KR20170011542A - 스테롤 당전이 효소를 이용한 스테롤 글루코사이드의 제조방법 - Google Patents

스테롤 당전이 효소를 이용한 스테롤 글루코사이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스테롤 당전이 효소 및 이를 이용한 스테롤 글루코사이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로모노스포라 로도랑지아(Micromonospora rhodorangea) 방선균 유래의 스테롤 당전이 효소를 이용한 푸코스테롤 글루코사이드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이크로모노스포라 로도랑지아(Micromonospora rhodorangea) 방선균 유래의 스테롤 당전이 효소가 대장균 내에 발현된 신규한 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)을 이용하여 효소적 생합성된 스테롤 글루코사이드는 항산화, 항암 및 당뇨합병증 관련 HRAR과 PTP1B 효소 활성 억제 효과를 나타내므로, 암 또는 당뇨합병증 관련 질환의 예방 또는 치료 목적의 의약품 및 건강기능식품으로 유용하다.

Description

스테롤 당전이 효소를 이용한 스테롤 글루코사이드의 제조방법 {Method for Preparing Sterol Glucosides Using Sterol Glucosyltransferase}
본 발명은 스테롤 당전이 효소 및 이를 이용한 스테롤 글루코사이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로모노스포라 로도랑지아(Micromonospora rhodorangea) 방선균 유래의 스테롤 당전이 효소를 이용한 푸코스테롤 글루코사이드의 제조방법에 관한 것이다.
식물 유래 피토스테롤(phytosterol)은 식물 세포막의 필수 구성성분으로 동물에서 생합성 되는 콜레스테롤(cholesterol)과 구조적으로 비슷하며, 최근에 다양한 생물학적 활성이 보고되어 건강기능식품, 화장품 및 제약 산업에서 주목받고 있다. 대표적인 피토스테롤로는 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol) 및 스티그마스테롤(stigmasterol)등이 있으며, 식물유나 식물성 기름 등에 다수 함유되어있다(Ostlund et al., Annu . Rev. Nutr . 22:533-549, 2002). 1950년대 이후 피토스테롤의 콜레스테롤 저하 효과, 혈관신생 효과 등에 대한 보고와 연구가 진행되고 있으나, 체내 콜레스테롤 농도와 밀접한 협심증, 심근경색 및 뇌혈관 질환 등의 심혈관 질환에 대한 효과 및 그 기작은 과학적으로 실증된 바가 없다(Weingartner et al., Eur . Heart J. 30(4):404-409, 2009).
피토스테롤의 구조적 변형을 통한 약리적 활성 증대 및 의약 후보물질로의 개발은 개량신약 뿐만 아니라 건강기능식품 개발의 주요 기술로서 인식되고 있으며, 그 중 하나는 그 화학구조 내 수산기(hydroxy function)에 당 분자를 전이시킬 수 있는 스테롤 당전이 효소(sterol glycosyltransferase; 이하 SGT)를 이용한 효소적 제조방법이 있다. 이와 같은 특정 화합물의 당전이화는 원래 물질에 비하여 그 용해도 및 생체 적용시 흡수성을 보다 높여줄 수 있어서, 건강기능식품 및 의약품의 제형 개량, 신규 제형 개발 및 프로드럭(prodrug)화에 도움을 줄 수 있다.
스테롤 당전이 효소인 SGT는 CAZY(Carbohydrate Active enZYmes) 데이타베이스 내 94종의 당전이 효소들 중에서 제1종(family 1)으로 구분되어 있으며, 단백질 서열상 C-말단(terminal)에 특이 모티프(motif)로서 핵산당 당 공여체(sugar donor)와의 결합부위로 인식되는 부위를 포함하고 있다(http://www.cazy.org/). 현재까지 그 기능이 규명된 SGT 암호화 유전자들의 경우 대부분이 식물 유래이고(Madina et al., Biochim . Biophys . Acta . 1774:392-402, 2007; Warnecke et al., Plant Molecular Biol . 35:597-603, 1997; Potocka et al., Acta Biochim . Polonica 55:127-134, 2008; Debolt et al., Plant Physiol . 151:78-87, 2009), 스테롤 당전이 효소 반응을 통하여 생합성되는 당부가 스테롤(sterol glucoside; 이하 SG)은 식물 외에도 미생물과 일부 동물에 두루 편재되어 있다. 이러한 당부가 스테롤은 트리테르페노이드(triterpenoid), 스테롤성 알칼로이드(steroidal alkaloids) 등을 포함하고 있으며, 대다수가 스테로이드 구조 내 3번 탄소에 위치한 수산기에 당이 결합한 구조이다. 상술한 기능이 밝혀진 SGT들 중에서 가지(Solanum melongena)에서 부분적으로 정제된 SGT(SmSGT)의 경우, 세포막에 존재(membrane-associated)하며 안드로스탄(androstane), 프레그난(pregnane), 콜레스탄(cholestane) 등의 피토스테롤 및 스테롤성 알칼로이드, 트리테르페노이드 알코올을 기질로 하여 당화 작용을 하는 것으로 보고되어 있다(Potocka et al., Acta Biochim. Polonica 55:127-134, 2008; Potocka et al., Acta Biochim . Polonica 55:135-140, 2008). 한편, 인삼(Panax ginseng)유래 SGT(PgSGT)와 2종의 인디안 원터 체리 유래 SGT(WsSGT)들 또한 그 기능이 밝혀져 있고 세포막이 아닌 세포 내(cytosolic) 존재하는 것으로 보고되어 있다(Madina et al., Biochim . Biophys . Acta . 1774:392-402, 2007; Yue et al., Process Biochem . 40:3742-3748, 2005; Sharma et al., Arch. Biochem . Biophys . 460:48-55, 2007).
피토스테롤 중 하나로 해양 유래 갈조류(brown algae)의 주요 스테롤(83-97%)로 알려진 푸코스테롤(fucosterol)은 항산화, 간장독성보호(hepatoprotective), 항염증(anti-inflammatory), 항암, 항진균(anti-fungal), 항당뇨(anti-diabetic), 항히스타민(anti-histamic) 및 항콜린(anti-cholinergic)과 같은 다양한 생리 활성(Lee et al., Arch. Pharm . Res. 26:719-722, 2003; Yoo, et al., Food Chem . 135:967-975, 2012; Khanavi et al., Pharmacogn . Mag. 8:60-64, 2012; Atta-ur-Rahman et al., J. Nat. Prod. 60:472-474, 1997; Lee et al., Arch. Pharm . Res. 27:1120-1122, 2004; Kumar et al. Pharmacologyonline 1:1104-1112, 2009) 및 콜레스테롤의 위장관 흡수 저해효과와 내피세포 내 글루코콜티코이드 수용체에 작용하여 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme) 활성을 약화시키는 약리적 효과가 보고되고 있다(Vahouny et al., Am. J. Clin. Nutr. 37:805-809, 1983; Hagiwara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 139:348-352, 1986). 이러한 푸코스테롤의 당화와 관련하여 나이지리아산 식물인 레몬그래스(Cymbopogon citratus)의 중화된 유기용매 추출물에서 처음으로 푸코스테롤 글루코사이드(fucosterol glucoside)로 예측되는 SG가 보고되었으며(Atopkina et al., Khimiya Prirodnykh Soedinenii 5:656-657, 1982), 푸코스테롤을 전구체로 하여 반합성법으로 푸코스테롤 글루코사이드가 유기 합성된 바 있다(Olaniyi et al., Planta Medica 28(2):186-189, 1975). 하지만, 효소적 반응을 통한 푸코스테롤 당부가 화합물의 제조는 현재까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 당이 부가되지 않은 스테롤 대비 생리활성 및 제형적 특성이 현저히 향상된 스테롤 글루코사이드를 제조하고자 예의 노력한 결과, 푸코스테롤을 기질로 하여 당전이 반응을 가능케 하는 신규 스테롤 당전이 효소를 발견하여 효소적 반응을 통해 제조한 푸코스테롤 글루코사이드의 항암 및 항당뇨합병증 등의 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 스테롤 당전이 효소(MrSGT1), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 스테롤 당전이 효소의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)를 이용한 스테롤 글루코사이드의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 미생물을 배양하여 스테롤 당전이 효소의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 스테롤 당전이 효소(MrSGT1) 존재하에 스테롤 및 당 공여체를 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드를 합성시키는 단계; 및 (b) 상기 합성된 스테롤 글루코사이드를 회수하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, R1은 CHCH3, CH3 또는 H이고, R2 및 R3는 각각 H2 또는 H이고, R4는 글루코스이다.
본 발명에 따른 마이크로모노스포라 로도랑지아(Micromonospora rhodorangea) 방선균 유래의 스테롤 당전이 효소가 대장균 내에 발현된 신규한 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)을 이용하여 효소적 생합성된 스테롤 글루코사이드는 항산화, 항암 및 당뇨합병증 관련 HRAR과 PTP1B 효소 활성 억제 효과를 나타내므로, 암 또는 당뇨합병증 관련 질환의 예방 또는 치료 목적의 의약품 및 건강기능식품으로 유용하다.
도 1은 스테롤 당전이효소 MrSGT1의 효소 반응에 대한 모식도이다.
도 2는 당전이 효소반응을 통한 푸코스테롤 글루코사이드 화합물의 고압 액체 크로마토그래피-전자분무이온화-질량분석기 (HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry) 기기 분석 결과를 나타낸 크로마토그램이다(A: 열처리로 불활성화된 재조합 당전이 효소 MrSGT1, 기질 푸코스테롤 및 UDP-Glc의 반응 후 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출액; B: 재조합 당전이 효소 MrSGT1, 기질 푸코스테롤 및 UDP-Glc의 반응 후 에틸아세테이드 추출액).
도 3은 푸코스테롤 글루코사이드 화합물과 푸코스테롤, 양성 대조구인 아스코르브산의 항산화 활성을 비교한 그래프이다.
도 4는 푸코스테롤 글루코사이드 화합물, 푸코스테롤 및 양성 대조구인 시스플라틴(cisplatin) 화학요법제의 유방암 또는 결장암 암세포주에 대한 항암 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 푸코스테롤 글루코사이드 화합물, 푸코스테롤 및 양성 대조구인 퀘르세틴(quercetin) 혹은 울소르산(ursolic acid)의 인간 재조합 알도스 환원효소(HRAR) 및 타이로신 포스파타아제 1B(PTP1B)에 대한 활성 억제를 확인하여, 당뇨합병증 관련 효과를 비교한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 마이크로모노스포라 로도랑지아 균주의 유전체(genome)로부터 SGT 암호화 유전자를 분리하고, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 대장균을 제작한 다음, 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)를 제조하였다. 이후, 상기 재조합 당전이 효소에 푸코스테롤을 당 수용체로 그리고 핵산당인 우리딘 이인산 글루코스(uridine diphosphate glucose; 이하 UDP-Glc)를 당 공여체로 반응시켜 푸코스테롤 글루코사이드를 생합성하였다. 그 다음, 질량분석기(mass spectrometry)와 핵자기 공명 스펙트로미트리(nuclear magnetic resornance spectrometry) 기기분석을 통하여 그 구조를 확인하고, 인간 유관 유방암(breast ductal carcinoma; 이하 T47D), 결장암(colon carcinoma; 이하 HT29) 등의 일부 암세포주들을 대상으로 항암 활성을 그리고 당뇨/당뇨합병증 관련하여 인간 재조합 알도스 환원효소(human recombinant aldose reductase; 이하 HRAR)와 PTP1B 효소활성 억제와 같은 당뇨합병증 억제 활성을 확인함으로써, 피토스테롤 계열 저분자 화합물에 당이 효소적으로 부가된 푸코스테롤 글루코사이드 화합물을 생합성 제조하였다.
따라서, 본 발명은 제1관점에서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)에 관한 것이다.
본 발명은 제2관점에서, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 마이크로모노스포라 로도랑지아(Micromonospora rhodorangea) 균주 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 제3관점에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 제4관점에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 제5관점에서, 상기 미생물을 배양하여 스테롤 당전이 효소의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)의 제조방법을 제공한다.
본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)" 된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명은 제6관점에서, (a) 상기 스테롤 당전이 효소(MrSGT1) 존재하에 스테롤 및 당 공여체를 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드를 합성시키는 단계; 및 (b) 상기 합성된 스테롤 글루코사이드를 회수하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서, R1은 CHCH3, CH3 또는 H이고, R2 및 R3는 각각 H2 또는 H이고, R4는 글루코스이다.
본 발명에 있어서, 상기 스테롤은 푸코스테롤(fucosterol), 캄페스테롤(campesterol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 당 공여체는 UDP-글루코스(Glc), UDP-갈락토스(Gal) 또는 TDP-2'-디옥시글루코스(deoxy-Glc)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 부가되는 당의 종류로는 단당(mono-saccharide)의 경우에는 글루코스, 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 알로스(allose), 알트로스(altrose), 이도스(idose), 탈로스(talose), 프럭토스(fructose), 아라비노스(arabonose) 또는 자일로스(xylose)일 수 있으며, 그리고 아미노당으로는 N-아세틸-갈락토사민(N-acetyl-galactosamine), N-아세틸-글루코사민(N-acetyl-glucosamine), N-아세틸-뉴라미닉산(N-acetyl-neuraminic acid), 글루코사민(glucosamine) 또는 갈락토사민(galactosamine)일 수 있고, 이당(di-saccharide)의 경우에는 수크로스(sucrose), 셀로비오스(cellobiose), 말토스(maltose), 락토스(lactose), 트레할로스(trehalose), 겐티오비오스(gentiobiose) 또는 멜리비오스(melibiose)일 수 있으며, 삼당(tri-saccharide)의 경우엔 라피노스(raffinose) 또는 겐티아노스(gentianose)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드는 푸코스테롤-3-O-β-글루코사이드, 캄페스테롤-3-O-β-글루코사이드 및 콜레스테롤-3-O-β-글루코사이드, 베타-시토스테롤-3-O-β-글루코사이드, 스티그마스테롤-3-O-β-글루코사이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 역상 C18 고정상, 메탄올:아세토나이트릴:물:포름산 45:40:14.8:0.2(v/v/v/v) 혼합액 이동상 및 14-15분 유지시간(Retention time) 조건의 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC)를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 황산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 화학식 1의 화합물이 결정 형태로 제조될 경우, 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 암 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 암 질환 및 당뇨합병증 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 항산화 활성을 나타내고, 유방암과 결장암 관련 암세포주에 대하여 항암 활성, 나아가 당뇨합병증 관련 항당뇨 활성을 나타내어, 관련 암 질환 혹은 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 표준 약학적 실시에 따라 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석액 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 적어도 하나 이상 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여시에 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 캅셀제, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등의 제형일 수 있는데, 이들 제형은 유효성분 외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산의 마그네슘염, 스테아르산의 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제형으로는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의할 수 있다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 적어도 하나 이상 포함하고, 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하며, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
[ 실시예 ]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 마이크로모노스포라 로도랑지아 유전체로부터 SGT 암호화 유전자의 분리
마이크로모노스포라 로도랑지아 균주로부터 유래한 스테롤 당전이 효소를 분리하기 위하여, 우선 마이크로모노스포라 로도랑지아 균주에서 분리한 유전체를 주형으로 사용하고, 기존 마이크로모노스포라 속에서 보고된 유전체의 염기서열을 기초로 하여 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(primer)로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 다음과 같이 실시하였다. N-터미널 프라이머는 하기 서열번호 1의 서열이고, C-터미널 프라이머는 하기 서열번호 2의 서열이다.
[서열번호 1] 5'-GG CATATG ATCCACGCGCACGACTTCCGGATG-3' (NdeI 제한위치)
[서열번호 2] 5'-CG CTCGAG ATTCGGCCTGCGCCTCCCACGTCCA-3' (XhoI 제한위치)
상기 균주의 유전체 DNA 및 상기 프라이머들을 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)와 함께 혼합하여 전체 32 사이클의 PCR을 수행하였다(초기 불활성 98℃에서 5분, 52.8℃에서 69.3℃로 기울기 반응 후, 72℃에서 5분 동안 반응 후 종결). PCR 산물을 정제한 후, pGEMR-T 이지 벡터(pGEMR-T easy vector, Promega, Madison, WI, USA)에 접합한 다음, 대장균 XL1 블루(XL1 blue, Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 42℃에서 45초간 열처리한 후, 형질전환을 수행하였다. 선발된 형질전환 대장균으로부터 T-이지 벡터를 분리, 정제한 후 그 염기서열(서열번호 3) 및 이로부터 유추한 아미노산 서열(서열번호 4)을 결정하였다. 전체 ORF의 염기서열은 1185bp이며, 그 번역 후 단백질은 394의 아미노산으로 구성(총 41.4 kDa)되어 있다.
실시예 2: 대장균에서 재조합 스테롤 당전이 효소 MrSGT1의 발현
상기 실시예 1의 T-이지 벡터를 NdeI과 XhoI 제한효소로 처리한 MrGT1 DNA 절편을, 동일한 제한효소들로 처리한 단백질 발현 벡터인 pET-28(a+)(Novagen, Madison, WI, USA)에 삽입한 후, 대장균 BL21(DE3)(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 형질전환시켰다. 이때, 형질전환체의 선발을 위하여 카나마이신 항생제 50 ppm을 사용하였다.
상기 재조합 대장균을 전술한 항생제와 최종 농도 1M의 소르비톨(sorbitol) 및 2.5mM 베타인(betaine)이 첨가된 LB 배지(Luria Bertani)에 1% 부피비로 접종한 후, 37℃에서 배양하였다. 이후, 최종 농도 0.5mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-D-thiogalactopyranoside, IPTG; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 광학농도(optical density) 0.6 ~ 0.8 사이로 성장이 확인될 때, 단백질 발현을 유도시켜 재조합 대장균 균주를 20℃에서 24시간 추가 배양하였다. 배양 후 배양액을 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50mM 인산나트륨 용균(lysis) 완충용액(300nM NaCl, 10mM imidazole, 10% glycerol, 1% Triton X-100)에 균체를 용해시키고, 초음파 분해(sonication)를 실시하였다. 그 다음, 12000rpm에서 20분간 냉장 원심분리하고, 상등액을 따로 모아 일부 시료를 12% SDS-PAGE로 분석하여 재조합 스테롤 당전이 효소 MrSGT1의 발현 정도를 확인하였다.
발현이 확인된 재조합 단백질을 정제하기 위하여, 전술한 상등액을 50mM 인산 완충용액(0.3M NaCl, 20mM imidazole)으로 평형화된 탈론-금속 친화성 수지(Talon-metal affinity resin, Clontech, Mountain View, CA, USA)와 섞은 후 4℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 2000rmp에서 5분간 냉장 원심분리한 후, 수지를 일회용 컬럼에 도입한 후, 수지 10배 용량의 20mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충용액으로 세척하였다. 최종적으로 180mM 이미다졸을 포함한 인산 완충용액 3ml로 수지에 결합된 재조합 스테롤 당전이 효소 MrSGT1을 정제하였다.
실시예 3: MrSGT1 재조합 효소 반응에 의한 푸코스테롤 글루코사이드 화합물의 생합성, 분리 및 정제
기질로 사용되는 페녹소다이올(Sigma, St. Louis, MO, 미국) 50mM을 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide; 이하 DMSO)에 용해시켜 반응 완충용액(50mM 인산 완충용액, 10mM 염화마그네슘)으로 최종 1mM의 농도가 되게 희석한 후, 스테롤 당전이 효소 MrSGT1 30μM와 핵산당 UDP-glc 2mM을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 당전이 효소 반응을 실시하였다(도 1). 반응 후, 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 3000rpm에서 5분간 원심분리한 후의 상층 유기 용매층 만을 모아서 진공건조를 실시하였다. 상기 추출물 내 목적 화합물의 생합성 여부를 확인하기 위하여 고압 액체 크로마토그래피-전자분무이온화-질량분석기(HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry) 분석을 실시하였다. 이동상으로 메탄올:아세토나이트릴:물:포름산 45:40:14.8:0.2(v/v/v/v) 혼합액을 분당 150㎕ 속도로, 고정상 컬럼으로는 Acquity CSH C18(Waters, 50 x 1.0mm, 1.7㎛; Milford, MA, USA)을 사용하여 분석하였다(도 2).
한편, 상기 조추출물로부터 목적하는 당부가 푸코스테롤 화합물의 분리 및 정제를 위하여 하기 콤비플래시 Rf 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 시스템을 사용하였다. 역상(reverse-phase) C18 카트리지에 메탄올:아세토나이트릴:물:포름산 45:40:14.8:0.2(v/v/v/v) 혼합액을 이동상으로 분당 8ml의 속도로 흘러가는 MPLC 시스템에, 동일한 이동상 5ml에 용해시킨 전술한 조추출물을 주입한 후, 크로마토그램 상 검출된 피크를 자동 분취하였다. 개별 분획을 다시 감압하여 농축한 후, 이온트랩 질량 분석기(LCQ ion-trap mass spectrometer, ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)로 질량 스펙트럼을 분석함으로써 목적하는 당부가 푸코스테롤 화합물을 분리하였다. 기질로 사용된 푸코스테롤은 MPLC 시스템 상 약 19분의 유지 시간으로 분취되었고, 목적하는 당부가 푸코스테롤 화합물들은 기질보다 빠른 유지 시간인 14 ~ 15분으로 검출되었다. 이들 정제된 당부가 화합물은 도 1에 나타내었으며, 상기 글루코스 당 부가 화합물은 5.2mg으로 최종 정제되었다.
NMR 시료들은 200㎕의 CD3OD에 화합물을 용해시킨 후, 5mm 시게미 어드밴스드 NMR 마이크로튜브(Shigemi advanced NMR microtube, Sigma, St. Louis, MO)에 상기 용매를 방치시킴으로써 제조하였다. 13C NMR 스펙트럼은 배리언(Varian) INOVA 500 분광광도계를 이용하여 298K에서 획득하였고, 화학적 이동은 내부 준거로서 TMS를 이용하여 ppm으로 기록되었다. 모든 NMR 데이타 산출은 Mnova Suite 5.3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였고, 글루코스 부가 푸코스테롤의 13C-NMR 스펙트럼을 기질로 사용한 푸코스테롤과 비교하였다(표 1).
Figure pat00003
실시예 4: 푸코스테롤 글루코사이드 화합물의 항산화 활성 확인
상기 실시예 3에서 생성된 푸코스테롤 3-O-글루코사이드의 항산화 활성 검정을 위하여, DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용한 항산화능을 측정하였다. 정제된 푸코스테롤 3-O-글루코사이드를 메탄올을 이용하여 20에서 1,000㎍/ml 사이의 5구간으로 희석한 시료 각 0.1ml에 100μM DPPH 시약(메탄올) 1.9ml을 첨가하여 5초간 진탕하여 섞은 후, 37℃에서 15분간 정치하였다. 이후, UV-VIS 분광광도계 515nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 아스코르브산(L-ascorboic acid; Sigma, St. Louis, MO)를 그리고 당전이 반응 전의 푸코스테롤을 양성 비교군으로 사용하여, 상기와 동일한 5구간을 이용하여 상기 방법과 동일하게 측정하였다. 활성 검정은 DPPH의 농도가 50% 감소하는데 필요한 화합물의 농도(IC50)로 표시하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 아스코르브산은 IC50이 약 23.4㎍/ml로 나타났고, 비교군인 푸코스테롤은 IC50이 약 31.1㎍/ml로 나타났으며, 푸코스테롤 글루코사이드 화합물은 약 33.9㎍/ml로 나타났다. 이를 통하여 당전이된 푸코스테롤 유도체인 푸코스테롤 글루코사이드 화합물들은 강한 항산화 활성을 지닌 아스코르브산 보다는 낮은 항산화 활성을 나타내지만, 원래 물질인 푸코스테롤과는 유사한 항산화 활성을 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 푸코스테롤 글루코사이드 화합물의 사람 암세포주에 대한 항암 활성 확인
상기 실시예 3에서 생성된 푸코스테롤 글루코사이드 화합물의 항암 활성을 검정하기 위하여, 인간 유관 유방암(breast ductal carcinoma) 세포주인 T47D와 인간 결장암(colon carcinoma) 세포주인 HT29를 대상으로 하여 MTT 방법으로 그 항암 활성을 확인하였다. 상기 암세포주들에 대하여 양성 비교군으로 항암 활성이 이미 보고된 푸코스테롤을 동일 농도로 사용하였고, 또 다른 양성 대조군으로서, 화학요법제(chemotherapy agent)로 빈번히 사용되는 시스플라틴(cisplatin)을 사용하였다.
우선, 상기 2종의 사람 암세포주인 T47D와 HT29를 활성화시켰다. 각각의 세포주를 0.2% sodium bicarbonate, 100ppm 스트렙토마이신, 10ppm 페니실린, 4mM glutamine 및 fetal bovine serum(T47D의 경우엔 15%; HT29의 경우 10%)이 포함된 RPMI1640 배지에 전 배양시킨 후, 원심 분리하고 T-플라스크에 분주하여 본 배양을 5일간 수행하였다. 배양 조건은 5% 이산화탄소 대기 내, 37℃에서 실시하였다. 배양 3일째에 양성 비교군, 양성 대조군 및 실시예 3의 화합물 각각을 10% DMSO에 용해하여 최종 1, 3, 10, 30, 100 및 200μM 수준이 되도록 처리한 후, 2일간 추가 배양을 실시하였고, 필요할 경우 하루 간격으로 처리 세포주들을 분리하여 샘플링을 실시하였다. 각 처리군과 함께 페녹소다이올 및 시스플라틴 대조군을 동일하게 처리한 후, 최종 MTT로 정색 반응을 실시하여 각 암세포주에 대한 개별 IC50(50% 세포주 성장 저해를 야기시키는 화합물의 농도)을 측정하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 양성 비교군인 푸코스테롤은 유방암 세포주 T47D에 대하여 약 59.4μM의 IC50 수치를, 결장암 세포주인 HT29에 대하여는 약 146.3μM의 IC50 수치를 나타내었다. 반면, 또 다른 양성 대조군인 시스플라틴 화학요법제의 경우 상기 유방암 세포주에는 약 11.1μM, 결장암 세포주에는 약 22.1μM의 IC50 수치를 나타내었다. 그에 비하여, 푸코스테롤 글루코사이드 화합물은 상기 유방암 세포주를 대상으로 원래 물질인 푸코스테롤과 유사하게 약 62.1μM의 IC50 수치를, 그리고 상기 결장암 세포주에 대하여는 다소 약하게 약 167.3μM의 IC50 수치를 나타내었다. 이를 통하여 당전이된 푸코스테롤 유도체인 푸코스테롤 글루코사이드 화합물은 기존 화학요법제인 시스플라틴에 비하여 확연히 낮은 항암 활성을 나타내고 있으며, 원래 물질인 푸코스테롤보다는 다소 낮으나 여전히 유방암 및 결장암 관련 항암 활성을 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 푸코스테롤 글루코사이드 화합물의 당뇨합병증 연관 HRAR 및 PTP1B 효소 활성 억제 효과 확인
상기 실시예 3에서 생성된 푸코스테롤 3-O-글루코사이드 화합물의 당뇨합병증 관련 효소들의 억제 활성을 확인하기 위하여, 인간 재조합 알도스 환원효소(HRAR)과 타이로신 포스파타제 1B 효소 활성 검정법을 활용하였다.
HRAR 활성의 경우에 우선 0.15mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 인산(nicotineamide adenine dinucleotide phosphate; 이하 NADPH; Sigma) 10μL, 10mM DL-glyceraldehyde(Sigma) 기질 10μL 및 HRAR(Wako chemicals, 오사카, 일본; 0.4 unit) 2μL로 구성된 총 100μL의 100mM 인산나트륨 완충액(pH 6.2)을 마이크로플레이트(96-well microplate)에 분주하였다. 이후, 양성 비교군(푸코스테롤), 양성 대조군인 퀘르세틴(quercetin; Sigma) 및 실시예 3의 화합물 각각을 DMSO에 용해하여 최종 1, 3, 10, 30, 100 및 200μM 수준이 되도록 처리하며, 그 음성 대조구는 DMSO로 하였다. 알도스 환원효소의 활성은 반응 시간 1분 동안 조효소로 사용되는 NADPH의 흡광도(340nm) 감소 정도로 검정되었다. 각 처리군들의 HRAR 효소 억제 활성은 IC50(HRAR 활성을 50% 저해하는 처리군의 농도)을 측정하였다.
한편, PTP1B 활성의 경우에 우선 PTP1B(Biomol International LP, Plymouth Meeting, PA, 미국) 0.5 unit을 0.1M NaCl, 1mM EDTA 및 1mM DTT(dithiothreitol, Bio-rad, Hercules, CA, 미국)을 포함하는 50mM 구연산 나트륨 완충용액(pH 6) 40μL에 희석하여 마이크로플레이트에 분주하였다. 이후, 양성 비교군(푸코스테롤), 양성 대조군인 울소르산(ursolic acid; Sigma) 및 실시예 3의 화합물 각각을 DMSO에 용해하여 최종 1, 3, 10, 30, 100 및 200μM 수준이 되도록 처리(10μL)하며, 그 음성 대조구는 DMSO로 하였다. 반응 전 37℃에서 10분간 전 배양하고 2 mM PNPP(p-nitrophenyl phosphate, Sigma) 50μL를 가한 후 20분간 반응을 수행하였다. 타이로신 포스파라아제의 활성은 첨가된 PNPP의 효소적 탈인산화를 통하여 생성되는 p-nitrophenyl의 흡광도(405nm) 생성 정도로 검정되었다. 각 처리군들의 PTP1B 효소 억제 활성은 IC50(PTP1B 활성을 50% 저해하는 처리군의 농도)을 측정하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 양성 비교군인 푸코스테롤은 HRAR 활성에 대하여 약 142.3μM의 IC50 수치를, PTP1B 활성에 대하여는 약 56.7μM의 IC50 수치를 나타내었다. 반면, HRAR 활성에 대한 양성 대조군인 퀘르세틴의 경우 약 8.3μM, 그리고 PTP1B 활성에 대한 양성 대조군인 울소르산은 약 1.7μM의 IC50 수치를 나타내었다. 그에 비하여, 푸코스테롤 글루코사이드 화합물은 상기 HRAR 활성 대상으로 원래 물질인 푸코스테롤과 유사하게 약 146.0μM의 IC50 수치를, 그리고 상기 PTP1B 활성에 대하여는 다소 향상된 약 55.8μM의 IC50 수치를 나타내었다. 이를 통하여 당전이된 푸코스테롤 유도체인 푸코스테롤 글루코사이드 화합물은 원래 물질인 푸코스테롤과 유사하거나 다소 향상된 당뇨합병증 관련 효소들의 억제 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과에서 나타난 바와 같이, 기존 건강기능성 및 약리 활성 화합물의 당 전이에 의한 구조 변경을 통하여 기존 화합물을 개량할 수 있으며, 이러한 개량화로서 기존 약물의 대체 가능한 프로드럭화 및 신규 제형(dosage form)으로의 응용 가능성을 포함하는 다양한 건강기능식품 혹은 의약품 원료로서의 활용 잠재성을 확인할 수 있었다.
이에, 상기 실시예에서 생성된 화합물에 대하여 하기와 같이 제제화하였다.
제제예 1 : 정제 (직접 가압)
화합물 5.0㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1㎎, 크로스포비돈(USNF) 0.8㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.
제제예 2 : 정제 (습식 조립)
화합물 5.0㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0㎎과 녹말 4.0㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 800.3㎎을 순수한 물에 녹인 후, 이 용액의 적당량을 첨가하여 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후, 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0㎎과 혼합하였다. 상기 혼합물을 가압하여 정제로 제조하였다.
제제예 3 : 분말과 캡슐제
화합물 5.0㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.2㎎과 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 캡슐 제조기를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.
제제예 4 : 주사제
활성 성분 100mg에 만니톨 180mg, Na2HPO4 ·12H2O 26mg 및 증류수 2974mg을 함유시켜 주사제를 제조하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Method for Preparing Sterol Glucosides Using Sterol Glucosyltransferase <130> P15-B198 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 1 ggcatatgat ccacgcgcac gacttccgga tg 32 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 2 cgctcgagat tcggcctgcg cctcccacgt cca 33 <210> 3 <211> 1185 <212> DNA <213> Micromonospora rhodorangea <400> 3 atgcgcatcc tcatcgccac cgccggctcg cggggcgacg tggccccgta caccggcctc 60 ggcgcggccc tgcggcgcgc ggggtacgac gtggccgtcg ccacgaccga cacgttcgcc 120 cggatggtcc gggacgccgg cctggggttc cgccggctcc cggccgacac ccgcggccac 180 gcgggcgtgc gctccaaccg cgaggtcgtg cgcgcggccg gcgttcaccg cggaactggg 240 ccagggcttc gccgacgcgc cgtctcggag ggcacggacc tcctgctgct gtcgacgacc 300 accgcgccgc tggggtggct catcggcgag gcgacgggca tccggtccct cggggtctac 360 ctccagccca ccgcccccac cgccgacttc ccgccggtcg tcaccggcgc gcgctccctg 420 gggcggctcg gcaaccgcac ggccggccgc ctggccctgc gcatggccga ccggatctac 480 gccgaggccg tcgcgggcct gcgggagcgg ctgtgcctgc cgccgctgtc cgcggccgcg 540 atgcgggcgc ggcaggagcg ggccggctgg cccgtcctgc acggcttcgg cacggccctc 600 gtcccgcggc cggccgactg gcgccccggc ctcgaggtcg tggggccgtg gtggccgcac 660 cacgacgccg gcgagcgcct gccctcggaa ctcgaggact tcctggacgc gggaccgcgg 720 ccggtcctgg tgggcttcgg cagcatggcc gccggggacg gcgagcggct cagcgaactg 780 gcggtgcgcg cgctgcgccg cgccggcctc cgcggcatcc tccagtccgg caacgcctgc 840 ctcgcggcgg agggcgacga cgtcctgacg gtcggcgacg tcccccacgc cctcctgttc 900 ccccggctcg cggcggtggt gcaccacgcg cgccggcacc agcgccgcga ccctgcgggc 960 ggccgtcccc tcggtggcgg tcccggtgac cgccgaccag agccgttctg ggcgggccgg 1020 ctggcgcgga tcggggccgc ccccgccccg gtccccttca ccacgctgac cgcggacggg 1080 ctcgccggcg ccctgggccg cgtcgtcggc gacgaggcgt acgcgcgggc ggccgagaag 1140 gccgcccggc acctggccgc ggaggacggc gccgcgcgcg tgtga 1185 <210> 4 <211> 394 <212> PRT <213> Micromonospora rhodorangea <400> 4 Met Arg Ile Leu Ile Ala Thr Ala Gly Ser Arg Gly Asp Val Ala Pro 1 5 10 15 Tyr Thr Gly Leu Gly Ala Ala Leu Arg Arg Ala Gly Tyr Asp Val Ala 20 25 30 Val Ala Thr Thr Asp Thr Phe Ala Arg Met Val Arg Asp Ala Gly Leu 35 40 45 Gly Phe Arg Arg Leu Pro Ala Asp Thr Arg Gly His Ala Gly Val Arg 50 55 60 Ser Asn Arg Glu Val Val Arg Ala Ala Gly Val His Arg Gly Thr Gly 65 70 75 80 Pro Gly Leu Arg Arg Arg Ala Val Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Ser Thr Thr Thr Ala Pro Leu Gly Trp Leu Ile Gly Glu Ala Thr 100 105 110 Gly Ile Arg Ser Leu Gly Val Tyr Leu Gln Pro Thr Ala Pro Thr Ala 115 120 125 Asp Phe Pro Pro Val Val Thr Gly Ala Arg Ser Leu Gly Arg Leu Gly 130 135 140 Asn Arg Thr Ala Gly Arg Leu Ala Leu Arg Met Ala Asp Arg Ile Tyr 145 150 155 160 Ala Glu Ala Val Ala Gly Leu Arg Glu Arg Leu Cys Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Ser Ala Ala Ala Met Arg Ala Arg Gln Glu Arg Ala Gly Trp Pro Val 180 185 190 Leu His Gly Phe Gly Thr Ala Leu Val Pro Arg Pro Ala Asp Trp Arg 195 200 205 Pro Gly Leu Glu Val Val Gly Pro Trp Trp Pro His His Asp Ala Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Pro Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Asp Ala Gly Pro Arg 225 230 235 240 Pro Val Leu Val Gly Phe Gly Ser Met Ala Ala Gly Asp Gly Glu Arg 245 250 255 Leu Ser Glu Leu Ala Val Arg Ala Leu Arg Arg Ala Gly Leu Arg Gly 260 265 270 Ile Leu Gln Ser Gly Asn Ala Cys Leu Ala Ala Glu Gly Asp Asp Val 275 280 285 Leu Thr Val Gly Asp Val Pro His Ala Leu Leu Phe Pro Arg Leu Ala 290 295 300 Ala Val Val His His Ala Arg Arg His Gln Arg Arg Asp Pro Ala Gly 305 310 315 320 Gly Arg Pro Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Arg Arg Pro Glu Pro Phe 325 330 335 Trp Ala Gly Arg Leu Ala Arg Ile Gly Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro 340 345 350 Phe Thr Thr Leu Thr Ala Asp Gly Leu Ala Gly Ala Leu Gly Arg Val 355 360 365 Val Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Glu Lys Ala Ala Arg His 370 375 380 Leu Ala Ala Glu Asp Gly Ala Ala Arg Val 385 390

Claims (13)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 스테롤 당전이 효소(MrSGT1).
  2. 제1항의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 마이크로모노스포라 로도랑지아(Micromonospora rhodorangea) 균주 유래인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  6. 제2항의 폴리뉴클레오티드 또는 제5항의 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 미생물.
  8. 제6항의 미생물을 배양하여 스테롤 당전이 효소의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 스테롤 당전이 효소(MrSGT1)의 제조방법.
  9. 다음 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드의 제조방법:
    (a) 제1항의 스테롤 당전이 효소(MrSGT1) 존재하에 스테롤 및 당 공여체를 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드를 합성시키는 단계; 및
    (b) 상기 합성된 스테롤 글루코사이드를 회수하는 단계;
    [화학식 1]
    Figure pat00004

    상기 화학식 1에서, R1은 CHCH3, CH3 또는 H이고, R2 및 R3는 각각 H2 또는 H이고, R4는 글루코스이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 스테롤은 푸코스테롤(fucosterol), 캄페스테롤(campesterol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스테롤 글루코사이드의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 당 공여체는 UDP-글루코스(Glc), UDP-갈락토스(Gal) 또는 TDP-2'-디옥시글루코스(deoxy-Glc)인 것을 특징으로 하는 스테롤 글루코사이드의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 스테롤 글루코사이드는 푸코스테롤-3-O-β-글루코사이드, 캄페스테롤-3-O-β-글루코사이드 및 콜레스테롤-3-O-β-글루코사이드, 베타-시토스테롤-3-O-β-글루코사이드, 스티그마스테롤-3-O-β-글루코사이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스테롤 글루코사이드의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계는 역상 C18 고정상, 메탄올:아세토나이트릴:물:포름산 45:40:14.8:0.2(v/v/v/v) 혼합액 이동상 및 14-15분 유지시간(Retention time) 조건의 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC)를 이용하는 것을 특징으로 하는 스테롤 글루코사이드의 제조방법.
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