCt 를 사용하였다.

6. 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)

1×10⁴ 세포/6 웰 플레이트의 각 웰을 PBS로 한 번 세척한 후 단백질가수분해효소(protease) 및 인산화가수분해(Phosphatase) 억제제가 포함된 용해 버퍼를 이용하여 4℃에서 30분간 용해하였다. 용해물을 10,000 rpm의 속도로 10분간 원심분리한 후, 6%, 10% 또는 12% SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 단백질 사이즈별로 분류하였다. 그런 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membranes, Bio-Rad)에 전기적으로 이동시켰다.

멤브레인을 3% BSA(bovine serum albumin, GenDEPOT, USA)를 용해한 TBST(0.1% Tween 20을 포함한 Tris buffered saline)으로 1시간 동안 블럭킹한 후, 각각의 1차 항체를 4℃에서 24시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST로 세번 세척한 후, 1시간 동안 각각의 2차 항체(1:3000 또는 1:5000 희석)와 반응시켰다. 그런 후 단백질의 발현을 ECL 용액을 이용하여 가시화하였다.

7. MTT(3- (4,5- dimethylthiazol -2- yl )-2,5- diphenyltetrazolium bromide)분석

세포(2×10³)를 96웰 플레이트에 분주한 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 밤새 배양하였다. 올라파립 및 DMSO를 정해진 시간 동안 처리해준 후, 20 μL MTT 용액(인산염 버퍼(phosphate buffer) 내 5mg/mL)을 각 웰에 첨가해 주고 2시간 동안 반응시켰다. 생성된 파란색 결정을 DMSO(200 μL)에 용해한 후, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정해 정량하였다.

8. 유동세포 분석(Flow cytometry analysis)

올라파립 또는 FOXO3A siRNA를 처리한 세포를 수확하여 PBS로 2번 세척하고 70% 차가운 에탄올로 4℃에서 밤새 고정시켰다. 분석 전, 세포를 PBS로 2번 세척하고, 400 μL PBS에 재현탁한 후, 100 μg/mL RNase A(Sigma-Aldrich) 및 50 μg/mL PI(propidium iodide, Sigma-Aldrich)를 처리하였다.

37℃에서 30분간 반응시킨 후, 세포의 DNA 함량을 분석하였다. PI 형광(fluorescence)은 FACS CantoⅡ(Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였고 BD FACSDIVA 7.0 (Becton Dickinson)를 이용하여 적어도 10,000개 세포로부터 데이터를 분석하였다. 세포 주기(cell cycle) 분포는 ModiFit LT 소프트웨어를 사용하여 산출하였다.

9. 환자 및 표본(specimens)

조직 마이크로어레이(Tissue microarray) 분석은 위선암(gastric adenocarcinoma) 166 케이스의 표본을 이용하여 수행하였다.

1997년 1월부터 2005년 12월까지 전북대학교 병원(Chonbuk National University Hospital)에서 근치 위 절제술(radical gastrectomy)을 받은 환자의 샘플로 사용하였다.

이 위암의 세트는 종양 단계별 수술 (각 스테이지 I, Ⅱ, Ⅲ 및 IV에 대해 원래 50 케이스) 성별, 연령(± 2 년) 및 AJCC(American Joint Committee on Cancer) 병기분류 시스템(staging system)의 6판을 기반으로 한 수술-의 역련(calendar year of surgery-)(± 2 년)에 대하여 일치된 집합이다.

그 후, 우리는 166 케이스를 AJCC 병기분류 시스템 7 판의 가이드 라인에 따라 재분류(re-staged)하였고, 세계 보건기구(World Health Organization, WHO)의 분류 기준에 따라 검토하였다.

본 연구는 전북 대학교 병원의 기관 심사위원회에서 승인되었으며 동의서는 헬싱키 선언에 따라 제공되었다.

환자는 연령, 성별, 수술 전의(preoperative) 혈청 암태아성 항원( carcinoembryonic, CEA)과 종양 표지자 CA 19-9(carbohydrate antigen 19-9) 수치, 종양의 단계(I 과 Ⅱ vs Ⅲ 과 IV), 림프절(lymph node) 전이 존재, 원격 전이(distant metastasis) 유무, 정맥 침략(venous invasion)의 존재, 조직학적(histologic) 유형의 존재에 따라 WHO의 분류, 조직학적 등급의 관(tubular) 암종 및 유두(papillary)암종, 로렌 분류(Lauren classifications), 종양 침윤에 따라 분류하였다[초기 위암(early gastric carcinoma, EGC) vs. 후기 위암(advanced gastric carcinoma, AGC)]. 환자의 전체 생존율(overall survival, OS) 및 무-재발 생존(recurrence-free survival, RFS)에 대한 후속의 종결 포인트(follow-up end point)는 마지막 접촉 또는 2011년 12월까지의 사망년월일(date of death)이었다.

10. 조직- 마이크로어레이 (tissue- microarray )

환자들로부터 수술로 적출한 암 조직의 파라핀 함몰 조직-마이크로어레이 블럭(paraffin-embedded tissue microarray blocks)을 이용하여 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemistry, IHC)을 수행하였다.

케이스 당 3.0 mm 코어 정도 크기로 조직 마이크로 어레이 분석을 하였다. 조직 절편을 20분 동안 pH 6.0 시트르산 나트륨 완충액(sodium citrate buffer)의 마이크로파 항원 검색 절차(microwave antigen retrieval procedure)로 처리하였고 마커는 PARP1 (H-300) (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 FOXO3A (D19A7) (1: 100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 사용하였다. 인간의 위 샘플에서 PARP1 및 FOXO3 에 대한 면역조직화학 염색에 대한 평가는 임상 정보에 대한 지식 없이 두 명의 병리학자(Jang KY과 Kim KM)의 합의에 의해 수행되었다.

PARP1 및 FOXO3A에 대한 점수화(scoring)은 일반적으로 핵 발현의 평가를 위해 사용되는 올레드 점수 시스템(Allred scoring system)을 따라 수행되었다.

핵의 염색 강도는 0(염색되지 않음), 1(약한 염색), 2(중급 수준의 염색) 또는 3(강한 염색)으로 점수화하였다.

염색 구역은 점수에 따라 평가하였다: 0(염색된 세포 없음), 1(세포의 1% 양성 염색), 2(세포의 2-10% 양성 염색), 3(세포의 11-33% 양성 염색), 4(세포의 34-66% 양성 염색) 및 5(세포의 66-100% 양성 염색).

강도 점수의 합계 및 비율 점수(proportion score)는 그 후의 분석을 위해 사용하였다. 최대 합계 점수는 8이었고 최소 합계 점수는 0이었다.

Ⅱ. 실험 결과

1. PPAR1 억제에 의한 위암 세포의 성장 억제

PARP1의 종양 억제 활성을 확인하기 위해 PARP1을 저해시키는 약물인 올라파립을 인간 위암 세포주인 NCIN87, MKN28 및 MKN74에 IC50 값(10uM) 외의 여러 농도로 처리한 후 세포 증식(Cell proliferation)을 알아보는 실험인 MTT 분석, 세포 카운팅, 콜로니 형성 분석을 수행하였다.

올라파립의 처리는 농도 의존적으로(dose-dependent manner) 암세포의 성장을 억제하는 것을 보여주었다(도 1A, 상단). 72시간이 지난 후, 올라파립의 IC50은 세 종류의 세포주에서 약 10μM이었다.

세포 카운팅 분석에서 올라파립 처리에 의해 시간 의존적인(time- dependent) 성장 억제를 확인할 수 있었다. 세포의 수는 5일 동안 올라파립(2.5μM)을 처리하였을 때 대조군에 비하여 현저히 감소되었으며(도 1A, 중간) 콜로니 형성 능력 또한 올라파립 처리에 의해 감소되었다(도 1A, 하단).

더불어 PARP1 억제를 통한 올라파립의 효과를 확인하기 위하여 siRNA 매개성 넉다운(knock-down) 실험을 수행하였다.

올라파립 처리와 유사하게, siRNA에 의한 PARP1의 넉-다운은 위암 세포의 콜로니 형성 및 증식을 현저히 억제하였다(도 1B 및 도 1C).

그러나 PARP1 siRNA-형질주입된 세포에서 올라파립의 처리는 세포 증식에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았으므로, 이를 통해 올라파립의 종양 억제 효과가 PARP1의 비활성화에 의한 것임을 알 수 있었다(도 1D).

2. PARP1 억제에 의한 FOXO3A 발현 유도 및 G2/M 세포주기 정지

FOXO3A는 PARP1의 추정되는 작동인자 다운스트림 타겟(putative effector downstream target) 중 하나로 여겨지고 있다.

이러한 이론을 확인하기 위해, FOXO3A의 발현에 있어서 올라파립의 효과를 확인하였다.

그 결과 웨스턴 블롯팅 분석에서 MKN28 및 MKN74 세포에서 올라파립의 처리는 농도 의존적으로 FOXO3A의 발현을 상향 조절(up-regulate)하였다(도 2A).

뿐만 아니라, 올라파립을 FOXO3A 넉-다운 세포에 처리하였을 때, 올라파립에 의한 성장 억제 효과가 FOXO3A 발현의 넉-다운에 의하여 부분적으로 저하되었다(도 2B).

그에 반해서, FOXO3A의 넉-다운은 PARP1 mRNAs 및 단백질의 발현 레벨에 영향을 미치지 않았다(도 2C 및 도 2D).

이러한 결과를 통해 FOXO3A는 PARP1 억제제의 종양 억제 효과에 대한 다운스트림 타겟 중 하나임을 알 수 있었다.

이와 더불어, PARP1 억제의 종양억제 효과가 FOXO3A 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 추정하였으며, 이에 따라 종양 성장에 있어서 PARP1 억제의 효과가 세포사멸(apoptotic) 절차를 거치는지 확인하였다.

그 결과 올라파립 처리에 의한 카스파제 3 또는 박스(Bax)와 같은 프로-세포사멸 단백질(pro-apoptotic proteins)의 발현은 관찰되지 않았다. 따라서 올라파립의 효과는 세포사멸 절차를 거치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 2E).

FOXO3A는 DNA 손상시 세포주기 정지 활성화를 통한 DNA 복구 계기(trigger)인 것으로 알려져 있기 때문에 세포주기 시스템에서 올라파립의 효과를 유동세포 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 올라파립(10μM)를 처리하고 대조군 세포와 비교하였을 때(1일, 2일 및 3일에서 11%, 15% 및 19%, 각각) G2/M기 세포의 비율(1일, 2일 및 3일에서 21%, 23% 및 28%, 각각)이 상당히 증가하였다(도 2F). 또한 siRNAs를 이용하여 FOXO3A 발현을 넉-다운하였을 때, 올라파립에 의한 G2/M기에 정지된 세포의 비율은 상당히 감소되었다(도 2G).

따라서 위암 세포에서 PARP1 억제는 FOXO3ADML 활성화를 통해 G2/M 세포 주기 정지를 유도한다는 것을 알 수 있었다.

3. PARP1 및 FOXO3A 발현과 위암 환자의 임상적 임상(clinical outcome)의 연관성

환자의 생존에 대한 수신기 동작 특성 곡선(receiver operating characteristic curve, ROC) 분석을 수행하여, PARP1 및 FOXO3A의 양성 면역염색의 컷오프(cutoffs) 값을 최고 및 최저 AUC(area under the curve)에서 선택하여 최고 가능도 비율(likelihood ratio)을 갖도록 결정하였다.

이 분석을 기반으로 PARP1-양성 그룹은 컷오프 점수 7로 결정하였고, FOXO3A 양성 그룹은 컷오프 점수 6으로 결정하였다(도 3).

위암 환자의 코호트(cohort)에서 임상 병리학적 특징(Clinico-pathological features) 및 PARP1 및 FOXO3A의 발현 상태는 도 4에 나타내었다.

전반적으로, PARP1 및 FOXO3A 단백질의 양성 염색은 각각 54%(166 중 89) 및 19%(166 중 32)으로 확인되었다.

PARP1의 발현이 특징적으로 확인된 그룹은 높은 병기 (P < 0.001), 종양 침습 (P < 0.001), 림프절 전이 (P < 0.001) 및 정맥 침습 (P = 0.017)과 관련이 있었다.

반면, FOXO3A의 발현이 특징적으로 확인된 그룹은 낮은 병기 (P = 0.019) 와 EGC (P = 0.042) 에서 유의한 수치가 나왔다.

따라서 PARP1 발현은 위암의 공격적인 표현형(aggressive phenotypes)과 관련이 있으며, FOXO3A 발현은 위암의 덜 공격적인 표현형과 관련이 있다는 것을 확인할 수 있었다.

더불어 위암 세포에서 PARP1 및 FOXO3A 발현의 생물학적 관계(biological relevance)를 확인하기 위해, 위암 환자 166 케이스에서 조직 마이크로어레이를 수행하였다.

면역화학적 염색은 PARP1 및 FOXO3A의 발현을 의미하며, 종양 세포의 핵에 위치하였고, 세포질(cytoplasm)에서는 약한 발현을 보였다. 그러므로 오직 핵에서의 PARP1 및 FOXO3A의 발현을 고려하였다(도 5A).

일도량의 콕스 회귀분석(Univariate Cox regression analysis) 결과는 짧은(shorter) 전체 생존율(OS) 및/또는 무-재발 생존(RFS)과 연관된 몇 가지 임상적 특징을 보여주었다(표 2). 이는 CEA의 수술 전 혈청 레벨 및 CA 19-9, 종양 단계(tumor stage), 림프절 전이, 종양 침습 분류 및 정맥 침습을 포함한다.

특징	n	OS		RFS
특징	n	사망위험률(hazard ratio, HR)(95% CI)	P -값	HR (95% CI)	P -값
일변량 분석( Univariate analysis)
CEA, 상향조정된 (vs. 정상)	30/136	2.024 (1.230-3.330)	0.006	1.917 (1.170-3.144)	0.01
CA19-9, 상향조정된 (vs. 정상)	16/136	2.510 (1.376-4.580)	0.003	2.275 (1.251-4.138)	0.007
TNM 단계, Ⅲ 및 IV (vs. I 및 Ⅱ)	93/166	4.660 (2.865-7.581)	< 0.001	4.488 (2.802-7.186)	< 0.001
종양 전이, AGC (vs. EGC)	135/166	3.539 (1.711-7.320)	< 0.001	3.767 (1.823-7.785)	< 0.001
LN 전이, 존재 (vs. 부재)	110/166	3.696 (2.178-6.271)	< 0.001	3.737 (2.230-6.261)	< 0.001
정맥 침습, 존재 (vs. 부재)	30/166	2.724 (1.705-4.352)	< 0.001	2.654 (1.666-4.229)	< 0.001
PARP1, 양성 (vs. 음성)	89/166	2.190 (1.424-3.370)	< 0.001	2.143 (1.406-3.265)	< 0.001
FOXO3A, 음성 (vs. 양성)	134/166	3.893 (1.800-8.416)	< 0.001	3.453 (1.673-7.127)	< 0.001
*다변량 분석(Multivariate analysis)**
TNM 단계, Ⅲ 및 IV (vs. I 및 Ⅱ)		3.444 (1.922-6.171)	< 0.001	3.345 (1.918-5.836)	< 0.001
PARP1, 양성 (vs. 음성)		1.783 (1.090-2.915)	0.021	1.756 (1.089-2.830)	0.021
FOXO3A, 음성 (vs. 양성)		6.958 (2.163-22.383)	0.001	5.351 (1.929-14.845)	0.001

더불어 PARP1-양성의 환자 그룹은 상당히 짧은 OS(HR: 2.19, 95% CI: 1.424-3.370, P < 0.001) 및 RFS(HR: 2.143, 95% CI: 1.406-3.265, P < 0.001)를 보였다.

반대로, FOXO3A-음성의 환자 그룹은 짧은 OS(HR: 3.893, 95% CI: 1.800-8.416, P < 0.001) 및 RFS(HR: 3.453, 95% CI: 1.673-7.127, P < 0.001)를 보였다.

카플란-메이어 분석(Kaplan-Meier analyses) 또한 세 가지 특징(종양 단계, PARP1 및 FOXO3A)을 통한 각각 OS 및 RES의 예후 예측을 보여주었다(log-rank test, P < 0.001, 도 5B).

추가적으로, PARP1 또는 FOXO3A의 발현 상태를 기초로 분류한 서브그룹에 대해 카플란-메이어 플롯(plot) 분석을 수행하여 PARP1과 FOXO3A 발현의 예후 의미가 서로 독립적인지 확인하였다.

그 결과 PARP1의 발현 상태를 통해 서브그룹의 FOXO3A의 발현 상태와 관계없이 예후를 예측할 수 있었다(도 6A 및 도 6B).

또한, FOXO3A의 발현 상태를 통해 서브그룹의 PARP1 발현 상태와 관계없이 예후를 예측할 수 있었다(도 6C 및 도 6D).

또한 상기 표 2에서 다변량 분석 또한 종양 단계 및 PARP1 및 FOXO3A의 발현을 통해 독립적으로 OS 및 RFS를 예측할 수 있음을 확인하였으므로 PARP1 및 FOXO3A 발현은 위암 환자의 임상적 예후 예측에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

더불어 도 4에서 확인한 PARP1 및 FOXO3A 단백질의 발현과 로렌 분류의 상당한 연관성(P = 0.035 및 P = 0.007, 각각)을 통해 올라파립의 효과 및/또는 PARP1 및 FOXO3A의 예후 연관성이 로렌 분류의 하위 유형(subtype)간에 차이가 있을 수 있음을 예상하였다.

따라서 로렌 분류의 각각의 하위 유형에 대해 카플란 메이어 플롯 분석을 수행하였다.

그 결과 하위 유형과 관계없이, PARP1-양성 종양은 좋지 않은 OS 및 RFS를 보이는 반면, FOXO3A-양성 종양은 호전된 OS 및 RFS를 보였다(도 7).

또한 PARP1 억제제가 종양 타입 간에 다른 영향을 미치는지 확인하였다. 올라파립의 처리는 확산형-유래된 위암 세포(diffuse type-derived gastric cancer cells, MKN45 및 KATOⅢ) 뿐만 아니라 창자형-유래된 위암 세포(intestinal type-derived gastric cancer cells, MKN28 및 MKN74)에 있어서 세포의 성장을 억제하는 효과를 보여주었다.

그러므로 올라파립은 로렌 분류의 하위 유형에 관계없이 위암 세포의 성장을 억제하는 효과를 보였다(도 8).

다음으로, PARP1 또는 FOXO3A 발현의 강도 점수와 임상 결과의 관계성을 확인하였다.

이를 위하여 면역화학적 염색의 강도를 PARP1에 대한 올레드 점수(Mean Allred score ± standard error: 4.8 ± 0.2) 또는 FOXO3A에 대한 올레드 점수로 측정하였다(Mean Allred score ± standard error: 3.8 ± 0.2).

환자는 PARP1의 면역염색 강도(점수 0-3, 4-5, 6-8) 또는 FOXO3A의 면역염색 강도(점수 0-2, 3-6, 7-8)를 기반으로 각각 하위 분류하였다.

그 결과 PARP1의 높은 점수를 보이는 환자 그룹은 OS 및 RFS의 좋지 않은 예후를 보이는 것을 확인하였고(P < 0.001, 도 9A), FOXO3A의 높은 점수를 보이는 환자 그룹은 OS 및 RFS의 호전된 예후를 보이는 것을 확인하였다(P < 0.001, 도 9B).

또한 도 4에서 PARP1-양성 종양은 FOXO3A 단백질과 같이 발현되는 것을 확인한 것(30 중 23, P = 0.021, Chi-square test)과 유사하게 PARP1 및 FOXO3A의 올레드 점수는 상당한 양성의 연관성을 보였다(Spearman’srho 0.382, P < 0.001, 도 10). 따라서 PARP1 및 FOXO3A간의 기능적 연관성이 있을 것이라 예측할 수 있었다.

그러나, 도 4에서 PARP1-양성 종양은 공격적인 표현형을 보이는 반면, FOXO3A-양성 종양은 덜 공격적인 표현형을 보이는 것을 확인하였다.

이러한 모순된 결과를 통해 종양 진행 억제에 있어서, PARP1의 암발생적(oncogenic) 발현은 보상적 메커니즘으로 FOXO3A의 발현을 수반하는 것으로 생각할 수 있었으며, 종양에서 PARP1의 FOXO3A 발현을 제거한 상쇄(counter-balanced) 발현(FOXO3A-/ PARP1+)은 종양의 성장을 조절하지 못하고 공격적인 양상을 자극할 것이라 예상되었다.

PARP1 및 FOXO3A의 기능적 연결을 고려하여, PARP1 및 FOXO3A의 결합된 발현 상태가 위암 환자의 임상적 결과의 예측에 있어서 더 도움이 되는지 확인하였다.

PARP1 및 FOXO3A의 결합된 발현 상태를 기반으로 환자를 분류하였을 때, PARP1+/FOXO3A-의 환자 그룹(n=66)은 안 좋은 예후를 보여주는 반면, PARP-/FOXO3A+의 환자 그룹(n=9)은 호전된 OS(P = 6.0 × 10^-9) 및 FRS(P = 2.2 × 10^-8)를 보여주었다(도 11).

PARP+/FOXO3A+의 그룹(n=23) 또는 PARP1-/FOXO3A-(n=23)의 그룹은 중간상태의 예후 결과를 보였다.

그러므로 이러한 결과들을 통해 위암 환자의 임상적 결과를 예측하는데 있어서, PARP1 및 FOXO3A의 결합된 발현 상태는 각각의 발현보다 더 신뢰성이 높을 것으로 판단되었다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarker composition for predicting prognosis of gastric cancer <130> ADP-2015-0598 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PARP1 Primer(sense) <400> 1 ctactcggtc caagatcg 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PARP1 Primer(reverse) <400> 2 ttgaaaaagc cctaaaggct ca 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXO3A Primer(forward) <400> 3 tctacgagtg gatggtgcgt t 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXO3A Primer(reverse) <400> 4 cgactatgca gtgacaggtt gtg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Primer(forward) <400> 5 acccagaaga ctgtggatgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Primer(reverse) <400> 6 ttctagacgg caggtcaggt 20

Claims

생물학적 시료로부터 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질을 포함하는 위암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자로 엔코딩된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 위암 예후 예측용 키트.
위암 환자 시료로부터 PARP1 및 FOXO3A로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 PARP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 높게 측정되거나, 상기 FOXO3A 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자로 엔코딩된 단백질의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 낮게 측정되면 전이 위험성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서,
상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 위암 예후 예측에 유용한 정보를 제공하는 방법.
PARP1 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 억제제 또는 상기 PARP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 전이 예방 또는 억제용 약학 조성물.
FOXO3A 유전자의 mRNA 발현을 활성화하는 효능제 또는 FOXO3A 단백질의 발현 촉진 또는 활성을 활성화하는 효능제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 전이 예방 또는 억제용 약학 조성물.