KR20170068464A - 항바이러스제 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항바이러스 효과를 발휘하는 것으로 확인된 화합물에 관한 것이다. 본 화합물은 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소 활성의 모듈레이터이다.
Description
본 발명은 의학적인 치료 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 새로운 항바이러스제 및 바이러스 감염으로 인해 유발되는 질환 또는 병태를 치료하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
본원의 배경기술에 대한 어떠한 언급이라도, 그러한 기술이 호주 또는 그외 지역에서의 통상의 일반적인 상식임을 용인하는 것으로 해석되어서는 안된다.
바이러스는 사회적인 비용 부담이 큰 매우 광범위한 포유류 질환의 원인이다. 바이러스 감염에 따른 결과는 감기 증상에서부터 중증 호흡 곤란에까지 이를 수 있으며, 특히 집단내 청년, 노년 및 면역결핍 계층들에서 사망을 일으킬 수 있다.
A형, B형 및 C형 인플루엔자 바이러스 등의 오르소믹소비리대 (Orthomyxoviridae) 과에 속하는 바이러스와 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae)과에 속하는 바이러스가, 매년 상당한 건수의 인간 감염에 원인이 되는 병원성 유기체이다.
일 예로 파라믹소비리대 과를 살펴보면, 1형 내지 3형의 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV-1, 2 및 3)는 신생아와 유아에서 상기도 및 하기도 질환의 주된 원인이다. 심각한 것은, 미국에서만도, 5세 미만의 어린이들에서 매년 최대 5백만건의 하기도 감염이 발생하는 것으로 추정되었으며, 이 중 약 1/3에서 hPIV가 분리되는 것이다. 현재, 계속적인 노력에도 불구하고, hPIV 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신이나 특별한 항바이러스 요법은 없는 실정이다. 최근 일부 연구들은 소분자에 의한 바이러스 유입 차단과 미성숙 바이러스 융합의 유발에 초점을 맞추고 있다.
파라인플루엔자 바이러스와 숙주 세포 간의 초기 상호작용은 표면 당단백질인 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN)를 통해 이루어지며, N-아세틸뉴라민산-함유 글리코컨주게이트의 인지를 수반한다. 파라인플루엔자 바이러스 HN은, 하나의 단백질 안에, 보다 명확하게는 하나의 결합 부위에 수용체 결합 (세포 부착) 기능과 수용체 파괴 (바이러스 방출 촉진) 기능을 가진, 다기능성 단백질이다. 또한, HN은 타겟 숙주 세포로의 감염을 개시하는데 필수적인 바이러스 표면 융합 (F) 단백질의 활성화에도 관여한다. 따라서, 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미다제 효소의 저해가 항바이러스제의 타겟이 될 수 있다.
본 발명은, 제1 측면에서, 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
식 (I)
상기 식에서, R1은 COOH 또는 이의 염, C(O)NR9R10, C(O)OR11으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R9, R10 및 R11은 독립적으로 수소 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R3는 1개 또는 2개의 고리 탄소 원자 위치에서 치환된 N-연결된 트리아졸, 선택적으로 치환된 N-연결된 테트라졸, 선택적으로 치환된 N-연결된 인돌, 선택적으로 치환된 N-연결된 이소인돌 및 선택적으로 치환된 N-연결된 벤조트리아졸로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R4는 NHC(O)R17이고, R17은 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 C3-C6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH, NH2, C1-C6 알킬, NR18R18', C1-C6 알콕시, -OC(O)R18, -NH(C=O)R18 및 S(O)nR18으로 이루어진 군으로부터 선택되고, n = 0 - 2이며, 각각의 R18 및 R18'은 독립적으로 수소이거나 또는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다.
제1 측면의 일 구현예에서, 식 (I)의 화합물은 식 (II)의 화합물이다:
식 (II)
상기 식에서, R1, R3, R4, R6, R7 및 R8은 상기 정의와 동일하게 정의된다.
본 발명은, 제2 측면에서, 유효량의 제1 측면의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
적절하게는, 약학적 조성물은 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
본 발명의 제3 측면은 유효량의 제1 측면에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염 또는 제2 측면에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4 측면은 환자에서 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 제1 측면에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염, 또는 제2 측면에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태의 치료용 약제의 제조에 있어 제1 측면에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염의 용도를 제공한다.
제3 측면, 제4 측면 또는 제5 측면에 대한 일 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 인플루엔자이다.
인플루엔자는 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 또는 파라인플루엔자일 수 있다.
일 구현예에서, 파라인플루엔자는 hPIV-1, -2 또는 -3 바이러스이다.
바람직하게는, 환자는 가금류, 가축 또는 인간이다.
본 발명의 제6 측면은 제1 측면에 따른 화합물을 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
상기 각 섹션에 언급된 본 발명에 대한 다양한 특성과 구현예들은 적절한 경우 다른 섹션들에 준용하여 적용된다. 따라서, 한 섹션에 기술된 특징들은 적절한 경우 다른 섹션에 언급된 특징들과 조합될 수 있다.
후술한 상세한 설명들로부터 본 발명의 또 다른 특징들과 이점들이 명확해질 것이다.
이제, 본 발명을 쉽게 이해하고 실질적인 효과를 거둘 수 있도록 하기 위해, 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 구현예들이 예시적으로 설명될 것이다:
도 1은 N-아세틸뉴라민산 (1), 시알리다제 저해제 Neu5Ac2en (2), 4-아지도-4-데옥시-Neu5Ac2en (3) 자나미비르 (4), Neu5Ac2en의 C-5 이소부티르아미도 유사체 (5), 기준물질 hPIV 저해제 BCX 2798 (6) 및 신규 저해제 7-10의 구조를 도시한 것이다;
도 2는 기니아 피그 적혈구 (gp RBC, 민무늬 막대) 및 인간 적혈구 (h RBC, 빗줄 무늬 막대)를 이용한 저해제 6 및 10의 HI IC50 값을 비교 도시한 것이다;
도 3은 Neu5Ac2en 유도체들 2, 3, 5-10의 NI (민무늬 막대) 및 HI (빗줄 무늬 막대) IC50 값을 도시한 그래프이다. C5 아세트아미도 기를 가진 저해제 2, 3, 7, 8 (좌측 패널, 그룹 1) 및 C5 이소부티르아미도 기를 가진 저해제 5, 6, 9, 10 (우측 패널, 그룹 2). IC50 값은 3번의 독립적인 실험들에서 수득한 평균 값이며, 에러 바는 계산된 표준 편차이다;
도 4A-C는 선택 저해제에 대한 NI (민무늬 막대) 및 HI (빗줄 무늬 막대) IC50 값들을 비교 도시한 것이다. (A) 화합물 3, 6-10 및 이의 C-4 하이드록시 유사체 (2 및 5)에 대한 NI IC50 값과 HI IC50 값의 비교. (B) 화합물 7-10 및 이의 C-4 아지도 유사체 (3 및 6)에 대한 NI IC50 값과 HI IC50 값의 비교. (C) 화합물 6, 9 및 10 및 이의 C-5 아세트아미도 유사체 (각각 3, 7 및 8)에 대한 NI IC50 값과 HI IC50 값을 비교 도시한다;
도 5는 (a) 48시간 바이러스 증식 저해 분석 후 후대 바이러스의 타이트레이션 (포커스 형성 분석). 후대 바이러스 타이트레이션 결과를 도시한다. 바이러스는 화합물 8, 10 또는 6 2 μM 존재 하에 48시간 증식시킨 후 회수하였다. 수집된 바이러스-배양물 상층물을 적어도 1:1000으로 희석하여, 잔류 화합물이 포커스 형성에 영향을 미치지 않게 하였다. (b) 기준 물질로서 저해제 6 및 저해제 10의 바이러스 증식 저해. 바이러스 증식 저해는 2 μM 저해제 존재 하에 저 MOI로 감염시킨 컨플루언트 LLC-MK2 단일층에서의 후대 바이러스를 타이트레이션하여 측정하였다. 이 저해제 농도에서, 10은 저해율이 94%인데 반해, 6은 저해율이 14%이었다. 이 결과는 2세트로 수행된 2가지의 독립 실험의 값이며, 에러 바는 계산된 표준편차이다;
도 6은 다양한 세포주에서 기준 물질 저해제 6 (■)과 저해제 10 (▲)의 바이러스 증식 저해를 도시한 것이다. 화합물 6 (■) 및 10 (▲)의 바이러스 증식 IC50 값은 2종의 인간 세포주 (A549 및 NHBE)와 원숭이 신장 세포주 (LLC-MK2)에 대한 인 시추 ELISA 기법으로 측정하였다. IC50 값 54.6 ± 3.8 μM 및 2.1 ± 0.6 μM (LLC-MK2); 130.6 ± 13.0 μM 및 10.3 ± 0.3 μM (A549); 79.3 ± 1.0 μM 및 13.9 ± 0.7 μM (NHBE)이 6 및 10에서 각각 측정되었다. 이들 값은 3세트로 수행된 2번 이상의 독립적인 실험에서 측정하였으며, 에러 바는 계산된 표준 편차였다;
도 7. hPIV-3 HN과 복합체 형태인 8의 1H 및 STD NMR 스펙트럼. (a) 8의 1H NMR 스펙트럼, 및 (b) 단백질-리간드 1:100 비율로 20 μM hPIV-3 HN가 존재하는 조건에서의 8의 STD NMR 스펙트럼 (2 mM 8). (c) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 1H NMR 스펙트럼. 잔류 글리세롤의 신호는 ★로 표시된다. (d) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 STD NMR 스펙트럼. (e) 저해제 8의 제안된 결합성 에피토프;
도 8은 hPIV-3 HN과의 복합체에서 10의 1H 및 STD NMR 스펙트럼과 에피토프 맵을 나타낸 것이다. (a) 10의 1H NMR 스펙트럼. (b) 단백질-리간드 1:100 비율로 20 μM hPIV-3 HN가 존재하는 조건에서의 10의 STD NMR 스펙트럼 (2 mM, 10). (c) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 1H NMR 스펙트럼. (d) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 STD NMR 스펙트럼. (e) 저해제 10의 제안된 결합성 에피토프;
도 9는 무손상 hPIV-3 바이러스 또는 재조합 HN과의 복합체에서 10의 STD NMR 스펙트럼을 비교 도시한 것이다. (a) hPIV-3 HN 존재시 10의1H NMR 스펙트럼, (b) 무손상 hPIV-3 바이러스의 존재시 10의 STD NMR 스펙트럼, 및 (c) hPIV-3 HN 존재시 10의 STD NMR 스펙트럼;
도 10은 무손상 바이러스 또는 재조합 HN과의 복합체에서 10 유래 페닐 프로톤의 스펙트럼을 겹쳐 도시한 것이다. (a) 10의 1H NMR 스펙트럼, 및 (b) hPIV-3 바이러스 (검정색) 또는 재조합 hPIV-3 HN (적색)의 존재시 10의 STD NMR 스펙트럼을 겹쳐 도시한 것이다;
도 11은 A549 세포에 대한 세포독성 검사 결과를 그래프로 도시한 것이다;
도 12는 불화 (fluorinated) 및 비-불화 화합물을 선택하기 위한 Neu2 저해 분석 결과를 도시한 것이다.
도 1은 N-아세틸뉴라민산 (1), 시알리다제 저해제 Neu5Ac2en (2), 4-아지도-4-데옥시-Neu5Ac2en (3) 자나미비르 (4), Neu5Ac2en의 C-5 이소부티르아미도 유사체 (5), 기준물질 hPIV 저해제 BCX 2798 (6) 및 신규 저해제 7-10의 구조를 도시한 것이다;
도 2는 기니아 피그 적혈구 (gp RBC, 민무늬 막대) 및 인간 적혈구 (h RBC, 빗줄 무늬 막대)를 이용한 저해제 6 및 10의 HI IC50 값을 비교 도시한 것이다;
도 3은 Neu5Ac2en 유도체들 2, 3, 5-10의 NI (민무늬 막대) 및 HI (빗줄 무늬 막대) IC50 값을 도시한 그래프이다. C5 아세트아미도 기를 가진 저해제 2, 3, 7, 8 (좌측 패널, 그룹 1) 및 C5 이소부티르아미도 기를 가진 저해제 5, 6, 9, 10 (우측 패널, 그룹 2). IC50 값은 3번의 독립적인 실험들에서 수득한 평균 값이며, 에러 바는 계산된 표준 편차이다;
도 4A-C는 선택 저해제에 대한 NI (민무늬 막대) 및 HI (빗줄 무늬 막대) IC50 값들을 비교 도시한 것이다. (A) 화합물 3, 6-10 및 이의 C-4 하이드록시 유사체 (2 및 5)에 대한 NI IC50 값과 HI IC50 값의 비교. (B) 화합물 7-10 및 이의 C-4 아지도 유사체 (3 및 6)에 대한 NI IC50 값과 HI IC50 값의 비교. (C) 화합물 6, 9 및 10 및 이의 C-5 아세트아미도 유사체 (각각 3, 7 및 8)에 대한 NI IC50 값과 HI IC50 값을 비교 도시한다;
도 5는 (a) 48시간 바이러스 증식 저해 분석 후 후대 바이러스의 타이트레이션 (포커스 형성 분석). 후대 바이러스 타이트레이션 결과를 도시한다. 바이러스는 화합물 8, 10 또는 6 2 μM 존재 하에 48시간 증식시킨 후 회수하였다. 수집된 바이러스-배양물 상층물을 적어도 1:1000으로 희석하여, 잔류 화합물이 포커스 형성에 영향을 미치지 않게 하였다. (b) 기준 물질로서 저해제 6 및 저해제 10의 바이러스 증식 저해. 바이러스 증식 저해는 2 μM 저해제 존재 하에 저 MOI로 감염시킨 컨플루언트 LLC-MK2 단일층에서의 후대 바이러스를 타이트레이션하여 측정하였다. 이 저해제 농도에서, 10은 저해율이 94%인데 반해, 6은 저해율이 14%이었다. 이 결과는 2세트로 수행된 2가지의 독립 실험의 값이며, 에러 바는 계산된 표준편차이다;
도 6은 다양한 세포주에서 기준 물질 저해제 6 (■)과 저해제 10 (▲)의 바이러스 증식 저해를 도시한 것이다. 화합물 6 (■) 및 10 (▲)의 바이러스 증식 IC50 값은 2종의 인간 세포주 (A549 및 NHBE)와 원숭이 신장 세포주 (LLC-MK2)에 대한 인 시추 ELISA 기법으로 측정하였다. IC50 값 54.6 ± 3.8 μM 및 2.1 ± 0.6 μM (LLC-MK2); 130.6 ± 13.0 μM 및 10.3 ± 0.3 μM (A549); 79.3 ± 1.0 μM 및 13.9 ± 0.7 μM (NHBE)이 6 및 10에서 각각 측정되었다. 이들 값은 3세트로 수행된 2번 이상의 독립적인 실험에서 측정하였으며, 에러 바는 계산된 표준 편차였다;
도 7. hPIV-3 HN과 복합체 형태인 8의 1H 및 STD NMR 스펙트럼. (a) 8의 1H NMR 스펙트럼, 및 (b) 단백질-리간드 1:100 비율로 20 μM hPIV-3 HN가 존재하는 조건에서의 8의 STD NMR 스펙트럼 (2 mM 8). (c) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 1H NMR 스펙트럼. 잔류 글리세롤의 신호는 ★로 표시된다. (d) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 STD NMR 스펙트럼. (e) 저해제 8의 제안된 결합성 에피토프;
도 8은 hPIV-3 HN과의 복합체에서 10의 1H 및 STD NMR 스펙트럼과 에피토프 맵을 나타낸 것이다. (a) 10의 1H NMR 스펙트럼. (b) 단백질-리간드 1:100 비율로 20 μM hPIV-3 HN가 존재하는 조건에서의 10의 STD NMR 스펙트럼 (2 mM, 10). (c) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 1H NMR 스펙트럼. (d) H7, H8, H9 및 H9' 영역의 STD NMR 스펙트럼. (e) 저해제 10의 제안된 결합성 에피토프;
도 9는 무손상 hPIV-3 바이러스 또는 재조합 HN과의 복합체에서 10의 STD NMR 스펙트럼을 비교 도시한 것이다. (a) hPIV-3 HN 존재시 10의1H NMR 스펙트럼, (b) 무손상 hPIV-3 바이러스의 존재시 10의 STD NMR 스펙트럼, 및 (c) hPIV-3 HN 존재시 10의 STD NMR 스펙트럼;
도 10은 무손상 바이러스 또는 재조합 HN과의 복합체에서 10 유래 페닐 프로톤의 스펙트럼을 겹쳐 도시한 것이다. (a) 10의 1H NMR 스펙트럼, 및 (b) hPIV-3 바이러스 (검정색) 또는 재조합 hPIV-3 HN (적색)의 존재시 10의 STD NMR 스펙트럼을 겹쳐 도시한 것이다;
도 11은 A549 세포에 대한 세포독성 검사 결과를 그래프로 도시한 것이다;
도 12는 불화 (fluorinated) 및 비-불화 화합물을 선택하기 위한 Neu2 저해 분석 결과를 도시한 것이다.
본 발명은, 적어도 부분적으로는, 특정 뉴라민산 유도체가 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환을 치료하는데 유용한 효능을 발휘한다는 발견 사실을 토대로 한다. 구체적으로, 본 발명의 화합물은 파라인플루엔자 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소를 저해하는데 유용한다.
정의
본 명세서에서, 용어 '포함한다', '포함하는', '함유한다', '함유하는' 또는 이와 유사한 용어들은 비-독점적인 포괄의 의미로 의도되며, 요소 리스트를 포함하는 방법 또는 조성물은 이들 요소만을 포함하는 것은 아니며 열거되지 않은 다른 요소들도 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어들과 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공통적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
본원에서, "유효량"은 치료 중인 병태의 증상 발생을 예방하거나 또는 증상의 악화를 중지시키거나 또는 증상을 치료 및 완화하거나 또는 중증도를 적어도 낮추는데 충분한 해당 활성 물질의 투여량을 의미한다. 유효량은 당해 기술 분야의 당업자라면 이해할 수 있는 방식에 따라 환자 연령, 성별, 체중 등에 따라 달라질 것이다. 적절한 투여량 또는 투약 요법은 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본원에서 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기 산 등의 약제학적으로 허용가능한 무독성의 염기 또는 산으로부터 제조되는 염과 같은 독성적인 측면에서 전신 또는 국소 투여에 안전한 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 알칼리 및 알칼리 토 금속 등의 그룹, 암모늄, 알루미늄, 철, 아민, 글루코사민, 클로라이드, 설페이트, 설포네이트, 바이설페이트, 나이트레이트, 사이트레이트, 타르트레이트, 바이트이트레이트, 포스페이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 말레이트, 말리에이트, 납실레이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 아세테이트, 벤조에이트, 테레프탈레이트, 파모에이트, 피페라진, 펙티네이트 및 S-메틸 메티오닌 염 등으로부터 선택될 수 있다.
용어 "치환된" 및 "선택적으로 치환된"은, 본원에 사용된 각각의 경우, 그리고 임의의 구체적인 모이어티에 대한 명확한 리스트가 없는 경우, 해당 모이어티에 대한 치환은, 예를 들어 알킬 쇄 또는 고리 구조가 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, CN, OH, 옥소, NH2, Cl, F, Br, I, 아릴 및 헤테로사이클릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환되는 것을 의미하며, 아릴과 헤테로사이클릴은 그 자체가 선택적으로 치환된 것일 수도 있다. 이 용어가 다수의 관능기를 열거하는 앞부분에 사용된다면, 명백하게 어긋나지 않는 한 열거된 관능기 전체에 적용되는 것으로 의도된다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 아미노, 헤테로사이클릭, 아릴"은 아미노, 헤테로사이클릭 및 아릴 기들이 모두 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "알킬"은, 예를 들어 1 - 약 12개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 - 약 8개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 1 - 약 6개의 탄소 원자, 보다 더 바람직하게는 1 - 약 4개의 탄소 원자, 또 더 바람직하게는 1 - 2개의 탄소 원자를 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄 알킬 치환기를 의미한다. 이러한 치환기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소아밀, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 헥실, 헵틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 등을 포함한다. 나타낸 탄소 원자의 갯수는 탄소 백본과 탄소 분지에 대한 것이며, 임의의 치환기에 속하는 탄소 원자를 포함하는 것은 아니며, 예를 들어 탄소 주쇄에서 갈라져 나오는 알콕시 치환기의 탄소 원자는 포함하지 않는다.
용어 "사이클로알킬"은 선택적으로 치환된 포화된 단환식, 이환식 또는 삼환식 탄소 기들을 지칭한다. 적절한 경우, 사이클로알킬 기는 명시된 수의 탄소 원자를 가질 수 있으며, 예를 들어, C3-C6 사이클로알킬은 탄소 원자 3, 4, 5 또는 6개를 가진 카보사이클릭 기이다. 비-제한적인 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사다이에닐 등이 있을 수 있다.
용어 "아릴"은 당해 기술 분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이 비-치환 또는 치환된 방향족 카보사이클릭 치환기를 지칭한다. 용어 아릴은 휘켈법에 따라 평면이며 4n+2 π 전자를 포함하는, 환형 치환기에 적용된다. C-6 아릴이 바람직하다.
본원에 특정 'R' 기와 관련하여 구체적으로 사용되는 "헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클릴"이라는 용어는 고리에 5-7개의 원자를 가지며 이중 1-4개가 이종 원자인 비-방향족 고리를 지칭하며, 이 고리는 단독이거나 또는 제2 고리와 융합되며, 이때 이종원자는 독립적으로 O, N 및 S로부터 선택된다. 헤테로사이클릭은 부분 및 완전 포화된 헤테로사이클릭 기들을 포함한다. 헤테로사이클릭 시스템은 라디칼의 임의 번호의 탄소 원자 또는 이종원자를 통해 다른 모이어티에 부착될 수 있으며, 모두 포화 및 불포화될 수 있다. 헤테로사이클릭에 대한 비-제한적인 예는 피라졸, 이미다졸, 인돌, 이소인돌, 트리아졸, 벤조트리아졸, 테트라졸, 피리미딘, 피리딘, 피라진, 다이아진, 트리아진, 테트라진, 피롤리디닐, 피롤리닐, 피라닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피라졸리닐, 다이티올릴, 옥사티올릴, 다이옥사닐, 다이옥시닐, 옥사지닐, 아제피닐, 다이아제피닐, 티아제피닐, 옥세피닐 및 티아피닐, 이미다졸리닐, 티오모르폴리닐 등으로부터 선택된다.
용어 "보호된 OH" 또는 "보호된 하이드록시"는 하이드록시 기가 아실 기, 에테르 기 또는 에스테르 기와 같은 일반적인 보호기, 예를 들어, C1-C3 아실, 에테르 또는 아릴을 형성하기 위한 C1-C4 알킬 기, 예컨대 에테르 또는 C1-C4 에스테르를 형성하는 벤질로 보호된 것을 의미한다.
본원에서, 식 (I) 및 (II)의 화합물 등의 제1 측면에 따른 화합물, 예를 들어 "N-연결된 트리아졸" 또는 "N-연결된 헤테로사이클"을 참조하여, 용어 "N-연결된"은, 뉴라민산 코어의 C-4 위치 (식 (I) 및 (II)에서 R3)에 결합된 모이어티를 지칭하며, 그 결합은 고리 탄소와 질소 원자 간의 직접 결합을 수반하는 것으로 한정된다. 바람직하게는, R3 모이어티가, 적절한 헤테로사이클의 일부를 형성하고 있는 질소 원자, 예를 들어 트리아졸 고리, 테트라졸, 인돌 등의 질소들 중 하나를 경유해 뉴라민산 코어에 연결되는 것을 의미한다. 식 (III) 및 (IIIa)의 "다이플루오로" 화합물의 경우, 용어 N-연결된은 R3 모이어티가 중간 질소 원자를 경유하여 코어에 연결되는 것을 지칭하거나, 또는 헤테로사이클릭 모이어티의 경우에는 헤테로사이클의 일부를 형성하는 질소, 예를 들어 트리아졸 고리의 질소를 경유할 수 있다.
구조에서 원자의 수 범위가 언급되는 경우 (예, C1-C12, C1-C10, C1-C9, C1-C6, C1-C4, 알킬 등), 언급된 범위에 포함되는 탄소 원자의 임의의 하위-범위 또는 각각의 개개의 수가 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 즉, 예를 들어, 본원에 참조되는 임의의 화학 기 (예, 알킬 등)와 관련하여 사용되는 바와 같이, 1-12개의 탄소 원자 (예, C1-C12), 1-9개의 탄소 원자 (예, C1-C9), 1-6개의 탄소 원자 (예, C1-C6), 1-4개의 탄소 원자 (예, C1-C4), 1-3개의 탄소 원자 (예, C1-C3) 또는 2-8개의 탄소 원자 (예, C2-C8) 범위에 대한 언급은, 적절한 경우, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및/또는 12개의 탄소 원자, 뿐만 아니라 이의 임의의 하위-범위 (예, 적절한 경우, 1-2개의 탄소 원자, 1-3개의 탄소 원자, 1-4개의 탄소 원자, 1-5개의 탄소 원자, 1-6개의 탄소 원자, 1-7개의 탄소 원자, 1-8개의 탄소 원자, 1-9개의 탄소 원자, 1-10개의 탄소 원자, 1-11개의 탄소 원자, 1-12개의 탄소 원자, 2-3개의 탄소 원자, 2-4개의 탄소 원자, 2-5개의 탄소 원자, 2-6개의 탄소 원자, 2-7개의 탄소 원자, 2-8개의 탄소 원자, 2-9개의 탄소 원자, 2-10개의 탄소 원자, 2-11개의 탄소 원자, 2-12개의 탄소 원자, 3-4개의 탄소 원자, 3-5개의 탄소 원자, 3-6개의 탄소 원자, 3-7개의 탄소 원자, 3-8개의 탄소 원자, 3-9개의 탄소 원자, 3-10개의 탄소 원자, 3-11개의 탄소 원자, 3-12개의 탄소 원자, 4-5개의 탄소 원자, 4-6개의 탄소 원자, 4-7개의 탄소 원자, 4-8개의 탄소 원자, 4-9개의 탄소 원자, 4-10개의 탄소 원자, 4-11개의 탄소 원자, 및/또는 4-12개의 탄소 원자 등)를 포괄하며, 이를 구체적으로 기술하는 것이다.
본원에서, 용어 "개체" 또는 "개인 (individual)" 또는 "환자"는, 치료가 요망되는, 모든 개체, 특히 척추동물 개체, 보다 더 구체적으로는 포유류 개체를 지칭할 수 있다. 적합한 척추동물로는, 영장류, 조류, 가축 (예, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험 검사용 동물 (예, 토끼, 마우스, 랫, 기니아 피그, 햄스터), 반려 동물 (예, 고양이, 개) 및 포획 야생 동물 (예, 여우, 사슴, 딩고) 등이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 개체는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환 또는 병태에 대한 치료가 필요한 인간이다. 그러나, 전술한 용어들이 증상이 반드시 존재함을 암시하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 제1 측면은 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
식 (I)
상기 식에서, R1은 COOH 또는 그의 염, C(O)NR9R10, C(O)OR11으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R9, R10 및 R11은 독립적으로 수소 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R3는 1개 또는 2개의 고리 탄소 원자 위치에서 치환된 N-연결된 트리아졸, 선택적으로 치환된 N-연결된 테트라졸, 선택적으로 치환된 N-연결된 인돌, 선택적으로 치환된 N-연결된 이소인돌, 및 선택적으로 치환된 N-연결된 벤조트리아졸로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R4는 NHC(O)R17이며, 여기서 R17은 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 C3-C6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH, NH2, C1-C6 알킬, NR18R18', C1-C6 알콕시, -OC(O)R18, -NH(C=O)R18 및 S(O)nR18으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 n = 0 - 2이고, 각각의 R18 및 R18'은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다.
제1 측면에 대한 일 구현예에서, 식 (I)의 화합물은 식 (II)의 화합물이다:
식 (II)
상기 식에서, R1, R3, R4, R6, R7 및 R8은 상기한 정의와 동일하게 정의된다.
바람직하게는, 트리아졸은 N-1 위치가 뉴라민산 고리 탄소와 직접 결합된 1,2,3-트리아졸 고리이다.
일 구현예에서, 테트라졸이 치환된 경우, 고리 탄소에서만 치환된다.
식 (I)의 화합물 또는 (II)의 화합물에 대한 일 구현예에서, R1은 COOH 또는 그의 염, 또는 C(O)OR11이며, 여기서 R11은 메틸, 에틸 및 프로필로부터 선택된다.
소정의 구체적인 구현예에서, R1은 COOH, COONa 및 C(O)OMe로 이루어진 군으로부터 선택된다.
식 (I)의 화합물 또는 (II)의 화합물에 대한 일 구현예에서, R3는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
상기 식에서, R20 및 R21은 독립적으로 수소, 하이드록시, 시아노, 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬에테르, 선택적으로 치환된 피리딜 및 선택적으로 치환된 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며, R20 및 R21 중 하나 이상은 수소가 아니며;
R22는 수소, C1-C6 알킬 및 선택적으로 치환된 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
R23 및 R24는 독립적으로 수소, 하이드록시, 시아노, 할로, C1-C6 알킬 및 C1-C6 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 바람직한 구현예에서, R20 및 R21은 C1-C6 알킬, C1-C6 하이드록시알킬, C1-C6 알콕시, 선택적으로 치환된 피리딜 및 선택적으로 치환된 페닐로부터 선택된다.
일 구현예에서, R20, R21 또는 R22가 적절하게 선택적으로 치환된 피리딜 또는 선택적으로 치환된 페닐인 경우, 치환은 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬하이드록시, C1-C6 알콕시, 할로, -C(O)OMe 및 -CH2OCH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티로 이루어질 수 있다.
특정 구현예들에서, R3는 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
상기에 열거된 구체적인 모이어티들은 본원에 기술된 R1, R4, R6, R7 또는 R8 기에 대한 임의의 언급과 조합될 수 있다.
전술한 임의의 구현예에서, R4는 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
특정 구현예들에서, R4는 -NHAc, -NHC(O)CH2(CH3)2, -NHC(O)CF3 및 -NHC(O)CH2CH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
식 (I) 또는 (II)의 화합물에 대한 임의의 구현예에서, R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH, C1-C3 알콕시 및 -OC(O)R18로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R18은 선택적으로 C1-C3 알킬로 치환된다.
전술한 구현예들 중 임의의 하나 이상의 구현예에서, R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH 및 OAc로부터 선택될 수 있다.
식 (I) 및 식 (II)의 화합물에 대한 구현예에서, 화합물은 하기 화합물들과 이들의 모든 C-2 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며:
여기서, C-2 카르복시 기는 양성자화된 형태 (protonated form), 소듐 염 형태 또는 C1-C3 에스테르 프로드럭 형태이며, 각각의 화합물은, R4 위치가 임의의 -NHC(O)R 기로 명시적으로 치환된, 유사한 유사체 (close analogue)를 포함하는 것으로 간주될 수 있으며, 상기 식에서 R은 C1-C4 알킬 또는 할로알킬이다.
화학 합성 분야의 당업자라면, COOH 기가 염 형태 또는 에스테르 보호기, 예를 들어 메틸 에스테르 기와 쉽게 상호 교환되며, 그래서 본원에서 이러한 모든 형태들이 전술한 화합물에 대한 내용에 함께 언급된 것으로 간주됨을, 인지할 것이다.
식 (I) 또는 식 (II)에 대한 일 특정 구현예에서, R4가 NHAc이고, R3가 치환된 트리아졸인 경우, 트리아졸은 카르복시 기로 치환되지 않는다.
식 (I) 또는 식 (II)에 대한 추가의 특정 구현예에서, R4가 NHAc이고, R3가 트리아졸 고리의 4-위치에서만 치환된 트리아졸(1-위치는 뉴라민산 코어와 결합된 고리 질소임)인 경우, 트리아졸은 프로필, 치환된 프로필, 치환된 ter-t-부틸 또는 다이에톡시알킬로 치환되지 않는다.
일 구현예에서, 제1 측면에 따른 화합물은 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 모듈레이터이며, 바람직하게는, 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 저해제이다.
일 구현예에서, 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 저해제가 인플루엔자 또는 파라인플루엔자 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 저해제인 것이 특히 바람직할 수 있다.
본원에서 "다이플루오로" 측면으로서 지칭되는 다른 일 측면에서, 본 발명은 식 (III) 또는 (IIIa)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
식 (III) 식 (IIIa)
상기 식에서, R1은 COOH 또는 그의 염, C(O)NR9R10, C(O)OR11, P(O)(OH)2 및 P(O)(OR11)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1a 및 R2는 F (fluorine)이고;
R3는 선택적으로 치환된 N-연결된 헤테로사이클릭, -NHC(O)NHR12, -NHC(O)R13 및 -NHS(O)2R14으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 NR15R16 및 NHC(O)R17으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH, NH2, C1-C6 알킬, NR18R18', C1-C6 알콕시, -OC(O)R18, -NH(C=O)R18 및 S(O)nR18으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 n = 0 - 2이고, 각각의 R18 및 R18'은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R1은 COOH 또는 그의 염, 및 COOR11으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R11은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R11은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸 및 펜틸로부터 선택된다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R12, R13 및 R14은 독립적으로 선택적으로 치환된 벤질 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R3는 피라졸, 이미다졸, 인돌, 이소인돌, 트리아졸, 벤조트리아졸, 테트라졸, 피리미딘, 피리딘, 피라진, 다이아진, 트리아진 및 테트라진으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들 모두 선택적으로 치환될 수 있으며, 고리 질소를 경유하여 코어와 연결된다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R3는 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R4는 NR15R16 및 NHC(O)R17으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R15, R16 및 R17은 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알케닐 및 C3-C6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R4는 NHC(O)R17이며, 여기서 R17은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 C3-C6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R4는 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 
.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R4는 -NHC(O)-메틸, -NHC(O)-에틸, -NHC(O)-프로필, -NHC(O)-이소프로필, -NHC(O)-n-부틸, -NHC(O)-sec-부틸, -NHC(O)-이소부틸, -NHC(O)-tert-부틸 및 -NHC(O)-펜틸로부터 선택된다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R5는 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알케닐이며, 이들 각각은 선택적으로 치환될 수 있다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R5는 하이드록시 또는 보호된 하이드록시로 치환된 C1-C6 알킬이다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH, C1-C10 알콕시 및 -OC(O)R18으로부터 선택되며, 여기서 R18은 C1-C10 알킬이다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 일 구현예에서, R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH 및 OAc로부터 선택된다.
다이플루오로 측면에 대한 일 구현예에서, 식 (III) 또는 식 (IIIa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되며:
각각의 COOH는 상호 호환적으로 COONa로 읽힐 수 있으며, 그 반대도 가능할 수 있다.
식 (III) 또는 식 (IIIa)에 대한 전술한 임의 구현예들에서, R3는 N-연결된 아릴이 아닐 수 있으며, 즉, 중간 질소 원자를 경유해 코어와 결합된 아릴 고리가 아닐 수 있다.
C-2 및 3 플루오로 치환 패턴이 존재하는 화합물, 예를 들어 식 (III) 또는 식 (IIIa)로 표시되는 화합물이 인플루엔자 균주에 특히 효과적일 수 있는 것으로 추측된다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 화합물이 바이러스 뉴라미니다제에 대한 효과적인 저해제로서 활성이 있는 것으로 보인다.
본 발명의 화합물을 입수하기 위해 다양한 합성 패턴들이 채택될 수 있다. 아래 반응식 1은 공지된 소정의 뉴라미니다제 저해제를 기준 화합물로서 이용하기 위해 합성하는 한가지 방식을 보여준다. 제1 측면에 따른 화합물을 합성하는데에도 적용될 수 있는 관련 합성 기법들은 Carbohydr . Res. 244, 181-185 (1993); Carbohydr . Res. 342, 1636-1650 (2007); Bioorg . Med . Chem . Lett . 16, 5009-5013 (2006); 및 PCT 출원 WO2002076971에 기술되어 있다.
반응식 1: i) (Boc)2O, DMAP, THF, 60℃, o/n, (18, 71%; 19, 96%) (ii) NaOCH3/CH3OH, rt, 1h; (iii) Ac2O, 피리딘, rt, o/n, (20, 81%; 21, 63%, 2단계) (iv) TFA, DCM, rt, o/n, (22, 90%; 23, 85%) (v) 이소부티릴 클로라이드, Et3N, DCM, rt, 4h, (24, 84%; 12, 91%) (vi) NaOH, MeOH/H2O (1:1), rt, o/n, (5, 94%; 6, 82%).
아래 반응식 2는 제1 측면에 따른 바람직한 화합물인 화합물 7-10을 입수하기 위해 사용되는 합성 경로를 보여준다.
반응식 2: (i) CuSO4, Na-아스코르베이트, tert-부탄올/H2O (1:1), 45℃, 6 h (13, 78%; 14, 82%; 15, 71%; 16, 84%); (ii) NaOH, MeOH/H2O (1:1), rt, o/n (7, 85%; 8, 96%; 9, 92%; 10, 89%).
간략하게, 트리아졸 7-10의 합성은 공지된 4-아지도-4-데옥시-Neu5Ac2en 기재의 중간산물 (4-azido-4-deoxy-Neu5Ac2en based intermediate) 11 및 12를 이용해 달성하였다. 2종의 중간산물 각각을 메틸프로파길 에테르 또는 에티닐벤젠에 전형적인 아지드-알킨 클릭 커플링 조건 (물과 tert-부탄올 (1:1) 혼합물 중에 4-아지도-4-데옥시-Neu5Ac2en 유도체, 알킨, CuSO4 및 소듐 아스코르베이트 혼합물을 6시간 가열) 하에 노출시켜, 트리아졸 유도체 (도 1)을 수득하였다. 트리아졸 13과 14 (출발물질 11) 및 트리아졸 유도체 15과 16 (출발물질 12)을 각각 78%, 82%, 71% 및 84%의 수율로 분리하였다. 그런 후, 제조된 per-O-아세틸화 트리아졸 유도체 13-16에, pH 13-14로 적정된 메탄올 수용액 (50%)을 RT에서 24시간 처리하여 탈보호화함으로써, 최종 산물 7-10을 소듐 염으로서 각각 85%, 96%, 92% 및 89% 수율로 수득하였다.
합성 타겟은, 부분적으로는, hPIV-3 HN 결정 구조에 대한 분자 모델링으로 입수된 정보에 의해 진행되었다. 구체적으로, hPIV-3 HN의 216 루프는 상당한 유연성을 나타내며, 그래서 다소 벌키한 C4 치환기를 가진 Neu5Ac2en 유도체가 활성 부위 내부의 열린 216 공동 안에 수용되어 잠그는 것으로 추정하였다. 분자 다이나믹스 (MD) 시뮬레이션을 적용해, 이 이론을 검정하기 위한 베이스로서 C4 관능화된 트리아졸을 가진 Neu5Ac2en 유도체를 설계하여 평가하였다. 216 루프 유연성과 제조된 216 공동의 크기에 대한 초기 연구로부터, 불포화 뉴라민산-기재의 주형 (도 1에 나타낸 화합물 7-10) 상의 상대적으로 벌키한 C4 치환기가 열린 216 공동 안에서 잘 견딜 수 있는 것으로 생각되었다. 또한, 이들 C4 트리아졸 치환된 저해제를 hPIV-3 HN과의 복합체 형태에서 모델링한 결과, 주형의 C5에 위치한 아세트아미도 (7, 8)와 이소부티르아미도 (9, 10) 모이어티 역시 C5 결합 도메인 안에 동시에 잘 수용될 수 있는 것으로 확인되었다. MD 시뮬레이션을 통해, 좀더 벌키한 트리아졸 화합물 (8 및 10)의 hPIV-3 HN의 열린 216 루프를 효율적으로 잠그는 능력을 평가하였다. 더 벌키한 C5 아실아미노 모이어티가 벌키한 C4 치환기와 함께 저해제 친화성을 개선시킬 것으로 예상되는 지를 예측하기 위해, hPIV-3 HN과의 복합체에서 8 및 10의 상대적인 상호작용 에너지를 측정하였다.
모델링 방법과 생물학적 평가 방법은 실험 섹션에서 상세히 논의되지만, 간략하게는 저해제 효능에 대한 C4/C5 치환기의 영향에 대한 여러가지 결론을 도출하였다. 스크리닝한 2가지 그룹, 즉 그룹 1 (C5 아세트아미도) 및 그룹 2 (C5 이소부티르아미도)에서, C4 위치의 치환기에 따른 효능 순서는 하이드록시 < 아지도 ≤ 4-메톡시메틸트리아졸 < 4-페닐트리아졸 순으로 확인되었다. 양쪽 그룹에서 최소 저해는 4-하이드록시 유도체인 2와 5에서 관찰되었다. 이 결과는, Neu5Ac2en (2) 상에 C4 하이드록시 기를 수용하는 C4 결합 도메인이 현저한 소수성 특징을 가지고 있어, 하이드록시 기 등의 극성, 친수성 기와의 상호작용에 우호적이지 않을 것이라는 생각을 뒷받침해준다. 216 루프의 오프닝에 의해 형성된 거대한 216 공동 크기를 가진 포켓의 소수성 특성은, C4 하이드록시 기가 벌키한 소수성 치환기로 치환된 저해제 8 및 10 등의 저해제를 선호한다.
이들 양쪽 그룹의 IC50 비교를 통해, 제조된 저해제들 모두 C5 아세트아미도 기를 이소부티르아미도 기로 치환하면 전체적인 효능 증가로 이어지는 것으로 확인되었다. 전형적으로, 가장 강력한 저해제 10을 제외하고는, 10배에 가까운 개선이 관찰되었다. 또한, IC50 분석은, 최고 저해제인 8 및 10에서의 효능 증가가 대체적으로 C4 치환기의 도입에 의한 것이며, C5 치환기는 기여 수준이 훨씬 낮을 것이라는 생각을 뒷받침해주었다. 또한, 이 생각은, 4-페닐트리아졸 모이어티의 양성자가 hPIV-3 HN과의 복합체에서 10의 결합 현상에 가장 강하게 기여하는 반면, 이소부티르아미도 기에서 관찰되는 상대적인 상호작용은 약하다는 (~50%), 저해제 10의 에피토프 맵을 도출한 STD NMR 데이타 분석에서도 입증된다.
2가지 HN 기능 (NI 및 HI)에 대한 저해제 10에 의한 강력한 저해는, 이 화합물이 바이러스의 중요한 HN 단백질에 작용함으로써 hPIV-3에 대해 항바이러스 효과를 발휘한다는 것을 입증해준다. 이러한 발견 사실은 무손상 바이러스 또는 재조합 HN 단백질과의 복합체 상태의 10에 대한 STD NMR 실험들에서도 추가로 뒷받침되는데, 명백하게도 저해제의 C4 트리아졸 방향족 모이어티에 대해 동일한 STD NMR 신호 강도가 확인된다. 아울러, hPIV-3 HN과 복합체를 이룬 10에 대해 계산된 결합 에피토프는, Neu5Ac2en 유도체의 H3와 C4 트리아졸로 모이어티의 페닐 양성자가 단백질 표면에 가까이 접촉함을 확실히 예측한, MD 시뮬레이션과도 완벽하게 일치된다.
또한, 인 시추 ELISA 결과 역시 NI 및 HI 분석 데이타와 충분히 일치한다. LLC-MK2 세포 분석에서, NI 및 HI 단백질 분석과 비교해, 10이 세포 수준에서 더 강력한 것으로 확인된다. 이러한 세포 분석에서, 10은 6 보다 ~26배 더 강한 것으로 확인된 반면, 단백질 저해 분석의 경우 NI 및 HI 분석에서 불과 각각 ~8 및 11배 향상된 것으로 나타났다. 이는, 10이 단백질의 뉴라미니다제 활성과 헤마글루티닌 활성 둘다를 저해함으로써 효과적인 상승작용을 일으키는, 강력한 듀얼 작용 저해제임을 강하게 시사해준다. 이 점은, 헤마글루티닌 활성에 대해 현저하게 낮은 저해로 인해 상승작용이 낮은 기존 저해제 6과 대비된다. 마지막으로, 6과 비교해, 저해제 10의 2종의 인간 세포주에 대한 바이러스 증식 저해 수준은 디자이너 리간드 10의 우월성을 명확하게 입증해준다.
제1 측면에 따른 화합물은 단순히 hPIV-3 HN 이상의 효능을 가지는 것으로 인정될 것이다. 실험 섹션에 나타낸 바와 같이, 화합물의 구조 변형으로 일반적으로 여러가지 hPIV 또는 인플루엔자 뉴라미니다제에 맞게 활성을 조정할 수 있는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 본원에 언급된 다이플루오로 유도체는 특정 인플루엔자 뉴라미니다제에 대해 선호적으로 활성을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 이들 결과에 따르면, 화합물 10은 hPIV-3 바이러스 감염과 LLC-MK2 세포에서의 증식을 저해하는 능력을 비교하기 위한 저해 분석에서 종래 기술에 따른 화합물인 BCX-2798 (기준물질 화합물 6)과 비교해 각각 94% 대 14%의 감소를 나타내는 훨씬 우수한 저해제일 뿐만 아니라, 제1 측면에 따른 다른 화합물들은 10 또는 6 보다 효능이 심지어 더 높은 것으로 확인되었다. 예를 들어, 본 발명자들은 화합물 IE1398-33과 IE927-99를 설계, 합성하여 생물학적으로 평가하였다. 이들 화합물은 hPIV-3 HN에 대한 IC50이 각각 1.97 micromolar 및 0.27 micromolar이다. 이는, 종래 기술에 따른 기준물질 화합물 BCX-2798의 10배 내지 102배 개선을 의미한다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 화합물의 놀라운 효능 수준과 이러한 구조-기반의 저해제 설계 가치를 입증해준다.
본 발명은, 제2 측면에서, 유효량의 식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
적합하게는, 약학적 조성물은 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
약학적 조성물은 식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물 2종 이상을 포함할 수 있다. 조성물이 2종 이상의 화합물을 포함하는 경우, 화합물은 임의 비율로 포함될 수 있다. 조성물은 공지된 공동-활성제 (co-actives), 전달용 비히클 또는 보강제를 더 포함할 수 있다.
식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물은 약학적 조성물에 치료 대상인 질환, 장애 또는 병태를 저해 또는 완화하는데 충분한 양으로 존재한다. 적절한 투약 형태 및 화합물과 이를 포함하는 약학적 조성물의 비율은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
투약 형태는 정제, 분산제, 현탁제, 주사제, 용액제, 시럽제, 트로키제, 캡슐제 등을 포함할 수 있다. 이들 투약 형태는 또한 결합 조직 분해 부위에서의 안착 (placement)을 확보하기 위해 특수 설계되거나 또는 변형된 주사 또는 이식 기구를 포함할 수도 있다. 하이드로겔이 바람직한 전달 형태이다.
본 발명의 제3 측면은 유효량의 식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염, 또는 제2 측면에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4 측면은 환자에서 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염, 또는 제2 측면에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염의 용도를 제공한다.
제3, 제4 또는 제5 측면에 대한 일 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 인플루엔자 또는 파라인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 감염이다.
감염은 A, B 또는 C형 인플루엔자 또는 파라인플루엔자 바이러스에 의해 유발될 수 있다.
일 구현예에서, 파라인플루엔자는 hPIV-1, 2, 3 또는 4 바이러스이다.
바람직하게는, 환자는 가축 또는 가금류 동물 또는 인간이다.
본 발명의 제6 측면은 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소를 식 (I), (II), (III) 또는 (IIIa)의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 조절은 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소의 저해를 포함한다.
아래 실험 섹션은 본 발명의 특정 화합물의 특성과 항바이러스 활성을 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 화합물에 대한 일부 구체적인 구현예들과 이의 효능을 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실험
컴퓨터 화학
분자동역학 시뮬레이션은 역장 파라미터 세트 54A4 (ref 39)를 이용해 GROMOS 소프트웨어로 수행하였다. 초기 배위는 4 (도 1)와의 복합체를 이룬 hPIV-3 HN의 X선 구조 (PDB 접근 코드 1V3E)에서 취하였다. 화합물 8을 결정 구조에서 자나미비르 (4) 고리 원자와 겹치게 두었다. 8에 대한 파라미터는 GROMOS 역장에서 기존 파라미터와 유사한 방식으로 생성시켰다. 1V3E-4 및 IV3E-8에 대한 최종 컴포지트 시스템에서 원자의 수는 각각 78253개와 78084개였다. 아미노산 잔기들의 이온화 상태는 pH 7.0에서 지정되었다. 히스티딘 측쇄는 Nε-원자에서 양성자화되었다. X선 구조와 조합된 물 분자를 제거하고, 기존에 공개된 방법에 따라 심플-포인트-차지 (SPC: simple-point-charge) 워터 모델과 주기 경계 조건 (periodic boundary condition)을 이용해 확실한 용매화로 치환하였다. 시뮬레이션에서, 물 분자를, 단백질 원자와 주기 박스 (periodic box)의 사각형 벽 간의 최소 거리가 1.4 nm인 절삭된 팔면체 (truncated octahedron) 안에 단백질 주위로 부가하였다. 결합들 모두 SHAKE 알고리즘을 이용해 기하 공차 (geometric tolerance) 10- 4으로 제한하였다.
시스템의 최속-강하 에너지 최소화 (steepest-descent energy minimization)를 수행하여 용질-용매 접촉을 완화하면서, 힘 상수 2.5 x 104 kJ mol- 1 nm-2로 하모니 상호작용을 이용해 용질 원자를 위치적으로 제한하였다. 그런 후, 어떠한 제한이 없이 시스템의 최속-강하 에너지 최소화를 수행하여 임의의 남아있는 스트레인 (strain)을 제거하였다. 에너지 최소화는, 단계별 에너지 변동이 0.1 kJ mol- 1 보다 소폭일 때, 완료하였다. 비-결합성 상호작용의 경우, 컷-오프 반경 (cut-off radii) 0.8/1.4의 3중-범위 방법을 이용하였다. 단거리 범위의 반 데르 발스 상호작용과 정전기적 상호작용을 각 시간별 단계에서 전하-그룹 쌍-리스트 (charge-group pair-list)에 기반하여 평가하였다. 0.8 nm 보다는 멀고 1.4 nm 보다는 가까운 거리의 (전하 그룹) 쌍들 간의 중간 거리 범위의 반 데르 발스 상호작용과 정전기적 상호작용은, 쌍 리스트가 업데이트 되는 시기인 5차 단계마다 평가하였다. 이를 벗어난 더 먼 컷-오프 반경 범위에서는, 반응-장 근사법 (reaction-field approximation)을 상대 유전율 (relative dielectric permittivity) 78.5로 수행하였다. 전체 시스템의 질량 운동 중심을 1000번 마다 이동시켰다. 용매와 용질은 독립적으로 약하게 295 K 온도의 수조와 완화 시간 (relaxation time) 0.1 ps로 커플링되었다.
또한, 본 시스템은 1 atm 압력 조와 완화 시간 0.5 ps 및 등온 압축도 (isothermal compressibility) 0.7513 x 10-3 (kJ mol-1nm-3)-1로 약하게 커플링되었다. 용질 원자의 하모니 위치 제한과 힘 상수 2.5 x 104 kJ mol- 1 nm-2, 2.5 x 103 kJ mol-1 nm-2, 2.5 x 102 kJ mol- 1 nm-2, 2.5 x 101 kJ mol- 1 nm-2를 적용한 20 ps 시간의 MD 시뮬레이션을 수행하여, 시스템을 각각 50 K, 120 K, 1800 K, 240 K 및 300 K에서 추가로 평형화하였다. 시뮬레이션은 각각 30 ns 간 수행하였다. 4와 복합체를 이룬 상태에서 hPIV-3 HN의 시뮬레이션 궤적을 전술한 바와 유사한 방식으로 생성시켜, 이를 분석하여 8과의 복합체 형태의 hPIV-3 HN에서 수득된 결과와 비교하는데 이용하였다.
분석은 분석 소프트웨어 GROMOS++로 수행하였다. 구조체들 간의 원자-위치의 평균제곱근 편차 (RMSD: atom-positional root-mean-square difference)를, 하나의 구조를 2번째 구조에 대해 소정의 원자 세트 (N, Cα, C)를 이용해 회전 및 병진성 원자-위치 최소 제곱법 (rotational and translational atom-positional least-squares fit)을 수행함으로써, 216 루프를 포함하는 잔기 (210-221 잔기)에 대해 계산하였다. 기준물질에 대해 궤적 구조체들의 Cα-원자에 대한 회전 및 병진성 원자-위치 최소 제곱법을 수행함으로써, 원자-위치 평균제곱근 유동성 (RMSF: atom-positional root-mean-square fluctuation)을 시뮬레이션 30 ns 시간 동안 평균으로서 계산하였다. 시뮬레이션에서 감소된 대표적인 구조 총체를 수득하기 위해, RMSD-기반의 구조 클러스터링 (conformational clustering)을 수행하였다.
시뮬레이션으로부터 10 ps 마다 추출된 구조체들을 백본-Cα 원자 상에서 겹치게 배치하여, 전체 회전 및 병진을 제거하였다. 결합 부위를 형성하는 잔기들 (잔기들 190-198, 210-221, 251-259, 274-280, 320-326, 334-339, 369- 377, 407-413, 474-480, 529-533)의 전체 원자에 대한 클러스터링을 수행하여, 여러가지 시뮬레이션 궤적들로부터 파생된 hPIV-3 HN 단백질의 관련 구조 집단들을 비교하였다. 적용된 유사성 기준 (similarity criterion)은 컷-오프가 0.13 nm인 잔기의 전체 원자에 대한 RMSD였다. MD 시뮬레이션 30 ns에서 생성되는 최종 구조체들을 추출하였다. hPIV-3 HN과 저해제 8 및 10 간의 상호작용 에너지를 GROMOS에서 구해진 에너지, 자유 에너지 λ-도함수 (derivatives) 및 블럭 평균을 에너지 궤적으로 지칭되는 개별 궤적 파일로서 사용해 계산하였다. 프로그램 ene _ana을 이용해, 이들 파일들에서 비-결합성 기여인자 등의 개개 상호작용 에너지 값, 즉 반 데르 발스 및 쿨롬 상호작용을 추출하였다. 따라서, 리간드와 단백질 간의 이러한 기여인자를 시뮬레이션과 계산된 상호작용 에너지로부터 수득된 에너지 궤적으로부터 추출하였다. 오차 추정은 무한 블럭 크기로 외삽하여 증가되는 크기들의 블럭 평균으로부터 계산하였다. 소수성 상호작용을 분석하고, 저해제 10과 hPIV-3 HN 간의 상호작용 맵을 LIGPLOT를 사용해 작성하였다. 선택 구조에 대한 공동 개방 수준을 측정하기 위해, 포켓의 용적을 POVME로 분석하였다. 중요하게도, 시뮬레이션 시간을 최대 80 ns로 연장시킨 경우 제시된 데이타와 전적으로 일치되는 결과가 나타났다.
벌키한
C4 치환기를 가진
Neu5Ac2en
-기반의
hPIV
-3
HN
저해제 모델로서 화합물 8
8과 복합체를 이룬 상태에서 이용가능한 hPIV-3 HN 결정 구조 (PDB 접근 코드 1V3E)의 시뮬레이션으로, 자나미비르 (4)에 결합된 구조체에 대한 단백질의 동역학적 거동을 분석할 수 있다. hPIV-3 HN-4 및 -8 복합체에 대한 시뮬레이션을 통한 216-루프에 대한 hPIV-3 HN 백본 원자 (Cα, N, C)의 원자-위치-평균제곱근 편차 (RMSD)에 따르면, 216-루프는 hPIV-3 HN-8 복합체인 경우에 결정 구조에서 보다 유의한 변화를 겪는 것으로 나타났다. hPIV-3 HN-8 복합체에 대한 시뮬레이션에서는 0.5 nm 보다 큰 RMSD 값이 관찰되는데 반해, hPIV-3 HN-4 복합체에 대한 시뮬레이션에서는 구조 변화는 적었다 (0.4 nm). 이는, 216-루프와 관련된 잔기 (잔기 205-225)의 경우 백본의 Cα원자에서 관찰되는 평균제곱근 유동성 (RMSF)에 의해 추가로 뒷받침된다. RMS 유동성 증가는 216-루프의 제2 절반 잔기 (215-220)에서 관찰되며, 그 값이 ~0.3 nm에 이르는데, 이는 출발물질인 hPIV-3 HN 기준 X선 구조 (PDB 접근 코드 IV3E)와 비교해 도메인에 상당한 구조적인 재배열이 이루어졌음을 의미한다. 표 1은 216-루프를 구성하는 잔기들의 RMSF 값 선택을 보여준다.
| 잔기 | 기준물질의 X선 구조 (IV3E) | 1V3E-4 | 1V3E-8 |
| 210 | 0.036 | 0.059 | 0.056 |
| 212 | 0.046 | 0.104 | 0.141 |
| 214 | 0.048 | 0.093 | 0.109 |
| 216 | 0.057 | 0.111 | 0.162 |
| 218 | 0.060 | 0.134 | 0.289 |
| 220 | 0.041 | 0.070 | 0.079 |
표 1: 1V3E-4 및 1V3E-8 시뮬레이션 시스템에서 216-루프를 구성하는 선택 잔기들의, 기준물질의 X선 구조 IV3E 대비, nm 수준의 평균 제곱근 유동성 (RMSF)
데이타는, 생리학적 시뮬레이션 조건에서 존재하는 루프 유연성이 결정 구조에서 상당히 과소평가되었고, 항-파라인플루엔자 바이러스 약물의 개발 기회를 제공함을, 시사해준다. hPIV-3 HN-4 복합체와 hPIV-3 HN-8 복합체에 대한 시뮬레이션에서, 8의 C4 치환기가 hPIV-3 HN 216-루프에 유의한 움직임을 유도하는 것으로 확인된다. 유도된 루프 열림은 hPIV-3 HN-4 복합체와 8 복합체에 대한 10 ns 시뮬레이션에서 수득된 최종 구조체들의 용매-접근가능한 표면 플롯에서 볼 수 있다.
4 및 8 복합체에서 hPIV-3 HN에 대한 MD 시뮬레이션으로부터 수득되는 가장 조밀한 구조 클러스터를 동정하고, 4 및 8 복합체에서 hPIV-3 HN 시뮬레이션으로부터 수득한 최종 구조와 겹치에 배치하였다. 216-루프의 구조 차이를 명확하게 볼 수 있었다. 216-루프 공동은, 보다 입체적으로-방해되는 저해제 8과 복합체를 형성한 경우에 보다 개방된 구조를 취한다. 일반적으로, 더 넓은 공동은 hPIV-3 HN-8 복합체의 시뮬레이션에서 관찰된다. hPIV-3 HN-4 복합체에 대한 시뮬레이션에서 가장 조밀한 클러스터는 공동 체적이 hPIV-3 HN-8 복합체 (717 Å3)와 비교해 약간 더 작다 (654 Å3).
C4 관능화된 트리아졸이 존재하는 경우에 더 벌키한 C5 아실아미노 모이어티를 수용할 수 있는지를 살펴보기 위해, hPIV-3 HN과의 복합체에서 10에 대한 동일한 분석을 수행하였다. 이 분석을 통해, C5 이소부티르아미도 모이어티가 C4 관능화된 트리아졸의 존재시 C5 결합 도메인 안에 충분히 수용되는 것으로 확인되었다.
hPIV
-3
HN과의
복합체에서 8 및 10의 상대적인 상호작용 에너지
저해제가 hPIV-3 HN과 결합하는 정도를 정량하기 위해, MD 시뮬레이션 방식을 적용해 공지된 저해제 2 뿐만 아니라 새로운 C5 아세트아미도 및 C5 이소부티르아미도 저해제, 즉 8 및 10 각각에 대해 이론적인 평균 상호작용 에너지를 측정하였다. 2, 8 및 10의 경우, hPIV-3 HN (1V3E)25과 복합체를 이룬 상태에서, 평균 상호작용 에너지 (EavI) 값은 각각 -609.38 ± 10.92 kJ mol-1, -733.96 ± 15.49 kJ mol-1 및 -821.88 ± 10.93 kJ mol- 1으로 측정되었다. 이들 계산 결과는, 8의 아세트아미도 모이어티를 10에서 이소부티르아미도 모이어티로 치환하면 단백질과의 복합체에서 저해제의 절대 EavI 값이 현저하게 향상될 것이라는 생각을 뒷받침해준다. 따라서, 10은 8 보다 더 강력한 hPIV-3 HN 저해제일 것으로 예상된다. hPIV-3 HN (1V3E)과 복합체 상태에서 10에 대한 MD 시뮬레이션 및 최저 (-1,078.13 kJ mol-1) 상호작용 에너지 추출에 대한 추가적인 분석을 통해, 10이 결합 포켓 안에서 몇가지 중요한 상호작용을 형성하는 것으로 밝혀졌다 (도 3d). 리간드의 카르복실레이트와 트리아르기닐 클러스터 (Arg192, Arg424, Arg502) 간의 정전기 상호작용, C7 하이드록시 기와 Glu276, C5 이소부티르아미도 NH와 Tyr337 및 Glu409 간의 수소 결합이 특징적이다. 또한, C4 방향족과 C5 이소부틸 관능기에서, 특히 펩타이드 백본과, C4 및 C5 결합 도메인 각각에서 추가적인 소수성 상호작용도 관찰된다.
화학
일반적인 방법
시약 및 드라이 용매 (dry solvent)는 상업적인 공급처에서 구입하여, 추가적인 정제없이 사용하였다. 무수 반응을 아르곤 분위기 하에 오븐 건조한 유리제품 안에서 수행하였다. 반응은 실리카 겔 60 F254 (E. Merck)로 사전-코팅된 알루미늄 플레이트에서 박막 크로마토그래피 (TLC)로 모니터링하였다. 현상한 플레이트를 UV 광 254 nm에서 관찰한 다음 EtOH (5% v/v) 중의 H2SO4 용액을 적용하여 가시화한 다음 탄화 (charring)하였다. 실리카 겔 60 (0.040 - 0.063 mm) 상에서 증류 용매를 사용해 플래시 크로마토그래피를 수행하였다. BrukerAvance 300 MHz 스펙트로미터를 사용해 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 각각 300 및 75.5 MHz에서 기록하였다. 화학적 쉬프트 (δ)를 내부 기준물질로서 잔류 용매 피크에 대한 ppm (parts per million)으로 기록하였다 [CDCl3: 1H의 경우 7.26 (s), 13C의 경우 77.0 (t); DMSO: 1H의 경우 2.50 (pent), 13C의 경우 39.51 (hept); D2O: 1H의 경우 4.79 (s)]. 2D COSY 및 HSQC 실험들은 지정(assignment)을 뒷받침하기 위해 수행하였다. 저-해상 질량 스펙트럼 (LRMS)은 전자분무 이온화 모드에서 BrukerDaltonics Esquire 3000 ESI 스펙트로미터를 이용해 파지티브 모드에서 기록하였다. 고-해상 질량 스펙트럼 (HRMS)은 보호된 또는 탈보호된 최종 유도체에 대해 기록하였고, Apollo ESI 소스가 장착된, 퀸슬랜드 대학 FTMS 시설의 BrukerDaltonics Apex III 4.7e Fourier Transform micrOTOF-Q70 MS로 수행하거나, 또는 그리피스 대학 FTMS 시설의 BrukerDaltonics Apex III 4.7e Fourier Transform MS로 수행하였다.
최종 탈보호된 시알산 유도체는 용매로서 2% 아세토니트릴/H2O를 이용한 GracePureTM SPE C18-Aq (5000 mg/20 mL) 컬럼으로 정제하였다. 합성 중간산물들 모두 크로마토그래피 정제한 이후의 순도가 1H 및 13C NMR 스펙트로스코피에 따르면 >90%인 것으로 측정되었으며, 스크리닝 목적으로 합성한 기준 화합물 (2, 3, 5, 6)과 최종 신규 생성물 7-10의 순도는 ≥95%인 것으로 측정되었다.
합성
중간산물 11, 12 및 17-24과 기준 물질인 저해제 2, 3, 5 및 6는 문헌의 공정에 따라 합성하였다. 일반적인 방법은 반응식 1 및 2에 기술되어 있으며, 이는 본원에서 언급 및 합성된 모든 화합물들에 적용가능하다.
18 & 19 의 일반 합성 공정: 무수 THF (5 mL) 중의 17 또는 11 (0.42 mmol), Boc2O (275 mg, 1.27 mmol) 및 DMAP (50 mg, 0.42 mmol) 혼합물을 아르곤 분위기 하에 60℃에서 o/n 동안 교반하였다. rt로 냉각시킨 후, 용매를 진공 증발시키고, 잔류물을 다이클로로메탄 (DCM) 중에 취하여, 실리카 겔 컬럼에서 용매로서 에틸 아세테이트:헥산 (1:2)을 사용해 크로마토그래피로 정제함으로써, 순수한 18 (170 mg, 71%) 또는 19 (225 mg, 96%)를 수득하였다.
20 & 2 의 일반 합성 공정: 무수 MeOH (5 mL)에 소듐 금속 (0.39 mmol, 9 mg)을 용해하여 금방 준비한 NaOMe의 메탄올 용액에, 화합물 18 또는 19 (0.26 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 1시간 교반한 다음 Amberlite? IR-120 (H+) 수지로 (pH = 5) 퀀칭하였다. 수지를 여과하여 MeOH (5 mL x 3)로 헹구고, 여과물과 세정물을 진공 증발시켰다. 잔류물을 피리딘 (2 mL)에 다시 용해하고, 무수 아세트산 (0.5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 아르곤 분위기 하에 o/n 동안 교반한 다음 용매와 과량의 Ac2O를 진공 제거하였다. 마지막으로, 잔류물을 DCM 중에 취하고, 실리카 겔 컬럼에서 용매로서 에틸 아세테이트:헥산 (1:2)을 사용해 크로마토그래피로 정제함으로써 순수한 20 (112 mg, 81%) 또는 21 (84 mg, 63%)을 수득하였다.
22 & 23 의 일반 합성 공정: 무수 DCM (2 mL) 중의 20 또는 21 (0.15 mmol) 용액에 TFA (230 ㎕, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 혼합물을 rt에서 아르곤 분위기 하에 o/n 동안 교반하였다. 반응물을 DCM (20 mL)으로 희석하고, NaHCO3 포화 수용액 (20 mL)으로 퀀칭하였다. DCM 층을 물, 브린으로 헹구고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 건조시킨 유기 용매를 감압 농축하고, 적정 용매 시스템을 이용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 순수한 22 (58 mg, 90%) 또는 23 (53 mg, 85%)를 수득하였다.
24 & 12 의 일반 합성 공정: DCM (2 mL) 중의 22 또는 23 (0.116 mmol) 용액에, 아르곤 분위기 하에, Et3N (82 ㎕, 0.58 mmol)과 이소부티릴 클로라이드 (18 ㎕, 0.17 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 rt에서 4시간 교반한 다음 실리카 겔 컬럼에 주입하여 용매로서 에틸 아세테이트:헥산 (1:1)을 이용해 크로마토그래피로 정제함으로써, 순수한 24 (50 mg, 84%) 또는 12 (51 mg, 91%)을 수득하였다.
5 & 6 의 일반 합성 공정: MeOH:H2O (2 mL) 1:1 혼합물 중의 화합물 24 또는 12 (0.08 mmol) 현탁액에, 0℃에서, NaOH 용액 (1.0 M)을 pH ~14에 도달할 때까지 점적 첨가하였다. 온도를 rt까지 점차 올리고, 혼합물을 rt에서 밤새 교반하였다. 그런 후, Amberlite? IR-120 (H+) 수지를 첨가하여 용액을 (pH =5까지) 산성화한 다음, MeOH (10 mL)와 H2O (10 mL)로 헹구었다. 여과물과 세척물을 조합하여 진공 농축한 후, 잔류물을 증류수 (5 mL)로 희석한 다음 0.05 M NaOH를 사용해 pH = 8.0으로 적정하여 화합물을 이의 소듐 염으로 변환시켰다. 그런 후, 화합물을 C18-GracePureTM 카트리지에서 2% 아세토니트릴/물을 용매로 사용해 정제함으로써, 순수한 5 (26 mg, 94%) 또는 6 (24 mg, 82%)을 솜털같은 백색 분말로 수득하였다.
13 - 16 의 일반 합성 공정: 적절한 4-아지도-4-데옥시-Neu5Ac2en 유도체 (11 또는 12, 0.22 mmol)와 대응되는 에티닐 유도체 (0.33 mmol)를 1:1 tert-부탄올:H2O (4 mL) 혼합물에 용해하였다. 이 혼합물에 구리(II) 설페이트 5수화물 (4 mg, 0.015 mmol)을 첨가한 다음, 소듐 아스코르베이트 (H2O 중의 1M 용액으로 신선하게 제조, 0.1 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 6시간 교반한 다음 rt로 냉각되게 두었다. 그런 후, 혼합물을 DCM (100 mL)으로 희석하고, 10% NH4OH (50 mL)로 헹군 다음 브린 (50 mL)으로 헹구었다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고 진공 농축하여 조산물 13-16을 수득하였으며, 이를 적절한 용매 시스템을 이용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
7 - 10 의 일반 합성 공정: MeOH:H2O (2 mL) 1:1 혼합물 중의 보호된 트리아졸 유도체 13-16 현탁액에, NaOH 용액 (1.0 M)을 pH ~14가 될 때까지 첨가하였다. 온도를 rt까지 점차적으로 승온시켜, 혼합물을 rt에서 밤새 교반하였다. 그런 후, 용액에 Amberlite? IR-120 (H+) 수지를 첨가하여 (pH = 5까지) 산성화하고, 여과한 다음 MeOH (10 mL)와 H2O (10 mL)로 헹구었다. 여과물과 세척물을 조합하여 진공 농축한 다음 증류수 (5 mL)로 희석하고, 0.05 M NaOH를 사용해 pH = 8.0로 적정하여 화합물을 소듐 염으로 변환하였다. 마지막으로, 화합물을 C18-GracePureTM 카트리지에서 2% 아세토니트릴/물을 용매로 사용해 정제하여, 순수 생성물 7-10을 수득하였다
합성 화합물의 특성 규명
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-
안하이드로
-3,4,5-
트리데옥시
-4-(4-메톡시메틸-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-
글리세로
-D-갈락토-non-2-에노네이트 (13)
에틸 아세테이트:아세톤 (6:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 13을 수득하였다 (90 mg, 78%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.81 (s, 3H, NAc), 2.05 (s, 6H, 2OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 3.36 (s, 3H, OCH3), 3.80 (s, 3H, COOCH3), 4.17 (dd, J = 12.5, 7.2 Hz, 1H, H-9), 4.29 (m, 1H, H-5), 4.50 (s, 2H, OCH2), 4.68-4,79 (m, 2H, H-9', H-6), 5.40 (ddd, J = 7.4, 4.9, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.53 (dd, J = 5.1, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.78 (dd, J = 10.0, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.05 (d, J = 9.1 Hz, 1H, NH), 7.64 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.71, 20.79, 20.91 (3 OCOCH 3 ), 22.80 (NHCOCH 3 ), 48.39 (C-5), 52.71 (COOCH 3 ), 58.16 (OCH3), 58.38 (C-4), 62.21 (C-9), 65.68 (OCH2), 67.73 (C-7), 70.90 (C-8), 76.71 (C-6), 107.18 (C-3), 121.50 (트리아졸-C-5), 145.24 (트리아졸-C-4), 145.92 (C-2), 161.27 (COOCH3), 170.06, 170.27, 170.81, 170.88 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C22H30N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 549.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C22H30N4NaO11 [M+Na]+ 549.1803; 실측치, 549.1805.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-
안하이드로
-3,4,5-
트리데옥시
-5-
이소부티르아미도
-4-(4-메톡시메틸-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (15).
에틸 아세테이트:아세톤 (9:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 15를 수득하였다 (65 mg, 71%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 1.01 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 6H, 2OAc), 2.24 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.37 (s, 3H, OCH3), 3.81 (s, 3H, COOCH3), 4.14-4.29 (m, 2H, H-9, H-5), 4.51 (s, 2H, OCH2), 4.68 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.84 (dd, J = 10.5, 1.7 Hz, 1H, H-6), 5.38 (ddd, J = 6.6, 5.5, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.48 (dd, J = 5.5, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.91 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.02 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H, NH), 7.59 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.81, 19.30 (이소부트-2CH3), 20.74, 20.90 (3 OCOCH 3 ), 35.51 (이소부트-CH), 48.79 (C-5), 52.69 (COOCH 3 ), 57.59 (C-4), 58.38 (OCH3), 62.08 (C-9), 65.73 (OCH2), 67.66 (C-7), 70.79 (C-8), 76.24 (C-6), 107.07 (C-3), 121.54 (트리아졸-C-5), 145.39 (트리아졸-C-4), 145.82 (C-2), 161.30 (COOCH3), 170.15, 170.23, 170.69 (3 OCOCH3), 177.87 (이소부트-CO). LRMS [C24H34N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 577.2 [M+Na]+.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-
안하이드로
-3,4,5-
트리데옥시
-5-
이소부티르아미도
-4-(4-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (16).
에틸 아세테이트:헥산 (4:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 16을 수득하였다 (82 mg, 84%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.95 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 6H, 2OAc), 2.20-2.27 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 4.16-4.39 (m, 2H, H-9, H-5), 4.70 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.88 (dd, J = 10.5, 1.7 Hz, 1H, H-6), 5.40 (m, 1H, H-8), 5.52 (dd, J = 5.4, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.99 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.08 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H, NH), 7.26-7.43 (m, 3H, Ph-H-3', Ph-H-4', Ph-H-5'), 7.74 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 7.81 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.83, 19.31 (이소부트-2CH3), 20.76, 20.92 (3 OCOCH 3 ), 35.55 (이소부트-CH), 48.74 (C-5), 52.72 (COOCH 3 ), 57.67 (C-4), 62.12 (C-9), 67.72 (C-7), 70.84 (C-8), 76.39 (C-6), 107.25 (C-3), 118.84 (트리아졸-C-5), 125.83 (Ph), 128.47 (Ph), 128.89 (Ph), 129.97 (Ph q 탄소), 145.81 (C-2), 148.19 (트리아졸-C-4), 161.35 (COOCH3), 170.18, 170.26, 170.71 (3 OCOCH3), 178.00 (이소부트-CO). LRMS [C28H34N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 608.9 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (7).
수율 = 85%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.84 (s, 3H, NAc), 3.31 (s, 3H, OCH3), 3.52-3.71 (m, 2H, H-9 & H-7), 3.85 (dd, J = 11.9, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 3.95 (ddd, J = 9.3, 6.2, 2.5 Hz, 1H, H-8), 4.33 (m, 1H, H-5), 4.51 (dd, J = 10.9, 1.2 Hz, 1H, H-6), 4.56 (s, 2H, OCH2), 5.48 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.80 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 8.08 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.65 (NHCOCH 3 ), 48.68 (C-5), 57.15 (OCH3), 59.94 (C-4), 63.06 (C-9), 64.22 (OCH2), 68.05 (C-7), 69.71 (C-8), 75.34 (C-6), 101.80 (C-3), 123.54 (트리아졸-C-5), 144.08 (트리아졸-C-4), 150.43 (C-2), 168.75 (COONa), 173.57 (NHCOCH3); LRMS [C15H21N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 432.1 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (8).
수율 = 96%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.87 (s, 3H, NAc), 3.64 (dd, J = 12.1, 6.4 Hz, 1H, H-9), 3.69 (dd, J = 9.6, 1.4 Hz, 1H, H-7), 3.89 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.00 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.39 (m, 1H, H-5), 4.56 (dd, J = 10.8, 1.4 Hz, 1H, H-6), 5.49 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.83 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.40 (m, 1H, Ph-H4'), 7.46 (dd, J = 8.4, 6.9 Hz, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.71 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 8.28 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.63 (NHCOCH 3 ), 48.70 (C-5), 59.96 (C-4), 63.05 (C-9), 68.03 (C-7), 69.69 (C-8), 75.31 (C-6), 101.75 (C-3), 120.41 (Ph), 125.61 (Ph), 128.77 (트리아졸-C-5), 129.10 (Ph), 129.28 (Ph q 탄소), 147.74 (트리아졸-C-4), 150.48 (C-2), 168.75 (COONa), 173.58 (NHCOCH3). LRMS [C19H21N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 463.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C19H22N4NaO7 [M+H]+ 441.138070; 실측치, 441.140189.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (9).
수율 = 92%. 1H NMR (300 MHz, D2O): d 0.98 (d, J = 7.0 Hz, 3H, 이소부트-CH-3), 1.03 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH-3), 2.46 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.39 (s, 3H,OCH3), 3.65-3.76 (m, 2H, H-9, H-7), 3.94 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.49 (m, 1H, H-5), 4.60-4.65 (m, 3H, H-6, OCH2), 5.61 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.87 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 8.18 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.43 (이소부트-CH3), 18.64 (이소부트-CH3), 35.10 (이소부트-CH), 48.19 (C-5), 57.24 (OCH3), 59.86 (C-4), 63.07 (C-9), 64.24 (OCH2), 68.13 (C-7), 69.82 (C-8), 75.43 (C-6), 102.02 (C-3), 123.65 (트리아졸-C-5), 144.07 (트리아졸-C-4), 150.30 (C-2), 168.81 (COONa), 180.66 (이소부트-CO). LRMS [C17H25N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 459.0 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C17H25N4Na2O8 [M+Na]+ 459.1462; 실측치, 459.1458.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-페닐-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (10).
수율 = 89%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.94 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.43 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.60-3.76 (m, 2H, H-9, H-7), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.2, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.51 (m, 1H, H-5), 4.62 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H6), 5.58 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.42-7.54 (m, 3H, Ph-H-3', Ph-H-4', Ph-H-5'), 7.78 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 8.36 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.38 (이소부트-CH3), 18.65 (이소부트-CH3), 35.10 (이소부트-CH), 48.23 (C-5), 59.91 (C-4), 63.07 (C-9), 68.15 (C-7), 69.76 (C-8), 75.41 (C-6), 101.96 (C-3), 120.66 (Ph), 125.67 (Ph), 128.81 (트리아졸-C-5), 129.16 (Ph), 129.36 (Ph q 탄소), 147.71 (트리아졸-C-4), 150.32 (C-2), 168.80 (COONa), 180.67 (이소부트-CO). LRMS [C21H25N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 491.2 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C21H25N4Na2O7 [M+Na]+ 491.1513; 실측치, 491.1515.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-이소부틸-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-6).
에틸아세테이트를 이용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE832-6을 수득하였다 (93 mg, 66%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.89 (d, J = 6.6 Hz, 6H, 이소부틸-2CH3), 1.81 (s, 3H, NAc), 1.93 (m, 1H, 이소부틸-CH), 2.06 (s, 6H, 2OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.58 (d, J = 6.9 Hz, 2H, 이소부틸-CH2), 3.82 (s, 3H, COOCH3), 4.17 (dd, J = 12.5, 6.7 Hz, 1H, H-9), 4.38 (m, 1H, H-5), 4.67 (dd, J = 12.4, 2.3 Hz, 1H, H-9'), 4.77 (d, J = 10.5 Hz, 1H, H-6), 5.40 (m, 1H, H-8), 5.55 (d, J = 5.4 Hz, 1H, H-7), 5.88 (d, J = 9.9 Hz, 1H, H-4), 6.03 (s, 1H, H-3), 7.07 (brs, 1H, NH), 7.49 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.74, 20.81, 20.93 (3 OCOCH 3 ), 22.12, 22.84 (2 이소부틸-CH3 + NHCOCH 3 ), 28.60 (이소부틸-CH), 34.17 (이소부틸-CH2), 48.04 (C-5), 52.76 (COOCH 3 ), 58.62 (C-4), 62.06 (C-9), 67.56 (C-7), 70.55 (C-8), 76.57 (C-6), 106.82 (C-3), 120.94 (트리아졸-C-5), 146.03 (C-2), 146.83 (트리아졸-C-4), 161.30 (COOCH3), 169.99, 170.00 170.13, 170.78 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C24H34N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 561.2 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-이소부틸-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-8).
수율 = 79%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.82 (d, J = 6.6 Hz, 6H, 이소부틸-2CH3), 1.81-1.86 (m, 4H, NAc & 이소부틸-CH), 2.53 (d, J = 6.9 Hz, 2H, 이소부틸-CH2), 3.54-3.68 (m, 2H, H-9 & H-7), 3.85 (dd, J = 11.9, 2.6 Hz, 1H, H9'), 3.94 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.5 Hz, 1H, H-8), 4.33 (m, 1H, H-5), 4.49 (dd, J = 10.9, 1.2 Hz, 1H, H-6), 5.40 (dd, J = 9.7, 2.2 Hz, 1H, H-4), 5.78 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.80 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.15 (이소부틸-2CH3), 21.54 (NHCOCH 3 ), 28.09 (이소부틸-CH), 33.42 (이소부틸-CH2), 48.53 (C-5), 59.65 (C-4), 62.99 (C-9), 67.98 (C-7), 69.63 (C-8), 75.29 (C-6), 102.06 (C-3), 122.01 (트리아졸-C-5), 147.74 (트리아졸-C-4), 150.12 (C-2), 168.81 (COONa), 173.28 (NHCOCH3). LRMS [C17H25N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 443.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C17H26N4NaO7 [M+1]+ 421.169370; 실측치, 421.170091.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(4-하이드록시메틸페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE932-10).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 1.86 (s, 3H, NAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 3.84 (s, 3H, COOCH3), 4.19 (dd, J = 12.5, 6.6 Hz, 1H, H-9), 4.31 (m, 1H, H-5), 4.60-4.74 (m, 3H, H-9', CH2), 4.80 (d, J = 10.4 Hz, 1H, H-6), 5.40 (m, 1H, H-8), 5.54 (dd, J = 5.8, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.93 (d, J = 10.1 Hz, 1H, H-4), 6.07 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 6.74 (brs, 1H, NH), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.74 (d, J = 7.7 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 7.96 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.74, 20.85, 20.98 (3 OCOCH 3 ), 22.90 (NHCOCH 3 ), 48.31 (C-5), 52.83 (COOCH 3 ), 58.49 (C-4), 62.19 (C-9), 64.66 (CH2), 67.72 (C-7), 70.93 (C-8), 76.78 (C-6), 107.12 (C-3), 119.00 (트리아졸-C-5), 125.91 (Ph), 127.47 (Ph), 128.61 (Ph q 탄소), 141.59 (Ph q 탄소), 146.01 (C-2), 147.65 (트리아졸-C-4), 161.37 (COOCH3), 170.13, 170.41, 170.92, 171.26 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C27H32N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 611.2 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(4-
하이드록시메틸페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-12).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.85 (s, 3H, NAc), 3.54-3.71 (m, 2H, H-9, H-7), 3.86 (dd, J = 11.9, 2.5 Hz, 1H, H-9'), 3.96 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.4 Hz, 1H, H-8), 4.37 (m, 1H, H-5), 4.54 (d, J = 10.9 Hz, 1H, H-6), 4.62 (s, 2H, CH2), 5.50 (dd, J = 9.6, 2.1 Hz, 1H, H-4), 5.83 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-3), 7.44 (d, J = 8.2 Hz, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 8.38 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.70 (NHCOCH 3 ), 48.78 (C-5), 60.04 (C-4), 63.12 (C-9), 63.55 (CH2), 68.11 (C-7), 69.77 (C-8), 75.39 (C-6), 101.78 (C-3), 120.53 (트리아졸-C-5), 125.90 (Ph), 128.06 (Ph), 128.77 (Ph q 탄소), 140.80 (Ph q 탄소), 147.60 (C-2), 150.57 (트리아졸-C-4), 168.77 (COONa), 173.66 (NHCOCH3). LRMS [C20H23N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 493.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C20H24N4NaO8 [M+1]+ 471.148635; 실측치, 471.147973.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-13).
에틸아세테이트 : 아세톤 (6:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE832-13을 수득하였다 (67 mg, 58%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.81 (s, 3H, NAc), 2.05 (s, 6H, 2OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 3.36 (s, 3H, OCH3), 3.80 (s, 3H, COOCH3), 4.17 (dd, J = 12.5, 7.2 Hz, 1H, H-9), 4.29 (m, 1H, H-5), 4.50 (s, 2H, OCH2), 4.68-4.79 (m, 2H, H-9', H-6), 5.40 (ddd, J = 7.4, 4.9, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.53 (dd, J = 5.1, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.78 (dd, J = 10.0, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.05 (d, J = 9.1 Hz, 1H, NH), 7.64 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.71, 20.79, 20.91 (3 OCOCH 3 ), 22.80 (NHCOCH 3 ), 48.39 (C-5), 52.71 (COOCH 3 ), 58.16 (OCH3), 58.38 (C-4), 62.21 (C-9), 65.68 (OCH2), 67.73 (C-7), 70.90 (C-8), 76.71 (C-6), 107.18 (C-3), 121.50 (트리아졸-C-5), 145.24 (트리아졸-C-4), 145.92 (C-2), 161.27 (COOCH3), 170.06, 170.27, 170.81, 170.88 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C22H30N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 549.1[M+Na]+. HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C22H30N4NaO11 [M+Na]+ 549.1803; 실측치, 549.1805.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-17).
수율 = 85%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.84 (s, 3H, NAc), 3.31 (s, 3H, OCH3), 3.52-3.71 (m, 2H, H-9 & H-7), 3.85 (dd, J = 11.9, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 3.95 (ddd, J = 9.3, 6.2, 2.5 Hz, 1H, H-8), 4.33 (m, 1H, H-5), 4.51 (dd, J = 10.9, 1.2 Hz, 1H, H-6), 4.56 (s, 2H, OCH2), 5.48 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.80 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 8.08 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.65(NHCOCH 3 ), 48.68 (C-5), 57.15 (OCH3), 59.94 (C-4), 63.06 (C-9), 64.22 (OCH2), 68.05 (C-7), 69.71 (C-8), 75.34 (C-6), 101.80 (C-3), 123.54 (트리아졸-C-5), 144.08 (C-2), 150.43 (트리아졸-C-4), 168.75 (COONa), 173.57 (NHCOCH3); LRMS [C15H21N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 432.1 [M+Na]+.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(3-
메톡시페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-18).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.84 (s, 3H, NAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 3.84 (s, 3H, OCH3), 4.20 (dd, J = 12.5, 7.0 Hz, 1H, H-9), 4.32 (m, 1H, H-5), 4.71 (dd, J = 12.5, 2.7 Hz, 1H, H9'), 4.83 (dd, J = 10.5, 1.9 Hz, 1H, H-6), 5.43 (ddd, J = 6.9, 5.4, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.57 (dd, J = 5.4, 1.9 Hz, 1H, H-7), 5.87 (dd, J = 10.0, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.05 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.79-6.92 (m, 2H, NH, Ph-H-4'), 7.23-7.38 (m, 3H, Ph-H-2', Ph-H-5', Ph-H-6'), 7.84 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.73, 20.79, 20.92 (3 OCOCH 3 ), 22.98 (NHCOCH 3 ), 48.79 (C-5), 52.74 (COOCH 3 ), 55.35 (Ar-OCH 3 ), 58.04 (C-4), 62.18 (C-9), 67.74 (C-7), 70.78 (C-8), 76.63 (C-6), 107.19 (C-3), 110.94 (Ph), 114.43 (Ph), 118.20 (Ph), 118.93 (트리아졸-C-5), 129.97 (Ph), 131.17 (Ph q 탄소), 146.02 (C2), 148.03 (트리아졸-C-4), 160.02 (Ph q 탄소), 161.31 (COOCH3), 170.12, 170.24, 170.81, 170.99 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C27H32N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 611.2 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(3-
메톡시페
닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-20).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.86 (s, 3H, NAc), 3.52-3.74 (m, 2H, H-9, H-7), 3.77-3.92 (m, 4H, OCH3, H-9'), 3.97 (m, 1H, H-8), 4.37 (m, 1H, H-5), 4.54 (d, J = 10.9 Hz, 1H, H-6), 5.49 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 1H, H-4), 5.84 (s, 1H, H-3), 6.96 (m, 1H, Ph-H-4'), 7.23-7.48 (m, 3H, Ph-H-2', Ph-H-5', Ph-H-6'), 8.35 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.71 (NHCOCH 3 ), 48.80 (C-5), 55.39 (OCH3), 60.03 (C-4), 63.12 (C-9), 68.11 (C-7), 69.77 (C-8), 75.39 (C-6), 101.73 (C-3), 110.89 (Ph), 114.54 (Ph), 118.49 (Ph), 120.66 (트리아졸-C-5), 130.49 (Ph), 130.85 (Ph q 탄소), 147.51 (C2), 150.62 (트리아졸-C-4), 159.29 (Ph q 탄소), 168.77 (COONa), 173.65 (NHCOCH3). LRMS [C20H23N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 493.0 [M+1]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C20H24N4NaO8 [M+1]+ 471.148635; 실측치, 471.148177.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-프로필-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-24).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 3H, 프로필-CH3), 1.73 (m, 2H, 프로필-2'-CH2), 1.83 (s, 3H, NAc), 2.07 (s, 6H, 2OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 2.77 (t, J = 7.6 Hz, 2H, 프로필-1'-CH2), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 4.16 (dd, J = 12.5, 6.0 Hz, 1H, H-9), 4.38 (m, 1H, H-5), 4.58 (dd, J = 12.6, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.85 (d, J = 10.6 Hz, 1H, H-6), 5.42 (m, 1H, H-8), 5.56 (d, J = 6.5 Hz, 1H, H-7), 6.01 (s, 1H, H-3), 6.11 (d, J = 10.1 Hz, 1H, H-4), 7.37 (brs, 1H, NH), 7.68 (s, 1H, 트리아졸-CH); LRMS [C23H32N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 547.2 [M+Na]+
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-프로필-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-26).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.92 (t, J = 7.4 Hz, 3H, 프로필-CH3), 1.57-1.76 (m, 2H, 프로필-2'-CH2), 1.93 (s, 3H, NAc), 2.71 (t, J = 7.3 Hz, 2H, 프로필-1'-CH2), 3.62-3.77 (m, 2H, H-9, H-7), 3.94 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.2, 6.3, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.41 (m, 1H, H-5), 4.58 (dd, J = 10.9, 1.3 Hz, 1H, H-6), 5.50 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.87 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.89 (s, 1H, 트리아졸-CH). LRMS [C16H23N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 429.0 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C16H23N4Na2O7 [M+1]+ 429.1357; 실측치, 429.1361.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(피리딘-3-일)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-25).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.82 (s, 3H, NAc), 2.06 (s, 6H, 2OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 3.82 (s, 3H, COOCH3), 4.19 (dd, J = 12.5, 7.2 Hz, 1H, H-9), 4.40 (q, J = 9.9 Hz, 1H, H-5), 4.64-4.88 (m, 2H, H-7, H-9'), 5.38 (m, 1H, H-8), 5.57 (dd, J = 4.8, 1.9 Hz, 1H, H-7), 5.86 (dd, J = 9.9, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.08 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 7.08 (d, J = 9.1 Hz, 1H, NH), 7.36 (dd, J = 7.9, 4.8 Hz, 1H, Pyr-H5'), 8.04 (s, 1H, 트리아졸-CH), 8.14 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Pyr-H4'), 8.54 (d, J = 4.8 Hz, 1H, Pyr-H-6'), 8.96 (s, 1H, Pyr-H-2'); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.69, 20.79, 20.94 (3 OCOCH 3 ), 22.89 (NHCOCH 3 ), 48.35 (C-5), 52.81 (COOCH 3 ), 58.57 (C-4), 62.14 (C-9), 67.77 (C-7), 71.17 (C-8), 76.85 (C-6), 106.88 (C-3), 119.07 (트리아졸-C-5), 123.89 (Pyr), 126.33 (Pyr q 탄소), 133.20 (Pyr), 145.13 (트리아졸-C-4), 146.17 (C2), 146.88 (Pyr), 149.31 (Pyr), 161.25 (COOCH3), 170.16, 170.49, 170.80, 170.95 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C25H29N5O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 582.2 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(피리딘-3-일)-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-27).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.92 (s, 3H, NAc), 3.62-3.78 (m, 2H, H-9, H-7), 3.93 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.44 (m, 1H, H-5), 4.61 (dd, J = 10.9, 1.3 Hz, 1H, H-6), 5.59 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.90 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.53 (m, 1H, Pyr-H-5'), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Pyr-H-4'), 8.49-8.60 (m, 2H, 트리아졸-CH, Phyr-H-6'), 8.87 (brs, 1H, Pyr-H-2'); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.67 (NHCOCH 3 ), 48.77 (C-5), 60.17 (C-4), 63.08 (C-9), 68.06 (C-7), 69.73 (C-8), 75.36 (C-6), 101.61 (C-3), 121.13 (트리아졸-C-5), 134.31 (Pyr), 144.68 (C-2), 145.64 (Pyr), 148.42 (Pyr), 150.65 (트리아졸-C-4), 168.72 (COONa), 173.65 (NHCOCH3). LRMS [C18H20N5NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 463.7 [M+1]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C18H21N5NaO7 [M+1]+ 442.133319; 실측치, 442.133358.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(4-
메톡시페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-29).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.88 (s, 3H, NAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 6H, 2OAc), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 3.84 (s, 3H, OCH3), 4.13-4.30 (m, 2H, H-9, H-5), 4.66 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.83 (dd, J = 10.6, 1.9 Hz, 1H, H-6), 5.41 (m, 1H, H-8), 5.52 (dd, J = 5.8, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.93 (dd, J = 10.0, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.01-6.16 (m, 2H, H-3, NH), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.61-7.83 (m, 3H, 트리아졸-CH, Ph-H-2', Ph-H-6'); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.71, 20.78, 20.90 (3 OCOCH 3 ), 22.90 (NHCOCH 3 ), 48.45 (C-5), 52.70 (COOCH 3 ), 55.31 (Ph-OCH 3 ), 58.17 (C-4), 62.23 (C-9), 67.80 (C-7), 70.92 (C-8), 76.83 (C-6), 107.40 (C-3), 114.32 (Ph), 117.88 (트리아졸-C-5), 122.57 (Ph q 탄소), 127.13 (Ph), 145.93 (C-2), 148.07 (트리아졸-C-4), 159.87 (Ph q 탄소), 161.33 (COOCH3), 170.10, 170.27, 170.81, 170.99 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C27H32N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 611.3 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(4-
메톡시페닐
)-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트
(IE832-31).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.92 (s, 3H, NAc), 3.63-3.77 (m, 2H, H-9, H-7), 3.85 (s, 3H, OCH3), 3.93 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.6, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.42 (m, 1H, H-5), 4.59 (dd, J = 10.9, 1.3 Hz, 1H, H-6), 5.52 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.87 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.05 (d, J = 9.0 Hz, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.68 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 8.26 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.65 (NHCOCH 3 ), 48.75 (C-5), 55.39 (OCH3), 60.01 (C-4), 63.08 (C-9), 68.07 (C-7), 69.72 (C-8), 75.35 (C-6), 101.82 (C-3), 114.60 (Ph), 119.78 (트리아졸-C-5), 122.49 (Ph q 탄소), 127.21 (Ph), 147.65 (C-2), 150.49 (트리아졸-C-4), 159.23 (Ph q 탄소), 168.78 (COONa), 173.62 (NHCOCH3). LRMS [C20H23N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 492.6 [M+1]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C20H24N4NaO8 [M+1]+ 471.148635; 실측치, 471.147452.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(2-
메톡시페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-30).
에틸아세테이트 : 헥산 (7:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE832-30을 수득하였다 (81 mg, 62%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.84 (s, 3H, NAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 3.88 (s, 3H, OCH3), 4.20 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H, H-9), 4.37 (m, 1H, H-5), 4.71 (dd, J = 12.4, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.89 (dd, J = 10.5, 1.9 Hz, 1H, H-6), 5.45 (m, 1H, H-8), 5.59 (dd, J = 5.4, 1.9 Hz, 1H, H-7), 5.87 (dd, J = 9.9, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.07 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.91 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ph-H-3'), 7.03 (m, 1H, Ph-H-5'), 7.22-7.30 (m, 2H, Ph-H-4', NH), 8.07 (s, 1H, 트리아졸-CH), 8.17 (dd, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H, Ph-H-6'); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.71, 20.76, 20.88 (3 OCOCH 3 ), 22.90 (NHCOCH 3 ), 48.84 (C-5), 52.64 (COOCH 3 ), 55.36 (Ph-OCH 3 ), 57.83 (C-4), 62.24 (C-9), 67.85 (C-7), 70.79 (C-8), 76.75 (C-6), 107.72 (C-3), 110.87 (Ph), 118.66 (Ph q 탄소), 120.88 (Ph), 122.32 (트리아졸-C-5), 127.37 (Ph), 129.24 (Ph), 143.40 (트리아졸-C4), 145.82 (C-2), 155.68 (Ph q 탄소), 161.44 (COOCH3), 170.06, 170.19, 170.75, 171.04 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C27H32N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 611.2 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C27H32N4NaO11 [M+Na]+ 611.195979; 실측치, 611.196049.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(2-
메톡시페
닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-37).
수율 = 91%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.91 (s, 3H, NAc), 3.63-3.77 (m, 2H, H-9, H-7), 3.86-3.97 (m, 4H, H-9', OCH3), 4.04 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.45 (m, 1H, H-5), 4.60 (dd, J = 10.9, 1.2 Hz, 1H, H-6), 5.53 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.90 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.08-7.14 (m, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.34-7.49 (m, 1H, Ph-H-4'), 7.92 (dd, J = 8.0, 1.7 Hz, H-6'), 8.32 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.67 (NHCOCH 3 ), 48.59 (C-5), 55.38 (OCH3), 59.81 (C-4), 63.09 (C-9), 68.11 (C-7), 69.74 (C-8), 75.40 (C-6), 101.95 (C-3), 111.84 (Ph), 117.87 (Ph q 탄소), 121.00 (Ph), 123.12 (트리아졸-C-5), 127.27 (Ph), 130.05 (Ph), 143.23 (트리아졸-C-4), 150.33 (C-2), 155.70 (Ph q 탄소), 168.81 (COONa), 173.59 (NHCOCH3). LRMS [C20H23N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 493.2 [M+1]+.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-(2-메톡시페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-23).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.00-1.04 (m, 6H, 이소부티릴-2CH3), 2.08 (s, 6H, 2OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 2.25-2.34 (m, 1H, 이소부티릴-CH), 3.84 (s, 3H, COOCH3), 3.88 (s, 3H, Ph-OCH3), 4.20-4.28 (m, 2H, H-9, H-5), 4.71 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9), 4.99 (d, J = 10.5 Hz, 1H, H-6), 5.43 (m, 1H, H-8), 5.55 (dd, J = 5.4, 1.6 Hz, 1H, H-7), 6.03 (dd, J = 10.1, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.11 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 6.79 (d, J = 8.3 Hz, 1H, NH), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ph-H-3'), 7.05 (m, 1H, Ph-H-5'), 7.29 (m, 1H, Ph-H-4'), 8.04 (s, 1H, 트리아졸-CH), 8.2 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ph-H-6'); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.86, 19.34, 20.80, 20.95 (3 OCOCH 3 , 이소부티릴-2CH3), 35.42 (이소부티릴-CH), 49.31 (C-5), 52.68 (COOCH 3 ), 55.29 (Ph-OCH 3 ), 57.12 (C-4), 62.19 (C-9), 67.74 (C-7), 70.75 (C-8), 76.30 (C-6), 107.73 (C-3), 110.71 (Ph), 118.68 (Ph q 탄소), 120.89 (Ph), 122.62 (트리아졸-C-5), 127.51 (Ph), 129.21 (Ph), 143.30 (트리아졸-C-5), 145.68 (C-2), 155.68 (Ph q 탄소), 161.56 (COOCH3), 170.10, 170.20, 170.68 (3 OCOCH3), 178.05(이소부티릴-CO). LRMS [C29H36N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 639.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C29H36N4NaO11 [M+Na]+ 639.227279; 실측치, 639.225897.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-(2-
메톡시
페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-34).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.90 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 2.31 (m, 1H, 이소부티릴-CH), 3.53 (d, J = 9.4 Hz, 1H, H-7), 3.60 (dd, J = 11.5, 5.4 Hz, 1H, H-9), 3.79 (dd, J = 11.4, 3.0 Hz, 1H, H-9'), 3.85-3.91 (m, 4H, H-8, Ph-OCH3), 4.39-4.55 (m, 2H, H-5, H-6), 5.61 (dd, J = 9.7, 2.2 Hz, 1H, H-4), 5.72 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 6.89-7.10 (m, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.27 (ddd, J = 8.7, 7.4, 1.7 Hz, 1H, H-4'), 8.02 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H, Ph-H-6'), 8.23 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.38, 18.53 (이소부티릴-2CH3), 35.09 (이소부티릴-CH), 48.18 (C-5), 55.34 (OCH3), 59.66 (C-4), 63.08 (C-9), 68.18 (C-7), 69.76 (C-8), 75.44 (C-6), 102.15 (C-3), 111.80 (Ph), 117.86 (Ph q 탄소), 121.00 (Ph), 123.47 (트리아졸-C-5), 127.21 (Ph), 130.05 (Ph) , 143.12 (트리아졸-C-4), 150.16 (C-2), 155.70 (Ph q 탄소), 168.84 (COONa), 180.64 (NHCOCH3); LRMS [C22H28N4O8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 499.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C22H28N4NaO8 [M+Na]+ 499.179935; 실측치, 499.179943.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-45).
에틸아세테이트 : 헥산 (5:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE889-45를 수득하였다 (88 mg, 70%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.79 (s, 3H, NAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 3.81 (s, 3H, COOCH3), 4.18 (dd, J = 12.4, 7.2 Hz, 1H, H-9), 4.42 (m, 1H, H-5), 4.72 (dd, J = 12.6, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.79 (dd, J = 10.5, 1.6 Hz, 1H, H-6), 5.42 (m, 1H, H-8), 5.58 (dd, J = 5.1, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.83 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.04 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.20-7.42 (m, 4H, NH, Ph-H-3', Ph-H-4', Ph-H-5'), 7.72 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 7.88 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 20.70, 20.80, 20.90 (3 OCOCH 3 ), 22.85 (NHCOCH 3 ), 48.26 (C-5), 52.71 (COOCH 3 ), 58.41 (C-4), 62.26 (C-9), 67.80 (C-7), 70.97 (C-8), 76.95 (C-6), 107.37 (C-3), 118.76 (트리아졸-C-5), 125.77 (Ph), 128.51 (Ph), 128.91 (Ph), 129.85 (Ph, q 탄소), 145.95 (C-2), 148.13 (트리아졸-C-4), 161.32 (COOCH3), 170.04, 170.30, 170.84, 170.99 (NHCOCH3, 3 OCOCH3). LRMS [C26H30N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 581.0 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C26H30N4NaO10 [M+Na]+ 581.185414; 실측치, 581.184724.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-52).
수율 = 96%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.87 (s, 3H, NAc), 3.64 (dd, J = 12.1, 6.4 Hz, 1H, H-9), 3.69 (dd, J = 9.6, 1.4 Hz, 1H, H-7), 3.89 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.00 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.39 (m, 1H, H-5), 4.56 (dd, J = 10.8, 1.4 Hz, 1H, H-6), 5.49 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.83 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.40 (m, 1H, Ph-H4'), 7.46 (dd, J = 8.4, 6.9 Hz, 2H, Ph-H-3', Ph-H-5'), 7.71 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 8.28 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.63 (NHCOCH 3 ), 48.70 (C-5), 59.96 (C-4), 63.05 (C-9), 68.03 (C-7), 69.69 (C-8), 75.31 (C-6), 101.75 (C-3), 120.41 (Ph), 125.61 (Ph), 128.77 (트리아졸-C-5), 129.10 (Ph), 129.28 (Ph q 탄소), 147.74 (트리아졸-C-4), 150.48 (C-2), 168.75 (COONa), 173.58 (NHCOCH3). LRMS [C19H21N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 463.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C19H22N4NaO7 [M+H]+ 441.138070; 실측치, 441.140189.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE927-57).
에틸아세테이트 : 아세톤 (9:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE927-57을 수득하였다 (60 mg, 66%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 1.01 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 6H, 2OAc), 2.24 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.37 (s, 3H, OCH3), 3.81 (s, 3H, COOCH3), 4.14-4.29 (m, 2H, H-9, H-5), 4.51 (s, 2H, OCH2), 4.68 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.84 (dd, J = 10.5, 1.7 Hz, 1H, H-6), 5.38 (ddd, J = 6.6, 5.5, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.48 (dd, J = 5.5, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.91 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.02 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H, NH), 7.59 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.81, 19.30, 20.74, 20.90 (3 OCOCH 3 , 이소부트-2CH3), 35.51 (이소부트-CH), 48.79 (C-5), 52.69 (COOCH 3 ), 57.59 (C-4), 58.38 (OCH3), 62.08 (C-9), 65.73 (OCH2), 67.66 (C-7), 70.79 (C-8), 76.24 (C-6), 107.07 (C-3), 121.54 (트리아졸-C-5), 145.39 (트리아졸-C-4), 145.82 (C-2), 161.30 (COOCH3), 170.15, 170.23, 170.69 (3 OCOCH3), 177.87 (이소부트-CO). LRMS [C24H34N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 577.2 [M+Na]+.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE927-60).
수율 = 92%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.98 (d, J = 7.0 Hz, 3H, 이소부트-CH-3), 1.03 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH-3), 2.46 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.39 (s, 3H,OCH3), 3.65-3.76 (m, 2H, H-9, H-7), 3.94 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.49 (m, 1H, H-5), 4.60-4.65 (m, 3H, H-6, OCH2), 5.61 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.87 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 8.18 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.43 (이소부트-CH3), 18.64 (이소부트-CH3), 35.10 (이소부트-CH), 48.19 (C-5), 57.24 (OCH3), 59.86 (C-4), 63.07 (C-9), 64.24 (OCH2), 68.13 (C-7), 69.82 (C-8), 75.43 (C-6), 102.02 (C-3), 123.65 (트리아졸-C-5), 144.07 (트리아졸-C-4), 150.30 (C-2), 168.81 (COONa), 180.66 (이소부트-CO). LRMS [C17H25N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 459.0 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C17H25N4Na2O8 [M+Na]+ 459.1462; 실측치, 459.1458.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-이소부틸-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-5-이소부티르아미도-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE927-58).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 6H, 이소부틸-2CH3), 0.96 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 1.00 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 1.90 (m, 1H, 이소부틸-CH), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 6H, 2OAc), 2.22 (m, 1H, 이소부티릴-CH), 2.53 (d, J = 7.0 Hz, 2H, 이소부틸-CH2), 3.82 (s, 3H, COOCH3), 4.13-4.36 (m, 2H, H-9, H-5), 4.70 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.81 (dd, J = 10.5, 1.7 Hz, 1H, H-6), 5.38 (ddd, J = 6.6, 5.4, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.49 (dd, J = 5.5, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.87 (dd, J = 10.1, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.02 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.41 (d, J = 8.8 Hz, 1H, NH), 7.32 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.83, 19.29, 20.76, 20.92 (3 OCOCH 3 + 이소부티릴-2CH3), 22.23 (이소부틸-2CH3), 28.70 (이소부틸-CH), 34.68 (이소부틸-CH2), 35.55 (이소부티릴-CH), 48.48 (C-5), 52.68 (COOCH 3 ), 57.47 (C-4), 62.11 (C-9), 67.69 (C-7), 70.89 (C-8), 76.44 (C-6), 107.53 (C-3), 120.36 (트리아졸-C-5), 145.56 (C-2), 147.53 (트리아졸-C-4), 161.40 (COOCH3), 170.15, 170.24, 170.70 (3 OCOCH3), 177.74 (이소부티릴-CO). LRMS [C26H38N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 589.3 [M+Na]+.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-이소부틸-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-5-이소부티르아미도-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트.
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 6H, 이소부틸-2CH3), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 1.02 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 1.92 (m, 1H, 이소부틸-CH), 2.43 (m, 1H, 이소부티릴-CH), 2.60 (d, J = 6.9 Hz, 2H, 이소부틸-CH2), 3.62-3.74 (m, 2H, H-9, H-7), 3.93 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.02 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.47 (m, 1H, H-5), 4.56 (d, J = 11.1 Hz, 1H, H-6), 5.53 (dd, J = 9.7, 2.2 Hz, 1H, H-4), 5.84 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.88 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.45 (이소부티릴-CH3), 18.61 (이소부티릴-CH3), 21.31 (이소부틸-2CH3), 28.17 (이소부틸-CH), 33.54 (이소부틸-CH2), 35.12 (이소부티릴-CH), 48.09 (C-5), 59.53 (C-4), 63.07 (C-9), 68.14 (C-7), 69.78 (C-8), 75.47 (C-6), 102.30 (C-3), 121.99 (트리아졸-C-5), 147.82 (트리아졸-C-4), 150.05 (C-2), 168.88 (COONa), 180.46 (이소부티릴-CO). LRMS [C19H29N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 471.2 [M+Na]+, 449.2; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C19H29N4Na2O7 [M+Na]+ 471.1826; 실측치, 471.1823.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아미도-4-(4-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE984-4).
에틸아세테이트 : 헥산 (4:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE984-4를 수득하였다 (72 mg, 74%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.95 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 6H, 2OAc), 2.20-2.27 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 4.16-4.39 (m, 2H, H-9, H-5), 4.70 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.88 (dd, J = 10.5, 1.7 Hz, 1H, H-6), 5.40 (m, 1H, H-8), 5.52 (dd, J = 5.4, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.99 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.08 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H, NH), 7.26-7.43 (m, 3H, Ph-H-3', Ph-H-4', Ph-H-5'), 7.74 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-5'), 7.81 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.83, 19.31, 20.76, 20.92 (3 OCOCH 3 , 이소부트-2CH3), 35.55 (이소부트-CH), 48.74 (C-5), 52.72 (COOCH 3 ), 57.67 (C-4), 62.12 (C-9), 67.72 (C-7), 70.84 (C-8), 76.39 (C-6), 107.25 (C-3), 118.84 (트리아졸-C-5), 125.83 (Ph), 128.47 (Ph), 128.89 (Ph), 129.97 (Ph q 탄소), 145.81 (C-2), 148.19 (트리아졸-C-4), 161.35 (COOCH3), 170.18, 170.26, 170.71 (3 OCOCH3), 178.00 (이소부트-CO). LRMS [C28H34N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 608.9 [M+Na]+.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(4-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE984-5).
수율 = 89%. 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.94 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.43 (m, 1H, 이소부트-CH), 3.60-3.76 (m, 2H, H-9, H-7), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.2, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.51 (m, 1H, H-5), 4.62 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H6), 5.58 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.42-7.54 (m, 3H, Ph-H-3', Ph-H-4', Ph-H-5'), 7.78 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ph-H-2', Ph-H-6'), 8.36 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.38 (이소부트-CH3), 18.65 (이소부트-CH3), 35.10 (이소부트-CH), 48.23 (C-5), 59.91 (C-4), 63.07 (C-9), 68.15 (C-7), 69.76 (C-8), 75.41 (C-6), 101.96 (C-3), 120.66 (Ph), 125.67 (Ph), 128.81 (트리아졸-C-5), 129.16 (Ph), 129.36 (Ph q 탄소), 147.71 (트리아졸-C-4), 150.32 (C-2), 168.80 (COONa), 180.67 (이소부트-CO). LRMS [C21H25N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 491.2 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C21H25N4Na2O7 [M+Na]+ 491.1513 ; 실측치, 491.1515.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-4-(4-(2-
클로로페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-70).
아세톤 : 헥산 (3:2)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1172-70을 수득하였다 (76%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.81 (s, 3H, NAc), 2.05 (s, 6H, 2 OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.82 (s, 3H, COOCH3), 4.20 (dd, J = 12.5, 7.0 Hz, 1H, H-9), 4.30 (q, J = 9.8 Hz, 1H, H-5), 4.71 (dd, J = 12.5, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.86 (dd, J = 10.7, 1.9 Hz, 1H, H-6), 5.42 (ddd, J = 6.8, 5.4, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.55 (dd, J = 5.3, 1.9 Hz, 1H, H-7), 5.91 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.09 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 1H, NH), 7.26 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H, Ph-H), 7.34 (td, J = 7.6, 1.4 Hz, 1H, Ph-H), 7.41 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H, Ph-H), 8.05 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H, Ph-H), 8.19 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.75, 20.80, 20.93 (3 OCOCH 3 ), 22.94 (NHCOCH 3 ), 49.00 (C-5), 52.74 (COOCH 3 ), 57.92 (C-4), 62.18 (C-9), 67.81 (C-7), 70.86 (C-8), 76.48 (C-6), 107.11 (C-3), 122.63 (트리아졸-C-5), 127.22 (Ph), 128.62 (Ph, q 탄소), 129.44 (Ph), 129.80 (Ph), 130.28 (Ph), 131.42 (Ph, q 탄소), 144.31 (트리아졸-C-4), 145.96 (C-2), 161.34 (COOCH3), 170.20, 170.28, 170.79, 171.01 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C26H29ClN4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 615.1 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-4-(4-(2-
클로로페닐
)-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-78).
수율 = 89%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.93 (s, 3H, NAc), 3.68 (dd, J = 12.0, 6.4 Hz, 1H, H-9), 3.73 (dd, J = 9.7, 1.3 Hz, 1H, H-7), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.48 (t, J = 10.3 Hz, 1H, H-5), 4.61 (dd, J = 11.1, 1.3 Hz, 1H, H-6), 5.58 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.93 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.37-7.51 (m, 2H, 2Ph-H), 7.58 (dd, J = 7.5, 1.9 Hz, 1H, Ph-H), 7.81 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H, Ph-H), 8.49 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.70 (NHCOCH 3 ), 48.67 (C-5), 60.10 (C-4), 63.09 (C-9), 68.10 (C-7), 69.74 (C-8), 75.39 (C-6), 101.87 (C-3), 123.78 (트리아졸-C-5), 127.36 (Ph), 128.03 (Ph q 탄소), 129.94 (Ph), 130.10 (Ph), 130.19 (Ph), 131.50 (Ph q 탄소), 144.37 (트리아졸-C-4), 150.41 (C-2), 168.78 (COONa), 173.56 (NHCOCH3); LRMS [C19H20ClN4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 497.1 [M+Na]+.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(2-
메틸페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-72).
아세톤 : 헥산 (4:3)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1172-72를 수득하였다 (81%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.76 (s, 3H, NAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 2.33 (s, 3H, Ph-CH3), 3.82 (s, 3H, COOCH3), 4.19 (dd, J = 12.5, 7.1 Hz, 1H, H-9), 4.39 (q, J = 9.9 Hz, 1H, H-5), 4.71 (dd, J = 12.4, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.82 (dd, J = 10.4, 2.0 Hz, 1H, H-6), 5.41 (ddd, J = 7.6, 5.1, 2.7 Hz, 1H, H-8), 5.57 (dd, J = 5.2, 1.9 Hz, 1H, H-7), 5.86 (dd, J = 10.2, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.07 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.16-7.30 (m, 4H, NH, 3PH-H), 7.60 (m, 1H, Ph-H), 7.70 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.72, 20.81, 20.93 (3 OCOCH 3 ), 21.09 (Ph-CH 3 ), 22.82 (NHCOCH 3 ), 48.63 (C-5), 52.73 (COOCH 3 ), 58.03 (C-4), 62.21 (C-9), 67.76 (C-7), 70.93 (C-8), 76.72 (C-6), 107.38 (C-3), 121.28 (트리아졸-C-5), 126.16 (Ph), 128.58 (Ph), 128.94 (Ph), 129.23 (Ph, q 탄소), 130.90 (Ph), 135.64 (Ph, q 탄소), 145.85 (C-2), 147.15 (트리아졸-C-4), 161.37 (COOCH3), 170.07, 170.30, 170.80, 171.06 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C27H32N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 595.2 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(2-
메틸페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-82).
수율 = 85%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.93 (s, 3H, NAc), 2.36 (s, 3H, Ph-CH3), 3.68 (dd, J = 11.9, 6.3 Hz, 1H, H-9), 3.74 (d, J = 9.7 Hz, 1H, H-7), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.48 (t, J = 10.3 Hz, 1H, H-5), 4.60 (dd, J = 10.8, 1.3 Hz, 1H, H-6), 5.58 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.92 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.29-7.46 (m, 3H, 3Ph-H), 7.58 (d, J = 7.4 Hz, 1H, Ph-H), 8.19 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 19.77 (Ph-CH 3 ), 21.67 (NHCOCH 3 ), 48.69 (C-5), 60.06 (C-4), 63.09 (C-9), 68.10 (C-7), 69.74 (C-8), 75.39 (C-6), 101.92 (C-3), 122.60 (트리아졸-C-5), 126.17 (Ph), 128.94 (Ph q 탄소), 129.01 (Ph), 129.03 (Ph), 130.76 (Ph), 136.45 (Ph q 탄소), 146.87 (트리아졸-C-4), 150.42 (C-2), 168.80 (COONa), 173.52 (NHCOCH3); LRMS [C20H23N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 477.2 [M+Na]+.
메틸
5-아세트아미도-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리데옥시-4-(4-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-74).
아세톤 : 헥산 (3:2)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1172-74를 수득하였다 (90%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.75 (s, 3H, NAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 3.83 (s, 3H, COOCH3), 4.14-4.35 (m, 2H, H-9, H-5), 4.70 (dd, J = 12.4, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.92 (dd, J = 10.6, 1.8 Hz, 1H, H-6), 5.42 (ddd, J = 6.8, 5.4, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.54 (dd, J = 5.5, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.97 (dd, J = 10.1, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.08 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 1H, NH), 7.48 (t, J = 7.7 Hz, 1H, Ph-H), 7.61 (td, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H, Ph-H), 7.72 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H, Ph-H), 7.75-7.84 (m, 2H, Ph-H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.76, 20.79, 20.92 (3 OCOCH 3 ), 22.73 (NHCOCH 3 ), 49.38 (C-5), 52.74 (COOCH 3 ), 57.48 (C-4), 62.16 (C-9), 67.80 (C-7), 70.79 (C-8), 76.25 (C-6), 107.09 (C-3), 122.58 (Ph, q 탄소), 122.82 (q, J = 5.1, 4.6 Hz, 트리아졸-C-5), 125.29 (Ph, q 탄소), 126.22 (q, J = 5.5 Hz, Ph), 127.61 (q, J = 30.4 Hz, CF3), 128.71 (Ph), 131.79 (Ph), 132.09 (Ph), 144.40 (트리아졸-C-4), 145.84 (C-2), 161.35 (COOCH3), 170.20, 170.26, 170.75, 171.19 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C27H29F3N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 649.1 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-
안하이드로
-3,4,5-
트리데옥시
-4-(4-(2-(
트리플루오로메틸
)페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-83).
수율 = 77%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.94 (s, 3H, NAc), 3.68 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H, H-9), 3.73 (d, J = 9.6 Hz, 1H, H-7), 3.93 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.3, 6.2, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.51 (t, J = 10.2 Hz, 1H, H-5), 4.59 (d, J = 10.9 Hz, 1H, H-6), 5.61 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.93 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.61-7.70 (m, 2H, 2Ph- H), 7.75 (t, J = 7.6 Hz, 1H, Ph-H), 7.90 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Ph-H), 8.23 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.61 (NHCOCH 3 ), 48.62 (C-5), 59.96 (C-4), 63.09 (C-9), 68.10 (C-7), 69.73 (C-8), 75.48 (C-6), 101.96 (C-3), 122.49 (Ph q 탄소), 123.77 (q, J = 3.0 Hz, 트리아졸-C-5), 125.20 (Ph q 탄소), 126.32 (q, J = 5.4 Hz, Ph), 127.39-128.51 (m, CF3), 129.38 (Ph), 131.99 (Ph), 132.27 (Ph), 144.83 (트리아졸-C-4), 150.33 (C-2), 168.75 (COONa), 173.52 (NHCOCH3); LRMS [C20H20F3N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 531.2 [M+Na]+.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(5-
메톡시메틸
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-79).
에틸아세테이트 : 아세톤 (6:1)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1172-79를 수득하였다 (68%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.87 (s, 3H, NAc), 2.01 (s, 3H, OAc), 2.03 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.34 (s, 3H, CH2OCH 3 ), 3.79 (s, 3H, COOCH3), 4.15-4.27 (m, 2H, H-5, H-9), 4.34-4.50 (m, 2H, CH2O), 4.60 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 5.09 (dd, J = 10.7, 1.8 Hz, 1H, H-6), 5.42 (td, J = 6.2, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.49 (dd, J = 6.3, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.91 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.05 (dd, J = 9.9, 2.5 Hz, 1H, H-4), 7.26 (d, J = 7.8 Hz, 1H, NH), 7.46 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.71, 20.76, 20.92 (3 OCOCH 3 ), 23.04 (NHCOCH 3 ), 50.03 (C-5), 52.60 (COOCH 3 ), 55.20 (C-4), 58.59 (CH2OCH 3 ), 61.94 (CH 2 OCH3), 62.10 (C-9), 67.74 (C-7), 70.25 (C-8), 75.54 (C-6), 107.87 (C-3), 133.48 (트리아졸-C-4), 134.46 (트리아졸-C-5), 145.50 (C-2), 161.55 (COOCH3), 169.96, 170.21, 170.66, 171.54 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C22H30N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 549.3 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(5-
메톡시메틸
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-87).
수율 = 83%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.89 (s, 3H, NAc), 3.40 (s, 3H, OCH3), 3.65-3.74 (m, 2H, H-9, H-7), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.57 (d, J = 10.9 Hz, 1H, H-6), 4.61-4.73 (m, 3H, H-5, OCH2), 5.62 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 1H, H-4), 5.85 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 7.81 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.73 (NHCOCH 3 ), 47.97 (C-5), 57.87 (OCH3), 58.92 (C-4), 61.34 (OCH2), 63.08 (C-9), 68.08 (C-7), 69.70 (C-8), 75.34 (C-6), 102.36 (C-3), 134.66 (트리아졸-C-5), 134.73 (트리아졸-C-4), 150.02 (C-2), 168.75 (COONa), 173.61 (NHCOCH3); LRMS [C15H21N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 431.2 [M+Na]+.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(5-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-39).
헥산 : 아세톤 (4:3)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1172-39를 수득하였다 (82%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.74 (s, 3H, NAc), 2.02 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 3.80 (s, 3H, COOCH3), 4.04 (td, J = 10.1, 7.3 Hz, 1H, H-5), 4.21 (m, 1H, H-9), 4.51 (m, 1H, H-9'), 5.05 (d, J = 10.5 Hz, 1H, H-6), 5.31-5.46 (m, 2H, H-7, H-8), 5.98 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-3), 6.09 (dd, J = 9.7, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.75 (d, J = 7.4 Hz, 1H, NH), 7.30-7.32 (m, 2H, 2Ph-H), 7.47-7.53 (m, 3H, 3Ph-H), 7.58 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.73, 20.79, 20.89 (3 OCOCH 3 ), 23.03 (NHCOCH 3 ), 50.85 (C-5), 52.58 (COOCH 3 ), 54.24 (C-4), 62.01 (C-9), 67.63 (C-7), 69.87 (C-8), 74.78 (C-6), 108.02 (C-3), 126.01 (Ph q 탄소), 129.07 (Ph), 129.23 (Ph), 130.07 (Ph), 132.70 (트리아졸-C-4), 139.35 (트리아졸-C-5), 145.49 (C-2), 161.49 (COOCH3), 169.79, 170.40, 170.58, 171.03 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C26H30N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 581.1 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(5-페닐-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-45).
수율 = 88%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.72 (s, 3H, NAc), 3.55 (d, J = 9.7 Hz, 1H, H-7), 3.62 (dd, J = 12.0, 6.3 Hz, 1H, H-9), 3.87 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 3.95 (ddd, J = 9.3, 6.2, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.33-4.51 (m, 2H, H-5, H-6), 5.63 (dd, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H, H-4), 5.98 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.46-7.56 (m, 2H, 2Ph-H), 7.57-7.61 (m, 3H, 3Ph-H), 7.85 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.88 (NHCOCH 3 ), 48.83 (C-5), 57.52 (C-4), 63.00 (C-9), 67.95 (C-7), 69.64 (C-8), 75.01 (C-6), 103.14 (C-3), 125.71 (Ph q 탄소), 129.13 (Ph), 129.28 (Ph), 130.10 (Ph), 133.02 (트리아졸-C-4), 139.88 (트리아졸-C-5), 149.90 (C-2), 168.80 (COONa), 173.30 (NHCOCH3); LRMS [C19H21N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 462.6 [M+Na]+.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4,5-
다이페닐
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-90).
헥산 : 아세톤 (3:2)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1172-90을 수득하였다 (79%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.82 (s, 3H, NAc), 2.03 (s, 6H, 2OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 3.78 (s, 3H, COOCH3), 4.17-4.27 (m, 2H, H-5, H-9), 4.52 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 5.07 (d, J = 10.4 Hz, 1H, H-6), 5.40 (td, J = 6.3, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.45 (dd, J = 6.8, 1.7 Hz, 1H, H-7), 5.79-5.93 (m, 2H, H-3, H-4), 7.13-7.27 (m, 6H, NH, 5Ph-H), 7.28-7.34 (m, 2H, 2Ph-H), 7.38-7.48 (m, 3H, 3Ph-H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.75, 20.76, 20.89 (3 OCOCH 3 ), 23.33 (NHCOCH 3 ), 50.56 (C-5), 52.54 (COOCH 3 ), 54.97 (C-4), 62.09 (C-9), 67.54 (C-7), 69.93 (C-8), 75.13 (C-6), 108.41 (C-3), 126.48 (Ph q 탄소), 127.15 (Ph), 128.09 (Ph), 128.44 (Ph), 129.31 (Ph), 130.11 (Ph), 130.14 (Ph), 130.18 (Ph q 탄소), 135.11 (트리아졸-C), 144.35 (트리아졸-C), 145.49 (C-2), 161.50 (COOCH3), 169.80, 170.27, 170.63, 171.37 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C32H34N4O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 657.3 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4,5-
다이페닐
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1172-102).
수율 = 84%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.83 (s, 3H, NAc), 3.58 (d, J = 9.7 Hz, 1H, H-7), 3.63 (dd, J = 12.0, 6.2 Hz, 1H, H-9), 3.88 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 3.94 (ddd, J = 9.4, 6.2, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.37 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H-6), 4.59 (dd, J = 11.2, 9.2 Hz, 1H, H-5), 5.48 (d, J = 9.7 Hz, 1H, H-4), 5.90 (s, 1H, H-3), 7.36-7.59 (m, 10H, Ph-H); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.94 (NHCOCH 3 ), 48.33 (C-5), 58.44 (C-4), 63.01 (C-9), 67.98 (C-7), 69.61 (C-8), 74.96 (C-6), 103.15 (C-3), 126.05 (Ph q 탄소), 127.31 (Ph), 128.55 (Ph), 128.80 (Ph), 129.21 (Ph), 129.63 (Ph q 탄소), 130.25 (Ph), 130.42 (Ph), 135.79 (트리아졸-C), 144.67 (트리아졸-C), 149.71 (C-2), 168.67 (COONa), 173.41 (NHCOCH3); LRMS [C25H25N4NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 539.2 [M+Na]+.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-4-(4-(2-
브로모페닐
)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1257-75).
헥산 : 아세톤 (3:2)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1257-75를 수득하였다 (88%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.85 (s, 3H, NAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 3.84 (s, 3H, COOCH3), 4.16-4.28 (m, 2H, H-5, H-9), 4.68 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.91 (dd, J = 10.7, 1.8 Hz, 1H, H-6), 5.43 (ddd, J = 6.7, 5.6, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.53 (dd, J = 5.8, 1.7 Hz, 1H, H-7), 6.00 (dd, J = 9.9, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.11 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 6.59 (d, J = 8.4 Hz, 1H, NH), 7.20 (ddd, J = 8.1, 7.3, 1.6 Hz, 1H, PH-H), 7.40 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H, Ph-H), 7.63 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H, Ph-H), 7.96 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H, Ph-H), 8.22 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.80, 20.95 (3 OCOCH 3 ), 23.13 (NHCOCH 3 ), 49.56 (C-5), 52.75 (COOCH 3 ), 57.49 (C-4), 62.10 (C-9), 67.81 (C-7), 70.62 (C-8), 76.10 (C-6), 107.03 (C-3), 121.42 (Ph q 탄소), 122.66 (Ph), 127.76 (Ph), 129.75 (Ph), 130.65 (Ph), 133.59 (트리아졸-C5), 145.61 (트리아졸-C4), 145.94 (C-2), 161.33 (COOCH3), 170.15, 170.29, 170.71, 171.09 (NHCOCH3, 3 OCOCH3).
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-4-(4-(2-
브로모페닐
)-[1,2,3,]
트리아졸
-1-일)-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1257-84).
수율 = 89%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.93 (s, 3H, NAc), 3.62-3.77 (m, 2H, H-7, H-9), 3.92 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.02 (ddd, J = 9.2, 6.2, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.49 (dd, J = 10.9, 9.6 Hz, 1H, H-5), 4.60 (dd, J = 10.9, 1.3 Hz, 1H, H-6), 5.58 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.92 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.36 (ddd, J = 7.9, 7.3, 1.7 Hz, 1H, Ph-H), 7.49 (td, J = 7.6, 1.3 Hz, 1H, Ph-H), 7.69 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H, Ph-H), 7.77 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H, Ph-H), 8.45 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.77 (NHCOCH 3 ), 48.68 (C-5), 60.07 (C-4), 63.10 (C-9), 68.11 (C-7), 69.75 (C-8), 75.42 (C-6), 101.91 (C-3), 121.49 (Ph q 탄소), 123.72 (Ph), 127.90 (Ph), 129.16 (Ph), 130.16 (Ph q 탄소), 130.42 (Ph), 130.71 (Ph), 133.42 (트리아졸-C5), 145.89 (트리아졸-C4), 150.39 (C-2), 168.78 (COONa), 173.54 (NHCOCH3).
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(2-메톡시카르보닐)페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1398-25).
헥산 : 아세톤 (4:3)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 IE1398-25를 수득하였다 (91%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.76 (s, 3H, NAc), 2.02 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 3.75 (s, 3H, Ph-COOCH3), 3.80 (s, 3H, C2-COOCH3), 4.17 (dd, J = 12.4, 7.1 Hz, 1H, H-9), 4.31 (q, J = 9.8 Hz, 1H, H-5), 4.69 (dd, J = 12.5, 2.8 Hz, 1H. H-9'), 4.78 (d, J = 10.3 Hz, 1H, H-6), 5.38 (ddd, J = 7.6, 5.4, 2.8 Hz, 1H, H-8), 5.52 (dd, J = 5.0, 1.9 Hz, 1H, H-7), 5.78 (dd, J = 10.2, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.03 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 7.13 (d, J = 8.9 Hz, 1H, NH), 7.38 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Ph-H), 7.50 (td, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H, Ph-H), 7.65 (d, J = 7.7 Hz, 1H, Ph-H), 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Ph-H), 7.84 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 20.72, 20.79, 20.91 (3 OCOCH 3 ), 22.80 (NHCOCH 3 ), 48.65 (C-5), 52.29, 52.66 (2 COOCH 3 ), 57.96 (C-4), 62.23 (C-9), 67.78 (C-7), 70.91 (C-8), 76.66 (C-6), 107.37 (C-3), 122.06 (Ph), 128.35 (Ph), 129.85 (Ph), 129.99 (Ph q 탄소), 130.15 (Ph q 탄소), 130.35 (Ph), 131.62 (트리아졸-C5), 145.79 (트리아졸-C4), 145.89(C-2), 161.36 (C2-COOCH3), 168.39 (Ph-COOCH3), 170.07, 170.27, 170.76, 171.02 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C28H32N4O12] (m/z): (파지티브 이온 모드) 639.3 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-4-(4-(2-
메톡시카르보닐
)페닐)-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE1398-33).
수율 = 68%. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.94 (s, 3H, NAc), 3.66 (dd, J = 12.2, 6.0 Hz, 1H, H-9), 3.72 (dd, J = 9.8, 1.4 Hz, 1H, H-7), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.9 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.4, 6.4, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.47 (t, J = 10.3 Hz, 1H, H-5), 4.61 (dd, J = 10.9, 1.4 Hz, 1H, H-6), 5.59 (dd, J = 9.5, 2.1 Hz, 1H, H-4), 5.95 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.43-7.55 (m, 3H, 3 Ph-H), 7.75 (dd, J = 6.6, 1.5 Hz, 1H, Ph-H), 8.18 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (101 MHz, D2O): δ 21.76 (NHCOCH 3 ), 48.80 (C-5), 59.69 (C-4), 63.10 (C-9), 68.13 (C-7), 69.77 (C-8), 75.40 (C-6), 102.22 (C-3), 122.33 (트리아졸-C5), 125.00 (Ph q 탄소), 126.44 (Ph), 128.30 (Ph), 128.57 (Ph), 128.79 (Ph), 138.95 (Ph q 탄소), 146.15 (트리아졸-C4), 150.22 (C-2), 168.85 (C2-COONa), 173.80 (NHCOCH3), 178.10 (Ph-COONa); LRMS [C20H20N4Na2O9] (m/z): (파지티브 이온 모드) 528.8 [M+Na]+.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-3,4,5-트리데옥시-3-플루오로-5-이소부티르아미도-4-(4-메톡시메틸-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-에리트로-베타-L-글루코-non-2-울로피라노실로네이트
플루오라이드
(IE1257-22).
헥산/아세톤 (3:2)을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 10을 수득하였다 (57 mg, 81%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.96-1.01 (m, 6H, 이소부트-2CH3), 2.01 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.13 (s, 3H, OAc), 2.23 (dq, J = 13.0, 6.8 Hz, 1H, 이소부트-CH), 3.36 (s, 3H, OCH3), 3.90-3.96 (m, 4H, COOCH3, H-5), 4.19 (dd, J = 12.6, 4.6 Hz, 1H, H-9), 4.27 (dd, J = 12.6, 2.5 Hz, 1H, H-9'), 4.54 (s, 2H, OCH2), 4.99-5.30 (m, 3H, H-3, H-6, H-7), 5.37 (ddd, J = 8.6, 4.6, 2.4 Hz, 1H, H-8), 6.19-6.29 (m, 2H, H-4, NH), 7.60 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 18.86 (이소부트-CH3), 19.32 (이소부트-CH3), 20.59, 20.75, 20.79 (3 OCOCH 3 ), 35.53 (이소부트-CH), 50.84 (d, J = 5.8 Hz, C-5), 53.62 (COOCH 3 ), 58.34 (OCH3), 59.00-59.40 (m, C-4), 61.86 (C-9), 65.50 (OCH2), 67.08 (C-7), 68.29 (C-8), 71.51 (C-6), 90.64 (dd, J = 196.1, 30.3 Hz, C-3), 105.58 (dd, J = 230.3, 26.8 Hz, C-2), 124.52 (트리아졸-CH), 144.83 (트리아졸-q 탄소), 164.51 (d, J = 32.9 Hz, COOCH3), 169.56, 170.41, 170.69 (3 OCOCH3), 178.35 (이소부트-CO); 19F NMR (376 MHz, CDCl3): δ -118.67 (d, J = 14.0 Hz, F-2α), -197.42 (d, J = 13.2 Hz, F-3베타); LRMS [C24H34F2N4O11] (m/z): (파지티브 이온 모드) 615.3 [M+Na]+.
3,4,5-
트리데옥시
-3-
플루오로
-5-
이소부티르아미도
-4-(4-
메톡시메틸
-[1,2,3,]트리아졸-1-일)-D-에리트로-베타-L-글루코-non-2-울로피라노소닉
플루오라이드
(IE1257-24).
1H NMR (400 MHz, D2O): δ 0.81 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 0.94 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부트-CH3), 2.35 (p, J = 6.9 Hz, 1H, 이소부트-CH), 3.38 (s, 3H, OCH3), 3.54 (d, J = 9.2 Hz, 1H, H-7), 3.61 (m, 1H, H-9), 3.78-3.91 (m, 2H, H-8, H-9'), 4.52-4.76 (m, 3H, OCH2, H-6), 4.85 (m, 1H, H-5), 5.32 (ddd, J = 49.5, 13.7, 9.7 Hz, 1H, H-3), 5.75 (q, J = 11.2 Hz, 1H, H-4), 8.28 (s, 1H, 트리아졸-CH); 13C NMR (100 MHz, D2O): δ 18.11 (이소부트-CH3), 18.65 (이소부트-CH3), 34.87 (이소부트-CH), 48.15 (d, J = 6.1 Hz, C-5), 57.26 (OCH3), 63.16 (C-9), 63.18-63.58 (m, C-4), 64.13 (OCH2), 67.85 (C-7), 69.83 (C-8), 73.73 (d, J = 3.3 Hz, C-6), 90.22 (dd, J = 190.9, 32.6 Hz, C-3), 106.79 (dd, J = 224.1, 27.8 Hz, C-2), 124.89 (트리아졸-CH), 144.09 (trizaole-q C), 169.21 (d, J = 30.7 Hz, COOH), 180.88 (이소부트-CO); 19F NMR (376 MHz, D2O): δ -112.75 (d, J = 13.8 Hz, F-2α), -199.41 (d, J = 14.3 Hz, F-3베타); LRMS [C17H25F2N4NaO8] (m/z): (파지티브 이온 모드) 496.8 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+1]+ 계산치 C17H26F2N4O8 [M+1]+ 453.1791; 실측치, 453.1810.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-4-(1-
시아노
-
2H
-이소인
돌
-2-일)-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-76).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.60 (s, 3H, NAc), 1.82 (s, 6H, 2 OAc), 1.84 (s, 3H, OAc), 3.60 (s, 3H, COOCH3), 3.96 (dd, J = 12.7, 7.0 Hz, 1H, H-9), 4.19 (q, J = 9.9 Hz, 1H, H-5), 4.40-4.50 (m, 2H, H-6, H-9'), 5.16 (ddd, J = 7.5, 6.0, 2.4 Hz, 1H, H-8); 5.22-5.33 (m, 2H, H-4, H-7), 5.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-3), 6.20 (d, J = 9.6 Hz, 1H, NHAc), 6.84 (m, 1H, Ar-H), 6.99 (m, 1H, Ar-H), 7.26 (s, 1H, Ar-H-3'), 7.37 (m, 2H, Ar-H-4', Ar-H-7'); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.76, 20.92 (3 OCOCH 3 ), 22.97 (NHCOCH 3 ), 49.26 (C-5), 52.79 (COOCH 3 ), 58.00 (C-4), 62.08 (C-9), 67.67 (C-7), 70.86 (C-8), 77.06 (C-6), 93.82 (Ar-C-CN), 107.66 (C-3), 114.69 (CN), 117.55 (Ar), 117.78 (Ar), 121.14 (Ar), 123.23 (Ar), 124.63 (Ar q 탄소), 126.08 (Ar), 131.60 (Ar q 탄소), 146.63 (C-2), 161.29 (COOCH3), 170.17, 170.30, 170.63 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C27H29N3O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 578.1 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-안하이드로-4-(1-
시아노
-
2H
-이소인
돌
-2-일)-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-80).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.91 (s, 3H, NAc), 3.61-3.77 (m, 2H, H-7, H-9), 3.94 (dd, J = 11.9, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.05 (ddd, J = 9.2, 6.2, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.50 (m, 1H, H-5), 4.64 (d, J = 11.0 Hz, 1H, H-6), 5.47 (dd, J = 9.4, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.96 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.21 (m, 1H, Ar-H), 7.37 (ddd, J = 8.9, 6.7, 1.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.65-7.87 (m, 3H, Ar-H-3', Ar-H-4', Ar-H-7'); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.77 (NHCOCH 3 ), 49.83 (C-5), 59.20 (C-4), 63.08 (C-9), 68.09 (C-7), 69.77 (C-8), 75.41 (C-6), 92.08 (Ar-C-CN), 103.30 (C-3), 115.30 (CN), 117.35 (Ar), 119.65 (Ar), 121.36 (Ar), 122.82 (Ar), 124.09 (Ar q 탄소), 125.99 (Ar), 132.03 (Ar q 탄소), 150.56 (C-2), 168.78 (COONa), 173.36 (NHCOCH3); LRMS [C20H20N3NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 460.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C20H20N3Na2O7 [M+Na]+ 460.1091; 실측치, 460.1097.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-4-(1-
시아노
-
2H
-이소인
돌
-2-일)-3,4,5-트리데옥시-5-이소부티르아미도-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-92).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.92 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 1.00 (d, J = 6.8 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 2.07 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 2.27 (m, 1H, 이소부티릴-CH), 3.86 (s, 3H, COOCH3), 4.23 (dd, J = 12.4, 6.6 Hz, 1H, H-9), 4.50 (m, 1H, H-5), 4.68 (dd, J = 12.5, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.77 (d, J = 10.6 Hz, 1H, H-6), 5.40 (m, 1H, H-8), 5.51 (dd, J = 5.6, 1.6 Hz, 1H, H-7), 5.62 (dd, J = 9.7, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.15 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.24 (d, J = 9.4 Hz, 1H, NH), 7.11 (dd, J = 8.6, 6.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.28 (dd, J = 8.4, 6.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.50 (s, 1H, Ar-H-3'), 7.60-7.64 (m, 2H, Ar-H-4', Ar-H-7'); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.77, 19.05 (이소부티릴-2CH3), 20.69, 20.73, 20.90 (3 OCOCH 3 ), 35.51 (이소부티릴-CH), 49.11 (C-5), 52.78 (COOCH 3 ), 57.88 (C-4), 62.05 (C-9), 67.61 (C-7), 70.80 (C-8), 77.01 (C-6), 93.83 (Ar-C-CN), 107.56 (C-3), 114.80 (CN), 117.58 (Ar), 117.81 (Ar), 121.20 (Ar), 123.22 (Ar), 124.66 (Ar q 탄소), 126.15 (Ar), 131.56 (Ar q 탄소), 146.50 (C-2), 161.31 (COOCH3), 170.10, 170.14, 170.57 (3 OCOCH3), 177.07 (이소부티릴-CO); LRMS [C29H33N3O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 606.4 [M+Na]+.
소듐 2,6-
안하이드로
-4-(1-
시아노
-
2H
-
이소인돌
-2-일)-3,4,5-
트리데옥시
-5-
이
소부티르아미도-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-99).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 0.88 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H, 이소부티릴-CH3), 2.44 (m, 1H, 이소부티릴-CH), 3.62-3.75 (m, 2H, H-7, H-9), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.04 (ddd, J = 9.3, 6.3, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.56-4.66 (m, 2H, H-5, H-6), 5.47 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 1H, H-4), 5.95 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 7.20 (ddd, J = 7.8, 6.8, 1.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.36 (ddd, J = 8.3, 6.8, 1.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.70 (dd, J = 8.6, 1.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.74-7.87 (m, 2H, 2 Ar-H); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 18.16, 18.59 (이소부티릴-2CH3), 35.06 (이소부티릴-CH), 49.13 (C-5), 59.30 (C-4), 63.07 (C-9), 68.20 (C-7), 69.81 (C-8), 75.45 (C-6), 92.08 (Ar-C-CN), 103.34 (C-3), 115.47 (CN), 117.33 (Ar), 120.04 (Ar), 121.38 (Ar), 122.81 (Ar), 124.04 (Ar q 탄소), 126.01 (Ar), 132.04 (Ar q 탄소), 150.37 (C-2), 168.87 (COONa), 180.37 (이소부티릴-CO); LRMS [C22H24N3NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 488.1 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C22H24N3Na2O7 [M+Na]+ 488.1404; 실측치, 488.1400.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-4-(1-
시아노
-
2H
-이소인
돌
-2-일)-3,4,5-트리
데옥시
-5-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE927-93).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.07 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, OAc),2.10 (s, 3H, OAc), 3.86 (s, 3H, COOCH3), 4.22 (dd, J = 12.5, 6.6 Hz, 1H, H-9), 4.54 (q, J = 9.9 Hz, 1H, H-5), 4.68 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.82 (dd, J = 10.6, 1.9 Hz, 1H, H-6), 5.43 (td, J = 6.0, 5.5, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.52 (dd, J = 5.6, 1.8 Hz, 1H, H-7), 5.62 (dd, J = 9.7, 2.4 Hz, 1H, H-4), 6.17 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 7.13 (ddd, J = 7.9, 6.8, 1.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.28 (ddd, J = 8.4, 6.7, 1.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.52 (s, 1H, Ar-H-3'), 7.58-7.69 (m, 2H, Ar-H-4', Ar-H-7'), 7.91 (d, J = 9.6 Hz, 1H, NH); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.50, 20.71, 20.91 (3 OCOCH 3 ), 49.81 (C-5), 52.93 (COOCH 3 ), 57.45 (C-4), 61.93 (C-9), 67.46 (C-7), 70.64 (C-8), 76.40 (C-6), 93.61 (Ar-C-CN), 107.14 (C-3), 113.24-117.05 (CF3), 114.37 (CN), 117.73 (Ar), 117.80 (Ar), 121.08 (Ar), 123.65 (Ar), 124.93 (Ar q 탄소), 126.55 (Ar), 131.85 (Ar q 탄소), 146.73 (C-2), 157.56 (q, J C,F = 38.8 Hz, COCF3), 161.03 (COOCH3), 169.91, 170.38, 170.71 (3 OCOCH3); LRMS [C27H26-F3N3O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 632.1 [M+Na]+.
소듐 2,6-안하이드로-4-(1-
시아노
-
2H
-이소인
돌
-2-일)-3,4,5-트리
데옥시
-5-(2,2,2-
트리플루오로아세트아미도
)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE927-99).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 3.60-3.75 (m, 2H, H-7, H-9), 3.93 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.07 (ddd, J = 9.4, 6.4, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.64-4.74 (m, 2H, H-5, H-6), 5.57 (dd, J = 9.4, 2.3 Hz, 1H, H-4), 6.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3), 7.21 (m, 1H, Ar-H), 7.36 (m, 1H, Ar-H), 7.69 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.77 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.84 (s, 1H, Ar-H-3'); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 50.48 (C-5), 58.73 (C-4), 63.00 (C-9), 68.08 (C-7), 69.66 (C-8), 75.05 (C-6), 91.94 (Ar-C-CN), 103.21 (C-3), 109.60-118.88 (CF3), 115.01 (CN), 117.34 (Ar), 121.36 (Ar), 123.02 (Ar), 124.19 (Ar q 탄소), 126.23 (Ar), 132.12 (Ar q 탄소), 150.62 (C-2), 158.20 (q, J C,F = 38.8 Hz, COCF3), 168.44 (COONa); LRMS [C20H17F3N3NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 514.1 [M+Na]+, 492.2; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C20H17F3N3Na2O7 [M+Na]+ 514.0830; 실측치, 514.0836.
메틸
5-
아세트아미도
-7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-
안하이드로
-3,4,5-
트리데옥시
-4-(
1H
-테트라졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-86).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.95 (s, 3H, NAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 3.84 (s, 3H, COOCH3), 4.02 (m, 1H, H-5), 4.22 (dd, J = 12.6, 6.4 Hz, 1H, H-9), 4.63 (dd, J = 12.5, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.95 (dd, J = 10.5, 1.8 Hz, 1H, H-6), 5.38 (td, J = 6.2, 2.6 Hz, 1H, H-8), 5.49 (dd, J = 5.9, 1.8 Hz, 1H, H-7), 6.05 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-3), 6.11 (dd, J = 9.8, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.67 (d, J = 8.2 Hz, 1H, NH), 8.70 (s, 1H, 테트라졸-CH); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.72, 20.75, 20.91 (3 OCOCH 3 ), 23.13 (NHCOCH 3 ), 49.72 (C-5), 52.87 (COOCH 3 ), 55.92 (C-4), 61.93 (C-9), 67.62 (C-7), 70.50 (C-8), 75.70 (C-6), 105.19 (C-3), 140.84 (테트라졸-C5), 146.64 (C-2), 161.07 (COOCH3), 170.17, 170.27, 170.63, 171.54 (NHCOCH3, 3 OCOCH3); LRMS [C19H25N5O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 506.5 [M+Na]+.
소듐 5-
아세트아미도
-2,6-
안하이드로
-3,4,5-
트리데옥시
-4-(
1H
-
테트라졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE832-98).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 1.94 (s, 3H, NAc), 3.65-3.74 (m, 2H, H-7, H-9), 3.92 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H, H-9'), 4.02 (ddd, J = 9.3, 6.2, 2.7 Hz, 1H, H-8), 4.44 (dd, J = 10.9, 9.7 Hz, 1H, H-5), 4.62 (dd, J = 11.0, 1.4 Hz, 1H, H-6), 5.73 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.88 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ 21.63 (NHCOCH 3 ), 48.44 (C-5), 58.77 (C-4), 63.04 (C-9), 67.99 (C-7), 69.67 (C-8), 75.29 (C-6), 100.61 (C-3), 143.99 (테트라졸-C5), 150.85 (C-2), 168.53 (COOCH3), 173.82 (NHCOCH3); LRMS [C12H16N5NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 388.4 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C12H16N5Na2O7 [M+Na]+ 388.083964; 실측치, 388.084945.
메틸
7,8,9-트리-
O
-아세틸-2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아미도-4-(
1H
-테트라졸-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-36).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 6H, 이소부티르아미도-2CH3), 2.01 (s, 3H, OAc), 2.05 (s, 6H, 2OAc), 2.34 (m, 1H, 이소부티르아미도-CH), 3.81 (s, 3H, COOCH3), 4.01 (m, 1H, H-5), 4.18 (dd, J = 12.5, 6.3 Hz, 1H, H-9), 4.60 (dd, J = 12.6, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 5.03 (dd, J = 10.5, 1.7 Hz, 1H, H-6), 5.32 (td, J = 6.1, 2.5 Hz, 1H, H-8), 5.46 (dd, J = 5.9, 1.8 Hz, 1H, H-7), 6.03 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3), 6.14 (dd, J = 9.8, 2.5 Hz, 1H, H-4), 6.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H, NH), 8.65 (s, 1H, 테트라졸-CH); 13H NMR (75 MHz, CDCl3): δ 18.85, 19.27 (이소부티르아미도-2CH3), 20.66, 20.84 (3 OCOCH 3 ), 35.56 (이소부티르아미도-CH), 49.69 (C-5), 52.79 (COOCH 3 ), 55.77 (C-4), 61.91 (C-9), 67.49 (C-7), 70.51 (C-8), 75.64 (C-6), 105.15 (C-3), 140.81 (테트라졸-C5), 146.70 (C-2), 161.18 (COOCH3), 170.04, 170.15, 170.58 (3 OCOCH3), 178.53 (이소부티르아미도-CO); LRMS [C21H29N5O10] (m/z): (파지티브 이온 모드) 534.3 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C21H29N5NaO10 [M+Na]+ 534.180663; 실측치, 543.1788531.
소듐 2,6-안하이드로-3,4,5-트리
데옥시
-5-이소부티르아
미도
-4-(
1H
-
테트라졸
-1-일)-D-글리세로-D-갈락토-non-2-에노네이트 (IE889-42).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 9-1.04 (m, 6H, 이소부티르아미도-2CH3), 2.46 (m, 1H, 이소부티르아미도-CH), 3.59-3.75 (m, 2H, H-7, H-9), 3.93 (dd, J = 12.0, 2.6 Hz, 1H, H-9'), 4.03 (ddd, J = 9.7, 6.2, 2.6 Hz, 1H, H-8), 4.49 (dd, J = 10.9, 9.7 Hz, 1H, H-5), 4.65 (dd, J = 10.9, 1.2 Hz, 1H, H-6), 5.76 (dd, J = 9.7, 2.3 Hz, 1H, H-4), 5.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-3), 9.38 (s, 1H, 테트라졸-CH); LRMS [C14H20N5NaO7] (m/z): (파지티브 이온 모드) 416.0 [M+Na]+; HRMS (API) (m/z): [M+Na]+ 계산치 C14H20N5Na2O7 [M+Na]+ 416.115264; 실측치, 416.116886.
생물학
세포 및 바이러스:
A549 세포 (선암종 인간 폐포 기저 상피 세포)는 European Collection of Cell Cultures (86012804-1VL, Sigma Aldrich)에서 제공받았다. 세포를 5% 소 태아 혈청과 1% 글루타민 (200 mM)이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM) (Lonza, Basel, Switzerland)에서 증식시켰다. 감염 및 감염 후 공정을 위해, A549 세포를 1% 글루타민만 첨가된 DMEM에서 유지시켰다. 정상 인간 기관지/기관 상피 (NHBE) 세포 (CC-2540, lot 313831, Lonza)는 B-ALI™ 증식 배지 (Lonza)에서 증식시켰으며, 동일 배지를 감염 및 감염 후 실험들에 사용하였다. LLC-MK2 세포 (레수스 원숭이 신장, ATCC CCL-7)는 1% 글루타민 (200 mM)과 2% 열-불활화된 소 태아 혈청이 첨가된 이글스의 최소 필수 배지 (EMEM) (Lonza)에서 배양하였다. hPIV-3 감염 및 감염 후 인큐베이션에서는, LLC-MK2 세포를 1% 글루타민이 첨가된 EMEM에서 유지시켰다. 모든 세포주들은 5% CO2 습윤 대기 하에 37℃에서 인큐베이션하였다.
hPIV-3 (균주 C-243)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)으로부터 입수하였다. 이 바이러스는 글루타민 (EMEMinf) 첨가된 EMEM을 이용해 LLC-MK2 세포에서 5% CO2 습윤 분위기 하에 증식시켰다. 바이러스-함유 배양물 상층액을 감염 후 3 - 4일에 채집하였고, 이때 세포변성 효과를 모니터링하였으며, 원심분리 (3,000 RCF, 15분)를 통해 세포 찌꺼기로부터 청징하였다. 바이러스는 헤마글루틴화 저해 (HI) 분석에 사용하기 위해 30 kDa 아미콘 울트라 필터 유닛 (Millipore, Billerica, MA)을 이용해 10번 이상 농축하였다. 뉴라미니다제 저해 (NI) 분석과 STD-NMR 실험에서는 PEG-석출 후 상기와 같이 정제한 바이러스를 사용하였다.
청징처리된 hPIV-3 상층액을 PEG6000 (8% 최종 농도) 및 NaCl (0.4 M 최종 농도)과 혼합한 다음 밤새 4℃에서 천천히 교반하면서 인큐베이션하였다. PEG6000/hPIV-3 복합체를, 3,000 RCF로 30분간 4℃에서 원심분리함으로써, 펠릿화하였다. 상층액은 버리고, 처음 바이러스 현탁액 부피의 적어도 1:40에 해당되는 부피의 GNTE 완충제 (200 mM 글리신, 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 7.4)를 사용해 펠릿을 밤새 4℃에서 재현탁하였다. 바이러스 현탁물을 상하 파이펫팅하여 균질화한 다음, 다운서 (douncer)와 "타이트" 유봉 (pestle)을 이용해 남아있는 바이러스 응집체를 기계적으로 분쇄하였다. hPIV-3 균질물을 GNTE 완충제 중에 준비된 30% - 60% 비-선형 슈크로스 농도 구배의 상부에 로딩하여, 100,000 RCF로 2시간 30분 동안 4℃에서 감속을 위한 브레이크 사용없이 원심분리하였다. 바이러스를 30% - 60% 슈크로스 인터페이스에서 농축시킨 다음 수집하여 NI 분석용으로는 -80℃에, STD-NMR 실험용으로는 4℃에 보관하였다.
hPIV -3 HN 저해제: 화합물 2, 3, 5-10은 각각 동결건조된 분말로서 제공되며, 이후 이를 멸균수에 용해하여 10 mM 원액으로 만든다. 이 용액을 15분간 초음파처리하여 완전히 용해시키고, 여과-멸균 처리하였다. 이 원액은 유리 바이얼에 넣어 -20℃에서 보관하고, 사용 직전에 적절한 완충액에 희석하였다. STD NMR 실험의 경우, 원액은 D2O에서 100 mM로 준비하였다. 용액들은 전술한 바와 같이 가공 및 보관하였다.
재조합 HN 발현 및 정제: HN 단백질을 Bac-to-Bac? 베쿨로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용해 실질적으로 수정된 문헌의 공정에 따라 발현시켰다. 즉, 꿀벌 멜리틴 신호 펩타이드 (HBM)의 뉴클레오티드 서열은 HN 엑토도메인 코딩 서열 (아미노산 125 - 572)의 하류에 부가하였다. 이 서열 (HBM + HN)은 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 (Sf9)에서의 발현을 위해 코돈을 최적화하였고, DNA2.0 유전자 합성 서비스 (DNA2.0, Menlo Park, CA)를 통해 HBM-HNhPIV-3opt라는 유전자 이름으로 직접 주문하였다. HBM-HNhPIV-3opt를 PCR로 증폭시키고, 정제 및 검출 목적으로 부가적인 C-말단 6-히스티딘 테그 (His-Tag)를 제공하는 pFastBac/CT-TOPO? 벡터에 연결하였다.
HBM-HNhPIV-3opt를 함유한 재조합 베큘로바이러스의 제작 및 증식은 제조사의 지침에 따라 수행하였다. Insect-XPRESS 단백질 무함유성 곤충 세포 배지 (Lonza)에서 배양한 Sf9 세포 (Invitrogen)에, HBM-HNhPIV-3opt 베큘로바이러스를 높은 MOI로 감염시켰다. 감염 후 4일째에, 재조합 HN이 함유된 상층액을 수집하여 최고 단백질 발현을 수확하였다. 상층액은, 원심분리 (3,000 RCF, 15분)하여 세포 찌꺼기를 제거하여 청징 처리한 다음 HisTrap excel 5 mL 컬럼 (GE Healthcare life sciences, Buckinghamshire, Enland)에서 제조사의 프로토콜에 따라 정제하였다. 재조합 HN을 500 mM 이미다졸 용액으로 희석하고, 수집된 분획들을 뉴라미니다제 활성 (NA) 분석 (하기 참조)으로 평가하였다. 가장 활성이 높은 분획들을 모아, 10 kDa 아미콘 울트라 필터 유닛 (Millipore)을 사용해 최종 부피 800 ㎕로 농축하였다. 4℃에서 수퍼덱스 75 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 신속 단백질 액체 크로마토그래피 (Amersham Biosciences)를 수행하는 추가적인 정제 공정을 수행하였으며, Frac-920이 함유된 분획을 1 mL씩 수집하였다. 280 nm에서 분획 수집을 모티너링함으로써 확인된 단백질-함유 분획들을 대상으로 NA 분석을 수행하고, SDS-PAGE를 수행하였다. 정제 및 농축된 재조합 HN 단백질은 4℃에 보관하였다.
헤마글루티닌화 저해 분석: HN 저해제들은 2세트로 하여 U자형 바닥의 96웰 플레이트 분석으로 분석하였다. 화합물을 PBS에 각 테스트 농도에 대한 4X 용액으로 희석하였다 (25 ㎕/웰, 최종 1X). 각 희석물을 hPIV-3 (25 ㎕/웰, 1 HAU 최종) 4 HAU (haemagglutination unit)과 혼합하여 실온에서 20분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 얼음 위로 옮기고, 동일 부피 (50 ㎕)의 빙랭한 0.75% 기니아피그 적혈구 (Gp-RBC) 또는 1% 인간 적혈구 (h-RBC)를 각 웰에 첨가하였다. 그런 후, 플레이트를 1시간 30분 동안 4℃에 인큐베이션한 다음 헤마글루틴화 수준을 판독하였다. HI IC50은 무-처리 바이러스 현탁물과 비교하여, 헤마글루티닌 활성을 50%까지 떨어뜨리는 저해제의 농도로서 간주하였다.
뉴라미니다제 저해 분석
정제된 hPIV-3, 저해제 및 MUN을 준비하여, NA 반응 완충제 (NaOAc 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 4.6)로 희석하였다. 여러가지 hPIV-3 희석을 사용하는 NA를 먼저 측정하여, 분석에 사용할 최저 바이러스 농도를 결정하였다. NA 분석은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되기 위해 실험 백그라운드 대하여 적어도 5배 높은 최고 형광 신호를 달성할 만큼 충분한 정제된 바이러스를 사용하여 수행하였다. 뉴라미니다제 저해 (NI) 분석은 3세트로 수행하였다. 각 테스트 농도에서, 정제된 hPIV-3 2 ㎕ 및 2.5X 저해제 용액 (최종 1X) 4 ㎕를 각 웰에 넣었다. 플레이트를 20분간 실온에 둔 후, 5 mM 2'-(4-메틸움벨리페릴)-D-N-아세틸뉴라미니드 (MUN) (최종 2 mM) 4 ㎕를 각 웰에 첨가하여 플레이트를 교반 (1000 rpm)하면서 30분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 글리신 완충제 (글리신 0.25 M, pH 10.4) 190 ㎕를 각 웰에 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 바이러스에 MUN을 첨가하여 음성 대조군을 포함시켰으며, 효소 반응은 t = 0에서 정지시켰다. 상대적인 형광도 (RF)를 Victor 3 멀티라벨 리더 (PerkinElmer, Waltham, MA)를 이용해 측정하였다. 데이타는 백그라운드 (음성 대조군 RF)를 제하여 가공한 다음 GraphPadPrism 4 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)로 분석하여 IC50 값 (비선형 회귀 (curve fit), 용량-반응-저해, 3 파라미터 로지스틱)을 계산하였다. 뉴라미니다제 활성 (상대적인 형광도)을 무-처리 바이러스 현탁액과 비교해 50%까지 낮추는 저해제의 농도를 NI IC50 값으로 간주하였다. 저해제 6와 10의 K i 값은, 효소 카이네틱 실험을 기존에 공개된 공정에 따라 whole hPIV-3를 이용해 수행함으로써, 측정하였다. 즉, 뉴라미니다제 활성은 기질 농도 5가지 [S], 즉 2, 4, 8, 10 및 16 mM, 저해제 농도 4가지 [I]: 10의 경우 0, 0.5, 2.5 및 5 μM, 6의 경우 0, 10, 20 및 60 μM에서 20분 동안 5분 간격으로 측정하였다. 전체 분석은 3세트로 수행하였으며, 최종 데이타는 GraphPadPrism 4 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)를 사용해 경쟁적인 저해에 대한 미하엘리스-멘텐 등식에 적용하여, [I] = 0 및 가변성 [S] 실험들의 데이타와 K i 값을 이용해, 미하엘리스-멘텐 상수 (K m)를 구하였다.
바이러스 증식 저해 분석: 세포 기반의 분석에서 최상의 저해제를 평가하기 전에, MTT 분석을 수행하여 화합물의 세포독성을 평가하였다. LLC-MK2 세포를 테스트한 최고 농도인 303 μM의 6, 8 및 10과 함께 48시간 인큐베이션한 후, 세포독성 효과는 관찰되지 않았다. 바이러스 증식 저해는, 48웰 플레이트 포멧으로 저 MOI로 감염된 컨플루언트 LLC-MK2 단일층에서 EMEMinf 중의 6, 8 및 10 2 μM 존재 하에 후대를 타이트레이션함으로써, 포커스-형성 분석을 이용해 평가하였다. 바이러스 접종물 (100 FFU/웰)은 6, 8 및 10과 20분간 예비-인큐베이션하였다. 감염은 2세트로 진행하였으며, 15분 마다 가볍게 교반하면서 1시간 동안 37℃에서 계속 수행하였다. 접종물을 제거하고, 각각의 상응하는 2 μM 화합물 희석물 (EMEMinf 중의) 500 ㎕/웰로 교체하였다.
감염의 양성 대조군은 화합물은 제외한 동일한 조건을 이용하여 포함시켰다. 감염된 세포 단일층에서의 바이러스 증식은 48시간 동안 37℃에서 5% CO2 조건 하에 유지시켰다. 두플리케이트 (duplicate)로부터 배양 상층액을 수집하여 모은 다음 15,000 RCF에서 10분간 원심분리하여 청징한 후 -80℃에 보관하였다. 상층액을 EMEMinf에서 10-3, 10-4 및 10-5로 희석하여, 이후의 바이러스 타이트레이션에서 잔류 화합물의 어떠한 영향도 배제시켰다. 바이러스 타이트레이션은 바이러스 감염에서 언급된 상기 조건을 이용해 2세트로 수행하였다. 1시간 후, EMEMinf 중의 Avicel (FMC BioPolymer, Philadelphia, PA)을 직접 접종물 (최종 농도 1%)에 첨가하여, 바이러스 증식을 제한 및 국지화하였다. 이 플레이트를 37℃, 5% CO2 조건 하에 36 - 40시간 인큐베이션하여 포커스를 형성시켰다. Avicel을 조심스럽게 제거하고, 3.7% 파라포름알데하이드/PBS로 교체한 다음 플레이트를 바이러스 불활화 및 세포 고정을 위해 실온에서 15분간 두었다. 세포 단일층을 각 5분씩 PBS로 3번 헹군 다음 0.3% H2O2/PBS로 내인성 퍼옥시다제를 30분간 37℃에서 불활성화하였다. 다시 플레이트를 PBS로 3번 각 5분씩 헹군 다음 마우스 단일클론 IgG 항-hPIV-3 HN (Fitzgerald, clone# M02122321, 2.0 mg/mL)을 5% 밀크/PBS 중의 1 ㎍/mL로 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 단일층을 0.02% Tween20/PBS로 5분간 3번 헹구었다. 각 웰에, 5% 밀크/PBS로 1:1000으로 희석한 염소 항-마우스-IgG(H+L)-HRP 접합체 (BioRad, ref# 170-6516)를 첨가하여, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 단일층을 0.02% Tween20/PBS로 상기와 같이 헹군 다음 다시 PBS로 2번 헹구었다. 트루블루 용액 (HRP 기질)을 각 웰에 첨가하여 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써, 포커스를 노출시켰다. 트루블루 용액을 버리고, 플레이트를 물로 2번 헹군 다음 건조시켜 스캐닝 (도 2)한 다음 포커스를 카운팅하였다. IC50 값은 무-처리 감염된 LLC-MK2 단일층과 비교해 후대 바이러스 타이터를 50% 감소시키는 저해제의 농도로 간주하였다.
인 시추 ELISA: 인 시추 ELISA는 바이러스 증식 저해를 평가하기 위한 유용한 기법이다. 이는 한 단계로, 감염된 세포 단일층의 세포 표면에서 hPIV-3 HN의 발현 수준을 측정한다. 발현 수준은 비-고정된 바이러스가 타겟 세포를 감염 및 재-감염시키는 능력과 직접적으로 상호 연관되어 있다. 감염은 96웰 플레이트에 접종된 컨플루언트 세포 단일층 상에서 수행하였다. 바이러스 (40 FFU/웰)를, 화합물 6 및 10과 10배 연속 희석으로 1000 μM - 0.001 μM로 사용하여 함께 20분간 예비-인큐베이션하였다. 감염은 3세트로 수행하였으며, 15분 마다 가볍게 교반하면서 1시간 동안 37℃에서 계속 진행하였다. 접종물을 제거하고, 각 해당 화합물 희석물 200 ㎕/웰로 교체하였다. 감염에 대한 양성 대조군으로서 저해제만 뺀 동일한 실험 조건을 적용하여 포함시켰다. 감염된 세포 단일층을 36 - 40시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 바이러스 증폭을 위해 유지시켰다. 여기에 11.1% 파라포름알데하이드/PBS 100 ㎕를 직접 첨가하여, 바이러스를 불활화하고, 세포를 고정하였다. 플레이트를 실온에서 15분간 유지시킨 다음 PBS로 5분간 3번 헹구고, 30분간 37℃에서 0.3% H2O2/PBS를 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 불활성화하였다. 세포 단일층을 헹구고, 마우스 단일클론 IgG anti-hPIV-3HN (Fitzgerald, clone# M02122321, 2.0 mg/mL)를 5% 밀크/PBS 중의 1 ㎍/mL로 사용하여 1시간 동안 37℃에서 함께 인큐베이션하였다. 웰을 0.02% Tween20/PBS로 5분간 3번 헹구었다. 각각의 웰에, 5% 밀크/PBS에서 1:2000으로 희석한 염소 항-마우스-IgG(H+L)-HRP 접합체 (BioRad, ref# 170-6516)를 첨가하여, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 단일층을 0.02% Tween20/PBS로 헹군 다음 PBS로 2번 헹구었다. BD OptEIATMB 기질 (BD Biosciences, San Jose, CA, 100 ㎕)을 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하였다. 3 - 5분 후, 웰 당 0.6 M H2SO4 50 ㎕를 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 각 웰의 흡광도 (OD)를 0.1초간 450 nm에서 Victor 3 멀티라벨 리더 (PerkinElmer, Waltham, MA)로 판독하여 원 데이타를 입수하였다. 처음 OD 판독값에서 음성 대조군 (비-감염 세포)의 OD를 제하여 최종 OD를 구하였으며, 데이타를 GraphPadPrism4 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)로 분석하여 IC50 값을 계산하였다 (비-선형 회귀 (curve fit), 용량-반응-저해, 4 파라미터 로지스틱). IC50 값은 비-처리된 감염 세포 단일층과 비교해 450 nm에서의 흡광도를 50%까지 낮추는 저해제의 농도로 간주하였다.
본 발명의 화합물들은 공개된 모델을 이용하여 잘-분화된 인간 기도 상피 (HAE) 세포에서 hPIV-3 저해 분석으로 테스트할 수 있다. 간략하게 설명하면, 테스트 과정은 다음과 같다: 인간 기도 상피 (HAE) 세포를 기존 (Muller et al., 2013)에 기술된 바와 같이 분리, 배양 및 분화시킨다. 간략하게는, 인간 코 기도 상피 세포를 분리, 증식시키고, 콜라겐-코팅된 투과성 막 지지체 상에 접종한다. 세포가 컨플루언트에 도달하면, 제일 윗쪽 배지를 제거하고, 세포를 공기-액체 계면에서 약 4-6주간 유지시켜 상피 분화를 유도한다. 섬모 세포 (ciliated cell)를 함유한 배양물을 내강 표면 (luminal surface)을 통해 웰 당 hPIV-3 5000 포커스 형성 단위로 1시간 동안 접종한다. 세포가 바이러스 감염된 직후 기저외측 (basolateral) 배지에 식 (I), (II), (III) 및 (IIIa)의 시험 화합물들을 다양한 농도로 첨가한다. 감염 후 1, 3 및 6일째에, 기존에 공개된 바와 같이 (Guillon et al., 2014), A549 또는 LLC-MK2 세포에서의 포커스 형성 분석 또는 인 시추 ELISA를 이용한 바이러스 타이트레이션을 통해, 바이러스 로드 감소를 분석한다. 그 결과는 종래 기술에 따른 기준 화합물, 예를 들어 BCX-2855 등의 BCX 화합물과 비교하여, 상대적인 효능의 지표로 제시할 수 있다 (Guillon, P., Dirr, L., El-Deeb, I.M., Winger, M., Bailly, B., Haselhorst, T., Dyason, J.C., and von Itzstein, M. (2014). Structure-guided discovery of potent and dual-acting human parainfluenza virus haemagglutinin-neuraminidase inhibitors. Nat. Commun. 5.; 및 Muller, L., Brighton, L.E., Carson, J.L., Fischer, W.A., and Jaspers, I. (2013). Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at Air Liquid Interface. J. Vis. Exp.).
결과
C4 변형된 Neu5Ac2en 합성 유도체의 hPIV-3 HN에 대한 효능 비교를 수행하였으며, 편의상, IC50 값을 C5 위치에 존재하는 아실아미노 기를 기준으로 2개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1 저해제는 C5 아세트아미도 관능기를 가지며, 그룹 2 저해제는 C5 이소부티르아미도 관능기를 가진다 (도 3 및 도 4A-C). 기준 (benchmark)이 되며 널리-특정화된 광범위한 스펙트럼을 가진 스펙트럼 뉴라미니다제 저해제 Neu5Ac2en (2)는 가장 약한 저해를 나타내었는데, hPIV-3 HN NI 및 HI에 대한 IC50 값이 각각 1565 μM 및 1438 μM이었다. 3, 즉, BCX 2798 (6)의 C5 아세트아미도 유사체에서 관찰된 저해는, hPIV-3 HN NI 및 HI에 대한 IC50 값이 각각 138 μM과 210 μM로 비록 여전히 높은 마이크로몰 범위임에도 불구하고, 2에 비해서는 개선되었다. 이들 IC50 값은 C4 메톡시메틸 관능화된 트리아졸 Neu5Ac2en 유도체인 본 발명의 새로운 저해제 7에서 관찰되는 결과와 유사하였는데, hPIV-3 HN NI 및 HI에 대한 IC50 값은 각각 154 μM 및 313 μM로 실험적으로 확인되었다. 효능의 유의한 개선은, C4 트리아졸의 메톡시메틸 모이어티 (7)를 보다 벌키한 페닐 기 (8)로 치환한 경우에 관찰되었다. hPIV-3 HN NI 및 HI에 대한 8의 IC50 값은 각각 6.5 μM 및 4.6 μM인 것으로 측정되었다. 이들 값은 표 2에 요약 개시한다.
C5 이소부티르아미도 관능기를 가진 저해제 2번째 그룹의 경우, 각 저해제의 친화성이 C5 아세트아미도 유사체 보다 확실히 개선되었다. 효능의 순서는, 예상했던 대로, 동일 그룹에서는 동일하였다. 즉, 최저 저해는 Neu5Ac2en의 C5 이소부티르아미도 유사체인 5에서 확인되었으며, 이의 NI 및 HI 각각에 대한 IC50 값은 각각 188 μM과 358 μM이었으며, 기준물질인 hPIV 저해제 BCX 2798 (6)의 경우에는 NI 및 HI 각각에 대한 IC50 값은 21.5 μM 및 16.1 μM인 것으로 측정되었다. 트리아졸 고리에 비해 소형인 메톡시메틸 치환기를 가진 저해제 9의 경우, 이의 IC50 값은 C4 아지도 유사체 6 (NI 및 HI에 대한 IC50 = 각각 14.2 μM 및 13.8 μM)과 비슷하였다. 마찬가지로, C5 아세트아미도-함유 그룹 1 저해제에서 관찰되는 바와 같이, 저해제 9의 메톡시메틸 기가 저해제 10의 보다 벌키한 페닐 모이어티로 치환기 크기가 커질수록, 효능이 현저하게 개선되어, NI 및 HI에 대한 IC50 값은 각각 2.7 μM 및 1.5 μM이었다. 흥미롭게도, 인간 적혈구를 기니아 피그 적혈구 대신 사용하였을 때 HI IC50 값의 개선이 관찰되었다 (도 2). 이러한 개선은, 인간과 기니아 피그 적혈구 간의 시알산 유형 및/또는 연결 제시의 차이가 반영된 결과일 가능성이 매우 높다. 예를 들어, 적혈구를 비롯해 인간 조직 및 세포는 N-아세틸뉴라민산-함유 글리코컨주게이트 수용체만 발현하는데 반해, 다른 동물들은 N-글리콜릴뉴라민산-기반의 수용체도 발현한다는 것은 잘 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 특정한 적혈구 사용과 무관하게, 본 발명의 디자이너 저해제 10은, 기준 화합물 6과 비교해 현저하게 높은 효능을 가진다. MUN의 K m 값은 5.1 mM이고, 저해제 10 및 6 각각의 K i 값은 각각 1.3 μM 및 16 μM이다.
표 2: NI 및 HI IC50 값. 시험 화합물 각각의 평균 IC50 과 계산된 표준 편차 및 표준 오차.
세포를 이용한 분석
초기 효소 스크리닝을 수행한 후, 가장 강력한 저해제 10과 기준물질인 hPIV 저해제 (BCX 2798, 6)를 증식 저해 분석으로 평가하여, LLC-MK2 세포에서 hPIV-3 바이러스 감염과 증식을 저해하는 능력을 비교하였다 (도 5A 및 B). 화합물 6는, 현재까지 가장 잘 검증된 hPIV-3 Neu5Ac2en-기반의 저해제이고 적절한 시험관내 hPIV-3 항바이러스 효능을 가지고 있기 때문에, 기준 저해제로서 선택하였다. 일차 분석에서, 저해제 농도 2 μM에서, 바이러스를 6 또는 10의 존재 하에 48시간 증식시키고, 바이러스 타이터를 측정하였다. 상기한 저해제 농도에서의 바이러스 타이트 감소는 6 및 10에서 각각 14% 및 94%인 것으로 계산되었다 (도 5B). 이후, 2종의 저해제를 대상으로, 3종의 세포주를 이용한 잘-확립된 인 시추 ELISA 기법으로 바이러스 증식 저해 IC50 값을 측정하였다. LLC-MK2 (원숭이 신장 상피 세포) 세포주는, hPIV-3 세포를 이용한 감염 실험들에서 널리 사용되므로, 선택하였으며, hPIV-3 감수성 인간 호흡기 세포주 A549 (폐 선암종 상피 세포)와 정상 인간 기관지 상피 (NHBE) 일차 세포 (primary cell)는 천연 조직-관련 세포에서 바이러스 증식 저해를 조사하기 위해 선택하였다. 본 방법은, 비-고정된 바이러스 증식을 낮은 MOI (low multiplicity of infection)로 감염시킨 세포 단일층의 HN 발현 수준과 상호 연관시키는 보다 신속하며, 한-단계로 진행되는 비-주관적인 기법이므로, 그 자체적으로도 바이러스 타이트레이션 방법 보다 유익한 이점을 가지고 있다. 흥미롭게도, 실험실에서 확립된 세포주 LLC-MK2를 이용한 경우 인간 세포주와 비교해 10 및 6에서 약간 낮은 바이러스 증식 저해, 즉, 약간 낮은 IC50 값이 측정되었다. 요컨대, 3종의 세포주 모두에서, 저해제 10의 항바이러스 효과 (IC50 = 2.1-13.9 μM)가 저해제 6 (IC50 = 54.6-130.6 μM)에 비해 현저하게 강한, 동일한 추세가 관찰된다 (도 6).
구조 생물학
샘플 준비 및 1 H NMR 실험: 모든 NMR 실험들은 5-mm TXI 프로브가 장착된 600 MHz NMR 스펙트로미터 (Bruker)에서 3축 구배 (axis gradient)로 수행하였다. 무손상 바이러스 현탁물 또는 재조합 hPIV-3 HN을, 아미콘 필터 유닛 (Millipore)을 컷오프 30 kDa 또는 10 kDa으로 사용해 한외여과함으로써, pD 4.6의 D2O 중의 50 mM 중수소화 소듐 아세테이트, 5 mM CaCl2에 대해 완충제를 교체하였다. 각 실험에서, 최종 부피 200 ㎕ 중에, hPIV-3 HN 단백질의 농도는 20 μM이고, 단백질 : 리간드의 몰 비는 1:100으로 사용하였다.
1H NMR 스펙트럼은, 스펙트럼 폭 6000 Hz에서 2 s 완화 지연 (relaxation delay)으로 283 K에서 32회 스캔하여 획득하였다. 단백질이 바이러스에 비해 안전하고 취급이 용이할 뿐만 아니라 각각의 실험에서 단백질을 동일한 농도로 정확하게 제공하기 때문에, 일차 STD NMR 실험은 무손상 hPIV-3 바이러스와 복합체 상태의 화합물 10을 대상으로 수행하였으며, 이후의 실험들은 모두 재조합 HN 단백질을 이용해 수행하였다.
포화 이동차 (STD, Saturation Transfer Difference) NMR 실험: 단백질을, 50 ms 동안 선택적인 가우시안 형의 펄스 60회로 구성된 케스케이드를 적용해, -1.0 ppm에서 공진 상태 (on-resonance)로, 300 ppm에서 비-공진 상태 (off-resonance)로 포화시켜, 총 포화 시간 3 s를 만들고, 완화 지연을 4 s로 설정하였다. 각 STD NMR 실험으로, 총 1056회 스캔 (재조합 hPIV-3 HN) 또는 1512회 스캔 (무손상 바이러스)을 획득하였으며, WATERGATE 시퀀스를 사용해 남아있는 HDO 신호를 억제하였다. 스핀-락 필터 (Spin-lock filter)를 5 kHz 강도와 10 ms 동안 사용해, 단배질 백그라운드를 억제하였다. 대조군 STD NMR 실험은 동일한 실험 조건과 동일한 리간드 농도로 수행하였지만, 단백질은 생략하였다. 공진 및 비-공진 스펙트럼을 각각 저장 및 처리하였으며, 비-공진 스펙트럼에서 공진 스펙트럼을 제하여 최종 STD NMR 스펙트럼을 수득하였다. 모든 STD 실험들은 등식 A STD = (I 0 -I sat ) / I 0 = I STD / I 0 을 이용해 정량하였다. 따라서, STD NMR 스펙트럼의 신호 강도 (I STD )를 기준 물질의 스펙트럼의 대응되는 신호 강도 (I 0 )와 비교하였다. 스펙트럼에서 가장 강한 STD 신호를 100%로 지정하고, 기준으로 사용하여 상대적인 STD 결과들을 그에 따라 계산하였다.
특이적인 결합 및 저해를 입증한 컴퓨터 및 생물학적 연구 결과를 추가로 뒷받침하기 위해, 재조합-발현된 hPIV-3 HN과의 복합체 형태의 8 (도 7)과, 재조합-발현된 hPIV-3 HN (도 8) 또는 무손상 hPIV-3 바이러스와의 복합체 형태 (도 9)의 가장 강력한 저해제 10에 대해, 포화 이동차 (STD) NMR 실험들을 수행하였다.
저해제가 무손상 바이러스 또는 재조합 hPIV-3 HN과 복합체를 형성한 상태인 경우에, 8 또는 10과 관련된 양성자들 모두에 대해 STD NMR 신호 강도가 다양한 수준으로 명확하게 관찰되었으며, 이는 리간드가 양쪽 경우에 모두 결합한다는 것을 명확하게 입증해주었다. 무손상 바이러스 입자 존재 하에 입수된 10의 1H NMR 스펙트럼에서 3.25, 3.5 및 4.0 ppm에서 나타난 마이너 신호들은 바이러스 정제 과정에서 기인한 불순물들의 것이며, 바이러스 입자 또는 10과 관련있는 것은 아니다. 예상된 바와 같이, STD NMR 스펙트럼에서는 이들 신호들 모두 관찰되지 않았는 바, 불순물은 바이러스에 결합하지 않는다는 것이 명확하게 확인되었다 (도 9). 이들 실험은, 10이 무손상 hPIV-3 바이러스 및 hPIV-3 HN 둘다에 특이적으로 결합함을 명확하게 입증해주며, 저해제의 생물학적 유의성과 잠재성을 추가로 입증해준다.
중요하게도, 무손상 바이러스와 재조합 HN 단백질 둘다에서, STD NMR 스펙트럼의 7.1-7.6 ppm에서 관찰되는 방향족 페닐 양성자 신호 겹침 역시, 무손상 hPIV-3 바이러스 또는 재조합 hPIV-3 HN 단백질 중 어느 것에 결합되었을 때, 저해제 10의 결합 에피토프가 동일하진 않더라도 비슷하다는 것을 보여준다 (도 10).
저해제 10의 에피토프 맵핑
완전한 리간드 결합성 에피토프를 10과 복합체를 이룬 hPIV-3 HN 단백질에 대한 STD NMR 스펙트럼 (도 8) 분석을 통해 확인하였다. 10의 STD NMR 신호들은 모두 관찰된 가장 강력한 STD NMR 신호, 즉 7.18 ppm에서의 저해제의 H4 양성자 신호에 대해 정규화하였다. 저해제의 전체 양성자에 대한 상대적인 STD NMR 결과들을 계산하였다 (표 2). STD NMR 신호 강도 수준은 단백질 표면에 대한 양성자의 근접성에 크게 좌우되며, 고안된 저해제 10이 HN 단백질의 결합부에 결합하는 방식을 보여준다.
|
저해제 8
(%) |
저해제 10
(%) |
|
| 트리아졸 CH | 63 | 75 |
| ArH2' ArH6' | 92 | 95 |
| ArH3' ArH5' | 100 | 100 |
| ArH4' | 100 | 100 |
| H3 | 85 | 80 |
| H4 | 59 | 59 |
| H5 | 50 | 49 |
| H6 | 49 | 47 |
| H7 | 30 | 36 |
| H8 | 30 | 35 |
| H9 | 12 | 24 |
| H9' | 18 | 21 |
| 이소프로프-CH | - | 54 |
| 이소프로프-2CH3 | - | 42 |
| NHAc | 41 | - |
표 3: hPIV-3 HN과 복합체를 이룬 8과 10의 상대적인 STD NMR 결과a. aSTD 결과는 식 A STD = (I 0 - I sat ) / I 0 - I STD / I 0 에 따라 계산된다. STD NMR 결과들 모두 C4 트리아졸 ArH4'의 가장 강력한 STD NMR 신호를 기준으로 제시된다.
특히, 매우 강력한 관련 STD NMR 결과들이 페닐 기 양성자 H2', H3', H4', H5' 및 H6'에서 7.1 ppm 내지 7.6 ppm에서 관찰되었는데, 이는 분자의 이 영역이 단백질 표면에 밀접하게 접촉됨을 나타낸다. 또한, 유의미한 STD NMR 결과는 트리아졸 모이어티의 CH에 대해서도 마찬가지로 검출되었다. 반면, 저해제의 C5 이소부티르아미도 모이어티의 양성자는 신호가 약하였다 (상대적인 STD NMR 신호 강도 범위 42-54%).
10의 Neu5Ac2en 코어 구조와 관련된 양성자들은 다양한 상대적인 STD NMR 강도들을 나타내었다. H3의 현저한 STD NMR 상대적인 신호 강도 (80%)는 분자의 이 부분과 hPIV-3 HN이 강하게 상호작용함을 시사해준다. 또한, H4, H5 및 H6의 상대적인 STD NMR 신호 강도는 각각 59%, 50% 및 49%로, 이는 Neu5Ac2en 코어 구조의 고리 양성자 역시 저해제가 단백질에 결합하는데 참여한다는 것을 나타낸다.
마지막으로, 36%, 35%, 24% 및 21%로 약한 상대적인 STD NMR 결과는 글리세롤의 측쇄 양성자 H7, H8, H9 및 H9'에서 각각 관찰되었는데, 이는 글리세롤 측쇄가 C4 트리아졸로 관능기 및 저해제의 코어 고리 구조와 비교해 저해제 결합 현상에 거의 기여하지 않는다는 것을 의미한다 (도 8). C4 트리아졸로 모이어티가 명백히 단백질 표면에 밀접하게 접촉된다는 점에서, 저해제 8 에피토프 맵 (도 7)은 저해제 10의 맵과 사실상 모든 점에서 동일하였다.
다이플루오로
유사체
본 발명의 화합물은 다이플루오로 화합물 (diflouronated compound)을 포함할 수 있으며, 테스트는 이 유형에 속하는 선택 화합물 (후술된 I-170, I-179 및 I-104)을 대상으로 수행되었다. 이러한 화합물의 타겟은 hPIV-3 및 hPIV-1의 헤마글루티닌-뉴라미니다제이다. I-I70과의 복합체에서 hPIV-3 HN의 공동-결정 구조 (co-crystal structure)를 수득하였다. 하기 화합물들 모두 (i) hPIV-3에 대한 NI 효소적 분석 (I70은 hPIV-1에 대한 효소적 분석); (ii) hPIV-3를 이용한 인간 세포주 A549 세포 (선암성 인간 폐포 기저 상피 세포)에서의 세포 분석; (iii) A549 세포에 대한 화합물으 세포독성 검사; 및 (iv) 인간 뉴라미니다제 2에 대한 NI 효소적 분석 (활성이 없었음)으로 테스트하였다. 도 11에 도시한 바와 같이, 전체 화합물들에서 A549 세포를 대상으로 150 μM에서 세포독성은 관찰되지 않았다. 인간 Neu2에 대한 활성 역시 도 12에 나타낸 바와 같이 관찰되지 않았다.
| μM | 6 | I-70 | I-57 | I-79 | I-40 | I-104 |
| NI hPIV -3 IC 50 | 18 | 6 | 2.5 | 63 | 12 | 4 |
| 세포-기반의 ELISA IC 50 | 130 | 14 | 10 | 45 | 80 | 25 |
표 4: 비교를 위한 대응되는 비-불화된 'en' 화합물로서 I-57 및 I-40과 함께, 선택된 다이플루오로 화합물에 대한 효소적 분석 및 세포성 분석.
인플루엔자 바이러스 시알리다제 활성 분석
표준적인 96웰 플레이트 포멧에서, Potier 등 (Anal. Biochem. 1979, 94, 287 - 296)의 형광측정 방법을 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 N-아세틸-α-D-뉴라미니드 (MUN)를 이용해 변형시켜 (Biochim. Biophys. Acta 1991, 10, 65 - 71), A형 및 B형 인플루엔자의 시알리다제를 사용하여 합성 화합물의 인플루엔자 바이러스 시알리다제 저해력을 분석할 수 있다. 모든 저해 분석은 6가지의 저해제 농도에서, 0.1 mM MUN을 사용해 3세트로 수행될 수 있다. 구체적으로, 50 mM 소듐 아세테이트-6 mM CaCl2 완충제 (pH 5.5) 7 ㎕를 얼음 위에 둔 96웰 솔리드 블랙 플레이트의 각 웰에 넣은 다음, 저해제 1 ㎕, 시알리다제 1 ㎕ 및 마지막으로 기질 MUN 1 ㎕를 첨가한다. 그런 후, 플레이트를 최대 1000 rpm에서 약 10 s간 간단히 원심분리하여, 모든 구성 성분을 혼합하고, 이 혼합물을 20분간 900 rpm으로 교반하면서 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 반응을 중단시키기 위해, 0.25 M 글리신, pH 10 250 ㎕를 각각의 웰에 첨가할 수 있으며, Victor 3 멀티라벨 리더 (PerkinElmer, Waltham, MA)에서 여기 355 nm 및 방출 460 nm 하에 형광을 판독할 수 있다 (웰 당 1 s). 데이타는 백그라운드 (음성 대조군 RF)를 제하여 가공할 수 있으며, 그런 후 GraphPadPrism 4 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)로 분석하여 IC50 값을 측정할 수 있다 (비-선형 회귀 (curve fit), 용량-반응-저해, 3 파라미터 로지스틱).
A 및 B형 인플루엔자에 대한
인 시추 세포
ELISA
합성 화합물을 대상으로 A형 인플루엔자 바이러스와 B형 인플루엔자 바이러스의 증식 저해를 평가하기 위해, Berkowitz 및 Levin, 1985 (Antimicrob . Agents Chemother, 28, 207-210)에 의해 개시되고 Myc et al, 1999 (J. Virol . Methods 77, 165-177 (1999))에 의해 IAV에 맞게 변형된 원칙에 기반한 인 시추 세포 ELISA에 따라, MDCK 세포를 A형 인플루엔자 바이러스 또는 B형 인플루엔자 바이러스로 감염시킨다. MDCK 세포를 2mM 글루타민과 10% FBS가 첨가된 이글스 최소 필수 배지 (EMEM) 100 ㎕에 바닥이 평평한 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 접종하여, 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 배양 배지는 제거하고, 세포를 배지로 헹군다. 웰에 바이러스 접종물 (40 FFU/웰) 총 50 ㎕를 넣고, 1시간 동안 15분마다 가볍게 교반하면서 37℃, 5% CO2 조건 하에 인큐베이션한다. 바이러스 접종물을 제거하고, 감염 배지 (2 mM 글루타민과 3.0 ㎍/ml의 TPCK 처리된 트립신이 첨가된 EMEM) 100 ㎕로 교체한다. 감염된 MDCK 세포를 필요에 따라 12 - 20시간 추가로 인큐베이션하고, 배지는 흡입 제거한다. 세포를 PBS 중의 3.7% 파라포름알데하이드로 고정시킬 수 있다. 분석 당일, 고정된 세포를 헹구고, 0.35% H2O2/PBS를 30분간 37℃에서 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 불활성화한다. 웰을 다시 헹구고, 1.5 mg/ml의 마우스 단일클론 항-인플루엔자 A 또는 항-인플루엔자 B 헤마글루티닌 50 ㎕를 첨가하여 45분간 37℃에서 인큐베이션한다. 세포를 세척 완충제 (PBS + 0.02% Tween-20)로 4번 헹구고, 1:2000 희석의 염소 항-마우스 IgG (H+L) HRP 접합체 (BioRad, ref. 170-6516) 50 ㎕를 첨가하여 45분간 37℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 상기와 같이 세척 완충제로 헹구고, BD OptEIATMB 기질 (BD Biosciences, San Jose, CA) 100 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 플레이트를 37℃에서 인큐베이션할 수 있다.
효소 반응은, 웰에 1 M H2SO4 50 ㎕를 첨가하여 3-5분 후 정지시킬 수 있다. 원 데이타는 각 웰의 흡광도 (OD)를 0.1초간 450 nm에서 Victor 3 멀티라벨 리더 (PerkinElmer, Waltham, MA)로 판독하여 입수한다. 처음 OD 판독값에서 음성 대조군 (비-감염 세포)의 OD를 제하여 최종 OD를 구하고, 데이타를 GraphPadPrism4 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)로 분석하여 IC50 값을 계산한다 (비-선형 회귀 (curve fit), 용량-반응-저해, 4 파라미터 로지스틱). IC50 값은 비-처리된 감염 세포 단일층과 비교해 450 nm에서의 흡광도를 50%까지 낮추는 저해제의 농도로 간주된다.
인 시추 세포 기반의 ELISA는 다음과 같이 hPIV-1 및 3 간의 차이를 비롯해 약간 변형시켜 hPIV-3에서와 같이 수행할 수 있다:
일차 항체: 마우스 단일클론 항-hPIV-3 HN (Fitzgerald, clone M02122321); 마우스 단일클론 항-hPIV-1 HN (LSbio, ref LS-C74109); hPIV-3 감염 배지: EMEM + 2 mM 글루타민; hPIV-1 감염 배지: EMEM + 2 mM 글루타민 + TrypLE select 1.2%.
본 발명의 화합물에 대한
hPIV
-3
NI
및
hPIV
-1
NI
IC
50
제1 측면에 따른 다수 화합물들의 IC50 값을, 기존에 Guillon, P et al, Nature Communications (2014)에서 언급된 표준 분석 방법을 통해 결정하였다. 아래 표는 제조한 화합물의 IC50 값을 나타낸 것으로, 화합물 ID는 실험적인 규명 섹션에 제시된 기준 물질 및 화합물 구조체들과 함께 열거된다.
| hPIV -3 NI (IC 50 값) | hPIV -1 NI (IC 50 ) | |||
| 화합물 ID | IC50 (μM) | 화합물 ID | IC50 (μM) | |
| IE1172-78 | 2.47 | IE1172-78 | 75.15 | |
| IE1172-82 | 3.95 | IE1172-82 | 57.18 | |
| IE1172-83 | 5.61 | IE1172-83 | 73.62 | |
| IE1172-87 | 77.35 | IE1172-87 | 92.79 | |
| IE1172-45 | 315 | IE1172-45 | >1000 | |
| IE1172-102 | >1000 | IE1172-102 | 793.4 | |
| IE1257-84 | 2.19 | IE1257-84 | 24.88 | |
| IE1398-33 | 1.97 | IE1398-33 | no data | |
| IE832-8 | 54.43 | IE832-8 | 300.6 | |
| IE832-12 | 51.85 | IE832-12 | 215.3 | |
| IE832-17 | 148.5 | IE832-17 | 19.82 | |
| IE832-20 | 6.28 | IE832-20 | 192.7 | |
| IE832-26 | 67.67 | IE832-26 | 95.49 | |
| IE832-27 | 106.1 | IE832-27 | 301.9 | |
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표 5 - 시험 화합물들의 hPIV-3 및 hPIV-1 IC50
Claims (19)
- 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:
식 (I)
상기 식에서,
R1은 COOH 또는 그의 염, C(O)NR9R10, C(O)OR11으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R9, R10 및 R11은 독립적으로 수소 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R3는 1개 또는 2개의 고리 탄소 원자 위치에서 치환된 N-연결된 트리아졸, 선택적으로 치환된 N-연결된 테트라졸, 선택적으로 치환된 N-연결된 인돌, 선택적으로 치환된 N-연결된 이소인돌 및 선택적으로 치환된 N-연결된 벤조트리아졸로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R4는 NHC(O)R17이며, 여기서 R17은 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 C3-C6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R6, R7 및 R8은 독립적으로 OH, NH2, C1-C6 알킬, NR18R18', C1-C6 알콕시, -OC(O)R18, -NH(C=O)R18 및 S(O)nR18으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 n = 0 - 2이고, 각각의 R18 및 R18'은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬임. - 제1항에 있어서,
R1이 COOH 또는 그의 염이거나 또는 C(O)OR11이며, 여기서 R11이 메틸, 에틸 및 프로필로부터 선택되는, 화합물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
R3가 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:
상기 식에서, R20 및 R21은 독립적으로 수소, 하이드록시, 시아노, 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬에테르, 선택적으로 치환된 피리딜 및 선택적으로 치환된 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R20와 R21 중 적어도 하나는 수소가 아니며;
R22는 수소, C1-C6 알킬 및 선택적으로 치환된 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
R23 및 R24는 독립적으로 수소, 하이드록시, 시아노, 할로, C1-C6 알킬 및 C1-C6 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택됨. - 제3항에 있어서,
상기 R20, R21 또는 R22가 선택적으로 치환된 피리딜 또는 선택적으로 치환된 페닐인 경우, 상기 치환이 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬하이드록시, C1-C6 알콕시, 할로, -C(O)OMe 및 -CH2OCH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티에 의한 것인, 화합물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
R3가 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:
및
.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
R4가 하기 기들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:
및.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
R4가 -NHAc, -NHC(O)CH2(CH3)2, -NHC(O)CF3 및 -NHC(O)CH2CH3로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
R6, R7 및 R8이 독립적으로 OH 및 OAc로부터 선택되는, 화합물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서,
상기 식 (I)의 화합물이 식 (II)의 화합물인, 화합물:
식 (II)
상기 식에서, R1, R3, R4, R6, R7 및 R8은 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 정의와 동일하게 정의됨. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서,
상기 식 (I)의 화합물 또는 식 (II)의 화합물이 하기 화합물들 및 그 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이며,
상기 유사체는, C-2 카르복시 기가 양성자화된 형태 (protonated form), 소듐 염 형태 또는 C1-C3 에스테르 프로드럭 형태이고, R4 위치가 -NHC(O)R 기로 치환되며, R이 C1-C4 알킬 또는 할로알킬인, 화합물:
.
- 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 약학적 조성물이 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, 약학적 조성물. - 환자에서 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염 또는 제11항 또는 제12항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 질환, 장애 또는 병태가 인플루엔자 또는 파라인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 감염인, 방법. - 제14항에 있어서,
상기 감염이 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 또는 파라인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 것인, 방법. - 제15항에 있어서,
상기 파라인플루엔자 바이러스가 hPIV-1, 2 또는 3 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법. - 제13항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서,
상기 환자가 가축, 가금류 동물 또는 인간인, 방법. - 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소의 활성을 조절하는 방법으로서,
상기 효소를 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 유효한 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 효소의 활성을 조절하는 방법. - 제18항에 있어서,
상기 조절이 저해이고,
상기 바이러스 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제가 파라인플루엔자의 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제인, 방법.
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