KR20170027076A

KR20170027076A - 금 나노입자의 광열효과를 이용한 효율적인 세포내 유전자 전달방법

Info

Publication number: KR20170027076A
Application number: KR1020150123535A
Authority: KR
Inventors: 박지호; 오누리
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2017-03-09
Also published as: WO2017039074A1; KR101777837B1

Abstract

본 발명은 금 나노입자의 광열효과를 이용하여 세포 내로 유용물질을 효율적으로 전달하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 a) 세포 내로 전달하고자 하는 물질과 리포좀의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 복합체와 금 나노입자를 세포에 처리하고, 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는 세포 내 물질 전달방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포 내에 생리활성물질을 전달하는데 있어서, 기존의 리포좀 복합체를 이용하는 방법보다 현저히 높은 세포내 물질전달 효율을 나타내므로,세포내 유전자 전달을 용이하게 하여, 유전자 치료 효율을 높일 수 있다.

Description

금 나노입자의 광열효과를 이용한 효율적인 세포내 유전자 전달방법{Effecive Method for Transfering Genes into Cells Using Photothermal Effects of Gold Nanoparticles}

본 발명은 금 나노입자의 광열효과를 이용하여 세포 내로 유용물질을 효율적으로 전달하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 세포 내로 전달하고자 하는 물질과 리포좀의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 세포에 상기 복합체와 금 나노입자를 동시에 처리한 다음, 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는 세포 내 물질 전달방법에 관한 것이다.

유전자 요법이란 유전자 및 생물학적 활성 제제를 이용하여 유전 질환을 치료하는 것으로, 암과 같은 여러 유전자가 원인이 되는 장애나 외부에서 유래된 바이러스성 유전자들로부터 생긴 질환도 치료할 수 있는 새로운 개념의 치료법이다. 유전자 요법에는 변이된 유전자를 정상 유전자로 치환하거나, 치료 단백질을 합성하는 새로운 유전자를 도입시키거나, 내부적으로 세포의 유전자 발현을 조절하는 것이 포함된다. 여기에서 필요한 첫번째 접근이 표적세포로 유전자를 형질주입시키는 것이므로, 치료의 여러 형태에 적합한 형질주입 방법의 개발이 중요하다.

최근에 연구되고 있는 형질주입 기술 중에서 지질을 이용한 전달체계(리포좀, 미셀 그리고 기타 구조의 지질 등)는 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 상대적으로 높은 활성 그리고 사용상의 간편함 등 적합한 특징으로 특히 관심의 대상이 되고 있다.

이들 중에서 다양한 구조와 조성을 갖는 리포좀들이 개발되어, 시험관 내에서나 또는 살아있는 동물에 정맥주사, 에어로졸 또는 직접 주사로 투여하는 등의 방법으로 사용될 수 있으며, 리포좀에 특이한 리간드를 공유결합시켜 유전자를 특정 세포에 선택적으로 전달하는 효율을 개선시킬 수 있다. 이러한 리포좀의 예로는, 미국 Gibco BRL 회사가 공급하고 있는 Lipofectamine, Lipofectin, Cellfectin, Lipofectace 등이 있다. 이들 리포좀은 형질주입 전에 형질주입하고자 하는 유전자 DNA와 섞어서 쓰면 된다는 사용상의 간편성 이외에 세포독성이 적다는 장점이 있으나, 생물학적 벡터에 비해 형질주입 효율이 현저하게 떨어진다는 문제점을 내포하고 있다.

기존에 알려진 금 나노입자를 이용한 약물 및 유전자 전달방법은 금 나노입자의 표면을 개질하여 약물 또는 유전자와 결합하여 세포 내로 전달하는 방법이 알려져 있으나, 이는 나노입자의 세포독성 등으로 안정성이 떨어진다는 단점이 있었다(Han, G. et al., NanoBiotechnology, 4:40, 2007).

이에, 본 발명자들은 유전자 전달용 리포좀의 유전자 전달 효율을 향상시키기 위하여 예의 노력한 결과, 금 나노입자가 가지는 광열효과를 이용하여, 유전자와 리포좀 및 금 나노입자를 함께 세포에 처리하는 경우, 세포 내 유전자 전달효율이 현저히 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 금 나노입자의 광열효과를 이용하여 세포 내로 유용물질을 효율적으로 전달하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 세포 내로 전달하고자 하는 물질과 리포좀의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 세포에 상기 복합체와 금 나노입자를 동시에 처리한 다음, 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는 세포 내 물질 전달방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 따르면, 세포 내에 생리활성물질 전달하는데 있어서, 기존의 리포좀 복합체를 이용하는 방법보다 현저히 높은 세포내 물질전달 효율을 나타내므로, 세포내 유전자 전달을 용이하게 하여, 유전자 치료 효율을 높일 수 있다.

도 1의 (a)는 본 발명의 나노전달시스템에서 유전자 전달 메카니즘을 나타낸 것으로, 원적외선 레이저가 조사된 금나노입자의 광열효과에 의하여, 리포펙타민-플라스미드 복합체가 세포내로 전달되는 것을 나타낸 것이고, (b)~(d)는 본 발명에서 합성한 금 나노막대의 표면을 mPEG 물질로 변형한 후 특성을 분석한 결과를 나타낸 것으로, (b)는 금 나노막대 표면변형 모식도이고, (c)는 금 나노막대의 투과전자현미경 사진으로, 왼쪽은 mPEG 변형 전 금 나노막대이고, 오른쪽은 mPEG 변형 후의 금 나노막대이다. (d)의 왼쪽은 적외선/가시광선 흡광분석기를 통한 금 나노막대의 흡수파장을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 오른 쪽은 제타 전위 분석기를 이용한 금 나노막대의 표면전하를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 금 나노막대의 광열효과를 확인한 것으로, 여기서 금 나노막대의 농도는 적외선/가시광선 흡광분석기를 통해 810 nm 파장의 빛을 흡수하는 금 나노입자의 농도를 OD(Optical Density)로 표현하였다. (a)는 근적외선에 노출되는 동안 mPEG로 코팅된 금 나노막대의 농도별 광열효과를 열화상카메라를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 금 나노막대의 광열효과가 지속됨에 따라 인간 섬유아세포의 활성도를 MTT 어세이를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이며, (c) 근적외선을 쬐기 전과 후의 나노입자의 안정성을 적외선/가시광선 흡광분석기를 통하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간 섬유아세포에 금나노막대와 함께 플라스미드와 리포펙타민을 처리한 후 레이저 조사 시간에 따른 유전자 전달 효율 측정 및 세포 활성도 분석 결과를 나타낸 것으로, (a)는 레이저 조사 시간을 다양하게 조절한 후, 유세포 분석기를 이용하여 eGFP의 발현 효율을 측정한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 레이저 조사 시간 별 세포의 활성도 변화를 MTT 어세이로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인간 섬유아세포에 금나노막대와 함께 플라스미드와 리포펙타민의 비율을 1:1로 고정시키고 양을 증가시켜 레이저 조사에 따른 유전자 전달 효율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 유세포분석기를 이용하여 유전자 전달 효율을 분석한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 세포 활성도를 MTT 어세이로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)의 첫번째 열은 본 발명의 나노전달시스템에 의해 유전자가 세포에 전달된 후 세포 활성도를 미분간섭현미경을 통하여 세포형태를 확인한 결과이고, 두번째 열은 eGFP 발현을 형광현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 세번째 열은 eGFP 발현률을 유세포분석기로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인간 섬유아세포에서 나노기술기반 전달시스템의 메커니즘을 확인한 결과를 나타낸 것이다( (a): 금 나노막대를 세포에 처리해서 레이저를 30분 동안 조사한 후 플라스미드와 리포펙타민 복합체를 30분 처리; (b) 플라스미드와 리포펙타민 복합체를 세포에 30분 처리한 후 세척하고, 금 나노막대를 처리하고 레이저를 조사; (c) 금 나노막대와 플라스미드 리포펙타민 복합체를 처리하고 레이저를 30분 처리 후 바로 새로운 배지로 교체함; (d) 플라스미드와 리포펙타민 복합체를 레이저 조사 없이 30분 동안 처리; (e) 세포가 없는 조건에서 금 나노막대와 플라스미드 리포펙타민 복합체를 처리하여 레이저를 조사한 후 세포에 이 복합체를 처리).
도 6은 인간 섬유아세포에서 본 발명의 나노전달시스템의 유전자 전달 효율성을 전달하고자 하는 플라즈미드를 형광표지한 후 형광현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 인간 섬유아세포에서 리포펙타민을 사용하지 않고, 세포에 플라스미드만을 처리하거나, 플라즈미드와 금나노막대를 처리하고 레이저를 조사한 경우의 유전자 전달효율을 나타낸 것이다.
도 8은 인간 면역세포중 T 세포주인 Jurkat cell에 본 발명의 나노전달시스템의 유전자 전달 효율을 측정한 것으로, (a)는 대조군과 비교한 나노전달시스템을 이용한 경우의 유전자 전달 효율을 나타낸 것이고, (b)는 상기 실험 조건에서 세포의 활성도를 MTT 어세이를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.

금 나노막대는 근적외선 영역대의 빛을 흡수하여 열 형태로 에너지를 방출하는 특징을 가지고 있다. 본 발명에서는 유전자 전달을 위해서 상용화되어 가장 많이 사용되고 있는 리포펙타민(lipofectamine)의 유전자 전달 효율을 높이기 위하여, 금 나노막대의 광열효과를 이용하였다. 아울러, 근적외선은 에너지 준위가 높고 조직에 존재하는 단백질 및 혈액에 의해 손실되는 에너지가 적어, 금 나노막대에 근적외선을 조사하는 경우, 많은 에너지가 금 나노막대에 전달되므로 온열효과가 높다.

본 발명에서는 금 나노막대를 직접 세포 내에 이입시켜 유전자를 전달했을 때 발생할 수 있는 세포독성을 감소시키고 리포펙타민의 낮은 유전자 전달 효율성을 높이기 위해 세포외부에 존재하는 금 나노막대에서 발생하는 국부적인 열을 이용하여 세포막의 투과도를 증가시켜 유전자 전달 효율을 높였다 (도 1a).

본 발명의 일양태에서는 CTAB(세틸트리메틸 암모늄 브롬)을 이용하여 금 나노막대를 합성하고, 세포독성을 줄이고 세포내 이입을 저해하기 위하여, 제조된 금 나노막대의 표면을 mPEG-SH로 변형하고, eGFP 유전자를 함유하는 플라스미드와 리포펙타민 복합체를 형성시킨 후 상기 금 나노막대와 플라스미드 리포펙타민 복합체를 인간 섬유아세포에 동시에 처리하고 근적외선을 조사하였을 때, 리포펙타민과 플라스미드만을 처리한 세포에 비하여, 현저히 높은 유전자 전달효과를 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 일 관점에서, 본 발명은 (a) 세포 내로 전달하고자 하는 물질과 리포좀의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 세포에 상기 복합체와 금 나노입자를 동시에 처리한 다음, 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는 세포 내 물질 전달방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 내로 전달하고자 하는 물질은 핵산, 플라스미드, 유전자 단편, 올리고핵산, 생리활성물질, siRNA, miRNA, 단백질, 리피드, 올리고 펩타이드 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 외래유전자가 삽입된 플라스미드 백터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

리포좀은 리포좀을 구성하는 양전하를 가진 지질에 의해 그 표면이 양전하를 띠고 있고, 표면이 음전하를 띠거나, 음전하를 띠도록 개질된 물질과 리포좀은 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 일양태에서 사용한 플라스미드는 인산기에 의해 음전하를 띠고 있기 때문에 정전기적 산호작용을 통해 리포좀과 복합체를 형성한다.

본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자는 금 나노막대, 금 나노스피어, 금 나노쉘, 금 나노케이지, 금 나노트라이앵글, 금 나노스타, 금 나노바이피라미드(nanobipyramid) 및 금 나노큐브로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 나노플라즈모닉 기반 광열효과를 가지는 금 나노입자라면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 금 나노입자는 세포 독성 및 세포내 이입을 저해하기 위하여, 표면이 개질된 것이 바람직하며, 상기 금나노 입자의 표면 개질은 methoxy polyethylene glycol (mPEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyroolidone (PVP), polyacrylic acid (PAA), polyacrylic maleic acid (PAMA), poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA), poly(carboxybetaine methacrylate) (PCBMA), cysteine 및 dextran으로 구성되는 군에서 선택되는 것으로 개질된 금나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리포좀은 리포펙타민, 리포펙틴, 셀펙틴, 리포펙테스 등을 사용할 수 있으며, Cellfectin, DMRIE-C, lipofectin, lipofectamine LTX, RNAiMAX, Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000, DOTAP, SAINT-RED, Avalanche-Omni, EX plex, polyfect, superfect, effectene, attractene, HiPerFect 등 시판되는 리포좀을 제한없이 사용할 수 있다.

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 리포좀을 이용해서 외래 DNA 분자를 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine (Invitrogen, USA)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열과 결합한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

본 발명에서 유전자 전달체에 의해 세포내로 운반될 수 있는 목적 뉴클레오타이드 서열은 어떠한 뉴클레오타이드 서열도 가능하며, 예컨대, 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자 [예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자], 항원성 유전자, 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포 내 물질 전달 방법은 식물세포 또는 동물세포에 이용될 수 있으며, 상기 동물세포는 곤충세포 또는 포유동물세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물세포를 사용할 수 있으며, 특히, 기존의 방법으로는 유전자 전달효율이 낮은 세포에 대하여, 전달효율을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 근적외선은 600~1000nm 파장을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 600~900nm의 파장을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 700~900nm의 파장을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 750nm~850nm의 파장을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일양태에서는 인간 섬유아세포 (D551) 세포와 인간 T 세포(Jurkat)에 eGFP 유전자를 포함하는 pcDNA3.3 플라스미드와 리포펙타민의 복합체를 810 nm 파장의 빛을 가장 효율적으로 흡수하고 mPEG로 코팅된 금 나노막대와 함께 처리하고, 808 nm의 근적외선 레이저를 30분간 조사하였을 때 인간 섬유아세포의 경우 유전자 전달 효율이 60% 이상을 유지하는 것을 확인하였으며 인간 T 세포의 경우 유전자 전달 효율이 25% 이상 유지하는 것을 확인하였다. 이는 금 나노막대 처리에 의한 광열효과를 주지 않은 대조군에 비하여 인간 섬유아세포의 경우 3배, 인간 T 세포의 경우 8배 이상 유전자 전달 효율이 향상된 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 금 나노막대 합성 및 광열효과 분석

금 나노막대를 합성하기 위해 씨앗용액과 성장용액을 각각 합성하여 혼합하였다. 상기 씨앗용액은 0.2 M의 CTAB(세틸트리메틸 암모늄 브롬)용액과 0.0005 M의 HAuCl₄용액을 각각 5 mL씩 취하여 혼합한 후 NaBH₄물질을 이용하여 환원시켜 제조하였으며, 성장용액은 0.2 M의 CTAB 용액과 0.001 M의 HAuCl₄ 용액을 각각 5 mL씩 취해서 혼합한 후 0.004 M의 AgNO₃ 280 μL와 0.0788 M의 ascorbic acid 70 μL를 차례대로 혼합하여 제조하였다. 상기 성장용액에 씨앗용액을 24 μL 첨가 한 후 1 시간 동안 반응시킨 후, 적외선/가시광선 흡광분석기, 입도분석기 그리고 투과전자현미경을 통하여 합성된 금 나노막대의 특성을 분석하였다.

상기 합성된 금 나노막대의 형태를 투과전자현미경을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 도 1의 c에 나타난 바와 같이 제조된 금 나노막대는 길이와 넓이의 비율이 약 4:1 (n=30)인 것을 확인할 수 있었다.

금 나노막대가 잘 합성되었는지 확인하기 위해 적외선/가시광선 흡광분석기를 이용하여 금 나노막대의 흡수파장을 확인하였으며, 그 결과, 도 1d의 왼쪽에 나타낸 바와 같이, 810nm 파장에서 에너지를 가장 잘 흡수하는 것으로 확인되었다.

제조된 금 나노막대의 세포 독성을 감소시키기 위해, 도 1b와 같이 금 나노입자 표면을 methoxy poly(ethylene glycol) thiol (mPEG-SH)로 코팅하였다.

적외선/가시광선 흡광분석기를 이용해 합성된 금 나노막대의 농도를 확인하고, 810 nm 파장에서 10.0 OD의 농도를 가지는 금 나노막대를 준비하였다. 그리고 0.005 M의 methoxy poly(ethylene glycol) thiol (mPEG-SH)(5k)를 준비하고 금 나노막대 용액에 200μL의 0.005M의 mPEG 용액을 추가한 후 24시간 동안 Vortexing을 통해 반응시켰다. 그 후 반응하고 남은 mPEG는 원심분리기를 이용하여 제거하고, mPEG-SH로 코팅된 금 나노막대를 수득하였다.

mPEG으로 코팅하기 전 금 나노막대는 CTAB으로만 코팅되어 있기 때문에 양전하를 띠게 되지만 mPEG으로 코팅하게 되면 음전하를 띠는 특성이 있다. 이와 같은 특성을 이용하여 mPEG 물질의 코팅 유무를 제타 전위 분석기를 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 1d의 오른쪽에 나타낸 바와 같이, mPEG으로 코팅된 금 나노막대는 -15~-20 mV의 표면전하를 띠는 것을 확인할 수 있었다.

세포 활성도에 영향을 미치지 않으면서 세포막의 투과도를 변화시킬 수 있는 금 나노막대의 적정 온도를 찾기 위하여, 금 나노막대에 808nm 빛을 30분 동안 조사하고 온도변화를 열화상카메라로 관찰하였다.

Opti MEM 배지(Gibco, USA)에 810 nm 파장의 빛을 흡수하는 금 나노막대의 최종농도가 2.0 OD가 되도록 처리한 후, 808nm 레이저(B&W TEK INC, USA,)를 30분 동안 조사하고 온도변화는 열화상 카메라를 이용하여 관찰하였다.

금 나노막대의 광열효과에 의한 세포의 활성도는 MTT 어세이를 통해 관찰하였다. 인간 섬유아세포 D551(Human fetal dermal fibroblast, ATCC number:CCL-110)를 6 well plate에 2.0 ■ 10⁵ cells/mL 분주하고 24시간 후에 리포펙타민-pcDNA3.3_eGFP 플라스미드(Addegene, USA) 복합체와 금 나노막대를 처리한 다음 레이저를 30분 동안 조사하였다. 37℃ 배양기에서 30분간 배양 한 후 리포펙타민-플라스미드 복합체, 금 나노막대를 PBS 용액을 이용해서 제거한 후 새로운 배지로 교체하였다. eGFP(녹색형광단백질)가 발현할 수 있도록 48 시간 더 배양기에서 배양한 다음 2 mg/mL MTT stock용액을 100 μL 처리하고 4 시간 동안 배양기에서 배양한다. 그리고 세포배지를 제거한 후 DMSO 1mL을 처리하고 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 레이저를 조사한 5분 동안 온도가 급격하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 5분 후에는 온도가 거의 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 810 nm 파장의 빛을 흡수하는 금 나노막대의 농도가 1.0 OD인 경우, 레이저를 조사한 30분 동안 37℃에서 40℃까지 온도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 810 nm 파장의 빛을 흡수하는 금 나노막대의 농도가 2.0 OD인 경우, 30분 동안 온도가 37℃에서 43℃까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 때 세포 활성도는 각각 90 %이상으로 유지가 되는 것을 MTT 어세이를 통하여 확인하였다(도 2b).

금 나노막대에 가해지는 에너지가 금 나노막대의 물리적인 특성을 변화시키는지 파악하기 위하여, 레이저를 조사하기 전과 후의 상태를 적외선/가시광선 흡광분석기를 통해 확인하였다. 그 결과, 도 2c에 나타난 바와 같이, 금 나노막대에 조사하는 에너지는 금 나노막대의 특성에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.

이 후의 실시예에서는 세포의 활성도에 영향을 미치지 않는 온도를 생성하는 금 나노막대의 농도를 2.0 OD로 설정하고 레이저 조사 시간을 조절하면서 효율적으로 유전자가 세포 안으로 전달될 수 있는 시스템을 구축하였다.

실시예 2: 금 나노막대에 대한 최적 레이저 조사조건 확인

세포의 활성도에 영향을 미치지 않으면서 유전자 전달 효율을 높이는 적절한 레이저 지속시간을 확인하기 위하여 리포펙타민(Invitrogen, USA) 6μL와 플라스미드 6μg를 혼합하여 복합체를 형성시킨 후 810 nm 파장의 빛을 흡수하는 금 나노막대의 최종농도가 2.0 OD가 되도록 추가로 처리한 후에 레이저(BWF2-808-2-400-0.22-SMA, B&W TEK INC, USA)를 10분, 30분, 60분 동안 조사하였다 (도 3). 레이저를 10분 조사한 실험군에서는 레이저 처리후 50분동안 세포를 금 나노막대 및 복합체와 배양시킨후 금 나노막대 및 복합체를 세척하였고, 레이저를 30분 조사한 실험군에서는 레이저 처리후 30분 동안 세포를 금 나노막대 및 복합체와 배양시킨후 금 나노막대와 복합체를 세척하였고, 레이저를 60분 조사한 실험군에서는 레이저 처리후 바로 금 나노막대 및 복합체를 세척하였다. 이러한 세척후 모든 실험군들은 유전자 전달 효율을 분석하기 위해서 48시간 동안 더 배양하였다.

사용한 세포주는 인간 섬유아세포 D551(Human fetal dermal fibroblast, ATCC number:CCL-110)로 6 well plate에 2 ■ 10⁵cells/mL세포를 배양한 후 레이저를 조사하였다. 배양조건은 DMEM 배지에 10 % FBS, 100 μg/mL penicillin-streptomycin, 1x의 MEM Non-essential amino acids를 혼합하여 사용하였으며 37℃ 배양기에서 배양하였다. 유전자 전달효율 확인을 위해 사용한 플라스미드는 녹생형광단백질(eGFP)을 발현할 수 있는 pcDNA3.3_eGFP (Addegene, USA)를 사용하였다.

유전자 전달 효율은 유세포분석기를 이용해서 단일세포의 녹생형광단백질(eGFP)의 형광세기 측정을 통해 분석하였다. 이 때 대조군은 리포펙타민과 플라스미드를 세포에 처리하지 않은 그룹으로 X축 상에서 10⁰~10¹ 사이에 eGFP형광을 발현하지 않은 세포들이 포함될 수 있도록 flowjo라는 프로그램상에서 조정해준 다음 그 범위를 벗어나서 형광을 띠기 시작하는 세포들을 형광세기별로 계수하여 그래프로 나타내었으며 전체세포 중에서 몇 개의 세포가 형광을 띠고 있는지 계산하여 백분률로 기재하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 금 나노막대와 레이저처리 없이 플라스미드 6μg 와 리포펙타민 6μL을 세포에 처리한 대조군은 22.70%의 유전자 전달 효율을 보였고, 10분, 30분 및 60분 동안 세포에 레이저를 조사하고 유전자 전달 효율을 측정한 결과, 각각 34.90%, 61.07% 및 52.47%로 확인되었다. 레이저를 30분 동안 조사한 세포는 대조군과 세포 활성도를 비교하였을 때 거의 차이가 없었고 유전자 전달 효율은 38.37% 증가한 반면 60분 동안 레이저를 조사한 세포는 유전자 전달 효율이 30분 동안 레이저를 조사한 세포에 비해 10% 정도 감소하였을 뿐만 아니라 세포의 활성도도 70% 이하로 유지되었다 (도 3a 및 도 3b). 이 결과를 바탕으로 유전자 전달 효율은 60% 이상 유지되면서 세포 활성도에 영향이 없는 30분의 조사시간으로 이 후 실시예를 진행하였다.

실시예 3: 유전자 전달에 적합한 플라스미드와 리포펙타민 비율 확인

유전자 전달에 최적의 플라스미드와 리포펙타민의 비율을 확인하기 위하여, 리포펙타민 각각 2μL, 4μL, 6μL 및 8μL에, 1μg/μL 농도의 플라스미드를 2μL, 6μL, 12μL 및 18μL로 각각 혼합하여, 표 1에 기재된 비율별로 유전자 전달 효율을 확인하였다.

플라스미드 6μL를 사용하고, 리포펙타민 4μL, 6μL 및 8μL를 사용하였을 때, 유전자 전달 효율은 각각 60.30%, 62.10% 및 61.60%이었으며, 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 반면 플라스미드를 18μL 사용한 경우는 리포펙타민(4μL, 6μL 및 8μL)을 처리하였을 때, 오히려 6μL의 플라스미드를 사용하였을 때보다 약 10% 정도 유전자 전달 효율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 그 이유는 플라스미드양이 적정 수준보다 세포 안으로 많이 전달되었을 때 오히려 플라스미드끼리 복합체를 형성하여 유전자 발현을 저해하기 때문일 것으로 판단된다.

유전자 전달효율이 가장 좋다고 판단되는 플라스미드와 리포펙타민의 비율을 1:1로 고정하고 그 양을 증가시키면서 유전자 발현 효율을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 플라스미드와 리포펙타민의 양이 각각 12μL일 때까지 유전자 전달 효율은 60.0% 이상을 유지하였으나 플라스미드 18μL에 리포펙타민을 18μL 추가하여 세포에 처리하였을 경우 유전자 발현 효율이 약 20.0% 정도 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 유전자 전달 효율을 종합적으로 확인하였을 때, 유전자 전달 효율성을 높이기 위해서는 리포펙타민과 플라스미드의 비율과 세포에 처리해주는 양이 중요한 것으로 확인되었다.

실시예 4: 본 발명의 나노전달시스템의 유전자 전달 메커니즘 규명

본 발명의 나노전달시스템은 금 나노막대의 광열효과에 의해 세포막의 투과도를 변화시켜 플라스미드와 리포펙타민 복합체가 세포 내 이입 경로를 통해 전달될 뿐만 아니라 다른 방법을 통해서도 세포 안으로 전달될 것이라고 가정하였다.

이러한 메커니즘을 규명하기 위해 다양한 조건을 설정하여 유전자 전달 효율을 확인하였다.

금 나노막대를 세포 배양액에 첨가하고 레이저를 30분 동안 조사하고 플라스미드-리포펙타민 복합체를 추가로 30분 동안 처리한 후 바로 금 나노막대와 복합체를 세척 후 48시간 동안 배양한 (a) 실험군의 경우, 유전자 전달 효율이 10.30%이었으며(도 5a), 플라스미드와 리포펙타민을 세포에 30분 동안 처리하고 복합체를 세척한 후, 금 나노막대를 첨가하고 바로 레이저를 30분 조사하고 금 나노막대를 세척한 후 48시간 동안 배양한 (b) 실험군의 경우, 9.37%의 유전자 전달 효율을 나타내었다 (도 5b).

반면, 세포를 금 나노막대와 플라스미드-리포펙타민으로 동시에 처리하고, 레이저를 30분 동안 조사하고 바로 금 나노막대와 복합체를 세척한 후 48시간 동안 배양한 (c) 실험군의 경우 유전자 전달 효율은 46.30%이었다 (도 5c). 이 결과를 통하여 (a) 조건을 (c) 조건과 비교하였을 때 세포막의 투과도가 금 나노막대의 광열효과가 존재하는 동안에만 변화를 보인다는 것을 확인할 수 있었으며 그 변화에 의해 플라스미드-리포펙타민 복합체 전달이 잘 되는 것을 확인할 수 있었다.

(d) 실험군은 플라스미드와 리포펙타민 복합체를 레이저 조사 없이 30분 동안 처리하였으며(도 5d), (e) 실험군은 세포가 없는 조건에서 금 나노막대와 플라스미드 리포펙타민 복합체를 혼합하고 레이저를 30분 동안 조사한 후 세포에 이 레이저처리가 된 금나노입자와 복합체를 30분간 처리하고 세척후 48시간 동안 배양하였다 (도 5e).

그리고 (b) 실험군의 경우 세포 내 이입경로를 통해 세포 안으로 들어간 후 엔도좀에 쌓인 리포펙타민-플라스미드 복합체는 리포펙타민-플라스미드 복합체만 세포에 30분 동안 처리한 (d) 실험군과 비교하였을 때 유의한 차이가 없는 것으로 보아 엔도좀에 쌓인 리포펙타민 플라스미드 복합체는 금 나노막대의 광열효과에 영향을 받지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 5d). 세포 없이 금 나노막대와 플라스미드-리포펙타민 복합체에 레이저를 30분 동안 조사한 후 세포에 처리한 실험군의 유전자 전달 효율은 11.60%로 나타났으며 금 나노막대 없이 플라스미드-리포펙타민 복합체를 세포에 30분 동안 처리한 결과와 크게 차이가 없는 것으로 나타났다(도 5). 이는 금 나노막대의 광열효과가 리포펙타민과 플라스미드 복합체의 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 것이다.

금 나노막대의 광열효과에 의한 유전자 전달 효율성을 증명하기 위하여, 유전자를 염색할 수 있는 Sybr green 염색약을 이용하여 플라스미드를 염색한 후 리포펙타민과 복합체를 형성시켰다. 그리고 리포펙타민-플라스미드 복합체와 금 나노막대를 함께 처리한 후 레이저를 30분 동안 조사하고 30분 더 반응시간을 준 다음 공초점현미경(confocal microscopy)을 이용하여 세포 안에서 플라스미드의 분포를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 리포펙타민-플라스미드 복합체만 세포에 처리한 경우 플라스미드가 핵 보다는 세포질에 더 많이 분포하는 것을 확인할 수 있었고 리포펙타민-플라스미드 복합체에 금 나노막대를 처리하고 레이저를 조사한 실험의 경우 대조군에 비해 더 많은 플라스미드가 세포질에 분포할 뿐만 아니라 핵에도 대조군에 비해 더 많이 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.

이 결과를 통해 금 나노막대의 광열효과에 의해 플라스미드가 세포질뿐만 아니라 핵 안으로도 잘 전달될 수 있기 때문에 리포펙타민만 사용하여 유전자를 전달 했을 때보다 더 높은 효율로 유전자가 전달되는 것을 알 수 있다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 플라스미드만을 세포에 처리하였을 경우 0.8 %정도의 유전자 전달 효율을 보이고, 리포펙타민 없이 금 나노막대와 플라스미드만 처리한 후 레이저를 조사하였을 때 세포의 유전자 전달 효율이 증가하지 않아, 금 나노막대처리에 의한 광열효과는 리포펙타민과 복합체를 이룬 물질의 경우에만 세포 내 전달 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

아울러, 섬유아세포와 유사하게 기존의 리포펙타민으로 유전자 전달효율 및 형질변환효율이 매우 낮다고 알려진 인간 세포인 인간 T 세포(Jurkat cell)에 본 발명의 나노전달시스템을 적용시켜 유전자 전달효율을 확인하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8의 (a)의 왼쪽 그래프는 6μL 리포펙타민과 6μg 플라스미드의 복합체만 인간 T 세포에 1시간동안 처리한 후 48시간 동안 배양한 그룹이고 오른쪽 그래프는 6μL 리포펙타민과 6μg 플라스미드의 복합체와 2 OD의 금 나노막대를 동시에 처리한 후 808 nm 근적외선 레이저를 30분 동안 조사한 후 30분 동안 배양하고 세척한 후 다시 48시간 동안 배양한 결과를 나타낸 것으로, 금 나노막대를 처리하고 레이저를 조사한 그룹의 유전자 전달 효율이 대조군에 비해 약 8배 이상 증가한 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 본 발명의 나노전달시스템은 인간 섬유아세포뿐만 아니라 인간 T 세포에 유전자 전달 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 상기 실험조건은 인간 T 세포의 활성도에 영향을 주지 않는다는 것을 MTT 어세이를 통해 확인하였다 (도 8b).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 세포 내 물질 전달방법:
(a) 세포 내로 전달하고자 하는 물질과 리포좀의 복합체를 형성시키는 단계; 및
(b) 세포에 상기 복합체와 금 나노입자를 동시에 처리한 다음, 근적외선을 조사하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 세포 내로 전달하고자 하는 물질은 핵산, 플라스미드, 유전자 단편, 올리고핵산, 생리활성물질, siRNA, miRNA, 단백질, 리피드, 올리고 펩타이드 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 금 나노입자는 금 나노막대, 금 나노스피어, 금 나노쉘, 금 나노케이지, 금 나노트라이앵글, 금 나노스타, 금나노 바이피라미드 및 금 나노큐브로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 리포좀은 리포펙타민, 리포펙틴, 셀펙틴, RNAiMAx, DMRIE-C, DOTAP, SAINT-RED, Avalanche-Omi, EX plex, polyfect, superfect, effectene, attractene, HiPerFect및 리포펙테스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 동물세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 근적외선은 600~1000nm 파장을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 세포독성 억제 및 세포내 이입을 저해하기 위하여 표면이 개질된 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 금나노 입자의 표면 개질은 methoxy polyethylene glycol (mPEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyroolidone (PVP), polyacrylic acid (PAA), polyacrylic maleic acid (PAMA), poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA), poly(carboxybetaine methacrylate) (PCBMA), cysteine 및 dextran으로 구성되는 군에서 선택되는 것으로 수식되는 것을 특징으로 하는 방법.