KR20170027405A

KR20170027405A - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 참홍어의 동정 방법

Info

Publication number: KR20170027405A
Application number: KR1020150123960A
Authority: KR
Inventors: 황인관; 이양한; 이해용; 김민희
Original assignee: 대한민국(관리부서: 행정자치부 국립과학수사연구원장)
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2017-03-10
Also published as: KR101817107B1

Abstract

본 발명은 참홍어 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 참홍어 프라이머와 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브로 이루어진 프라이머세트, 참홍어 동정용 프라이머 세트를 포함하는 참홍어 동정용 키트 및 이를 이용하는 참홍어 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 참홍어 특이서열을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응은 많은 시간과 비용이 소모되는 염기서열분석을 실시할 필요가 없고, 더 적은 노력과 비용으로 참홍어를 신속, 정확하게 식별할 수 있는 DNA 기법으로서 참홍어에 대한 사기 또는 모호한 표기를 방지할 수 있다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 참홍어의 동정 방법{Method For Identification Of Beringraja pulchra Using Real-Time PCR assay}

본 기술은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 참홍어 동정 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 참홍어 특이적인 염기서열로 구성된 참홍어 동정용 프라이머_프로브 세트, 참홍어 동정용 프라이머_프로브 세트를 포함하는 참홍어 동정용 키트 및 이를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용하는 참홍어 동정 방법에 관한 것이다.

참홍어는 홍어목의 가오리과에 속하는 연골어류로서, 서식층이 30-200m, 서식 수온이 5-15℃인 냉수성 어종으로, 주로 새우류와 소형 어류 등을 먹이로 한다. 참홍어는 이러한 특성으로 인해 흑산도와 대청도를 위시한 우리나라 남서해, 동중국해, 일본 중남부해 이남 등에 주로 서식하고, 주로 흑산도 연안과 대청도 연안에서 주로 어획된다. 홍어(Rajiforms)는 3과(family)와 30속(genera)에 포함된 245종으로 구성되어 있다. 새로운 속(genera)인 Beringraja가 Ishihara에 의해 설립 될 때까지 참홍어(B. pulchra)는 Raja pulchra로 분류되었다. 참홍어는 한국의 흑산도와 대청도 섬 주변의 황해에서는 약 20년 전까지 매우 일반적이었으나, 지속적으로 심각한 개체수의 감소를 보이고 있으며, 현재 세계자연보존연맹(IUCN, International Union for Conservation of Nature)에 의해 취약 종으로 분류되어있다. 최근까지 한국에서는 5가지 속(genera)에 속하는 11종의 홍어가 확인되었고, 그 중에 흑산도 홍어라고 널리 알려진 참홍어는 한국에서 가장 경제적으로 가치 있는 어류 중의 하나로서 형태학적으로 확인할 수 없는 주로 날것이나 발효된 살 조각의 형태로 주로 소비된다. 참홍어(B. pulchra)종의 가치가 날로 증가함에 따라 식품관련 범죄가 증가하고 있고, 경찰은 현재 한국에서 이러한 식품관련 범죄에 대해서 강력 단속 중에 있다. 그러나, 아직까지 외부 형태학적으로 판별이 불가능한 참홍어 관련 식품에 대해서 신속하고 정확한 식별 방법은 아직 개발되지 않았다.

상업적으로 판매되는 식품시료는 외부적인 형태학적 특징(morphological characteristics)이 사라졌기 때문에 분자 마커(molecular marker)를 이용해서 종을 확인하는 것만이 유일한 방법이다. 분자 마커로서는 단백질(protein)과 DNA(deoxyribonucleic acid)가 사용된다. 단백질 분석기술은 물리화학적인 차이(physicochemical difference)에 기반을 둔 것인 반면, DNA 기술은 염기서열(sequence) 안에 단일염기의 다양성(nucleotide variation)을 감지하는 것으로 구성 된다. 그럼에도 불구하고, 시료를 확인 할 때는 이미 온도, 화학물질 첨가, 습도, 가공 등 다양한 과정을 거친 상태이기 때문에 마커의 적합성은 아주 중요하다. 시료에서 추출한 단백질의 전기영동 분석법은 열처리(thermal treatment)에 의한 비가역적인 변화(irreversible change)를 가지는 시료에 대해서는 적합하지 않다. 그러나, DNA 분자는 다른 것보다는 훨씬 열처리에 더 안정적이므로 분자적인 마커로서 DNA의 사용은 종(species)의 식별(identification)에 있어서는 가장 강력한 도구이다.

다양한 식품의 종 식별에 널리 사용되는 DNA 기반 방법들은 특이적인 프라이머(primer)에 의한 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), 제한효소처리 중합효소연쇄반응(PCR-RFLP, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymerphism), 법과학 염기서열분석 정보(FINS, Forensically Informative Nucleotide Sequencing) 및 실시간 형광 중합효소연쇄반응(Real-time fluorescence PCR)같은 방법들이 있다. RT-PCR 기술은 특정 형광 프로브(fluorogenic probe)를 포함한 형광 리포터(fluorescence reporter)를 고품질의 광학 감지기(high-quality optical detection instrument)를 사용하여 검출 및 정량화하는 것을 기반으로 한다. 그리고, 이것은 더 세심하고 명확하게 표준 실험실 조건을 충족하며, DNA 무결성(integrity)을 위태롭게 하는 시료 처리에 더 적합하다.

본 발명은 표적(target) DNA의 진단 부위에 결합하여 증폭하는 동안 형광을 내는 MGB(Minor Groove Binding) TaqMan probe의 사용에 기초한 RT-PCR 분석을 사용하였다. 또한, 미토콘드리아 시토크롬 산화 효소 서브 유닛 1(mitochondrial cytochrome oxidase subunit 1, COI) 유전자는 종 식별을 위한 유전적 마커로서 상업용 식품 및 참홍어(B. pulchra)에 적용하였다. 미토콘드리아(mitochondria, mt) 유전자는 핵(nuclear)DNA에 비해 높은 사본 수(copy number)를 가지고 있으므로 추적 샘플(trace sample)에서 더 많은 회수율을 가진다. 또한, 미토콘드리아 유전자는 일반적으로 미토콘드리아 DNA 반수체(haplotypes)의 손실 또는 고정을 촉진하는 재조합이 부족하여 종내 다양성이 적어서 종간 식별을 가능하게 한다.

본 발명에서는 참홍어(B. pulchra)종의 식별을 위해 미토콘드리아 COI 유전자 염기서열 단편의 증폭에 기초한 TaqMan 실시간 PCR 기법을 제공한다. 이 시스템은 미국국립보건원의 GenBank DNA 데이터베이스에 보고된 157종의 홍어와 가오리들에 대한 COI 유전자 염기서열과 참홍어의 COI 유전자 염기서열을 비교, 분석하여 찾은 참홍어 특이적인 염기서열을 기반으로 제작하였고, 29개의 참홍어와 종이 확실하지 않은 27개의 상업용 식품시료에 적용해 보았다. 이에 본 발명자들은 실시간 중합효소연쇄반응 분석 방법이 참홍어 종과 유사한 종들 사이에서 참홍어 종만을 정확하고 빠르게 구별할 수 있으며, 검사방법 또한 간편함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

관련 선행기술로 한국등록특허 10-0806208호 (홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트)와 한국등록특허 10-1232878호 (깍지벌레류의 미토콘드리아 COI 유전자 DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머)에 관한 것이 공지되어 있다.

본 발명의 목적은 참홍어를 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 참홍어 동정용 프라이머_프로브 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 참홍어를 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 참홍어 동정용 프라이머_프로브 세트를 포함하는 참홍어 동정용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 참홍어를 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 참홍어 동정용 프라이머_프로브 세트를 포함하는 참홍어 동정용 키트를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용하는 참홍어 동정 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 참홍어 동정용 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 참홍어 동정용 세트를 제공한다.

상기 프라이머와 프로브는 참홍어 미토콘드리아 COI 유전자에 특이적인 것이 특징이다.

상기 프로브 5' 말단은 리포터인 FAM 으로 표지되어 있고, 상기 프로브 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹인 MGB로 표지되어 있는 것이 특징이다.

본 발명은 시료 DNA를 주형으로 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열의 프라이머 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 참홍어 동정 방법을 제공한다.

상기 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)은 분리된 시료로부터 DNA를 얻는 단계; 서열번호 1 및 2로 기재되는 염기서열의 프라이머와, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열의 프로브를 이용하여 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 프로브에서 방출하는 형광을 감지하는 단계를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머_프로브 세트를 포함하는 참홍어 동정용 키트를 제공한다.

본 발명은 참홍어를 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 참홍어 동정용 프라이머_프로브 세트, 이를 포함하는 참홍어 동정용 키트 및 이를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용하는 참홍어 동정 방법을 제공한다. 상기 방법에 의하면 검사가 간편하고 정확하며 빠르고, 적은 비용으로 효율적으로 참홍어를 동정할 수 있는 수단을 제공할 수 있다.

도 1은 종이 불분명한 27개의 상업용 식품시료를 표1의 세가지 프라이머 세트에 의해 COI 유전자 일부를 증폭 시킨 후 증폭 시킨 산물의 QIAxcel gel 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 참홍어 종만 동정할 수 있는 프라이머 및 프로브 염기서열과 가장 유사한 22종 염기서열을 나타낸 도면이다. 박스는 본 발명의 프라이머-프로브 세트의 위치를 보여준다.
도 3은 참홍어와 다른 종의 실시간 중합효소연쇄반응 증폭패턴을 본 도면이다.
(A) 참홍어 증폭 패턴
(B) (a)참홍어 증폭 패턴
(b) 3번 샘플 증폭 패턴
(C) 11번 샘플 증폭 패턴
(D)참홍어 외 나머지 25개 샘플 증폭 패턴

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 참홍어 동정용 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머_프로브 세트에 관한 것이다.

본 발명의 프라이머_프로브 세트의 염기서열은 참홍어 종내에서 뉴클레오티드 간 차이가 없으며, 다른 종과는 차이점을 보이는 특정 변이를 포함하여 참홍어 종의 미토콘드리아 COI 염기서열을 특이적으로 분석하는 분석능을 가진다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 통한 참홍어 동정 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 참홍어 동정용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 동정방법은 보다 상세하게는 분리된 시료로부터 DNA를 얻는 단계, 상기 DNA에 대해 미토콘드리아 COI 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계 및 프로브에서 방출하는 형광을 감지하는 단계를 포함하는 참홍어 동정 방법에 관한 것이다.

본 발명의 동정방법으로 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)은 특별하게 한정되지 않고, 공지인 여러 개량방법 중 하나일 수 있다. 일 예로, 프라이머 세트, DNA 주형 이외에 Tris-HCl, KC1, MgCl₂, dNTP, 및 TaqDNA 폴리머라아제 등의 시약류를 혼합해서 RT-PCR 용액으로 한다.

또한, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 참홍어 동정용 키트는 PCR에 의한 동정방법에 활용이 가능하며, 구체적으로 이에 포함되는 시약은 dNTP, MgCl₂, Taq polymerase, Tris-HC1, 글리세롤, DMSO, 포지티브 컨트롤용 DNA, 네거티브 컨트롤용 DNA, 증류수 등을 들 수 있다. 상기 시약은 키트에 각각 독립으로 포장되어 제공되거나, 2종 이상의 시약이 혼합된 형태로 제공될 수 있으며, 키트에 포함된 각각의 시약 농도에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하는데 대해서 가능한 범위일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에는, 바람직한 RT-PCR 조건에 대한 정보만이 첨부되어도 좋고, 프라이머 세트만을 포함할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

시료 수집 및 DNA 추출

참홍어 종의 꼬리 조직 시료를 한국의 연안에서 포획된 29마리의 야생 참홍어 종에서 분리하였다. 주로 발효된 물고기로 구성된, 종을 확실히 알 수 없는 상업용 식품시료들은 서울과 전라도 지방의 슈퍼마켓에서 얻었다. 이 조직들은 100% 에탄올(ethanol)에서 보존 한 후 DNA 추출을 위해 실험실로 운반하였다. 조직의 약 0.2 g을 DNA 추출을 위해 각각 사용하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA microkit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여, 지시에 따라 각각의 시료로부터 분리하였다. 추출된 DNA는 Nanodrop ND-1000 분광 광도계(spectrophotometer) (Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA)를 사용하여 정량하였고, -20 ℃에 저장하였다.

PCR 분석 및 DNA 염기서열분석

1. 실험방법

모든 시료의 미토콘드리아 COI 유전자의 DNA 단편을 표 1에 나타낸 세 쌍의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭은 10 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ Gold ST*R 10x buffer(Promega, Madison, WI, USA), 2.5 U AmpliTaq Gold® DNA polymerase(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 각각의 프라이머 1.0 μM를 포함하는 25㎕ 용액에서 수행되었다. 열 사이클링(thermal cycling)은 GeneAmp® PCR System 9700(Applied Biosystems)에서 실시하였다. 반응 조건은 95℃에서 11분 동안 변성을 하고, 94℃에서 1분 동안 세 쌍의 프라이머들에 대해서 각각 58, 54 및 52℃에서 1분 동안 풀림을 30 사이클 반복해서 시행하며, 마지막으로 72℃에서 7분 동안 연장하였다. 증폭된 PCR 산물들은 QX Size 50-800 base pair(bp), 15bp/1000bp alignment Marker(Qiagen), gel polymers로 채워진 12 모세관(capillaries)의 집합체(array)로 구성된 QX 카트리지(cartridges)를 이용한 QIAxcel Advanced system(Qiagen)에 의해 분석되어졌다.

시퀀싱 반응(sequencing reactions)은 BigDye Terminatior v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 지시에 따라 수행되었다. 시퀀싱은 3500xL 유전자 분석기(Genetic Analyzer, Applied Biosystems)를 이용한 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis)에 의해 실험하였다.

원시 데이터(Raw data)는 Sequence Analysis software v.5.4(Applied Biosystems)에 의해 분석하였다. 염기서열은 Molecular Evolutionary Genetics Analysis(Mega) Version 5.1 소프트웨어에 의해 분석하였고, 그 결과들은 NCBI(National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland; ) GenBank 데어타베이스의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 종(species)을 확인하였다.

2. 실험결과

본 발명은 홍어와 가오리 종들 사이에서 참홍어를 신속, 정확하게 구분하기 위해 미토콘드리아 COI 염기서열들을 조사하여 특이한 참홍어 COI 염기서열을 찾았고, 그 염기서열을 기반으로 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 개발하였다. 본 발명에서 제시한 방법이 개발되기 전까지는 일반적인 PCR을 시행한 후에 PCR 증폭산물에 대한 염기서열을 분석하는 방법을 통하여 종의 확인을 수행하였다. 이전의 방법에 따라 29개체의 참홍어 종과 27개의 종이 불분명한 식품시료의 DNA를 추출하였고, 표 1에 묘사된 세 가지의 프라이머 세트에 의해 성공적으로 증폭하였다.

Description of the primers used in PCR amplification of B. pulchra and unknown commercial samples.
PCR Round	Primer name	Sequences (5 3)	Position ^a	Expected size (bp)
First	BPCOI-F1	GTGCCTGAGCAGGTATGGT	21-39	600
First	BPCOI-R1	CCGGGTCAAAGAAAGTTGTG	601-620	600
Second	BPCOI-F2	ATAATGTCATTGTTACAGCCCA	114-135	507
Second	BPCOI-R1	CCGGGTCAAAGAAAGTTGTG	601-620	507
Third	BPCOI-F1	GTGCCTGAGCAGGTATGGT	21-39	439
Third	BPCOI-R2	ATAATTGTGGTGATGAAGTTAAT	437-459	439
Position ^a is defined according to the sequence of the Beringraja pulchra (GenBank accession number EU327184).

프라이머들은 참홍어(GenBank accession number EU327184)종의 COI 유전자의 일부 염기서열을 기반으로 설계하였다. 증폭된 산물은 QIAxcel 시스템으로 분석하였고, 그 결과 도 1에서 보는 바와 같이, 각각 약 600 bp(base pair), 507 bp와 439 bp 크기를 보였으며, 증폭에 사용된 프라이머들을 이용하여 염기서열분석을 하였다. 시료들의 종을 확인하기 위해, 모든 시료에서 얻어진 COI 유전자의 단편(fragment)에 대해서 GenBank BLAST를 이용하여 서열 유사성 검색(sequence similarity searche)을 시행하였다. 표 2에서 보여진 것과 같이 종을 알 수 없는 27개 식품 시료의 GenBank 데이터베이스 검색 결과는 Dipturus chilensis(N = 14) (N = number, 시료 개수), Bathyraja brachyurops(N = 7), Dipturus laevis(N = 2), Beringraja pulchra(N = 2), Rajiforms sp.(N = 1) 및 Bathyraja albomaculata (N = 1)에 99%-100%의 동일성을 가지는 것으로 확인 할 수 있었다. 그 결과로 보았을 때 단지 2개의 식품시료(3번, 11번)만이 참홍어 종으로 확인되었으며, 비율상으로는 검사한 식품 시료의 7.4 %였다. 27개의 식품시료 중에 상대적으로 높은 비율을 보인 종은 D. chilensis(52%)와 B. brachyurops(26%)였다. 이 2가지 종들은 세계 자연 보존 연맹(International Union for the Conservation of Nature, IUCN) (www.iucnredlist.org.)의 취약 종 리스트(red list)에 따르면 남서 대서양과 남서 태평양 지역(Atlantic-southwest, Pacific-southwest area)에 걸쳐 광범위하게 분포되어 있는 것으로 알려져 있다.

The results of nucleotide database search of 27 unknown commercial samples using BLAST.
Number of Sample	Species	Identity	GenBank accession number
14	Dipturus chilensis	99-100 %	EU074400.1, EU074401.1, EU074403.1, EU074404.1
7	Bathyraja brachyurops	99-100 %	EU074333.1
2	Dipturus laevis	100 %	JF895055.1, JF895059.1
2	Beringraja pulchra	100 %	EU327177.1
1	Rajiforms sp. BOLD:AAB4961	99 %	JX033998.1
1	Bathyraja albomaculata	100 %	EU074331.1

실시예 1: 프라이머(primer) 및 프로브(probe)의 고안

국립수사과학원(National Fisheries Research and Development Institute, NFRDI)에서 제공을 받은 참홍어 종과 마트에서 수거한 종이 불분명한 식품에서 종의 식별은 표 1에 제시된 것과 같이 참홍어(GenBank accession number EU327184.1)의 미토콘드리아 COI 유전자를 기반으로 제작된 프라이머를 사용하여 수행하였다.

Real-time PCR에 사용하는 프라이머와 프로브 서열은 동일 종내에서 뉴클레오티드 간 차이가 없어야 하며, 다른 종과는 차이점을 보이는 특정 변이를 포함해야 한다. 이러한 두 가지 조건을 충족하는 염기 서열 영역은 29 개체의 참홍어 종과 NCBI에 보고된 157개 홍어와 가오리 종들의 미토콘드리아 내의 12S rRNA, cytochrome b 및 COI 유전자 염기서열을 비교, 분석하여 식별에 적합한 부위를 찾았다. 모든 시료에서 얻어진 미토콘드리아 COI 부분 염기서열은 NCBI BLAST를 사용하여 GenBank에 등록된 자료들을 검색 및 비교 할 수 있었다. GenBank에 보고되어 있는 157개 홍어와 가오리 종들의 COI 염기서열을 다운로드(download) 하였고, MEGA 프로그램의 Clustal W 기능을 이용하여 참홍어 종의 COI 염기서열과 비교 한 후에 특정한 MGB TaqMan primer-probe system을 설계하기 위한 적당한 단편을 선정하였다. 참홍어 종만 동정 할 수 있는 프라이머 및 프로브 염기서열과 가장 유사한 22종의 염기서열은 도 2에 나타내었다.

참홍어 종을 식별할 수 있는 이 시스템은 59 bp의 염기서열로 구성되어 있으며, 프라이머 및 프로브 세트의 염기서열에 대한 적합성 및 오류 가능성을 살펴보기 위하여 Primer Express 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 디자인을 진행하였다. 이 프로그램을 이용해서 프로브와 프라이머 상에 여러 개의 SNP 좌위의 차이로 인해 100% 일치하는 염기서열이 아닐 경우에는 풀림(annealing)이 되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 그로인해 참홍어 종의 분석에 대한 특이도를 높일 수 있었다.

본 연구에서 제작된 프라이머-프로브 세트의 서열은 아래와 같다.

BPCOIRT-F (forward ; 서열번호 1) : 5' GGGCCGGAACAGGTTGA - 3'

BPCOIRT-R (reverse ; 서열번호 2) : 5' CCCAGCGTGGGCTATATTTC - 3'

BPCORT-P (probe ; 서열번호 3) : 5' CTGTGTACCCCCCCTT - 3'

프로브는 5' 말단(end)에 형광 색소인 FAM, 3' 말단에 Minor Groove Binding(MGB)으로 표지(labeling) 되었다.

실시예 2: Real-time PCR 시스템 설정

1. 실험방법

Real-time PCR 분석은 MicroAmp 광학 접착제 막(optical adhesive film) (Applied Biosystems)으로 덮여, MicroAmp 고속 광학 마이크로 암페어 96-웰 반응 플레이트(fast optical 96-well reaction plate) (Applied Biosystems)에서 25 ㎕의 총 부피로 수행하였다. 실험은 자연에 존재하지 않는 합성 염기서열(synthetic sequence)인 내부 양성 대조군(Internal Positive Control, IPC) (Applied Biosystems)에 대한 프로브에서 방출하는 VIC 형광과 COI 유전자에 대한 프로브에서 방출하는 FAM 형광을 감지하는 것에 의해 조사되었다. 각 반응은 10ng의 DNA, 12.5 ㎕의 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix no UNG Amperase(2X) 및 최종 900 nM 의 프라이머와 225 nM의 프로브 농도를 함유하였다. TaqMan 반응은 7500 PCR System(Applied Biosystems)에서 운영되었고, 열 사이클(thermal cycling) 조건은 95℃에서 10분 동안 수행한 후 다음 95℃에서 15초와 60℃에서 15초의 40 사이클로 반응 시켰다. 플레이트로부터 방출된 형광 데이터(fluorescence data)는 7500 system SDS software v1.3.0에 의해 분석되었다. DNA 시료의 증폭에 대한 저해 여부를 확인하기 위하여 음성 대조군(negative control)과 양성 대조군(positive control)이 포함되었다. 각각의 Ct 값은 세 번씩 수행해서 나온 수치의 평균값을 구했다. 참홍어의 시료들에서 구한 평균 Ct 값은 종이 불분명한 상업용 식품시료들과 비교하였다.

2. 실험결과

프라이머와 TaqMan 프로브의 최적 농도를 결정하기 위해 프라이머(50, 300 및 900 nM) 및 프로브(25-225 nM)의 다양한 농도를 사용하여 예비 시험을 하였다. 참홍어의 식별은 가장 낮은 역치값(Cycle threshold, Ct value)과 가장 높은 형광값(fluorescence value)을 내는 900 nM의 프라이머와 225 nM의 프로브 최종 농도를 사용하는 것으로 수행되었다.

개발된 방법의 효율은 RT-PCR을 위한 주형(template)으로서 다양한 양의 DNA(0.1 pg - 100 ng)를 사용하는 것에 의해 얻어진 표준 곡선의 기울기에 기초하여 산출 하였고, 얻어진 기울기의 평균값은 - 3.32였다. 이 기울기로부터, 증폭 효율은 100% 가까운 효율을 내는 식인 E = [10 ^(-1/-slope)-1] X 100을 사용하여 계산하였다. Ct 값과 증폭 효율은 참홍어 종을 식별하는 RT-PCR 시스템의 유용성을 입증하였다. 개발된 RT-PCR 분석의 동정 한계를 보이는 대상 DNA의 양은 최소 1 pg이였다. 도 3은 이 시스템의 특이성(specificity)과 교차 반응(cross-reactivity)이 29개의 참홍어 표본시료와 27개의 종을 알 수 없는 상업용 식품시료를 가지고 시험하였음을 보여준다.

참홍어 종과 식품 시료번호 3, 11에서 얻은 평균 Ct 값은 각각 19.1 ± 0.1, 19.1 ± 0.0 및 26.7 ± 0.1이었고, 나머지는 37.5 ± 0.3(동정되지 않은 시료의 Ct 값은 40으로 주어짐.)의 평균 Ct 값을 보였다(도 3A). 도 3B에서 보여진 것과 같이 상업용 식품시료 11번의 경우에는 시퀀싱에 의해 참홍어 종으로 확인이 되었음에도 불구하고 29개의 참홍어 표본시료와 상업용 식품 시료 3번에 비해서 높은 Ct 값을 보였다. IPC(Internal Positive Control) 테스트는 모든 DNA 시료와 함께 수행되었고, RT-PCR 반응상의 문제점이나 추출된 DNA 시료 안에 RT-PCR 억제 물질(inhibitor)은 관찰되지 않았다. RT-PCR 결과와 같이 도 1에서 보여진 일반적인 PCR상에서도 상업용 식품시료 11번이 참홍어 표본시료나 상업용 식품 시료 3번에 의해 훨씬 덜 증폭이 되는 것을 확인 할 수 있었다. 식품 시료 11 번에서 비교적 높은 Ct 값을 보이는 것은 아마도 개체나 조직간의 차이 또는 발효나 유통과정 사이에 추가된 화학물질이나 온도 상승으로 인한 미토콘드리아의 적은 사본(copy) 수로 인해서 발생한 것으로 사료된다.

실시예 3: Real-time PCR 분석법을 이용한 참홍어 종의 식별

표 2에 보여진 것과 같이 법과학 염기서열분석 정보(FINS, Forensically Informative Nucleotide Sequencing)에 의해 식별된 27개의 종이 모호하게 표지된 상업용 식품시료와 29개의 참홍어 표본시료가 본 연구에서 개발된 RT-PCR 분석법의 검증에 사용되었다. RT-PCR 결과는 FINS에 의해 얻어진 결과와 일치하였다. 29개의 참홍어 표본 시료에서 얻어진 평균 Ct 값은 19.1 ± 0.1이었고, 상업용 식품시료 27개 중 FINS에 참홍어 종으로 확인된 2개(시료 번호 3, 11)의 시료의 평균 Ct 값은 각각 19.1 ± 0.0과 26.7 ± 0.1이었다. 다른 참홍어 종보다 상업용 식품시료 11의 높은 Ct 값은 세포 내 미토콘드리아 DNA의 양적인 차이에 의해 생긴 결과이다.

본 발명은 참홍어 종의 미토콘드리아 COI 염기서열을 특이적으로 분석하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)방법을 이용하여 신속하고, 신뢰성 있게 Beringraja pulchra 종을 식별하는 방법을 처음으로 제시한다. 이 방법은 증가하고 있는 참홍어 종 관련 식품의 오기 표지나 불분명한 표지와 같은 식품 범죄에 대해서 효과적으로 대처할 수 있는 경제적으로 유용한 기술이다. 특히, TaqMan 기술에 기반한 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)방법은 식품으로서 가장 가치 있고, 선호하는 어류 종 중의 하나인 참홍어 종을 다양한 홍어와 가오리 종들 사이에서 구분할 수 있는 유전자적인 식별력을 제공한다. 앞으로 이 방법이 참홍어 종의 식별을 위해 주로 사용된다면 참홍어 종을 다른 홍어와 가오리 종으로 대체해서 판매하는 식품사기 등을 방지하고, 식품 표지 규정의 준수에 기여하며, 궁극적으로 소비자들의 권리를 보호하는데 이바지 할 것으로 사료된다.

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 참홍어 동정용 프라이머-프로브 세트.
청구항 1에 있어서,
상기 프라이머와 프로브는 참홍어 미토콘드리아 COI 유전자에 특이적인 참홍어 동정용 프라이머-프로브 세트.
청구항 1에 있어서,
상기 프로브는 5' 말단에 리포터인 FAM 으로 표지되어 있고, 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹인 MGB로 표지되어 있는 참홍어 동정용 프라이머-프로브 세트.
시료 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열의 프라이머 세트와 서열번호 3으로 기재되는 염기서열의 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 참홍어 동정 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)은 분리된 시료로부터 DNA를 얻는 단계; 서열번호 1 및 2로 기재되는 염기서열의 프라이머와, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열의 프로브를 이용하여 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 프로브에서 방출하는 형광을 감지하는 단계를 포함하는 참홍어 동정 방법.
서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 참홍어 동정용 키트.