KR20170027338A

KR20170027338A - 암세포를 치료하기 위한 조성물 및 그 방법

Info

Publication number: KR20170027338A
Application number: KR1020177002426A
Authority: KR
Inventors: 카림 에사니; 데이비드 정; 스티븐 제이. 콘래드
Original assignee: 웨스턴 미시간 유니버시티 리서치 파운데이션
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2017-03-09
Also published as: CN106794208B; CA3050095A1; EP3169342A4; CN110267671A; CN106794208A; WO2018136491A1; AU2015289512A1; WO2016011336A1; CA2953072C; US20200114024A1; CA2953072A1; JP2017526633A; JP2020504146A; AU2015289512B2; PH12017500109A1; KR101949849B1; EP3169342A1; US20170165378A1; EP3570859A1; US10434189B2

Abstract

면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물은 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 돌연변이는 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시킨다. 또 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이는 바이러스에 의해 티미딘 키나아제("TK")의 발현을 억제시킨다. 또 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이는 바이러스를 박테리아 플라젤린을 발현시키기 위해 이식 유전자로 무장된다. 돌연변이는 단독 또는 조합으로 존재될 수 있다. 추가 양태는 본원에 기재된 바와 같이 조성물을 사용하여 암세포를 치료하는 방법, 및 적어도 하나의 유전자를 대상의 암세포에 전달하는 방법을 포함한다.

Description

암세포를 치료하기 위한 조성물 및 그 방법{COMPOSITION FOR TREATING CANCEROUS CELLS AND A METHOD THEREFOR}

본 발명은 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

본원에 기재된 암 종양을 치료하기 위한 약제 조성물 및 방법은 종래의 치료방법으로 익숙해질 수 있고, 몇몇 경우에 있어서 종래 치료방법과 조합해서 사용될 수 있는 심각한 감염 또는 부작용의 제한된 리스크로 암세포의 잠재적으로 효과적인 치료를 고려한다. 본원에 기재된 변형된 폭스바이러스는 변형되지 않은 폭스바이러스와 비교해서 증가된 종양 선택성 및 증가된 종양 치사율을 나타내는 결과를 나타내 왔고, 감염된 대상에게 가볍고 자기-제한적인 열병만을 야기하는 것과 같이 바람직한 OV 특징을 유지할 것으로 기대된다.

본 장치의 이들 및 다른 특성, 이점, 및 목적은 하기 명세서, 청구항, 및 첨부된 도면을 연구할 때 당업자에 의해 추가로 이해되고 인식될 것이다.

본 발명의 일 양태는 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물이다. 조성물은 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함한다. 적어도 하나의 돌연변이는 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시킨다.

본 발명의 또 다른 양태는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하는 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물이고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 티미딘 키나아제("TK")의 발현을 억제시킨다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물은 박테리아 플라젤린을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 폭스바이러스를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 암세포를 가진 대상의 치료방법은 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의해서, 적어도 하나의 유전자는 MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위해 바이러스를 돌연변이화 함으로써 야타폭스바이러스 속 바이러스를 변형시킴으로써 대상의 암세포에 전달된다. 또한, 바이러스는 바이러스의 적어도 하나의 유전자를 인코딩함으로써 변형되고, 상기 바이러스의 인코딩된 적어도 하나의 유전자는 암세포의 아폽토시스를 증가시키거나 대상의 면역 반응을 활성화시킨다. 변형된 바이러스는 대상에 투여된다.

도 1은 발현된 이식 유전자 및 형광성 리포터를 삽입하기 위해 p2KO 방법으로 대체된 대로 재조합 타나폭스바이러스(TPV)의 일 실시형태를 도시하는 회로도이다.
도 2a는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액으로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2b는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV/egfp)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2c는 HTC 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ66R/mMCP-1)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2d는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ66R/mGM-CSF)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2e는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ66R/fliC)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2f는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ66R)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2g는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ2L)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 2h는 HCT 116 세포로 이종 이식되고 비히클-전용 대조 용액과 비교해서 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC)의 일 실시형태로 치료된 가슴샘 없는 마우스에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 3은 형광성 리포터를 발현하기 위해 대체되어 온 재조합 TPV의 일 실시형태의 감염으로 생성되는 2일, 4일, 및 6일에서의 바이러스 플라크의 일 실시형태의 도면을 포함한다.

본원에 설명의 목적을 위해서, 용어 "상부," "하부," "우," "좌," "후," "전," "수직," "수평," 및 그 유도체는 도 1에서 배향된 대로 조성물에 관한 것이다. 그러나, 조성물이 다양한 대체적인 배향을 취할 수 있고 방법은 달리 명시적으로 특정된 경우를 제외하고 다양한 단계 서열을 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 첨부된 도면에 도시되고, 하기 명세서에 기재된 특정 장치 및 과정은 첨부된 청구항으로 정의되는 발명 개념의 단순한 예시 실시형태인 것을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 개시된 실시형태와 관련된 특정 규모 및 다른 물리적 특징은 청구항을 달리 명시적으로 기재하지 않는 한, 제한적으로 간주되지 않아야 한다.

암 및/또는 변형된 세포의 감염에 대한 몇몇 선호가 VACA와 같은 몇몇 바이러스의 종양 세포 붕괴성의 변종으로 나타내어 왔지만, 타나폭스바이러스("TPV")를 제한없이 포함하는 야타폭스바이러스 속의 것과 같은 야생형 폭스바이러스는 일반적으로 고도의 본래 종양 특이성을 갖는 것으로 고려되지 않는다. 상당한 본래 종양 특이성이 없는 바이러스에 있어서, 암세포의 선택성을 증가시키기 위해서 유전 공학을 채용해 왔다.

그들은 필수적으로 고도의 본래 종양 특이성을 갖는 것은 아니지만, 폭스바이러스, 및 보다 구체적으로 야타폭스바이러스 속 폭스바이러스는 OV로서 사용되기 위해 변형에 매우 적합한 여러 고유의 성질을 갖는다. 폭스바이러스는 다량의 첨가 유전 물질을 수용할 수 있는 바이러스 게놈을 갖고, 공격과 방어 능력이 내장되어 있다. 폭스바이러스 게놈은 숙주 면역 감시, 몇몇 숙주 면역 및 염증 반응의 억제 및 회피, 그리고 숙주 사이토카인과 사이토카인 수용체를 모방하는 바이러스로 인코딩된 펩티드를 사용하여 세포 외 환경에서의 신호 혼란으로부터 감염과 관련된 세포면 에피토프를 숨기기 위해 기여되는 다양한 면역 조절 단백질을 인코딩한다. 또한, 폭스바이러스는 성숙한 비리온(MV)형과 피막 비리온(EV)형의 자손 비리온의 2가지 별개의 타입을 생성한다. 바이러스의 MV형은 단일 지질 이중층으로 둘러싸여 있고 세포 용해만으로 숙주 세포로부터 방출된다. EV형은 아마도 숙주 세포의 후기골지망으로부터 제 2, 외피막을 획득한 후 숙주 세포로부터 능동적으로 내보내지고, 감염된 세포로부터 내보내질 때까지는 포장된 비리온(WV)이라 불리며, 그 후에 그것을 EV형이라 부른다. 폭스바이러스 EV형은 혈류 및 림프관망을 통해 수송됨으로써 폭스바이러스를 숙주 내에서 멀리 떨어진 위치로 분산시키는 바이러스의 특수형이다. EV형은 세포 외 환경에 노출된 6개의 막관통 단백질 vs. MV형에 대해서 약 20개만을 가지고 있기 때문에, 이 과제에 매우 적합하다. 소수 노출된 에피토프는 EV형이 MV형보다 중화 면역을 더 피할 수 있음을 의미한다.

또한, OV를 개발하기 위해 야타폭스바이러스 속의 바람직한 부재가 되는 TPV, 야타폭스바이러스 속의 부재 및 야생 폭스바이러스는 OV를 개발할 때 이로운 추가적인 특성을 갖는다. 아마도 TPV 감염이 정상적으로 신체의 주변 부위에 국한되기 때문에, TPV로 감염된 인간은 가볍고 자기 제한적인 열병만을 경험하게 된다. 적도 아프리카의 지역(그것이 풍토병인 경우)을 제외하고, 인간은 TPV에 대하여 면역학적으로 무관하다. 또한, OV의 매우 바람직한 안전한 특성인 TPV는 사람에서 사람으로 전염되는 것이 관찰된 적이 없다.

야타폭스바이러스 속의 표본을 포함하는 유전적으로 조작된 폭스바이러스의 표본은 암세포를 치료하기 위한 조성물에 포함되고, 암세포의 치료방법에 사용되어지도록 OV로서 사용되기 위해 본원에서 개시된다. 또한, 재조합 TPV를 포함하는 여러 바람직한 실시형태를 포함하는 여러 바람직한 실시형태가 본원에 기재된다.

요약해서, 추가로 후술되는 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물이다. 일 양태에 있어서, 조성물은 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함한다. 적어도 하나의 돌연변이는 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시킨다. 본 발명의 또 다른 양태는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하는 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물이고, 상기 바이러스는 티미딘 키나아제("TK")의 발현을 억제시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 또 다른 양태에 있어서, 조성물은 박테리아의 플라젤린을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 폭스바이러스를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 인간 및 동물 대상을 포함하고, 바람직하게는 포유동물 대상이다.

또한, 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 암세포를 갖는 대상의 치료방법은 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같다. 예를 들면, 일 실시형태에 있어서, 조성물은 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조성물은 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하고, 상기 바이러스는 TK의 발현을 억제시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조성물은 박테리아 플라젤린을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 폭스바이러스를 포함한다. 이들 돌연변이 중 여하 또는 모두는 조성물 내에 단독으로 또는 여하의 조합으로 존재할 수 있다. 또한, 조성물은 암세포의 군에 타겟되는 방식으로 전달될 수 있거나, 대상 온몸에 전달될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 의해서, 보다 상세하게 후술되는 바와 같이, 적어도 하나의 유전자는 MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위해 바이러스를 돌연변이화 함으로써 야타폭스바이러스 속 바이러스를 변형시킴으로써 대상의 암세포에 전달된다. 또한, 바이러스는 바이러스의 적어도 하나의 유전자를 인코딩함으로써 변형되고, 상기 바이러스의 인코딩된 적어도 하나의 유전자는 암세포의 아폽토시스 증가시키거나 대상의 면역 반응을 활성화시킨다. 변형된 바이러스는 대상에게 투여된다.

소정 실시형태에 있어서, 폭스바이러스는 TNF 결합 활성을 가진 숙주 범위 인자의 발현을 억제시키기 위해 유전적으로 변형되고, 본원에서 TNF 결합 단백질이라 불린다. 억제된 TNF 결합 단백질은 MHC-1 중쇄 단백질과 구조가 유사하고, 인코딩된 TNF 결합 단백질은 NHC-1 경쇄와 상호작용할 수 있다. TPV에 있어서, TNF 결합 단백질은 2L 유전자로 인코딩된다. 2L 유전자가 절제되거나 달리 TNF 결합 단백질의 발현을 억제하기 위해 돌연변이화 되는 재조합 TPV는 때때로 본원에서 "2L 제거" 또는 "Δ2L"라 불린다. 정상적인 폭스바이러스 감염에 있어서, 분비된 TNF 결합 단백질은 감염된 세포와 상호 작용하기 위해 결합하고 TNF 존재량을 효과적으로 감소시킴으로써 숙주 염증 및 항바이러스 면역 반응을 둔화시키는 역할을 한다. 이것은 폭스바이러스를 위해서는 바람직한 결과이지만, 폭스바이러스가 OV로서 사용될 경우에는 치료된 종양에 의해 경험하는 염증의 양을 감소시키는 것보다 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 종양이 폭스바이러스로서 재조합 TPV에 근거하여 OV로 치료된 인간 대상에 있어서, 재조합 TPV의 2L 유전자의 절제는 종양 부위에서의 TNF 농도가 효과적으로 증가될 수 있다(2L을 함유하는 TPV로 감염된 종양과 비교). TNF의 증가된 레벨은 궁극적으로 종양 제거를 증가시키는 역할을 할 수 있다. 2L 유전자가 이전에 마우스 TNF가 아니라 인간 TNF와 결합하는 것으로 나타났기 때문에, 본원에 기재되는 재조합 TPV 중 일부에서 2L 유전자의 절제가 마우스 실험 중에 종양 제거에 있어서 중요한 인자가 될 것으로 기대되진 않지만, 영장류 및 인간의 종양 제거에서는 보다 중요한 인자가 될 것으로 기대된다. 마우스 시험이 암 바이오테라피의 보다 관련된 영장류 모델에서 폭스바이러스계 OV의 추가 시험을 향해서 중요한 단계이기 때문에, 2L 유전자의 절제는 본원에 기재된 바와 같이 이종 이식이 인간 암세포로 구성된 이종 이식된 가슴샘 없는 마우스에서 사용된 재조합 TPV의 구체예로 수행되었다.

소정 실시형태에 있어서, 폭스바이러스의 종양 선택성은 티미딘 키나아제(TK)의 발현을 억제시키기 위해서 폭스바이러스를 변형시킴으로써 증가된다. TPV에 있어서, TK 인코딩 유전자는 66R로서 알려져 있다. 66R 유전자가 TK의 발현을 억제시키기 위해 절제되거나 달리 돌연변이화 된 재조합 TPV를 때때로 본원에서 "66R 제거된" 또는 "Δ66R"이라 부른다. 신생 세포의 TK 활성은 암세포에서 세포 TK1의 작용으로 인해 본질적으로 높다. 이것은 TK 활성 레벨이 세포 사이클의 S단계 중에 최고조에 달하고 다른 때에는 거의 감지되지 않는 정상 세포와 대조적이다. 세포 TK1은 뉴클레오티드 합성, 티미딘에서 티미딘 1인산염으로의 변환 단계를 촉매 작용한다. 이런 이유로 인해, 암세포는 세포 사이클 내내 TK1을 발현하고, 결과적으로 세포 사이클의 모든 단계에서 이용 가능한 티미딘 1인산염의 큰 세포질 풀을 가지는 경향이 있다. TK 인코딩 유전자, 특히 야타폭스바이러스 속 폭스바이러스를 억제시킴으로써, 폭스바이러스는 TK 인코딩 유전자가 온전한 경우보다 암세포의 선택성이 높다. 마우스가 TPV에 대해 정상적인 동물 숙주가 아니더라도, 본원에 기재된 이종 이식된 가슴샘 없는 마우스에서 사용된 재조합 TPV의 몇몇 구체예로 66R 유전자의 절제가 수행된다. 66R 유전자의 절제가 허용 세포(인간 암 종양 세포와 같은)에서 비복제 TPV를 야기하지 않았다는 것을 이 환경에서의 66R 유전자의 절제가 증명한다.

또한, 폭스바이러스의 종양 치사율은 암세포의 아폽토시스를 증가시키거나 대상의 면역 시스템을 활성화시키기 위해 이식 유전자와 함께 폭스바이러스를 인코딩함으로써 증가될 수 있다. 폭스바이러스를 인코딩하는데 사용될 수 있는 이식 유전자의 예로는 사이토카인, 케모카인, 항원 제공 폴리펩티드, 또는 박테리아 항원을 발현하기 위한 유전자를 제한 없이 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 사이토카인은 면역 세포를 자극, 면역 세포의 성장을 촉진, 또는 특정 부위로 면역 세포를 유도하는 것과 같이, 면역 세포 또는 시스템 조절 효과를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 소정 바람직한 실시형태에 있어서, 사용된 폭스바이러스는 과립구 단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포화학주성 단백질 1(CCL2, 또한 MCP-1 및 MCF-1이라 불림), 또는 박테리아 플라젤린(FliC, 살모넬라 엔테리카의 fliC 유전자 생성)을 갖추고 있는, 재조합 TPV이다. 마우스와 함께 사용되는 재조합 TPV로 실험할 경우, 이들 이식 유전자의 마우스(m) 버전은 재조합 TPV, 즉 mGM-CSF, mCCL2, mMCP1, mMCF-1과 관련하여 사용된다. 시험 또는 치료가 행해지게 될 때 대상에게 이들 이식 유전자의 적절하거나 효과적인 버전을 사용하는 것이 바람직하다.

중합된 플라젤린은 본 발명에 의해 사용되는 박테리아 편모의 주성분이다. 본원에 기재된 특정 실험에서 사용되는 플라젤린은 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨 유전자의 생성물, fliC이다. FliC 및 다른 박테리아 플라젤린은 톨형 수용체 5(TLR5)의 동족 리간드이고, MyD88-의존적인 세포 내 신호화 및, 궁극적으로 전사 인자 NFkB의 활성을 통해 포유동물 세포에서 타고난 면역 반응의 강한 활성제이다. 플라젤린은 박테리아 발병의 다른 중요한 역할을 갖는 강력하고 다발성 독성 인자이다.

상술한 폭스바이러스 실시형태에 있어서 게놈의 변형 이외에, 형광성 리포터 이식 유전자는 폭스바이러스의 게놈에 선택적으로 삽입된다. 배양 세포 내에 바이러스 감염의 가시화는 형광성 리포터 이식 유전자의 포함에 의해 크게 촉진됨으로써, 본원에 기재된 폭스바이러스 변종을 사용하는 연구를 용이하게 한다. 바람직한 형광성 리포터 이식 유전자는 리포터 mCherry(여기/방출 587 ㎚/610 ㎚) 및 개선된 그린 형광성 단백질(GFP, 여기/방출 475 ㎚/509 ㎚)을 포함한다.

폭스바이러스의 바람직한 실시형태는 상술된 돌연변이 또는 삽입물 중 여하 또는 모두를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하는 것이 바람직하고, 돌연변이 및 삽입물은 p2KO 벡터법을 사용하여 행해지는 것이 바람직하다. 바람직한 일 실시형태에 있어서, 재조합 TPV, 야타폭스바이러스 속 부재는 본원에서 사용된 바와 같이 p2KO법으로 대체되고, 그 도식을 도 1에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 2개의 우두 바이러스(VACV)가 유래된 초기/후기 합성 프로모터는 바이러스를 인코딩하기 위해 바람직한 발현 이식 유전자(예를 들면, mGM-CSF, mCCL2, mMCP1, mMCF-1, fliC) 및 선택적 형광성 리포터 이식 유전자의 발현을 유도하는데 사용된다. 도 1에 도시된 p2KO 벡터법의 실시형태는 p2KO 발현 카세트(좌 및 우 플랭크, 발현된 이식 유전자 또는 형광성 리포터 이식 유전자를 포함하는 적어도 하나의 개재 개방 판독 프레임(ORF), 및 적어도 하나의 프로모터를 포함)를 보다 상세하게 후술하는 바와 같이 트렌스펙션/감염 과정 동안 상동 재조합 이중 크로스오버 사건을 통해 TPV의 바이러스 게놈으로 전이시키는 것을 포함한다. 이런 식으로, p2KO 발현 카세트는 바이러스 게놈의 플랭크 서열의 사용으로 TPV의 바이러스 게놈의 특정 점으로 안내되어 재조합 TPV의 바람직한 발현 이식 유전자 및 선택적 형광성 리포터 이식 유전자의 동시 발현과 함께 바람직한 유전자의 타겟화된 절제를 야기한다.

도 1에 도시된 바와 같이, TPV p2KO 발현 카세트의 실시형태에 있어서, 복수의 폭스바이러스의 초기/후기 합성 프로모터는 다수의 이식 유전자의 발현에 대해서 허용된다. p2KO 발현 카세트는 표적 유전자로부터 유래된 바이러스 게놈 플랭크 서열의 사용으로 바이러스 게놈의 특정 점으로의 삽입을 유도하여 형광성 리포터 이식 유전자 및 발현 이식 유전자의 동시 발현과 함께 바람직한 유전자의 표적화된 절제가 야기되어 바이러스를 무장시킨다. 도 1에 나타낸 실시형태에 있어서, 형광성 리포터 이식 유전자 및 발현 이식 유전자 모두를 나타낸다. 대체 실시형태에 있어서, 형광성 리포터 이식 유전자 또는 발현 이식 유전자 중 어느 하나를 바이러스 게놈에 삽입하기 위해 p2KO 발현 카세트로 존재할 수 있다. 좌우 플랭크는 고유한 제한 부위의 쌍으로 둘러싸인다. 플랭크 영역은 5'-(좌) 플랭크 상에 Sac I 제한 부위와 Not I 제한 부위 사이, 및 3'-(우) 플랭크 상에 EcoR I 제한 부위와 Hind III 제한 부위 사이의 p2KO 벡터에 결찰되었다. 발현되어진 유전자(형광성 리포터 및/또는 발현된 이식 유전자)는 고유한 5'-BamH I 제한 부위 및 3'-Xma I 제한 부위에 의해 둘러싸여 있다. 이들은 적절한 제한 부위에 의해 둘러싸여진 PCR 앰플리콘의 간단하고 방향성 있는 결찰을 허용한다.

본원에 기재된 실시예에서 p2KO 방법에 사용된 관련 프라이머를 하기 표 1에 나타낸다. 각각의 경우에 있어서, 삽입된 제한 엔도뉴클레아제 부위는 밑줄로 표시된다. 적용 가능한 경우, 순방향 프라이머에 있어서 개시 코돈은 그레이 음영으로 굵은체로 표시되고, 역방향 프라이머에 있어서 개시 코돈은 그레이 음영으로 굵은체로 표시된다. 본원에 기재된 실시혜에서 사용된 좌우 플랭크 프라이머는 개시 또는 종결 코돈을 포함하고 있지 않는다.

발현된 이식 유전자 삽입 부위에 대한 p2KO 방법의 다양한 실시형태에서 사용된 OFR은 mCCL2 이식 유전자, mGM-CSF 이식 유전자, 및 fliC 이식 유전자를 포함한다. 후술되는 실시예에서 사용되는 mCCL2 이식 유전자는 ORF를 가지고 있는 플라스미드(Sino Biological, Incorporated로부터 이용 가능)로서 구입되는 mCCL2 cDNA 클론 ORF를 사용하여 생성되었다. 후술되는 실시예에서 사용되는 mGM-CSF 이식 유전자는 그랜트 맥패든(Grant McFadden) 박사에 의해 제공된 mGM-CSF의 cDNA 클론 ORF를 사용하여 생성되었다. mCCL2, mGM-CSF, 및 fliC ORF를 PCR에 의해 그들의 벡터로부터 증폭시키고 각각 생성 앰플리콘의 5'- 및 3'-종단에 대한 BamHI 제한 서열 및 Xmal 제한 서열을 제공했다. mCCL2, mGM-CSF, 및 fliC ORF를 p2KO 절제/삽입 벡터에 결찰시켰다.

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 하기 약어는 p2KO 방법을 사용하여 생성되는 재조합 TPV의 다양한 실시형태를 기재하기 위해 본원에서 사용된다. p2KO 절제/삽입법이 본원에 기재되어 있지만, 그것은 게놈으로부터 유전자를 절제하거나 게놈으로 이식 유전자를 삽입하기 위한 공지된 여하의 방법이 사용되어 본원에 기재된 재조합 TPV를 형성할 수 있다는 것이 이해된다.

마우스 숙주에서 재조합 TPV를 시험하기 위한 적절한 세포주를 선택하기 위해서, 최소한으로 대체된 재조합 TPV/egfp를 인간 대장암 세포주의 패널에 대하여 시험하여 최상의 바이러스 복제를 허용하는 세포주를 선택함으로써 직접적인 바이러스 종양 세포 용해의 표효과를 최대화했다. TPV/egfp 복제에 대해 시험된 hCRC 세포주는 HCT 116, COLO205, SW1463 및 WiDr 포함한다. 종양 세포의 바이러스 용해는 몇몇 경우에 따라 종양 제거에 중요하지만, 바이러스 세포 용해는 종양 생존 및 제거를 유발하는 다수의 요인 중 하나일 뿐이고, 면역 세포 보충 역할도 할 수 있다. HCT 116이 대조 세포주 OMK보다 적은 자손 비리온을 생산하지만, HCT 116은 시험되는 hCRC 세포주 중 가장 생산성이 높았다. 또한, 다수의 OV는 HCT 116으로 DBV도된 종양에서 특성화되어 왔다. 이러한 이유로 인해, HCT 116은 생체 내에서 재조합 TPV의 온콜리틱 잠재성을 더 특성화하기 위한 실험에 사용되었다.

재조합 TPV의 다양한 실시형태를 평가하기 위해서, 가슴샘 없는 마우스의 배면 상에 5×10⁶ HCT 116 세포를 피하 주사하여 HCT 116 세포주를 갖는 가슴샘 없는 마우스 내에서 종양을 유도했다. 마우스를 종양 크기가 75 ㎣에 도달할 경우 대조 또는 실험군으로 각 군당 5마리의 마우스를 무작위로 분리했다. 0일째(75 ㎣의 종양 부피를 도달한 후)에 100 ㎕의 비히클(군 a) 또는 재조합 TPV(군 b-h)를 함유하는 단일 주사를 투여하고 종양 부피를 그 후 3일 간격으로 측정했다. 평균 종양 부피를 식을 사용하여 산출했다.

HCT 116이 유도된 종양 이종 이식은 재조합 TPV로 치료 중에 기대되는 레벨로 부피가 증가하지 않는다. 그러나, 재조합 TPV로 치료를 받는 마우스에서 다수의 2차 조양이 발생했다. 또한, HCT 116 동소 이종 기관 이식 모델을 포함하는 몇몇 생체 내 연구에 있어서, HCT 116 세포는 고도의 운동성 및 침습성이 있는 것으로 보고되어 왔다.

도 2a는 5×106 HCT 116 세포로 이종 이식된 가슴샘 없는 마우스에서 36일 기간 동안에 걸쳐(종양 질량이 75 ㎣을 초과하는 시점에서 시작) 관찰된 평균 종양 발달을 도시하고 이어서 비히클 전용 대조 용액으로 처리했다. 고리에 나타낸 평균 종양 부피는 약 15일까지 증가했고, 그 시점에서 그 부피는 나머지 기간 동안 약 100 ㎣에서 안정화되었다. 평균의 표준 오차는 바(+/-1 SEM)으로 나타낸다. 종양 부피의 안정화는 초기 이종 이식에서 HCT 116 세포의 동일하거나 유사한 수를 사용했을 경우, 누드 마우스에서 치료되지 않은 HCT 116 종양이 동일한 간격에 걸펴 부피를 점차적으로 증가시킨다는 것을 나타낸 몇몇 이전 연구와 대조적이다. 예를 들면, HCT 116이 유도된 종양이 약 8일의 2배의 시간을 갖는다고 보고되어 왔다. 또한, 누드 마우스에서 HCT 116 이종 이식에 대하여 OV 치료제로서 VACV를 조사한 최근 연구는 도 2a에 도시된 기간과 유사한 시간 간격에서 4000 ㎣까지의 HCT 116 종양 성장을 나타내었다.

도 2b에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 B군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV/egfp로 치료되고 대조군 A의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 종양 부피 및 B군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

도 2c에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 C군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV-p2KO/Δ66R/mMCP-1로 치료되고 대조군 Aa의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 종양 부피 및 C군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

도 2d에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 D군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV-p2KO/Δ66R/mGM-CSF로 치료되고 대조군 A의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 조양 부피 및 D군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

도 2e에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 E군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV-p2KO/Δ66R/fliC로 치료되고 대조군 A의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 종양 부피 및 E군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

도 2f에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 F군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV-p2KO/Δ66R로 치료되고 대조군 A의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 종양 부피 및 F군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

도 2g에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 G군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV-p2KO/Δ2L로 치료되고 대조군 A의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 종양 부피 및 G군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

도 2h에 도시된 실시형태에 있어서, 블랙으로 채워진 스퀘어는 H군의 마우스의 평균 종양 부피를 도시하고, 이것은 TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC로 치료되고 대조군 H의 마우스의 평균 종양 부피이다. 바는 대조군 A의 종양 부피 및 H군의 종양 부피에 대한 평균 표준 오차(+/-1 SEM)를 도시한다.

본원에서 사용되는 재조합 TPV의 특히 바람직한 일 실시형태는 이중-녹아웃 백그라운드(Δ66R 및 Δ2L)에 부가된 fliC 이식 유전자를 가진 재조합 TPV이다. 우리의 결과는 fliC 이식 유전자를 발현하는 2L 및 66R 모두에 대해 제거된 재조합 TPV가 HCT 116 종양 이종 이식에 견고하고 내구성 있는 치료 효과를 생성한다는 것을 입증했다. 본원에서 사용되는 재조합 TPV의 또 다른 바람직한 실시형태는 단일-녹아웃 바이러스(Δ66R)에 부가된 fliC 이식 유전자를 가진 재조합 TPV이다. 단일 녹아웃 재조합 TPV 실시형태(TPV-p2KO/Δ66R 및 TPV-p2KO/Δ2L) 모두는 적어도 2개의 시점에서 통계적으로 종양 부피의 상당한 감소를 나타내었고, 각각의 경우에 있어서 관찰되는 종양 부피의 상당한 감소는 바이오테라피성 접종의 시점으로부터 일시적으로 멀어졌다. 단일 녹아웃 재조합 TPV 모두는 이들 후속 시점에서 효과가 있는 것으로 나타났다. 실제로, TPV/egfp 바이러스를 제외하고, 시험된 재조합 TPV의 모든 실시형태는 상술된 재조합 TPV가 바람직한 몇몇 정도의 종양 절제를 생성하는 것으로 나타났다. T세포 의존성 면역 반응이 누드 마우스에서 심각하게 손상되기 때문에, 본원에 기재된 실시예는 본래의 면역 반응이 잠재적으로 대상의 종양 크기를 감소시킬 수 있으므로 본래의 면역 반응 활성제로 무장된 재조합 TPV는 면역결핍 증후군을 가진 대상에게 유용할 것으로 기대된다. 따라서, 우리는 본래의 면역 반응의 활성제로 무장된 OV가 면역결핍 증후군을 가진 개인에게도 유용할 것이라고 결론지었다.

매우 높게 보존된 병원균 관련 분자 패턴(PAMP)으로서, 플라젤린은 세포질 면역 감시에 수반되는 검출기 분자용 타겟이다. 예를 들면, Nod형 수용체 NCLR4(lpaf로도 알려짐)에 의한 플라젤린의 검출은 차례로 카스파제-1 및 소식 세포에서의 사이토카인 인터루킨 1β(IL-1β)의 성숙을 활성화하는 lpaf 염증 조절 복합체의 활성을 야기한다. OV 감염의 과정에서 생성된 FliC의 기대량이 소량일 것으로 기대되지만, 마우스에서 꼬리 정맥 주입에 의해 투여되는 박테리아 플라젤린의 미량(≤5 ㎍/animal)이라도 사이토카인 TNF, IL-1β, IL-6DML, 및 케모카인 MIP-2(IL-8)의 글로벌(즉, 기관 및 혈장 모두에서) 상승뿐만 아니라 MEK 세포 내 신호 전달 경로의 변화를 야기한다. 포유동물 세포에서의 FliC의 작용은 부분적으로 TLR 기반의 PAMP 검출기와는 독립적이고, 아직 완전하게 설명되지 않았다. 그러나, 본원에 기재된 결과에 기초하여, FliC를 발현하는 재조합 TPV에 의해 본래의 면역 반응의 활성은 손상되지 않은 본래의 면역 반응을 갖는 누드 마우스에서 종양 질향의 감소에 기여하는 것으로 나타난다.

비제한적인 실시형태의 리스트

실시형태 A는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하는 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물로서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시킨다.

실시형태 A의 조성물은 TNF 결합 단백질의 발현을 억제하는 바이러스가 MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 박테리아 플라젤린 단백질을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 야타폭스바이러스인 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 중합된 프라젤린 단백질이 박테리아 플라젤린의 주성분인 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 이식 유전자가 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무륨 유전자("fliC")의 생성물인 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 타나폭스바이러스(TPV)이고, TNF 결합 단백질의 적어도 하나의 돌연변이 억제 발현이 TPV의 2L 유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 제 2 돌연변이를 갖고, 제 2 돌연변이가 바이러스에 의해 티미딘 키나아제의 발현을 억제시키는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 타나폭스바이러스(TPV)이고, 티미딘 키나아제의 제 2 돌연변이 억제 발현이 TPV의 66R 유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 암세포의 아폽토시스를 증가시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 개재 특징으로 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 대상의 면역 시스템을 활성화시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 개재 특징으로 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 mCherry 형광성 리포터를 도입하기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 A의 조성물 또는 실시형태 A는 바이러스가 그린 형광성 단백질 형광성 리포터를 도입하기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하는 면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물이고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 티미딘 키나아제(TK)의 발현을 억제시킨다.

실시형태 B의 조성물은 바이러스가 박테리아 플라젤린 단백질을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 폭스바이러스이다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 이식 유전자가 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무륨 유전자("fliC")의 생성물인 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 바이러스가 타나폭스바이러스(TPV)이고, 티미딘 키나아제의 적어도 하나의 돌연변이 억제 발현이 TPV의 66R 유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 바이러스가 제 2 돌연변이를 갖고, 제 2 돌연변이가 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 바이러스가 타나폭스바이러스(TPV)이고, TNF 결합 단백질의 제 2 돌연변이 억제 발현이 TPV의 2L유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위한 바이러스가 MHC-1 경쇄와 결합할 수 있는 구조를 갖는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 바이러스가 암세포의 아폽토시스를 증가시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 B의 조성물 또는 실시형태 B는 바이러스가 대상의 면역 시스템을 활성화시킥 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 개재 특징을 갖는다.

실시형태 C는 대상의 암세포에 적어도 하나의 유전자를 전달하는 방법으로서, MHC-1 경쇄와 결합할 수 있는 구조를 갖는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위해 바이러스를 돌연변이화 함으로써 야타폭스바이러스 속 바이러스를 변형시키는 단계; 및 변형된 야타폭스바이러스 속 바이러스를 대상 온몸에 투여하는 단계를 포함한다.

실시형태 C의 방법은 바이러스의 적어도 하나의 유전자를 인코딩함으로써 바이러스를 변형시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 유전자는 암세포의 아폽토시스를 증가시키거나 대상의 면역 반응을 활성화시킨다.

실험의 상세한 설명:

아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터의 OMK(올빼미 원숭이 신장) 세포, HCT 116, COLO 205, SW1463 및 WiDr 세포주를 사용했다(각각 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 제품 번호 CRL-1556, CCL-247, CCL-222, CCL-234 및 CCL-218로서 이용 가능). OMK 세포는 본원에 기재된 바이러스 증폭 및 바이러스 적정에 사용되었다. 10%(vol/vol) 소태아 혈청(Atlanta Biologicals로부터 이용 가능), 2 mM L-글루타민(Sigma-Aldrich로부터 이용 가능) 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트(AMRESCO로부터 이용 가능)가 보충된 DMEM(Gibco/Life Technologies로부터 이용 가능)으로 이루어지는 완전한 증식 배지에서 세포주를 번식시켰다. 바이러스 감염 후, 세포주의 세포 단분자층은 소태아 혈청의 농도가 2%로 감소되는 것을 제외하고 증식 배지와 동일한 유지 배지 내에서 유지되었다. 세포는 5% CO₂ 분위기 하 37℃에서 배양되었다. 세포 카운팅 및 세포 생존 능력 분석은 0.2%(wt/vol) 트리판 블루를 사용하여 개선된 노이바우어 혈구 계산기로 행했다.

실험 1: 대조

야생형 TPV(케냐 품종)는 조지프 에스포지토(Joseph Esposito) 박사(미국 조지아주 아틀란타 질병관리센터 소속)에 의해 제공되었다. 야생형 TPV는 본원에 기재된 바와 같이 변형되어서 형광성 기록기 EGFP(다른 유전적인 변형이 없음)를 발현하는 대조 재조합 TPV를 형성했다. 간략하게, 2개의 동일한 우두 바이러스(VACV) 유래의 초기/후기 합성 프로모터는 p2KO 방법을 사용하여 대조 재조합 TPV 내에서 형광성 기록기 유전자의 발현을 유도하는데 사용된다. p2KO 발현 카세트(좌 및 우 플랭크, 뿐만 아니라 중간 개방형 해독틀(ORF) 및 프로모터를 포함)는 트랜스펙션/감염 과정 중에 상동 재조합 이중 크로스오버 사건을 통해 야생형 TPV의 바이러스 게놈에 전사되어 대조 재조합 TPV를 형성했다. 재조합을 위한 플랭크 영역은 5'-(좌) 플랭크 상에 Sac I 제한 부위와 Not I 제한 부위 사이, 및 3'-(우) 플랭크 상에 EcoR I 제한 부위와 Hind III 제한 부위 사이의 p2KO 벡터에 결찰되었다.

실험 2: 트랜스펙션/감염 과정

트랜스펙션/감염 과정은 이들 예시 실시형태에서 사용되는 재조합 TPV를 생성하는데 사용된다. 간략하게, OMK 세포는 트랜스펙션 시약의 트랜스펙션 프로토콜의 제조자에 의해 정제된 p2KO 벡터의 ㎍당 1㎕ 트랜스펙션 시약의 농도에서 jetPRIME 트랜스펙션 시약(PolyPlus Transfection SA로부터 이용 가능)을 사용하여 트랜스펙션된다. 트랜스펙션 후 약 5시간에, OMK 단분자층은 야생형 TPV-케냐 품종(비형광성)의 세포당 1개의 플라크 형성 단위(pfu/cell)로 접종된다. 접종 후 5일에, 감염된 단분자층을 얼음 상에서 고무 세포 스크레이퍼로 긁어내고, -80℃에서 3회 동결 및 해동, 4℃에서 15초 초음파 분해를 행하며, 약 90% 융합에서 갓 시드된 OMK 단분자층 상에서 연속적으로 희석되고 도금되어 0.5% 메틸셀룰로오스를 함유하는 유지 배지로 오버레이 했다. 형광성, 잘 분리된 플라크를 채취하고 각각의 채취물은 적어도 3회의 플라크 정제를 행하여 가시적인 야생형(비형광성) 플라크를 함유하지 않은 바이러스 제제를 생성했다. 야생형 플라크가 배양에서 가시적이지 않고 야생형 TPV DNA가 PCR에 의해 검출될 수 없는 경우에만 시료가 순수한 것으로 간주되었다.

실험 3: 바이러스 이식 유전자 발현의 확인

FliC 발현의 검증은 특수 단백질 검출 검사에 의해 행해졌다. mCCL2 및 mGM-CSF 발현의 검증은 루미넥스 다분석물 사이토카인 검출 분석(the University of Maryland cytokine core laboratory에 의해 행해짐)에 의해 행해졌다. 분석용 시료는 10 pfu/cell을 사용하는 TPV-p2KO/Δ66R/mCCL2, TPV-p2KO/Δ66R/mGM-CSF, 및 TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC로 60 ㎜ 조직 배양 디쉬(세포 증식에 이용 가능한 22.1 ㎠ 표면적을 가짐)에서 반융합성 OMK 세포 단분자층을 감염시킴으로써 제조되었다. 상청액(3 ㎖/dish) 및 세포질 추출물은 감염 후 지시된 시간에서 제조되었다. FliC 검출에 대해서, 추출된 용해물은 특수 단백질 검출 검사로 분석되었다. 단백질을 PVDF 막(Millipore로부터 이용 가능)에 전사하고 1:2000 희석물(vol/vol)에서의 항-FliC 단일 클론 항체로 조사했다. 분유 5%(wt/vol)를 차단제로서 사용했다. 2차 항체는 1:2500 희석물에서 사용된 겨자무 과산화효소(Abcam으로부터 이용 가능)와 결합된 단일 클론 항-마우스 IgG이다. 가시화는 ECL(Thermo Scientific/Pierce)에 의해 행해졌다. p2KO 벡터를 함유하지만, fliC, mGM-CSF 또는 mCCL2 삽입 없이 TPV 재조합의 실시형태가 대조로서의 역할을 했다.

실험 4: 세포 밀도 결정

4개의 인간 대장암 세포주, 및 OMK 세포 대조를 1일 후 세포가 90%의 융합을 달성할 수 있도록 12-웰 플레이트(세포주 당 3웰)에 분리하여 접종했다. 각각의 웰(세포 증식에 이용 가능한 3.8 ㎠ 표면적을 가짐)을 트립신화하고, 트리판 블루 배제에 의한 생존 능력에 대해 카운트되고 스코어된다. 이것은 각 세포주에 대한 바이러스 pfu/cell의 특정 수에서 실험이 정확하다는 것을 보장하기 위해서 행해진다.

실험 5: 바이러스 적정

시료에 존재하는 가시적인 재조합 TPV 비리온의 수를 분석하기 위해서, 플라크 분석이 사용된다. 간략하게, 바이러스 시료를 얼음 상에서 15초 동안 초음파 분해하고, 유지 배지에서 연속적으로 희석하여 6-웰 플레이트(각 시료의 희석물에 대해 n=3)에서 거의 융합하는 OMK 단분자층 상에 접종했다. 바이러스는 1시간 동안 천천히 흔들면서 실온에서 흡수시켰다. 접종물을 제거한 다음, 각 웰을 1 ㎖의 예열된 유지 배지를 사용하여 2회 천천히 세정했다. 세정 후, 2 ㎖의 오버레이 배지를 첨가하고 감염된 OMK 단분자층을 37℃에서 10일 동안 배양했다. 오버레이 배지를 제거한 다음, 단분자층을 염색했다(37% 포름알데히드에서 0.1% 크리스탈 바이올렛을 사용). 플레이트를 증류수로 세정하고, 대기 중에서 건조하여 플라크를 카운트했다.

실험 6: 동물

수컷 신생아 가슴샘 없는(Nude-Foxn1^nu ^/ ^nu) 마우스(Harlan Laboratories로부터 이용 가능)는 4주 시기에서 받아 실험 시작 전 1주 동안 적응되었다. 마우스는 12시간/12시간 명/암 사이클 하에서 투명한 폴리카보네이트 케이지 내에 개별적으로 수용되었다. 음식과 물은 무제한으로 이용 가능했다. 모든 동물 주거 조건, 취급 및 처리는 the Institutional Animal Care 및 Use Committee of Western Michigan University(IACUC 프로토콜 번호 13-07-01)에 의해 승인된 프로토콜에 의해 행해진다.

실험 7: 누드 마우스의 종양 이종 이식에 대한 세포주의 선택

가슴샘 없는 마우스에서 생체 내 연구를 시작하기 전에, 우리는 TPV/egfp로 감염되었을 경우, hCRC 세포주가 가장 높은 바이러스 생산성을 가지는지를 결정했다. TPV/egfp는 4개의 hCRC 유래의 세포주: HCT 116, WiDr, SW1463 및 COLO 205에서의 복제 능력에 대해 분석했다. OMK 세포를 양성 대조로서 사용했다. 각각의 세포주를 12-웰 조직 배양 플레이트(세포 증식에 이용 가능한 3.8 ㎠ 표면적을 가짐)에 시드되고 TPV/egfp의 0.1 pfu/cell을 각 웰에 접종했다. 감염 후 4일째에 용해물을 수집하여 플라크 분석으로 분석했다.

실험 8: 종양 유도 및 측정

종양은 제 1 요추골 위에 가깝게, 배면 상에 5×10⁶ HCT 116 세포의 피하 주입에 의해 가슴샘 없는 마우스 내에 생성되었다. 각각의 주입은 세포가 주입 시기 이후에 생존될 수 있도록 트립판 블루를 배제하여 생존력을 평가했다. 일단 가시화되면, 종양은 장축(길이), 단축(폭) 및 z 크기(높이)에 따라 디지털 캘리퍼스(피츠버그(Pittsburgh) 모델 6ZBTMCO)를 사용하여 측정되었다. 그 다음, 종양의 부피는 본원에 제시된 식 1을 사용하여 추정되었다. 종양 크기의 추정값이 75 ㎣에 도달되거나 초과될 경우, 각각의 동물은 무작위로 대조군(군 a) 또는 7개의 실험군 중 하나(군 b-h)로 분리되었다.

실험 9: 누드 마우스 내에 HCT 116 이종 이식의 바이오테라피

각각의 치료군은 5개 또는 6개의 종양을 가지고 있는 가슴샘 없는 마우스로 구성되어 있다. 종양 부피가 75 ㎣에 도달되거나 초과되면, 단일 바이오테라피성 주입이 각 종양을 가지고 있는 마우스에 투여되었다. 바이오테라피성 주입은 생리 식염수로 희석된 100 ㎕의 조 OMK 세포 용해물로 현탁된 5×10⁶ pfu의 단일 주입으로서 종양내 방식으로 투여되었다. 각각의 마우스의 체중 및 종양 부피를 그 후 3일 간격으로 측정하고 기록했다. 총 39일 동안 13개 시점에 대해서 데이터를 수집했다. 재조합 TPV 주입의 투여에 의해 생성되는 예상하지 않은 염증 또는 다른 주입 효과를 제어하기 위해서, 본원에서 군 a로서 표시된 비히클 대조군을 사용했다. 이 대조군은 HCT 116 세포를 받았지만 모의 재조합 TPV 주입(100 ㎕의 비히클만)을 경험한 동물로 구성되었다. 이 군은 "모의 바이오테라피"군 또는 군 A로서 불리어진다. 모든 실험군은 군 A와 비교되어 재조합 TPV의 치료 효능이 평가되었다.

치료 효과를 평가하기 위해서, 각각의 실험군은 만-휘트니 U 검증(때때로 윌콕슨의 순위합 검증이라 불림)을 사용하여 대조군과 비교되었다. 재조합 TPV를 사용한 치료는 모의 주입된 대조와 비교되었을 경우 군 내에서 평균 종양 부피가 상당하게 감소되면 상당한 치료 효과를 생성하는 것으로 판단되었다. p<0.05의 유의 레벨을 연구 내내 사용했다.

결과: p2ko 폭스바이러스 제거/삽입 벡터

p2ko 폭스바이러스 제거/삽입 벡터는 여하의 바람직한 TPV 유전자를 동시에 제거하여 제거된 유전자를 바람직한 발현된 형광성 리포터 및/또는 바람직한 발현된 이식 유전자로 대체하는 신속하고 신뢰할 수 있는 방식을 제공하도록 설계 및 구성되었다. 배양된 세포의 바이러스 감염의 가시화는 형광성 리포터, mCherry 및 EGFP의 포함에 의해 크게 촉진되었다. 2개의 형광성 리포터의 사용은 이중 삭제된 재조합 TPV를 fliC 삽입(TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC)으로 인식하고 단리할 수 있게 한다. OMK 세포 단분자층 상에 TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC 바이러스 감염에 의해 생성된 바이러스 플라크를 도 3에 나타내고, 각각 mCherry 및 EGFP와 관련된 브릴리언트 오렌지-레드 및 그린 컬러의 동시발생의 발현을 입증한다.

기저 벡터(즉, 형광성 리포터를 가지지만 발현되는 선택적 이식 유전자가 없음)의 전체 서열은 M13 포워드와 리버스 프라이머 결합 서열간 영역의 PCR 증폭에 의해 생성된 앰플리콘의 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. mCCL2, mGM-CSF, 또는 fliC를 인코딩하는 ORF의 삽입은 p2KO 벡터의 DNA 시퀀싱에 의해 확인되어 트랜스펙션/감염 과정에 사용되기 전에 올바른 배치와 배향을 보장한다. 재조합 TPC는 재조합 바이러스 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR 산물의 아가로오스 겔 분석에 의해 2L, 66R 또는 모두 중 어느 하나에 대해서 녹아웃되는 것으로 확인되었다.

결과: 트랜스펙션/감염

접종 4-5일 후까지, 형광성 리포터의 발현은 야생형 TPV 감염 세포의 시토졸 구간 내에서 p2KO 벡터로부터 유전자 발현을 나타내는 OMK 세포 단분자층 내에서 분명했다. p2KO 벡터로 트랜스펙션되지만 야생형 TPV로 연속 접종되지 않은 대조 배양에 있어서, 형광성이 관찰되지 않았다. 그 다음, 바이러스 시료의 순도는 추가 사용 전에 재조합 바이러스 게놈 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 확인되었다. 모든 바이러스 DNA 시료는 암피실린 내성 유전자의 존재에 대해 조사되었고, 이것은 여하의 재조합 TPV에서 검출되지 않았다. 이것은 모든 재조합 TPV가 단일 크로스오버 사건보다는 이중 크로스오버 사건을 야기하는 것을 나타낸다.

결과: 바이러스 이식 유전자 발현의 확인

삽입된 ORF가 재조합 TPV(TPV-p2KO/Δ66R/mCCL2, p2KO/Δ66R/mGM-CSF, 및 TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC를 포함)로 감염된 세포 내에서 발현되었음을 입증하기 위해서, 60 ㎜의 디쉬(20 ㎠ 증식 영역을 가짐) 내에 OMK 단분자층은 관련 있는 재조합 TPV로 접종되고 상술한 바와 같이 세포 용해물 및 배양 상층액으로 이식 유전자 발현을 분석했다. TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC가 접종된 OMK 세포로부터 용해물의 특수 단백질 검출 검사를 단일 클론의 항-FliC 항체로 조사했다. FliC 양성 대조와 동일한 50 kDa의 겉보기 분자량을 가진 단일 밴드가 예상한 대로 관찰되었다. 이 밴드의 강도는 감염 후 3일과 6일 사이에 점진적으로 증가되었다. FliC 이식 유전자는 모의 감염 세포에서 검출되지 않았다. 감염 세포 용해물 및 그들의 배양 상층액을 분석하여 mCCL2 및 mGM-CSF의 존재를 알아내었다. 이식 유전자 모두는 크게 발현되었고, 감염 세포 상층액(4.9 ng/㎖ mCCL2, 및 10.0 ng/㎖ mGM-CSF 이상)에 다량으로 존재한다. mGM-CSF 및 mCCL2 모두는 감염 세포 또는 대조 비감염 세포의 세포질 추출물 및 이들 이식 유전자를 발현하지 않는 TPV로 RKADA된 세포에서만 약하게 검출되거나 검출되지 않았다. 이 데이터는 mCCL2 및 mGM-CSF 모두는 예상한 바와 같이 감염 세포로부터 분비되지만, FliC는 다시 예상한 바와 같이 감염 세포의 세포질 내에 축적되는 것을 나타낸다.

결과: 세포 밀도 결정

본 연구에서 사용되는 각 세포주는 융합 부근에서 결정되는 융합 밀도(cells/㎠)를 갖는다. OMK 대조 세포주는 약 1.0×10⁵ cells/㎠의 융합 밀도를 갖는다. 대장암 세포주에 대해 측정된 밀도는 다음과 같다: HCT 116은 약 1.4×10⁵ cells/㎠의 융합 밀도를 갖고; COLO205는 약 6.9×10⁵ cells/㎠의 융합 밀도를 갖고; SW1463은 약 4.5×105 cells/㎠의 융합 밀도를 갖고; WiDr은 약 2.5×10⁵ cells/㎠의 융합 밀도를 갖는다. 이들 값은 이들 세포주를 접종할 경우 사용되는 pfu수를 산출하는데 사용된다.

결과: 누드 마우스에서의 바이오테라피 HCT 116 이종 이식

가슴샘 없는 마우스로 생체 내 연구를 시작하기 전에, OMK 세포는 상술한 바와 같이 TPV/egfp로 감염되었을 경우 가장 높은 바이러스 생산성을 가진 hCRC 세포주가 되는 것으로 밝혀졌다. OMK 세포는 약 3×106 자손 pfu/well의 생산을 가능하게 하는 가장 좋은 숙주 세포이다. 시험된 hCRC 세포주 중, HCT 116은 약 7×10⁵ 자손 pfu/well의 평균 수율로 가장 많은 자손 비리온을 생성했다. 따라서, 우리는 본 연구의 생체 내 단계에서 HCT 116을 선택했다.

재조합 TPV의 종양 세포 붕괴성의 잠재력을 평가하기 위해서, 종양은 가슴샘 없는 마우스(Nude-Foxn1^nu ^/ ^nu)에서 유도되었다. HCT 116 세포의 생존 능력 카운트는 주입 시기에 >99%가 생존 가능함을 입증되었다. 종양은 일반적으로 HCT 116 주입 후 1~3주 내에 75 ㎣에 도달했다. TPV/Δ66R(F군), TPV/Δ2L(G군), 및 TPV/Δ2L/Δ66R/fliC(H군) 모두를 사용한 치료는 모의 주입 대조와 비교했을 경우 2개 이상의 시점에서 종양 크기가 상당하게 감소했다. TPV/Δ2L 치료 종양(G군)은 2개의 시점인 치료 후 33일(47.6% 감소) 및 36일(65.2% 감소)에서 모의 주입 종양보다 상당하게 작았다. TPV/Δ66R 치료 종양(F군)은 2개의 시점인 치료 후 27일(34.9% 감소) 및 36일(52% 감소)에서 모의 주입 종양보다 상당하게 작았다. TPV/Δ2L/Δ66R/fliC 치료 종양(H군)은 단단하고 내구성 있는 치료 효과를 나타내고, 6개의 시점인 치료 후 15일(56.1% 감소), 21일(62.0% 감소), 24일(63.8% 감소), 27일(59.5% 감소), 33일(55.3% 감소) 및 36일(69.6% 감소)에서 모의 주입 종양과 비교했을 경우 부피가 상당하게 감소했다. 초기 시험이 인간의 대장암 세포주를 사용하여 행해졌지만, 본원에 기재된 약제 바이오테라피는 광범위한 암 치료에 사용되기 위한 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 약제 조성물로 치료되는 암의 비제한적인 리스트는: 기저 세포함, 상피성 암, 융모암, 신경 교종 종양, 상피내 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 흑색종, 골수종, 신경아세포종, 망막아종, 횡문근육종, 육종, 및 담도, 방광, 골, 뇌, 유방, CNS, 대장과 직장, 결합 조직, 소화계, 자궁내막 세포, 식도, 눈, 위, 머리와 목, 신장, 후두, 간, 폐, 췌장, 전립선, 구강, 난소, 호흡계, 피부, 위, 고환, 갑상선, 자궁, 및 비뇨계를 포함한다.

본원에 기재된 바와 같이 약제 조성물은 치료상 유효량으로 투여되어야 한다. 본원에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 투여 후, 바람직한 치료 결과를 달성하는데 효과적인 약제량을 가리킨다. 치료상 유효량은 개인의 질병 상태, 나이, 성별, 및 체중과 같은 요인, 약제의 형태, 및 개인에게 바람직한 반응을 이끌어내기 위한 투여 형태의 능력에 따라 환자마다 달라질 수 있다. 치료상 유효량은 낮고, 안전한 투여량으로 시작하여 더 높은 투여량으로 증가시키면서 여하의 유해한 부작용의 존재와 함께 치료 효과(예를 들면, 암세포 증식의 감소)를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 약제 조성물은 폭스바이러스, 바이러스 핵산, 또는 바람직한 바이오테라피 효과를 생성하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.

약제 조성물은 비경구, 경구, 창자, 구강, 비강, 국소, 직장, 질, 경점막, 표피, 경피, 진피, 눈, 폐, 및 피하 투여 경로를 포함하는 당업계에 공지된 여하의 적합한 투여 형태 또는 경로, 및 전신성 또는 국소화된 치료상 유효량을 제공하기 위한 피하 투여 경로를 통해 투여될 수 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다. 약제는 특정 투여 경로에 적합한 제형 또는 제제로 대상에게 투여될 것이다. 약학 투여 형태의 투여에 적합한 제형은 에어로졸, 분산제, 유제, 임플란트, 리포솜계 제형, 점비약, 패치, 분말, 용액, 스프레이, 좌약 및 현탁액을 포함할 수 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다. 제형은 단위 투여 제형으로 제공될 수 있고 당업계에 공지된 여하의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 제형 또는 투여 형태의 제조방법은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 본원의 폭스바이러스 또는 핵산을 결합하는 단계를 포함할 수 있고 안정제, 방부제 및 약품의 세포 흡수를 돕는 트랜스펙션 촉진제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다. 적합한 안정제는 알부민, EDTA, 글리신 및 모노소듐 글루타메이트를 포함할 수 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다. 적합한 방부제는 항생제, 메틸 히드록시벤조에이트, 페놀, 2-페녹시에탄올, 소르브산 칼륨, 벤조산 나트륨, 및 티메로살을 포함할 수 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다.

약제 조성물은 치료를 필요로 하는 대상의 종양 부위에 표적 조직 또는 기관에 국소적으로 전달될 수 있다. 조성물의 유효량은 대상의 피부를 통해 또는 주사기를 사용하는 노출되는 수술실 내에서 종양 부위에 직접적으로 주입된다. 소정 실시형태에 있어서, 약제 조성물은 체내 이식형 투여 장치를 사용하여 주입될 수 있다.

예시적인 실시형태에 나타내고 기재된 바와 같이 조성물 요소의 구성 및 배열이 단지 예시적인 것임을 주목하는 것이 중요하다. 본 발명의 단지 몇몇 실시형태가 본원에서 상세하게 기재되어 왔지만, 본원을 검토하는 당업자는 인용되는 주제의 신규한 가르침 및 이점으로부터 실질적으로 벗어나는 것 없이 다수의 변형(예를 들면, 크기, 면적, 구조, 형상의 변화 및 다양한 요소의 비율, 매개 변수의 값, 실장 배열, 물질의 사용, 컬러, 배향 등)이 가능하다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 일체적으로 형성되는 것으로서 나타낸 요소는 다수의 부분으로 구성될 수 있거나 다수의 부분으로서 나타낸 요소는 일체적으로 형성될 수 있고, 인터페이스의 작동이 반대로 또는 달리 다양해질 수 있으며, 구조 및/또는 부재의 길이 또는 폭 또는 시스템의 커넥터 또는 다른 요소가 다양해질 수 있고, 요소 간에 제공되는 조정 위치의 성질 또는 수가 다양해질 수 있다. 시스템의 요소 및/또는 어셈블리가 매우 다양한 컬러, 텍스쳐, 및 조합 중 여하로 충분한 강도 또는 내구성을 제공하는 매우 다양한 물질 중 여하로부터 구성될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 모든 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되도록 의도된다. 본 발명의 사상으로부터 벗어나는 것 없이 바람직하고 다른 예시적인 실시형태의 설계, 작동 조건, 및 배열에 있어서 다른 대체, 변형, 변경, 및 생략이 이루어질 수 있다.

기재된 과정 내에 여하의 기재된 과정 또는 단계가 본 장치의 범위 내에 구조를 형성하기 위해 다른 개시된 과정 또는 단계와 조합될 수 있을을 이해할 것이다. 본원에 개시된 예시적인 구조 및 과정은 예시적인 목적을 위한 것이고 한정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

본 장치의 개념으로부터 벗어나는 것 없이 상술된 구조 및 방법에 대해서 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 하고, 또한 청구항을 다른 언어로 명확하게 언급하지 않는 한, 이러한 개념이 하기 청구항에 의해 커버되도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다.

상기 설명은 도시되는 실시형태의 것으로만 고려된다. 장치의 변형은 당업자 및 장치를 제조하거나 사용하는 사람들에게서 발생할 것이다. 따라서, 도면에 나타내고 상술된 실시형태가 단지 실례가 되는 목적을 위한 것이고 동등한 교리를 포함하는 특허법의 원리에 따라 해석된 하기 청구항에 의해 정의된 장치의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다.

Claims

면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물로서,
적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스(Yatapoxvirus) 속 바이러스를 포함하고,
상기 적어도 하나의 돌연변이는 바이러스에 의한 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 TNF 결합 단백질의 발현을 억제하기 위한 바이러스는 MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 바이러스는 박테리아 플라젤린 단백질을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 야타폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,
중합 플라젤린 단백질이 상기 박테리아 플라젤린의 주성분인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 이식 유전자는 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨 유전자(Salmonella enterica serovar typhimurium("fliC"))의 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 타나폭스바이러스(tanapoxvirus(TPV))인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 돌연변이는 TPV의 2L 유전자에 의해 인코딩되는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 제 2 돌연변이를 갖고, 상기 제 2 돌연변이는 바이러스에 의해 티미딘 키나아제의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 타나폭스바이러스(TPV)이고, 상기 제 2 돌연변이는 TPV의 66R 유전자에 의해 인코딩되는 티미딘 키나아제의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 대상의 면역 시스템을 활성화시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 암세포의 아폽토시스를 증가시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 mCherry 형광성 리포터를 도입하기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 그린 형광성 단백질 형광성 리포터를 도입하기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
적어도 하나의 유전자를 대상의 암세포에 전달하는 방법으로서,
MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위한 바이러스를 돌연변이화 함으로써 야타폭스바이러스 속 바이러스를 변형시키는 단계; 및
상기 변형된 야타폭스바이러스 속 바이러스를 대상의 온몸에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 유전자를 바이러스 내에서 인코딩함으로써 바이러스를 변형시키는 단계를 추가로 포함하고,
상기 적어도 하나의 유전자는 암세포의 아폽토시스를 증가시키거나 대상의 면역 반응을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물로서,
적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하고,
상기 적어도 하나의 돌연변이는 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위한 바이러스는 MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 바이러스는 박테리아 플라젤린을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 야타폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18 항에 있어서,
상기 이식 유전자는 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨 유전자("fliC")의 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 바이러스는 타나폭스바이러스(TPV)이고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 TPV의 2L 유전자에 의해 인코딩되는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 바이러스는 제 2 돌연변이를 갖고, 상기 제 2 돌연변이는 바이러스에 의해 티미딘 키나아제의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 바이러스는 타나폭스바이러스(TPV)이고, 상기 제 2 돌연변이는 TPV의 66R 유전자에 의해 인코딩되는 티미딘 키나아제의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 바이러스는 대상의 면역 시스템을 활성화하기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 바이러스는 암세포의 아폽토시스를 증가시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
면역 시스템을 갖는 대상의 암세포를 치료하기 위한 조성물로서,
적어도 하나의 돌연변이를 갖는 야타폭스바이러스 속 바이러스를 포함하고,
상기 적어도 하나의 돌연변이는 티미딘 키나아제(TK)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서,
상기 바이러스는 박테리아 플라젤린 단백질을 발현하는 이식 유전자를 인코딩하는 야타폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 26 항에 있어서,
상기 이식 유전자는 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨 유전자("fliC")의 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서,
상기 바이러스는 타나폭스바이러스(TPV)이고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 TPV의 66R 유전자에 의해 인코딩되는 티미딘 키나아제의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서,
상기 바이러스는 제 2 돌연변이를 갖고, 상기 제 2 돌연변이는 바이러스에 의해 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서,
상기 바이러스는 타나폭스바이러스(TPV)이고, 상기 제 2 돌연변이는 TPV의 2L 유전자에 의해 인코딩되는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 30 항에 있어서,
상기 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위한 바이러스는 MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서,
상기 바이러스는 암세포의 아폽토시스를 증가시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서,
상기 바이러스는 대상의 면역 시스템을 활성화시키기 위해 이식 유전자를 추가로 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
적어도 하나의 유전자를 대상의 암세포에 전달하는 방법으로서,
MHC-1 경쇄에 결합할 수 있는 구조를 갖는 TNF 결합 단백질의 발현을 억제시키기 위한 바이러스를 돌연변이화 함으로써 야타폭스바이러스 속 바이러스를 변형시키는 단계; 및
상기 변형된 야타폭스바이러스 속 바이러스를 대상의 온몸에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제 34 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 유전자를 바이러스 내에서 인코딩함으로써 바이러스를 변형시키는 단계를 추가로 포함하고,
상기 적어도 하나의 유전자는 암세포의 아폽토시스를 증가시키거나 대상의 면역 반응을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.