KR20170047028A - 단일 간세포 특이적인 전사인자와 소분자화합물의 조합을 이용한 간세포로의 교차분화 유도 방법 - Google Patents

단일 간세포 특이적인 전사인자와 소분자화합물의 조합을 이용한 간세포로의 교차분화 유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, (a) 체세포에 Hnf1a, cMyc 및 Klf4를 포함하는 간세포 특이적인 전사 인자를 도입하여 간세포로의 직접교차분화(direct reprogramming)를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 간세포 특이적인 전사인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물 및 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화시키는 단계;를 포함하는 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 간세포 특이적인 전사인자 및 소분자화합물 조합을 이용한 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화 유도 방법은, 중간엽 세포에서 내배엽 세포로의 전이과정을 촉진시키는 전사인자(cMyc/Klf4) 및 단일 간세포 특이적 전사인자(Hnf1α)와 함께 조합하여 생쥐의 체세포에 도입하여 간세포로의 직접교차분화를 유도하고, 단일 간세포 특이적인 전사인자가 도입된 세포를 Tgfβ 신호전달을 차단 및 억제하는 A-83-01 및 세포의 증식을 유도하는 Wnt 신호전달 활성화 유도 CHIR99021를 포함하는 소분자화합물과 배아발달과정에서 간 발달 및 생성에 관여하고 전능성 배아줄기세포로부터 간세포로의 분화과정에서 간세포 특이적인 유전자인 알부민(albumin)의 발현을 촉진하는 BMP4를 포함하는 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 직접교차분화시켜 간세포의 특징을 가지고 있는 유도 간세포를 제조할 수 있다.

Description

단일 간세포 특이적인 전사인자와 소분자화합물의 조합을 이용한 간세포로의 교차분화 유도 방법{Method for inducing reprogramming to liver cell used for single specific transmission factor of liver cell and small molecules}
본 발명은 간세포 특이적인 전사인자 및 소분자화합물 조합을 이용하여 생쥐 체세포를 간세포로 직접 교차분화하는 방법에 관한 것이다.
2006년 shinya yamanaka 연구팀은 체세포에 Oct4 , Sox2 , Klf4 및 cMyc의 4종 외래 유전자를 도입하여 체내의 모든 세포로 분화(differentiation)가 가능한 전능성 배아줄기세포의 특징을 가지는 유도만능줄기세포로의 역분화(de-differentiation)가 가능함을 밝혔다.
그러나, 유도만능줄기세포로부터 특정 세포로의 분화과정에서 완전히 분화가 되지 않은 '미분화 세포'의 잔존 가능성이 있어, 체내 이식시 종양(teratoma)을 형성할 수 있다는 커다란 한계점을 가지고 있다.
이에 따라, 최근 특정세포 특이적인 전사인자 체세포에 도입하여 유도만능줄기세포로부터 역분화시킨 후 다시 하위 세포로의 분화과정을 거치지 않은 직접 교차분화(direct reprogramming) 기술이 활발히 연구가 되고 있다.
2011년 중국 연구팀은 일반 체세포를 이용하여 간세포 특이적인 전사인자인 Foxa3, Hnf1α , Gata4를 이용하여 간세포의 특징을 가지고 있는 세포로의 직접 교차분화에 성공하였음을 보고하였다.
또한, 2011년 일본 연구팀에 의하여 Hnf4α와 Foxa1, Foxa2 또는 Foxa3 등의 3가지 전사인자를 이용한 조합이 일반 간세포의 특징을 가지는 유도 간세포(induced hepatocyte)로의 직접 교차분화에 필수적임을 보고하였다.
하지만, 이러한 직접 교차분화 과정의 기작은 역분화 유도를 위해 사용된 유전자의 수가 너무 많아 자세한 기작을 규명하기 어렵기 때문에 현재까지 밝혀진 수준이 미미한 상태로서, 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화 유도시 cMyc/Klf4 유전자 또는 소분자화합물의 조합이 직접 교차분화에 미치는 영향에 관한 기술 내용은 개시된 바 없다.
한국공개특허 제10-2015-0050961호 (공개일 : 2015.05.11) 한국등록특허 제10-1158402호 (공개일 : 2011.07.07)
Huang et al., Nature 2011. Sekiya and Suzuki., Nature 2011.
본 발명의 발명자들은 중간엽 세포에서 내배엽 세포로의 전이(mesenchymal to epithelial transition, MET)과정을 촉진시키는 전사인자를 단일 간세포 특이적인 전사인자와 함께 조합하여 유도 간세포로의 직접 교차분화를 시도한 결과, 특정 전사인자 조합에서 체세포에서 간세포로의 교차분화가 가능함을 확인하였으며, 소분자화합물 및 사이토카인과 단일 간세포 특이적인 전사인자를 이용한 조합에서 체세포에서 간세포로의 직접교차분화가 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 간세포 특이적인 전사인자, 소분자화합물 및 사이토카인 조합을 이용하여 체세포에서 간세포로의 직접교차분화를 유도하는 방법에 관한 기술 내용을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, (a) 체세포에 Hnf1a, cMyc 및 Klf4를 포함하는 간세포 특이적인 전사 인자를 도입하여 간세포로의 직접교차분화(direct reprogramming)를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 간세포 특이적인 전사인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물 및 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화시키는 단계;를 포함하는 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 유도 방법을 제공한다.
또한, 상기 체세포는 생쥐 배아 섬유아세포(Murine embryonic fibroblasts, MEFs)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (a)는 pMX 레트로바이러스(pMX retrovirus)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 소분자 화합물은 A-83-01 및 CHIR99021를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 사이토카인은 BMP4를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 방법을 통해 체세포에서 직접 교차분화된 간세포를 제공한다.
본 발명에 따른 간세포 특이적인 전사인자, 소분자화합물 및 사이토카인 조합을 이용한 인간 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화 유도 방법은, 중간엽 세포에서 내배엽 세포로의 전이(mesenchymal to epithelial transition, MET)과정을 촉진시키는 전사인자(cMyc/Klf4) 및 단일 간세포 특이적 전사인자(Hnf1α)와 함께 조합하여 체세포에 도입하여 간세포로의 직접교차분화를 유도하고, 단일 간세포 특이적인 전사인자(Hnf1α)가 도입된 체세포를 Tgfβ 신호전달(signaling)을 차단 및 억제하는 A-83-01 및 세포의 증식을 유도하는 Wnt 신호전달 활성화 유도 CHIR99021를 포함하는 소분자화합물과 배아발달과정에서 간 발달 및 생성에 관여하고 전능성 배아줄기세포로부터 간세포로의 분화과정에서 간세포 특이적인 유전자인 알부민(albumin)의 발현을 촉진하는 BMP4를 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 직접교차분화시켜 간세포의 특징을 가지고 있는 유도 간세포(induced hepatocyte)를 제조할 수 있다.
상기한 바와 같은 본 발명에 따른 인간 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 유도 방법은 향후 간세포를 이용한 치료제 개발의 가속화와 신약물질의 독성 검증, 환자 특이적인 간세포의 생산 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 비교예 1(Foxa1CK), 비교예 2(Foxa3CK), 비교예 3(Gata4CK), 실시예 1-1(Hnf1aCK) 및 비교예 5-1(Hnf4aCK)에 따른 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율 측정 결과이다.
도 2는 비교예 1(Foxa1CK), 비교예 2(Foxa3CK), 비교예 3(Gata4CK), 실시예 1-1(Hnf1aCK) 및 비교예 5-1(Hnf4aCK)에 따른 세포주에서 간세포 특이적 유전자의 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 3은 비교예 4(Hnf1a+AR) 및 비교예 5-2(Hnf4a+AR)에 따른 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율 측정 결과와 세포의 형태학적 변화 양상을 확인한 실제 이미지이다.
도 4는 비교예 4(Hnf1a+AR), 실시예 1-2(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주에서 간세포 특이적 유전자의 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 5는 실시예 1-2(Hnf1a + ARB)에 따른 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율 측정 결과와 비교예 4(Hnf1a+AR) 및 실시예 1-2(Hnf1a+ARB)에 따른 Aat, Albumin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율 측정 결과이다.
도 6은 실시예 1-2(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율 측정 결과이다.
도 7은 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주의 증식률 및 핵형을 분석 결과이다.
도 8은 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)의 간세포 표시인자 발현 여부를 확인하기 위한 면역형광법 결과이다.
도 9는 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)의 간세포 기능성을 확인하기 위해, PAS 염색, ICG uptake & release, Dil-Ac-LDL 및 Oil-red-O를 이용한 염색 분석 결과이다.
도 10은 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)에서 CYP 효소의 발현양상을 확인한 결과이다.
도 11은 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)의 요소(urea) 분비능과 albumin 분비능 분석 결과이다.
도 12는 실시예 1-2(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주의 전체적인 유전자 발현 양상을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, (a) 체세포에 Hnf1a, cMyc 및 Klf4를 포함하는 간세포 특이적인 전사 인자를 도입하여 간세포로의 직접교차분화(direct reprogramming)를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 간세포 특이적인 전사인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물 및 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화시키는 단계;를 포함하는 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 유도 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)는 체세포에 Hnf1a, cMyc 및 Klf4를 포함하는 전사 유전자를 도입한 후, 배양하여 간세포로의 직접교차분화를 유도하는 단계이다. 이를 위해, 본 단계에서는 pMX 레트로바이러스를 매개로 체세포에 상기 전사 유전자를 도입하는 방법(pMX retroviral infection)을 통해 체세포내 상기 전사 유전자를 도입하여 체세포를 간세포로 직접교차분화를 유도할 수 있다.
보다 상세히 설명하면, 젤라틴-코팅된 플레이트에서 pMX 레트로바이러스(pMX retrovirus)를 매개로 체세포에 상기 전사 유전자를 형질도입한 후, 48시간이 경과하면 간세포 특이적인 배양액(Hepatocyte culture medium, HCM)으로 교체하고, 배지의 90 내지 100 %로 세포가 배양되면 콜라겐-코팅된 플레이트에 계대배양하여 후술할 단계에서 체세포를 간세포로 직접교차분화 시키도록 구성할 수 있다.
상기 체세포는 생쥐 배아 섬유아세포 (Murine embryonic fibroblasts, MEFs) 유래의 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 (b)에서는 단일 간세포 특이적인 전사인자가 도입되어 직접교차분화(direct reprogramming)가 유도될 수 있도록, 상기 체세포를 소분자 화합물 및 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화를 유도하도록 구성할 수 있다.
이를 위해, 소분자화합물 및 사이토카인을 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하도록 구성할 수 있으며, 상기 배양액은 간세포 특이적인 배양액 (Hepatocyte culture medium, HCM)을 사용할 수 있다.
본 단계에서는 상기와 같이 체세포가 간세포로의 직접교차분화 될 수 있도록 소분자 화합물 및 사이토카인을 배양액에 첨가하도록 구성할 수 있다.
상기 소분자 화합물은 Tgfβ 신호전달(signaling)을 차단 및 억제하는 A-83-01과 세포의 증식을 유도하는 Wnt 신호전달활성화 소분자화합물인 CHIR99021을 포함하여 체세포가 간세포로의 직접교차분화를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 상기 사이토카인은 배아발달과정에서 간 발달 및 생성에 관여하고 전능성 배아줄기세포로부터 간세포로의 분화과정에서 간세포 특이적인 유전자인 알부민(albumin)의 발현을 촉진하는 BMP4를 포함하여 체세포가 간세포로의 직접교차분화를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 상기한 바와 같은, 본 발명에 따른 간세포 특이적인 전사인자, 소분자화합물 및 사이토카인 조합을 이용한 생쥐 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화 유도 방법은, 중간엽 세포에서 내배엽 세포로의 전이(mesenchymal to epithelial transition, MET)과정을 촉진시키는 전사인자(cMyc/Klf4) 및 단일 간세포 특이적 전사인자(Hnf1α)와 함께 조합하여 체세포에 도입해 간세포로의 직접교차분화를 유도하거나, 단일 간세포 특이적인 전사인자(Hnf1α)가 도입된 세포를 Tgfβ 신호전달(signaling)을 차단 및 억제하는 A-83-01 및 세포의 증식을 유도하는 Wnt 신호전달 활성화 유도 CHIR99021를 포함하는 소분자화합물과 배아발달과정에서 간 발달 및 생성에 관여하고 전능성 배아줄기세포로부터 간세포로의 분화과정에서 간세포 특이적인 유전자인 알부민(albumin)의 발현을 촉진하는 BMP4를 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 직접교차분화시켜 간세포의 특징을 가지고 있는 유도 간세포(induced hepatocyte)를 제조할 수 있다.
상기한 바와 같은 본 발명에 따른 생쥐 체세포에서 간세포로의 직접 교차분화 유도 방법은 향후 간세포를 이용한 치료제 개발의 가속화와 신약물질의 독성 검증, 환자 특이적인 간세포의 생산 등에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기에 기재된 방법을 통해 체세포에서 직접교차분화된 간세포를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하도록 한다.
제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
<실시예 1-1>
pMX 레트로바이러스를 매개로, 단일의 간세포 특이적인 전사인자인 Hnf1a과 MET과정을 촉진하는 전사인자인 cMyc, Klf4를 최초 5만개의 일반 체세포(Murine embryonic fibroblasts, MEFs)에 도입한 후, 48시간 경과한 시점에서 간세포 특이적인 배양액(Hepatocyte culture medium, HCM)에서 배양하여 세포주(Hnf1aCK)를 수득하였다.
<실시예 1-2>
pMX 레트로바이러스를 매개로, 단일의 간세포 특이적인 전사인자인 Hnf1a를 최초 5만개의 일반 체세포에 도입한 후, 48시간 경과한 시점에서 A-83-01(2 μM), CHIR99021(3 μM) 및 BMP4(10 ng/ml)을 포함하는 간세포 특이적인 배양액에서 배양하여 세포주(Hnf1a+ARB)를 수득하였다.
<실시예 1-3>
실시예 1-2와 동일한 방법으로 배양하여 얻어진 세포주(Hnf1a+ARB)를 수득하고, 수득한 세포주를 A-83-01(2 μM), CHIR99021(3 μM) 및 BMP4(10 ng/ml)을 포함하지 않는 간세포 특이적인 배양액에서 2주 동안 더 배양하여 세포주(Hnf1a-ARB)를 수득하였다.
<비교예 1>
실시예 1-1과 동일한 방법으로 체세포에 간세포 특이적인 전사인자인 Foxa1 및 전사인자인 cMyc, Klf4를 각각 도입한 후, 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하였다(Foxa1CK).
<비교예 2>
실시예 1-1과 동일한 방법으로 체세포에 간세포 특이적인 전사인자인 Foxa3 및 전사인자인 cMyc, Klf4를 각각 도입한 후, 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하였다(Foxa3CK).
<비교예 3>
실시예 1-1과 동일한 방법으로 체세포에 간세포 특이적인 전사인자인 Gata4및 전사인자인 cMyc, Klf4를 각각 도입한 후, 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하였다(Gata4CK).
<비교예 4>
실시예 1-2와 동일한 방법으로 체세포에 간세포 특이적인 전사인자인 Hnf1a 를 도입한 후, 48시간 경과한 시점에서 A-83-01(2 μM) 및 CHIR99021(3 μM)을 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하였다(Hnf1a + AR).
<비교예 5-1>
실시예 1-1과 동일한 방법으로 체세포에 간세포 특이적인 전사인자인 Hnf4a 및 전사인자인 cMyc, Klf4를 각각 도입한 후, 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하였다(Hnf4aCK).
<비교예 5-2>
실시예 1-2와 동일한 방법으로 체세포에 간세포 특이적인 전사인자인 Hnf4a 도입한 후, 48시간 경과한 시점에서 A-83-01(2 μM) 및 CHIR99021(3 μM)을 간세포 특이적인 배양액에 첨가하여 배양하였다(Hnf4a + AR).
<실험예 1> 전사인자 도입된 체세포의 직접 교차분화 효율 산출 및 유전자 발현 양상 확인
(1) 직접 교차분화 효율 산출
체세포에서 간세포로의 직접교차분화 효율을 산출하기 위하여 체세포에 Foxa1, Foxa3, Gata4, Hnf1a 및 Hnf4a 전사인자와 MET과정을 촉진하는 전사인자인 cMyc, Klf4를 각각 도입한 후, 14일이 경과한 시점의 비교예 1(Foxa1CK), 비교예 2(Foxa3CK), 비교예 3(Gata4CK), 실시예 1-1(Hnf1aCK), 비교예 5-1(Hnf4aCK)에 따른 세포주와 전사인자 도입하지 않은 세포주(Mock)를 FACS analysis 기법을 이용해 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수의 비율을 측정하였으며 측정결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 단일 간세포 특이적인 전사인자 비교예 1 내지 3에 따른 방법에 의해 전사인자가 도입된 체세포 배양액의 세포수 비율은 MET 과정을 촉진시키는 cMyc, Klf4를 각각 도입후 14일이 경과하였을 때, E-cadherin 양성 세포가 비교예 1은 53.1%, 비교예 2는 63%, 비교예 3은 22.7%, 실시예 1-1은 50.1%, 비교예 5-1는 32.9%로 나타났다.
(2) 유전자 발현 양상 확인
직접교차분화된 유도 간세포의 유전자 발현 양상을 확인하기 위하여 비교예 1(Foxa1CK), 비교예 2(Foxa3CK), 비교예 3(Gata4CK), 실시예 1-1(Hnf1aCK) 및 비교예 5-1(Hnf4aCK)에 따른 세포주와 미처리한 체세포(MEFs) 및 생쥐간세포(Primary Heps)를 실험군별로 수거하여 total RNA를 추출하고, cDNA를 합성한 후, 간세포 특이적인 유전자의 발현 양상을 RT-PCR기법을 이용하여 분석하였으며, 분석 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1 및 비교예 5-1의 세포주에서 체세포 특이적인 유전자의 발현은 감소하고 간세포 특이적인 유전자의 발현이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 2> 전사인자 도입된 체세포에서 소분자화합물의 영향 분석
(1) 소분자화합물을 포함하는 배양액에서 배양된 세포주의 유전자 발현양상 확인
소분자화합물을 포함하는 배양액에서 배양후, 수득한 세포주 각각의 유전자 발현양상을 확인하기 위해서, 비교예 4(Hnf1a+AR), 비교예 5-2(Hnf4a+AR) 및 교차분화가 유도되지 않은 체세포를 대조군(Mock)으로 하여 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율을 FACS analysis 기법으로 측정하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 전사인자 도입후, 5주가 경과 시점에서, 비교예 4에 따른 세포주(도 3(b)) 및 비교예 5-2에 따른 세포주(도 3(c))에서 E-cadherin positive 세포가 각각의 조합에서 나타남을 확인하였다.
그러나, 비교예 4에 따른 세포주의 경우, 상피세포 모양의 군체 (epithelial colony)가 형성되었으나 비교예 5-2에 따른 세포주의 경우 체세포의 모양으로 다시 돌아가는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 전사인자 도입된 체세포에서 소분자화합물 및 사이토카인의 영향 분석
(1) 소분자화합물 및 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양된 세포주의 직접 교차분화 분석
ARB, A-83-01, CHIR99021 및 BMP4에 의한 체세포의 유도 간세포로의 직접 교차분화 가능 여부를 분석하기 위해서, 상기와 같이 수득한 세포주에서 유전자 발현 양상을 RT-PCR 기법을 이용하여 분석하였다. RT-PCR 기법을 수행하기 위해서, 실시예 1-2에 따른 세포주(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB), 비교예 4(Hnf1a+AR), 전사인자 도입하지 않은 체세포(MEFs)와 생쥐 간세포를 대조군(Primary Heps)으로 하고 RT-PCR을 수행하여 간세포 특이적인 유전자 발현 양상을 확인하고, 확인 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 4에 따른 세포주(Hnf1a+AR)의 경우, 체세포 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인하였으나, 알부민(albumin), Aat, Mrp2, Mrp3, MaoB 또는 Mgst1 등과 같은 성숙 간세포 유전자의 발현이 되지 않음을 확인하였다. 반면에, 실시예 1-2 및 실시예 1-3에 따른 세포주에서는 성숙 간세포 유전자가 모두 발현함을 확인하였다.
또한, 실시예 1-2(Hnf1a+ARB) 및 교차분화가 유도되지 않은 체세포를 대조군(Mock)으로 하여 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율을 FACS analysis 기법으로 측정하여 도 5에 나타내었다. 또한, 비교예 4(Hnf1a+AR) 및 실시예 1-2(Hnf1a+ARB)에 따른 세포주와 직접교차분화가 유도되지 않은 체세포를 대조군(Mock)으로 하여 Aat, Albumin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율 측정하고 유전자 발현 효율을 산출하였으며, 세포수 측정결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 전사인자 도입후 5주 경과한 시점의 실시예 1-2에 따른 세포주(Hnf1a+ARB)에서 e-cadherin positive 세포가 비교예 4(Hnf1a+AR)에 비하여 대략 2배 이상 증가함을 확인하였고, Albumin과 Aat positive 세포 또한 비교예 4(Hnf1a+AR)에 비하여 각각 약 82배, 54배 가량 증가하는 것을 FACS analysis를 이용하여 확인하였다(도 3 및 도 5 참조).
(2) 사이토카인에 의한 유도 간세포의 유지에서의 영향 분석
소분자화합물에 의한 유도 간세포 유지의 영향 여부를 확인하기 위해서, 소분자화합물 조합을 제거한 배양조건에서 유도 간세포를 2주 동안 배양하였으며, 실시예 1-2(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주와 전사인자를 도입하지 않은 체세포를 대조군(Mock)으로 하여 E-cadherin 항체에 양성반응을 보이는 세포수 비율을 FACS analysis 기법으로 측정 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 2주 동안 소분자화합물이 제거된 배양조건에서 배양을 진행한 결과, 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주의 경우, e-cadherin positive 세포가 유지가 되는 것을 확인하였고, 유전자 발현 양상 또한 변하지 않음을 RT-PCR을 통하여 확인하였다(도 4 및 도 6 참조).
(3) 사이토카인에 의한 세포수 증식률 및 행형 분석
또한, 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주의 증식률 및 핵형을 분석하였으며, 분석 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 소분자화합물을 제거한 뒤 배양한 실시예 1-3(Hnf1a-ARB)에 따른 세포주의 경우, 정상적인 증식율을 보였으며, 계속적인 계대배양 후에도 정상핵형을 유지하는 것을 확인하였다.
(4) 직접 교차분화가 유도된 간세포의 기능성 확인
직접교차분화가 유도된 간세포 표시인자 발현을 확인하기 위해서 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)를 이용하여 면역형광법을 수행하였으며, 도 8에 확인 결과를 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)가 체내 유래 간세포와 유사하게 Albumin, CK18, CYP1a2, E-cadherin, Zo-1을 발현하는 것을 확인할 수 있고, 섬유아세포 인자인 Vimentin은 발현하지 않는 것을 확인할 수 있다.
직접 교차분화가 유도된 간세포의 기능성을 확인하기 위해서 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)를 이용하여 세포내 글리코겐 축적을 확인하는 PAS 염색, 생체이물대사(xenobiotic metabolism)를 확인가능한 ICG uptake & release, 간세포의 아세틸화 저밀도 지단백질(acetylated low-density lipoprotein)의 흡수를 확인할 수 있는 Dil-Ac-LDL, 트리글리세라이드와 지질의 세포질내의 축적을 확인하기 위하여 Oil-red-O 염색 방법을 수행하였으며, 수행결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)는 간세포내의 글리코겐, 생체이물대사(xenobiotic metabolism), 간세포의 아세틸화 저밀도 지단백질 (acetylated low-density lipoprotein)의, 트리글리세라이드와 지질의 세포질내의 축적과 같은 기능성을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 실시예 1-3에 따른 세포주에서 CYP 효소의 발현양상을 확인하기 위해서, 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB), 전사인자 도입하지 않은 체세포(MEFs) 및 생쥐 간세포(primary HEPs)간의 전체 유전자 발현 양상을 확인하였다. 이를 위해, 각각의 세포군에서 total RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하고 real time PCR을 이용하여 증폭시켜, CYP enzyme의 발현 양상을 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)기법을 이용하여 분석하였으며, 분석 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)에서 체내 유래의 간세포와 유사한 CYP 효소의 발현 양상을 보이는 것을 확인할 수 있다.
또한, 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)의 요소(urea) 분비능과 albumin 분비능을 분석하기 위해, ELISA 기법을 이용하여 분석하였으며, 분석 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 대조군과 달리, 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)에서 요소 및 알부민을 분비하는 것을 확인할 수 있다.
(5) 직접 교차분화가 유도된 간세포의 전체적인 유전자 발현 양상 확인
실시예 1-2에 따른 세포주(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)의 전체적인 유전자 발현 양상을 확인하기 위해서, 전사인자 처리하지 않은 체세포(MEFs), 쥐의 간세포(Primary Heps) 및 실시예 1-2에 따른 세포주(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)를 아피매트릭스 마이크로어레이(Affymetrix microarray) 방법을 통해 전체 유전자 발현 양상을 확인하였고, 확인 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, Microarray를 통해 전체적인 유전자 발현 양상을 확인해본 결과, 실시예 1-2에 따른 세포주(Hnf1a+ARB) 및 실시예 1-3에 따른 세포주(Hnf1a-ARB)는 일반체세포와는 달리 체내 유래 간세포와 유사한 유전자 발현 양상을 나타내는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 단일 간세포 특이적 전사인자 Hnf1a와 소분자화합물(A-83-01, CHIR99021 및 BMP4) 조합을 이용하여, 체내 유래의 간세포가 가지는 형태학적 기능적 특징을 가지고 있는 유도 간세포로의 직접 교차분화가 가능하다는 사실을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명에 따른 방법은 향후 간세포를 이용한 치료제 개발의 가속화와 신약물질의 독성 검증, 환자 특이적인 간세포의 생산, 간세포로의 메커니즘 연구 등에 유용하게 사용될 것을 판단된다.

Claims (6)

  1. (a) 체세포에 Hnf1a, cMyc 및 Klf4를 포함하는 간세포 특이적인 전사 인자를 도입하여 간세포로의 직접교차분화(direct reprogramming)를 유도하는 단계; 및
    (b) 상기 간세포 특이적인 전사인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물 및 사이토카인을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화시키는 단계;를 포함하는 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 체세포는 생쥐 배아 섬유아세포(Murine embryonic fibroblasts, MEFs)인 것을 특징으로 하는 직접 교차분화 유도 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 pMX 레트로바이러스(pMX retrovirus)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 직접 교차분화 유도 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 소분자 화합물은 A-83-01 및 CHIR99021를 포함하는 것을 특징으로 하는 직접 교차분화 유도 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 사이토카인은 BMP4를 포함하는 것을 특징으로 하는 직접 교차분화 유도 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 통해 체세포에서 직접 교차분화된 간세포.
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