KR20170013856A

KR20170013856A - 신경계 장애를 갖는 인간에서의 인식 및 사회적 행동을 개선시키기 위한 화합물

Info

Publication number: KR20170013856A
Application number: KR1020167025243A
Authority: KR
Inventors: 메흐다드 샴루; 비트나 이; 푸네 메마르 아데스타니
Original assignee: 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
Priority date: 2014-02-18
Filing date: 2015-02-18
Publication date: 2017-02-07
Also published as: EP3122350A2; WO2015126915A2; EP3122350A4; US20160184315A1; CA2940059A1; US9849134B2; WO2015126915A3; CN106456649A; JP2017505826A; MX2016010662A

Abstract

본 발명은 생체내 가수분해성이어서 β₁-ADR 작용제 화합물을 방출하며, β₁-ADR 작용제 화합물에 대한 전구약물 화합물에 더 큰 친유성 및 CNS 생체이용률을 부여하는 기를 포함하는 β₁-ADR 작용제 전구약물 화합물에 관한 것이다.

Description

신경계 장애를 갖는 인간에서의 인식 및 사회적 행동을 개선시키기 위한 화합물{COMPOUNDS FOR IMPROVING COGNITION AND SOCIAL BEHAVIOR IN HUMANS HAVING NEUROLOGICAL DISORDERS}

연방정부 지원 연구 또는 개발에 대한 성명

연방 정부는 본 발명을 이르게 하는 작업이 미국 국립 신경계 장애 및 뇌졸중 협회 (NINDS)로부터 계약 NS069375-01A1에 의하여 적어도 부분적으로 자금을 지원하였으므로 본 발명에서 일부 권한을 가질 수 있다

신경변성 장애, 병태 및 질환, 예컨대 알츠하이머병 (AD)은 현대 사회에서 계속 증가하는 문제이다. AD 단독은 전세계적으로 24백만 인간들이 앓고 있으며, 그의 발병은 노령화 인구 및 더 높은 진단율 모두로 인하여 지수적으로 증가되는 것으로 예상된다. FDA에 의하여 승인된 현재 시판 중인 AD 약물, 예컨대 콜린에스테라제 억제제 및 메만틴은 증상 완화만을 제공한다. AD는 현재는 불치로 남아 있다. 의심할 여지 없이, AD에 대한 효과적인 요법의 부재는 발병과 관련된 요인의 복잡한 배열 및 질환의 진행에 기인할 수 있다. 예를 들면, AD 발생 및 진행은 뉴런 및 시냅스의 손실, 다양한 신경전달물질계의 변경, 아밀로이드판 및 신경원섬유 매듭의 축적 및, AD의 다양한 단계에서 관찰된 아밀로이드판을 둘러싼 반응성 성상세포 및 활성화된 미세아교세포의 존재에 의하여 입증된 만성 염증을 특징으로 한다. 이러한 증상의 배열은 AD를 갖는 인간에 대한 유효 요법을 개발하는데 관련된 복잡한 곤란성을 강조하며, AD 병리학의 각종 핵심 표적 포인트의 동시 변경은 이에 대한 가장 포괄적인 요법을 대표한다는 것을 나타낸다.

얼굴 (사회적 인지)의 인지 불능은 알츠하이머병 (AD)을 비롯한 수개의 신경계 장애의 규정된 내적표현형이다. 여전히, 이러한 증상의 근본 원인은 난제로 남아 있다. 수개의 연구는 사회적 인지에서 옥시토신 및 바소프레신의 역할을 강조하며, 낮은 수준의 옥시토신은 자폐 환자에서 안면 인지에서의 결핍에 대한 원인이 되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, AD 환자에서, 사후 연구는 정상의 환자에서의 수준보다 더 높은 것으로 보이는 해마를 제외하고, 중추 바소프레신 및 옥시토신 농도에서의 차이를 나타내지 못하였다. 이는 옥시토신 수준에서의 변동이 AD의 사회적 인지에서의 결핍의 기초가 되지 않는다는 것을 나타내며, 사회적 인지에 대한 원인이 되는 신경 회로의 불완전한 이해를 지적한다. 추가로, 인간에 의한 옥시토신 사용의 장기간 효과는 알려지지 않았으며, 유해한 것으로 입증될 수 있다.

AD의 잘 규정된 병리학적 특징은 뇌에서의 노르아드레날린 (NA)의 주요 공급원인 청반에서의 신경세포의 변성이다. 이러한 변성은 NA의 차후의 감소 및 아드레날린성 수용체의 감소된 활성화와 관련되어 있다. 아드레날린성 수용체는 각종 세포내 신호 경로를 통한 NA의 뚜렷한 작용을 매개하며, 학습 및 기억 과정에서 중요한 역할을 한다. 최근, 인식 기능에서의 β-아드레날린계, 구체적으로 β₁-아드레날린성 수용체 (β₁-ADR)의 기여가 관심을 받아 왔다. 예를 들면, β-ADR에서의 NA 작용은 억제성 시냅스 작용을 조정한다. 기타 연구는 β₁-선택성 길항제 베탁솔롤이 야생형 마우스 및 래트에서의 공간 항행 상기(retrieval) 결핍을 생성하는 한편, NA 결핍증을 갖는 마우스에서 관찰된 상기 결핍은 β₁-부분 작용제 사모테롤(xamoterol)에 의하여 구제될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 β₁-ADR에 의하여 매개되는 NA 신경전달이 NA 변성을 특징으로 하는 신경계 장애에서 관찰되는 인식 결핍에 임계적으로 관련될 수 있다.

불행하게도, 알츠하이머병의 기본이 되는 신경 및 궁극적으로 분자적 원인의 불완전한 이해는 이에 대한 효과적인 요법의 결여에 기여한다. 인식 및 사회적 인지/사회적 기억 모두를 개선시키기 위한 효과적인 요법도 또한 자폐증에 대한 유용한 요법이 될 것이다. 유사하게, 본 발명은 인식 및 사회적 행동 모두를 개선시키기 위한 수단을 제공하므로, ADD 및 ADHD 모두의 치료 방법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 인식(cognition) 및 사회적 인지(social recognition)를 개선시키기에 충분한 양으로 β₁-아드레날린성 수용체 작용제 또는 그의 전구약물-화합물 또는 둘다인 화합물 1종 이상 또는 상기 화합물 중 어느 하나 또는 둘다의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병, 다운 증후군, ADD, ADHD 또는 자폐증을 갖는 인간에서 인식 및 사회적 인지를 개선시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 생체내 가수분해시 β₁-아드레날린성 수용체 작용제를 방출하는 다수의 전구약물 β₁-아드레날린성 수용체 작용제 화합물 및 이를 함유하는 조성물을 제공한다. β₁-ADR 작용제 전구약물은 β₁-ADR 작용제 화합물에 대한 개선된 친유성 및 CNS 생체이용률을 갖는다.

본 발명은 추가로 β₁-ADR 작용제 화합물의 라세미 혼합물 대신에 별도로 사용될 수 있는 키랄 중심을 갖는 상기 화합물의 R- 및 S-거울상이성질체 화합물뿐 아니라, 이들 거울상이성질체 화합물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병, 다운 증후군, ADD, ADHD 및/또는 자폐증을 나타내는 인간에서의 사회적 기억 및 기타 인식 특성을 개선시키는 방법을 제공한다.

도 1: 알츠하이머병의 APP 마우스 모델은 손상된 사회적 인지 및, MeA에서의 β₁-ADR 발현의 상향조절을 특징으로 한다. 좌측에는, 실험의 대표적 개략도가 도시되어 있다. (A) 야생형 (WT; n=11) 및 APP (n=9) 미에(Mie) 둘다는 비어있는 컵에 비하여 낯선 C57B1/6 침입물 마우스를 함유하는 컵을 조사하여 정상적 사회성 (*** p<0.0001, 대응표본 t-테스트에 의함)을 나타낸다: (B) 그러나, WT는 익숙한 것에 비하여 새로운 C56B1/6 침입물에 대한 선호를 나타내며 (** p<0.0067, 대응표본 t-테스트에 의함), APP 마우스는 사회적 인지 결핍을 나타내는 이러한 선호를 나타내지 않았다 (p=0.2780, 대응표본 t-테스트에 의함). 사회적 인지에서의 이러한 결핍은 비-사회적 냄새 인지에서의 결핍과 관련되지 않는다. (C) WT (n=7) 및 APP (n=8) 마우스 모두는 비어있는 튜브보다는 헵탄올 용액을 함유하는 튜브를 더 많이 냄새 맡았다 (** p<0.01, 대응표본 t-테스트에 의함); (D) 유사하게, WT 및 APP 마우스 둘다는 익숙한 것 (헵탄올 단독)에 비하여 새로운 알콜 냄새 (헵탄올:옥탄올 용액)를 함유하는 튜브에 대한 선호를 나타내며 (** p=0.0062 및 *** p=0.0001, 대응표본 t-테스트에 의함), 이는 유전형 둘다 익숙한 비-사회적 냄새를 기억할 수 있다는 것을 나타낸다. 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다.
도 2: β₁-ADR의 활성화는 사회적 인지에 필요하다. 좌측에서, 실험 설계의 대표적 개략도에 이어서 사회적 인지 평가를 나타낸다. 0.01 내지 1 ㎎/㎏ 범위내의 다양한 투여량의 베탁솔롤을 사용한 β₁-ADR의 차단 (군당 n=8)은 사회적 학습이 아니라 손상된 사회적 인지에 영향을 미쳤다. (A) 베탁솔롤 또는 비히클을 주사한 모든 마우스는 비어있는 컵에 비하여 낯선 C57B1/6 마우스를 함유하는 컵을 선호하였다 (*** p<0.0001, 대응표본 t-테스트에 의함). (B) 그러나, 0.1 또는 1 ㎎/㎏의 베탁솔롤을 주사한 마우스는 익숙한 것에 비하여 새로운 C56B1/6 침입물 마우스에 대한 선호를 나타내지 않았으며 (ns, 대응표본 t-테스트에 의함), 이는 손상된 사회적 인지를 나타내는 한편, 비히클 또는 0.01 ㎎/㎏의 베탁솔롤을 주사한 마우스는 이러한 선호를 나타내며 (** p=0.003 및 0.008 각각 대응표본 t-테스트에 의함); 베탁솔롤은 비-사회적 냄새 인지를 손상시키지 않았으며; (C) 비-사회적 냄새 인지의 테스트에서, 베탁솔롤은 비어있는 튜브에 비하여 헵탄올 용액을 함유하는 튜브에 대한 마우스의 선호에 영향을 미치지 않았으며 (비히클 n=7 *** p=0.0004; 베탁솔롤 n=7 ** p=0.0016, 대응표본 t-테스트에 의함), (D)는 익숙한 냄새 (헵탄올) 대 새롭지만 유사한 냄새 (헵탄올:옥탄올의 용액) 사이를 마우스가 구별하는 능력에 영향을 미치지 않는다 (비히클 ** p=0.019; 베탁솔롤 ** p=0.0015, 대응표본 t-테스트에 의함). (E) 사회적 인지 테스트 이전에 사모테롤 (3 ㎎/㎏)의 전신 주사는 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물에 대한 WT (n=10) 및 APP (n=10) 마우스의 선호에 영향을 미치지 않지만 (*** p<0.0001, 대응표본 t-테스트에 의함); (F) APP 마우스에서 이전에 관찰된 사회적 인지 결핍을 구제하며 (도 1B 참조); 사모테롤로 주사한 그의 WT 대조군 한배새끼 (n=10)와 유사하게, 사모테롤을 주사한 APP 마우스 (n=10)는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물에 대한 선호를 나타냈다 (WT; * p=0.0198; APP: ***p=0.0001,, 대응표본 t-테스트에 의함).
도 3: β₁-ADR의 활성화는 사회적 신호의 습득에 필요하다. (A) 대조군 마우스 (FVB 마우스 n=16) (*** p=0.0002)와 유사하게, 3-챔버 테스트에서 테스트한 β₁-ADR KO 마우스 (n=17)는 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물을 함유하는 컵에 대한 선호를 나타낸다 (*** p<0.0001). 그러나, β₁-ADR KO 마우스는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물을 인지하지 못한 반면, 그의 WT 대조군은 이러한 구별을 하였다 (** p=0.005, 대응표본 t-테스트에 의함). (B) 대조군 FVB 마우스 (n=8; *** p<0.0001) 또는 3 ㎎/㎏의 베탁솔롤로 처치한 β₂-ADR KO 마우스 (n=8; ** p=0.001)와 유사하게, β₂-ADR KO 마우스 (n=8)는 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물을 함유하는 컵에 대한 선호를 나타낸다 (*** p=0.0002). FVB 대조군 및 β₂-ADR KO 마우스 둘다는 β₂-ADR이 결여된 마우스에서조차 정상의 사회적 인지 능력을 나타내는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물에 대한 선호를 나타내며 (*** p=0.0004, 대응표본 t-테스트에 의함); 게다가 베탁솔롤은 β₂-ADR KO 마우스에서의 사회적 인지 능력을 효과적으로 손상시키는데 (ns, 대응표본 t-테스트에 의함), 이는 사회적 인지에 대한 베탁솔롤 효과가 β₂-ADR에 의하여 조정되지 않는다는 것을 시사한다. 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다. (C) 테스트의 상기 단계 전 30 분에 베탁솔롤 (1 ㎎/㎏)의 전신 주사는 사회적 인지를 손상시키지 않으며; 비히클-주사한 및 베탁솔롤-주사한 마우스 (n=8) 둘다는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물을 선호하였다 (** p=0.0023 및 * p=0.0136 각각, 대응표본 t-테스트에 의함). (D) 테스트의 학습 단계 전 20 분에 베탁솔롤 (1 ㎎/㎏)의 전신 주사는 단기간 사회적 인지를 손상시켰으며; 베탁솔롤-주사한 마우스 (n=8)는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물을 선호하지 않았으며 (ns p=0.3889, 대응표본 t-테스트에 의함), 이는 사회적 인지 결핍을 나타내는 한편, 비히클-주사한 마우스 (n=8)는 이러한 선호를 나타냈다 (*** p=0.0007, 대응표본 t-테스트에 의함). (E) 테스트의 학습 단계 전 20 분에 베탁솔롤 (1 ㎎/㎏)의 전신 주사는 장기 사회적 기억을 손상시켰으며; 학습 단계 후 24 시간에 베탁솔롤-주사한 마우스 (n=8)는 이러한 선호를 나타냈다 (* p=0.0119). 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다.
도 4: 내측 편도 (MeA)에서의 β₁-ADR의 활성화는 사회적 인지에 필요하다. (A) 사회적 인지 과제에서의 테스트 이전에 베탁솔롤 (1 ㎎/㎏)의 주사는 MeA에서의 c-Fos 양성 세포의 개수를 감소시켰다 (비히클-주사한 마우스 n=4; 베탁솔롤-주사한 마우스 n=4; ** p=0.0076, t-테스트에 의함). (B) 관상 절편의 대표적인 개략도는 MeA에서의 주사를 나타낸다. (C) 마우스에게 MeA에 비히클 (n=5) 또는 30 nmol의 베탁솔롤 (n=5)을 주사하였다. 베탁솔롤은 사회적 학습에 영향을 미치지 않으면서 마우스에서의 사회적 인지를 손상시킨다. 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다. 축적 바아, 50 ㎛. (D) 마우스에게 MeA에 비히클 (n=4) 또는 PKA 억제제 (2.75 nmol - n=5)를 주사하였다. PKA 억제는 비어있는 컵에 비하여 낯선 동종에 대한 마우스의 존재에 대하여 영향을 미치지 않지만 (비히클 처치된 마우스: * p=0.047 및 PKA 억제제 처치된 마우스: * p=0.02, 대응표본 t-테스트에 의함), 마우스가 새로운 및 익숙한 동종 사이를 인지하는 능력을 손상시켰다 (비히클 처치된 마우스 * p=0.031 및 PKA 억제제 처치된 마우스: ns, 대응표본 t-테스트에 의함).
도 5: CREB 인산화는 사회적 인지에 필요하다. (A) pCREB의 웨스턴 블롯 분석은 사회적 습득 (SA) (기준선) (n=6) 이전, 사회적 습득의 3 (n=6) 또는 5 분 (N=5) 직후 및, 5 분 사회적 습득 (n=6) 후 10 분에 C57B1/6 마우스의 MeA 추출물에 수행하였다. pCREB 발현은 기준선 값과 비교시 5 분의 사회적 학습 후 유의하게 증가되었으며 (*, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어서 사후 분석(post hoc test) (**, p=0.0333)), 사회적 학습이 종료된 후 10 분에 감소되었다 (**, 일원 분산 분석에 이어서 사후 분석 (** p=0.0333)). 상대적 광학 밀도는 CREB에 대하여 정규화하였다. (B) pCREB의 웨스턴 블롯 분석은 사회적 학습 전 60 분에 베탁솔롤 (1 ㎎/㎏) 또는 비히클 (군당 n=5)로 전신 주사한 C57B1/6 마우스의 MeA 추출물에 수행하고, 사회적 상호작용의 5 분 후 안락사시켰다. pCREB 발현은 베탁솔롤-주사에서 유의하게 감소되었다 (* p=0.0113, t-테스트에 의함). (C) pCREB의 웨스턴 블롯 분석은 안락사 전 5 min (n=6), 15 min (n=6) 및 30 min (n=5)에 β₁-ADR 부분 작용제 사모테롤 (3 ㎎/㎏)로 전신 주사한 C57B1/6 마우스의 MeA 추출물에 수행하였다. pCREB 발현은 기준선과 비교시 주사 후 5 분에 증가되었다 (n=5) (*, 일원 분산 분석에 이어서 사후 분석 (* p=0.0415)). 상대적 광학 밀도는 CREB에 대하여 정규화하였다. (D) 사회적 학습 전 사모테롤 (n=4 APP, n=5 WT) 또는 비히클 (n=4 APP, n=4 WT)을 주사한 APP 마우스 및 WT 대조군의 내측 편도의 핵 분획의 웨스턴 블롯 분석은 핵 pCREB의 수준이 APP 마우스에서보다 더 낮다는 것을 나타내며 (*, 일원 분산 분석에 이어서 사후 분석), 사모테롤 주사군에서 유의하게 더 높았다 (**, 일원 분산 분석에 이어서 사후 분석 (**, p=0.011)). 상대적 광학 밀도는 히스톤 H3에 대하여 정규화하였다. 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다.
도 6: 베탁솔롤 (1 ㎎/㎏)을 사용한 β₁-ADR의 차단은 비-사회적 냄새 인지 및 물체 인지와는 관계 없이 사회적 인지를 손상시켰다. (A) 3-챔버 사회적 인지 테스트에서, 테스트의 학습 단계 전 베탁솔롤의 전신 주사는 비어있는 컵에 비하여 컵 안의 낯선 침입물에 대한 마우스의 선호를 변경시키지 않았다 (비히클-τττβ주사된 마우스 n=10 *** p=0.0005, 대응표본 t-테스트에 의함; 베탁솔롤-주사한 마우스 n=10 ** p=0.0015, 대응표본 t-테스트에 의함). 그러나, 베탁솔롤은 사회적 인지를 손상시키며: 베탁솔롤-주사한 마우스는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물 에 대한 선호를 나타내지 않았으며 (p=0.7127, 대응표본 t-테스트에 의함), 비히클-주사한 마우스는 이러한 선호를 나타냈다 (** p=0.0082, 대응표본 t-테스트에 의함). (B) 베탁솔롤은 비-사회적 냄새 인지를 손상시키지 않았으며: 비-사회적 냄새 습관화, 탈습관화 및 인지의 테스트에서, 비히클-주사한 (n=10) 및 베탁솔롤-주사한 (n=10) 마우스 모두는 3회의 연속적 노출 과정에서 비-사회적 냄새 (물 및 바닐라)에 습관화되고, 새로운 냄새를 제시하였을 때 탈습관화되었다 (물 습관화: 비히클 *** p<0.0001; 베탁솔롤 ^τττ p<0.001; 물 습관화: 비히클 ** p=0.0011; 베탁솔롤 ^τττ p<0.001; 바닐라 습관화: 비히클 888 p=0.0001; 베탁솔롤 ^τττ p=0.0029). 모든 마우스는 또한 3번째로 바닐라 냄새를 제시할 때 냄새 맡는 시간에 대한 민트 냄새를 제시할 때의 더 긴 냄새 맡는 시간에 의하여 나타낸 바와 같이 이전에 제시된 냄새 (바닐라) 및 새로운 냄새 (민트) 사이를 구별할 수 있었다 (비히클 ** p=0.0025; 베탁솔롤 ^ττ p=0.0017). (C 및 D) 마우스가 새로운 것에 비하여 익숙한 냄새 또는 물체 각각을 인지하는 능력은 베탁솔롤에 의하여 영향을 받지 않았다. 비히클-주사한 (n=10 *** p<0.0001, 대응표본 t-테스트에 의함) 및 베탁솔롤-주사한 (n=10 ** p=0.0015, 대응표본 t-테스트에 의함) 마우스 둘다는 물체 인지 테스트에서 익숙한 것에 비하여 새로운 냄새 또는 물체를 선호하였다. 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다.
도 7: (A) c-Fos 발현은 사회적 인지 후 90 분에 MeA에서 유발되었다. c-Fos 양성 세포의 정량화는 비편견 입체해석 방법을 사용하여 대조군 마우스 (n=4) 및 사회적 인지 과제에 노출된 마우스 (n=$)에서 수행하였다 (* p-0.0303, t-테스트에 의함). (B) c-Fos 발현은 사회적 인지 후 기저측 편도 (BLA)에서 유발되지 않았다. c-Fos 양성 세포의 정량화는 대조군 마우스 (n=4) 및 사회적 인지 과제에 노출된 마우스 (n=4)에서 비편견 입체해석 방법을 사용하여 수행하였다 (p=0.4857, 맨-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의함). (C) 사회적 인지 과제에서 테스트 전 베탁솔의 주사는 사회적 기억에 관련되지 않은 뇌 부위인 시상 (PV)에서 c-Fos 양성 세포의 개수에 영향을 미치지 않으며, β₁-ADR에서는 불량하였다 (비히클-주사한 마우스 n=4; 베탁솔롤-주사한 마우스 n=4; p=0.8571, 맨-휘트니 테스트에 의함). 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다. 축적 바아, 100 ㎛ (확대된 박스) 및 200 ㎛.
도 8: pCREB의 웨스턴 블롯 분석은 대조군 마우스 및 APP 마우스 (군당 n=4)의 내측 편도로부터의 전 조직 균질물에 수행하였으며, pCREB 수준은 APP 마우스에서 유의하게 더 높았다 (*, p=0.0286, 맨-휘트니 테스트에 의함). 상대적 광학 밀도는 CREB에 대하여 정규화하였다. 데이타는 평균±SEM으로서 제시한다.
도 9: 예를 들면 AD에 대한 치료제로서 β₁-ADR 작용제 화합물 (또는 그의 전구약물 또는 유도체)의 작업 모델을 예시한다. β₁-ADR의 활성화는 인식 기능의 복원 이외에 독특한 질환 변경 효과를 제공할 수 있다.
도 10: AD, DS, ADD, ADHD 및 자폐증의 치료를 위한 치료적 화합물로서 개개의 화합물 및 그의 전구약물의 효능을 측정하기 위하여 사용되는 방법론의 개략도를 도시한다.
도 11: (A) 사모테롤의 약리학을 도시하며, 사모테롤은 β₁-ADR 작용제로서 cAMP 신호를 자극하지만 (A), β-아레스틴 경로에는 효과가 없다 (B). 반대로, 이소프레날린은 cAMP 및 β-아레스틴 경로 둘다를 활성화시킨다.
도 12: C57B1/6 마우스를 맥락 기억의 손상을 초래하는 β₁-ADR 길항제 베탁솔롤의 단일 투여량 (1 ㎎/㎏)으로 처치한다.
도 13: Thy1-APP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스에서 관찰된 사회적 기억 (A) 및 작업 기억 (B)에서의 결핍이 사모테롤의 급성 피하 투여에 의하여 구제된다는 것을 예시한다. (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. Non-tg: 비-트랜스제닉).
도 14: Thy1-APP^Lond ^/ ^Swe ⁺ (Tg) 마우스의 내측 편도에서 β₁-ADR 발현의 상향조절이 DAB-염색에 의하여 검출된다는 것을 예시한다 (*p<0.05; Non-Tg=비-트랜스제닉).
도 15: 5XFAD 마우스에서의 사모테롤을 사용한 만성 투여의 효과를 예시한다: (A) 서술 기억에서의 결핍 (기회 수준(chance level)보다 크게 높지 않은 구별비)은 사모테롤 처치에 의하여 구제된다. (B 및 C) 모리스 워터(Morris-Water) 미로 (탈출 잠복기 - B 및 주촉성 시간 - C)에서의 수행은 처치로 개선되었다. Ns: 기회 수준보다 유의하게 높지 않음; *p=0.05; **p<0.001; ***p<0.001. 사모테롤을 사용한 만성 투여는 활성화된 미세아교세포 및 Aβ 플라크 청소율을 증가시켰다. (D) 위쪽 사진, 항-Iba1 항체 (활성화된 미세아교세포에 대한); 아래쪽 사진, 6E10 항-아밀로이드 Aβ항체로 염색시킨 50 ㎛ 관상 절편 상의 DAB 염색.
도 16: 사모테롤 (3 ㎎/㎏, s.c., 3 개월)을 사용한 만성 처치는 절개된 심장의 마손(Masson) 삼색 염색에 의하여 측정시 심근 구조에서의 변화를 생성하지 않았다는 것을 도시한다 (A). 3 개월 동안 사모테롤/비히클로 처치한 야생형 마우스는 심근 섬유증 (B) 및 우심실에 대한 좌심실 비 (LV/RV) (C)에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 3 개월 동안 사모테롤/비히클로 처치한 야생형 마우스는 심혈관 기능에서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (D). 전신 혈압: sys BP; 확장기 혈압: diast BP; 심박수; 박출률: EF; 구획 단축률: FS; 심장 중량/체중: HW/BW (n=3).
도 17: 사모테롤의 구조 및, R₁ 및 R₂로 지칭한 기를 첨가한 구조적 변경에 대한 일부 위치를 도시한다. R₁ 및 R₂의 예는 아실, 카르바밀 및 옥소아졸리딜이다. 추가로, 사모테롤 분자에서, 가수분해성 전구약물은 -NH- 기를 유도체화시켜 형성될 수 있다. 예를 들면 -NH- 기는 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,865,920호에 기재된 바와 같이 아실화될 수 있다. 본 발명에서, 구조 변경을 형성하는데 사용된 기는 전구약물이 β₁-ADR 작용제보다 더 큰 CNS 생체이용률과 함께 더 큰 친유성을 갖도록 사모테롤의 전구약물 및 기타 β₁-ADR 작용제를 형성하는데 사용된다.
도 18: 사모테롤의 친유성 전구약물 (1-4) 및 그의 clogP 값의 예를 도시한다. 이 도면에서, R₁ 및 R₂ 둘다를 사용하지만, R₁ 또는 R₂ 단독을 갖는 전구약물을 고려한다.
도 19: R₁만을 사용하는 본 발명에 의한 사모테롤의 구체적인 예시의 전구약물을 도시한다. R₂는 이들 2가지 예에 사용하지 않았다.
도 20: AD의 임상전 동물 모델에서의 전구약물의 테스트에 대한 개략도를 도시한다.
도 21: 알츠하이머병의 트랜스제닉 마우스 모델, Thy1-hAPP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 선(line) 트랜스제닉 마우스에서의 사모테롤의 행동 효과를 도시한다. (A)는 사모테롤을 사용한 만성 처치가 이들 트랜스제닉 마우스에서 과다활동 표현형의 투여량-의존성 역전을 생성한다는 것을 나타낸다. (B)는 사모테롤을 사용한 만성 처치가 공포 조건화 테스트에 의하여 측정시 인식 기능에서의 투여량-의존성 개선을 생성하였다는 것을 나타낸다. 이는 ADD 및 ADHD의 치료에서 전구약물의 잠재적 유용성을 입증한다.
도 22: 사모테롤의 전구약물이 cAMP 신호 경로를 활성화하지 못하며, 전구약물이 사모테롤로 생체내 전환되었다는 것을 도시한다. (A)는 사모테롤 및 2개의 전구약물 (AT-001) 및 (AT-002)의 분자 구조 및, cAMP 신호 경로에 대한 그의 약리 효과를 나타낸다. (B)는 2종의 전구약물의 경구 주사 후 사모테롤 및 AT-001 (위쪽) 및 AT-002 (아래쪽)의 혈장 농도 대 시간 프로파일을 나타낸다. 사모테롤 혈장 수준은 전구약물이 가수분해되어 사모테롤을 생체내에서 생성하는데 요구되는 시간 및 그의 정도를 반영한다. 전구약물 모두의 경우, 투여는 경구로 실시하였다.
도 23: S-거울상이성질체가 β₁-ADR 효능작용에서 R-거울상이성질체보다 약 500 배 더 강력하기 때문에 사모테롤의 R- 및 S-거울상이성질체가 뚜렷하게 상이한 약리 활성을 갖는다는 것을 도시한다. 사모테롤 (R,S), 사모테롤 (S) 및 사모테롤 (R)에 대한 EC₅₀ (nM) 값은 각각 11.6, 21.2 및 11,900이다. 이는 사모테롤 (라세메이트(racemate)) 및, 사모테롤의 R- 및 S-거울상이성질체에 대한 농도-반응 곡선이다.
도 24: AT-002를 사용한 피하 (subQ) 투여가 생체내 가수분해로부터 사모테롤의 높은 혈장 수준을 생성한다는 것을 도시한다. SubQ 주사는 아마도 사모테롤의 높은 혈장 수준을 얻기 위하여 사모테롤의 친유성 전구약물 투여의 가장 신속하며 가장 효과적인 방법이다.

실시양태의 상세한 설명

본 발명은 수개의 기본적인 발견에 기초한다. 첫번째로, 본 발명자들은 β₁-노르아드레날린 신호가 사회적 인지의 인식 기능을 조절하며, 신경변성 질환, 예컨대 AD, DS, ADD, ADHD 및/또는 자폐증을 치료하기 위한 치료 표적으로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

두번째로, 본 발명자들은 또한 Thy1-hAPP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스가 사회적 인지 결핍을 나타낸다는 것을 발견하였다. 또한 선택성 β₁-ADR 길항제인 베탁솔롤로 처치한 WT 마우스가 β₁-ADR 발현 세포에서의 감소된 c-Fos 활성화 및 MeA에서의 감소된 pCREB 수준과 관련된 사회적 인지 결핍을 나타낸다는 것을 발견하였다. 추가로, MeA에서의 PKA 억제제의 직접 주사가 유사한 사회적 인지 결핍을 초래하는 것으로 관찰되었다.

세번째로, 본 발명자들은 β₁-아드레날린성 수용체 작용제, 예컨대 사모테롤이 예를 들면 핵 pCREB의 수준을 증가시켜 Thy1-hAPP^Lond ^Swe ⁺ 마우스의 사회적 인지 결핍을 구제한다는 것을 발견하였다.

네번째로, 본 발명자들은 또한 작용제에 의한 β₁-ADR의 활성화가 과다활동을 감소 또는 억제하여 주의력 결핍 장애 (ADD) 및/또는 주의력 결핍 과잉 장애 (ADHD)를 치료하는 방법을 제공한다는 것을 발견하였다.

다섯번째로, 본 발명자들은 또한 β₁-ADR의 작용제 자극은 DS 및/또는 자폐증과 함께 발생하는 사회적 기억에서의 관찰 가능한 저하를 치료하기 위한 이로운 방법인 사회적 기억을 향상시키기 위한 기전을 제공한다는 것을 발견하였다. 사실상, 본 발명자들은 β₁-ADR의 활성화가 사회적 인지에 대하여 필수적이라는 것을 발견하였다.

여섯번째로, 본 발명자들은 향상된 친유성을 갖는 사모테롤의 다양한 전구약물이 본원에 개시된 용도에 대하여 증가된 생체이용률을 제공한다는 것을 발견하였다.

일곱번째로, 본 발명자들은 또한 사모테롤의 다양한 전구약물의 R- 및 S-거울상이성질체 사이의 활성 차이가 인식의 향상된 개선 및 과다활동의 역전을 생성하기 위하여 높은 β₁-ADR 작용제 활성을 갖는 거울상이성질체를 제공하는데 이롭게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

여덟번째로, 본 발명자들은 추가로, 사모테롤의 R- 또는 S-거울상이성질체 전구약물을 생성하기 위한 거울상이성질체선택성 합성뿐 아니라, 라세미 사모테롤 또는 그의 전구약물을 생성하기 위한 합성 절차를 발견하였다.

본 발명은 부분적으로 임의의 β₁-ADR 작용제의 친유성 전구약물에 관한 것이다. 그러나, 사모테롤의 친유성 전구약물이 특히 유용하다. 사모테롤은 하기 화학식을 갖는다:

HO-Phe-O-CH₂-C*HOH-CH₂-NH-CH₂CH₂-NH-C(=O)-모르폴린

상기 화학식에서, Phe는 서로에 대하여 파라인 말단 OH 및 OCH₂를 갖는 페닐이며, 모르폴린은 모르폴린 고리이며, *는 키랄 탄소를 나타낸다. -C(=O)-는 카르보닐 기를 나타낸다. 사모테롤의 구조 표현에 대하여서는 도 17의 위쪽 화학식을 참조한다.

일반적으로, 사모테롤의 친유성 화합물은, 가수분해성 기가 모두 친유성이며, 전체 분자의 친유성을 향상시키며, 가수분해성 기가 생체내 가수분해성이라면 가수분해성 기를 페닐 고리에 결합된 말단 -OH 기에 또는 키랄 탄소에 결합된 히드록시 기에 또는 둘다에 공유 결합시켜 생성된다. 상기 가수분해성 기의 비제한적인 예는 아실, 카르바메이트 에스테르 및 옥소아졸리딘 기이다. 일반적으로, 이들 기 모두는 본질적으로, 생체내 가수분해성이어서 라세메이트로서 또는 (R) 또는 (S)-거울상이성질체로서 유리 사모테롤을 방출하는 기인 말단 페닐 히드록실 기 또는, 키랄 탄소에 결합된 히드록시 기 또는 둘다에 대한 친유성 차단기로서 사용될 수 있다. 이들 동일한 기는 또한 예를 들면 친유성 및 그에 따라 생체이용률 및 CNS 유용성을 개선시키기 위하여 임의의 β₁-ADR 작용제 화합물, 예컨대 노르아드레날린, 이소프레날린 또는 도부타민의 말단 히드록시 기에서 에스테르를 형성하는데 사용될 수 있다. 노르아드레날린 및 이소프레날린 둘다는 2개의 말단 페닐 히드록시 기 및 1개의 2급 히드록시 기를 갖는다. 도부타민은 3개의 말단 페닐 히드록시 기를 갖지만, 2급 히드록시 기는 갖지 않는다. 그래서, 사모테롤에 대하여 하기 기재된 바와 같은 방법론은 구체적으로 예를 들면 임의의 기타 β₁-ADR 작용제 화합물, 예컨대 노르아드레날린, 이소프레날린 및 도부타민과의 용도를 고려한다.

NA계는 AD에서 가장 저평가되어 있으나 중요한 신경약리적 표적을 나타낸다. AD 환자로부터의 사후 뇌는 뇌에서 NA의 주요 공급원인 청반 (LC)의 진행성 및 광범위한 변성을 나타낸다. NA의 감소된 피질 수준 및 아드레날린성 수용체 (ADR) 및 NA 수송체의 변경된 발현과 같은 생화학적 변화는 또한 인간 AD 환자 및 AD 마우스 모델 둘다에서 기재되어 있다. 중요하게는, NA 병리학은 AD의 수개의 핵심 특징과 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌다. 추가로, NA는 학습 및 기억과 관련된 피질 회로 및 시냅스 기능에 대한 확립된 효과를 갖는다.

NA 신경세포의 감소는 치매의 경중도와 양성의 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 신경독소 N-[2-클로로에틸]-N-에틸-2-브로모벤질아민을 사용한 LC의 화학적 절제는 AD의 트랜스제닉 마우스 모델에서 인식 결핍을 악화시키는 것으로 밝혀졌다. 게다가, NA계 기능이상은 권투선수 치매, 경도 인지 손상, 베르니케-코르사코프(Wernicke-Korsakov) 증후군 및 다운 증후군을 비롯한 기억 손상을 특징으로 하는 기타 질환과 연루되어 있다. 또한, LC 신경세포 변성 및 NA 결핍증이 아밀로이드판 및 신경원섬유 매듭의 조직 부하를 비롯한 AD의 수개의 병리학적 특징과 강한 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌다. 사실상, AD의 NA 결핍증 및 신경병리학적 특징 사이의 상관관계는 염증 반응에서 그의 중요한 역할에 의하여 설명될 수 있다. 예를 들면 NA는 β-아밀로이드 펩티드 (Aβ)를 분해하는 단백질분해 효소의 분비 및 Aβ의 엔도시토시스의 매개 둘다에 의하여 신경보호 기능을 가질 수 있는 미세아교세포를 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명자들은 β₁-ADR이 사회적 인지 및 기억에서 중요한 역할을 하며, 따라서 신경변성 장애, 예컨대 알츠하이머병으로 인한 이들 특성에서의 결핍증을 갖는 인간에서의 인식 및 사회적 인지/사회적 기억을 개선시키고자 하는 요법에 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 약리 및 분자 도구를 사용한 AD의 Thy1-APP^Lond ^/ ^Swe ⁺ (APP) 마우스 모델에서의 사회적 인지/기억을 연구하였으며, APP 마우스에서 관찰된 사회적 인지 결핍이 MeA에서의 β₁-ADR 신호에서의 비정상과 관련있는 것으로 밝혀졌다. APP 마우스에서의 pCREB 수준의 복원 및 β₁-ADR의 약리 활성화는 AD의 이와 같은 모델에서 검출되는 사회적 기억 결핍을 구제한다. 본 발명의 최초의 결과는 MeA에서의 β₁-ADR 및 CREB 인산화가 정상의 뇌 기능 하에서의 사회적 학습에 대한 필수적인 신호 캐스케이드라는 것을 입증하였다.

다수의 각종 화합물 및 이들 화합물의 조합 및 그의 약리적으로 허용되는 염은 본 발명에 의한 β₁-ADR 작용제로서의 용도에 대하여 명백하게 고려된다.

예를 들면 화합물, 예컨대 사모테롤, 이소프레날린, 도부타민 및 도파민 또는 그의 염은 β₁-ADR 작용제로서 사용될 수 있다. 추가로, 전구약물-유도체 또는 전구약물-화합물, 예컨대 분자 히드록실 기에서의 작용화에 의한 아실- 또는 아미드-유도체 및 또한 그의 염도 마찬가지로 사용될 수 있다. 그러나, 아실화된 말단 페닐 히드록실 기를 갖는 사모테롤의 전구약물 화합물 및 사모테롤의 이들 전구약물 화합물의 R- 및 S-거울상이성질체가 특히 중요하다. 이들 화합물은 하기에서 보다 상세하게 추가로 기재된다.

용어 정의

하기 제시된 용어가 본 명세서에서 사용되어 있으며, 하기 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.

신경변성 장애: 통상의 지혜 및 지식에 의하여 인간을 비롯한 포유동물류에 대하여 예상되는 바와 같이, 병태, 장애 또는 질환을 나타내는 인간을 비롯한 포유동물이 정상의 또는 전형적 인식 또는 사회적 기억 또는 사회적 기억을 나타내는 인간을 비롯한 정상의 또는 대조군 포유동물에 비하여 약화된 인식 또는 사회적 인지 또는 사회적 기억을 나타내도록 하는 임의의 신경변성 병태, 장애 또는 질환을 의미한다. 상기 병태, 장애 또는 질환의 비제한적인 예는 알츠하이머병 (AD) 및/또는 자폐증이다.

사회적 인지: 비-인간 포유동물의 경우에서 확립된 테스트에 의하여 및 행동 또는 말에 의하여 나타난 바와 같이 인간에 의한 얼굴 인지에 의하여 측정한 바와 같이 인간을 비롯한 포유동물이 인간을 비롯한 기타 포유동물을 인지하는 능력을 의미한다.

MeA: 내측 편도를 의미한다.

PKA: 효소의 군인 단백질 키나제 A를 의미한다.

CREB: cAMP 반응 요소 (CRE)로 지칭되는 특정 DNA 서열에 결합되는 세포성 전사 인자인 cAMP 반응 요소-결합 단백질을 의미한다. 전사가 CREB에 의하여 조절되는 유전자는 예를 들면 c-fos, 뉴로트로핀 BDNF 및 다수의 뉴로펩티드, 예컨대 소마토스타틴을 포함한다.

cAMP: 환형 아데노신-3',5'-모노포스페이트를 의미한다. cAMP 의존성 경로는 아데닐릴 시클라제 경로를 의미한다.

베타-1 ADR 또는 β₁-ADR: β₁-아드레날린성 수용체를 의미한다.

베타-1 ADR 작용제 또는 β₁-ADR 작용제: β₁-ADR에 대한 완전 또는 부분 효능작용을 나타내는 임의의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 의미한다. 상기 화합물의 예는 사모테롤, 이소프레날린 (또한 이소프로테레놀로 공지됨), 도부타민, 노르아드레날린 또는 도파민을 포함한다.

전구약물-화합물: 생체내 화학적 또는 효소 변환을 거쳐 활성 화합물 또는 모 약물을 방출하는 약리적 활성 화합물의 화학적 변성물을 의미한다. 보다 구체적으로, 화학적 또는 효소 변환으로 처리 가능한 작용적 모이어티는 약리적 활성 화합물에 부착되어 약물 표적화를 개선시킨다. 예를 들면 β₁-ADR 모 (즉, 비유도체화된) 화합물의 히드록실 기로부터 기능화된 아실- 또는 아미드-유도체는 전구약물 유도체 또는 화합물의 예로서 언급될 수 있다. 아실- 또는 아미드-모이어티를 모 화합물에 첨가하여 모 화합물의 생체이용률은 유도체화되지 않은 모 화합물에 비하여 개선될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "유도체"는 "전구약물 화합물"과 상호 교환적으로 사용된다. 아실화된 말단 페닐 히드록실 기 또는 2급 히드록시 기 또는 둘다를 갖는 사모테롤의 전구약물 화합물이 본 발명의 특정한 잇점을 가지며, 여기서 아실 기의 R₁ 또는 R₂ 기는 둘다에 대하여 총 5 내지 30개, 바람직하게는 9 또는 10 내지 30개의 탄소일 수 있다. R₁ 및 R₂ 둘다는 하기에 보다 구체적으로 추가로 정의된다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "유도체화된"은 해당 β₁-ADR 작용제 화합물로부터 R₁ 또는 R₂ 기 함유 전구약물 β₁-ADR 화합물의 형성을 의미한다.

염: 유기- 및 무기-산 부가 염 둘다를 비롯한 약학적으로 허용되는 염을 의미한다. 유기 산 염의 예는 예를 들면 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 옥살레이트, 푸마레이트, 헤미푸마레이트, 락테이트, 살리실레이트, 벤조에이트 및 아디페이트를 포함한다. 무기 산 염의 예는 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염을 포함한다.

clogP: 옥탄올/물 분배 계수로서 차동 용해도 또는 더 정확히는 소수화도의 척도인 계산된(computed) logP를 의미한다. 일반적으로, logP의 음의 값, 예컨대 -0.50은 불량한 생체흡수율 및 불량한 생체이용률을 나타낸다. logP의 양의 값, 예컨대 1.00은 더 우수한 생체흡수율 및 더 우수한 생체이용률을 나타낸다. 본 발명은 구체적으로 선두(lead) 또는 모 β₁-ADR 작용제 화합물에 대하여 향상된 친유성을 가지며, 일반적으로 선두 또는 모 화합물보다 +0.50 이상, 바람직하게는 +1.00 이상 더 큰 logP 값을 갖는 유도체 또는 전구약물에 대한 clogP 값을 갖는 β₁-ADR 작용제 화합물 유도체 또는 전구약물의 제조 및 용도를 개시한다. 더욱 바람직하게는, clogP 차이는 +1.50 이상의 logP 값이다. clogP 값이 클수록 우수하다.

본 발명은 β₁-ADR 작용제 화합물뿐 아니라, 그의 전구약물 또는 유도체를 제공한다. β₁-ADR 작용제 화합물의 구체적인 예는 이소프레날린, 도부타민, 노르아드레날린, 도파민 및 사모테롤을 포함한다. 이들 β₁-ADR 작용제 화합물의 다양한 전구약물은 예를 들면 이들 작용제 분자의 말단 페닐 히드록실 기 또는 2급 히드록시 기가 유도체화되어 각각 R₁ 또는 R₂ 기를 형성하며, 이들 기는 예를 들면 -O-(C=O)-저급 알킬, -O-(C=O)-아미노알킬 또는 -O-(C=O)-페닐 또는 -O-(C=O)-치환된 페닐일 수 있는 화합물을 포함한다. 이들 작용제 분자가 또한 2급 히드록실 기를 갖는 경우, 이들 기는 유도체화되어 R₂ 기를 형성하며, 여기서 R₂는 R₁에 대하여 정의된 바와 같을 수 있다. R₁ 및 R₂ 둘다의 경우, 저급 알킬은 선형 또는 분지형 알킬일 수 있는 C₁-C₆ 알킬을 의미한다. 아미노알킬은 -NH-알킬을 의미하며, 여기서 알킬은 C₁-C₆ 선형 또는 분지형 알킬을 의미한다. 페닐은 자체 규정되며, 치환된 페닐은 페닐 치환된 하나 이상의 저급 알킬, 할로 또는 히드록실 기를 의미한다. 여기서, 저급 알킬은 선형 또는 분지형일 수 있는 C₁-C₆ 알킬을 의미한다. 본 명세서에서, 유도체화가 모 β₁-ADR 작용제 화합물의 친유성을 증가시킬 목적을 위한 것이므로 용어 "유도체"는 "전구약물"과 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "모"는 단순히 유도체화 또는 "선두 화합물" 이전에 β₁-ADR 작용제 화합물을 의미한다. 화학식 R-(C=O)-O-의 아실화된 말단 페닐 히드록실 기를 갖는 사모테롤의 전구약물 화합물이 특정한 잇점을 가지며, 여기서 R은 사모테롤에 대한 전체 전구약물 분자의 친유성을 개선시키는 친유성 기이며, 여기서 R은 5 내지 30개의 탄소 원자를 가지며, 이는 선형, 분지형 또는 환형 또는 그의 조합이며, 비치환되거나 또는 1 내지 4개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시 또는 할로로 임의로 치환되며, 환형 기는 0, 1 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5- 또는 6-원 고리이며, 상기 헤테로원자는 -O- 또는 -N- 또는 둘다이며, 상기 환형 기는 포화 또는 불포화이다. 5- 또는 6-원 고리는 예를 들면 언급한 바와 같이 비치환되거나 또는 1 내지 4개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시 또는 할로에 의하여 임의로 치환될 수 있는 피롤, 푸란, 이미다졸린, 이미다졸, 피라졸리딘, 피라졸, 피리딘 또는 피란일 수 있다. 할로는 클로로 또는 플루오로일 수 있으며, 바람직하게는 플루오로이다. 용어 "저급"은 예를 들면 저급 알킬 또는 저급 알콕시에서와 같이 본원에서의 모든 구조 정의 및 화학식에서의 C₁-C₆을 의미한다. 전구약물 화합물에서 결합된 것에서 고리 피롤, 푸란, 이미다졸린, 이미다졸, 피라졸리딘, 피라졸, 피리딘 및 피란은 물론 피롤릴, 푸라닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 피라졸리디닐, 피라졸릴, 피리디닐 및 피라닐이다.

편의를 위하여, β₁-ADR 작용제 화합물의 전구약물을 형성하는데 사용된 R₁ 및 R₂ 기는 도 17에서의 아래쪽 구조에 도시된 바와 같이 R₁이 말단 페닐 히드록시 기에 결합된 가수분해성 기를 지칭하며, R₂는 2급 히드록시 기에 결합된 가수분해성 기를 지칭하도록 본원에서 일관되게 지칭될 것이다.

KO: 녹아웃 (마우스)를 의미한다.

단기 기억: 단기 저장으로부터 1차 또는 능동적 기억을 의미하며, 종종 작업 기억으로 지칭된다.

장기 기억: 필요시 작업 기억으로 불릴 수 있는 연속적으로 저장된 정보를 의미한다. 인간에서, 장기 기억은 의식 중에 이용할 수 있는 모든 기억을 포함하는 서술 기억; 신체 이동의 기억 및 환경내의 물체의 사용법을 포함하는 절차 기억으로 분류된다. 서술 기억은 특정 사례에 대한 사건 기억 및, 세상에 관한 지식에 대한 의미 기억으로 추가로 세분될 수 있다.

사회적 기억: 단기 또는 장기 기억으로부터 유래하건 간에 작업 기억으로부터 이름, 얼굴 또는 물리적 위치의 인지를 상기하는 능력을 의미한다.

생체가역적: 약리적 활성제의 전구약물 또는 유도체가 효소에 의하여 또는 pH/산화환원에 의할 수 있는 생체내 변환을 통하여, 예컨대 가수분해에 의하여 초기 활성 화합물로 다시 쉽게 변환될 수 있다는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 생체가역적 및/또는 가수분해성은 한 기전만을 의미하지 않는다.

자폐증 (또는 자폐) 스펙트럼 장애 (ASD): 의미 있는 사회적, 소통 및 행동 도전을 야기할 수 있는 발달 장애의 군을 의미한다. ASD는 상이한 인간에게 예컨대 증상의 성질, 증상이 시작되는 때 및 증상의 경중도와 같은 상이한 방식으로 영향을 미친다. 예를 들면 ASD 증상은 변동되는 측정된 지능 (IQ)를 포함할 수 있으나, 인간들과 어울려서 말로 소통하는 능력 부족뿐 아니라, 반복적 행동의 징후를 포함할 수 있다. 또한, 변경되는 정도의 감각적 감수성이 존재할 수 있다.

ANOVA: 분산의 분석을 의미한다.

ADD: 주의력 결핍 장애를 의미한다.

ADHD: 주의력 결핍 과다활동 장애를 의미한다.

ADME: 흡수, 분포, 대사 및 배설을 의미한다.

노르아드레날린 (NA)계 및 β ₁ -ADR 화합물 및 그의 친유성 유도체

본 발명은 적어도 부분적으로 NA 결핍증이 AD의 복수의 병리학적 특징, 예컨대 시냅스 기능이상뿐 아니라, 인식 증상과 관련되었다는 인지에 기초한다. 본 발명은 부분적으로 NA 전달을 증가시키는 약리적 조정이 예를 들면 통상의 방법론보다 AD를 치료하는 보다 포괄적인 접근법을 제공할 수 있다는 발견에 기초한다. 도 9는 β₁-ADR의 활성화가 인식 기능의 복원 이외에 AD 질환 변경 효과를 제공하는 본원에 개시된 접근법을 도시한다.

구체적으로, 도 9에서 β₁-ADR을 통한 NA 신호의 복원은 개재신경세포에서의 탈분극의 조절 및 인식 기능에 필요한 신경전달의 하류(downstream) 조정에 필요한 cAMP 반응 요소-결합 단백질 (CREB) 인산화 및 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)의 수준을 증가시켜 AD와 관련된 인식 저하를 구제한다. β₁-ADR의 활성화는 미세아교세포 활성에 대한 그의 영향을 통하여 신경보호 가능성을 Aβ 병리학에 부여하여 추가의 잇점을 제공한다. 추가로, β₁-ADR 활성화를 통한 cAMP에서의 증가는 세포 및 시냅스 손실뿐 아니라, 시토킨 종양 괴사 인자-알파 (TNFα)의 방출을 억제하여 가능한 신경세포염증을 개선시킨다.

추가로, AD의 치료를 위한 치료적 표적으로서 β₁-ADR의 용도 이외에, 본 발명은 또한 구체적으로 중추신경계에서 β₁-ADR의 신호 캐스케이드 하류를 표적화하면서 심장 기능에 대한 최소의 원치않는 말초 효과를 유지하는 것을 개시한다. 본 발명에 의하여 생성된 전구약물을 평가하는데 사용하기 위한 상세한 개략도는 도 10에 도시한다. 개략도에 도시된 절차는 최소의 말초 효과와 함께 개선된 친유성으로 인한 개선된 뇌 분포를 갖는 β₁-ADR 작용제 유도체의 확인 및 추가의 개발 둘다를 허용한다. 이는 또한 합성된 생체가역의 라이브러리 또는 카탈로그, 즉 β₁-ADR 화합물의 가수분해성 유도체의 제조를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생체가역적"은 β₁-ADR 작용제 화합물의 전구약물로부터 모 β₁-ADR 화합물을 방출하도록 생체내 가수분해성인 것을 의미한다.

합성된 전구약물은 시험관내 흡수, 분포, 대사 및 배설과 같은 일련의(a battery of) 테스트를 실시하고 (총괄적으로 ADME 테스트로 공지됨), 구조-성질 관계 (SPR)는 ADME 성질에 기초하여 개발되었다. 이들 연구 또는 평가는 반복적 방식으로 실시하며, 얻은 SPR은 그의 전구약물의 결합 및 형성에서의 추가의 전구약물 화합물 및 심지어 새로운 합성 β₁-ADR 작용제 화합물의 설계를 안내하는데 사용된다. 유망한 ADME 성질을 나타내는 유도체화된 β₁-ADR 화합물은 생체내 체내분포 및 약물동력학 연구로 진행되었다. 가장 바람직한 ADME 및 약물동력학 (PK) 성질을 갖는 2종의 화합물은 AD에 대한 임상전 모델에서 테스트한다. 시험관내 및 생체내 PK 성질 둘다뿐 아니라, 임상전 동물 모델 연구로부터 얻은 생체내 효능에 대한 데이타를 포함하는 표적 생성물 프로파일 (TPP)은 이들 테스트를 실시한 각각의 유도체 β₁-ADR 작용제 화합물에 대하여 생성한다.

추가로, β₁-ADR에 대한 작용제 효과를 나타내는 공지의 β₁-ADR 작용제 화합물 또는 기타 리간드는 문헌으로부터 얻을 수 있으며, 상기 나타낸 테스트로 처리하기 위하여 유도체화된다. 또한 포괄적인 카탈로그 또는 라이브러리를 형성하기 위하여 마찬가지로 이들 유도체에 대하여 TPP를 생성한다.

사모테롤

β₁-ADR에 대한 작용제 효과를 나타내는 임의의 β₁-ADR 작용제 화합물 또는 리간드를 유도체화에 사용할 수 있으며, 사모테롤은 AD의 치료에서의 용도를 위한 여러가지의 특징적인 약리적 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 첫번째로, 본 발명자들은 사모테롤이 cAMP 캐스케이드를 선택적으로 활성화시키면서 β-아레스틴 신호 경로에 최소한의 활성만을 나타낸다는 것을 발견하였다. 도 8은 사모테롤의 약리학을 도시한다. 특히, β₁-ADR에 대한 작용제로서 사모테롤은 cAMP 신호를 자극하여 작용제 이소프레날린에 대한 최대 반응의 약 60%를 유도한다 (A). 반대로, cAMP 및 β-아레스틴 경로 둘다를 활성화시키는 무차별적인 이소프레날린과는 반대로, 사모테롤은 β-아레스틴 경로에 대하여 아무런 영향을 주지 않는다 (B). β-아레스틴은 심장 기능을 조절하는 역할을 하는 β₂-ADR로의 신호 전달을 조절하는 단백질의 패밀리이다.

예를 들면 β-아레스틴 신호 활성이 결여된 사모테롤의 기능적 선택성은 일관적이며 지속되는 효능인 제2의 중요한 영향을 갖는다. 보다 구체적으로, 작용제 요법의 치료적 유용성은 종종 β-아레스틴 신호 의존성 수용체 탈민감화에 의하여 매개되는 내성 및 속성내성의 발생에 의하여 제한되었다. 사실상, 래트 심실을 사용한 동물 연구는 사모테롤의 연장된 투여가 β₁-ADR 밀도 또는 아데닐레이트 시클라제 커플링 효율에서의 감소를 유발하지 않는 것으로 밝혀졌다.

사모테롤의 제3의 중요한 성질은 밀접하게 관련된 수용체 β₂-ADR보다 β₁-ADR에 대한 서브-타입 선택성이다. β₁-ADR은 일반적으로 아데닐릴 시클라제에 커플링되며, 그의 활성은 CREB 인산화의 수준을 증가시킨다. 그래서, β₁-ADR의 활성화는 CREB-의존성 기억 결핍을 구제하는 것으로 예상된다. 그리하여, 사모테롤의 서브-타입 선택성은 특히 β₂-ADR과의 상호작용을 방지하면서 β₁-ADR을 통한 인식 기능을 향상시킬 것으로 예상된다.

사모테롤의 제4의 중요한 성질은 BBB를 통과하여 중추신경계에 도달하며, 여기서는 본 발명자들에 의하여 입증된 바와 같이 CREB 인산화에서의 증가를 유도하며, 전-인식 효과를 매개한다. 하기 표 1 및 도 9를 참조한다.

도 8은 마우스에서 3 ㎎/㎏의 사모테롤의 마우스 뇌 피하 주사에서 pCREB 발현에 대한 사모테롤의 효과가 15 분 후 뇌에서 pCREB의 상당한 증가를 유발한다는 것을 도시한다. *** p<0.001.

상기 데이타 모두는 사모테롤이 예를 들면 AD의 치료를 위한 유의적인 치료적 가치를 갖는다는 것을 나타낸다. 그래서, 예를 들면 그의 약물동력학 성질 및 CNS 이용 가능성을 향상시키는 사모테롤의 유도체화는 AD의 치료를 위한 더 유효한 화합물을 산출한다.

마지막으로, 사모테롤의 추가의 잇점은 임의의 유의한 부작용 없이 인간에 의하여 잘 견딘다는 점이다.

사모테롤을 사용한 실험:

이전에, 본 발명자들은 선택성 β₁-ADR 길항제 베탁솔롤의 주사가 야생형 (WT) 동물에서 사회적 및 맥락 기억을 손상시킨다는 것을 나타낸다. 특히, 사회적 인지 및 맥락 기억은 1 ㎎/㎏의 베탁솔롤의 1회 투여량으로 처치한 C57B1/6 마우스에서 손상되었다. 실험에 의하여 관찰된 바와 같이 β₁-ADR KO 마우스는 사회적 인지가 손상되었으나, 그의 대조군 한배새끼 또는 β₂-ADR KO 마우스는 정상적으로 ** p<0.01; *** p<0.0001 대 기회 수준 (0)으로 실시되었다.

사회적 및 맥락 기억 이외에, Y-미로 테스트에 대한 베탁솔롤을 사용한 실험은 또한 공간 기억에서의 β₁-ADR의 중요한 역할을 입증하였다. 추가로, β₁-ADR KO 마우스는 손상된 사회적 및 맥락 기억을 나타내면서, β₂-ADR KO 마우스는 정상의 기억 기능을 갖는다.

종합적으로, 이들 결과는 다양한 형태의 인식 기능에서 β₁-ADR의 필수적인 역할을 나타내며, β₁-ADR 신호의 복원은 AD에서 인식 기능을 개선시키기 위한 치료적 전략을 제공한다.

게다가, 본 발명자들은 3 ㎎/㎏의 사모테롤의 급성 피하 (s.c.) 주사가 AD의 Thy1-APP^Lond/Swe+ 마우스 모델에서 작업 기억 및 사회적 인지 결핍을구제한다는 것을 입증하였다. 중요하게는, β₁-ADR의 조절되지 않은 발현은 Thy1-APP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스의 특정한 뇌 구역, 예컨대 내측 편도에서 관찰되었다. β₁-ADR의 증가된 발현은 NA에 대한 포스트시냅스 발현이 LC의 변성에도 불구하고 기능을 유지하며, 손상된 NA 신호는 개선된 ADME 및 생체이용률을 갖는 β₁-ADR 작용제 및 그의 친유성 유도체로 복원될 수 있다는 것을 나타낸다. AD의 5xFAD 마우스 모델에서, 인식 손상에 대한 사모테롤을 사용한 만성 경구 투여의 효과가 관찰되었다. 특히, 3 개월에 걸친 6 ㎎/㎏의 사모테롤의 1일 경구 투여는 5xFAD 마우스에서 관찰된 서술 및 공간 기억 결핍을 구제한다.

β ₁ -ADR 활성화로부터 발생한 부작용 없음:

파일럿 실험에서, 심장 조직의 조직학적 검사는 사모테롤을 사용한 만성 처치 (3 ㎎/㎏ s.c. 3 개월 동안)가 심장 섬유증을 유발하지 않았다는 것을 나타낸다. 유사하게는, 사모테롤 (3 ㎎/㎏ s.c. 3 개월 동안)로 처치한 야생형 마우스는 혈압 (BP), 심박수 (HR), 박출률 (EF), 구획 단축률 (FS) 및 심장 중량:체중비에 의하여 측정한 심장 기능에서의 병리학적 변화를 발생하지 않았다. 게다가, 심부전을 갖는 인간에서의 임상적 연구는 임의의 유의적인 부작용 없이 사모테롤 (200 mg, 2-12 개월 동안 1일 2회)을 사용한 만성 처치의 효과를 나타낸다. 이는 예를 들면 AD의 경우 사모테롤을 사용한 만성 처치가 인간에서의 심장 기능에 대한 부적절한 부작용과 관련되지 않았다는 것을 나타낸다.

본 발명은 특정한 비제한적인 예에 의하여 추가로 예시될 것이다.

실시예

물질 및 방법

동물. AD의 모델인 성체 C57B1/6 마우스 (잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory), #000664), β₂-ADR (녹아웃) KO 마우스 (알지 지파드(RG Giffard) 박사 제공), β₁-ADR KO 마우스 (디. 번스타인(Dr. D. Bernstein) 박사 제공) 및 그의 연령이 일치하는 대조군 (FVB/NJ 마우스, 잭슨 래버러토리, #001800) 및 Thy1-hAPP^Lond/Swe+ 마우스 (APP)를 사용하였다. 실험은 스탠포드 대학의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜에 따르며, 미국 국립보건원의 실험 동물의 관리와 사용에 관한 지침에 기초하여 실시하였다.

행동 테스트. 사회적 인지는 2종의 상이한 테스트로 테스트하였다: Nadler et al.이 개발한 3-챔버 사회적 테스트 및 Macbeth et al.이 개발한 가정용 케이지 사회적 구별 과제. 사회적 인지 및 비-사회적 냄새/물체 사이의 인지를 구별하기 위하여, 비-사회적 냄새 구별 테스트 (후각 습관화/탈습관화 및 후각 인지 테스트) 및 물체 인지 테스트를 사용하였다.

약물 처치. β₁-ADR 부분 작용제, 사모테롤, β₁-ADR 길항제, 베탁솔롤 및 단백질 키나제 A (PKA) 억제제, PKI 14-22 아미드 미리스토일화 (토크리스 바이오사이언스(Tocris bioscience), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하였다. 사모테롤을 피하 주사하였다 (3 ㎎/㎏). 베탁솔롤을 피하 (1 ㎎/㎏) 또는 MeA (30 nmol/측면) 주사하였다. PKI 14-22 아미드를 30% 아세토니트릴 중에 용해시키고, MeA (2.75 nmol/측면)에 주사하였다.

분자 분석. 면역조직화학을 사용하여 c-Fos, 티로신 히드록실라제 (TH) 및 β₁-ADR을 평가하였다. 염색된 세포의 정량적 분석을 마우스 뇌 환추에 따른 상이한 뇌 구역에서 실시하였다. 세포 계수는 비편견-입체적 방법을 사용하여 달성하였다. 양성 세포의 총 개수는 스테레오인베스티게이터(StereoInvestigator) 소프트웨어 (엠비에프 바이오사이언스(MBF Bioscience), 미국 버몬트주 월리스턴 소재)를 사용하는 광학 분별 방법으로 정량화하였다. 계수 기준은 ≤0.10의 평균 오차 계수를 얻도록 결정하였다. pCREB의 분석은 웨스턴 블롯에 의하여 실시하였다.

통계. 소프트웨어 프리즘(Prism) 5.01 (그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc.), 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 데이타를 분석하였다. 행동 및 약리 테스트의 경우 군당 최소 5마리 동물 및 면역조직화학 및 웨스턴 블롯의 경우 군당 3 내지 4마리의 동물을 사용하였다.

결과

사회적 인지 및 β ₁ -노르아드레날린 신경전달은 알츠하이머병의 마우스 모델에서 손상되었다

설치류에서, 사회적 인지는 이전에 만난 동종에 비하여 만나지 않은 동종을 조사하는 시간의 더 큰 양에 의하여 측정할 수 있다. 우선 APP 마우스가 이전에 만난 동종을 인지하는 능력을 조사하였다. 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물에 대한 선호를 나타냈지만 (도 1A), 이들은 사회적 인지 결핍을 나타내는 익숙한 것에 비하여 새로운 침입물에 대한 선호를 입증하지 못하였다 (도 1B). 이러한 결핍은 후각 능력 또는 비-사회적 냄새 사이의 구별에서의 결핍에 연관되어 있지 않다 (도 1C 및 1D).

그 후, β₁-ADR의 발현에서의 비정상이 APP 마우스에서 존재하는지에 대하여 테스트하였으며, 그의 대조군 한배새끼에 비하여 APP 마우스의 MeA에서의 유의한 더 큰 개수의 β₁-ADR 발현 세포를 밝혀냈다. AD의 이러한 APP 마우스 모델이 이전에 만난 개체의 인지 불가뿐 아니라, 사회적 기억에 대하여 중요한 것으로 공지된 부위인 MeA에서 β₁-노르아드레날린 회로에서의 비정상인 AD의 중요한 증상 특징 하나를 재현한다는 것을 최초로 밝혀냈다.

β ₁ -ADR 및 그의 하류 신호는 사회적 신호의 학습에 필수적이다

그 후, APP 마우스에서 β₁-노르아드레날린 신경전달에서의 비정상이 그의 사회적 기억 결핍에 대한 원인이 되는지를 결정하기 위하여 사회적 인지에서의 β₁-ADR의 잠재적 기여를 조사하였다. 다양한 투여량의 선택성 β₁-ADR 길항제인 베탁솔롤 (0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎏)의 급성 피하 주사 후 C57B1/6 마우스가 이전에 만난 동종을 인지하는 능력을 평가하였다. 베탁솔롤이 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물에 대한 선호에 영향을 미치지는 않았으나, 0.1 및 1 ㎎/㎏의 베탁솔롤은 2종의 동종을 조사하는데 소요된 총 시간에 영향을 미치지 않으면서 마우스가 새로운 및 익숙한 동종 사이를 구별하지 못하는 것을 초래하였다 (1-원 ANOVA p=0.153) (도 2A 및 2B). 이러한 발견은 또한 사회적 인지, 3-챔버 테스트를 평가하는 상이한 행동 패러다임에서 재현되었다. 그 후, 일반적인 후각 능력 및 구별에 영향을 미치지 않으면서 β₁-ADR의 차단이 사회적 신호의 인지에 영향을 미친다는 것을 입증하였다 (도 2C 및 2D). 이러한 결과는 냄새 습관화/탈습관화 패러다임에서 확인되었다. 마지막으로, 익숙한 물체를 기억하는 능력이 베탁솔롤 또는 비히클로 주사한 마우스에서 상이하지 않은 것으로 관찰되었다.

이러한 결과는 β₁-ADR 활성화가 마우스에서 사회적 학습 및 인지에 필요하다는 것을 시사한다. 그래서, APP 마우스에서 관찰된 β₁-ADR 발현 수준에서의 비정상이 사회적 인지에서의 그의 결핍의 원인이 되며, APP 마우스에서의 β₁-ADR의 기능의 복원이 사회적 인지 결핍을 구제한다는 것을 제안한다. 사회적 학습전 APP 마우스에서의 β₁-ADR 부분 작용제인 사모테롤의 주사는 이전에 관찰된 결핍을 구제하였다 (도 2E 및 2F).

본 발명의 약리 데이타는 β₁-ADR이 사회적 인지에 필요하다는 것을 나타낸다. 그러나, 특정한 수용체에 대한 약물 선택성은 종종 논란의 여지가 있다. 베탁솔롤이 사회적 인지에서 β₁-ADR, 및 β₂-ADR에 대하여 β₁-ADR을 특이적으로 표적화한다는 것을 확인하기 위하여, β₁-ADR KO 및 β₂-ADR KO 마우스 둘다 및 그의 FVB 대조군에서의 사회적 인지를 테스트하였다. 모든 마우스는 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물이 든 컵에 대한 선호를 나타냈다. 그 후, β₁-ADR KO 마우스는 사회적 인지가 손상되었으나 (도 3A), β₂-ADR KO 마우스는 과제를 정확하게 수행한다 (도 3B). 게다가, 사회적 학습전 β₂-ADR KO 마우스에서의 베탁솔롤 주사는 손상된 사회적 인지를 초래하였다 (도 3B). 이는 베탁솔롤에 의하여 유발된 사회적 인지 결핍이 β₂-ADR이 아니라 β₁-ADR에 의존하며, β₁-ADR이 사회적 인지에 대하여 필수적이라는 것을 시사한다.

그 다음, β₁-ADR의 활성화가 사회적 신호 (사회적 학습)의 습득 중에 또는 이러한 정보의 상기 중에 중요한지를 평가하였다. 학습 단계 전 20 분 또는 테스트의 상기 전 30 분에 베탁솔롤을 주사하였다. 학습 단계 중 β₁-ADR의 억제는 사회적 인지 결핍을 초래하는 한편 (도 3C), 상기 중 β₁-ADR의 억제는 사회적 인지를 손상시키지 않았다 (도 3D). 그 후, 장기 사회적 인지 테스트의 학습 단계 전 베탁솔롤을 주사하여 사회적 신호의 학습에 대한 β₁-ADR의 중요성을 확인하였다. 학습 전 마우스에게 베탁솔롤을 주사하고, 24 시간 후 테스트하여 손상된 사회적 인지를 나타냈으며, 비히클-주사한 마우스는 무손상 사회적 인지를 갖는다 (도 3E). 종합적으로, 이러한 데이타는 사회적 인지에 필요한 사회적 신호의 학습에 대한 β₁-ADR의 중요성을 강조한다.

내측 편도에서의 β ₁ -ADR은 사회적 인지에 필수적이다

사회적 인지와 관련된 뇌 구역은 이미 규정되어 있다. 이들 중에서는 외측 중격벽, 전전두엽 피질 및 MeA이다. 우선 사회적 인지에 대한 MeA의 중요성을 확인하였다. 신경세포성 활성의 마커로서 c-Fos를 사용하였으며, 사회적 학습 후 C57B1/6 마우스의 군에서의 그의 발현과 사회적 학습 및 사회적 인지 모두의 이후에 마우스의 군을 비교하였다. 비편견 입체해석 계수는 사회적 신호의 처리를 위한 MeA의 중요성을 확인하는 기저측 편도에서가 아니라 MeA에서의 사회적 인지 후 c-Fos 발현의 더 높은 수준을 확인하였다. 그 후, 베탁솔롤의 주사 후 MeA에서의 c-Fos 발현이 사회적 인지후 (비히클 주사에 비하여) 크게 감소되었다는 것을 관찰하였다 (도 4A). β₁-ADR에서 불량하게 발현되지만, 사회적 인지에 의하여서는 선택적으로 활성화시키지 않는 시상의 뇌실곁 핵에서의 효과를 관찰하지 못하였으므로, 이러한 감소는 MeA와 같은 사회적 인지 중에 활성화되는 구역에 대하여 특이적이었다. 또한 베탁솔롤에 의하여 유발된 MeA에서의 c-Fos의 낮은 발현은 β₁-ADR 발현 세포에서의 낮은 c-Fos 발현과 관련되어 있다는 것을 관찰하였다: 2중 면역염색은 c-Fos를 발현시키는 β₁-ADR 세포의 비율이 비히클-주사한 것에 비하여 베탁솔롤-주사한 마우스에서 유의하게 감소되었다는 것을 나타낸다 (도 4B).

사회적 인지에 대한 MeA에서의 β₁-ADR의 역할을 추가로 확인하기 위하여, 베탁솔롤을 사회적 학습 전 C57B1/6 마우스의 MeA에 직접 주사하였다 (도 4C). MeA에서 베탁솔롤로 처치한 마우스는 익숙한 동종을 인지할 수 없었다 (도 4D). 결과는 MeA가 사회적 인지에 중요한 구조이며, MeA에서의 β₁-ADR의 활성화가 마우스 사회적 학습 및 인지에 필요하다는 것을 입증하였다.

β₁-ADR은 Gs 이종삼량체 G-단백질과 관련된 G-단백질 커플링된 수용체이다. 그래서, β₁-ADR의 신호 경로 하류 중 하나는 cAMP 반응 요소-결합 (CREB) 인산화를 초래하는 cAMP/PKA 캐스케이드의 활성화를 포함한다. 그리하여, 베탁솔롤에 의한 β₁-ADR의 경로 하류의 차단이 사회적 학습 및 인지를 손상시키는지에 대하여 분석하였다. 우선, 사회적 학습 전 PKA 억제제를 C57B1/6 마우스의 MeA에 주사하여 PKA/CREB/pCREB 캐스케이드의 차단이 사회적 인지에 영향을 미치는지를 결정하였다. PKA의 차단이 사회적 학습 중 비어있는 컵에 비하여 낯선 침입물에 대한 선호에 영향을 미치지 않으면서 마우스가 익숙한 동종을 인지하는 능력을 손상시킨다는 것을 관찰하였다 (도 4E). 이러한 결과는 PKA 활성이 사회적 학습 및 인지에 필요하다라는 것을 나타낸다. 본 발명의 결과는 베탁솔롤 또는 PKA 억제제에 의한 MeA에서의 β₁-ADR 신호 경로의 억제가 사회적 인지 결핍을 초래한다는 것을 나타낸다.

β ₁ -ADR은 CREB 인산화를 조정한다

PKA의 공지된 하류 표적 하나는 CREB 인산화이므로, 사회적 학습에서 pCREB의 가능한 역할을 평가하고자 하며; 일련의 실험을 수행하였으며: 우선 사회적 신호를 학습하는 C57B1/6 마우스에서 사회적 학습의 개시 후 5 분에서 채취한 MeA에서의 pCREB의 강력한 증가가 유발되었으며, 10 분 후 기준선으로 되돌아갔다는 것을 관찰하였다 (도 5A). 그 후, β₁-ADR의 약리 조정이 사회적 학습의 맥락에서 MeA에서의 CREB 인산화에 영향을 미치는지를 테스트하였다. 사회적 학습 전 1 ㎎/㎏의 베탁솔롤의 급성 전신 주사에 의한 β₁-ADR의 차단이 사회적 학습 후 pCREB의 유발을 억제하는 한편 (도 5B), 3 ㎎/㎏의 부분 작용제 사모테롤을 사용한 β₁-ADR의 활성화가 pCREB를 증가시키는 것으로 확인하였다 (도 5C). 이러한 데이타를 사용하면, β₁-ADR의 PKA/pCREB 캐스케이드 하류의 활성화가 사회적 학습 및 인지를 매개한다는 것을 밝혀냈다.

APP 마우스에서 사회적 기억에 대한 사모테롤의 구제 효과가 pCREB의 수준에서의 변경과 관련되어 있는지를 평가하기 위하여, 사모테롤 주사 및 사회적 학습 후 APP 마우스 및 그의 WT 한배새끼의 MeA에서 pCREB의 수준을 측정하였다. C57B1/6 마우스에서 이미 발견된 바와 같이 (도 5C), 사모테롤은 WT 동물에서 사회적 학습 후 pCREB에서의 증가를 유발하였다. 그러나, APP 마우스에서의 유의적인 증가는 존재하지 않았다. 알츠하이머병에서 수개의 인산화된 단백질 및 전사 인자는 (핵에 대하여) 세포질에서 선택적으로 존재하며, 그리하여 학습 및 기억에 대하여 중요한 유전자의 발현을 유발하는데 있어서 효과적이지 않은 것으로 보고되었다. 그래서, APP 마우스의 핵에서의 pCREB (효과적인 pCREB)의 수준은 사모테롤에 의하여 영향을 받는지를 결정하였다. 사모테롤은 APP 마우스에서 MeA의 핵 분획에서의 pCREB 수준을 증가시킨다는 것을 관찰하였다 (도 5D). 이는 부분 작용제 사모테롤을 사용한 AD의 마우스 모델에서 β₁-ADR의 활성화는 개선된 사회적 인지를 초래하며, 이는 MeA에서 핵 pCREB의 증가된 수준과 관련되어 있다는 것을 나타낸다.

다수의 신경계 장애, 예컨대 AD는 사회적 기억 및 인지에서의 결핍을 특징으로 한다. 이와 같은 특정한 증상의 원인은 아직 잘 규정되지는 않았으며, 그 결과, 이와 같은 불능화 결핍을 구제하는 치료는 현재 존재하지 않는다. 사회적 학습 및 인지에 관련된 분자 경로를 확인하였으며, AD의 모델에서 이러한 캐스케이드의 병리학적 변화를 나타냈다. Thy1-hAPP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스의 MeA에서의 β₁-노르아드레날린 계에서의 심각한 비정상이 발견되었다. 구체적으로, 사회적 학습 및 인지의 핵심 조정제로서 β₁-ADR 및 그의 하류 PKA/pCREB 신호 캐스케이드를 확인하였다. 게다가, β₁-ADR의 선택성 부분 작용제가 AD에서 사회적 기능을 개선 또는 복원시키기 위한 가능한 접근법을 강조하는 선택성 결핍을 복원할 수 있는 것으로 밝혀냈다.

Thy1-hAPP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스는 비-사회적 후각 신호에 대한 정상의 인지를 나타냄에도 불구하고, 사회적 인지 결핍을 나타내는 것으로 보고하였다. 후각 망울의 수준에서, 노르아드레날린이 후각 자극에 대한 선택적 주의력을 촉진시켜 중성 및 사회적 후각 정보를 처리하기 위하여 중요한 것으로 밝혀지기는 하였으나, 본 발명의 결과는 후각 망울의 2가지 독립적 경로 하류가 사회적 및 비-사회적 신호에 대한 기억을 조절한다는 것을 나타낸다. 최초로, 사회적 또는 중성 후각 신호의 학습 전 β₁-ADR의 차단은 비-사회적 후각 인지에 영향을 미치지 않으면서 손상된 사회적 인지를 초래한다는 것을 밝혀냈다. 게다가, 본 발명의 결과는 β₁-ADR 경로가 그의 연상(recall)이 아니라 사회적 신호의 학습에 필요하다라는 것을 나타낸다.

MeA는 인간 및 비-인간 포유동물 모두에서 사회적 및 성적 행동의 조절에 필요한 감각 정보의 처리에 관련된 것으로 공지되어 있다. 다수의 설치류 실험은 사회적 인지에 대한 MeA의 중추적 역할을 나타내지만, 본 발명의 결과는 사회적 인지에 대한 MeA에서의 β₁-ADR 노르아드레날린 신경전달의 중요성을 입증하며, Thy1-hAPP^Lond/Swe+ 마우스에서 이와 같은 뇌 구역에서의 이와 같은 수용체/신호 캐스케이드의 비정상적 발현이 그의 사회적 인지 결핍의 원인이 될 수 있다는 것을 시사한다.

본 발명의 데이타는 MeA에서의 β₁-ADR이 PKA/CREB 인산화-신호 캐스케이드의 활성화에 의하여 사회적 학습을 조절한다는 것을 나타낸다. 사실상, 사회적 학습 전 MeA에서의 PKA의 약리 억제는 사회적 인지를 손상시킨다. 또한, 사회적 인지 결핍을 유발하는 선택성 길항제를 사용한 β₁-ADR의 차단은 MeA에서 CREB 인산화의 심각한 감소를 초래하는 것으로 입증되었다. 이러한 결과는 마우스에서 PKA/pCREB 캐스케이드 및 사회적 학습 사이의 직접적인 연결을 나타낸다. 일반적으로, pCREB는 장기 기억에 필요한 유전자 발현 및 단백질 합성에 대한 그의 공지의 효과로 인하여 단기 기억보다는 장기 기억에 필요하다는 것을 상정한다. 최근, Suzuki et al.은 BDNF의 더 높은 발현을 초래하는 CREB 활성의 상향조절이 마우스에서 사회적 및 비-사회적 단기 기억을 향상시키는 것으로 입증되었다. 여기서, 이는 β₁-ADR의 활성화의 결과로서 유사한 현상이 발생한다는 것을 시사하고 있다. 사회적 학습은 노르아드레날린의 방출을 유도하며, MeA에서의 β₁-ADR을 활성화시켜 cAMP/PKA/pCREB 신호 캐스케이드의 활성화를 초래한다. β₁-ADR 및 그의 하류 신호의 활성화는 사회적 신호의 학습에 필요한 것으로 밝혀졌다.

β₁-ADR 부분 작용제인 사모테롤을 사용한 치료는 APP 마우스의 사회적 인지 결핍을 구제하는 한편, pCREB의 전체 수준에 영향을 미치지 않지만, 핵 pCREB의 증가된 수준에 유의적으로 영향을 미친다. 그래서, APP 마우스에서 관찰된 사회적 인지 결핍은 핵 pCREB의 부적절한 수준의 결핍에 의하여 설명된다는 것을 시사한다. 세포계에서는 Aβ가 pCREB의 높은 수준 및 핵 전위의 결여를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 사모테롤을 사용한 β₁-ADR의 활성화는 APP 마우스의 MeA에서 pCREB의 핵 수준에 영향을 미치며, 추가의 사회적 인지에 필요한 사회적 신호의 처리를 가능케 하는 기전을 활성화시킨다는 것을 시사한다.

본 발명의 발견은 β₁-ADR이 AD에서 사회적 기억 및 기타 인식 결핍을 개선시키기 위한 치료적 표적으로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 심혈관 기능에서 노르아드레날린계의 유의한 관련으로 인하여, 안전성 및 번역 실험은 본원에 개시된 요법에 사용하기 위한 추가의 화합물의 확인시 이러한 접근법의 안전성 및 효능을 보장하는데 사용될 수 있다. 추가의 화합물의 목적은 심혈관 효과를 최소화하면서 아드레날린계의 양성의 CNS 효과를 향상시키기 위하여 최소의 전신 활성 및 높은 CNS 침투를 갖는 분자를 개발하는데 있다.

AD, DS , ADD, ADHD 및 자폐증에 대한 요법에 사용하기 위한 β ₁ -ADR 전구약 물 및 유도체의 확인 및 평가:

본 발명의 화합물 및 조성물을 투여하는데 있어서 사회적 기억뿐 아니라, 기타 인식 결핍의 향상을 고려하면, 이들 화합물 및 조성물은 AD, DS, ADD, ADHD 및 자폐증을 나타내는 인간에서 사회적 기억 및 기타 인식 특성을 향상시키는데 사용될 수 있다는 것을 명백하게 고려한다. NA 병리학이 인간 환자 및 마우스 모델 모두에서 AD의 복수의 병리학적 특징과 관련있는 것으로 공지된 것을 고려하면, 본 발명에 대한 하나의 중요한 기본은 단일 신호 경로를 표적화하는 화합물을 사용한 통상의 접근법보다 더 넓으며 더 효과적인 치료 접근법을 제공할 수 있다는 실현이다. 구체적으로, 본 발명은 개재신경세포에서 탈분극의 조절에 필요한 cAMP 반응 요소-결합 단백질 (CREB) 인산화 및 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF)의 수준 및 인식 기능에 필요한 신경전달의 하류 조정을 증가시켜 AD와 관련된 인식 저하를 구제하기 위하여 β₁-ADR의 작용제 자극을 통한 NA 신호의 복원에 관한 것이다.

그래서, 본 발명자들은 AD, DS, ADD, ADHD 및 자폐증을 치료하기 위한 화합물 및 조성물 모두뿐 아니라, 이들 질환의 치료 및 그의 증상의 개선 방법을 제공한다.

본원에 개시된 예시의 화합물 이외에 AD, DS , ADD 및 ADHD 및 자폐증을 치료하는데 사용하기 위한 추가의 화합물의 선택에 대한 가이드라인

또한, 본 발명은 심장 기능에 대한 최소의 또는 존재하지 않는 말초 효과를 나타내는 β₁-ADR 작용제 (부분 또는 완전) 및 그의 전구약물을 확인하는데 사용되는 방법 및 가이드라인을 제공한다. 전체 과정은 도 10에 도시된다. 이러한 과정의 또 다른 전체적인 목적은 개선된 뇌 분포 및 최소의 말초 효과를 갖는 β₁-ADR 작용제 (부분 또는 완전) 및 그의 전구약물, 보다 구체적으로 사모테롤 전구약물을 확인하기 위함이다. 이러한 절차의 한 결과는 생체가역적인 β₁-ADR 작용제 전구약물, 특히 사모테롤 전구약물의 확대된 라이브러리의 생성이다. 하기 절차는 생체가역적, 즉 생체내 가수분해성인 β₁-ADR 작용제 전구약물, 심지어 새로운 합성 β₁-ADR 작용제 화합물의 확대된 라이브러리를 생성하는데 사용된다.

1) 단계 1: 후보 β₁-ADR 작용제 전구약물 화합물은 추정된 바람직한 clogP 값을 기준으로 선택되며, 화합물에 대해 일련의 시험관내 흡수, 분포, 대사 및 배설 (ADME) 테스트를 실시한다. 이와 같은 초기 테스트에 대하여 선택된 화합물은 초기에 지정될 수 있거나 또는 관련 문헌의 검색으로부터 유래할 수 있다. 예를 들면 일반적으로 도 17-19에 도시한 바와 같은 사모테롤 전구약물, 예컨대 아실화된 사모테롤 화합물은 공지된 아실화 반응을 사용하여 생성된다. 사모테롤 전구약물은 거울상이성질체선택성 합성에 의한 라세메이트 (라세미 혼합물)로서 또는 (R)- 및 (S)-거울상이성질체로서 생성될 수 있다.

2) 단계 2: 테스트된 화합물에 대한 구조-성질 관계 (SPR)는 공지의 방법론에 의하여 결정되는 각각의 흡수, 분포, 대사 및 배설을 갖는 그의 ADME 성질에 기초하여 개발된다.

3) 단계 3: 단계 2로부터의 바람직한 ADME 성질을 나타내는 화합물은 생체내 체내분포 및 약물동력학 (PK) 연구로 진행된다. 가장 바람직한 ADME, 체내분포 및 PK 성질을 갖는 2종의 화합물이 임상전 동물 모델 실험에서의 테스트를 위하여 선택된다.

4) 단계 4: 동물 모델 실험으로부터 모든 시험관내 및 생체내 데이타를 포함하는 단계 1-3으로 처리한 각각의 화합물에 대하여 표적 생성물 프로파일 (TPP)을 생성한다.

5) 단계 5: 그 후, 추가의 약물 발생을 가이드하기 위한 전략적 계획 도구로서 TPP를 사용한다.

상기 제시한 바와 같이, 상기 기재된 5종의 단계도 또한 도 10에 도시한다.

사모테롤

사모테롤은 각종 전구약물이 생성되는 이로운 및 바람직한 β₁-ADR 선두 화합물이다. 이에 대한 여러 이유가 있다. 첫번째로, 본 발명에 의하여 얻은 결과는 β-아레스틴 신호 경로에 대한 최소의 활성을 유지하면서 사모테롤이 cAMP 캐스케이드를 선택적으로 활성화시키는 것을 나타낸다. 도 9 참조. β₁-ADR 활성화의 신호 경로 하류 중에서, cAMP 신호 캐스케이드는 시냅스 기능, 신경전달 및 인식 기능에서의 핵심 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

두번째로, β₁-ADR의 활성화를 통한 β-아레스틴-매개된 신호는 각종 심장 과정에 관여되므로, 사모테롤은 심장 기능에 대한 최소의 작용 또는 효과와 함께 인식 기능에 관련된 신호 경로를 특이적으로 표적화할 수 있는 점이 특히 이롭다.

세번째로, 사모테롤에 의한 β-아레스틴 신호 활성의 기능적 방지는 내성 및 속성내성의 발생에 의하여 작용제 요법에 대한 제한을 방지하는 추가의 잇점을 갖는다. 구체적으로, β-아레스틴은 수용체 탈민감화 및 하향-조절에 관여한다. 작용제 요법에서 발생하는 증가된 내성은 β-아레스틴 신호 의존성 수용체 탈민감화에 의하여 매개된다. 이러한 문제는 β₁-ADR 선두 화합물로서 사모테롤의 사용에 의하여 크게 최소화된다.

네번째로, β₁-ADR은 일반적으로 아데닐릴 시클라제에 커플링되고, CREB 인산화의 수준을 증가시키므로, 사모테롤은 밀접한 관련이 있는 수용체 β₂-ADR에 비하여 β₁-ADR에 대한 그의 서브타입-선택성을 고려하면 이롭다. 그래서, β₁-ADR의 활성화는 CREB-의존성 기억 결핍을 구제할 능력을 갖는다. 반대로, β₂-ADR은 AC 억제 G 단백질 G_i _/o에 커플링될 수 있으며, β₁-ADR의 신호 및 인식 작용을 반대할 수 있다. 그리하여, 선두 화합물로서 사모테롤의 서브타입 선택성이 중요하다. 사모테롤은 또한 혈액-뇌 장벽을 통과하며, CREB 인산화에서의 증가를 유도하며, 전-인식 효과를 매개하는 중추 신경계에 도달한다. 상기 표 1 및 도 9를 참조한다. 그러므로, 사모테롤은 생체이용률과 같은 향상된 성질을 갖는 다수의 사모테롤 전구약물의 제조를 위한 선두 작용제 화합물로서 이롭다.

화합물 선택의 예:

상기 기재된 선택 절차 단계의 전체적인 목적은 최소의 전신 또는 말초 부작용을 제외하고 최대화된 치료적 유용성을 갖는 β₁-ADR 전구약물, 특히 사모테롤 전구약물의 제공이다. 상기 기재된 일반적인 단계 (1-5)는 하기에서 보다 상세하게 기재될 것이다:

단계 1: 전구약물로서 β ₁ -ADR 작용제 화합물, 예컨대 사모테롤의 구조적 유사체의 설계 및 합성

효소에 의하여 또는 비-효소에 의하여 선두 또는 작용제 화합물, 예컨대 사모테롤로 전환될 수 있는 β₁-ADR 작용제 화합물, 예컨대 사모테롤의 생체가역적 유도체의 집중된 라이브러리를 생성한다. CNS 생체이용률을 개선시키고, BBB 침투를 향상시키기 위하여, 각종 전략을 사용하여 별도의 실험으로 할 수 있다. 게다가, 사모테롤과 같은 다수의 β₁-ADR 화합물은 라세미 혼합물이며, 그의 거울상이성질체 성분으로 분해될 수 있으며, 하기 기재된 바와 같은 선두 화합물로서 별도로 평가될 수 있다는 것은 명백하게 인지되어 있다. β₁-ADR 라세미 혼합물은 각종 공지의 방법론, 예컨대 기체 크로마토그래피 및 역류 추출을 사용하여 분해될 수 있다. 예를 들면 EP 0 663 897 (1997)을 참조한다. 대안으로, 사모테롤 및 사모테롤 전구약물의 (R)- 및 (S)-거울상이성질체 화합물 모두는 거울상이성질체선택적으로 합성될 수 있다. 또한, 반응식 1에서의 실시예에서 본 발명에 의하여 하기 제공된 거울상이성질체선택성 합성을 참조한다. 또한, 절차는 반응식 2에서의 실시예에서 라세미 사모테롤 및 사모테롤 전구약물의 합성에 대하여 본 발명에 의하여 제공된다. 이들 절차는 사모테롤의 전구약물뿐 아니라, 예를 들면 기타 β₁-ADR 작용제, 예컨대 노르아드레날린, 이소프레날린 또는 도부타민을 비롯한 본원에 개시된 임의의 전구약물을 생성하는데 사용될 수 있다.

추가로, 구조적 유사체의 제조에서, 반응 진행은 LCMS에 의하여 분석하며, 90% 미만의 순도를 갖는 화합물은 HPLC에 의하여 정제된다. 모든 생성물 화합물은 ¹H 및 ¹³C NMR에 의하여 특징화된다. 입증된 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 50 mM DMSO 용액으로서 -25℃에서 보관한다.

예를 들면, 실험 1에서, 선두 화합물의 구조를 변경시켜 얻는 선두 또는 작용제 화합물의 개선된 친유성이 목적이다. 사모테롤은 불량한 흡수 및 낮은 생체이용률을 가지므로 (-0.62의 계산된 logP (clogP) 값으로 매우 친수성임), 구조적 유사체는 개선된 친유성을 갖도록 생성된다. 이를 실시하기 위하여, 효소적으로 불안정한 기, 예컨대 에스테르, 카르바메이트 및 옥사졸리딘은 예를 들면 사모테롤의 히드록실 및/또는 아미노 기에 공유 결합된다. 사모테롤의 구체적인 친유성 전구약물의 예는 도 17-19에 도시되어 있다. 말단 페닐 히드록실 기의 아실화에 의하여 형성된 사모테롤의 전구약물이 특이 이롭다. 하기에는 사모테롤 전구약물의 제조, 특히 사모테롤 전구약물의 R- 및 S-거울상이성질체의 거울상이성질체선택성 합성을 도시하는 수개의 반응식이 있다. 또한, cAMP 검정에 사용되는 바이오센서 및 프로토콜이 기재되어 있다.

사모테롤 거울상이성질체의 방법 및 합성

cAMP 검정

cAMP 검정의 경우, cAMP-결합 모티브를 함유하는 반딧불이 루시페라제의 변형된 형태를 사용하는 글로센서(GloSensor) cAMP 바이오센서 (프로메가(Promega))를 사용하였다. cAMP 결합시, 글로센서 cAMP 바이오센서의 변형된 형태는 배좌 변위를 겪으며, 이는 효소 상보성을 초래하며, 루시페라제 기질 반응 후 발광 판독을 제공한다. β₁-아드레날린성 수용체 (β-ADR)-매개된 반응을 정량화하기 위하여, β₁-ADR을 안정하게 발현시키는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 사용하였다. 간략하게, 세포를 맑은 94-웰 배양 평판에서 웰당 2.0×10⁴ 개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 37℃에서 5% CO₂ 중에서 배양하였다. 플레이팅 후 24 시간에 세포를 리포펙타민(Lipofectamine)™ 2000 (인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 p글로센서™-20F cAMP (프로메가) 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 37℃에서 5% CO₂ 중에서 유지하였다. 48 시간 후, 세포를 평형 배지 (CO₂ 독립 배지, 3% 글로센서™ cAMP 시약) 중에서 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 2 시간 배양 후, CO₂ 독립 배지 중에서 생성된 테스트 화합물을 첨가하고, 발광 신호에서의 변화를 평판 판독기 (플렉스스테이션(FlexStation); 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 평판의 바닥으로부터 20 분 동안 측정하였다. 화합물 첨가 전 기준 발광 값 및 화합물 첨가후 피크 발광 값 사이의 차이를 계산하여 작용적 반응을 정량화하였다. 결과를 30 μM 이소프로테레놀의 비율로서 나타냈다.

하기에는 라세미 사모테롤 및 (R)- 및 (S)-사모테롤에 대한 제조 절차의 비제한적인 예로서 수개의 반응식 및 관련 실험 절차를 제시한다.

실시예

<반응식 1>

tert -부틸 2-(모르폴린-4- 카르복스아미도 ) 에틸카르바메이트 (10)

300 ㎖의 CH₂Cl₂ 중의 tert-부틸 2-아미노에틸카르바메이트 8 (50 g, 312.09 mmol)의 용액에 트리에틸아민 (94.74 g, 936.3 mmol)을 첨가하고, 200 ㎖의 CH₂Cl₂ 중의 모르폴린-4-카르보닐 클로라이드 9 (46.7 g, 312.09 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 상온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC에 의하여 모니터하였다. 그 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 통상적인 워크업을 실시하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 (CH₂Cl₂:MeOH=10:1)에 의하여 정제하여 tert-부틸 2-(모르폴린-4-카르복스아미도)에틸카르바메이트 10 (75 g, 87.9%)를 백색 고체로서 얻었다. ¹H NMR은 구조와 일치하였다.

N-(2- 아미노에틸 ) 모르폴린-4- 카르복스아미드 (4)

500 ㎖의 CH₂Cl₂ 중의 tert-부틸 2-(모르폴린-4-카르복스아미도)에틸카르바메이트 3 (75 g, 274.39 mmol)의 용액에 0℃에서 TFA (156.0 g, 1.37 mol)를 적가 처리하였다. 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 감압하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 CH₂Cl₂ 중에 용해시키고, 6M NaOH을 첨가하여 pH 8로 조절하였다. 이 혼합물을 CH₂Cl₂로 추출한 후, 통상의 워크업을 실시하여 N-(2-아미노에틸)모르폴린-4-카르복스아미드 4 (43 g, 91%)를 황색 오일로서 얻었다. ¹H NMR은 구조와 일치하였다. 일부 유리 염기를 4-(N-베타-아미노에틸카르바모일)모르폴린 수소 술페이트 (mp. 168-169℃)로 전환시켰다.

(S)-2-((4-( 벤질옥시 ) 펜옥시 ) 메틸 ) 옥시란 (13a)

500 ㎖의 DMF 중의 4-(벤질옥시)페놀 11 (50 g, 249.71 mmol) 및 (R)-2-(클로로메틸)옥시란, 12a (69.31 g, 749.14 mmol)의 혼합물에 CsF (113.79 g, 749.14 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3 일 동안 교반하였다. 그 후, 생성된 반응 혼합물을 물 (1 ℓ) 및 EtOAc (2 ℓ) 사이에 분배시켰다. 유기 층을 물 (900 ㎖, 각각) 및 염수로 3회 세정한 후, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 유기 추출물을 감압 하에서 농축시키고, 실리카 컬럼 (석유 에테르:EtOAc, 4:1)에 의하여 정제하여 (S)-2-((4-(벤질옥시)펜옥시)메틸)옥시란 13a (47 g, 73.4%)를 백색 고체로서 얻었다. ¹H NMR은 구조와 일치하였다.

(S)-N-(2-(3-(4-( 벤질옥시 ) 펜옥시 )-2- 히드록시프로필아미노 )에틸)모르폴린- 4-카르복스아미드 (14a)

120 ㎖의 프로판-2-올 중의 N-(2-아미노에틸)모르폴린-4-카르복스아미드 4 (30 g, 104.11 mmol)의 혼합물을 230 ㎖의 프로판-2-올 중의 (S)-2-((4-(벤질옥시)펜옥시)메틸)옥시란 13a (19.72 g, 156.66 mmol)의 용액에 50℃ 미만에서 5 시간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc로 철저히 추출하였다. 유기층을 물 (300 ㎖), 염수로 세정한 후, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. EtOc 추출물을 감압 하에서 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 (CH₂Cl₂:MeOH, 10:1)에 의하여 정제하여 (S)-N-(2-(3-(4-(벤질옥시)펜옥시)-2-히드록시프로필아미노)에틸)모르폴린-4-카르복스아미드 14a (20.8 g, 63%)를 백색 고체로서 얻었다. ¹H NMR은 구조와 일치하였다.

(S)- 사모테롤 (7a)

2 ㎖의 아세트산을 함유하는 200 ㎖의 EtOH 중의 (S)-N-(2-(3-(4-(벤질옥시)펜옥시)-2-히드록시프로필아미노)에틸)모르폴린-4-카르복스아미드 14a (20 g, 46.56 mmol)의 혼합물에 Pd(OH)₂/C (5 g)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 55 psi에서 밤새 수소화하였다. 촉매를 여과에 의하여 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 EtOH 중에 용해시키고, 푸마르산을 사용하여 헤미푸마레이트로 전환시켰다. 헤미푸마레이트 염을 EtOH로 재결정화시켜 (S)-사모테롤 7a (12.3 g, 91.7%)를 회백색 고체로서 얻었다. ¹H NMR은 구조와 일치하였다.

(R)-2-((4-( 벤질옥시 ) 펜옥시 ) 메틸 ) 옥시란 (13b)

상기 화합물은 11 (8 g, 41.9 5 mmol)로부터 13a에 대하여 기재된 바와 같은 절차를 수행하여 (R)-2-((4-(벤질옥시)펜옥시)메틸)옥시란 13b (6.3 g, 24.6 mmol, 61%)를 백색 고체로서 얻었다.

(R)-N-(2-(3-(4-(벤질옥시)펜옥시)-2- 히드록시프로필아미노 )에틸)모르폴린- 4-카르복스아미드 (14b)

화합물 14b는 6.3 g (24.6 mmol)의 7a 및 12.77 g (73.80 mmol)의 4로부터 14a의 제조에 대하여 기재된 절차를 수행하여 3 g (6.98 mmol, 30%)의 14b를 얻었다.

(R)- 사모테롤 (7b)

3 g (6.98 mmol)의 14b는 상기 기재된 바와 같은 절차를 수행하여 (R)-사모테롤 (7b)로 전환시켜 2.5 g (6.8 mmol, 91%)의 7b를 회백색 고체로서 헤미푸마레이트 염으로서 얻었다.

<반응식 2>

라세미 사모테롤의 제조:

N- 펜옥시카르보닐모르폴린 (3):

모르폴린 2 (4.35 g) 및 페닐 클로로포르메이트 1 (6.35 g)을 20 분 동안 0℃에서 유지되는 톨루엔 (10 ㎖), 물 (5 ㎖) 및 수산화나트륨 (2 g)의 교반된 혼합물에 별도로 및 동시에 적가하였다. 혼합물을 추가의 2 시간 동안 교반하고, 온도를 20℃로 상승되도록 하였다. 톨루엔 용액을 분리하고, 수성 용액을 톨루엔으로 2회 추출하고, 합한 톨루엔 용액을 물로 세정하고, 건조시키고, 무수 상태로 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르 (비점 60-80℃)로부터 결정화시켜 N-펜옥시카르보닐모르폴린 (3)을 얻었다. 융점 46.5-47.5℃.

4-(N- 베타아미노에틸카르바모일 )모르폴린 수소 술페이트 (4)

상기 화합물 3 (11 g) 및 에틸렌디아민 (27.8 g)의 혼합물을 실험실 온도에서 3 일 동안 교반하고, 과잉의 에틸렌디아민을 감압 하에서 증발에 의하여 제거하였다. 잔류물을 메탄올 중에 용해시키고, 용액을 5℃로 냉각시키고, 용액의 pH가 2가 될 때까지 진한 황산을 첨가하였다. 필터-보조물 (셀라이트(Celite), 10 g)을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 무수 상태로 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 함께 교반하였다. 혼합물을 여과하여 고체 잔류물로서 4-(N-베타-아미노에틸카르바모일)모르폴린 수소 술페이트 (4)를 얻었다. 융점 168-169℃.

1-p- 벤질옥시펜옥시 -3-(베타- 모르폴리노카르본아미도에틸 )아미노-2-프로판올 히드로클로라이드 (6)

이소프로판올 (6 ㎖) 중의 1-p-벤질옥시펜옥시-2,3-에폭시프로판 5 (11.5 g)의 현탁액을 4-(N-베타아미노에틸카르바모일)모르폴린 수소 술페이트 4 (12.7 g), 수산화칼륨 (7.0 g) 및 이소프로판올 (10 ㎖)의 교반된 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 45℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 무수 상태로 감압 하에서 증발시켰다. 잔류 오일을 물과 함께 교반하고, 혼합물을 여과하고, 고체 잔류물을 아세톤 중에 용해시켰다. 프로판올 중의 염화수소의 30% 용액을 혼합물의 pH가 2 미만이 될 때까지 첨가하고, 혼합물을 여과하였다.

고체 잔류물을 물로부터 결정화시켜 1-p-벤질옥시펜옥시-3-(베타-모르폴리노카르본아미도에틸)아미노-2-프로판올 히드로클로라이드 6 (4.9 g)을 얻었다.

사모테롤 (7c): (1-p- 히드록시펜옥시 -3-베타-( 모르폴리노카르본아미도 )에틸-아미노-2-프로판올 수소 푸마레이트)

에탄올 (20 ㎖) 및 아세트산 (20 ㎖)의 혼합물 중의 상기 화합물 6의 용액을 30% 탄소상 팔라듐 촉매 (0.1 g)와 함께 수소 대기 중에서 실험실 온도 및 압력에서 250 ㎖의 수소가 흡수될 때까지 진탕시켰다. 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압 하에서 무수 상태로 증발시키고, 잔류물에 에탄올 (15 ㎖) 중의 푸마르산 (1.25 g)의 고온 용액을 첨가하였다. 혼합물을 5℃에서 12 시간 동안 유지한 후, 여과하고, 고체 잔류물을 고온 에탄올로 세정하고, 건조시켰다. 그리하여 1-p-히드록시펜옥시-3-베타-(모르폴리노카르본아미도)에틸-아미노-2-프로판올 수소 푸마레이트 (7c)를 얻었다. m.p.168-169℃ (분해 포함). 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제4,143,140호를 참조한다.

실험 2에서, 뇌 미세혈관 중의 특이성 담체는 선두 화합물의 CNS 생체이용률을 개선시키기 위하여 표적화하였다. 이러한 전략은 기타 말초 기관에 대한 노출 및 독성을 감소시키면서 뇌로의 약물 전달을 향상시키는 목적을 갖는다. 구체적으로, BBB 상에 발현된 내인성 담체 또는 수송체, 예컨대 GLUT-1, LAT-1 및 콜린 수송체는 예를 들면 약물을 뇌로 특이적으로 전달하는 담체 또는 수송체를 위한 기질로 사모테롤을 콘쥬게이트시키는데 사용된다. 사모테롤의 표적화된 전구약물의 예는 도 17에 도시한다.

실험 3에서, 라세미 전구약물 화합물의 거울상이성질체 분리는 거울상이성질체 전구약물의 성질을 평가하기 위하여 실시한다. 상기 언급한 바와 같이, β₁-ADR 라세미 선두 또는 전구약물 화합물 혼합물의 거울상이성질체로의 분해는 임의의 공지의 절차, 예컨대 기체 크로마토그래피, 역류 추출 및 또한, α-메톡시-α-트리플루오로메틸-페닐아세트산을 사용한 모셔(Mosher) 에스테르화를 사용한 키랄 분해에 의하여 수행할 수 있다. 문헌[Mosher et al., Journal of Organic Chemistry 34(9):2543-2549 (1969)]을 참조한다.

사실상, 본 발명자들은 사모테롤의 R- 및 S-거울상이성질체가 실질적으로 상이한 약리 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 예를 들면 도 23은 사모테롤 라세메이트 (R,S) 및 (S)-거울상이성질체가 나노몰 범위의 EC₅₀ 값, 즉 (R,S)-사모테롤, EC₅₀=11.6 nM; 및 (S-)-사모테롤, EC₅₀=21.2 nM의 유사한 효능을 갖는 cAMP 축적을 자극한다는 것을 입증하였다. 반대로, (R)-사모테롤은 11,900 nM의 EC₅₀으로 cAMP 축적을 자극하였다. 이는 (S)-사모테롤이 β₁-ADR을 통한 cAMP 축적의 자극에서 (R)-사모테롤보다 약 500배 더 유효하다는 것을 나타낸다. 그러나, 본 발명은 사모테롤 전구약물의 (R)- 및 (S)-거울상이성질체뿐 아니라, β₁-ADR 작용제의 상기 거울상이성질체, 일반적으로 예컨대 노르아드레날린, 이소프레날린 및 도부타민을 생성하는 거울상이성질체선택적 방법을 제공한다.

단계 2: 바람직한 약물동력학 성질 및 개선된 CNS 생체이용률을 갖는 전구약 물 화합물의 선택

상기 단계에서 선택한 화합물 전구약물은 일반적으로 뇌에 도달하기 전 생물학적 매체 또는 조직 중에서의 안전성, BBB를 통한 세포횡단 침투에 대한 바람직한 물리화학적 성질을 나타내거나 또는 능동 수송을 위한 BBB에서 발현된 수용체 또는 수송체에 의하여 인지된 구조를 가져야 하며, 모 또는 선두 화합물로 다시 쉽게 전환될 수 있어야 한다. C57B1/6 마우스는 인간 및 마우스 사이의 사모테롤 대사에서의 유사성으로 인하여 생체내 PK 실험에 사용된다.

실험 1에서, β₁-ADR 전구약물 화합물, 예컨대 사모테롤 유사체의 생체안정성 및 모 약물로의 그의 시험관내 전환을 평가하였다. 예를 들면 사모테롤 유사체는 마우스 혈액, 간 S9 분획, 뇌 균질액 및 등장성 인산염 완충액과 함께 37℃에서 교반기 수조 내에서 배양하였다. 약물 첨가후 시간 0 및 3 시간까지 30 분마다 100 ㎕의 분액을 빼냈다. 수집한 샘플을 즉시 원심분리하고, 상청액을 조심스럽게 제거하고, 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다. 예를 들면 상청액 중에서 무손상 전구약물 및 사모테롤의 양을 측정하기 위하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 대사 반감기 및 생체전환율도 또한 측정하였다.

실험 2에서, β₁-ADR 작용제 전구약물, 예컨대 사모테롤 유사체의 CNS 침투는 비접촉 공생배양 모델을 사용하여 평가하고, 이는 낮은 경세포 침투, 잘 발달된 융합막 및 유출 수송체의 발현을 비롯한 BBB의 다수의 특징을 나타낸다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (HBMEC) 및 인간 성상세포 (HA)는 미공성 반투막을 갖는 트랜스웰 평판을 사용하여 공생배양하였다. HBMEC를 피브로넥틴-코팅된 반투명 막 삽입물에 파종하고, 편광 단층을 3-4 일 동안 생성되도록 하였다. 내피 세포의 형성된 층은 정단 및 기저측 구획으로 분리되며, 모델의 양측에서 테스트 화합물의 투여 및 시료 채취를 허용하였다. HA를 담체 평판의 바닥에 파종하였다. 실제 실험 당일에, 모든 배지를 제거하고, 인산염 완충 염수를 함유하는 새로운 24-웰 평판에 삽입물을 재배치하였다. 테스트 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 공여체 구획에 1 μM의 농도로 첨가하였다. 수혜자측에서 화합물 외관의 비율을 구하기 위하여, 약물 첨가 후 5, 15, 30, 60, 90 및 120 분에서 수혜자측으로부터 샘플을 수집하였다. 챔버를 통하여 일정한 부피를 유지하기 위하여, 등가량의 인산염 완충 염수를 각각의 시료 채취 후 수혜자 챔버에 첨가하였다. 수집된 샘플을 LC/MS/MS에 의하여 분석하였다. 겉보기 정단에서 기저로의 투과율 (P_app AB), 겉보기 기저로부터 정단으로의 투과율 (P_app BA) 및 유출비 (P_app BA/P_app AB)를 구하였다. 테스트한 각각의 약물 또는 약물 전구약물을 각각의 막에 대하여 다수의 시점에서 최소 4종의 상이한 막을 통하여 테스트하였다.

실험 3에서, 시험관내 실험에서 유망한 물리화학적 성질을 나타내는 전구약물, 예컨대 사모테롤 유사체는 생체내 PK 실험으로 진행하였다. 예를 들면 사모테롤을 C57B1/6 마우스에게 3 ㎎/㎏의 단일 투여량으로 정맥내 또는 피하 투여하였다. 전구약물의 경우, 3 ㎎/㎏의 사모테롤에 해당하는 투여량을 투여하였다. 약물 투여 후 3, 15, 30, 60, 120, 240 및 360 분에서 마우스를 안락사시켰다. 혈액을 심장 천자에 의하여 뽑아내고, 헤파린을 첨가한 시험관에 수집하였다. 혈장을 원심분리에 의하여 즉시 분리하고, 검정시까지 -80℃에서 보관하였다. 조직 분포 실험의 경우, 뇌, 심장, 신장, 간 및 비장으로부터의 조직 샘플을 약물 투여 후 60 및 120 분에 수집하였다. 0.9% 염수를 사용하여 1:2의 비로 조직 샘플을 균질화시켰다. 균질물을 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. 혈장 및 조직 샘플로부터 사모테롤의 농도를 LC-MS/MS에 의하여 공지의 방법을 사용하여 분석하였다. 문헌[Faizi et al., Brain Behavior, 2012. 2(2): p. 142-154]을 참조한다. 혈장 뇌 중의 사모테롤 및 그의 유사체의 농도는 비-구획 방법에 의하여 분석하여 약물동력학 변수를 구하였다. 최대 혈장 농도 (C_max), 최대 농도까지의 시간 (T_max) 및 곡선 아래 면적 (AUC)을 비롯한 전구약물의 PK 변수를 구하고, 사모테롤과 비교하였다. 이들 결과는 사모테롤 유사체에 대한 BBB 투과율 지수를 제공하였다.

통계 분석

모든 화합물 (선두 및 전구약물/유사 화합물)은 시험관내 생체안정성, 생체전환율 및 BBB 투과율 테스트를 사용하여 스크리닝하였다. 개선된 CNS 생체이용률을 나타내는 가능성을 보이는 화합물만이 생체내 PK 실험을 실시하였다. PK 데이타 분석은 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어를 사용하여 실시하였다. 프리즘 3.0 프로그램 (그래프 패드 소프트웨어(Graph Pad Software))을 사용하여 전구약물 및 모 또는 선두 약물의 변수 사이의 통계적 유의성을 검출하기 위하여 스튜던트(Student) t-테스트를 사용하였다. 차이는 p<0.05의 수준에서 유의적인 것으로 고려한다.

단계 3: 인식 증상에 대한 전구약물의 효과의 평가

본 단계에서, AD의 Thy1-APP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스 모델을 사용하며, 마우스 모델은 인식 결핍, 성숙한 β-아밀로이드 플라크뿐 아니라, 시냅스 변성을 제시한다. Thy1-App^Lond/Swe+ 마우스를 만성 투여량의 사모테롤 및 2종 이상의 전구약물로 6 개월령으로부터 시작하여 4 개월 동안 피부 아래 이식한 삼투 펌프를 사용하여 처치하였다. 도 20은 하기 기재된 실험 1 및 2의 개략도를 도시한다.

실험 1에서, 마우스의 인식 효과에 대한 사모테롤 및 그의 전구약물을 사용한 만성 처치의 효과를 테스트하였다. 이러한 실험은 작업 기억 (Y-미로 테스트 사용), 사회적 기억 (사회적 새로움 테스트 사용) 및 맥락 기억 (공포 조건화 테스트 사용)에 대한 β₁-ADR 작용제, 예컨대 사모테롤 및 그의 전구약물의 효과의 실험을 수반한다. Thy1-APP^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스는 6개월령에서 손상된 작업 기억 (Y-미로 테스트), 사회적 인지 및 맥락 기억 (공포 조건화 테스트)을 나타내며, AD의 마우스 모델이다. 구체적으로, β₁-ADR 작용제, 예컨대 사모테롤 및 그의 전구약물을 사용한 만성 처치를 테스트하여 AD에 대한 마우스 모델에서 관찰된 인식 결핍의 구제에서 각각의 효과를 평가하였다. 이들 특이성 마우스 및 non-Tg (비-트랜스제닉) 마우스는 6개월령이 된 후, 상기 및 도 20 모두에서 나타낸 3종의 행동 테스트로 테스트하였다. 행동 테스트 후, 마우스를 죽이고, 실험을 위하여 뇌 조직을 수거하였다. 얻은 값을 기준선으로서 사용하였다. 마우스의 기타 코호트는 피하 삼투 펌프를 사용하여 사모테롤 전구약물을 비롯한 β₁-ADR 작용제 전구약물을 수용하였다. 이들 코호트는 투여 개시 2개월 (마우스 8 개월령) 및 4 개월 (마우스 10 개월령)에 명시된 3종의 인식 과제로 테스트하였다. 유전형당, 처치당 및 시점당 12 마리의 마우스 (n=12)를 사용하였다. 행동 테스트 후, 하기 실험 2에서의 뇌 조직 분석을 위하여 마우스를 죽였다. 뇌를 시상으로 절단하고, 뇌의 절반을 사용할 때까지 -80℃에서 냉동시키고, 나머지 절반은 밤새 4% 파라-포름알데히드 (PFA) 중에서 밤새 두고, 가공할 때까지 4℃에서 수크로스 중에서 보관하였다.

실험 2에서, 사모테롤을 비롯한 β₁-ADR 작용제 및 그의 전구약물을 사용한 만성 처치의 결과를 테스트하여 화합물이 AD와 관련된 병리학적 변화를 감소시킨다는 것을 결정하였다. (AD의 Thy1-App^Lond ^/ ^Swe ⁺ 마우스 모델은 시냅스 구조적 비정상 및 높은 수준의 Aβ42 및 플라크 개수를 나타낸다). 이러한 실험은 테스트된 전구약물이 AD의 마우스 모델에 나타난 시냅스 구조에서의 병리학적 변경을 개선시키는 정도를 평가한다. 추가로, 샌드위치 ELISA는 프리시냅스 소낭 단백질, 시냅토피신, 프리시냅스 막 단백질 SNPA-25 (25 kDa 시냅토솜-관련 단백질) 및 포스트시냅스 스카폴딩 단백질 PSD-95 (포스트시냅스 밀도 95)에 대하여 수행하였다. 플라크 수준에서의 감소도 또한 평가하였으며, Aβ40 및 Aβ42의 정량화는 ELISA에 의하여 수행하였다. 면역조직화학 테스트도 또한 항-Aβ 항체를 사용하여 시상 뇌 절편에 수행하였으며, 상이한 뇌 구역에서의 플라크 크기, 개수 및 로드의 분석은 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

또한, 이동에서의 NA의 관련 및 미세아교세포의 포식세포 활성에 기초하여 사모테롤 전구약물을 비롯한 다양한 β₁-ADR 작용제 전구약물을 사용한 만성 처치가 신경세포염증 과정에 영향을 미치는지를 결정한다. 미세아교세포 활성화는 또한 Ibal-항체 및 비편견 입체해석 계수와 함께 면역조직화학을 사용하여 정량화하였다. 신경세포염증 매개체, 예컨대 TNF-α 및 인터류킨-1 (IL-1) 및 6 (IL-6)은 ELISA에 의하여 평가하였다. 6 내지 8 마리의 동물/처치군을 분석하였다.

생체내 통계 분석

모든 생체내 효능 실험은 결과의 신뢰성을 보장하기 위하여 유전형 및 처치 모두에 대한 맹검 실험에 의하여 실시하였다. 모든 데이타는 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 테스트로 정규성에 대하여 테스트하였으며, 적절한 변수 또는 비-변수 테스트는 군간 비교에 사용할 것이다. 모든 데이타는 ANOVA (변수) 또는 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트 (비-변수)에 이어서 사후 (post-hoc) 분석을 사용하여 분석하였다. 모든 분석은 프리즘 소프트웨어를 사용하여 실시하였다.

본 발명은 본 발명의 일부 및 일부분 모두인 수개의 본 발명의 구체예를 제공한다.

첫번째로, 본 발명은 모 약물의 생체전환후 β₁-ADR을 효능적으로 자극하며, 해당 β₁-ADR 작용제에 비하여 개선된 친유성 및 CNS 생체이용률을 갖는 생체가역적 β₁-ADR 작용제 전구약물을 제공한다. 바람직하게는, 생체가역적 β₁-ADR 작용제 전구약물은 또한 해당 β₁-ADR 작용제로의 생체전환 후 β-아레스틴 경로를 자극하는 것보다 더 많이 cAMP 경로를 자극한다. 구체적으로, β₁-ADR 작용제 전구약물 화합물이 생체전환 후 10^-4 내지 10^-10 M 범위내의 동일한 농도에서 cAMP 경로를 자극하는 것보다 50% 이하로 β₁-ADR 작용제 전구약물 화합물이 β-아레스틴 경로를 자극하는 경우 가장 바람직하다. β-아레스틴 경로는 20% 이하로 자극하는 것이 더욱 바람직하며, β-아레스틴 경로의 자극이 전혀 없는 경우 가장 바람직하다.

또한, 생체가역적 β₁-ADR 작용제 전구약물은 생체전환 후 하류 CREB 경로를 자극하는 것이 바람직하다.

이들 화합물은 주사 가능한 형태의 조성물로서 제제화될 수 있다. 예를 들면 화합물은 살균 염수액 또는 덱스트로스 염수액 중에 용해될 수 있다. 그래서, 용액은 정맥내 (i.v.) 또는 피하 (s.c.) 주사될 수 있다. 그러나, 본 발명의 β₁-ADR 전구약물은 투여의 임의의 수단에 의하여, 예컨대 점비제, 비강 면봉 또는 건조 분말 흡입기 또는 비강내 전달에 의하여 일반적으로 또는 심지어 경구 투여될 수 있다.

두번째로, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 사회적 기억을 비롯한 인식을 개선시키기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 인간의 DS의 치료 방법을 제공한다.

세번째로, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 사회적 기억을 비롯한 인식을 개선시키기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 인간의 AD의 치료 방법을 제공한다.

네번째로, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 사회적 기억을 비롯한 인식을 개선시키기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 인간의 자폐증의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물 및 조성물은 AD, DS, ADD, ADHD 및 자폐증의 치료에 이롭게 사용될 수 있다. 이들 질환 또는 병태 모두는 사회적 기억을 비롯한 인식에서의 개선으로부터 잇점을 얻는다.

다섯번째로, 본 발명은 또한

a) 해당 β₁-ADR 작용제 화합물에 대한 향상된 clogP 값을 갖는 전구약물 화합물 1종 이상을 선택하며;

b) 단계 a)로부터 선택된 전구약물 화합물에 대해 일련의 ADME 테스트를 실시하고, 전구약물 화합물에 대한 SPR을 결정하고;

c) 단계 b)로부터의 전구약물 화합물 1종 이상을 선택하고, 상기 전구약물 화합물에 대해 생체내 체내분포 및 약물동력학 (PK) 평가를 실시하고;

d) 임상전 동물 모델 연구를 위하여 단계 c)로부터의 전구약물 화합물 1종 이상을 선택하고;

e) 치료 용도를 위한 추가의 개발을 위하여 단계 a)-d) 모두로부터 선택된 각각의 전구약물 화합물에 대한 TPP를 생성하는 것을 포함하는, 치료적 용도를 위하여 β₁-ADR 작용제 전구약물을 선택하는 방법을 제공한다.

β ₁ -ADR 전구약물의 합성

일반적으로, 본 발명의 β₁-ADR 전구약물은 0 이상, 바람직하게는 >1.0의 clogP 값을 갖는 것을 선택한다. 그러나, 전구약물은 예를 들면 >2.0 이상, 예컨대 3.0-5.0의 clogP 값을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 β₁-ADR 전구약물은 해당 β₁-ADR 모 또는 선두 화합물의 치환기 히드록실 기로부터 에스테르 화합물 및/또는 치환기 아민 기로부터 아미드 기를 형성하여 생성된다. 예를 들면 사모테롤의 에스테르 및/또는 아미드는 사모테롤의 히드록실 기를 에스테르화하여 형성되며, 사모테롤의 아미드는 사모테롤의 아민 기를 아미드화하여 형성된다. 공지된 화학적 반응은 해당 β₁-ADR 전구약물을 형성하기 위하여 β₁-ADR 화합물의 에스테르 및 아미드 둘다를 생성하는데 사용될 수 있다. 게다가, β₁-ADR 화합물에서의 히드록실 기 하나 이상은 에스테르화될 수 있으며 및/또는 β₁-ADR 화합물의 아민 기 하나 이상은 아미드화될 수 있다. 사모테롤은 예를 들면 2개의 유리 히드록실 기 및 2개의 내부 유리 아미노 기 (-NH-)를 갖는다. 일반적으로, 사모테롤의 말단 페닐 히드록시 기 또는 2급 히드록시 기 또는 둘다를 에스테르화시키는 것이 이롭다. 에스테르화의 가장 바람직한 방법은 아실화이다.

즉, 임의의 β₁-ADR 작용제 화합물의 경우, 그의 하나 이상의 유리 히드록실 기는 화학식 -O-(C=O)-R의 에스테르를 형성하여 유도체화된다.

전구약물의 제조를 위한 예시의 합성 개략도는 하기 제시된다:

<반응식 3>

주: 상기 반응식에서 화합물 7은 (S)-거울상이성질체, 즉 (S)-옥시란-2-일메틸-3-니트로벤젠술포네이트임

2,2- 디메틸옥탄산 (2a)

이소부티르산 (2.0 g, 22.7 mmol)을 LDA (7.6 ㎖)의 용액에 질소 대기 하에서 0℃에서 적가하였다. 용액을 15 분 동안 교반되도록 하였다. 1-요오도헥산 (4.8 g, 22.7 mmol)을 상기 용액에 상기 온도에서 적가하고, 생성된 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반되도록 하였다. 그 후, 반응 혼합물을 50 ㎖의 물로 처리하고, 3 N HCl을 사용하여 약 3의 pH로 조절하였다. 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트로 수회 추출하였다. 유기층이 분리되었으며, 건조시키고, 감압 하에서 증발시켜 2,2-디메틸옥탄산 (2.48 g, 63.4%)을 무색 오일로서 얻고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

2,2- 디메틸헥산산 (2b)

2,2-디메틸헥산산 (2a)은 상기 기재된 바와 같은 절차를 사용하여 (2 g, 13.87 mmol, 61%)을 무색 오일로서 얻었다.

4-( 벤질옥시 )페닐 2,2- 디메틸옥타노에이트 (5a)

디클로로메탄 (15 ㎖) 중의 2,2-디메틸옥탄산 2a (2.48 g, 14.4 mmol)의 용액에 옥살릴 클로라이드 (3.66 g, 28.8 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 생성된 용액을 질소 대기 하에서 2 시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 감압 하에 증발시켜 2,2-디메틸옥타노일 클로라이드 (3a)를 불안정한 중간체로서 얻고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 트리에틸아민 (2.91 g, 28.76 mmol)을 상기에서 얻은 2,2-디메틸옥타노일 클로라이드 (3a)의 용액에 적가한 후, 15 ㎖의 디클로로메탄 중의 4-(벤질옥시)페놀 4 (3.2 g, 15.98 mmol)의 용액으로 0℃에서 처리하였다. 수 방울의 디메틸포름아미드를 상기 용액에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을 15 시간 동안 실온에서 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 디클로로메탄으로 철저히 추출하였다. 유기 층을 물 (150 ㎖), 염수로 세정하고, 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (석유 에테르:에틸 아세테이트=10:1)를 사용하여 정제하여 4-(벤질옥시)페닐 2,2-디메틸옥타노에이트 5a (2.49 g, 49%)를 무색 오일로서 얻었다.

4-( 벤질옥시 )페닐 2,2- 디메틸헥사노에이트 (5b)

2.25 g의 4-(벤질옥시)페닐 2,2-디메틸헥사노에이트 (5b)는 5a에 대하여 상기 기재된 절차를 사용하여 생성하였다.

4- 히드록시페닐 2,2- 디메틸옥타노에이트 (6a)

4-(벤질옥시)페닐 2,2-디메틸옥타노에이트 5a (2.49 g, 7.02 mmol) 및 Pd/C (500 mg)을 THF (100 ㎖) 중에서 수소 하에 15 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트의 패드를 통하여 여과하였다. 여과액을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (석유 에테르:에틸 아세테이트=10:1)를 사용하여 정제하여 4-히드록시페닐 2,2-디메틸옥타노에이트 6a (1.86 g, 100%)를 백색 고체로서 얻었다.

4- 히드록시페닐 2,2- 디메틸헥사노에이트 (6b)

4-히드록시페닐 2,2-디메틸헥사노에이트 (6b) 3 g (12.7 mmol, 99%)은 4 g의 5b로부터 상기 기재된 절차를 사용하여 생성하고, 그 다음 단계에서와 같이 사용하였다.

(S)-4-( 옥시란 -2- 일메톡시 )페닐 2,2- 디메틸옥타노에이트 (8a)

디메틸포름아미드 (30 ㎖) 중의 4-히드록시페닐 2,2-디메틸옥타노에이트 6a (3.2 g, 12.1 mmol)의 용액에 NaH (0.32 g, 13.3 mmol)을 질소 대기 하에서 일부분씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, (S)-옥시란-2-일메틸 3-니트로벤젠술포네이트 7 (3.45 g, 13.3 mmol)를 상기 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15 시간 동안 교반되도록 한 후, 100 ㎖의 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 철저히 추출하였다. 유기 층을 물, 염수로 세정한 후, 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (석유 에테르:에틸 아세테이트=5:1)를 사용하여 정제하여 (S)-4-(옥시란-2-일메톡시)페닐 2,2-디메틸옥타노에이트 8a (3.04 g, 78%)를 무색 오일로서 얻었다.

(S)-4-( 옥시란 -2- 일메톡시 )페닐 2,2- 디메틸헥사노에이트 (8b)

(S)-4-(옥시란-2-일메톡시)페닐 2,2-디메틸헥사노에이트 (8b) 2 g (6.84 mmol, 54%)은 3 g의 6b로부터 상기 기재된 절차를 사용하여 백색 고체로서 생성하였다.

(S)- 사모테롤의 2,2- 디메틸옥타노에이트 에스테르 (10a)

(S)-4-(옥시란-2-일메톡시)페닐-2,2-디메틸옥타노에이트 8a (3.07 g, 9.6 mmol) 및 N-(2-아미노에틸)모르폴린-4-카르복스아미드 9 (4.98 g, 28.8 mmol)를 이소프로필 알콜 (100 ㎖) 중에서 50℃에서 15 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (100 ㎖)으로 희석하고, 물 (100 ㎖)로 세정하였다. 유기 층을 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (석유 에테르:에틸 아세테이트=10:1)를 사용하여 정제하여 (S)-사모테롤의 2,2-디메틸옥타노에이트 에스테르 10a (2.1 g, 44%)를 무색 오일로서 얻었다. ¹H NMR은 구조와 일치하였다.

에탄올 (15 ㎖) 중의 푸마르산 (0.18 g, 1.52 mmol)을 에탄올 (15 ㎖) 중의 10a (1.5 g, 3.04 mmol)의 교반된 용액에 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 5 시간 동안 교반되도록 하였다. 혼합물을 감압 하에서 여과하였다. 침전물을 에탄올 (10 ㎖)로 세정하고, 감압 하에 건조시켰다. 잔류물을 증류수 (10 ㎖) 중에 용해시키고, 진공 하에서 -78℃에서 건조시켜 에탄올 잔류물을 제거하였다. 10a의 헤미푸마레이트 염 (1.08 g, 64%)을 백색 고체로서 얻었다.

(S)- 사모테롤의 2,2- 디메틸헥사노에이트 에스테르 (10b)

상기 화합물 10b는 10a에 대하여 상기 기재된 절차에 따라 생성하고, 헤미푸마레이트 염으로 전환시켜 0.995 g (1.90 mmol, 28%)의 원하는 생성물을 얻었다.

추가로, 아민에 대한 가수분해-분해 가능한 카르바메이트 유도체는 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제5,466,811호 및 제7,988,956호에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 구체적으로, 미국 특허 제5,466,811호에는 1급 및 2급 아민 모두로부터 생체가역적 중성 전구약물을 생성하기 위한 옥소디옥솔레닐메틸 카르바메이트의 용도가 개시되어 있다.

일반적으로, β₁-ADR 작용제 화합물의 히드록실 및/또는 아민 기 중 어느 하나 또는 둘다의 임의의 유도체화는 생성된 전구약물의 clogP 값이 0 초과, 바람직하게는 1.0 초과, 가장 바람직하게는 2.0 초과이라면 허용 가능하다. 그러나, 상기 언급한 바와 같이, 아실화된 말단 페닐 히드록실 기를 갖는 사모테롤 전구약물을 사용하는 것이 특히 이롭다. 상기 화합물은 도 17의 아래쪽 구조식으로 제시한 화학식을 갖는다.

추가로, R₁-(C=O)-O- 기의 R₁ 모이어티 및/또는 R₂-(C=O)-O- 기의 R₂ 모이어티 (도 17에서의 위치로 제시한 바와 같음) 각각은 치환되지 않거나 또는 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 할로, 바람직하게는 플루오로로 임의로 치환될 수 있는 선형, 분지형 또는 환형 기일 수 있는 5 내지 30개의 탄소 원자의 친유성 기이다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "저급"은 C₁-C₆을 의미한다. 그러나, 환형 화합물은 또한 5 내지 30개의 탄소 원자의 친유성 기, 예컨대 도 19 (위쪽 도면)에 도시한 바와 같은 임의로 치환될 수 있는 페닐 고리 또는 도 19 (아래쪽 도면)에 도시한 바와 같은 헤테로환 고리에 포함될 수 있다. 아실 기의 1급 또는 주요한 쇄의 R₁ 및/또는 R₂ 모이어티는 8, 9 또는 10 내지 30개의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 1급 또는 주요 탄소 원자의 개수의 범위는 탄소 원자의 임의의 측쇄를 포함하지 않는다. 용어 "1급 또는 주요한 쇄" 대 "측쇄"는 본원에서 표준 IUPAC 명명법에 의하여 결정된다. 그래서, 예를 들면 2-메틸 펜탄에서, 1급 또는 주요한 쇄는 펜탄 (C₅)이며, 측쇄는 메틸 (C₁)이 된다.

R₁ 및/또는 R₂ 모이어티의 환형 화합물은 일반적으로 헤테로원자를 함유하지 않거나 또는 1 또는 2개의 헤테로원자, 예컨대 -O- 또는 -N-를 갖는 5- 또는 6-원 고리일 수 있다. 추가로, 헤테로원자를 함유하지 않는 고리는 포화 또는 불포화 및 심지어 방향족일 수 있다. 헤테로원자는 또한 -O- 또는 -N-일 수 있다. 예시의 고리계는 예를 들면 비치환되거나 또는 1-4개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록실 또는 할로 기, 특히 플루오로에 의하여 임의로 치환된 피롤, 푸란, 이미다졸린, 이미다졸, 피라졸리딘, 피라졸, 피리딘 또는 피란을 포함한다. 상기 모든 화합물은 원하는 해당 아실화된 사모테롤 전구약물을 생성하기 위하여 적절한 아실화 화합물을 사용하여 상기 반응식 1 및 2를 참조하여 말단 페닐 히드록시 기의 아실화를 포함하는 공지된 절차에 의하여 합성될 수 있다.

상기 반응식 3을 참조하여 임의의 친유성 아실 기는 화합물 2>화합물 3>화합물 5>화합물 6>화합물 8 및 마지막으로 화합물 10과 유사한 반응을 사용하여 사모테롤에 부착될 수 있다는 것을 알 수 있다. 즉, 반응식 3은 일반적으로 X-OH>R-(C=O)-O-X를 전환시키는데 사용될 수 있으며, 여기서 X는 사모테롤이며, R은 친유성 기이다.

주: 상기 단순화된 반응에서, 구체적인 R₁ 및/또는 R₂보다는 통칭 R이 사용되지만, 타당하게 제시된 기전은 둘다를 나타낸다.

일반적으로 에스테르화시키는 공지의 에스테르화 반응 및 사모테롤의 아실레이트, 구체적으로 2급 히드록시 기는 예를 들면 도 17에 도시된 기 R₂-(C=O)-O-를 형성하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참조로 그 전문이 포함되는 미국 특허 제3,278,585호 및 제8,669,311호를 참조한다.

유사하게, 반응식 1, 2 및 3에서 상기 기재된 반응은 기타 β₁-ADR 작용제의 전구약물을 생성하는데 사용될 수 있다.

R 기가 R-(C=O)-O-X로서 사모테롤 분자에 직접 부착되어 있는 반응식 3에서의 화학식 10에 해당하는 친유성 R 기의 구체적인 예는 하기와 같다:

R은 C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇, C₁₈, C₁₉, C₂₀, C₂₁, C₂₂, C₂₃, C₂₄, C₂₅, C₂₆, C₂₇, C₂₈, C₂₉ 또는 C₃₀인 치환되지 않거나 또는 임의로 치환된 선형 또는 분지형 알킬일 수 있거나 또는 각각의 이들 동일한 C₅-C₃₀ 알킬 기는 치환되지 않거나 또는 임의로 치환된 분지형 또는 환형 기, 예컨대 시클로펜틸 또는 시클로헥실 또는, 선형, 분지형 또는 환형 기의 조합일 수 있다. 추가로, 이들 선형, 분지형 또는 환형 기는 사모테롤 분자를 고리계, 예컨대 페닐 또는 피라닐과 연결시키는 1급 또는 주요한 쇄에서 하나 이상의 개재하는 -O- 또는 -N- 기를 가질 수 있다.

추가로, 도 17 및 18에 예시된 바와 같은 R₁ 및 R₂ 기 둘다를 갖는 화합물은 구체적으로 R₁ 및 R₂ 둘다에 대한 고리-함유 치환기, 예컨대 벤조에이트 에스테르 또는 피라닐 에스테르를 포함하는 것을 고려하며, 예를 들면 그의 고리가 비치환이거나 또는 1 내지 5개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시 또는 할로 기에 의하여 치환될 수 있다.

추가로, 기 R₁ 및/또는 R₂는 임의의 헤테로원자 및 고리 사이의 간헐적인 연결 시퀀스를 함유할 수 있다. 예를 들면 R₁ 및/또는 R₂는 각각 예를 들면 페닐알라닐-옥소-(CH₂)_m-(C=O)-O-, 피라닐-(CH₂)_m-(C=O)-O-일 수 있으며, 여기서 m은 1-20개의 탄소 원자, 바람직하게는 1-10개의 탄소 원자이다. 이러한 경우에서, 기 -(CH₂)-는 "링커"이다.

게다가, 기 R₁ 및/또는 R₂에서의 아미노산을 함유하는 화합물이 구체적으로 고려된다. 예를 들면 도 19의 위쪽의 화합물은 옥시에틸카르보닐 기에 의하여 사모테롤의 말단 페닐 히드록시 기에 가교된 페닐알라닐 기를 포함한다. 임의의 아미노산, 바람직하게는 L-아미노산은 상기 화합물에서 페닐-알라닌 대신에 사용될 수 있다. 아미노산, 예컨대 알라닌, 아스파르트산, 이소류신, 트레오닌 및 발린을 예로서 들 수 있다.

본 발명의 모든 전구약물 화합물은 상기 반응식 1, 2 또는 3을 참조하며, 필요한 임의의 변경이 이들 반응식과 유사하게 요구될 수 있다. 추가로, 요구되는 임의의 변경은 공지된 반응을 사용하여 실시될 수 있다.

사용된 β ₁ -ADR 전구약물 화합물의 양의 범위

일반적으로, AD, DS 또는 자폐증을 치료하기 위하여, 하나 이상의 β₁-ADR 전구약물 화합물은 임상적 용도를 위하여 인간 또는 임상전 테스트 또는 약물 스크리닝을 위하여 동물의 체중 1 ㎏당 약 1 내지 20 ㎎의 양으로 투여된다. 보다 바람직하게는 인간 및 동물 모두에 대하여 체중 1 ㎏당 약 2 내지 10 ㎎을 투여한다. 게다가, 인간의 경우 주치의, 동물의 경우 실험실 과학자 또는 수의사의 재량에 따라 투여는 복수회일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약"은 ±25%를 의미한다. 그래서, "약 1"은 0.75 내지 1.25를 의미한다.

상기 언급한 바와 같이, β₁-ADR 전구약물은 멸균 염수 또는 덱스트로스-5%-염수 (D5S)의 약학적으로 허용되는 용액 중의 용액의 형태로 정맥내 또는 피하 투여된다. 그러나, 매우 향상된 친유성, 즉 불량한 수용해도의 β₁-ADR 전구약물의 경우, 각종 공지의 현탁액을 사용할 수 있다. 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제5,679,138호를 참조한다. 투여의 기타 방식, 예컨대 경구 또는 비강내를 사용할 수 있다. 경구 투여는 현탁액, 정제 또는 캡슐로 실시될 수 있다. 비강내 투여는 건조 분말 흡입기, 미스트 흡입기를 사용하거나 또는 공지의 방법론을 사용한 액적 또는 면봉에 의하여 실시될 수 있다.

개선된 인식 및 사회적 기억에 대한 테스트

AD, DS, ADD, ADHD 및 자폐증을 갖는 인간에서의 개선된 인식 및 사회적 기억에 대한 테스트는 관찰을 비롯한 공지의 진단 방법론을 사용하여 실시한다. 마우스에 대한 테스트는 예를 들면 상기 기재된 바와 같은 공지의 테스트를 사용하여 실시할 수 있다.

AD를 갖는 인간의 경우, 폴스테인(Folstein) 테스트 (또는 간이 정신상태 검사로서 공지됨)를 사용하여 테스트를 실시할 수 있다. 이러한 테스트는 정신적 손상에 대하여 스크리닝하는 설문지를 사용하며, 심리 평가 재원(Psychological Assessment Resources)이 발행한다. 테스트한 카테고리는 예를 들면 시간 및 장소의 방향, 주의력 및 계산, 연상, 언어 인지, 반복 및 복잡한 명령에 복종하는 능력을 포함한다. 테스트한 개인은 각각의 카테고리에 대하여 포인트의 최대한 가능한개수로부터 각각의 카테고리에 제시된 포인트에 의하여 평가한다.

DS를 갖는 인간의 경우, 테스트는 일반적으로 아리조나 인식 테스트 시험(Arizona Cognitive Test Battery)을 사용하여 실시하였다. 문헌[J. Neurodev . Disorder 2010 Sep. 1; 2 (3): 149-164]을 참조한다.

자폐 스펙트럼 장애를 갖는 인간의 경우, 테스트는 사회적 인식 기술 테스트(Social Cognitive Skills Test)를 사용하여 실시하였다. 문헌[J. Intell . Disability 2008 March; 12(1):49-57]을 참조한다. 본 발명의 화합물 및 조성물이 자폐 스펙트럼 장애의 전 범위를 나타내는 개체를 치료하는데 이롭게 사용될 수 있다는 것은 본원에서 명백하게 인지된다.

합성예

본원에 그 전문이 참조로 포함된 미국 특허 제4,143,140호로부터 사모테롤 푸마레이트의 제조

이소프로판올 (6 ㎖) 중의 1-p-벤질옥시펜옥시-2,3-에폭시프로판 (11.5 g)의 현탁액을 4-(N-β-아미노에틸카르바모일) 모르폴린 수소 술페이트 (12.7 g), 수산화칼륨 (7.0 g) 및 이소프로판올 (10 ㎖)의 교반된 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 45℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 감압 하에서 무수 상태로 증발시켰다. 잔류 오일을 물과 함께 교반하고, 혼합물을 여과하고, 고체 잔류물을 아세톤 중에 용해시켰다. 혼합물의 pH가 2 미만이 될 때까지 프로판올 중의 염화수소의 30% 용액을 첨가하고, 혼합물을 여과하였다. 고체 잔류물을 물로부터 결정화시켜 1-p-벤질옥시펜옥시-3-(β-모르폴리노카르본아미도에틸)아미노-2-프로판올 히드로클로라이드 (4.9 g)를 얻었다.

에탄올 (20 ㎖) 및 아세트산 (20 ㎖)의 혼합물 중의 상기 화합물의 용액을 30% 탄소상 팔라듐 촉매 (0.1 g)와 함께 수소 대기 하에서 실험실 온도 및 압력에서 250 ㎖의 수소가 흡수될 때까지 진탕시켰다. 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압 하에서 무수 상태로 증발시키고, 잔류물에 에탄올 (15 ㎖) 중의 푸마르산 (1.25 g)의 고온 용액을 첨가하였다. 혼합물을 5℃에서 12 시간 동안 유지한 후, 여과하고, 고체 잔류물을 고온 에탄올로 세정한 후, 건조시켰다. 그리하여 1-p-히드록시펜옥시-3-β-(모르폴리노카르본아미도)에틸-아미노-2-프로판올 수소 푸마레이트를 얻었다. m.p. 168-169℃ (분해 포함).

출발 물질로서 사용된 4-(N-β-아미노에틸카르바모일)모르폴린 수소 술페이트는 하기와 같이 얻을 수 있다:

모르폴린 (4.35 g) 및 페닐 클로로포르메이트 (6.35 g)를 0℃에서 유지된 톨루엔 (10 ㎖), 물 (5 ㎖) 및 수산화나트륨 (2 g)의 교반된 혼합물에 20 분 동안 별도로 및 동시에 적가하였다. 온도를 20℃로 승온되도록 하면서 혼합물을 추가의 2 시간 동안 교반하였다. 톨루엔 용액을 분리하고, 수성 용액을 톨루엔으로 2회 추출하고, 합한 톨루엔 용액을 물로 세정하고, 건조시키고, 감압 하에서 무수 상태로 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르 (b.p. 60-80℃)로부터 결정화시키고, N-펜옥시카르보닐모르폴린을 얻었다. m.p. 46.5-47.5℃. 상기 화합물 (11 g) 및 에틸렌디아민 (27.8 g)의 혼합물을 실험실 온도에서 3 일 동안 교반하고, 과잉의 에틸렌디아민을 감압하에서 증발에 의하여 제거하였다. 잔류물을 메탄올 중에 용해시키고, 용액을 5℃로 냉각시키고, 용액의 pH가 2가 될 때까지 진한 황산을 첨가하였다. 필터-보조물 (셀라이트, 10 g)을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 무수 상태로 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 함께 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고체 잔류물로서 4-(N-β-아미노에틸카르바모일)모르폴린 수소 술페이트를 얻었다. m.p. 168-169℃. 상기 제조에서, 임의의 유기 또는 무기 산을 푸마르산 대신에 화학량론적 방식으로 사용하여 사모테롤의 해당 염을 생성할 수 있다.

본 발명을 기재하였으나, 다수의 통상의 변경예 및 변형예는 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남이 없이 상기 기재된 실시양태로 이루어질 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

Claims

생체내 가수분해성이어서 해당 β₁-ADR 작용제 화합물을 방출하며, 해당 β₁-ADR 작용제 화합물에 대한 전구약물 화합물에 더 큰 친유성 및 CNS 생체이용률을 부여하는 하나 이상의 기를 포함하는, β₁-ADR 작용제 전구약물 화합물.
제1항에 있어서, cAMP 경로를 β-아레스틴 경로보다 더 많이 자극하는 전구약물 화합물.
제1항에 있어서, cAMP 신호 캐스케이드를 10^-4 내지 10^-10 M 범위내의 동일한 농도에서 β-아레스틴 경로보다 50% 이상 더 많이 자극하는 전구약물 화합물.
제1항에 있어서, β-아레스틴을 cAMP 신호 경로의 수준의 20% 이하의 수준에서 자극하는 전구약물 화합물.
제1항에 있어서, clogP 값 > +1.0을 갖는 전구약물 화합물.
제5항에 있어서, β₁-ADR 작용제 화합물보다 +1.50 이상 더 큰 clogP 값을 갖는 전구약물 화합물.
제5항에 있어서, 사모테롤 전구약물인 전구약물 화합물.
제7항에 있어서, 라세메이트 화합물인 전구약물 화합물.
제7항에 있어서, (S)-화합물인 전구약물 화합물.
제7항에 있어서, (R)-화합물인 전구약물 화합물.
제1항에 있어서, 하류 CREB 경로를 더 활성화시키는 전구약물 화합물.
제7항에 있어서, 사모테롤 전구약물이 아실, 카르바메이트 또는 옥소아졸리디닐 기에 결합된 말단 페닐 히드록실 기 및/또는 2급 히드록시 기를 갖는 사모테롤을 포함하며, 아실, 카르바메이트 또는 옥소아졸리디닐 기가 생체내 가수분해성인 전구약물 화합물.
제12항에 있어서, 사모테롤 전구약물이 기 R₁-(C=O)-O- 및/또는 R₂-(C=O)-O-에 의하여 각각 아실화되는 말단 페닐 히드록실 및/또는 그의 2급 히드록시 기를 갖는 아실화된 사모테롤이며, 여기서 R₁ 및 R₂가 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 각각 선형, 분지형 또는 환형 또는 그의 조합이며, 비치환되거나 또는 1 내지 4 개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시, 아미노, 카르복시 또는 할로 기에 의하여 임의로 치환된, 5 내지 30 개의 탄소 원자의 친유성 기이며, 환형 기는 0, 1 또는 2 개의 헤테로원자를 함유하는 5- 또는 6-원 고리이며, 상기 헤테로원자는 -O- 또는 -N- 또는 둘다이며, 상기 환형 기는 포화 또는 불포화인 전구약물.
제13항에 있어서, R₁ 및/또는 R₂에서의 상기 환형 고리가 피롤, 푸란, 이미다졸리딘, 이미다졸, 피라졸, 피리딘 또는 피란을 포함하며, 이들 각각이 비치환되거나 또는 임의로 치환되는 전구약물.
제13항에 있어서, R₁ 및/또는 R₂가 아미노산 라디칼을 함유하는 전구약물.
제13항에 있어서, 상기 할로가 플루오로인 전구약물.
사회적 기억을 비롯한 인식을 개선시키기에 유효한 양으로 제1항의 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 DS의 치료 방법.
제15항에 있어서, 상기 β₁-ADR 작용제 전구약물이 사모테롤 전구약물인 치료 방법.
제17항에 있어서, 투여가 피하 주사에 의한 것인 치료 방법.
사회적 기억을 비롯한 인식을 개선시키는데 유효한 양으로 제1항의 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 AD의 치료 방법.
제17항에 있어서, β₁-ADR 작용제 전구약물이 사모테롤 전구약물인 치료 방법.
제20항에 있어서, 투여가 피하 주사에 의한 것인 치료 방법.
인식을 개선시키고 과다활동을 감소시키기에 유효한 양으로 제1항의 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 ADD 또는 ADHD의 치료 방법.
제19항에 있어서, β₁-ADR 작용제 전구약물이 사모테롤 전구약물인 치료 방법.
제23항에 있어서, 투여가 피하 주사에 의한 것인 치료 방법.
사회적 기억을 비롯한 인식을 개선시키기에 유효한 양으로 제1항의 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 자폐증의 치료 방법.
제21항에 있어서, 상기 β₁-ADR 작용제 전구약물이 사모테롤 전구약물인 치료 방법.
제26항에 있어서, 투여가 피하 주사에 의한 것인 치료 방법.
a) 해당 β₁-ADR 작용제 화합물에 대하여 향상된 clogP 값을 갖는 전구약물 화합물 1종 이상을 선택하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 선택된 전구약물 화합물에 대해 일련의 ADME 테스트를 실시하고, 전구약물 화합물에 대한 SPR 값을 결정하는 단계;
c) 단계 b)로부터의 전구약물 화합물 1종 이상을 선택하고, 상기 전구약물 화합물에 대해 생체내 체내분포 및 약물동력학 평가를 실시하는 단계;
d) 임상전 동물 모델 연구를 위하여 단계 c)로부터의 전구약물 화합물 1종 이상을 선택하는 단계; 및
e) 추가의 개발 및 치료적 용도를 위하여 단계 a)-d) 모두에서 선택된 각각의 화합물에 대한 TPP를 생성하는 단계
를 포함하는, 치료적 용도를 위하여 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상을 선택하는 방법.
제29항에 있어서, 선택된 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상이 사모테롤 전구약물인 치료 방법.
제1항의 β₁-ADR 작용제 전구약물 1종 이상 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제31항에 있어서, 수계 용액의 형태인 약학적 조성물.
제31항에 있어서, 현탁액 형태인 약학적 조성물.
제31항에 있어서, β₁-ADR 작용제 전구약물이 사모테롤 전구약물인 약학적 조성물.
제34항에 있어서, 사모테롤 전구약물이 (R)-거울상이성질체 전구약물인 약학적 조성물.
제34항에 있어서, 사모테롤 전구약물이 (S)-거울상이성질체 전구약물인 약학적 조성물.