KR20170076741A - 생제작을 위한 조직-모방 히드로겔 조성물 - Google Patents

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웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈
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Abstract

3차원 기관 구조물을 제조하는데 유용한 압출가능한 히드로겔 조성물은 가교-가능한 프리폴리머, 후-적층 가교기, 선택적으로, 상기 프리폴리머와 상기 가교기 사이의 반응을 촉매화하는 개시제; 살아 있는 세포 (예컨대, 식물, 동물 또는 미생물 세포), 선택적으로 적어도 하나의 성장 인자, 및 선택적으로 균형을 위한 물을 포함한다. 그 사용 방법 및 그와 같이 제조된 제품이 또한 개시되었다.

Description

생제작을 위한 조직-모방 히드로겔 조성물{TISSUE-MIMICKING HYDROGEL COMPOSITIONS FOR BIOFABRICATION}
정부 지원
본 발명은 국방 위협 감소국 (Defense Threat Reduction Agency)이 수여한 계약 번호 N6601-13-C-2027에 따른 정부 지원에 의해서 이루어졌다.
관련 출원
본 출원은 2014년 10월 24일 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/068,218호의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 인공 조직 구조물 (artificial tissue constructs)의 제작에 유용한 히드로겔 "바이오잉크 (bioink)" 조성물, 그 사용 방법 및 그로부터 형성된 제품에 관한 것이다.
생제작 기술 (biofabrication technologies)은 기관 (organs) 및 오르가노이드 (organoids) 또는 조직 (tissue) 구조물을 제작 (building)하기 위한 조직 공학적 접근법 (tissue engineering approaches)으로 대두되었다. 생체적합성 물질과 신속한 프로토타이핑 (rapid prototyping)의 조합은 생존가능한 조직 (viable tissues)에 필요한 복잡한 사항들을 해결하는 방법을 제공하였다. 생제작과 관련된 장애물 중 하나는 적층/제작 하드웨어 (deposition/fabrication hardware)와, 적층되는 바이오물질 (또는 "바이오-잉크"의 다른 형태들 사이에 인터페이싱 (interfacing)이다. 표준 히드로겔은 유체 용액으로 프린트되면 기계적 특성이 제한되고, 또는 고체 히드로겔로 프린트되면 압출 공정시에 깨지기 때문에 디자인에 문제가 있었다.
본원에 개시된 상기 물질의 구현예들은, 압출가능하고, 또한 조직 타입의 범위를 부합시키기 위해서 최종 산물의 강성을 안정화 및 증가시키는 후-적층 (post-deposition) 또는 제2 가교 단계 (secondary crosslinking step)를 포함함으로써, 전술한 문제점을 해결하였다. 또한, 상기 "바이오잉크" 조성물이 조직에서 유래된 생화학적 인자로 보충될 수 있으며, 이는 상기 생제작된 구조물 중 세포가 경험하는 인 비보 (in vivo) 조직의 생화학적 환경과 더 유사한 생화학적 환경이 유도된다. 이러한 인자들인 생화학적 및 기계적 인자 둘 다는 배양에서 생존가능한 세포를 유지하고, 배양 기간 동안 그 기능성 (functionality)을 증가시키는 능력을 증가시킬 수 있다.
상기를 고려하여, 본 발명은 3차원 기관 구조물을 제조하는데 유용한 압출가능한 히드로겔 조성물 (또는 "바이오잉크")을 제공한다. 상기 조성물은:
(a) 가교-가능한 프리폴리머 (cross-linkable prepolymer);
(b) 후-적층 가교기 (post-deposition crosslinking group) (또한, 제2 가교기라고 함);
(c) 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직하게, 상기 프리폴리머와 상기 후-적층 가교기 사이의 반응을 촉매화하는 개시제 (initiator);
(d) 살아 있는 세포 (live cells) (예컨대, 살아 있는 동물 세포);
(e) 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직하게, 적어도 하나의 성장 인자 (growth factor); 및
(f) 선택적으로, 균형을 위한 물을 포함한다.
상기의 사용 방법, 및 그로부터 제조된 제품이 또한 본원에 개시된다.
본 발명의 일부 구현예는 하기와 같은 장점을 제공한다:
생화학적 특성에 대한 조절. 체내 조직은 복잡한 조성물을 갖는다: 세포의 다양한 부분모집단 (subpopulations)은 신호 분자 (signaling molecules), 예컨대 성장 인자 (growth factors) 및 조직에서 세포의 생존력 및 기능을 유지하는데 도움을 주는 다른 시토킨 (cytokines)을 분비한다. 세포외 기질 (extracellular matrix)은 상기 조직에 구조를 제공하고, 또한 신호 전달의 다른 형태로 작용하는 세포 수용체와 상호작용하는 단백질 및 폴리머로 이루어진다. 또한, 일부 ECM 성분은 성장 인자 (헤파린, 헤파란 술페이트)를 결합하고, 또한 이들을 상기 세포로 경시적으로 서서히 방출한다. 상기 신호들의 조합은 조직마다 다양하다. 본 발명자들은 1차 사람의 간세포 (primary human hepatocytes)를 유지하기 위해서 히드로겔내에 상기 간에 특이적인 성분을 제공하는 방법을 이전에 개발하였다. 임의의 조직을 탈세포화하고 (decellularizing), 이를 분쇄하고 (pulverizing), 이를 용해시킴으로써 (dissolving), 본 발명자들은 3-D 히드로겔 구조물에서 임의의 조직으로부터 세포로 조직-특이적 생화학적 신호를 생성할 수 있다.
기계적 특성에 대한 조절. 기계적 특성, 특히 탄성 모듈러스 (elastic modulus)는 2가지 주요 이유로 중요하다. 첫번째, 초기 보고서에 개시되어진 바와 같이, 상기 히드로겔 바이오잉크 강성에 대한 조절은 연질 겔 (soft gel)을 사용하는 압출-기반 생제작 (extrusion-based biofabrication)을 가능하게 하여, 안정성을 증가시키기 위한 제2 가교에 의해서 이후에 강화될 수 있다. 두번째, 상기 제2 가교 단계가 사용되어서, 각 개별 오르가노이드에 대한 표적 기관 타입과 일치하는 탄성 모듈러스 수준에 도달할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 상기 간 바이오잉크 (liver bioinks)를 본래의 간과 유사한 5-10 kPa의 강성 (stiffnesses)에 도달하도록 맞춤제작하거나 (customize), 또는 심장 바이오잉크 (cardiac bioinks) (또는 미시환경)를 본래의 심장 조직과 유사한 10-15 kPa의 강성에 도달하도록 맞춤제작할 수 있고, 이론적으로 이들 본래의 조직 대응물과 유사한 방식으로 기능하도록 상기 오르가노이드의 능력을 증가시킨다.
본 발명이 본원에 첨부된 도면 및 하기에 개시된 명세서에서 더 상세하게 설명된다.
도 1. 히드로겔 바이오잉크로 생화학적 인자를 제공하기 위한 조직 ECM-유래 용액 중 존재하는 성분들의 분석. (A) 간, 심장 및 골격근 ECM 용액에서 측정된 성장 인자 및 시토킨 양 (pg/ml)을 표시하는 패널. (B) 간, 심장 및 골격근 ECM 용액에서 콜라겐, GAGs, 및 엘라스틴의 농도.
도 2. (A) 아크릴레이트-기반 가교제 (가교제 1), 알킨-기반 가교제 (가교제 2), 티올레이티드 (thiolated) HA, 티올레이티드 젤라틴, 및 비변형된 (unmodified) HA 및 젤라틴으로 이루어진 프린트가능한 바이오잉크의 조제 전략. (B) 바이오프린트가능한 히드로겔 바이오잉크의 구현. 상기 바이오잉크 조제가 제조되고, 티올-아크릴레이트 결합을 통해서 자발적으로 가교되어서, 연질의 압출가능한 물질을 수득한다. 바이오프린팅이 수행된다. 마지막으로, 상기 바이오프린팅된 구조가 융합되고, 안정화되고, 또한 목표 강성을 갖게 된다.
도 3. 바이오잉크의 바이오프린팅 테스트. (A) 상기 바이오프린터에서 바이오잉크 적층 테스트를 위해서 사용된 7 x 7 mm 패턴. (B) 프린팅 후에 바이오잉크를 포함하는 PEGDA 및 4-아암 PEG 알킨의 초기 조제. (C) 전단 담화 (shear thinning) 및 물질 평활 (material smoothing)을 향상시키기 위해서 비변형된 HA 및 젤라틴의 첨가 후에 개선된 압출 및 최종 구조 평활도 (smoothness).
도 4. 바이오잉크 강성 조절 및 조제들의 범위. (A) 상기 패널에서 Gel # 2를 사용하여 바이오잉크 강성을 조절하는 능력의 입증. 단계 1 가교 후에, 상기 겔이 상대적으로 연질이고, 평활하게 압출될 수 있다. UV 광에 의한 단계 2 가교 후에, 강성은 한 자릿수 이상으로 증가한다. (B) 단계 2 가교 후에 다양한 바이오잉크 조제의 최종 강성 수준의 범위는 약 100 Pa 내지 약 20 kPa이다.
도 5. 생제작된 오르가노이드의 디자인.
도 6. 본 발명의 조성물에서 압출 생제작 후에 오르가노이드의 LIVE/DEAD 촬상.
도 7. 본 발명의 조성물에서 압출 생제작 후에 오르가노이드의 알부민 및 우레아 분석.
도 8. LIVE/DEAD 염색에 의해서 평가된 아세트아미노펜 (파라세타몰; N-아세틸-p-아미노페놀; "APAP") 처리된 오르가노이드의 생존력 (viability).
도 9. APAP 처리 후에 오르가노이드의 알부민 및 우레아 분석.
본 발명은 수반된 도면을 참조로 하기에서 더 충분히 서술되며, 본 발명의 구현예가 개시된다. 그러나, 본 발명은 많은 다른 형태로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 구현예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다; 오히려 상기 구현예는 본 명세서를 철저하고 완전하게 할 것이고, 본 발명의 범위를 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 충분히 전달할 수 있도록 제공된다.
본원에 사용된 용어는 특정 구현예 만을 서술하기 위한 목적이며, 본 발명이 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는, 명세서에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본 명세서에 사용되는 용어 "포함한다 (comprises)" 또는 "포함하는 (comprising)"은 명시된 특성, 정수, 단계, 조작, 요소 성분 및/또는 그룹 또는 그 조합의 존재를 명시하지만, 그러나 하나 이상의 다른 특성, 정수, 단계, 조작, 요소, 성분 및/또는 그룹 또는 그 조합의 존재 또는 부가를 배제하는 것은 아니라고 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 (기술 및 과학 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한 통상적으로 사용되는 사전에서 정의되는 바와 같이 용어는 본 명세서 및 청구범위의 문맥에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에서 정의된 바와 같이 표현되지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 형식적 의미로 해석되어서는 안되는 것으로 이해될 것이다. 잘 알려져 있는 기능 또는 구조가 간결성 및/또는 명료성을 위해서 상세하게 서술되지 않을 수 있다.
A. 조성물.
본 발명의 조성물은 "바이오잉크 (bioink)" 중 살아있는 세포를 포함할 수 있고, 상기 "바이오잉크"는 차례로 가교가능한 폴리머, 후-적층 가교기 또는 제제; 및, 이에 한정되는 것은 아니지만, 성장 인자, 개시제 (예컨대, 가교의 개시제), 물 (균형을 위해) 등을 포함하는 기타 임의의 성분으로 이루어진다. 상기 조성물은 바람직하게 히드로겔의 형태이다. 상기 조성물의 다양한 성분 및 특성이 하기에서 더 토의되었다. 세포. 임의의 형태의 세포는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 식물, 동물, 미생물 세포 (예컨대, 이스트, 박테리아 등)를 포함하는, 일반적으로 살아있는 세포가 본 발명을 수행하기 위해서 사용될 수 있다. 상기 세포들은, 동일한 생물체 또는 종으로부터의 세포의 조합, 상이한 종의 세포들의 공생하는 조합 등을 포함하는 다수의 세포 형태의 조합일 수 있다. 일반적으로, 상기 세포들은 바람직하게 동물 세포 (예컨대, 새, 파충류, 양서류 등)이고, 일부 구현예에서, 바람직하게 포유류 세포 (예컨대, 개, 고양이, 마우스 (mouse), 래트 (rat), 원숭이, 유인원, 사람)이다. 상기 세포는 분화 또는 미분화된 세포일 수 있지만, 그러나 일부 구현예에서, 조직 세포 (예컨대, 간 세포, 가령, 간세포 (hepatocytes), 이자 세포 (pancreatic cells), 심근 세포 (cardiac muscle cells), 골격근 세포 (skeletal muscle cells) 등) 이다. 조직 세포가 사용되는 경우, 상기 조직에 대한 다수의 세포 형태 중 하나의 세포 형태로서 포함될 수 있고, 또한 개별의 세포, 또는 세포 응집체 (cell aggregates), 예컨대 오르가노이드 (오르가노이드가 캡슐화되지 않거나 또는 캡슐화될 수 있음; 예컨대 스페로이드 (spheroids))로 포함될 수 있다.
캡슐화되지 않은 세포로서 또는 스페로이드로 이전에 캡슐화된 세포로서 포함되는, 임의의 적당한 형태로 상기 세포가 상기 조성물로 포함될 수 있다. 폴리머 스페로이드 중에 캡슐화되거나 또는 포함된 동물 조직 세포가 공지된 기술에 따라 제조될 수 있거나, 또는 일부 사례에서, 상업적으로 입수할 수 있다 (예컨대, Insphero AG, 3D Hepg2 Liver Microtissue Spheroids (2012); Inspherio AG, 3D InSight TM Human Liver Microtissues, (2012) 참조).
가교가능한 프리폴리머 (Cross- linkable prepolymers). 본원에 개시된 방법에 사용되는 경우 적층 후에 그 탄성 모듈러스를 증가시키기 위해 더 가교될 수 있는 한, 본 발명을 수행하기 위해서 임의의 적당한 프리폴리머가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 프리폴리머가: (i) 올리고사카라이드 (예컨대, 히알루론산, 콜라겐, 그 조합 및 특히 그 티올-치환된 유도체) 및 (ii) 제1 가교제 (예컨대, 티올-반응성 가교제, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트 등, 특히 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 등; 티올-티올 디술피드 결합 (thiol-thiol disulfide bonds)을 형성하기 위한 티올레이티드 가교제; 티올-금 결합을 형성하는 금 나노입자 금 관능화된 가교제; 등, 그 조합을 포함)의 적어도 부분적인 가교 반응으로부터 형성된다.
가교기 (Cross-linking group). 일부 구현예에서, 상기 조성물은 후-적층 가교기를 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 다중-아암 (multi-arm) 티올-반응성 가교제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 디알킨, 다른 알킨-관능성기; 등 그 조합을 포함하는 임의의 적당한 가교기가 사용될 수 있다.
개시제 ( Initiators). 본 발명의 조성물은, 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직한, 개시제 (예컨대, 열개시제 또는 광개시제)를 포함할 수 있다. 상기 프리폴리머와 상기 제2 (또는 후-적층) 가교기 (예컨대, 가열 시에 또는 광 노출 시에) 사이의 반응을 촉매화하는 임의의 적당한 개시제가 사용될 수 있다.
성장 인자 (Growth factors). 본 발명의 조성물은, 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직한, 적어도 하나의 성장 인자 (예컨대, 포함된 특정 세포 및/또는 제조되는 특정 조직 대체물에 대해 적당함)를 포함할 수 있다. 예로는 상기 조직 세포에 해당하는 조직으로부터 탈세포화된 세포외 기질 조성물 ("ECM") (예컨대, 상기 살아 있는 동물 세포가 간 세포인 경우 탈세포화된 세포외 간 기질; 상기 살아 있는 동물 세포가 심근 세포인 경우 탈세포화된 세포외 심근 기질; 상기 살아 있는 동물 세포가 골격근 세포인 경우 탈세포화된 골격근 기질; 등)이다. 부가의 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및/또는 엘라스틴 (예컨대, 상기 세포외 기질 조성물을 보충하기 위해 첨가될 수 있음) 등이 또한 포함될 수 있다.
탄성 모듈러스 (Elastic modulus). 상기 조성물은 바람직하게 실온 및 대기압에서, 어떤 적층 방법이 사용되던지 간에 (예컨대, 압출 적층) 기재 상에서 조작 및 적층될 수 있도록 충분히 낮은 탄성 모듈러스를 갖는다. 또한, 상기 조성물은 다시, 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직한, 실온 및 대기압에서, 적층 후에 가교될 때까지 (가교가 자발적, 열 또는 광 개시 등이 될 수 있음) 실질적으로 그 형태 또는 구성을 유지하도록 충분히 높은 탄성 모듈러스를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은, 적층 전에, 실온 및 대기압에서, 0.05, 0.1 또는 0.5 내지 1, 5 또는 10 킬로파스칼 (kiloPascals)의 강성을 갖는다.
B. 방법.
본 발명의 조성물이 임의의 편리한 방식으로 사용될 수 있다. 하나의 비-제한된, 그러나 바람직한, 사용 방법에서, 3차원 기관 구조물의 제조 방법에 상기 조성물이 사용된다. 상기 방법은 일반적으로 하기 단계들을 포함한다:
(a) 전술한 바와 같이 압출가능한 히드로겔 조성물 (extrudable hydrogel composition)을 함유하는 저장소 (reservoir)를 제공하는 단계; 그 후
(b) 상기 히드로겔 조성물을 기재에 (예컨대, 시린지를 통한 압출에 의해서) 적층하는 단계; 및 그 후
(c) (예컨대, 상기 히드로겔을 가열시킴으로써, 상기 히드로겔 조성물을 광 (예컨대, 실내등, UV 광)으로 조사함으로써, 상기 히드로겔의 pH를 변경시킴으로써; 등) 상기 히드로겔의 강성을 증가시키고, 또한 상기 3차원 기관 구조물을 형성하기에 충분한 양으로 상기 제2 가교기로 상기 프리폴리머를 가교시키는 단계.
상기 적층 단계가, 이에 한정되는 것은 아니지만, H.-W. Kang, S. J. Lee, A. Atala and J. J. Yoo, US 특허 출원 공개 제US 2012/0089238호 (April 12, 2012)에 개시된 것을 포함하는 임의의 적당한 장치로 실행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 적층 단계는 패턴된 적층 단계 (patterned depositing step)이고: 즉, 상기 적층된 조성물이 규칙적 또는 비규칙적 패턴, 예컨대 규칙적 또는 비규칙적 격자 (lattice), 그리드 (grid), 나선 (spiral) 등의 형태로 적층되도록 적층 단계가 실행된다.
일부 구현예에서, 상기 가교 단계는 실온 및 대기압에서 상기 히드로겔의 강성을 1 또는 5 내지 10, 20 또는 50 킬로파스칼 또는 그 이상으로 증가시킨다.
일부 구현예에서, 상기 히드로겔은 실온 및 대기압에서 상기 가교 단계 (c) 후에 1 또는 5 내지 10, 20 또는 50 킬로파스칼의 강성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 지지 폴리머 (supporting polymer) (예컨대, 폴리-L-락트산, 폴리(글리콜산), 폴리카프로락톤; 폴리스티렌; 폴리에틸렌 글리콜 등, 그 코폴리머, 예컨대 폴리(락트-코-글리콜산) 포함)를 상기 히드로겔 조성물의 그 인접한 위치에서 상기 기재에 적층하는 단계를 (예컨대, 상기 히드로겔을 적층하는 단계와 동시에, 그 후에, 또는 이와 교대로 반복하고, 또한 일부 구현예에서는 상기 가교 단계 이전에) 더 포함한다.
유기 및 무기 기재를 포함하고, 또한 그 위에 형성된 웰 (well), 챔버 (chambers), 또는 채널 (channels)과 같은 특성을 갖거나 또는 갖지 않는 기재를 포함하는, 임의의 적당한 기재가 상기 적층을 위해서 사용될 수 있다. 하기에 개시되는 특정 제품에 있어서, 상기 기재는 적어도 하나의 챔버 (상기 챔버는 선택적으로, 그러나 바람직하게 유입 채널 및/또는 출구 채널과 결합됨)를 갖는 미세유체 장치 (microfluidic device)를 포함할 수 있고, 또한 상기 적층이 적어도 하나의 챔버에서 수행된다. 대안으로서, 상기 기재는 제1 평면 부재 (예컨대, 현미경 커버 슬립)를 포함할 수 있고, 상기 적층 단계가 상기 평면 부재로 수행될 수 있고, 또한 상기 방법은 상기 평면 부재를 미세유체 장치의 챔버로 삽입시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 후-처리 단계 (post-processing steps), 예컨대 챔버들의 밀봉 (sealing), 및 세포 생존력의 유지가 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다.
C. 제품.
다양한 상이한 제품이 전술한 방법 및 조성물에 의해서 제조될 수 있다. 비-제한된, 그러나 바람직한, 예에서, 상기 제품은 인 비트로 (in vitro)에서 동물 조직 기능을 모델링 (modeling)하는데 유용한 장치일 수 있다. 상기 장치는 하기를 포함할 수 있다: (a) 장치 본체, 예컨대 적어도 하나의 챔버가 그 안에 형성된 미세유체 장치; (b) 상기 챔버 중에 제1 패턴 (first pattern)으로 적층된 히드로겔 조성물, (c) 상기 히드로겔 조성물 중 살아 있는 동물 조직 세포; 및 (d) 상기 히드로겔에 인접하게 상기 챔버 중에 적층된 구조적 지지 폴리머. 전술한 바와 같이, 상기 장치에 대한 세포는 동물 조직 세포, 예컨대 간의 세포 (예컨대, 간세포), 이자 세포, 골격근 세포; 심근 세포 등을 포함할 수 있다.
상기 장치 본체 또는 미세유체 장치 자체가 임의의 적당한 물질 또는 물질들의 조합으로 형성될 수 있다. 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리디메틸실록산 (PDMS), 폴리스티렌, 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 폴리아크릴아미드, 관능성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예컨대, PEG 디아크릴레이트, PEG 디아크릴아미드, PEG 디메타크릴레이트 등 또는 다중-아암 형태의 상기 PEG들의 어느 것 등), 가교 또는 경화될 수 있는 천연 폴리머 또는 단백질 (예컨대, 히알루론산, 젤라틴, 콘드로이틴 술페이트, 알기네이트 등, 가교를 지지하기 위한 화학기로 관능화된 그 유도체를 포함, 전술한 가교된 형태로 "가교가능한 프리폴리머들"의 어느 것, 및 그 조합을 포함)을 포함한다. 상기 장치 본체가 성형 (molding), 주조 (casting), 부가 제조 (additive manufacturing) (3d 프린팅), 리소그래피 (lithography) 등, 그 조합을 포함하는 임의의 적당한 프로세스에 의해서 형성될 수 있다.
구조적 지지가 전술한 "방법" 부분에 언급된 장치에 포함되는 경우, 상기 히드로겔과 같은 구조적 지지가 패턴화 (예컨대, 규칙적 또는 불규칙적 패턴, 예컨대 규칙적 또는 불규칙적 격자, 그리드, 나선 등)될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조직 세포가 스페로이드 (예컨대, 폴리머 스페로이드) 중에 포함되고, 상기에서 스페로이드가 상기 히드로겔 중에 포함된다.
전술한 바와 같이, 상기 히드로겔이 적층 후에 가교되는 것이 바람직하고, 상기 장치에 있는 상기 히드로겔은 실온 및 대기압에서 1 또는 5 내지 10, 20 또는 50 킬로파스칼의 강성 (예컨대, 상기 세포들이 인 비보에서 발견되는 천연 조직에 해당함)을 갖는다.
상기 장치가, 하기에 더 토의되는 바와 같이, 펌프, 검출기 등을 포함하는 더 큰 장치에서 "스냅 인 (snap in)" 설치에 적당한 방식으로 구성된, 카트리지 (cartridge), 또는 하위조합 유닛 (subcombination unit) 또는 "빌딩 블록 (building block)"으로 제공될 수 있다.
D. 패키징 (PACKAGING), 보관 (STORAGE) 및 선적 (SHIPPING).
일단 제조되면, 전술한 바와 같은 하위조합 또는 "카트리지" 장치가 즉시 사용될 수 있거나, 또는 보관 및/또는 운송을 위해 제조될 수 있다.
상기 제품을 보관 및 운송하기 위해서, 실온 (예컨대, 25 ℃)에서 유동가능한 액체이지만, 그러나 냉장 온도 (예컨대, 4 ℃)에서 겔화 또는 고화되는 임시 보호 서포트 배지 (transient protective support media), 예컨대 물과 혼합된 젤라틴이 상기 장치 중에 첨가되어서, 상기 챔버(들) 및 바람직하게, 임의의 관련된 도관을 실질적 또는 완전하게 충전시킬 수 있다. 임의의 유입구 및 배출구 포트가 적당한 캡핑 요소 (capping element) (예컨대, 플러그) 또는 캡핑 물질 (capping material) (예컨대, 왁스)로 캡핑 (capping)될 수 있다. 상기 장치가 그 후에 냉각 요소 (cooling element) (예컨대, 얼음, 드라이 아이스, 열전기 냉각기 (thermoelectric chiller) 등)와 함께 포장되고, 모두를 (바람직하게 절연된) 패키지 내에 넣는다.
대안으로서, 상기 제품을 보관 및 운송하기 위해서, 냉장된 온도 (예컨대, 4 ℃)에서 유동가능한 액체이지만, 따뜻한 온도, 예컨대 실온 (예컨대, 20 ℃) 또는 체온 (예컨대, 37 ℃)에서 겔화 또는 고화되는 임시 보호 서포트 배지, 예컨대 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 블록 코폴리머이다.
수령 시에, 상기 최종 사용자가 간단하게 상기 장치를 상기 관련된 패키지 및 냉각 요소로부터 제거하고, 상기 온도를 (임시 보호 서포트 배지의 선택에 따라서) 올리거나 또는 내리고, 임의의 포트들을 언캡핑(uncapping)하고, 또한 시린지로 상기 임시 보호 서포트 배지를 제거한다 (예컨대, 성장 배지로 플러싱함에 의함).
본 발명이 하기 비제한된 실시예에서 더 상세하게 설명된다.
실시예
물질 및 방법
물질. 히드로클로르산 (HCl)이 Fischer Scientific (Houston, TX)으로부터 입수되었다. 펩신 (돼지의 위점막)이 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수되었다. 헤프라실 (Heprasil) (est. 160 kDa MW), 겔린-S (Gelin-S), 및 엑스트라링크 (Extralink) (PEGDA, 3.4 kDa MW)가 ESI-BIO (Alameda, California, USA)로부터 HyStem-HP 히드로겔 키트로부터 사용되었다. PEG 4-아암 아크릴레이트 (10 및 20 kDa MW), PEG 4-아암 알킨 (10 kDa MW), 및 PEG 8-아암 알킨 (10 kDa MW)이 Creative PEGWorks (Winston-Salem, North Carolina, USA)로부터 입수되었다.
조직-특이적 세포외 기질 (ECM) 소화물의 제조. 조직-특이적 ECM 소화물 용액 (digest solutions)이 간에 대해 이전에 서술된 바와 같이 제조되었다 (A. Skardal, L. Smith, S. Bharadwaj, A. Atala, S. Soker and Y. Zhang, Biomaterials, 33, 4565 (2012).). 신선한 간, 심장, 또는 골격근 조직이 차가운 Dulbecco 포스페이트 완충된 식염수 (Dulbecco's phosphate buffered saline: DPBS)로 린스되었다. 상기 조직을 10 cm × 0.5 - 1.0 cm의 스트립 (strips)으로 자르고, 수술용 작은 칼 (surgical scalpels)로 잘게 썬다. 잘게 자른 조직을 500 ml의 증류수로 옮기고, 4 ℃에서 3일 동안 200 rpm으로 로터리 세이커 (rotary shaker)에서 진탕시키고, 그 동안에 상기 물을 하루 3번 갈아주었다. 상기 조직이 4일 동안 2% 트리톤 X-100으로 처리되었고, 그 후에 24시간 동안 0.1% NH4OH를 갖는 2% TX-100으로 처리되었다. 상기 TX-100으로 린스 중에, 상기 용액을 하루 2번 갈아주었다. 상기 탈세포화 조직이 2일 더 증류수로 세척되어서 임의의 미량의 TX-100을 제거하고, 그 후에 추가로 사용될 때까지 4 ℃에서 보관되었다.
탈세포화된 조직 ECMs이 48시간 동안 동결 및 동결건조되었다. 동결건조 이후에, 시료가 프리저 밀 (freezer mill)에 의해 분말로 분쇄되었다. 1 g의 간 조직 또는 간 ECM 분말이 100 mg의 펩신 (돼지의 위 점막, 단백질의 3400 유닛, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)과 혼합되고, 감마 조사 (gamma irradiation) (1 Mrad)에 의해서 멸균되었다. 멸균 후에 모든 후속 절차가 멸균 조건 하에 수행되었다. 히드로클로르산 (0.1 N, 100 mL)이 상기 멸균된 물질로 첨가되고, 실온에서 48 시간 동안 인큐베이션되었다. 상기 수득된 혼합물을 50 ml의 코니칼 튜브 (conical tube)로 옮기고, 3000 rpm으로 15분 동안 원심분리되었다. 상기 상층액 (supernatant)이 제거되었고, 상기 펠렛 (pellet)이 폐기되었다. 상기 상층액이 맑아질 때까지 이를 3번 반복하였다. 남아 있는 입자체 물질이 더 이상 없도록, 상기 현탁액이 0.45 mm의 시린지 필터 (Fisher Scientific)를 통해서 여과되었다. 상기 수득된 탈세포화된 ECM 용액이 추가로 사용될 때까지 80 ℃로 보관되었다.
히드로겔 바이오잉크 조제 및 제조. 히드로겔 조제 이전에, 광개시제인, 이르가큐어 (Irgacure) 2959 (4-(2-히드록시에톡시)페닐-(2-프로필)케톤, Sigma)가 0.05% w/v로 수중에 용해되었다. 히드로겔 바이오잉크를 형성하기 위해서, 먼저 HyStem-HP 히드로겔 키트 (ESI-BIO, Alameda, CA)로부터의 상기 베이스 물질 성분이 물-광개시제 용액 (water-phoinitiator solution) 중에 용해되었다. 간단하게, 헤프라실 및 겔린-S가 물-광개시제 용액 중에 용해되어서 2% w/v 용액이 제조되었다. 엑스트라링크 (Extralink)인, 상기 가교제가 물-광개시제 용액 중에 용해되어서 4% 및 8% w/v 용액이 제조되었다. 또한, 다중-아암 PEG-기반 가교제가 개별로 제조되었다: PEG 4-아암 아크릴레이트 (10 kDa 또는 20 kDa MW; 4% 및 8% w/v), PEG 4-아암 알킨 (10 kDa MW; 4% w/v), 및 PEG 8-아암 알킨 (10 kDa MW; 8%, 10%, 16% 및 20% w/v).
모든 물질들의 용해 이후에, 히드로겔이 2가지 일반 반응식에 의해서 조제되었다. 먼저, 4부의 2% 헤프라실, 4부의 2% 겔린-S, 1부의 가교제 1, 1부의 가교제 2가 10부의 조직 ECM 용액 (또는 일반적 비조직-특이적 히드로겔로서 물)과 배합되었다. 상기 수득된 혼합물이 사용 전에 혼합시키기 위해서 와동시켰다. 압출 또는 바이오프린팅 테스트를 위해서, 상기 혼합물을 시린지 또는 프린터 카트리지로 옮기고, 30분 동안 자발적으로 가교시켰다 (단계 1 가교). 유동 (rheological) 측정을 위해서, 상기 혼합물을 35 mm의 페트리 디쉬 (petri dish)로 옮기고, 가교시켰다. 제2 조제 접근법으로, 상기 헤프라실, 겔린-S 및 가교제 용액이, 증가된 폴리머 농도를 달성하기 위해서, 조직 ECM 용액 또는 물로 더 희석시키지 않았다. 대신에 상기 광개시제가 상기 조직 ECM 용액에 0.05% w/v로 용해되고, 그 후에 상기 헤프라실, 겔린-S 및 다양한 가교제를 용해시키기 위해서 사용되었다. 상기 성분들이 그 후에 동일하게 4:4:1:1의 부피 비율로 배합되었다. 상기 물질을 시린지, 프린터 카트리지 또는 페트리 디쉬로 옮기고, 구현을 위해서 전술한 바와 같이 자발적으로 가교시켰다 (단계 1 가교). 제2 가교 (단계 2)를 위해서, 상기 단계 1-가교된 겔이 자외선광 (365 nm, 18 w/cm2)으로 조사되어서 티올-알킨 중합 반응이 개시되었다.
프린터 호환성 테스트 (Printer compatibility testing). 압출-기반 바이오프린팅 (Extrusion-based bioprinting)이 먼저, 표준 시린지 및 작은 게이지 바늘 팁 (20 - 30 게이지)을 사용하여 간단한 압출 시험에 의해서 실험실 벤치 (laboratory bench)에서 시험되었다. 다음, 바이오잉크 조제가 프린터 카트리지에 로딩되어서, 자발적 단계 1 가교가 실시되었고, 또한 바이오프린팅을 위한 압출 호환성이 특히 조직 구조물 프린팅을 위해 하우스내 고안된 맞춤 3-D 바이오프린팅 장치 (custom 3-D bioprinting device)를 사용하여 평가되었다 (예컨대, H. Kang, S. Lee, A. Atala and J.Yoo, US 특허 출원 공보 제US 2012/0089238호 (April 12, 2012) 참조). 7 x 7 mm의 패턴이 시험 목적으로 구현되었다. 전단 담화 및 압출 특성을 향상시키기 위해서, 비변형된 HA 및 젤라틴이 상기 바이오잉크로 보충되었다 (1.5 mg/mL 및 30 mg/mL) (Sigma). 평활하게 압출될 상기 바이오잉크 대 불규칙한 클럼프 (irregular clumps)에 대한 경향 (tendency)이 관찰되었다.
유동에 의한 바이오잉크 기계적 특성의 결정. 바이오잉크 기계적 특성의 결정을 위해서, 히드로겔이 전술한 바와 같이 제조되었고, 상기 단계 1 자발적 가교를 실시하는 35 mm의 페트리 디쉬로 피펫팅되었다. 유동 시험이 HR-2 Discovery Rheometer (TA Instruments, Newcastle, DE)를 사용하여 수행되었다. 12-mm의 스틸 디스크 (steel disc)가, 상기 히드로겔의 표면과 접촉이 만들어질 때까지 낮추었다. 상기 장치에서 축력 (axial force), 또는 상기 히드로겔로부터 상기 디스크에 작용하는 정상 힘 (normal force)이 0.4 N으로 동일해질 때까지 상기 디스크를 더 낮추었다. 상기 지점에서, 유동계 (rheometer)에 의해서 적용된 1 Hz의 진동 주파수 (oscillation frequency)에서 0.6 내지 10 Pa 범위의 전단 응력 스윕 테스트 (shear stress sweep test)를 사용하여 각 히드로겔에 대해서 G'가 측정되었다.
상기 제2 단계 가교의 완료 후에 상기 강성의 결정을 위해서, G' 측정이 개시된 바와 같이 수행된 후에, UV 광중합에 의해서 동일한 시험되지 않은 히드로겔이 더 가교되었다.
바이오잉크의 생물학적 유효성을 위한 간 오르가노이드의 바이오프린팅. 1차 간 간세포-기반 스페로이드가 현적법 (hanging drop method)에 의해서 형성되었다. 스페로이드가 수확되고, 간 ECM 물질을 포함하는 간-특이적 바이오잉크 조제내에 현탁되고, 상기 바이오프린팅과 호환가능한 시린지로 뽑아내어서, 상기 바이오잉크가 티올-아크릴레이트 결합을 통해서 자발적으로 가교되었다. 30분 후에, 상기 스페로이드-함유 바이오잉크가 플라스틱 커버슬립 (plastic coverslip) 상에 폴리카프로락톤 지지 패턴내에 바이오프린트되었다. 바이오잉크 적층 이후에, UV 광이 상기 제2 가교 단계를 개시하기 위해서 사용되어서, 상기 바이오잉크를 더 안정화시키고, 상기 바이오잉크 강성을 본래의 간과 유사한 값으로 올려서, 더 큰 간의 오르가노이드를 포함한다. 대조군으로서, 상기 바이오프린터에서 이전에 사용된 젤라틴-기반 히드로겔이 병렬로 스페로이드를 바이오프린트하기 위해서 사용되었다. 프린팅 이후에, 상기 오르가노이드의 생존력이 LIVE/DEAD 염색을 사용하여 평가되었고, 그 후에 상기 오르가노이드가 파라포름알데히드로 고정되고, Leica TCS LSI macro-confocal 현미경으로 촬상되어서, 살아 있는 (녹색 형광) 및 죽은 (적색 형광) 세포의 상대량을 결정하였다.
간의 오르가노이드 및 독성 손상의 기능 분석. 오르가노이드가 전술한 바와 같이 제조되었다. 9개의 오르가노이드가 14일 배양 시간 코스 동안 미크로반응기 (microreactors)에 넣었고, 그 동안 배지의 분취량이 샘플링되었고, 기능 분석을 위해서 저장되었다. 미크로반응기는, 오르가노이드 배치를 위한 챔버, 및 미세-연동 펌프를 사용하여 저장소로부터 세포 배양 배지가 순환될 수 있는 채널을 갖는 폴리디메틸실록산 (PDMS) 장치로 이루어진다. 기준 관능성 기질에 대해 3일 및 6일에 배지 분취량을 샘플링한 후에, 3개의 오르가노이드는 정상 배지를 갖는 배양에서 지속되고; 3개의 오르가노이드는 1 mM의 아세트아미노펜을 함유하는 배지로 투여되었고, 3개의 오르가노이드는 배지 중 10 mM의 아세트아미노펜에 투여되었다. 배지 분취량이 10일 및 14일에 수집되었고, 그 후에 우레아 및 알부민 분비가 정량화되었고, 생존력이 LIVE/DEAD 촬상에 의해서 평가되었다.
독성 손상 및 N-아세틸-L-시스테인에 의한 임상적 관련 개입. 오르가노이드가 다시 전술한 바와 같이 제조되었고, 배양 14일 동안 미크로반응기 장치에 넣었다. 기준 관능성 기질에 대해 3일 및 6일에 배지 분취량을 샘플링한 후에, 제1 오르가노이드 그룹이 정상 배지를 갖는 배양에서 지속되고; 제2 오르가노이드의 그룹은 10 mM의 아세트아미노펜을 포함하는 배지로 투여되고, 제3 오르가노이드의 그룹이 배지에 10 mM의 아세트아미노펜 + 20 mM의 N-아세틸-L-시스테인 (NAC)에 투여되었다. 배지 분취량이 10일 및 14일에 수집되었고, 그 후에 우레아 및 알부민 분비가 정량화되었다.
결과: 특성화.
ECM 성분 분석. 간 ECM 용액이 일련의 발색 분석 (colorimetric assays)에 의해서 이전에 분석되었다 (A. Skardal et al., supra). 2개의 조제들이 분석되었다: (1) LEE, 전술한 바와 같이 제조된 탈세포화된 간; 및 LTE, 동일하게 제조된 신선한 간 조직, 단 탈세포화되지 않은 것임. 결과에 의해서 분명한 추세를 나타내었고, LEE 용액은 콜라겐, 글리코사미노글리칸 (GAGs), 및 엘라스틴의 더 높은 농도를 함유하였다 (도 1a). 특히, 91.33 mg/mL인 LEE의 전체 콜라겐 함량은 4.17 mg/mL인 LTE의 전체 콜라겐 함량보다 현저하게 더 높았고 (p < 0.001), 189.33 mg/mL인 LEE의 엘라스틴 함량은 36.00 mg/mL인 LTE의 엘라스틴 함량보다 현저하게 더 높았으며 (p < 0.05), 86.00 mg/ mL인 LEE의 GAG 함량은 40.67 mg/mL인 LTE의 GAG 함량보다 더 높지만, 그러나 현저하지는 않았다 (p > 0.05).
심근 및 골격근 ECM 용액 (둘 다 탈세포화된 조제)이 동일한 방식으로 평가되었다.
성장 인자 분석. 간의 ECM 용액이 상기 Quantibody Growth Factor Array에 의해서 이전에 분석되었고, 일반적으로 LEE는 성장 인자 및 시토킨의 농도를 더 많이 포함하는 것으로 나타내었다 (pg/mL로 표시됨, 도 1b). 이 중에서 뇌-유래된 신경영양 인자 (brain-derived neurotrophic factor: BDNF), bFGF, 골 형태형성 단백질 5 (bone morphogenetic protein 5: BMP-5), FGF-4, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (insulin-like growth factor binding protein 2: IGFBP-2), 및 TGF- b1이 LEE와 LTE 둘 다의 사이에서 상대적으로 보존되었다. 그러나, LEE는 또한 BMP-7, EGF, FGF-7, 성장 호르몬 (growth hormone: GH), 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자 (heparin-binding EGF-like growth factor: HB-EGF), HGF 및 뉴로트로핀 3 (neurotrophin 3: NT-3)을 포함하고, 이는 LTE에서는 관찰되지 않거나 또는 무시할 수 있었다. 한편, BMP-4, 및 아교세포-유래된 신경영양 인자 (glial-derived neurotrophic factor: GDNF)가 LTE에 존재하지만, 그러나 LEE에는 존재하지 않는다 (A Skardal et al., supra). 심장 및 골격근 ECM 용액들 (둘 다 탈세포화된 조제들)이 동일한 방식으로 평가되었다.
히드로겔 바이오잉크 조제 및 압출 바이오프린팅 테스트. 상기 히드로겔 바이오잉크의 단계 1 및 단계 2 가교의 전략 및 구현이 도 2a 및 도 2b에서 개시되었다. 7 x 7 mm의 패턴이 테스트 목적을 위해서 구현되었다 (도 3a). 초기 테스트는 상기 초기 조제가 압출가능하지만, 그러나 압출 중 및 압출 후에 불규칙하고, 덩어리지는 것을 보였다 (도 3b). 전단 담화 및 압출 특성을 향상시키기 위해서, 비변형된 HA 및 젤라틴이 상기 바이오잉크로 보충되었다 (1.5 mg/mL 및 30 mg/mL). 상기 향상된 매끄러운 프린트된 구조가 도 3c에 개시되었다.
유동 시험. 상기 방법에서 개시된 바와 같이, 다른 조제들의 히드로겔들이 그 기계적 특성의 유동 평가를 위해서 제조되었다. 도 4a는 PEGDA와의 자발적 가교 후에 113.66 Pa의 G'을 갖는 겔내 전단 탄성 모듈러스 (shear elastic modulus, G' )에서 증가를 보였다. 이는 상기 히드로겔이 바이오잉크로 압출될 수 있는 단계이다. 4-아암 PEG 알킨 가교제로 UV 가교 후에, 상기 G' 값이 1981.79 Pa로 증가되었다. 도 4b는 제2 알킨-기반 가교 단계를 통해서 달성될 수 있는 G' 값의 범위를 나타내고, 체내 많은 조직 타입을 모방하였다. 표 1은 상기 시스템, 조제 및 관련된 조직 타입의 범위 내에서 히드로겔 강성의 범위를 나타내었다.
(A) 간, 심장 및 골격근-특이적 히드로겔 바이오잉크를 형성하기 위한 조제. (B) 관심 있는 부가의 조직 타입에 대한 조제.






A



조직 생화학적 파라미터 물리적 파라미터
가교제 1 생제작 G' 가교제 2 종점 G'
간 용해/탈세포 간 조직으로부터 GFs/ECM PEGDA 100-200 Pa 8-아암 PEG 알킨 ~10 kPa
심장 용해/탈세포 심장 조직으로부터 GFs/ECM PEGDA 100-200 Pa 8-아암 PEG 알킨 ~10-15 kPa
골격근 용해/탈세포 골격근 조직으로부터 GFs/ECM 4-아암 PEG 아크릴레이트 200-400 Pa 8-아암 PEG 알킨 ~15-20 kPa










B
조직
생화학적 파라미터 물리적 파라미터
가교제 1 생제작 G' 가교제 2 표적 종점 G'
골수 골수 ECM PEGDA 100-200 Pa PEG-디-알킨/4-아암 PEG 알킨 블렌드 ~1 kPa
지방 지방 ECM PEGDA 100-200 Pa PEG-디-알킨/4-아암 PEG 알킨 블렌드 ~1 kPa
뇌/신경 뇌/신경 조직 ECM PEGDA 100-200 Pa 4-아암 PEG 알킨 ~1-2 kPa
폐 폐 ECM PEGDA 100-200 Pa 4-아암 PEG 알킨 ~3-5 kPa
신장 신장 ECM PEGDA 100-200 Pa 8-아암 PEG 알킨 ~10 kPa
평활근 평활근 ECM 4-아암 PEG 아크릴레이트 200-400 Pa 8-아암 PEG 알킨 ~10-15 kPa
연골/힘줄 연골/힘줄 ECM 4-아암 PEG 아크릴레이트 200-400 Pa ? 100-1000 kPa
결과: 확인.
바이오프린팅 생제작 세팅에서 1차 오르가노이드 생존력의 바이오잉크 유지. 상기 생제작된 오르가노이드가 도 5에 도시된 바와 같이 디자인되었다. 폴리카프로락톤 (PCL) 및 히드로겔 둘 다를 프린팅하는 통합 프린팅 접근법을 사용하여, 상기 간 세포를 갖는 바이오잉크가 프린트되는 내부에 PCL 채널 구조가 프린트되었다. 상기 히드로겔과 세포의 높이-너비 애스펙트 비의 증가 뿐만 아니라 흐름 하에 있을 때 상기 채널 구조는 상기 히드로겔에 안정성을 제공한다. 상기 구조가 상기 미세유체 미크로반응기 챔버 내부에 피트시키기 위해 맞춤되어진 플라스틱 커버슬립 상에 프린트되었다. 상기 사각형 커버슬립은 상기 코너에서 2개의 추가 절단 (cuts)을 특징으로 하며, 이는 상기 미크로반응기내의 상기 오르가노이드 챔버로 유입구 및 배출구 흐름을 제공하는 상기 미세채널의 막힘을 방지하였다.
상기 전체 구조물 내에 대부분의 구형 오르가노이드가 상기 프린팅 과정 중에 구형으로 체류되고, 배양에서 그 원래 형태를 유지하였다. PCL 채널이 없는 초기 배치 (batches)에서, 일부 오르가노이드가 프린팅 과정 중에 변형되거나, 압축되거나, 심지어 찢어지는 것이 관찰되었다. 이는 상기 생제작 기술에서 실질적인 향상을 나타낸다. 구형 오르가노이드 분포 및 양의 균일성이 개선되었다. 상기 배치에서, 미크로반응기 배양으로 이동된 각 오르가노이드 구조물 (n = 9)은 40-45개의 구형 오르가노이드를 포함하였다. 과거의 배치에서, 상기 숫자는 10 내지 30 사이에서 가변하였다.
오르가노이드의 다수의 배치들이 생제작되어서, 상기 생제작 조건을 최적화시켰다. 상기 바이오잉크 및 상기 바이오프린팅 챔버에서 37 ℃ 근처로 유지되도록 온도가 조절되었다. 생제작 조제 및 방법이 더 적은 시간내에 수행되었다. 간세포 배양 배지가 상기 바이오잉크로 첨가되어서, 프린팅 중에 영양물질이 상기 세포로 제공되었다. LIVE/DEAD 촬상은, 상기 바이오잉크 중 압출 생제작 후에 상기 오르가노이드의 다수의 반복의 증가된 생존력을 나타낸다 (도 6). 젤라틴 대조군이 비교로서 배치 4과 병행하여 사용되었다. 간단한 젤라틴 겔이 압출 생제작을 위해서 통상적으로 사용되었다.
간 바이오잉크를 사용하여 인 비트로에서 1차 세포 기능을 지지하기 위한 능력: 기준 분비 활성 및 독성 손상. 간의 오르가노이드가 전술한 바와 같이 제조 및 생제작되었고, 미세유체 미크로반응기에 넣었고, 또한 14일 동안 배양되었다. 6일에, 오르가노이드가 정상 배지, 또는 APAP의 2개의 농도 중 하나를 받았다.
사람의 알부민 ELISA 키트 (Alpha Diagnostic International)에 의한 알부민 분석 (도 7)으로 6일에 걸쳐 바이오프린트된 간의 오르가노이드에 의해서 일정한 알부민 생성을 나타내고, 평균 약 120 ng/mL로 유지되었다. 상기 2개의 기준 시점 중에, 분비 크기에서 추세를 관찰하였고, 0 mM의 오르가노이드는 대부분을 분비하였고, 그 후에 1 mM의 오르가노이드 그룹, 그 후에 10 mM의 그룹을 분비하는 것을 나타냈다. 기준 알부민 생성에서 이러한 감소는 상기 오르가노이드가 프린트되는 시점에서 기인되는 것으로 사료된다. 그룹 1에서 상기 오르가노이드가 먼저 프린트되었고, 그러므로 약간 향상된 생존력을 가지며, 향상된 알부민 분비로 해석되었다. 상기 추세에도 불구하고, 상기 2개의 시점에서 알부민 수준이 서로 비교하여 통계적으로 유의하지 않았다. 그러나, 미래 연구에서, 오르가노이드가 실험 치료 그룹으로 무작위로 할당될 것이다. 6일 후에 APAP 투여 이후에, 알부민 수준이, 0 mM의 대조군과 비교하여, 1 mM 및 10 mM 그룹 둘 다에서 현저하게 감소되었다 (p < 0.05). 또한, 상기 10 mM의 그룹 알부민 수준이 상기 1 mM의 그룹과 비교하여, 현저하게 감소되었다 (p < 0.01). 사실상, 14일에, 상기 10 mM의 그룹에서 상기 알부민 수준이 거의 측정불가능했다.
QuantiChrom 우레아 발색 분석 키트 (BioAssay Systems)에 의한 우레아 분석 (도 7)은 상기 알부민 분석보다 덜 급격하게 떨어지는 결과를 나타내고, 상기 결과는 기대된 추세를 갖는 여전히 통계적으로 유의했다. 우레아 수준이 APAP 투여 전 시점 중에 상기 3개의 그룹들 사이에서 현저하게 상이하지 않았다. APAP 투여 후에, 측정된 우레아 수준은 APAP 농도에 대해서 투여량 의존성 방식으로 떨어지는 것으로 나타났다. 10일 시점에서, 상기 0 mM의 대조군 알부민 수준은 상기 1 mM 및 10 mM 그룹 둘 다에서보다 현저하게 더 높았다 (p < 0.05). 14일 시점에서, 모두 3개의 그룹들은 서로 현저하게 상이했다 (p < 0.05).
상기 0 mM, 1 mM, 및 10 mM의 APAP 처리된 오르가노이드의 생존력이 전술한 바와 같이 LIVE/DEAD 염색 및 마크로-공초점 현미경 (macro-confocal microscope)을 사용하는 촬상에 의해서 평가되었다 (도 8). 살아 있는 세포 대 죽은 세포의 비율에 기반하여, 상기 0 mM의 대조군이 14일의 실험 기간에 걸쳐 생존력이 상대적으로 높은 수준 (14일에 70-90%)으로 유지되는 것이 입증되었다. 비교로서, 상기 1 mM의 그룹은 감소된 생존력 (14일에 30-50%)을 가졌고, 상기 0 mM의 그룹은 14일에 거의 살아 있는 세포는 없는 것으로 나타났다.
APAP 독성 시험 및 N-아세틸-L-시스테인 개입. 전술한 바와 같이, 간의 오르가노이드가 이전 보고서에서 개시된 바와 같이 제조 및 바이오프린트되었다. 상기 오르가노이드가 3일 및 6일에 보존된 배지 분취량에 의해서 기준 기능성 기질을 설정하는데 사용되었다. 그 후에 오르가노이드가 아세트아미노펜 (10 mM)으로 독성 손상시켰지만, 그러나 일부 그룹에 또한 N-아세틸-L-시스테인 (20 mM)이 임상적 관련 대응수단으로서 투여되었다. 배지 분취량이 3일, 6일, 10일, 및 14일에 기능 분석을 위해서 보존되었다.
사람의 알부민 ELISA 키트 (Alpha Diagnostic International)에 의한 알부민 분석 (도 9)으로 6일에 걸쳐서 바이오프린트된 간의 오르가노이드에 의해서 일정한 알부민 생성을 나타내며, 평균 거의 120 ng/mL을 유지하고, 상기 June 보고서에서 이전에 보고된 실험과 일치한다. APAP 만의 투여 이후에, 발명자들은 검출된 알부민에서 감소를 관찰하였다. 상기 감소는, 10일 및 15일에 처리되지 않은 대조군 오르가노이드와 비교하여 통계적으로 유의했다 (p < 0.5). APAP 및 NAC의 동시-투여 (co-administration)는 검출된 알부민 생성에서 약간 감소를 보였고, 14일까지 98 ng/mL로 감소되었지만, 그러나 상기 값은, 상기 대조군 오르가노이드 또는 상기 APAP 만의 오르가노이드에서 어느 것도 현저하게 상이하지 않았다. 상기 데이터의 일반적 추세가 적당하고, 상기 간의 오르가노이드가 APAP에 정확하게 응답하고, 또한 진료소에서 환자가 존재한다면 NAC에 의해서 구조될 수 있음을 제시하였다.
QuantiChrom 우레아 발색 분석 키트 (BioAssay Systems)에 의한 우레아 분석 (도 9)은 또한 유망한 추세를 갖는 결과를 나타내었다. APAP 투여 이후에, 검출된 우레아는 기대된 바와 같이 감소되었다. 상기 대조군 오르가노이드 뿐만 아니라 상기 APAP + NAC 오르가노이드에서, 검출된 우레아 생성은 경시적으로 증가되었다. APAP 우레아 생성에서 감소에도 불구하고, 3일 및 6일에서 (기대되는) 그룹들 사이, 10일에서 그룹 어디에서도 통계적 유의성이 없었다. 그러나, 14일에, 상기 대조군 오르가노이드 및 APAP + NAC 오르가노이드 둘 다는 검출된 우레아 수준이 증가되었다 (p < 0.05). 알부민 데이터와 함께, 상기 추세는 적절하고, 예상되었다.
상기는 본 발명의 설명이며, 그에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 하기 청구범위에 포함되는 청구항에 균등하게, 하기 청구범위에 의해서 한정된다.

Claims (23)

  1. 3차원 기관 구조물 (three-dimensional organ construct)을 제조하는데 유용하고,
    (a) 가교-가능한 프리폴리머 (cross-linkable prepolymer);
    (b) 후-적층 가교기 (post-deposition crosslinking group);
    (c) 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직한, 상기 프리폴리머와 상기 후-적층 가교기 사이의 반응을 촉매화하는 개시제 (initiator);
    (d) 살아 있는 세포 (live cells) (예컨대, 식물, 동물 또는 미생물 세포); 및
    (e) 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직한, 적어도 하나의 성장 인자 (growth factor); 및
    (f) 선택적으로, 균형을 위한 물을 포함하는, 압출가능한 히드로겔 조성물 (extrudable hydrogel composition).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 적어도 하나의 성장 인자는 탈세포화된 세포외 기질 (decellularized extracellular matrix) 조성물을 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 개시제가 존재하고, 열 개시제 또는 광개시제를 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3에 있어서, 상기 후-적층 가교기는 다중-아암 티올-반응성 가교제 (multi-arm thiol-reactive crosslinking agent)를 포함하는 것인 조성물.
  5. 청구항 1 내지 4에 있어서, 상기 프리폴리머가: (i) 올리고사카라이드 및 (ii) 제1 가교제의 적어도 부분적인 가교 반응으로부터 형성되는 것인 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5에 있어서, 상기 조성물은 점성 (예컨대, 실온 및 대기압에서, 0.05, 0.1 또는 0.5 내지 1, 5 또는 10 킬로파스칼 (kiloPascals), 또는 그 이상의 강성 (stiffness)을 가짐)인 것인 조성물.
  7. 청구항 1 내지 6에 있어서, 상기 세포는 동물 조직 세포 (예컨대, 간 세포 (liver cells), 이자 세포 (pancreatic cells), 심근 세포 (cardiac muscle cells), 골격근 세포 (skeletal muscle cells) 등)인 것인 조성물.
  8. 청구항 1 내지 7에 있어서, 상기 세포가 스페로이드 (spheroids) (예컨대, 폴리머 스페로이드) 중에 캡슐화되는 것인 조성물.
  9. 하기 단계들을 포함하는 3차원 기관 구조물을 제조하는 방법:
    (a) 하기를 포함하는 압출가능한 히드로겔 조성물을 함유하는 저장소 (reservoir)를 제공하는 단계:
    (i) 가교-가능한 프리폴리머;
    (ii) 후-적층 가교기;
    (iii) 선택적으로, (예컨대, 가열 시 또는 광 노출 시에) 상기 프리폴리머와 상기 후-적층 가교기 사이의 반응을 촉매화하는 개시제 (예컨대, 열 또는 광 개시제);
    (iv) 살아 있는 세포 (예컨대, 식물, 동물 또는 미생물 세포); 및
    (v) 선택적으로, 그러나 일부 구현예에서는 바람직한, 상기 조직 세포에 상응하는 조직으로부터의 탈세포화된 세포외 기질; 및
    (vi) 선택적으로, 균형을 위한 물; 그 후
    (b) 상기 히드로겔 조성물을 기재 상에 (예컨대, 시린지를 통한 압출에 의해서) 적층하는 (depositing) 단계; 및 그 후
    (c) 상기 히드로겔의 강성을 증가시키고, 또한 상기 3차원 기관 구조물을 형성하기에 충분한 양에 의해 상기 후-적층 가교기로 상기 프리폴리머를 가교시키는 단계.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 가교 단계는 열 개시되거나 또는 광개시된 가교 단계인 것인 방법.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 프리폴리머가: (i) 올리고사카라이드 및 (ii) 제1 가교제의 적어도 부분적인 가교 반응으로부터 형성되는 것인 방법.
  12. 청구항 9 내지 11에 있어서, 상기 히드로겔 조성물은 상기 적층 단계에서 상기 가교 단계까지 상기 기재상에서 적층의 형태 (configuration)를 유지하기에 충분하게 강성인 것인 방법.
  13. 청구항 9 내지 12에 있어서,
    (i) 상기 히드로겔은, 상기 적층 단계 이전에, 실온 및 대기압에서, 0.05, 0.1 또는 0.5 내지 1, 5 또는 10 킬로파스칼, 또는 그 이상의 강성을 갖고; 및/또는
    (ii) 상기 가교 단계는, 실온 및 대기압에서, 1 또는 5 내지 10, 20 또는 50 킬로파스칼, 또는 그 이상으로 상기 히드로겔의 강성을 증가시키고; 및/또는
    (ii) 상기 히드로겔은, 상기 가교 단계 (c) 이후에, 실온 및 대기압에서, 1 또는 5 내지 10, 20 또는 50 킬로파스칼의 강성을 갖는 것인 방법.
  14. 청구항 9 내지 13에 있어서, 상기 적층 단계는 패턴화된 (patterned) 적층 단계인 것인 방법.
  15. 청구항 9 내지 14에 있어서,
    (d) 상기 히드로겔 조성물에 인접한 위치에 상기 기재 상에 지지 폴리머 (supporting polymer)를 적층하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 9 내지 15에 있어서,
    상기 기재는 적어도 하나의 챔버를 갖는 미세유체 장치 (microfluidic device)를 포함하고, 상기 적층이 상기 적어도 하나의 챔버 중에서 수행되거나; 또는
    상기 기재는 제1 평면 부재 (first planar member)를 포함하고, 상기 적층 단계가 상기 평면 부재 상에서 수행되고, 또한 상기 방법은 상기 평면 부재를 미세유체 장치의 챔버 내로 삽입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 하기를 포함하는, 인 비트로 (in vitro)에서 세포 기능 (cellular function)을 모델링 (modeling)하는데 유용한 장치:
    (a) 적어도 하나의 챔버가 그 안에 형성된 미세유체 장치 기재 (microfluidic device substrate);
    (b) 상기 챔버 중에 제1 패턴으로 적층된 히드로겔 조성물;
    (c) 상기 히드로겔 조성물 중 살아 있는 세포 (예컨대, 식물, 동물 또는 미생물 세포); 및
    (d) 상기 히드로겔에 인접하게 상기 챔버 중에 적층된 구조적 지지 폴리머 (support polymer).
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 세포는 동물 세포 (예컨대, 동물 조직 세포)인 것인 장치.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 세포는 간 조직 세포 (예컨대, 간세포), 이자 세포, 골격근 세포, 심근 세포, 또는 그 조합인 것인 장치.
  20. 청구항 17 내지 19에 있어서, 상기 구조적 지지가 패턴화되는 것인 장치.
  21. 청구항 17 내지 20에 있어서, 상기 기관 조직 세포가 스페로이드 (예컨대, 폴리머 스페로이드) 중에 포함되고, 상기 스페로이드가 상기 히드로겔 중에 포함되는 것인 장치.
  22. 청구항 17 내지 21에 있어서, 상기 히드로겔은 실온 및 대기압에서 1 또는 5 내지 10, 20 또는 50 킬로파스칼의 강성을 갖는 것인 장치.
  23. 청구항 17 내지 22에 있어서, 겔화된 형태로 상기 챔버 중에 임시 보호 서포트 배지 (transient protective support media)와 함께 용기 중에 포장되며, 또한 선택적으로 상기 용기 중에 냉각 요소 (cooling element)와 함께 포장되는 것인 장치.
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