JP2018528977A - カンナビノイドグリコシドプロドラッグおよび合成の方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、カンナビノイド分子の、部位および組織特異的送達に適したカンナビノイドグリコシドプロドラッグに関する。本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼを介したカンナビノイド分子のグリコシル化による、カンナビノイドグリコシドプロドラッグの生成方法に関する。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、薬開発の分野に関し、特に、新規のカンナビノイドグリコシドプロドラッグ、および酵素を介した炭水化物の転移によるそれらの製造方法に関する。
カンナビス サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）由来のフィトカンナビノイドは、精神状態を変えるために長く使用されてきたが、最近の知見は、様々な疾患および状態の治療および維持のための特定のカンナビノイド化合物の可能性を明らかにしている。特に重要なのは、抗精神病薬、神経保護薬としての潜在的な治療用途を有し、また多数の他の病気を治療する可能性がある、非精神病性分子カンナビジオール（ＣＢＤ）である（それぞれＺｕａｒｄｉ ２０１２、Ｉｕｖｏｎｅ ２００９、レビューＭｅｃｈｏｕｌａｍ ２００２）。ＣＢＤの１つの欠点は、光、熱、および酸性または塩基性の条件によってＴＨＣおよびＣＢＮ誘導体に容易に酸化され、またＣＢＤの別の有害な特性は、その疎水性が非常に高いため、調合および送達が困難であることである。さらに、ＣＢＤおよびＴＨＣの現在の薬学的組成物は不快な感覚刺激特性を有し、また、その疎水性により、口蓋にとどまる。
カンナビノイドの疎水性が本来的に非常に高いため、薬物製剤におけるそれらの使用が困難である。非共有的な結合法により、環化マルトデキストリンなどの担体炭水化物を利用することで、カンナビノイドの溶解性が改善することが見出されている（Ｊａｒｈｏ １９９８）。共有化学的操作により、溶解度が改善した新規なＣＢＤプロドラッグが製造されている（国際公開第２００９／０１８３８９号、国際公開第２０１２／０１１１１２号）。ＣＢＤを機能化するための取り組みの中で、合成化学的操作によって、フッ素置換されたＣＢＤ化合物さえも生成されている（国際公開第２０１４／１０８８９９号）。上述した戦略は、ＣＢＤの溶解性を改善するのにいくらか成功したが、それらは組成物を変化させ、かつ加水分解の際に非天然のプロドラッグ部分構造を放出する、非天然組成物を生成する。
グリコシドがプロドラッグとして作用することができ、また直接的な治療効果を有することを示す証拠が増えている。グリコシドプロドラッグは、より部位特異的な、またはより組織特異的な薬物送達、血漿中の薬物のより一定した量、および薬物の持続放出または遅延放出を含む、薬物の生物学的利用能の改善または薬物動態の改善を可能にすることができ得る。ステロイドグリコシドの結腸への部位特異的送達が実証されており（Ｆｒｉｅｎｄ １９８５，Ｆｒｉｅｎｄ １９８４）、炎症性腸疾患などの局所障害の治療を可能にすることができた。ステロイドのグリコシル化は、酸性胃環境における安定した生物活性分子の残存、および大腸への送達を可能にし、大腸においてアグリコンは大腸菌によって生成されたグリコシダーゼによって遊離され、その後全身循環に吸収された。グリコシダーゼはまた、異なる組織に普遍的に存在するので（Ｃｏｎｃｈｉｅ １９５９）、静脈内送達などの、消化管および結腸をバイパスする方法によるグリコシドの送達は、グリコシダーゼの発現を増加させた他の細胞および組織への標的化送達を可能にする。さらに、アルファ‐グリコシダーゼおよびベータ‐グリコシダーゼ酵素の分布は、腸管および他の組織の間で異なり、従って、異なる形態のグリコシドは、特定の疾患領域への標的化送達をする、または、本明細書に記載のカンナビノイドおよび他の化合物の全身吸収を促進または制限することができる、局所的な標的化放出をする製剤を含む、独自の薬物動態プロファイルを提供することができる。多くの生物学的に活性のある化合物は、ホルモン、抗生物質、甘味料、アルカロイド、およびフラボノイドなどのクラスの化合物のメンバーを含むグリコシドである。グリコシドはアグリコンよりも水溶性であることが一般に受け入れられているが、文献レビューにおいて、構造と活性との関係が分析され、異なるクラスの化合物について、グリコシドの生物学的活性の一般的なパターンを明らかにすることはほとんど不可能であると判断された（Ｋｒｅｎ ２００８）。
合成化学と同様に、ｉｎ ｖｉｖｏ解毒戦略は、カンナビノイドの溶解性を改善するための他のモデルとしての役割を果たす。ＣＢＤはヒトにおいて肝臓グルコシルトランスフェラーゼによってグルクロン酸化されるが、これまでのところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイではＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ２Ｂ７についてわずかな活性しか証明されていない（米国特許第８，４１０，０６４号）。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、カンナビノール（ＣＢＮ）がヒトＵＧＴ１Ａ１０によって効率的にグルクロン酸化されることが示された（米国特許第８，４１０，０６４号）。ＣＢＤのグルクロン酸化は、ＣＢＤの溶解性を高め、腎臓を介した除去および排泄を促進するための１つの機構である。カンナビノイドに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を探索した結果、カンナビノールは、カラスビシャク（Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｒｎａｔａ）のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養と共にインキュベートしたときにグリコシル化されることが見出された（Ｔａｎａｋａ １９９３）。同様に、カラスビシャクおよびケチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｉｎｏｘｉａ）からの組織培養物と共にインキュベートすると、カンナビジオールがグリコシル化され、ＣＢＤ‐６’‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシドおよびＣＢＤ‐（２’，６’）‐Ｏ‐β‐Ｄ‐ジグルコピラノシドが生成されることが示された（Ｔａｎａｋａ １９９６）。これらの生体内変換の研究は、未知の植物グルコシルトランスフェラーゼによって生じる、これらの２つの化合物の限定的なグリコシル化の可能性、およびそれらが微量で生成されている可能性を示すが、今日まで、カンナビノイドのグリコシル化が可能な植物特異的なグルコシルトランスフェラーゼタンパク質は同定されておらず、カンナビノイドグリコシドは、大量に精製されて生成されておらず、かつカンナビノイドグリコシドの生物学的活性または薬学的特性は決して特徴付けられていない。
カンナビノイドは、ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）植物に見出されるステビオールグリコシドのステビオール骨格と同様に、ヒドロキシル化された疎水性骨格を含む。ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールグリコシドのＣ１３‐ＯＨ位およびＣ１９‐ＣＯＯＨ位の両方で、１次グリコシル化の３Ｃ‐ヒドロキシル基に２次グルコースを転移することができる、ステビア属に由来するグルコシルトランスフェラーゼであり、したがってその基質は、ステビオールモノシド、ステビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＥなどを含む（Ｒｉｃｈｍａｎら、２００５、Ｓｔｅｖｉａ Ｆｉｒｓｔ株式会社の未発表の研究）。ＵＧＴ７６Ｇ１の基質認識部位は、複数のステビオールグリコシドに結合し、かつグリコシル化することができるが、任意の他のグリコシドに対してグリコシル化活性を有することは従来知られておらず、任意のアグリコン化合物に対するＵＧＴ７６Ｇ１の活性は従来全く立証されていなかった。ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールグリコシドを、Ｃ１３ヒドロキシル基およびＣ１９カルボキシル基の両方に位置した１次糖上においてグリコシル化することができるので、二官能性グリコシル化を示す。シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ、Ｔｏｒｕｚｙｍｅ ３．０Ｌ、ノボザイムズ株式会社）は、酵素のアミラーゼファミリーのメンバーであり、マルトデキストリン鎖を環化するその能力が最もよく知られている。ＣＧＴアーゼのあまり知られていない活性は、直鎖状マルトデキストリン鎖の不均化およびアクセプター糖分子への転移である（Ｌｉ ２０１２）。
カンナビノイドプロドラッグとして入手可能な公知のカンナビノイドグリコシドは存在しない。個々のグリコシドを大量に精製して製造するため、および、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬の薬物動態および薬力学的評価を含む、それらの薬学的特性を評価するために必要な、カンナビノイドグリコシドの効率的な位置選択的生成のための公知の方法も存在しない。上述した問題を解決する目的で、カンナビノイドのグリコシル化の候補を同定するために、ならびに、カンナビノイドの潜在的プロドラッグとして、および新規の特性と機能とを有する新規なカンナビノイド組成物として、カンナビノイドグリコシドを同定するために、様々な生物からグルコシルトランスフェラーゼ酵素のスクリーニングが実施されている。
この背景情報は、本発明と関連する可能性があると本出願人が信じる情報を明らかにするために提供される。前述の情報のいずれも、本発明に対する先行技術を構成することを認めることを必ずしも意図せず、またそう解釈すべきでもない。
国際公開第２００９／０１８３８９号 国際公開第２０１２／０１１１１２号 国際公開第２０１４／１０８８９９号 米国特許第８，４１０，０６４号 米国特許第８，４１０，０６４号
Zuardi AW, et al. (2012). "A Critical Review of the Antipyschotic Effects of Cannabidiol: 30 Years of a Translational Investigation." Current Pharmaceutical Design, 18, 5131-5140. Iuvone T., Esposito G., De Filippis D., Scuderi C., Steardo L. (2009). "Cannabidiol: a promising drug for neurodegenerative disorders?" CNS Neurosci Ther. 15(1):65-75. Mechoulam R., Parker LA., Gallily R. (2002). "Cannabidiol: An Overview of Some Pharmacological Aspects." 42(S1):11S-19S. Friend DR., Chang GW. (1985). "Drug Glycosides: Potential Prodrugs for Colon-Specific Drug Delivery." J Med Chem. 28:51-57. Friend DR., Chang GW. (1984). "A Colon-Specific Drug-Delivery System Based on Drug Glycosides and the Glycosidases of the Colonic Bacteria." J Med Chem. 27:261-266. Kren V (2008) "Glycoside vs. Aglycon: The Role of Glycosidic Residue in Biologic Activity." Glycoscience. pp2589-2644. Tanaka H., et al. (1993). "Cannabis, 21.1 Biotransformation of cannabinol to its glycosides by in vitro plant tissue." Journal of Natural Products. 56(12):2068-2072. Tanaka H., et al. (1996). "Cannabis 25, biotransformation of cannabidiol and cannabidiolic acid by Pinellia ternata tissue segments." Plant Cell Reports. 15:819-823. Richman A., Swanso, A., Humphrey T., Chapman R., McGarvey B., Pocs R., Brandle J. (2005). "Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides of Stevia rebaudiana." Plant J. 41(1):56-67. Li S., Li W., Xiao Q., Xia Y. (2012). "Transglycosylation of stevioside to improve the edulcorant quality by lower substitution using cornstarch hydrolyzate and CGTase." J Food Chem. 138(2013):2064-2069.
本発明は、新規のカンナビノイドグリコシドプロドラッグ、および酵素を介した炭水化物の転移によるそれらの製造方法に関する。
本発明の目的は、カンナビノイドグリコシドプロドラッグを提供することである。本発明の一実施形態によれば、式（Ｉ）を有するカンナビノイドグリコシドプロドラッグ化合物、またはその薬学的に適合する塩を提供する：

（式中、Ｒは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；
Ｒ’は、Ｈ、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；かつ
Ａは、カンナビノイド化合物、エンドカンナビノイド化合物、もしくはバニロイド化合物の、ヒドロキシル基の反応を通して形成されたアグリコン部分構造である。）。
本発明の他の態様によれば、被験者に対するカンナビノイド薬物の部位特異的送達の方法であって、本発明に係るカンナビノイドグリコシドプロドラッグを、それを必要とする被験者に対して投与する工程を含む、被験者に対するカンナビノイド薬物の部位特異的送達の方法を提供する。
本発明の他の態様によれば、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法を提供する。
本明細書に記載された技術のさらなる態様は、本明細書の以下の部分で明らかになり、詳細な説明は、本技術の好ましい実施形態を制限を置くことなく完全に開示することを目的とする。
図１Ａは、本発明のグリコシル化方法に使用されるアグリコンを例示する。 図１Ｂは、アグリコン中のグリコシル化が可能な箇所を例示する。 図２は、カンナビジオール（ＣＢＤ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図３は、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図４は、カンナビジオール（ＣＢＤ）のグリコシル化による可能性のある回転生成物（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）を例示する。 図５は、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）のグリコシル化による可能性のある回転生成物を例示する。 図６は、ＵＧＴ７６Ｇ１の触媒部位における基質カンナビジオール（ＣＢＤ）の提唱された重ね合わせを例示する。 図７は、テトラヒドロカンナビノール（Δ９‐ＴＨＣ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図８は、カンナビノール（ＣＢＮ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図９は、アラキドノイルエタノールアミド（ＡＥＡ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１０は、２‐アラキドノイルエタノールアミド（２‐ＡＧ）のグリコシル化の可能性のある生成物を例示する。 図１１は、１‐アラキドノイルエタノールアミド（１‐ＡＧ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１２は、Ｎ‐ドコサヘキサエノイルエタノールアミン（ＤＨＥＡ）のグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１３は、カプサイシンのグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１４は、バニリンのグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１５Ａは、クルクミンのグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１５Ｂは、クルクミンのグリコシル化による可能性のある生成物を例示する。 図１６は、ＣＢＤのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図１７は、ＣＢＤＶのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図１８は、Δ９‐ＴＨＣのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図１９は、ＣＢＮのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図２０は、１‐ＡＧおよび２‐ＡＧのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図２１は、シナプタミド（ＤＨＥＡ）のグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図２２は、ＡＥＡのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図２３は、バニリンのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図２４は、カプサイシンのグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースである。 図２５は、グリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７６Ｇ１を用いたＣＢＤｇ１（ＶＢ１０４）のグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースを示す。 図２６は、グリコシルトランスフェラーゼＯｓ０３ｇ０７０２０００を用いたＣＢＤｇ１（ＶＢ１０４）のグリコシル化による反応生成物のＨＰＬＣライントレースを示す。 図２７は、単離した、ＣＢＤのグリコシル化による生成物ＶＢ１０４の１ＮＭＲスペクトルである。 図２８は、単離した、ＣＢＤのグリコシル化による生成物ＶＢ１１０の１ＮＭＲスペクトルである。 図２９は、選択されたカンナビノイドおよびカンナビノイドグリコシドについての、Ｃ１８保持時間に対するｃＬｏｇＰ値のプロットである。 図３０Ａは、生物学的利用能アッセイの小腸抽出物の分析結果のグラフ式表現である。図３０Ｂは、生物学的利用能アッセイの大腸抽出物の分析結果のグラフ式表現である。
以下の略語を一貫して用いる：
ＣＢ カンナビノイド
ＣＢＤ カンナビジオール
ＣＢＤＶ カンナビジバリン
ＣＢＧ カンナビゲロール
Δ９‐ＴＨＣまたはＴＨＣ テトラヒドロカンナビノール
ＣＢＮ カンナビノール
ＣＢＮＶ カンナビナバリン
ＣＢＤＡ カンナビジオール酸
ＴＨＣＶ テトラヒドロカンナビバリン
ＵＧＴ ＵＤＰＧ‐依存グルコシルトランスフェラーゼ
ＵＤＰＧ ウリジンジホスホグルコース
ＵＤＰ ウリジン２リン酸
ＡＥＡ アラキドノイルエタノールアミド（別名アナンダミド）
２‐ＡＧ ２‐アラキドノイルエタノールアミド
１‐ＡＧ １‐アラキドノイルエタノールアミド
ＤＨＥＡ Ｎ‐ドコサヘキサエノイルエタノールアミン（別名シナプタミド）
ＳＵＳ スクロースシンターゼ
用語「グルコピラノシド」は、分子を命名するために用いられ、それはグルコースの第１位（アノマー炭素）のヒドロキシル基を介して、アグリコンに結合した、β‐Ｄ‐グルコースについての略記である。
本願において、用語「アグリコン」は、グリコシド化合物の非グリコシド部分について言及するために用いられる。
用語「プロドラッグ」は、投与の際に、活性型薬剤となる前に、代謝プロセスによって化学的に変換されなければならない化合物を指す。
用語「カンナビノイドグリコシドプロドラッグ」は、カンナビノイド化合物、エンドカンナビノイド化合物、およびバニロイド化合物のグリコシドを一般的に指す。カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、典型的にはグリコシダーゼの作用によって、グリコシド結合の加水分解を受け、活性型のカンナビノイド、エンドカンナビノイド、またはバニロイド化合物を、被験者の体内の所望の部位に対して放出する。本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグはまた、用語「カンナボシド（ｃａｎｎａｂｏｓｉｄｅ）」を用いて言及され得る。
本願において用語「カンナビノイド」は、アサ（ｃａｎｎａｂｉｓ）で見つかり、かつカンナビノイド受容体に対して作用する化合物を一般的に指すために用いられる。「カンナビノイド」化合物は、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、テトラヒドロカンナビノール（Δ９‐ＴＨＣまたはＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、およびテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）を含むが、これらに限定されない。特に好ましいカンナビノイド化合物は、ＣＢＤ、ＣＢＤＶ、ＴＨＣ、およびＣＢＮである。
本願において用語「エンドカンナビノイド」は、アラキドノイルエタノールアミド（アナンダミド、ＡＥＡ）、２‐アラキドノイルエタノールアミド（２‐ＡＧ）、１‐アラキドノイルエタノールアミド（１‐ＡＧ）、およびドコサヘキサエノイルエタノールアミド（ＤＨＥＡ、シナプタミド）、オレオイルエタノールアミド（ＯＥＡ）、エイコサペンタエノイルエタノールアミド、プロスタグランジンエタノールアミド、ドコサヘキサエノイルエタノールアミド、リノレノイルエタノールアミド、５（Ｚ），８（Ｚ），１１（Ｚ）‐エイコサトリエン酸エタノールアミド(ミード酸エタノールアミド)、ヘプタデカノールエタノールアミド、ステアロイルエタノールアミド、ドコサエノイルエタノールアミド、ネルボノイルエタノールアミド、トリコサノイルエタノールアミド、リグノセロイルエタノールアミド、ミリストイルエタノールアミド、ペンタデカノイルエタノールアミド、パルミトレオイルエタノールアミド、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含む化合物を指すために用いられる。特に好ましいエンドカンナビノイドは、ＡＥＡ、２‐ＡＧ、１‐ＡＧ、およびＤＨＥＡである。
本願において用語「バニロイド」は、バニリル基を含み、かつＴＲＰＶ１のようなバニロイド受容体に作用する化合物を指す。「バニロイド」化合物は、バニリン、カプサイシン、およびクルクミンを含むが、これらに限定されない。
本明細書中で用いられる場合、用語「約」は、名目値からの＋／−１０％の変動を指す。そのような変動は、具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される与えられた値に常に含まれることが理解される。
本明細書中で用いられる場合、用語「被験者」または「患者」は、治療を必要とする動物を指す。一実施形態において、動物は、ヒトである。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明によれば、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、およびバニロイドは、グルコシルトランスフェラーゼの基質として使用され、１または２以上の糖分子が結合して新規のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを生成する。得られるカンナビノイドグリコシドプロドラッグは、部位特異的または組織特異的送達、薬理学的送達の改善のための水溶性の改善、および／または、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、およびバニロイド薬分子の持続放出もしくは遅延放出を示す。
また、本発明によれば、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、グリコシド結合の加水分解により変換され、活性型カンナビノイド、エンドカンナビノイド、およびバニロイド薬を提供する。したがって、本発明は、疎水性アグリコン部分構造を有するグリコシドが、胃腸管またはグリコシダーゼの発現の増加した組織においてグルコース加水分解を受け、標的組織または器官において疎水性カンナビノイド化合物を生成することを実証する。
グリコシドのグルコース残基は一般に、胃で酸加水分解されるか、または、腸の種々の領域にわたって腸微生物叢によって発現されるα-グリコシダーゼおよびβ-グリコシダーゼを含む、腸管のグリコシダーゼ酵素によって切断される。したがって、グリコシドは、摂取時に加水分解されて、所望の化合物を腸または標的組織に放出する。
一実施形態において、カンナビノイド薬のグリコシル化は、経口投与の際に酸性胃環境で残存することができるカンナビノイドグリコシドプロドラッグを提供し、それにより大腸へのプロドラッグの送達が可能となり、カンナビノイドアグリコンを結腸細菌により生成されたグリコシダーゼによって解放することができる。
一実施形態においては、カンナビノイド薬物のグリコシル化は、グリコシダーゼの発現が増加した組織に対して標的化送達を行うのに適したカンナビノイドグリコシドプロドラッグを提供する。被験者に対するカンナビノイドグリコシドプロドラッグの非経口投与の際に、標的組織中でグリコシダーゼによってカンナビノイドアグリコンが解放される。
カンナビノイドグリコシドプロドラッグが、グルコース切断がなくても薬剤としても有用であり、単独の親化合物と比較して新規の薬力学的特性を示すことも、本発明の技術的範囲内である。本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグの増加した水溶性により、疎水性カンナビノイド、エンドカンナビノイドおよびバニロイド分子を調合するとすれば達成できなかった、経皮または水性製剤で送達するための新しい製剤も可能となる。
本発明の一実施形態において、式（Ｉ）を有するカンナビノイドグリコシドプロドラッグ化合物、またはその薬学的に適合する塩を提供する：

（式中、Ｒは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；
Ｒ’は、Ｈ、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；かつ
Ａは、カンナビノイド化合物、エンドカンナビノイド化合物、もしくはバニロイド化合物、のヒドロキシル基の反応を通して形成されたアグリコン部分構造である。）。
本発明の一実施形態によれば、Ａは、Ａ’、Ａ’’またはＡ’’’であり；
Ａ’は：

であり；
Ａ’’は：

であり；
かつＡ’’’は：

であり、
Ｇは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル、もしくはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１→３）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１→３）‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；またはそれらの薬学的に適合する塩である。
本発明の一実施形態によれば、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、カンナビノイドのグリコシドであり、該プロドラッグは、式（Ｉ’）を有する：

（式中、Ｒは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；
Ｒ’は、Ｈ、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；かつ
Ａ’は：

であり；
Ｇは、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１‐３）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１‐３）‐Ｄ‐グルコピラノシルである。）。
式（Ｉ’）の化合物は、表１から４に列挙された化合物を含む。
式（Ｉ’）の範囲内に入る例示的なカンナビジオール（ＣＢＤ）‐グリコシドは、本発明にしたがってＣＢＤ（ＶＢ１０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’）の範囲内に入る例示的なカンナビジバリン（ＣＢＤＶ）‐グリコシドは、本発明にしたがってＣＢＤＶ（ＶＢ２０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’）の範囲内に入る例示的なテトラヒドロカンナビノール（Δ９‐ＴＨＣ）‐グリコシドは、本発明にしたがってΔ９‐ＴＨＣ（ＶＢ３０１）のグリコシル化によって生成され：
を含む。
式（Ｉ’）の範囲内に入る例示的なカンナビノール（ＣＢＮ）‐グリコシドは、本発明にしたがってＣＢＮ（ＶＢ４０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
本発明の一実施形態によれば、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、エンドカンナビノイドのグリコシドであり、該プロドラッグは、式（Ｉ’’）を有する：

（式中、Ｒは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；
Ｒ’は、Ｈ、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；かつ
Ａ’’は：

である。）。
式（Ｉ’’）の化合物は、表５から８に列挙された化合物を含む。
式（Ｉ’’）の範囲内に入る例示的なアラキドノイルエタノールアミド（ＡＥＡ）‐グリコシドは、本発明にしたがってＡＥＡ（ＶＢ５０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’’）の範囲内に入る例示的な２‐アラキドノイルエタノールアミド（２‐ＡＧ）‐グリコシドは、本発明にしたがって２‐ＡＧ（ＶＢ６０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’’）の範囲内に入る例示的な１‐アラキドノイルエタノールアミド（１‐ＡＧ）‐グリコシドは、本発明にしたがって１‐ＡＧ（ＶＢ７０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’’）の範囲内に入る例示的なＮ‐ドコサヘキサエノイルエタノールアミン（ＤＨＥＡ）‐グリコシドは、本発明にしたがってＤＨＥＡ（ＶＢ８０１）のグリコシル化によって生成され：


を含む。
本発明の一実施形態によれば、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、バニロイドのグリコシドであり、該プロドラッグは式（Ｉ’’’）を有する：

（式中、Ｒは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；
Ｒ’は、Ｈ、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；かつ
Ａ’’’は：
である。）。
化学式（Ｉ’’’）の化合物は、表９から１１に列挙された化学式を含む。
式（Ｉ’’’）の範囲内に入る例示的なカプサイシン‐グリコシドは、本発明にしたがってカプサイシン（ＶＢ９０１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’’’）の範囲内に入る例示的なバニリン‐グリコシドは、本発明にしたがって、バニリン（ＶＢ１００１）のグリコシル化によって生成され：

を含む。
式（Ｉ’’’）の範囲内に入る例示的なクルクミン‐グリコシドは、本発明にしたがって、クルクミン（ＶＢ１１０１）のグリコシル化によって生成され：



を含む。
一実施形態においては、被験者へのカンナビノイド薬物の部位特異的送達の方法であって、本発明の一実施形態に係る１または２以上のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを、それを必要とする被験者に対して投与する工程を含む、被験者へのカンナビノイド薬物の部位特異的送達の方法を提供する。一実施形態において、送達の部位は、大腸である。一実施形態において、送達の部位は、直腸である。一実施形態において、送達の部位は、肝臓である。一実施形態において、送達の部位は、皮膚である。
一実施形態において、鼻腔内、定位、もしくは髄腔内送達による、または被験者の血液脳関門を越える輸送による、カンナビノイド薬の脳への輸送を容易にするための方法であって、本発明に係るカンナビノイドグリコシドプロドラッグを、それを必要とする被験者に投与する工程を含む、カンナビノイド薬の脳への輸送を容易にするための方法を提供する。
本発明の一実施形態によれば、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、カンナビノイド薬の投与によって利益を受ける、または改善することのできる状態の治療に有用である。本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグの投与によって治療または改善することができる状態は、クローン病からの寛解の誘導、および大腸炎、および潰瘍性大腸炎からの寛解の誘導を含む炎症性腸疾患を含むが、これらに限定されない。本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグの投与によって達成することができる利益としては、腸および直腸の炎症の減少、腸内、直腸の痛みの減少、ならびに、神経因性疼痛および腹痛の減少、および結腸直腸癌の増殖または細胞傷害性の阻害がある。カンナビノイドまたはカンナビノイドグリコシドの追加の治療の効能、効果、また適用は、拒食症、悪心、嘔吐、痛み、消耗性症候群、ＨＩＶ消耗性、化学療法誘発悪心および嘔吐、てんかん、統合失調症、過敏性腸症候群、痙攣、痙縮、発作性疾患、アルコール使用障害、薬物乱用障害、嗜癖、癌、筋萎縮性側索硬化症、多形性膠芽腫、神経膠腫、眼内圧の上昇、緑内障、大麻使用障害、トゥレット症候群、ジストニア、多発性硬化症、白質障害、脱髄障害、慢性外傷性脳症、白質脳症、ギラン・バレー症候群、炎症性腸疾患、胃腸障害、細菌感染症、ＭＲＳＡ、敗血症、敗血症性ショック、ウイルス感染症、関節炎、皮膚炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗炎症、抗けいれん、抗精神病、抗酸化、神経保護、抗癌、免疫調節効果、神経因性疼痛、ヘルペス後神経痛に関連する神経因性疼痛、糖尿病性ニューロパシー、帯状疱疹、火傷、光線性角化症、口腔傷および潰瘍、会陰切開後の痛み乾癬、掻痒症、痛風、軟骨石灰症、関節痛、線維筋痛、筋骨格痛、神経障害術後合併症を含み得るが、これらに限定されない。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、薬学的に許容される担体、希釈剤、添加剤、またはアジュバントをさらに含む薬学的組成物中で投与される。一実施形態において、薬学的組成物は、１または２以上のカンナビノイドグリコシドプロドラッグ、ならびに１または２以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、添加剤、および／またはアジュバントを含む。被験者に対する投与のために、経口、局所、直腸、非経口、および鼻腔内投与を含むがこれらに限定されない様々な経路による投与のために、薬学的組成物を調合することができる。
薬学的組成物は、約１％から約９５％の本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含み得る。単回投与の形態で投与するために調合された組成物は、例えば、約２０％から約９０％の本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含み得るが、単回投与の形態ではない組成物は、例えば、約５％から約２０％の本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含み得る。単位投与の形態の非限定的な例には、錠剤、アンプル、糖衣錠、坐剤およびカプセル剤が含まれる。
好ましい実施形態においては、薬学的組成物は、経口投与のために調合される。経口投与のための薬学的組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、散剤もしくは顆粒剤、乳剤硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として、調合され得る。そのような組成物は、薬学的組成物の製造のための、当該技術分野において公知の標準的な方法にしたがって調製することができ、薬学的にエレガントで口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤および保存剤からなる群から選ばれる１または２以上の薬剤を含み得る。錠剤は、適切な非毒性の薬学的に許容される添加剤と混合して、活性成分を含んでもよく、そのような添加剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴムなどの結合剤；ならびにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤を含む。錠剤は、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、それにより、長期間にわたって持続作用を与えるために、公知技術によってコーティングされていなくても、コーティングされていてもよい。例えば、消化管の中の所望の場所への薬化合物の送達をさらに容易にするために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。
経口使用のための製剤は、活性成分が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合される硬質ゼラチンカプセル剤として、または、活性成分が、水、もしくはピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油などの油媒体と混合される軟質ゼラチンカプセル剤として、提供することができる。
水性懸濁液として調合される薬学的組成物は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムなどの懸濁剤；例えばレシチンなどの天然に存在するホスファチドなどの分散剤または湿潤剤、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンなどの、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、または例えばヘプタ‐デカエチレンオキシセタノールなどの、エキレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、または例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合物、または例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合物などの１または２以上の適切な添加剤と混合して、活性化合物を含む。水性懸濁液は、ｐ‐ヒドロキシ‐安息香酸エチル又はｎ‐プロピルなどの１または２以上の防腐剤、１もしくは２以上の着色剤、１もしくは２以上の香味料、またはスクロース、ステビア、もしくはサッカリンなどの１もしくは２以上の甘味料もまた含み得る。
薬学的組成物は、活性化合物を、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココナッツ油などの植物油、または液体パラフィンなどの鉱物油に懸濁することによって、油性懸濁液として、調合することができる。油性懸濁液は、例えば、ミツロウ、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含み得る。上記のような甘味料、および／または香味料は、口当たりのよい経口の調製物を提供するために加えることができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を加えることによって保存することができる。
薬学的組成物は、散剤または顆粒剤として調合することができ、これらは次いで水を加えることによって水性懸濁液を調製するために用いることができる。そのような散剤または顆粒剤は、１または２以上の分散剤または湿潤剤、懸濁剤、および／または保存料と混合して、活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、すでに上記の言及によって例示されている。甘味料、香味料、および着色剤などの追加の添加剤もまた、これらの組成物中に含めることができる。
本発明の薬学的組成物は、水中油型乳剤として調合することもできる。油相は、例えばオリーブ油、もしくはラッカセイ油などの植物油、または例えば液体パラフィンなどの鉱物油であり得、またはこれらの油の混合物であり得る。これらの組成物に含まれる適切な乳化剤は、例えばアラビアゴム、もしくはトラガカントゴムなどの天然に存在するゴム；例えばダイズ、レシチンなどの天然に存在するホスファチド；または、例えばソルビタンモノオレエートなどの、脂肪酸および無水ヘキシトールに由来するエステルもしくは部分エステル、ならびに、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物を含む。乳剤は、任意で、甘味料および香味料を含むこともできる。
薬学的組成物は、活性成分を、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはスクロースなどの１または２以上の甘味料と組み合わせることによって、シロップ剤もしくはエリキシル剤として、調合することができる。そのような製剤はまた、任意で１または２以上の増粘剤、保存剤、香味料、および／または着色剤を含むこともできる。
所望であれば、他の活性成分を、本組成物に含まることができる。一実施形態においては、グリコシドプロドラッグは、グリコシダーゼ活性を有する他の成分もしくは物質、または他の方法で様々な化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの薬物代謝および薬物動態プロファイルを変更し得る他の成分もしくは物質であって、精製された形態のもの、および食品、飲料、および他の製品の中で見つかるような化合物を含む他の成分もしくは物質と、組み合わせ得る。一実施形態において、カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、直接的なグリコシダーゼ活性を有する物質、または腸の１または２以上の領域において、グリコシダーゼ活性を変化させる胃微生物叢を、変更する物質と、組み合わせて投与されるか、またはこれらの物質とともに調合される。そのような組成物の例は、ヨーグルト、プレバイオティクス、プロバイオティクス、または糞便移植を含むが、これらに限定されない。
さらに好ましい実施形態においては、薬学的組成物は、非経口投与のために調合される。用語「非経口」は、本明細書中において、皮下注射、静脈内、筋肉内、髄腔内、胸骨内注射または注入技術を含む。
非経口的な薬学的組成物は、当該技術分野において公知の方法にしたがって、かつ上記のような１または２以上の適切な分散剤または湿潤剤および／または懸濁化剤を用いて、無菌注射用の水性または油性懸濁液として調合することができる。無菌注射用調製物は、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤中の、無菌注射用溶液または懸濁液であり得、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。用いることができるビヒクルおよび溶剤は、水、リンガー溶液、乳酸リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液を含むが、これらに限定されない。他の例は、溶剤または懸濁媒として簡便に採用される、無菌の不揮発性油、および合成モノ−またはジグリセリドを含む様々な当たり障りのない不揮発性油を含む。オレイン酸などの脂肪酸を注射液の調製において用いることができる。
カンナビノイドが非常に親油性であるために、これらの分子は、典型的には、ヒトを含む哺乳類の皮膚などの膜を通した吸収が不十分であり、治療上有効な量のカンナビノイドを、それを必要とする被験者に、妥当な時間枠内で、かつ適切な表面領域にわたって経皮的に投与することは、実質的に限定的にしか成功していなかった。したがって、本発明のカンナビノイドグリコシドプロドラッグは、疎水性カンナビノイドアグリコンを親水性グリコシド部分構造に結合させることにより、皮膚を介してより容易に吸収される、受動拡散に好ましい両親媒性特性を有する分子を提供することが提案される。
したがって、一実施形態において、薬学的組成物は、局所的投与のために調合される。そのような局所的組成物は、例えば、エアロゾルスプレー、パウダー、スティック、顆粒、クリーム、液体クリーム、ペースト、ゲル、ローション、軟膏、スポンジもしくは綿アプリケータ上、または水性液体、非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油型乳剤、または油中水型液体乳剤として提供され得る。
局所用薬学的組成物は、増粘（ゲル化）剤とともに調合することができる。本明細書中で用いられる増粘剤は、ポリアクリル酸（オハイオ州クリーブランドのノベオン株式会社製のカーボポール（ＣＡＲＢＯＰＯＬ）（登録商標））、カルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロースなどのアニオン性ポリマー、および、カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）Ｕｌｔｒｅｚ １０、カーボポール（登録商標）９４０、カーボポール（登録商標）９４１、カーボポール（登録商標）９５４、カーボポール（登録商標）９８０、カーボポール（登録商標）９８１、カーボポール（登録商標）ＥＴＤ ２００１、カーボポール（登録商標）ＥＺ‐２およびカーボポール（登録商標）ＥＺ‐３などのカーボポール（登録商標）ポリマーの誘導体を含むそれらの同類、ならびに、ペムレン（Ｐｅｍｕｌｅｎ）（登録商標）高分子乳化剤、およびノベオン（登録商標）ポリカルボフィルなどの他のポリマーを含み得る。増粘剤またはゲル化剤は、所望の流動学的特性の組成物を提供するために十分な量含まれる。
局所用薬学的組成物は、浸透エンハンサとともに調合することができる。浸透促進剤の非限定的な例は、イソステアリン酸、オクタン酸、およびオレイン酸などのＣ８〜Ｃ２２脂肪酸；オレイルアルコールおよびラウリルアルコールなどのＣ８〜Ｃ２２脂肪アルコール；オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチルおよびラウリン酸メチルなどのＣ８〜Ｃ２２脂肪酸の低級アルキルエステル；ジイソプロピルアジペートなどのＣ６〜Ｃ２２二酸のジ（低級）アルキルエステル；グリセリルモノラウレートなどのＣ８〜Ｃ２２脂肪酸のモノグリセリド；テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール；２‐（２‐エトキシエトキシ）エタノール；ジエチレングリコールモノメチルエーテル；ポリエチレンオキシドのアルキルアリールエーテル；ポリエチレンオキシドモノメチルエーテル；ポリエチレンオキシドジメチルエーテル；ジメチルスルホキシド；グリセロール；酢酸エチル；アセト酢酸エステル；Ｎ‐アルキルピロリドン；テルペンを含む。
局所用薬学的組成物は、薬剤の製剤の技術分野において公知の、湿潤剤（界面活性剤）、潤滑剤、皮膚軟化剤、抗菌防腐剤、および乳化剤をさらに含むことができる。
カンナビノイドグリコシドプロドラッグの経皮送達は、マイクロニードルアレイ薬物送達システムの使用によって、さらに容易にすることができる。
他の薬学的組成物および薬学的組成物の調製方法が当該技術分野において知られており、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”(かつての“Remingtons Pharmaceutical Sciences”); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)に記載されている。
上記の本発明の薬学的組成物は、意図された目的を達成するために有効な量の本発明の１または２以上のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含む。したがって、用語「治療上有効な投与量」は、例えば、治療される疾患または障害の症状を改善する、疾患または障害を防ぐ、または疾患の病状を変化させる、治療される被験者の状態を改善する量のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを指す。治療上有効な化合物の投与量の決定は、十分当業者の能力の範囲内である。一実施形態において、その効果がいくらか相乗的であり得る、ＴＨＣおよびＣＢＤを含むカンナビノイドグリコシドは、部位特異的に多数のカンナビノイドを同時に送達することを可能にするために、組み合わせることができる（Ｒｕｓｓｏ ２００６）。したがって、一実施形態においては、薬学的組成物は、単回投与の形態でともに調合された、１または２以上のＣＢＤ‐グリコシド、および１または２以上のＴＨＣ‐グリコシドを含む。
被験者に対して投与される正確な投与量は、治療を必要する被験者に関連する因子に基づいて、従事者が決定することができる。投与量および投与は、所望のレベルのカンナビノイドグリコシドプロドラッグ、および／または、プロドラッグの加水分解によって得られるカンナビノイド薬化合物を提供するように、調節することができる。適切な投与量を決定する際に考慮に入れ得る因子は、疾患状態の深刻さ、被験者の一般的な健康状態、年齢、体重、および被験者の性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療法に対する耐性／応答性を含み得る。投与計画は、上記の因子、および特定の製剤の半減期およびクリアランス率などの因子に依存して、従事者によって計画され得る。
本発明によれば、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法を提供する。
一実施形態において、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼである。一実施形態において、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１−様グルコシルトランスフェラーゼ、およびＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００−様グルコシルトランスフェラーゼを含む。
一実施形態において、１または２以上の糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコース、ＵＤＰ‐グルクロン酸、ＵＤＰ‐マンノース、ＵＤＰ‐フルクトース、ＵＤＰ‐キシロース、ＵＤＰ‐ラムノース、ＵＤＰ‐フルオロ‐デオキシグルコース、およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。好ましい実施形態において、糖供与体はＵＤＰ‐グルコースである。
本発明によれば、カンナビノイドアグリコンは、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、またはバニロイドである。好ましい実施形態において、本発明の方法によって製造されるカンナビノイドグリコシドプロドラッグは、式（Ｉ）の化合物である。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法は、グリコシル化が可能である条件下で、第１のグリコシルトランスフェラーゼおよび第２のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む。一実施形態において、糖供与体はＵＤＰ‐グルコースであり、第１のグリコシルトランスフェラーゼはＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼであり、かつ第２のグリコシルトランスフェラーゼはＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼである。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼ、およびＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法は、グリコシル化が可能である条件下で、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、マルトデキストリンとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースおよびマルトデキストリンとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む。
好ましい実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法に用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼである。一実施形態において、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、５、または７に記載された配列を含む。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法に用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼである。一実施形態において、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号９に記載された配列を含む。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドの製造方法は、スクロースシンターゼとともにインキュベートする工程をさらに含む。一実施形態において、スクロースシンターゼは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載された配列を含む。
一実施形態において、カンナビノイドグリコシドプロドラッグの製造方法は、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼを、細胞または植物内で発現させることによってカンナビノイドアグリコンを生成する工程、およびカンナビノイドグリコシドプロドラッグを単離する工程を含む。
カンナビノイドのグリコシル化は、Ｃ１８分析ＨＰＬＣカラムからの溶出が加速されたことによって実証されるように、水性溶液中での溶解性を改善し、このことは、新たなカンナビノイド‐グリコシドが、疎水性クロマトグラフィーカラムからの溶出のために必要とする有機溶媒の量がはるかに少ないことを示す。この溶解性の改善は、精製した固体のカンナボシドの水溶性を試験することによってさらに実証され、カンナボシドの高次のグリコシドの形態の混合物を用いて、５００ｍｇ／ｍｌ（５０質量／体積％）までの溶液を調製することに成功した。溶解性が著しく改善したこと、およびカンナビノイドの新規の２次、および３次のグリコシル化を考慮すると、グリコシル化カンナビノイドは、所望の組織へのカンナビノイドの選択的送達のための有効なプロドラッグとして作用することができ、該組織においてグルコース分子が加水分解され、アグリコンカンナビノイドを放出することができる。さらに、グリコシル化は、ＣＢＤおよびＣＢＤＶをＣ６’‐ヒドロキシル基の酸化および閉環から保護することによって、それぞれΔ９‐ＴＨＣまたはΔ９‐ＴＨＣＶへ、次いでそれぞれカンナビノール（ＣＢＮ）またはカンナビナバリン（ＣＢＮＶ）への分解を防止し、ＣＢＤおよびＣＢＤＶの安定性を高める。
カンナビノイドへの糖結合の多様性および複雑性を増加させること、およびグリコシドの混合物の投与によって、プロドラッグ送達の動力学の変化がもたらされ、それによって、薬物の持続放出製剤が提供される。ヒトにおけるカンナビノイドの１次解毒機構は、ＣＢＤおよびＣＢＤＶのＣ７メチル基またはＴＨＣおよびＣＢＮのＣ１１メチル基のＣＹＰ４５０を介したヒドロキシル化であり、カンナビノイドレゾルシノール環のアクセプターヒドロキシル基のグリコシル化は、ＣＹＰ４５０活性部位へのカンナビノイド‐グリコシドの結合を妨げる立体障害に起因して、Ｃ７／Ｃ１１ヒドロキシル化と、後続の身体からの脱離とから保護する。実際、ＣＢＤのヒドロキシル基は、小腸の上皮の解毒シトクロムＰ４５０ ＣＹＰ３Ａ４への結合を容易にすると考えられている（Ｙａｍａｏｒｉ ２０１１）。これらの効果に起因する胃および小腸における分解または代謝の減少は、経口送達の際に、任意のグリコシル化生成物の生物学的利用能の高い総計にもつながり得る。
いくつかの場合において、体内におけるグリコシドからの糖の除去は、化合物がそれらの主要な生物学的活性を発揮するために、必要であり得る。したがって、グリコシドプロドラッグは、それらの主要な生物学的効果が経口吸収の後にのみおこる可能性があることから、濫用に抵抗性のある、安定した薬物調合を可能にし得る。濫用を抑止する化合物のほとんどは、単純に混合または製剤に基づく抑止であるため、単純な物理的および化学的方法によって依然として危険にさらされ得る。一例においては、本明細書中に記載のベータ‐グリコシドは、ベータ‐グリコシダーゼ酵素の作用によってのみアグリコンを放出する。ベータ‐グリコシダーゼは、哺乳類の大腸を占める微生物によって分泌されることが知られており、それによって、経口吸収の際に、グリコシドプロドラッグは、大腸に到達するまでグリコシル化されたままである。グリコシル化による他の化合物の、濫用抵抗性、濫用抑止性、および部位特異的送達のために、同様の手法を用い得る。ステビア レバウディアナに由来するＵＧＴ７６Ｇ１酵素（配列番号１）は、グルコース分子を、糖供与体ＵＤＰ‐グルコース（ＵＤＰＧ）からＣＢＤのヒドロキシル基へと転移させることによって、新規のＣＢＤ‐Ｏ‐グリコシドを生成する（表１、図２および４）。ＵＤＰＧはＵＧＴ７６Ｇ１によって変換され、ＣＢＤ上のヒドロキシル基アクセプター部位によって共有結合されたβ−Ｄ−グルコース残基を生成する。ＵＧＴ７６Ｇ１の触媒効率を改善する目的で、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現のために、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン最適化が実施された（配列番号４および６）。ステビオールグリコシドに対する活性と同様に、ＵＧＴ７６Ｇ１は高度に生産的であり、かつＣＢＤに対する約２４の平衡定数（Ｋｅｑ）を有する。実験および分析によって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＣＢＤ分子へ多数のグルコース部分構造をつける独自の能力を有することが発見された。ＣＢＤをＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＤＰＧとともに、長期にわたってインキュベーションした際に、反応混合物のＨＰＬＣ分析から８つのグリコシド生成物の移動群が見出され、このことから、ＵＧＴ７６Ｇ１は、２次および３次グルコース部分構造によって、１次グルコース残基をグリコシル化するだけでなく、ＣＢＤ上のＣ２’およびＣ６’ヒドロキシル基の両方もグリコシル化することができることが示唆された。ＵＧＴ７６Ｇ１による２次および３次グリコシル化は、そのステビアにおける活性から示唆されるように、レシピエント糖のＣ３ヒドロキシル基においておこり（３→１結合性）、Ｏ‐（３‐１）‐グリコシド、および後続の生成物を生成する。ＣＢＤ‐グリコシド生成物の移動群はまた、ＣＢＤがＵＧＴ７６Ｇ１活性部位に前方および後方の両方からドッキングして、カンナビノイド骨格に対して相対的に、グリコシル化のためのシス様コンフォメーションを創出し得ることを示唆し（図３に示された機構）、またはおそらくＣ１’における結合についての回転自由度（Ｍａｚｕｒ ２００９により記載されたＣ６）により、グリコシル化後にヒドロキシル基が回転することが可能になり、ＵＤＰＧに隣接する他のヒドロキシル基を活性部位に配置し、カンナビノイド骨格上のグリコシル化のためのトランス様立体配座を生成する（図４に示す機構）。ＵＧＴ７６Ｇ１の活性部位における、可能性のあるＣＢＤ分子のドッキングを図６に示し、ここでＣＢＤは、ＵＧＴ７６Ｇ１の二官能性基質であるレバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）の上に重ね合わされる（図６）。
ＣＢＤをＵＧＴ７６Ｇ１によってグリコシル化することに成功したため、グリコシル化活性を試験するために、ＣＢＤＶをＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＤＰＧとともにインキュベートした。ＨＰＬＣ分析に際して、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＤＰＧの両方の追加に依存する４つの追加の生成物ピーク移動群に加えて、ＣＢＤＶの枯渇が観察された。形成された４つの新しい生成物は、ＣＤＢＶと同様の吸収特性を示し、それらは１次グリコシドＣＢＤＶ‐２’‐Ｏ‐グルコピラノシド、ＣＢＤＶ‐６’‐Ｏ‐グルコピラノシド、および２次グリコシドＣＢＤＶ‐２’‐Ｏ‐（３‐１）‐ジグルコピラノシド、およびＣＢＤＶ‐６’‐Ｏ‐（３‐１）‐ジグルコピラノシド（それぞれ、表２のＶＢ２０２、ＶＢ２０６、ＶＢ２０４およびＶＢ２０８の化合物）であると決定された。追加の反応時間によって、より高次のグリコシド生成物もまた生成されたことが決定された。ＣＢＤＶ‐グリコシド生成は、ＵＧＴ７６Ｇ１からのＣＢＤ‐グリコシドと同様であり（表２）、Ｋｅｑが約２４に達するまで進行した。多数のＣＢＤＶ‐グリコシド生成物があることを考慮すると、１次および２次グリコシル化と同様に、ＵＧＴ７６Ｇ１はＣＢＤＶ上のＣ２’およびＣ６’ヒドロキシル基の両方に対して多数のグルコース分子を転移させる。
カンナビノイドΔ９‐ＴＨＣがＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＤＰＧとともにインキュベートされるとき、反応混合物のＨＰＬＣ分析によって、３つの主要な生成物のピーク移動群が示された。３つの生成物は、Δ９‐ＴＨＣ‐１‐Ｏ‐グルコピラノシド、Δ９‐ＴＨＣ‐１‐Ｏ‐（３‐１）‐ジグルコピラノシド、およびΔ９‐ＴＨＣ‐１‐Ｏ‐（３‐１，３‐１）‐トリグルコピラノシドと同定された（正式なピランナンバリング、表３、図７）。Δ９‐ＴＨＣの堅い構造は、Ｃ１’レゾルシノール環への結合の周りでＣＢＤと同じ回転自由度を有さないことから、カンナビノイド骨格は、ＵＧＴ７６Ｇ１の活性部位において認識され、Δ９‐ＴＨＣのＣ１ヒドロキシル基は、ＵＤＰＧ糖供与体に対して位置している（ピランナンバリング、図１Ｂ）。
ＵＧＴ７６Ｇ１は分析した他のすべてのフィトカンナビノイドに対してグリコシル化活性を示すことから、カンナビノール（ＣＢＮ）に対するグリコシル化活性も試験した。Δ９‐ＴＨＣと同様のパターンで、ＵＧＴ７６Ｇ１によるＣＢＮの効果的なグリコシル化が観察され、どちらもレゾルシノール環のＣ１位置において、単一のヒドロキシル受容基を共有していた。ＵＧＴ７６Ｇ１についてみられた活性は、酵素活性部位による幅広いカンナビノイドの認識と一貫している。
代替的なカンナビノイド基質は、それらがカンナビノイド骨格上の同様の位置にヒドロキシル基を持つことを考慮すると、このＵＧＴ７６Ｇ１グリコシル化反応基盤に挿入されて、新規のカンナビノイド‐グリコシドを生成し得る。理想的な候補は、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビジオールヒドロキシキノン（ＣＢＤＨＱ）、ＨＵ‐３３１、Δ８‐ＴＨＣなどのΔ９‐ＴＨＣの他のアイソマー、およびＨＵ‐２１０などのΔ９‐ＴＨＣの合成アナログである。
ＵＧＴ７６Ｇ１の２次３→１グリコシル化活性と同様に、ＵＧＴ７６Ｇ１による１次グリコシル化に続いて、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来するＵＧＴ酵素Ｏｓ０３ｇ０７０２０００（配列番号９）もまた、追加のグルコース構造部分をＵＤＰ‐グルコースから１次糖のＣ２‐ヒドロキシル基の上に転移することができることがわかった（表１〜１１、図７〜９、および１２〜１４）。このグリコシル化活性は、存在する１次グルコース残基上でＣ２‐ヒドロキシル基の２次グリコシル化（２→１結合性）を確立するという点において、ステビオールグルコシドに対するＵＧＴ Ｏｓ０３ｇ０７０２０００の活性と一貫している。この２次グリコシル化は、ＣＢＤＶ（表２、図３）、およびＴＨＣ（表２、図７）において観察され、それぞれ新規のＣＢＤＶおよびΔ９ＴＨＣ‐１‐Ｏ‐（２‐１）‐ジグルコピラノシド種を生成する。幅広い基質認識および反応性と一貫して、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００のこの活性は、図１で同定された残りの基質についてさらに実証された。
ＵＤＰＧ‐依存性のグルコシルトランスフェラーゼ活性に加えて、シクロデキストリン‐グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ、Ｔｏｒｕｚｙｍｅ ３．０Ｌ、ノボザイムズ株式会社の商標）は、α‐（１‐４）‐マルトデキストリン短鎖を、カンナビノイドのヒドロキシル基の上に転移させることが可能である。ＣＧＴアーゼがＵＧＴ７６Ｇ１およびＯｓ０３ｇ０７０２０００によって確立された１次および２次グリコシル化をグリコシル化することもできることにより、β‐Ｄ‐グルコース分子から開始するがα‐Ｄ‐グルコース分子で終わる、β‐プライムド‐α‐グルコシル（β‐ｐｒｉｍｅｄ‐α‐ｇｌｕｃｏｓｙｌ）と称される炭化水素の結合につながる（表１〜１１）。シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを介したマルトデキストリン転移によるα‐グリコシル化は、カンナビノイドに共有結合した１次または２次糖の任意のヒドロキシル基においておこり得る。当業者は、これにより、表１〜１１に列挙された、グリコシドにα‐グリコシル鎖が結合した、任意の数の立体配座が可能となることを理解するだろう。
カンナビノイドの同様のグリコシル化を生成するために、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＯｓ０３ｇ０７０２０００に対して相同性を有する代替的な酵素を用い得る。ＵＧＴ７６Ｇ１に似た、１次グリコシル化を確立するための適切な酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ２またはＵＧＴ７６Ｈ１などの、ＵＧＴ７６クレードの追加のメンバーである。ＵＧＴ７６Ｇ１タンパク質配列を用いたＢＬＡＳＴ結果は、最大ホモロジーが４９％のアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であり、６６％ポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であった（同様のアイデンティティ）。理想的な候補は、ペプチド全長のアイデンティティまたはシミラリティ（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）が低くあり得るが、ＵＤＰＧ触媒部位に隣接した開口部において保存されたアミノ酸配列を有する。この配列は、位置３７９におけるロイシン、およびＳＤＦＧＬＤＱの幅広いペプチド配列によって例示される（ＵＧＴ７６Ｇ１の３７５から３８１のアミノ酸）。Ｏｓ０３ｇ０７０２０００の２次グリコシル化を生成するために適した酵素は、ＵＧＴ９１Ｄ１およびＵＧＴ９１Ｄ２を含むＵＧＴ９１クレードのメンバーである。
本明細書中で実施されるグリコシル化反応は、ヌクレオチド糖供与体としてＵＤＰ‐グルコースを含むが、ＵＧＴの間で交差反応性がいくらかあるため、ＵＤＰ‐グルクロン酸などの代替的なヌクレオチド糖の使用が可能となる。グルクロン酸は、肝臓におけるフェーズＩＩ解毒ＵＧＴによって利用される有力なクレオチド糖であり、かつカンナビノイド‐グルクロニドは、共通の解毒生成物である。炭水化物部分構造を供与して、同様の性質を有する新規のグリコシドを生成するために用いることができる、追加のヌクレオチド糖は、ＵＤＰ‐グルクロン酸、ＵＤＰ‐マンノース、ＵＤＰ‐フルクトース、ＵＤＰ‐キシロース、ＵＤＰ‐ラムノース、ＵＤＰ‐フルオロデオキシグルコースなどを含む。さらに、同じアグリコン骨格の上に多数の種類の残基を含むグリコシドを生成するために、ヌクレオチドも組み合わせて用いることもできる。カンナビノイドおよび本明細書に記載の他の化合物の溶解性および送達をさらに改善するために、代替の戦略は、それらをグリコシル化し、それから追加のリガンドまたは修飾によって、糖部分構造を官能化することを含む。この例は、硫酸化、ミリストイル化、リン酸化、アセチル化などを含む。
エンドカンナビノイド系は、幅広い臨床病理学において役割を担うことが実証され、かつ幅広い臨床病理学に影響を及ぼすことから、最近、激しい研究努力の対象となっている。ＵＧＴ７６Ｇ１は幅広いクラスのフィトカンナビノイドを認識することがわかっていることから、同じ酵素が、ヒトのカンナビノイド受容体によって認識される内在的なシグナル伝達分子である、エンドカンナビノイドを認識およびグリコシル化もするという仮説がたてられた。アラキドノイルエタノールアミド（アナンダミド、ＡＥＡ）、２‐アラキドノイルエタノールアミド（２‐ＡＧ）、１‐アラキドノイルエタノールアミド（１‐ＡＧ）、およびドコサヘキサエノイルエタノールアミド（ＤＨＥＡ、シナプタミド）を含む４つの原型のエンドカンナビノイドを試験した結果、ＵＧＴ７６Ｇ１が効率的にそれぞれのエンドカンナビノイドをグリコシル化することがわかった（表５〜８、図９〜１２）。エンドカンナビノイドのグリコシル化によって、エンドカンナビノイド‐グリコシドおよび他の脂肪酸神経伝達物質‐グリコシドを生成することが可能となり、エンドカンナビノイドの標的化送達の新しい方法を示す。
ＡＥＡ、２‐ＡＧ、１‐ＡＧ、およびシナプタミドなどのエンドカンナビノイドはＵＧＴ７６Ｇ１によってグリコシル化されることから、似たエンドカンナビノイドもまた、ＵＧＴ７６Ｇ１によるグリコシル化の適切な基質となるという仮説がたてられた。ＵＧＴ７６Ｇ１によってグリコシル化されるだろう他のエンドカンナビノイド候補は、オレオイルエタノールアミド（ＯＥＡ）、エイコサペンタエノイルエタノールアミド、プロスタグランジンエタノールアミド、ドコサヘキサエノイルエタノールアミド、リノレノイルエタノールアミド、５（Ｚ），８（Ｚ），１１（Ｚ）‐エイコサトリエン酸エタノールアミド（ミード酸エタノールアミド）、ヘプタデカノールエタノールアミド、ステアロイルエタノールアミド、ドコサエノイルエタノールアミド、ネルボノイルエタノールアミド、トリコサノイルエタノールアミド、リグノセロイルエタノールアミド、ミリストイルエタノールアミド、ペンタデカノイルエタノールアミド、パルミトレオイルエタノールアミド、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、および同様の化合物を含む。これらの糖脂質は、溶解性および薬物動態の性質が改善した、新規のエンドカンナビノイド薬としての薬学的使用から、抗菌剤としての使用、他の糖脂質と似た洗浄剤としての使用に至る、幅広い商業的な使用を有し得る。
ＡＥＡおよびＣＢＤが、カプサイシンの受容体である、ｔｏｌｌ‐様バニロイド受容体タイプ１（ＴＲＰＶ１）のフルアゴニストとして特徴づけられた。さらに、ＣＢＤ、ＣＢＮ、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、ならびにＣＢＤ、ＴＨＣ、およびＣＢＧの様々なプロピルホモログを含むが、これらに限定されない他のカンナビノイドおよび植物抽出物は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰ）に結合し、ＴＲＰに対して活性を有することが実証されている（Ｄｅ Ｐｅｔｒｏｃｅｌｌｉｓ ２０１１）。これは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ２だけでなく、ＴＲＰＶ１の刺激および脱感作、ならびにＴＲＰＭ８の拮抗作用も含む。ＴＲＰＶ１の刺激は血管拡張および炎症をもたらすが、カプサイシンおよびそのアナログは、受容体を刺激剤に対して脱感作させ、かつ強力な抗炎症効果をもたらす（Ｂｉｓｏｇｎｏ ２００１）。類似の効果が、他のＴＲＰに加えてＴＲＰＡ１で生じ得る。ＣＢＤに関しては、これは、カンナビノイド受容体の結合に必要な濃度よりも低い濃度において、かつヒトの臨床試験および使用において典型的に達成される濃度範囲内で起こり得る。ＴＲＰＶ１受容体の直接アゴニスト（ｄｉｒｅｃｔ ａｇｏｎｉｓｔ）として作用することに加えて、ＣＢＤは、エンドカンナビノイドアナンダミドの代謝を促進する原因となる酵素である、脂肪酸アミドヒドロキシラーゼ（ＦＡＡＨ）を阻害することが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ、１９９８；ＤＥ ｅ Ｐｅｔｒｏｃｅｌｌｉｓ ２０１０）。これらのフィトカンナビノイドが多様なＴＲＰのリガンドとして作用することを考慮して、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１を含む、同じＴＲＰの多くの異なるリガンドをグリコシル化することができると仮定された。カプサイシンはＣＢＤ様構造に変形することができる（Ｂｉｓｏｇｎｏ ２００１）ので、カプサイシンはＵＧＴ７６Ｇ１によるグリコシル化のための適切な基質であろうと仮定された。この目的のために、ＵＧＴ７６Ｇ１はヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）に由来するＰａＧＴ３と構造的に同一の方法でカプサイシンのバニロイド部分構造をグリコシル化することができることが示された（Ｎｏｇｕｃｈｉ ２００９）。カプサイシンのグリコシル化された構造がバニロイド頭部であるので、ＵＧＴ７６Ｇ１は、最小のバニロイド、すなわちバニリン、および多くのアナログのグリコシル化が可能であろうとさらに仮定された。この仮説と一致して、ＨＰＬＣ分析により、ＵＧＴ７６Ｇ１がバニリンの複数のグリコシド生成物を生成することが発見された（図１４、表１０）。ＵＧＴ７６Ｇ１がバニロイドをグリコシル化する能力をより広範に試験するために、ターメリックスパイスから発見され、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）ジンジャーから単離された、よく特徴付けられたバニロイドであるクルクミンを、グリコシル化反応の基質として適用した。バニリンのグリコシル化と一致して、ＵＧＴ７６Ｇ１は効率的にクルクミンをグリコシル化し、複数のグリコシド生成物のピークを生じ、このことはＣＢＤおよびステビオールグリコシドでの観察と同様に、ＵＧＴ７６Ｇ１による二官能性認識およびグリコシル化を示唆する（図１５Ａおよび１５Ｂ、表１１）。
カンナビノイドグリコシドはまた、それらのアグリコン形態のプロドラッグの有用性の他に、直接的な生物活性および治療効果もまた有し得る。クエルセチンは野菜中に偏在し、しばしばそのアグリコンおよびグリコシル化形態の両方で存在する抗酸化性フラボノイドである。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける研究により、クエルセチングルクロニドが、アグリコンクエルセチンの前駆体分子としてだけでなく、生物活性剤としてもまた作用することが示されている（Ｔｅｒａｏ ２０１１）。抗菌効果および抗腫瘍効果を発揮するグリコシドを含む多くの場合で、グリコシド残基は活性にとって重要である（ＫｒｅｎおよびＲｅｚａｎｋａ ２００８）。
グリコシドはまた、グルコース輸送体ＧＬＵＴ１によって、血液脳関門（ＢＢＢ）を超える促進された輸送を受けることが実証されている。主要な例は、イブプロフェンのグリコシドが脳内のイブプロフェンアグリコン濃度の有意な増加を達成することである（Ｃｈｅｎ ２００９）。これらのグリコシドと同様に、カンナビノイドおよび本明細書中に記載の他の化合物のグリコシドは、ＢＢＢまたは他のバリアを超える、向上され、促進された送達により、利益を受け得る。グルコース輸送体は、ヒトゲノムにコードされた幅広いグループの膜タンパク質であり、ＢＢＢにおいてだけでなく、脳、赤血球、脂肪、筋肉、腎臓、肝臓、腸および膵臓を含む、多くの異なる細胞および組織を横切って見つかり、よって、グリコシル化は、これらの任意の組織に部位特異的送達を提供するために、調節される。したがって、一実施形態において、本発明に係るカンナビノイドグリコシドプロドラッグを被験者に対して投与する工程を含む、被験者の血液脳関門を超えたカンナビノイド薬の送達を容易にするための方法を提供する。
カンナビノイドおよびカンナビジオールの脳への送達は、オリゴデンドロサイトの保護（オリゴプロテクティブ）および一般的な神経保護効果があることから、特に有用であり得る。カンナビノイドシグナル伝達は、オリゴデンドロサイト分化（Ｇｏｍｅｚ ２０１０）、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の生存の促進（Ｍｏｌｉｎａ‐Ｈｏｌｇａｄｏ ２００２）の両方に関連していることが実証されている。カンナビジオールを主要な成分として含む薬物製剤は、筋肉痙縮、および多発性硬化症に由来する痛み、ミエリンおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞の喪失を引き起こす神経変性症を治療することが承認されている。カンナビジオールの効果は、小胞体ストレス経路の減衰によって、オリゴプロテクティブ効果を媒介することが実証された（Ｍｅｃｈａ ２０１２）。カンナビジオールは、その抗精神病効果についてもよく研究されているが、オリゴデンドロサイトの保護、および再ミエリン化の促進における正確な役割は、まだ説明されていない（Ｚｕａｒｄｉ ２０１２）。髄鞘形成不全が関与していることを示唆する、精神病の臨床症状と神経病理学的分析との間の相関関係にもかかわらず、統合失調症および他の精神症の引き金または原因としての髄鞘形成不全の役割には、議論の余地がある（Ｍｉｇｈｄｏｌｌ ２０１５）。再ミエリン化はまた、アルツハイマー病、および他の形態の痴呆の治療に潜在的に有用であると記述されている（Ｂａｒｔｚｏｋｉｓ ２００４）。したがって、カンナビノイドの脳への送達は、その立証された神経保護、およびオリゴプロテクティブ効果のために、特に有用であり得る。オリゴデンドロサイト前駆体の分化または再ミエリン化などの、修復または再生の他の側面に影響を及ぼす他の薬剤と組み合わせて共投与されるカンナビノイドグリコシド薬物製剤もまた、有益であることが証明され得る。これは、抗‐ＬＩＮＧＯ‐１モノクローナル抗体、グアナベンズ、セフィン１、ベンザトロピン、クレマスチン、多価不飽和脂肪酸などの化合物を含む。
本研究の過程で、ＵＧＴ７６Ｇ１、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００およびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）は、ステビオールグリコシド、ならびにカンナビノイド、エンドカンナビノイド、バニリン、クルクミン、およびカプサイシンを含む多様な化学構造のアグリコン生成物の１次、２次および３次グリコシル化が可能であることが発見された。
Ｄｅｗｉｔｔｅ ２０１６によって記載されたスクリーニングおよび分析方法においては、高溶媒流速と組み合わせた５０ｍｍのＨＰＬＣ分離カラムを使用して、グリコシド生成物の分離および全体的な検出は限定されていた。したがって、多くの化合物についてのグリコシル化反応生成物の解釈は推測にすぎないが、ＵＧＴ７６Ｇ１が広い基質特異性を有するという本知見の意義を依然として強調している。明らかに、本明細書中に記載の研究は、ＵＧＴ７６Ｇ１が、ステビオールグリコシドだけでなく、他の形態のグリコシド、およびカンナビジオールなどの新規のアグリコンもまたグリコシル化することができることを実証する。低溶媒流量と組み合わせた１５０ｍｍ長のＣ１８カラムを含む改善された分離方法を使用した内部研究はまた、２次および３次グリコシドの明確な検出を可能にした。これらの化合物は、Ｄｅｗｉｔｔｅ ２０１６に記載された方法によっては検出することができず、多様な化学構造のグリコシド化合物をグリコシル化するだけでなく、これら同じ化合物のグリコシドについて、多数のより高次のグリコシル化もまた実施する、ＵＧＴ７６Ｇ１の能力の追加の実証を提供する。
本明細書中に記載される反応は、組換え酵素および全ての必要な補因子を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり、植物組織からのカンナビノイドの抽出前にカンナビノイドをｉｎ ｖｉｖｏで生体内変換するために、カンナビス植物の細胞内でＵＧＴ７６Ｇ１酵素の発現をすることが可能である。ＵＧＴ７６Ｇ１は植物ステビア レバウディアナに由来する酵素であることから、カンナビス属における発現に適合性があるだろう。カンナビス植物内でＵＧＴ７６Ｇ１を発現するための理想的な戦略は、ＵＧＴ７６Ｇ１のオープンリーディングフレームを、遺伝子工学的に操作して、カンナビノイドが生産されるのと同じ組織、すなわち植物の分泌毛状突起に特異的なプロモータエレメントの下流にすることである。適切なプロモータエレメントは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来する細胞質Ｏ−アセチルセリン（チオール）リアーゼ（ＯＡＳＡ１）酵素のためのプロモータを含む（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ａｌｃａｌａ ２００５）。ＵＧＴ７６Ｇ１による形質転換の候補は、カンナビス サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、カンナビス インディカ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎｄｉｃａ）、およびカンナビス ルデラリス（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｒｕｄｅｒａｌｉｓ）を含む。他の多くの異なる植物種内におけるグリコシル化二次代謝産物の植物内での生産のために、同様の手法を、ＵＧＴ７６Ｇ１および同様の酵素について用い得、特に、植物種が既に所望のアグリコン生成物または既知の酵素基質を既に大量に生産している場合には、有用であり得る。
フィトカンナビノイドグリコシル化反応を実施する過程で、ＣＢＤおよびＴＨＣは顕著な抗微生物活性を示し、大規模反応混合物が滅菌フィルター装置の破損後に汚染されることを防止しさえした。酵素処理中に基質としてステビオールグリコシドを利用する従来のパイロット規模のグリコシル化反応は、厳格な衛生技術がない場合には感染の影響をかなり受けやすかった。ＣＢＤおよびＴＨＣのパイロット規模の反応は、非常に限定された継続的な維持管理またはケアを伴う同じ反応容器中で１週間以上無菌のままであった。この目的のために、アグリコンカンナビノイドおよびそれらの各グリコシドの、効率的な抗微生物剤としての使用が提案されている。したがって、一実施形態において、有効量の本発明に係るカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含む抗微生物剤を提供する。
同様に、大量のカンナビノイド‐グリコシドの製造および水溶液中での調合に際して、複数のカンナビノイド‐グリコシドが水中で洗剤と同様の発泡特性を有することが観察された。これは、８‐オクチルグリコシド、８‐オクチルチオグリコシドおよびそれらの同類などの他のグリコシド洗浄剤と一致し、洗剤としてのカンナビノイド‐グリコシドの使用の可能性を立証する。したがって、一実施形態において、有効量の本発明に係るカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含む洗浄剤を提供する。
（核酸）
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む核酸を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、１次、２次、３次グリコシル化、またはそれらの組み合わせをすることができる。ある実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、１次、２次、および３次グリコシル化をすることができる。他の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、２次、および３次グリコシル化をすることができる。ある実施形態においては、核酸は、ＵＤＰ‐グルコシルトランスフェラーゼを含むがこれに限定されないグルコシルトランスフェラーゼをコードする。グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７４Ｇ１などのステビア レバウディアナのＵＤＰ‐グルコシルトランスフェラーゼ、またはＯｓ０３ｇ０７０２０００などのイネのグルコシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。スクロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供する。
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、断片、およびそれらのコドン最適化されたバージョンを含むがこれに限定されない、修飾されたバーションを含むが、これらに限定されない。例えば、ヌクレオチド配列は、ピキア パストリスまたは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ．）における発現のためにコドン最適化され得る。核酸は、単離されて、追加のコード配列を組み合わせて（例えば、精製用タグを含むが、それらに限定されない）、グリコシルトランスフェラーゼまたはスクロースシンターゼのコード配列を含み得る。
ある実施形態においては、核酸は、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。ＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ２またはＵＧＴ７６Ｈ１などのＵＧＴ７６Ｇ１クレードの他のメンバーを含む。ある実施形態においては、核酸は、配列番号１、３、５および７のいずれか１つに記載され、以下に列挙されたアミノ酸配列、またはそれらの断片および変異体を有するＵＧＴ７６Ｇ１グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
配列番号１（ＵＧＴ７６Ｇ１（天然タンパク質配列））
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
配列番号３（Ｎ末端に６×ヒスチジンタグを有するＵＧＴ７６Ｇ１）
MHHHHHHGSGENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
配列番号５（Ｎ末端に６×ヒスチジン‐グルタミンタグを有するＵＧＴ７６Ｇ１）
MHQHQHQSGSMENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
配列番号７
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTRASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSHHHHHH
ある実施形態においては、核酸は、ＡＡＲ０６９１２．１に記載されたアミノ酸配列を有するＵＧＴ７６Ｇ１をコードする配列を含む。ある実施形態においては、核酸は、ＵＧＴ７６Ｇ１グリコシルトランスフェラーゼをコードし、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つに記載され、以下に列挙されたヌクレオチド配列、またはそれらの断片および変異体を含む。
配列番号２（ＵＧＴ７６Ｇ１の天然核酸配列）
ATGGAAAATAAAACGGAGACCACCGTTCGCCGGCGCCGGAGAATAATATTATTCCCGGTACCATTTCAAGGCCACATTAACCCAATTCTTCAGCTAGCCAATGTGTTGTACTCTAAAGGATTCAGTATCACCATCTTTCACACCAACTTCAACAAACCCAAAACATCTAATTACCCTCACTTCACTTTCAGATTCATCCTCGACAACGACCCACAAGACGAACGCATTTCCAATCTACCGACTCATGGTCCGCTCGCTGGTATGCGGATTCCGATTATCAACGAACACGGAGCTGACGAATTACGACGCGAACTGGAACTGTTGATGTTAGCTTCTGAAGAAGATGAAGAGGTATCGTGTTTAATCACGGATGCTCTTTGGTACTTCGCGCAATCTGTTGCTGACAGTCTTAACCTCCGACGGCTTGTTTTGATGACAAGCAGCTTGTTTAATTTTCATGCACATGTTTCACTTCCTCAGTTTGATGAGCTTGGTTACCTCGATCCTGATGACAAAACCCGTTTGGAAGAACAAGCGAGTGGGTTTCCTATGCTAAAAGTGAAAGACATCAAGTCTGCGTATTCGAACTGGCAAATACTCAAAGAGATATTAGGGAAGATGATAAAACAAACAAGAGCATCTTCAGGAGTCATCTGGAACTCATTTAAGGAACTCGAAGAGTCTGAGCTCGAAACTGTTATCCGTGAGATCCCGGCTCCAAGTTTCTTGATACCACTCCCCAAGCATTTGACAGCCTCTTCCAGCAGCTTACTAGACCACGATCGAACCGTTTTTCAATGGTTAGACCAACAACCGCCAAGTTCGGTACTGTATGTTAGTTTTGGTAGTACTAGTGAAGTGGATGAGAAAGATTTCTTGGAAATAGCTCGTGGGTTGGTTGATAGCAAGCAGTCGTTTTTATGGGTGGTTCGACCTGGGTTTGTCAAGGGTTCGACGTGGGTCGAACCGTTGCCAGATGGGTTCTTGGGTGAAAGAGGACGTATTGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAAGTGCTAGCTCATGGAGCAATAGGCGCATTCTGGACTCATAGCGGATGGAACTCTACGTTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCTATGATTTTCTCGGATTTTGGGCTCGATCAACCGTTGAATGCTAGATACATGAGTGATGTTTTGAAGGTAGGGGTGTATTTGGAAAATGGGTGGGAAAGAGGAGAGATAGCAAATGCAATAAGAAGAGTTATGGTGGATGAAGAAGGAGAATACATTAGACAGAATGCAAGAGTTTTGAAACAAAAGGCAGATGTTTCTTTGATGAAGGGTGGTTCGTCTTACGAATCATTAGAGTCTCTAGTTTCTTACATTTCATCGTTGTAA
配列番号４（ピキア パストリス（Pichia pastoris）における発現のためにコドン最適化された、配列番号３をコードする配列）
ATGCACCACCATCACCACCATGGTTCTGGTGAAAACAAAACTGAAACTACTGTTAGAAGAAGAAGAAGAATCATTTTGTTTCCAGTACCATTTCAAGGCCATATCAATCCAATTCTTCAATTGGCCAATGTTTTGTACTCCAAAGGATTCTCCATCACCATTTTTCACACCAATTTCAACAAACCAAAGACTTCCAACTATCCTCACTTCACTTTCAGATTTATTTTGGATAATGATCCTCAAGATGAAAGAATTTCCAATCTTCCGACTCATGGTCCTTTGGCTGGTATGAGAATTCCAATCATCAATGAACATGGTGCTGATGAATTAAGAAGAGAATTGGAACTTTTGATGTTGGCTTCTGAAGAAGATGAAGAAGTTTCATGTTTAATCACTGATGCTTTATGGTATTTTGCTCAATCTGTTGCTGATTCTTTGAATTTGCGACGGTTGGTTTTGATGACTTCTTCTTTGTTCAACTTTCATGCTCATGTTTCTTTACCTCAGTTTGATGAACTTGGATATTTGGATCCAGATGACAAAACTAGATTGGAAGAACAAGCTAGTGGGTTTCCTATGTTGAAAGTCAAAGATATCAAATCTGCTTACTCCAACTGGCAAATTCTCAAAGAAATTTTGGGAAAAATGATCAAACAAACAAAAGCTTCTTCTGGAGTCATTTGGAACTCATTCAAAGAATTGGAAGAATCTGAATTGGAAACTGTTATTAGAGAAATTCCTGCTCCAAGTTTTTTGATTCCTTTGCCAAAACATTTGACTGCTTCTTCTTCTTCTTTATTGGATCACGATAGAACTGTTTTTCAATGGTTAGATCAACAACCTCCATCTTCTGTTTTGTATGTTAGTTTTGGATCTACTTCTGAAGTTGATGAAAAAGATTTTTTGGAAATTGCTAGAGGTTTGGTTGATTCCAAACAAAGTTTTTTATGGGTTGTTAGACCAGGATTTGTCAAAGGATCTACTTGGGTCGAACCTTTGCCAGATGGATTTTTGGGAGAAAGAGGAAGAATTGTCAAATGGGTTCCACAGCAAGAAGTTTTGGCTCATGGTGCTATTGGTGCTTTTTGGACTCATTCTGGATGGAACTCTACTTTGGAATCTGTTTGTGAAGGTGTTCCAATGATTTTTTCTGATTTTGGTTTGGATCAACCATTGAATGCTAGATACATGTCTGATGTTTTGAAAGTTGGTGTTTATTTGGAAAATGGGTGGGAAAGAGGTGAAATTGCCAATGCTATTAGAAGAGTCATGGTTGATGAAGAAGGAGAATACATTAGACAAAATGCTAGAGTTTTGAAACAAAAAGCTGATGTTTCTTTGATGAAGGGTGGATCTTCTTATGAATCTTTGGAATCTTTGGTTTCTTACATTTCTTCTCTTTAA
配列番号６（ピキア パストリス（Pichia pastoris）における発現のためにコドン最適化された、配列番号５をコードする配列）
ATGCATCAACATCAACACCAATCTGGATCTATGGAGAACAAGACCGAGACTACAGTTAGAAGAAGAAGAAGAATAATCCTGTTTCCAGTACCATTCCAAGGACACATCAACCCAATCTTGCAGTTAGCAAATGTACTTTATTCTAAAGGCTTTAGTATTACGATTTTTCACACTAATTTTAATAAGCCAAAAACATCCAATTACCCTCACTTCACATTCAGATTTATCTTGGATAACGATCCTCAAGATGAACGTATCTCCAACCTGCCAACACATGGACCATTGGCCGGTATGCGTATTCCTATAATCAACGAGCATGGTGCTGATGAGCTTAGACGTGAACTGGAACTGTTGATGCTGGCATCGGAGGAAGATGAAGAGGTTAGTTGCTTGATAACGGATGCCCTCTGGTATTTCGCACAATCAGTCGCTGACTCCTTGAACCTTAGGAGATTGGTATTGATGACTAGTTCGTTGTTCAACTTCCATGCCCATGTTTCTTTGCCTCAATTTGATGAGCTGGGTTATTTGGATCCTGACGATAAGACTCGTTTAGAAGAACAGGCGTCAGGCTTCCCCATGTTAAAGGTTAAAGATATTAAGTCCGCCTATTCTAACTGGCAAATTCTCAAAGAGATTCTAGGGAAAATGATTAAACAAACCAAGGCCTCTTCAGGAGTAATCTGGAACAGTTTCAAAGAACTAGAAGAATCCGAGTTGGAAACTGTTATTCGTGAAATCCCTGCTCCATCTTTCCTTATCCCATTACCAAAGCACCTCACTGCCTCCTCTAGTTCTCTTCTGGACCATGATAGAACAGTCTTTCAGTGGCTCGATCAGCAACCTCCATCTTCTGTCTTGTACGTTAGTTTTGGTTCCACCTCGGAAGTAGATGAAAAAGACTTTCTGGAAATTGCTCGAGGACTAGTTGACTCCAAGCAATCCTTTCTGTGGGTTGTTAGACCTGGATTCGTAAAAGGATCCACCTGGGTAGAACCCCTCCCAGATGGATTTTTGGGCGAAAGGGGAAGAATTGTTAAATGGGTGCCTCAACAAGAAGTTTTAGCTCATGGGGCCATTGGAGCTTTTTGGACTCATAGTGGATGGAATTCTACCTTAGAATCTGTTTGTGAAGGAGTTCCAATGATTTTTTCTGATTTTGGATTGGATCAGCCTCTTAATGCCAGATATATGTCCGATGTCCTCAAGGTCGGAGTGTACCTGGAAAATGGTTGGGAGAGAGGTGAGATTGCAAATGCTATACGTAGAGTCATGGTTGATGAAGAGGGCGAGTATATTAGACAAAACGCTAGAGTGCTAAAGCAGAAGGCCGATGTTTCCCTTATGAAGGGGGGAAGTTCATATGAGAGTTTGGAATCCCTAGTGTCCTACATTTCTTCGCTATAA
配列番号８（大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、配列番号７をコードする配列）
ATGGAAAATAAAACCGAAACCACCGTCCGTCGCCGTCGTCGTATCATTCTGTTCCCGGTCCCGTTCCAAGGTCACATCAACCCGATTCTGCAGCTGGCCAACGTGCTGTATAGCAAAGGTTTCTCTATCACCATCTTCCATACGAACTTCAACAAACCGAAAACCTCTAACTACCCGCACTTTACGTTCCGTTTTATTCTGGATAACGACCCGCAGGATGAACGCATCAGTAATCTGCCGACCCATGGTCCGCTGGCGGGTATGCGTATTCCGATTATCAACGAACACGGCGCAGATGAACTGCGTCGCGAACTGGAACTGCTGATGCTGGCCTCTGAAGAAGATGAAGAAGTTAGTTGCCTGATCACCGACGCACTGTGGTATTTTGCCCAGAGTGTTGCAGATTCCCTGAACCTGCGTCGCCTGGTCCTGATGACGAGCTCTCTGTTCAATTTTCATGCCCACGTTTCCCTGCCGCAGTTCGATGAACTGGGTTATCTGGACCCGGATGACAAAACCCGCCTGGAAGAACAAGCTTCAGGCTTTCCGATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAAAGTGCGTACTCCAACTGGCAGATTCTGAAAGAAATCCTGGGTAAAATGATCAAACAAACCCGTGCAAGTTCCGGCGTCATCTGGAATTCCTTCAAAGAACTGGAAGAATCAGAACTGGAAACGGTGATTCGCGAAATCCCGGCTCCGTCTTTTCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCGTCATCGAGCTCTCTGCTGGATCACGACCGTACGGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCGCCGAGTTCCGTGCTGTACGTTAGCTTCGGTAGCACCTCTGAAGTGGATGAAAAAGACTTTCTGGAAATCGCTCGTGGCCTGGTTGATTCAAAACAATCGTTCCTGTGGGTGGTTCGCCCGGGTTTTGTGAAAGGCAGCACGTGGGTTGAACCGCTGCCGGATGGCTTCCTGGGTGAACGTGGTCGCATTGTCAAATGGGTGCCGCAGCAAGAAGTGCTGGCACATGGTGCTATCGGCGCGTTTTGGACCCACTCAGGTTGGAACTCGACGCTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTCCCGATGATTTTCTCGGATTTTGGCCTGGACCAGCCGCTGAATGCACGTTATATGAGCGATGTTCTGAAAGTCGGTGTGTACCTGGAAAACGGTTGGGAACGCGGCGAAATTGCGAATGCCATCCGTCGCGTTATGGTCGATGAAGAAGGCGAATATATCCGTCAGAATGCTCGCGTCCTGAAACAAAAAGCGGACGTTAGTCTGATGAAAGGCGGTTCATCGTACGAATCCCTGGAATCACTGGTCTCCTACATTTCTTCTCTGGGCTCGCATCATCATCATCATCATTAA
ある実施形態においては、核酸分子は、ＵＧＴ７６Ｇ１グルコシルトランスフェラーゼをコードし、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３４５９７４．１に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの変異体もしくは断片を含む。
ある実施形態においては、核酸は、ＵＧＴ７６Ｇ２グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。特定の実施形態において、核酸は、配列番号２７に記載され、下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体および断片を有するＵＧＴ７６Ｇ２グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
配列番号２７
MENKTETTVRRRRRIILFPVPVQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDVRISNLPTHGPLTVMRILIINEHGADELQRELELLMLASEEDGEVSCLITDQIWYFTQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKCGFSMWKQGKEIFENITKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFPWLDQQPSRSVLYVSFGSATEVDAKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSAFAFDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGGYIRQNASVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVAYISSL
ある実施形態においては、核酸は、ＵＧＴ７６Ｇ２グルコシルトランスフェラーゼをコードし、配列番号２８に記載され、下に列挙された核酸配列、またはその変異体および断片を有する配列を含む。
配列番号２８
ATGGAAAATAAAACGGAGACCACCGTTCGCCGGCGCCGGAGAATAATATTATTCCCGGTACCAGTTCAAGGCCACATTAACCCAATTCTTCAGCTAGCCAATGTGTTGTACTCCAAAGGATTCAGTATCACCATCTTTCACACCAACTTCAACAAACCCAAAACATCTAATTACCCTCACTTCACTTTCAGATTCATCCTCGACAACGACCCACAAGACGTACGCATTTCCAATCTACCGACTCATGGTCCGCTCACTGTTATGCGGATTCTGATTATCAACGAACACGGAGCTGACGAATTACAACGCGAACTGGAACTGTTGATGTTAGCTTCTGAAGAAGATGGAGAGGTATCGTGTTTAATCACCGATCAGATTTGGTACTTCACGCAATCTGTTGCTGACAGTCTTAACCTCCGACGGCTTGTTTTGATGACAAGCAGCTTGTTTAATTTTCATGCACATGTTTCACTTCCTCAGTTTGATGAGCTTGGTTACCTCGATCCTGATGACAAAACCCGTTTGGAAGAACAAGCGAGTGGGTTTCCTATGCTGAAAGTGAAAGATATCAAGTGTGGTTTTTCGATGTGGAAACAAGGCAAAGAGATATTCGAGAACATTACGAAACAAACAAAAGCATCTTCAGGAGTCATCTGGAACTCATTTAAGGAACTCGAAGAGTCTGAGCTCGAAACTGTTATCCGTGAGATCCCGGCTCCAAGTTTCTTGATACCACTCCCCAAGCATTTGACAGCCTCTTCCAGCAGCTTACTAGACCACGATCGAACCGTTTTTCCATGGTTAGACCAACAACCGTCACGTTCGGTACTGTATGTTAGTTTTGGTAGTGCTACTGAAGTGGATGCGAAAGATTTCTTGGAAATAGCTCGTGGGTTGGTTGATAGCAAGCAGTCGTTTTTATGGGTGGTTCGACCTGGTTTTGTCAAGGGTTCGACGTGGGTCGAACCGTTGCCAGATGGGTTCTTGGGTGAAAGAGGACGTATTGTGAAATGGGTTCCGCAGCAAGAAGTGCTAGCTCATGGAGCAATAGGCGCATTCTGGACTCATAGCGGATGGAACTCTACGTTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCTATGATTTTCTCGGCTTTTGCGTTCGATCAACCGTTGAATGCTAGATACATGAGTGATGTTTTGAAGGTAGGGGTGTATTTGGAAAATGGGTGGGAAAGAGGAGAGATAGCAAATGCAATAAGAAGAGTTATGGTGGATGAAGAAGGAGGATACATTAGACAGAATGCAAGTGTTTTGAAACAAAAGGCAGATGTTTCTTTGATGAAGGGTGGTTCGTCTTACGAATCATTAGAGTCTCTAGTTGCTTACATTTCATCGTTGTAA
ある実施形態においては、核酸は、ＵＧＴ７６Ｈ１グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。特定の実施形態において、核酸は、配列番号２９に記載され、下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体および断片を有する、ＵＧＴ７６Ｈ１グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
配列番号２９
MLQLATYLHSQGISITIAQYPNFNSPDSSNHPELTFLPLSSGNLSVADISGGFFKFIQTLNHNCKPHFREYLVQNMSSDDKESIVIIRDNLMFFAGEIAGELGLPSIILRGSNAVMLTASDIIPQLHQEGRFPPPDSLLQETIPELVPFRYKDLPFIGYPIHQTLEFSITMMTPKSPASAILINTLEFLEQSALTQIRDHYKVPVFTIGPLHKIVTTRSTSILEEDTSCINWLDKQSPKSVVYVSLGSLAKLDEKVASEMACGLAMSNHKFLWVVRPGMVHGFEWVEFLPDSLVGEMKARGLIVKWAPQTTVLAHNAVGGFWSHCGWNSTIECLAEGVPMMCQPFFADQLLNARYVSDVWKTGFEIVIEKGEIACAIKRVLVDEEGEEMRQRAMEIKEKVKIAINDGGSSYDSFKDLVAFISSL
特定の実施形態において、核酸は、ＵＧＴ７６Ｈ１グルコシルトランスフェラーゼをコードし、配列番号３０に記載され、以下に列挙された配列、またはそれらの変異体および断片を有する配列を含む。
ATGCTTCAGCTTGCAACTTACCTCCATTCTCAAGGGATTTCAATAACCATCGCTCAGTACCCCAACTTCAACTCGCCGGATTCTTCCAACCATCCAGAACTAACCTTCCTCCCACTATCCTCCGGCAACTTATCCGTCGCCGACATCTCCGGCGGCTTTTTCAAGTTCATCCAAACTCTTAACCATAACTGCAAACCCCATTTCCGGGAATACCTTGTTCAGAACATGAGTTCTGATGATAAGGAATCAATCGTTATCATCCGTGATAATCTCATGTTTTTCGCCGGAGAAATCGCCGGCGAGCTGGGTCTGCCTTCGATCATTTTACGTGGCAGCAATGCTGTCATGTTGACTGCTAGCGACATCATCCCTCAACTTCATCAAGAAGGTCGTTTTCCGCCACCAGATTCTTTGTTGCAGGAAACAATTCCAGAACTGGTTCCATTCAGATACAAAGATCTACCATTTATTGGCTATCCAATACATCAAACCCTTGAATTTAGTATCACCATGATGACCCCCAAATCACCTGCTTCCGCCATTCTTATCAACACCCTCGAATTTCTTGAACAATCGGCATTAACCCAGATCCGTGATCATTACAAAGTTCCAGTTTTTACAATCGGACCATTGCACAAAATAGTCACAACTCGTTCCACTAGCATTCTTGAAGAAGATACAAGTTGCATCAATTGGTTAGATAAACAATCACCCAAATCAGTGGTTTATGTGAGTTTAGGAAGCTTAGCAAAGTTGGATGAAAAGGTTGCATCTGAAATGGCATGTGGTTTAGCCATGAGTAACCATAAGTTCCTATGGGTGGTTCGACCCGGTATGGTTCATGGGTTTGAATGGGTCGAGTTTTTGCCGGATAGTTTGGTGGGTGAAATGAAGGCTAGAGGTTTGATTGTGAAATGGGCACCCCAGACGACGGTTTTGGCGCATAACGCGGTTGGTGGATTTTGGAGTCATTGCGGTTGGAACTCGACCATAGAATGCTTAGCTGAAGGGGTCCCGATGATGTGTCAACCGTTTTTTGCTGATCAGTTGTTGAATGCTAGGTATGTGAGTGATGTTTGGAAGACGGGTTTTGAGATTGTTATCGAGAAAGGTGAGATTGCGTGCGCGATTAAACGAGTTTTGGTGGATGAAGAAGGCGAAGAAATGAGGCAGAGAGCTATGGAGATTAAAGAAAAGGTTAAAATTGCAATCAACGATGGTGGTTCTTCTTATGACTCGTTCAAGGACTTGGTGGCGTTTATTTCATCACTCTAA
ある実施形態においては、核酸は、イネのＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。Ｏｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ１またはＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＧＴ９１クレードの他のメンバーを含む。ある実施形態においては、核酸は、配列番号９に記載され、以下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を有するＯｓ０３ｇ０７０２０００グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
配列番号９
MHQHQHQSGSMDSGYSSSYAAAAGMHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLASRGHRVSFVSTPRNISRLPPVRPALAPLVAFVALPLPRVEGLPDGAESTNDVPHDRPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVIVDVFHHWAAAAALEHKVPCAMMLLGSAHMIASIADRRLERAETESPAAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTKGSSGMSLAERFSLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPLLSTLRGKPITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLGVEKVHELALGLELAGTRFLWALRKPTGVSDADLLPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGAFLTHCGWNSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKNAGLQVARNDGDGSFDREGVAAAIRAVAVEEESSKVFQAKAKKLQEIVADMACHERYIDGFIQQLRSYKD
ある実施形態においては、核酸分子は、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００グルコシルトランスフェラーゼをコードし、配列番号１０に記載され、以下に詳細を記載したヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
配列番号１０
ATGCATCAGCACCAACATCAGAGCGGTTCTATGGACTCCGGCTACTCCTCCTCCTACGCCGCCGCCGCCGGGATGCACGTCGTGATCTGCCCGTGGCTCGCCTTCGGCCACCTGCTCCCGTGCCTCGACCTCGCCCAGCGCCTCGCGTCGCGGGGCCACCGCGTGTCGTTCGTCTCCACGCCGCGGAACATATCCCGCCTCCCGCCGGTGCGCCCCGCGCTCGCGCCGCTCGTCGCCTTCGTGGCGCTGCCGCTCCCGCGCGTCGAGGGGCTCCCCGACGGCGCCGAGTCCACCAACGACGTCCCCCACGACAGGCCGGACATGGTCGAGCTCCACCGGAGGGCCTTCGACGGGCTCGCCGCGCCCTTCTCGGAGTTCTTGGGCACCGCGTGCGCCGACTGGGTCATCGTCGACGTCTTCCACCACTGGGCCGCAGCCGCCGCTCTCGAGCACAAGGTGCCATGTGCAATGATGTTGTTGGGCTCTGCACATATGATCGCTTCCATAGCAGACAGACGGCTCGAGCGCGCGGAGACAGAGTCGCCTGCGGCTGCCGGGCAGGGACGCCCAGCGGCGGCGCCAACGTTCGAGGTGGCGAGGATGAAGTTGATACGAACCAAAGGCTCATCGGGAATGTCCCTCGCCGAGCGCTTCTCCTTGACGCTCTCGAGGAGCAGCCTCGTCGTCGGGCGGAGCTGCGTGGAGTTCGAGCCGGAGACCGTCCCGCTCCTGTCGACGCTCCGCGGTAAGCCTATTACCTTCCTTGGCCTTATGCCGCCGTTGCATGAAGGCCGCCGCGAGGACGGCGAGGATGCCACCGTCCGCTGGCTCGACGCGCAGCCGGCCAAGTCCGTCGTGTACGTCGCGCTAGGCAGCGAGGTGCCACTGGGAGTGGAGAAGGTCCACGAGCTCGCGCTCGGGCTGGAGCTCGCCGGGACGCGCTTCCTCTGGGCTCTTAGGAAGCCCACTGGCGTCTCCGACGCCGACCTCCTCCCCGCCGGCTTCGAGGAGCGCACGCGCGGCCGCGGCGTCGTGGCGACGAGATGGGTTCCTCAGATGAGCATACTGGCGCACGCCGCCGTGGGCGCGTTCCTGACCCACTGCGGCTGGAACTCGACCATCGAGGGGCTCATGTTCGGCCACCCGCTTATCATGCTGCCGATCTTCGGCGACCAGGGACCGAACGCGCGGCTAATCGAGGCGAAGAACGCCGGATTGCAGGTGGCAAGAAACGACGGCGATGGATCGTTCGACCGAGAAGGCGTCGCGGCGGCGATTCGTGCAGTCGCGGTGGAGGAAGAAAGCAGCAAAGTGTTTCAAGCCAAAGCCAAGAAGCTGCAGGAGATCGTCGCGGACATGGCCTGCCATGAGAGGTACATCGACGGATTCATTCAGCAATTGAGATCTTACAAGGATTGA
ある実施形態においては、核酸分子は、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００グルコシルトランスフェラーゼをコードし、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０１５７７３６５５に記載された配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
ある実施形態においては、核酸は、ＵＧＴ９１Ｄ１グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。ある実施形態においては、核酸は、配列番号３１に記載され、以下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体もしくはその断片を有するＵＧＴ９１Ｄ１グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
配列番号３１
MYNVTYHQNSKAMATSDSIVDDRKQLHVATFPWLAFGHILPFLQLSKLIAEKGHKVSFLSTTRNIQRLSSHISPLINVVQLTLPRVQELPEDAEATTDVHPEDIQYLKKAVDGLQPEVTRFLEQHSPDWIIYDFTHYWLPSIAASLGISRAYFCVITPWTIAYLAPSSDAMINDSDGRTTVEDLTTPPKWFPFPTKVCWRKHDLARMEPYEAPGISDGYRMGMVFKGSDCLLFKCYHEFGTQWLPLLETLHQVPVVPVGLLPPEIPGDEKDETWVSIKKWLDGKQKGSVVYVALGSEALVSQTEVVELALGLELSGLPFVWAYRKPKGPAKSDSVELPDGFVERTRDRGLVWTSWAPQLRILSHESVCGFLTHCGSGSIVEGLMFGHPLIMLPIFCDQPLNARLLEDKQVGIEIPRNEEDGCLTKESVARSLRSVVVENEGEIYKANARALSKIYNDTKVEKEYVSQFVDYLEKNARAVAIDHES
ある実施形態においては、核酸分子は、ＵＧＴ９１Ｄ１グルコシルトランスフェラーゼをコードし、配列番号３２に記載され、以下に詳細を記載したヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
配列番号３２
ATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAAAGCAATGGCTACCAGTGACTCCATAGTTGACGACCGTAAGCAGCTTCATGTTGCGACGTTCCCATGGCTTGCTTTCGGTCACATCCTCCCTTTCCTTCAGCTTTCGAAATTGATAGCTGAAAAGGGTCACAAAGTCTCGTTTCTTTCTACCACCAGAAACATTCAACGTCTCTCTTCTCATATCTCGCCACTCATAAATGTTGTTCAACTCACACTTCCACGTGTCCAAGAGCTGCCGGAGGATGCAGAGGCGACCACTGACGTCCACCCTGAAGATATTCAATATCTCAAGAAGGCTGTTGATGGTCTTCAACCGGAGGTCACCCGGTTTCTAGAACAACACTCTCCGGACTGGATTATTTATGATTTTACTCACTACTGGTTGCCATCCATCGCGGCTAGCCTCGGTATCTCACGAGCCTACTTCTGCGTCATCACTCCATGGACCATTGCTTATTTGGCACCCTCATCTGACGCCATGATAAATGATTCAGATGGTCGAACCACGGTTGAGGATCTCACGACACCGCCCAAGTGGTTTCCCTTTCCGACCAAAGTATGCTGGCGGAAGCATGATCTTGCCCGAATGGAGCCTTACGAAGCTCCGGGGATATCTGATGGATACCGTATGGGGATGGTTTTTAAGGGATCTGATTGTTTGCTTTTCAAATGTTACCATGAGTTTGGAACTCAATGGCTACCTCTTTTGGAGACACTACACCAAGTACCGGTGGTTCCGGTGGGATTACTGCCGCCGGAAATACCCGGAGACGAGAAAGATGAAACATGGGTGTCAATCAAGAAATGGCTCGATGGTAAACAAAAAGGCAGTGTGGTGTACGTTGCATTAGGAAGCGAGGCTTTGGTGAGCCAAACCGAGGTTGTTGAGTTAGCATTGGGTCTCGAGCTTTCTGGGTTGCCATTTGTTTGGGCTTATAGAAAACCAAAAGGTCCCGCGAAGTCAGACTCGGTGGAGTTGCCAGACGGGTTCGTGGAACGAACTCGTGACCGTGGGTTGGTCTGGACGAGTTGGGCACCTCAGTTACGAATACTGAGCCACGAGTCAGTTTGTGGTTTCTTGACTCATTGTGGTTCTGGATCAATTGTGGAAGGGCTAATGTTTGGTCACCCTCTAATCATGCTACCGATTTTTTGTGACCAACCTCTGAATGCTCGATTACTGGAGGACAAACAGGTGGGAATCGAGATACCAAGAAATGAGGAAGATGGTTGCTTGACCAAGGAGTCGGTTGCTAGATCACTGAGGTCCGTTGTTGTGGAAAACGAAGGGGAGATCTACAAGGCGAACGCGAGGGCGCTGAGTAAAATCTATAACGACACTAAGGTGGAAAAAGAATATGTAAGCCAATTCGTAGACTATTTGGAAAAGAATGCGCGTGCGGTTGCCATCGATCATGAGAGTTAA
ある実施形態においては、核酸分子は、ＵＧＴ９１Ｄ２グルコシルトランスフェラーゼをコードする。ある実施形態においては、核酸分子は、配列番号３３に記載され、以下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を有するＵＧＴ９１Ｄ２グルコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
配列番号３３
MATSDSIVDDRKQLHVATFPWLAFGHILPYLQLSKLIAEKGHKVSFLSTTRNIQRLSSHISPLINVVQLTLPRVQELPEDAEATTDVHPEDIPYLKKASDGLQPEVTRFLEQHSPDWIIYDYTHYWLPSIAASLGISRAHFSVTTPWAIAYMGPSADAMINGSDGRTTVEDLTTPPKWFPFPTKVCWRKHDLARLVPYKAPGISDGYRMGLVLKGSDCLLSKCYHEFGTQWLPLLETLHQVPVVPVGLLPPEIPGDEKDETWVSIKKWLDGKQKGSVVYVALGSEVLVSQTEVVELALGLELSGLPFVWAYRKPKGPAKSDSVELPDGFVERTRDRGLVWTSWAPQLRILSHESVCGFLTHCGSGSIVEGLMFGHPLIMLPIFGDQPLNARLLEDKQVGIEIPRNEEDGCLTKESVARSLRSVVVEKEGEIYKANARELSKIYNDTKVEKEYVSQFVDYLEKNARAVAIDHES
ある実施形態においては、核酸分子は、ＵＧＴ９１Ｄ２グルコシルトランスフェラーゼをコードし、配列番号３４に記載され、以下に詳細を記載したヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
配列番号３４
ATGGCCACATCTGACTCTATCGTTGATGACAGAAAACAATTGCATGTTGCTACTTTCCCATGGTTGGCCTTTGGACACATTCTGCCCTACTTGCAATTGTCAAAGCTGATTGCAGAAAAAGGTCATAAGGTGTCCTTTTTGTCTACCACAAGAAACATCCAGAGACTAAGTTCTCATATTTCTCCATTGATTAATGTGGTTCAGTTGACCTTGCCTAGAGTCCAAGAACTTCCCGAAGACGCAGAAGCTACTACTGATGTTCACCCTGAAGATATCCCATATCTAAAGAAGGCATCTGATGGACTTCAACCAGAAGTAACCAGGTTTTTGGAGCAGCACAGTCCTGACTGGATTATCTATGATTATACTCATTACTGGCTTCCATCCATCGCAGCTAGTCTAGGCATTTCCAGAGCTCATTTCTCTGTCACTACCCCATGGGCAATTGCATATATGGGTCCTTCTGCTGATGCAATGATCAACGGTTCTGATGGTAGGACCACTGTTGAAGATTTAACTACACCTCCAAAGTGGTTCCCATTTCCTACTAAAGTTTGTTGGCGAAAACACGATCTGGCACGTTTGGTCCCATATAAGGCTCCAGGTATCTCCGATGGATATCGAATGGGTCTGGTGCTAAAGGGTTCTGATTGTCTGTTATCTAAGTGTTACCACGAATTTGGAACTCAATGGCTTCCTCTATTAGAGACTCTGCATCAAGTTCCAGTTGTTCCTGTCGGTCTGCTACCACCTGAAATTCCCGGTGACGAAAAGGACGAAACTTGGGTTTCCATAAAAAAATGGCTGGATGGTAAGCAGAAGGGTAGTGTTGTATATGTCGCTTTAGGCTCCGAGGTTTTGGTATCCCAGACTGAAGTTGTGGAACTTGCCTTAGGATTGGAGTTGTCCGGTTTGCCATTCGTCTGGGCATATAGAAAGCCAAAGGGACCAGCTAAGTCAGACTCAGTTGAATTGCCAGATGGTTTCGTAGAAAGGACAAGAGACAGAGGATTGGTTTGGACATCATGGGCCCCACAATTGAGAATTCTGAGTCATGAAAGTGTGTGTGGATTCTTGACTCACTGTGGCTCTGGCAGTATTGTTGAAGGACTGATGTTTGGACACCCACTGATAATGTTGCCAATCTTCGGTGACCAACCTCTGAATGCAAGATTGCTGGAGGATAAACAAGTTGGTATCGAAATCCCAAGAAACGAGGAAGACGGCTGCCTGACTAAGGAATCAGTTGCACGTAGTTTAAGATCTGTAGTTGTTGAAAAAGAAGGTGAAATATATAAGGCTAACGCTAGAGAACTTTCAAAGATATACAATGATACCAAGGTGGAGAAAGAATATGTTTCACAGTTTGTGGACTATTTGGAGAAAAACGCTAGAGCCGTTGCTATCGATCACGAATCATAG
ある実施形態においては、核酸は、ステビア レバウディアナのＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１をコードする配列を含む。ある実施形態においては、核酸は、配列番号１３に記載され、以下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含む、ステビア レバウディアナのＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１をコードする配列を含む。
配列番号１３
MAEQQKIKKSPHVLLIPFPLQGHINPFIQFGKRLISKGVKTTLVTTIHTLNSTLNHSNTTTTSIEIQAISDGCDEGGFMSAGESYLETFKQVGSKSLADLIKKLQSEGTTIDAIIYDSMTEWVLDVAIEFGIDGGSFFTQACVVNSLYYHVHKGLISLPLGETVSVPGFPVLQRWETPLILQNHEQIQSPWSQMLFGQFANIDQARWVFTNSFYKLEEEVIEWTRKIWNLKVIGPTLPSMYLDKRLDDDKDNGFNLYKANHHECMNWLDDKPKESVVYVAFGSLVKHGPEQVEEITRALIDSDVNFLWVIKHKEEGKLPENLSEVIKTGKGLIVAWCKQLDVLAHESVGCFVTHCGFNSTLEAISLGVPVVAMPQFSDQTTNAKLLDEILGVGVRVKADENGIVRRGNLASCIKMIMEEERGVIIRKNAVKWKDLAKVAVHEGGSSDNDIVEFVSELIKA
ある実施形態においては、核酸分子は、ステビア レバウディアナのＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１をコードし、配列番号１４に記載され、以下に列挙されたヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
配列番号１４
ATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAATCACCACACGTTCTACTCATCCCATTCCCTTTACAAGGCCATATAAACCCTTTCATCCAGTTTGGCAAACGATTAATCTCCAAAGGTGTCAAAACAACACTTGTTACCACCATCCACACCTTAAACTCAACCCTAAACCACAGTAACACCACCACCACCTCCATCGAAATCCAAGCAATTTCCGATGGTTGTGATGAAGGCGGTTTTATGAGTGCAGGAGAATCATATTTGGAAACATTCAAACAAGTTGGGTCTAAATCACTAGCTGACTTAATCAAGAAGCTTCAAAGTGAAGGAACCACAATTGATGCAATCATTTATGATTCTATGACTGAATGGGTTTTAGATGTTGCAATTGAGTTTGGAATCGATGGTGGTTCGTTTTTCACTCAAGCTTGTGTTGTAAACAGCTTATATTATCATGTTCATAAGGGTTTGATTTCTTTGCCATTGGGTGAAACTGTTTCGGTTCCTGGATTTCCAGTGCTTCAACGGTGGGAGACACCGTTAATTTTGCAGAATCATGAGCAAATACAGAGCCCTTGGTCTCAGATGTTGTTTGGTCAGTTTGCTAATATTGATCAAGCACGTTGGGTCTTCACAAATAGTTTTTACAAGCTCGAGGAAGAGGTAATAGAGTGGACGAGAAAGATATGGAACTTGAAGGTAATCGGGCCAACACTTCCATCCATGTACCTTGACAAACGACTTGATGATGATAAAGATAACGGATTTAATCTCTACAAAGCAAACCATCATGAGTGCATGAACTGGTTAGACGATAAGCCAAAGGAATCAGTTGTTTACGTAGCATTTGGTAGCCTGGTGAAACATGGACCCGAACAAGTGGAAGAAATCACACGGGCTTTAATAGATAGTGATGTCAACTTCTTGTGGGTTATCAAACATAAAGAAGAGGGAAAGCTCCCAGAAAATCTTTCGGAAGTAATAAAAACCGGAAAGGGTTTGATTGTAGCATGGTGCAAACAATTGGATGTGTTAGCACACGAATCAGTAGGATGCTTTGTTACACATTGTGGGTTCAACTCAACTCTTGAAGCAATAAGTCTTGGAGTCCCCGTTGTTGCAATGCCTCAATTTTCGGATCAAACTACAAATGCCAAGCTTCTAGATGAAATTTTGGGTGTTGGAGTTAGAGTTAAGGCTGATGAGAATGGGATAGTGAGAAGAGGAAATCTTGCGTCATGTATTAAGATGATTATGGAGGAGGAAAGAGGAGTAATAATCCGAAAGAATGCGGTAAAATGGAAGGATTTGGCTAAAGTAGCCGTTCATGAAGGTGGTAGCTCAGACAATGATATTGTCGAATTTGTAAGTGAGCTAATTAAGGCTTAA
ある実施形態においては、核酸分子は、ステビア レバウディアナのＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１をコードし、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３４５９８２に記載された配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
他の実施形態において、本発明は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する（ＷＯ国際公報第１９９６／０３３２６７号；米国特許第６２７１０１０号）。
スクロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供する。したがって、ある実施形態においては、核酸は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載され、以下に列挙されたアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むスクロースシンターゼをコードする配列を含む。
配列番号１５（ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）ＳＵＳ１アイソフォーム）
MAERVLTRVHSLRERLDSTLATHRNEILLFLSRIESHGKGILKPHQVMTEFEAICKEDQSKLSDGAFYEVLKCTQEAIVQPPWVALAIRLRPGVWEYVRVNVNVLVVEELSVPEYLHFKEELVNGTSNGNFVLELDFEPFTASFPRPTLTKSIGNGVEFLNRHLSAKMFHDKDSMHPLLDFLRTHHYKGKTMMLNDRIQNLNALQSVLRKASEYLSTLDAATPYSEFEHKFQEIGLERGWGDKAEVVMEMIHMLLDLLEAPDACTLEKFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQENVLGYPDTGGQVVYILDQVPALEREMLKRIKEQGLDIIPRILIVTRLLPDAVGTTCGQRLEKVFGAEHSHILRVPFRTEKGILRKWISRFEVWPYIETFTEDVAKEVTAELQAKPDLIIGNYSEGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKNFEEKYHFSSQFTADLIAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHTAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMGIYYSYTEKEKRLTALHPEIDELLFSSVENEEHLCVLKDKSKPILFTMARLDNVKNLTGLVEWYAKNDRLRELVNLVVVGGDRRKESKDLEEQAQMQKMHELIETYKLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRVIADTRGAFIQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATLHGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQVTELLVNFFEKTKQDPGHWEAISKGGLQRIQEKYTWQIYSDRLLTLAGVYGFWKHVSKLDRLEIRRYLEMFYALKYRKLAESVPLAVDE
配列番号１７（ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）ＳＵＳ２アイソフォーム）
MATSKLSRTHSMRERVEETLSAHRNEIVSLLSRYVAQGKAILQPHQILHELENIIGDVTSRQKLTDGPFGDALKTAQECIVLPPFVALAVRPRPGVWEYVRVDAYQLSVEQLTVSEYLTFKEELVGESNSSLMLELDFEPFNASFPRPTRSSSIGNGVQFLNRHLSSSMFRSKDCLEPLLDFLRTHRHNGHVMMLNDRITSMTRLQSSLVKAEEYLSKLPSDTDYSEFQYELQGMGFERGWGNNAERIIEMMHLLSDILQAPDPSILESFLARIPMVFNVVILSIHGYFGQANVLGLPDTGGQIVYILDQVRALENEMLLKLKHQGLDIKPRILIVTRLIPDAKGTSCNQRLERVSGTEHTHILRVPFRTEKGILRKWISRFDVWPFLEKFTQDAASEISAELHGTPDLIIGNYSDGNLVASLLSYKMGVTQCNIAHALEKTKYPDSDLYWKKFDEKYHFSCQFTADLLAMNNADFIITSTYQEIAGTKNTVGQYESHSSFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFSYTEKEKRLTSLHTTIEKLLFDPTQTEDYIGNLSDKSKPIIFSMARLDHVKNITGLVEWYAKNEKLRGLANLVVVAGYNNVKRSSDREEIAEIEKMHQLIKKYKLDGQMRWISAQTNRAQNGELYRYIADGRGIFVQPAIYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPGEIIENGVSGFHIDPYHPDTASATMADFFQKCKEDPSYWFKISEAGLKRIYERYTWKIYSERLMTLAGVYSFWKYVSKLERRETRRYLEMFYILKFRDLVKSVPVATDDEA
配列番号１９（ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）ＳＵＳ３アイソフォーム）
MATPKLTRTPSMRERLEETLSAHRNDIVSLLSRYVDQGKAILQPHHLLDEIDNFIGDQNCRQKLADSLFGEILKSAQEGIILPPYVTLAVRPRPGVWDFLRVNVDELSVEQLTVSEYLSFKEELVDGQSRNPFVLELDLEPFNATFPRMSRSSSIGNGVQFLNRHLSSIMFRNKDCMDPFLDFLRAHKHKGYAMMLNDRIQTMSRLESSLAKAEDHLSKLPPETPYSEFEYVLQGMGFERGWGDNCERVLGMMHLLSDILQAPDPSILEKFLGKMPMIFNVVVLSIHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYILDQVRSLENEMLLKLRHQGLDIKPKILIVTRLIPNAKGTSCNQRLEKVSGTEYTYILRVPFRTEKGILGKWLSRFDIWPYLEAFTTDAASEIAAELHGVPDLLIGNYSDGNLVASLLSNKLGVTQCNIAHALEKTKYPDSDLYWKKFEDKYHFSCQFTADLLAMNNADFIITSTYQEIAGTKNTVGQYENHSSFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMAIYFSYADKERRLTSLHPTIEKLLFDTEQNDVHIGNINDPSKPMIFTMARLDHVKNITGFVECYAKNNKLREHANLVVIAGYNDAKKSSDREEIAEIEKMHNLIKQYKLDGQMRWISAQTNRARNGEFYRYIADGRGVFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPAEIIEDGVSGFHIDPYHPDKMSTTLADFFQKCKEEPSYWGKISDGGLKRISERYTWKIYSERLMTLAGVYSFWKYVSKLERRETRRYLEMFYILKFRQLVKSVPLAVDEEP
配列番号２１（ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）ＳＵＳ４アイソフォーム）
MASASSSIMKRSESIVDTMPEALKQSRYHMKKCFLKYVEKGIRMMKRHHLIQEMETAIEDKDEKAQLLDGLLGYILCTTQEAAVVPPCVAFAIRPNPGFWEFVKVNSNDLSVDGITATDYLKFKEMIVDETWAKDENALEIDFGSMDFNLPNMSLSCSIGNGVNFTSKFITCKLYAQSSCQQLLVDYLLSLNHQGENLMINDALNSVSKLRAALIVAHASLSSLPNDTPYQSFELRFKEWGFEKGWGDNAERARETIRFLLEVLQAPDPINLEALFSRIPNIFNVVLFSIHGYFGQSNVLGLPDTGGQVVYVLDQVVAMEEELLMRIKQQGLNFKPQILVVTRLLPDAKGTKCNQVLEPVLNTKHSHILRVPFRTDKGVLRKWVSRFDIYPYLENFTQDASAKIIEMMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLMANKLGTTLGTIAHALEKTKYEDSDMNWKQFDPKYHFSCQFTADMIAMNSADFIITSTFQEIAGSKDRPGQYESHEAFTLPGLYRVVSGINVFDPKFNIASPGADQTVYFPYTETKKRFTAFQPAIEELLFSKVENEEHIGYLEDKTKPIIFSMARLDTVKNITGLTEWFGENKRLRSLVNLVIVAGFFDPSKSKDREEMAEIKKMHLLIEKYQLKGQIRWIAAQTDKNRNSELYRFIADSKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFQIDPNFGDQSSNKIADFFQKCKEDPGYWNNISEGGLKRIYECYTWKIYANKVLNMGNIYSFWKRLNKEQKEAKQRYIELFYNLHYKNLVRTVPIASDEAQPAPVSRAKLATQPTRRTQSRLQRLFGA
配列番号２３（ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）ＳＵＳ５アイソフォーム）
MAASSSPIMKRSESVLDTMPEALRQSRYHMKKCFLKYVGKGKRMVKLHHLMQEMETVIEDKDEKAQLLEGLLGYILCTTQEAAVVPPYVAFAIRPNPGFWEFVKVNSNDLSVKGITSTDYLKFKEMIVDETWANDENALEIDFGAMDFNLPTMSLSSSIGNGVNFTSKFIISKLYAHSGSQLQSLVDYLLSLNHQGEKLMINDKLNTVSKLQAALIVAHSFLSSLPNDTPYQSFELRFKEWGFEKGWGDYAERVQETIRFLLEVLQAPDPVNLEAFFSRVPNIFNIVLFSIHGYFGQSNVLGLPDTGGQVVYVLDQVVAMEEELLLRIKQQGLSFKPHILVVTRLLPDAKGTECSQVLEPVLNTKHSHILRVPFRTEKGVLRKWVSRFDIYPYLEKFTQDASAKITEMMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLMANKLGSTLGTIAHALEKTKYEDSDMKWKHLDTKYHFSCQFTADMIAMNSADFIITSTFQEIAGSKDRPGQYESHEAFTLPGLYRVVSGINVFDPKFNIASPGADQTVYFPYTETPKRFTTFQPAIQELLFSKVENDEHIGYLEDKNKPIIFSMARLDMVKNITGLTEWFGENKRLRSLVNLVIVAGFFDPSKSKDREEMEEIKKMHLLIEKYELKGQIRWIVAQTDKNRNSELYRCIADSKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFQIDPNYGDESSNKIADFFQKCKQDPGYWNRISDGGLMRIYECYTWKIYANKVLNMGNIYTFWKQLNKEQKDAKQRYIELFYNQHYKNLVRTVPIVSDEDDQVTRAKPATQPSTRRTQSALQRLLGA
配列番号２５（ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）ＳＵＳ６アイソフォーム）
MDFGIAETLAEALKQNRYHARRCFERFTSRGKRMVKPQELLHMIEKTIDDKLERTKVLEGSMGQILSSTQEAIVIPPYVILGLRANPGQWAYVKINADDVTVESLTPSQYLKFKESIYDQEWAKDENALELDFGAFDFDTPRLILPSSIGNGLGYISKFMTSRIGGDLENAKPLLDHLLALKYHGEKLMINETIDTVSKLQKALIVADVYLSAHPKDEQYQTLEPKLKEWGFEKGWGDTAERVRETMKMLSEILQAPDPINMQSFFSRLPVVFNIVIFSIHGYFGQSDVLGLPDTGGQVVYILDQVKALEEEILLRIKMQGLNAKPRILVVSRLIPDAQGTKCNEEMEPILNTMHSHILRVPFRTSKGVVPQWVSRFDIYPYLERFSQDAASKILEVMECKPDLILGNYTDGNIVASLIAKKFGVTQGTIAHALEKTKYEDSDVNWKNFEKKYHFSCQFTADLISMNAADFIITSTYQEIVGSKQRPGQYETHGAFSMPGLCRVVSGINVFDPKFNIASPGAEQSVYFPYTEKEKRLTDFHPAIKELLFNEQDNDEHMGYLADVTKPIIFSMARLDTVKNITGLTEWFGKNKRLRSLVNLVVVAGFFDPSKSKDREEMEEIKKMHELIEKYKLKGQMRWIAAQNDRTRNGELYRCISDTKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPVNGDESSNKIADFFTKCKVDGEYWDRVSQAGLQRIYECYTWKMYANKALNMGSMYGFWRQLNKETKQAKQRYIDILYNLQFKNLAKTIEIPDFVTPKLQEPVKTEPTKPLQEARPREPVQKLVPEETRLPKLELTKLGQPNLMSNARKPLIVLVSVLIVAYASKNLYRRYFK
ある実施形態においては、核酸分子は、スクロースシンターゼをコードし、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、または２６に記載され、以下に列挙された配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含む。
配列番号１６（ＳＵＳ１アイソフォームをコードする）
ATGGCGGAACGTGTACTCACTCGTGTTCACAGTCTTCGTGAGCGTCTCGATTCAACTCTCGCAACTCATCGTAATGAAATCCTCTTGTTTCTTTCAAGGATTGAAAGCCATGGAAAAGGAATATTGAAGCCTCATCAAGTTATGACTGAATTTGAAGCTATCTGCAAAGAAGATCAGAGCAAACTCTCTGATGGTGCTTTTTATGAAGTTCTTAAATGCACACAGGAAGCAATAGTGCAACCTCCATGGGTTGCACTCGCGATCCGTCTTCGACCCGGTGTTTGGGAATATGTTAGAGTCAATGTTAATGTTTTGGTGGTTGAAGAATTAAGTGTTCCTGAATATCTTCACTTCAAAGAAGAATTGGTTAATGGAACATCGAATGGCAACTTCGTGTTGGAACTGGATTTTGAACCTTTTACCGCATCGTTTCCTCGACCAACTTTAACCAAGTCTATTGGTAATGGTGTTGAGTTTCTAAACAGACATTTATCTGCTAAAATGTTTCATGATAAGGATAGCATGCACCCTCTTCTTGATTTCCTACGGACTCACCACTATAAGGGAAAGACAATGATGTTGAATGATAGAATCCAAAACCTCAATGCTCTACAATCGGTGTTGCGAAAGGCGTCAGAGTACTTATCAACACTCGACGCAGCAACACCGTACTCTGAGTTTGAACATAAGTTTCAAGAAATCGGGTTGGAGAGAGGTTGGGGTGATAAAGCGGAGGTCGTAATGGAGATGATCCACATGCTTCTAGACCTTCTAGAAGCACCCGACGCATGCACACTCGAGAAGTTTCTCGGAAGAATCCCAATGGTTTTCAATGTTGTCATTCTTTCGCCTCACGGCTACTTCGCCCAAGAAAATGTGTTGGGATATCCCGACACTGGCGGTCAGGTTGTTTACATCTTGGATCAAGTTCCCGCTCTGGAACGCGAGATGCTCAAAAGGATTAAGGAGCAAGGACTCGATATCATTCCTCGTATATTGATTGTTACGAGGCTTCTTCCCGACGCGGTTGGGACCACATGCGGGCAACGTTTAGAGAAAGTGTTTGGAGCCGAACACTCGCATATTCTTCGGGTCCCGTTTAGAACCGAAAAGGGTATTCTTCGTAAATGGATCTCTCGTTTTGAGGTGTGGCCTTACATCGAGACTTTCACCGAGGATGTTGCTAAAGAAGTTACAGCAGAGTTGCAAGCAAAACCAGATTTGATCATTGGAAACTATAGTGAAGGAAATTTGGTTGCATCTTTGCTAGCTCACAAGTTGGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTTTGGAGAAAACTAAATACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAACTTTGAGGAGAAATATCATTTCTCTTCGCAGTTTACCGCTGATCTTATCGCTATGAACCATACCGACTTCATCATCACCAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGTAAGGACACGGTTGGACAGTACGAGAGTCATACCGCGTTCACAATGCCGGGATTGTATCGGGTGGTTCACGGGATCGATGTTTTTGACCCCAAATTCAATATTGTTTCACCCGGGGCCGATATGGGAATTTACTACTCGTATACCGAGAAAGAAAAGAGGCTCACTGCGCTTCACCCTGAAATCGATGAACTTCTCTTTAGTTCCGTCGAAAACGAAGAACACTTATGTGTGTTGAAGGATAAGAGTAAACCAATCTTGTTCACAATGGCGCGATTGGATAATGTGAAGAATTTAACCGGACTGGTTGAATGGTACGCTAAAAACGACCGCCTTCGTGAGCTCGTGAACCTCGTGGTCGTCGGTGGTGACCGAAGGAAAGAGTCGAAAGATCTTGAAGAACAAGCTCAGATGCAGAAGATGCATGAACTTATCGAAACCTACAAACTCAACGGTCAGTTCAGGTGGATATCCTCACAAATGAACCGCGTGAGGAACGGTGAGTTGTATCGCGTTATTGCTGACACACGAGGTGCGTTTATCCAGCCTGCGTTTTACGAGGCGTTTGGGTTGACGGTTGTGGAGGCCATGACTTGTGGCCTGCCGACATTCGCGACACTTCATGGTGGGCCCGCTGAGATTATTGTTCACGGGAAATCCGGGTTCCATATTGACCCGTATCACGGTGACCAGGTCACCGAGTTGCTGGTCAATTTCTTTGAGAAAACTAAACAAGACCCGGGTCATTGGGAGGCCATTTCCAAGGGTGGTCTGCAACGTATTCAGGAGAAATACACGTGGCAGATTTATTCAGATAGGTTGTTGACGCTTGCCGGAGTTTATGGATTCTGGAAGCATGTGTCGAAGCTTGACAGGCTCGAGATCCGTCGTTATCTTGAAATGTTTTACGCGCTCAAGTATCGCAAACTGGCTGAATCTGTTCCATTGGCTGTTGATGAGTGA
配列番号１８（ＳＵＳ２アイソフォームをコードする）
ATGGCGACAAGTAAGTTGAGCAGAACGCATAGTATGCGTGAGCGTGTTGAAGAAACTCTTTCCGCTCATCGCAACGAAATCGTTTCTCTTCTTTCTAGGTATGTGGCTCAGGGGAAGGCGATATTGCAGCCGCATCAGATACTCCATGAACTTGAGAATATCATCGGTGATGTTACTTCGCGCCAAAAGCTTACAGATGGTCCGTTTGGAGATGCGTTGAAGACAGCACAGGAATGTATAGTTCTACCTCCATTTGTAGCTTTAGCAGTTCGTCCAAGACCTGGTGTTTGGGAATACGTGCGCGTGGATGCATATCAACTAAGTGTGGAACAACTAACTGTTTCAGAGTATCTTACCTTCAAAGAAGAACTTGTTGGAGAGTCTAATAGTTCTTTAATGCTCGAGTTGGATTTTGAGCCATTTAATGCTTCGTTTCCTAGACCAACCCGTTCTTCATCCATTGGCAATGGAGTTCAGTTCCTGAATCGCCACCTGTCGTCAAGCATGTTTCGCAGCAAAGATTGTTTAGAACCGCTTCTGGATTTCCTACGCACACACAGACATAATGGACATGTAATGATGTTAAATGACCGCATAACAAGCATGACTAGACTTCAATCTTCTTTGGTCAAAGCAGAGGAATATCTTTCTAAACTACCATCTGATACAGACTACTCTGAGTTTCAATATGAATTGCAAGGAATGGGTTTTGAAAGAGGATGGGGAAACAATGCTGAAAGAATCATTGAGATGATGCATCTTCTCTCAGACATTCTACAAGCTCCAGATCCTTCCATTTTGGAATCTTTTCTTGCTAGAATACCTATGGTGTTTAATGTTGTTATATTATCAATACATGGCTACTTTGGGCAAGCAAATGTTTTGGGTTTGCCAGATACTGGTGGCCAGATTGTATATATATTGGATCAAGTCCGTGCATTGGAAAATGAGATGCTTCTTAAATTAAAGCACCAAGGACTGGATATCAAACCTAGGATTCTGATTGTGACTCGGTTAATACCTGATGCAAAAGGTACTTCATGTAACCAACGACTGGAAAGAGTCAGTGGAACTGAACACACACATATACTTCGTGTTCCTTTTAGAACCGAGAAAGGAATTCTTCGTAAATGGATCTCAAGGTTTGATGTATGGCCTTTTTTGGAGAAATTTACACAGGATGCAGCAAGTGAAATTTCTGCTGAGTTGCATGGTACTCCAGATCTTATAATTGGAAATTATAGTGATGGCAATCTTGTTGCCTCTTTATTATCTTACAAAATGGGAGTAACCCAGTGTAACATTGCTCATGCTTTAGAGAAAACAAAGTATCCAGATTCTGATTTATATTGGAAGAAATTTGATGAGAAATATCACTTTTCTTGTCAATTTACTGCTGATCTTTTAGCCATGAACAATGCAGATTTTATCATCACCAGCACATACCAAGAAATCGCGGGAACGAAAAATACTGTCGGACAATACGAGAGTCATTCGTCTTTCACTCTCCCGGGGCTCTACAGGGTTGTTCATGGTATTGACGTTTTTGACCCTAAGTTCAACATTGTGTCTCCAGGGGCAGATATGTCTATATACTTCTCATACACCGAGAAGGAAAAAAGACTTACATCTCTTCATACTACAATTGAGAAGTTATTGTTTGACCCTACACAAACTGAAGATTACATTGGAAATCTGAGTGATAAATCAAAACCGATAATTTTTTCAATGGCAAGACTTGATCATGTGAAGAACATTACGGGTCTGGTTGAGTGGTACGCTAAGAATGAGAAGCTTAGAGGACTAGCAAACCTTGTTGTGGTTGCTGGTTATAATAATGTGAAGAGGTCTAGTGACAGAGAAGAAATTGCAGAAATTGAAAAAATGCATCAACTTATTAAGAAATACAAATTAGATGGTCAGATGAGATGGATTTCAGCACAAACAAACCGCGCACAAAATGGTGAACTTTATCGCTATATTGCTGATGGAAGGGGAATCTTTGTACAGCCCGCTATTTATGAAGCTTTTGGGCTGACAGTGGTGGAGGCCATGACTTGTGGGCTTCCAACATTTGCAACTTGCCATGGTGGGCCAGGAGAGATAATTGAAAATGGTGTTTCGGGCTTCCATATCGACCCGTATCATCCGGATACTGCATCAGCCACAATGGCTGATTTTTTTCAGAAATGCAAGGAGGACCCGAGTTATTGGTTCAAGATATCTGAAGCAGGGCTTAAAAGAATATATGAAAGGTACACATGGAAAATTTACTCTGAACGGTTGATGACATTAGCTGGAGTTTATAGCTTCTGGAAGTATGTCTCGAAACTTGAGAGACGTGAAACAAGACGATATCTTGAGATGTTTTATATTCTTAAGTTCCGTGATCTGGTAAAATCTGTTCCAGTGGCTACTGATGATGAGGCTTAG
配列番号２０（ＳＵＳ３アイソフォームをコードする）
ATGGCGACACCTAAGCTTACGCGAACACCAAGCATGCGAGAGCGTCTTGAAGAAACTTTATCAGCTCATCGCAACGATATCGTCTCTCTTCTTTCCAGGTATGTAGATCAAGGTAAGGCCATATTGCAGCCCCACCACCTACTTGACGAAATCGATAACTTCATCGGAGATCAAAATTGCCGCCAAAAGCTTGCTGATAGTCTATTCGGTGAAATCCTCAAGTCCGCACAGGAAGGTATAATTCTTCCTCCATATGTAACGCTTGCTGTTCGTCCAAGACCTGGTGTTTGGGACTTTTTGCGTGTGAATGTCGATGAATTGAGTGTCGAGCAACTTACTGTTTCTGAGTATTTAAGCTTCAAGGAGGAGCTTGTAGATGGCCAGAGTAGGAACCCGTTTGTGTTGGAACTGGATCTGGAACCGTTTAATGCAACATTTCCCCGGATGTCACGATCTTCATCCATCGGCAATGGAGTTCAGTTTCTCAACCGTCATCTCTCGTCAATTATGTTTCGCAACAAAGATTGTATGGATCCGTTTCTTGATTTCCTTCGTGCTCATAAACATAAAGGATACGCGATGATGTTGAATGATCGGATACAAACAATGTCTAGACTTGAATCTTCTTTAGCAAAAGCGGAGGATCATCTCTCTAAACTACCACCCGAAACACCGTACTCCGAATTCGAATACGTATTGCAAGGAATGGGGTTTGAAAGAGGTTGGGGGGATAATTGTGAAAGAGTTCTTGGTATGATGCATCTTCTTTCTGACATTCTTCAAGCTCCAGATCCTTCGATTCTTGAAAAGTTTCTTGGAAAGATGCCGATGATCTTCAATGTTGTTGTGTTATCGATTCATGGTTACTTTGGTCAGGCTAATGTTTTGGGTTTGCCGGATACCGGTGGTCAGGTTGTATATATATTGGATCAAGTACGTTCTTTGGAGAATGAAATGTTACTTAAATTAAGGCATCAAGGACTTGATATCAAACCCAAGATTCTAATTGTAACTCGATTGATACCAAATGCCAAAGGTACTTCATGCAACCAACGATTGGAGAAAGTAAGTGGAACCGAATACACGTATATATTACGTGTCCCTTTTAGGACAGAGAAAGGGATTCTTGGTAAATGGTTATCAAGGTTTGATATATGGCCTTATTTGGAGGCGTTTACAACGGATGCAGCAAGTGAAATTGCTGCTGAGTTACACGGTGTTCCGGATCTTTTAATAGGAAACTACAGTGATGGGAATCTCGTTGCCTCCTTGCTATCTAACAAATTGGGCGTAACCCAGTGCAACATTGCACACGCGTTAGAGAAAACAAAGTATCCAGATTCCGACTTATATTGGAAGAAATTTGAGGACAAATATCACTTTTCATGTCAATTTACCGCCGACCTTCTAGCAATGAACAATGCAGATTTTATCATCACTAGCACATACCAAGAGATTGCAGGAACGAAAAACACCGTTGGACAATACGAGAATCATTCATCGTTCACTCTTCCGGGTCTATACAGGGTTGTTCACGGTATCGATGTCTTTGACCCGAAGTTCAACATCGTGTCACCAGGGGCAGATATGGCAATTTACTTCTCATATGCCGATAAAGAGAGACGACTTACATCTCTACATCCCACAATTGAGAAGCTATTGTTCGACACTGAGCAGAACGATGTACACATTGGAAATATAAATGACCCGTCTAAACCCATGATTTTCACAATGGCGAGGCTTGATCATGTGAAGAATATAACTGGATTCGTCGAGTGTTATGCTAAAAATAATAAGTTGAGGGAACACGCAAATCTTGTGGTTATTGCTGGTTATAATGACGCGAAGAAATCAAGTGATCGAGAAGAAATTGCGGAAATTGAAAAGATGCATAATCTTATCAAGCAATACAAACTTGATGGTCAGATGAGATGGATATCAGCCCAAACAAACCGGGCCCGAAATGGGGAATTTTATCGGTATATCGCTGATGGTAGGGGCGTTTTCGTCCAGCCCGCTTTCTATGAAGCATTTGGGCTTACGGTTGTGGAGGCGATGACATGTGGGCTCCCAACATTTGCCACGTGTCATGGTGGGCCTGCTGAGATCATTGAGGATGGTGTGTCGGGGTTCCATATTGATCCATATCATCCTGATAAGATGTCGACTACGTTAGCTGATTTTTTTCAAAAGTGCAAAGAGGAACCTAGTTACTGGGGTAAAATATCCGATGGCGGGCTGAAAAGAATAAGTGAAAGGTACACATGGAAGATATATTCGGAACGGTTGATGACGTTGGCGGGCGTATATAGCTTTTGGAAATATGTGTCAAAACTCGAGAGGCGTGAAACCCGTCGATACCTTGAGATGTTCTACATTTTAAAGTTTCGTCAACTGGTGAAGTCGGTTCCGCTAGCTGTTGATGAGGAGCCGTAA
配列番号２２（ＳＵＳ４アイソフォームをコードする）
ATGGCATCTGCTTCAAGTTCTATCATGAAACGGTCTGAATCAATAGTTGACACCATGCCAGAAGCCTTAAAGCAGAGCCGCTATCATATGAAAAAATGTTTTCTAAAATATGTAGAAAAAGGAATTCGCATGATGAAAAGACATCATTTGATACAAGAAATGGAGACCGCAATTGAAGACAAGGATGAAAAGGCTCAGCTTCTAGATGGCTTACTTGGCTACATCTTGTGCACAACTCAGGAAGCAGCCGTTGTTCCTCCTTGTGTTGCATTTGCTATAAGACCGAATCCTGGATTCTGGGAGTTTGTTAAAGTCAACTCTAATGATCTATCGGTTGATGGGATAACTGCCACAGATTACTTGAAGTTCAAGGAAATGATCGTAGATGAGACATGGGCTAAAGATGAAAATGCATTGGAGATTGACTTTGGATCGATGGACTTTAACCTACCAAACATGAGTTTATCTTGTTCGATTGGAAATGGTGTTAACTTCACATCAAAATTCATTACTTGTAAACTTTACGCACAATCTAGTTGCCAACAACTGCTTGTTGATTACTTGCTCTCATTGAATCATCAAGGAGAAAATCTTATGATCAATGATGCATTAAACTCAGTCTCAAAACTTCGAGCGGCTTTAATTGTAGCTCATGCGTCGCTATCTTCGTTGCCCAACGATACTCCATATCAAAGCTTCGAGCTTAGATTCAAAGAATGGGGATTTGAGAAGGGATGGGGAGATAACGCGGAACGCGCGAGGGAAACAATTCGGTTTCTTTTGGAGGTTCTTCAAGCACCCGATCCGATAAACCTCGAGGCTTTATTCAGCAGGATTCCAAACATATTCAACGTTGTTTTATTCTCGATTCATGGGTATTTTGGTCAATCCAATGTTCTTGGATTGCCCGATACTGGTGGCCAAGTGGTTTATGTTTTGGATCAAGTGGTAGCTATGGAAGAAGAACTACTCATGAGGATCAAACAACAAGGACTCAACTTCAAGCCTCAAATTCTTGTGGTGACCCGACTTCTTCCTGATGCTAAAGGGACCAAGTGTAATCAGGTGTTGGAACCAGTTCTGAACACGAAACATTCGCATATTCTTAGGGTTCCATTCAGGACTGATAAAGGTGTTCTTCGTAAATGGGTATCTCGATTTGATATCTATCCATATCTCGAAAACTTCACTCAGGATGCAAGTGCGAAAATCATTGAAATGATGGAAGGGAAACCGGATCTTATCATCGGAAACTATACCGATGGAAACCTTGTTGCATCACTCATGGCTAACAAACTCGGAACGACATTGGGAACAATTGCACATGCTTTGGAGAAAACCAAATACGAAGATTCAGACATGAATTGGAAGCAATTCGACCCAAAATATCACTTCTCCTGCCAATTTACAGCCGATATGATTGCAATGAACTCAGCTGATTTCATCATCACAAGTACTTTCCAAGAAATCGCTGGAAGTAAAGATAGACCCGGACAATATGAAAGCCATGAAGCATTTACACTTCCAGGATTATACAGAGTTGTTTCAGGCATCAACGTGTTCGATCCCAAATTCAATATCGCGTCTCCAGGAGCCGATCAAACCGTTTATTTCCCGTACACCGAAACAAAGAAACGATTCACTGCATTTCAACCCGCCATAGAGGAATTACTCTTCAGTAAAGTTGAAAACGAAGAACACATTGGATACTTAGAAGACAAAACCAAACCGATCATATTCTCAATGGCGCGTCTCGACACAGTTAAGAACATAACAGGACTAACCGAATGGTTTGGAGAGAACAAACGGCTCCGAAGCTTGGTTAATCTTGTAATCGTGGCGGGTTTCTTTGACCCGTCAAAGTCAAAAGACAGAGAAGAAATGGCGGAAATAAAGAAAATGCATTTATTGATTGAAAAATATCAGCTTAAAGGTCAAATAAGATGGATTGCTGCACAAACTGATAAGAACCGAAACAGTGAGCTTTACCGGTTTATTGCTGACTCAAAAGGCGCGTTTGTGCAGCCCGCTTTGTATGAGGCGTTTGGGCTCACGGTTATTGAGGCGATGAACTGTGGTTTACCGACTTTTGCAACTAATCAAGGTGGTCCAGCTGAGATTATCGTTGATGGTGTTTCTGGGTTCCAGATTGATCCTAATTTTGGTGATCAGTCTAGTAATAAGATTGCTGATTTCTTCCAGAAGTGTAAGGAAGATCCTGGTTATTGGAATAATATTTCAGAAGGCGGTTTGAAGCGTATATACGAATGTTATACTTGGAAGATTTATGCGAATAAAGTGTTGAATATGGGGAACATATACTCGTTTTGGAAGCGGTTAAACAAGGAACAAAAAGAAGCAAAACAAAGATACATTGAACTATTCTACAATCTACACTACAAGAACTTGGTTAGGACTGTACCAATTGCTAGTGATGAAGCTCAACCTGCACCAGTGTCAAGGGCAAAACTTGCAACACAACCCACAAGACGTACGCAATCCAGGTTGCAAAGGCTGTTTGGAGCTTAA
配列番号２４（ＳＵＳ５アイソフォームをコードする）
ATGGCAGCTTCTTCAAGTCCCATTATGAAACGGTCTGAGTCAGTACTCGACACCATGCCAGAAGCTTTGAGGCAAAGTCGGTATCATATGAAAAAATGCTTTCTAAAATATGTAGGGAAAGGAAAGCGGATGGTGAAACTCCACCATTTGATGCAAGAAATGGAGACCGTCATTGAGGACAAGGACGAAAAGGCTCAGCTCTTGGAAGGCTTACTTGGTTACATCTTGTGCACCACTCAGGAAGCAGCAGTTGTTCCTCCTTATGTCGCCTTTGCAATAAGGCCAAACCCTGGATTTTGGGAGTTTGTTAAAGTCAACTCTAATGATCTCTCGGTTAAAGGGATCACTTCCACCGATTACTTGAAGTTCAAGGAAATGATCGTTGACGAAACATGGGCTAATGATGAAAATGCATTGGAGATCGACTTTGGAGCAATGGACTTTAACTTGCCAACAATGAGCTTATCTTCTTCAATTGGAAATGGAGTTAACTTCACATCAAAGTTTATTATTTCTAAACTTTATGCTCATTCTGGCAGCCAATTACAATCTCTAGTTGATTACTTACTTTCATTAAATCATCAAGGAGAAAAACTTATGATAAATGACAAACTAAACACAGTTTCAAAACTTCAAGCCGCTCTAATAGTAGCTCATTCTTTCCTTTCTTCATTGCCCAACGACACACCGTATCAAAGCTTTGAACTTAGATTTAAAGAGTGGGGTTTTGAAAAAGGATGGGGAGATTATGCAGAAAGGGTGCAAGAAACAATTCGGTTTTTGTTGGAGGTTCTTCAAGCACCCGACCCCGTAAACCTAGAGGCCTTTTTTAGCAGGGTTCCAAACATATTCAATATTGTTTTATTCTCGATTCATGGGTATTTTGGTCAATCCAATGTTCTTGGCTTGCCCGATACCGGAGGTCAGGTAGTTTATGTTTTGGATCAAGTTGTGGCAATGGAAGAAGAATTGCTACTTAGGATTAAGCAACAAGGACTCAGCTTCAAGCCTCATATTCTTGTGGTGACTCGACTTCTTCCCGATGCCAAAGGGACCGAGTGTAGCCAAGTTTTGGAACCAGTTCTCAACACGAAACACTCACACATTCTTAGAGTCCCATTTAGGACAGAAAAAGGTGTTCTTCGTAAATGGGTGTCTCGATTTGATATCTATCCATACCTCGAAAAGTTTACTCAGGATGCAAGTGCAAAAATAACTGAAATGATGGAAGGAAAACCTGATCTTATCATTGGAAACTACACTGACGGAAACTTGGTTGCATCTCTCATGGCTAACAAACTCGGAAGCACATTGGGAACGATTGCACACGCGTTAGAGAAGACTAAATACGAAGATTCAGACATGAAATGGAAACATTTGGACACAAAATATCACTTTTCTTGTCAATTTACAGCTGATATGATAGCAATGAATTCAGCAGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGTAAAGATAGACCCGGTCAGTATGAAAGCCATGAAGCATTTACACTCCCGGGTTTATATAGAGTTGTTTCGGGCATCAACGTGTTTGATCCCAAATTCAACATTGCATCTCCGGGAGCTGATCAAACCGTTTATTTCCCTTACACGGAAACACCAAAACGATTCACTACTTTTCAACCCGCTATACAAGAATTACTCTTTAGTAAAGTTGAAAACGACGAACACATTGGATATTTAGAAGATAAGAATAAACCAATCATCTTCTCAATGGCAAGACTCGACATGGTTAAGAACATAACGGGGCTAACCGAATGGTTTGGGGAAAACAAGCGGTTAAGAAGTTTGGTTAATCTTGTAATTGTGGCGGGGTTTTTTGATCCGTCAAAATCAAAAGATAGAGAAGAAATGGAAGAAATAAAGAAAATGCATTTGTTGATTGAGAAATATGAACTTAAAGGTCAAATAAGATGGATAGTAGCACAAACTGATAAAAACAGAAATAGTGAACTTTATCGTTGTATCGCTGACTCAAAGGGGGCGTTTGTGCAACCGGCTTTATATGAAGCGTTTGGGTTAACCGTTATTGAGGCTATGAATTGTGGGTTACCAACTTTTGCAACTAACCAAGGTGGTCCGGCTGAGATTATTGTTGATGGTGTTTCTGGGTTCCAAATCGATCCTAATTATGGCGACGAGTCTAGCAACAAGATCGCTGATTTTTTTCAAAAATGCAAACAGGATCCAGGATACTGGAATAGGATTTCAGACGGTGGTTTGATGCGTATATACGAATGCTACACATGGAAGATTTATGCAAATAAAGTGTTGAATATGGGGAACATTTACACATTTTGGAAGCAGTTAAACAAGGAACAGAAAGATGCGAAACAAAGATACATTGAGCTATTCTACAATCAACATTACAAGAATTTGGTTAGGACTGTGCCGATTGTAAGTGATGAAGATGACCAAGTTACAAGGGCAAAACCGGCAACACAACCTTCAACAAGGCGCACACAATCTGCCTTGCAAAGGCTGCTTGGAGCTTAA
配列番号２６（ＳＵＳ６アイソフォームをコードする）
ATGGATTTCGGTATAGCAGAGACTTTGGCCGAGGCATTGAAGCAAAACCGGTACCATGCAAGGAGATGCTTTGAGCGTTTTACATCACGTGGAAAAAGGATGGTGAAGCCTCAAGAGTTATTACACATGATTGAAAAAACCATTGACGACAAGCTTGAAAGAACGAAGGTCTTGGAGGGCTCAATGGGACAAATCTTGAGTTCCACACAGGAGGCAATCGTTATTCCACCATATGTTATTTTAGGATTGAGAGCGAATCCAGGACAATGGGCATACGTTAAGATCAATGCTGATGACGTCACTGTTGAGTCACTCACACCTTCACAATATCTAAAGTTCAAAGAATCCATCTACGATCAAGAATGGGCAAAGGACGAAAATGCCCTTGAACTAGATTTCGGAGCGTTCGACTTTGATACGCCTCGATTAATCCTCCCGTCATCTATCGGCAACGGACTCGGTTACATTTCAAAGTTCATGACTTCAAGAATTGGTGGTGATCTAGAAAACGCGAAGCCGTTGCTTGACCACTTGCTTGCTCTAAAATATCATGGAGAGAAGCTTATGATCAATGAGACAATAGATACAGTTTCAAAGCTCCAGAAAGCATTAATTGTTGCTGATGTCTACTTATCTGCACACCCGAAAGACGAACAATATCAAACCTTAGAGCCCAAGCTTAAAGAATGGGGATTTGAGAAAGGATGGGGAGATACTGCTGAAAGAGTTAGAGAGACAATGAAAATGCTTTCGGAGATTCTTCAAGCACCCGACCCGATTAACATGCAATCGTTCTTTAGCAGGCTTCCGGTGGTCTTCAATATTGTCATATTTTCTATTCATGGGTATTTTGGTCAATCAGATGTTCTTGGATTACCTGATACCGGAGGGCAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTAAAGCATTAGAGGAAGAGATATTGCTAAGAATAAAAATGCAAGGATTGAATGCAAAGCCTCGGATTCTTGTGGTGAGTCGACTCATTCCCGACGCACAAGGAACAAAGTGTAACGAGGAAATGGAACCGATCTTGAACACAATGCATTCACACATCCTTCGGGTTCCTTTCAGAACCTCAAAAGGCGTTGTTCCTCAATGGGTATCGCGGTTTGACATCTACCCGTATCTTGAAAGATTCTCACAGGACGCTGCCTCTAAAATACTTGAAGTAATGGAATGTAAACCAGATCTCATACTTGGAAACTACACAGATGGAAACATTGTTGCATCACTTATAGCCAAAAAGTTTGGAGTAACACAGGGGACGATTGCACACGCGTTAGAGAAGACAAAGTACGAAGATTCGGATGTTAACTGGAAAAACTTTGAAAAAAAGTATCATTTCTCATGTCAATTTACCGCGGATTTGATCTCAATGAACGCTGCAGATTTCATAATCACAAGCACTTATCAAGAAATTGTGGGAAGCAAACAAAGACCCGGACAGTATGAGACCCACGGGGCGTTTAGTATGCCCGGACTTTGTAGAGTCGTGTCGGGCATCAACGTGTTTGATCCTAAGTTCAACATTGCTTCACCCGGTGCGGAACAATCGGTTTATTTTCCGTACACCGAGAAGGAGAAACGGTTAACGGATTTTCATCCCGCAATTAAAGAACTACTTTTCAACGAACAAGACAATGACGAGCATATGGGATACCTCGCGGATGTAACCAAACCGATAATATTCTCAATGGCGAGGCTCGATACGGTGAAGAACATAACAGGGTTAACCGAGTGGTTCGGTAAGAACAAACGACTTAGAAGTCTTGTAAACTTGGTTGTTGTCGCGGGGTTCTTCGATCCATCAAAATCTAAAGACCGTGAAGAGATGGAGGAAATCAAGAAAATGCATGAACTAATAGAGAAATACAAACTCAAGGGTCAGATGAGATGGATCGCGGCTCAAAACGATAGGACCCGCAATGGTGAATTGTATCGGTGTATTTCCGATACGAAGGGAGCGTTTGTGCAGCCCGCGTTGTATGAGGCTTTTGGGCTCACGGTTATCGAGGCAATGAACTGCGGTCTCCCGACTTTTGCAACCAATCAAGGCGGGCCCGCGGAGATCATAGTTGACGGAGTTTCGGGATTTCATATTGATCCCGTTAACGGAGATGAATCAAGCAACAAGATTGCTGATTTCTTCACGAAATGCAAAGTCGATGGCGAGTATTGGGACCGCGTGTCGCAAGCGGGACTTCAACGTATTTACGAGTGCTACACATGGAAGATGTATGCTAACAAAGCATTGAACATGGGTTCGATGTATGGTTTTTGGAGGCAATTAAACAAAGAAACTAAGCAAGCGAAGCAACGATACATCGATATCTTGTATAACTTACAATTCAAGAATTTGGCAAAAACCATTGAAATCCCTGATTTTGTGACTCCTAAACTTCAAGAACCGGTCAAAACCGAACCAACAAAACCATTACAAGAAGCAAGACCTCGAGAACCGGTGCAAAAACTGGTACCGGAAGAAACCCGACTGCCAAAACTAGAGTTGACCAAGCTTGGTCAACCGAATTTGATGAGCAATGCAAGAAAACCATTGATTGTTCTTGTTTCTGTGTTGATAGTTGCATATGCATCCAAGAACTTGTATAGGAGGTATTTCAAATAG
他の実施形態において、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に記載されたいずれか１つの配列、ならびにそれらの断片または相補鎖と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアイデンティティを有する配列を含む核酸を提供する。
他の実施形態において、配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１および３３に記載されたいずれか１つの配列、ならびにそれらの断片と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のパーセントアイデンティティを有する配列を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。当技術分野における作業者は、配列全体のアイデンティティまたはシミラリティは５０％より低くあり得るが、酵素の領域（触媒部位または触媒部位に隣接した領域など）は、保存されたアミノ酸を有し得ることをただちに理解するだろう。例えば、ＵＤＰＧ触媒部位に隣接した開口部において、保存されたアミノ酸が存在する。特に、ＵＧＴ７６Ｇ１の位置３７９におけるロイシンが保存されている。ある実施形態においては、核酸は、配列番号１に記載されたＵＧＴ７６Ｇ１のアミノ酸残基３７５から３８１の位置に対応する配列ＳＤＦＧＬＤＱを有する、ＵＤＰ‐グルコシルトランスフェラーゼをコードする。
ある実施形態においては、断片は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。断片は、例えば、プライマーまたはプローブとして用い得る。
本発明の核酸またはそれらの相補鎖にハイブリダイズする核酸もまた提供する。ある実施形態においては、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に記載されたいずれか１つの配列に対して、低い、中程度、または高いストリンジェンシーにおいて、ハイブリダイズする核酸、またはそれらの相補鎖を提供する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸の間の結合の強度）は、核酸間の相補性の度合い、関係するストリンジェンシーの条件、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸のＧ：Ｃ比などの因子に影響を受けることを、当該技術分野における作業者は、ただちに理解する。そのような作業者は、適切なストリンジェントを、ただちに決定することができる（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 9.50-51, 11.48-49 and 11.2-11.3を参照されたい）。
典型的には、高いストリンジェンシーの条件において、高度に類似した配列（典型的には、９５％より大きいアイデンティティ）のみがこれらの条件においてハイブリダイズする。中程度のストリンジェンシーの条件においては、８０％より大きいアイデンティティを有する配列がハイブリダイズし、および低いストリンジェンシーの条件においては、５０％より大きいアイデンティティを有する配列がハイブリダイズする。
核酸ハイブリダイゼーションに関連して用いられるとき、「高いストリンジェンシーの条件」の非限定的な例は、約５００ヌクレオチドの長さのプローブを用いたとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨによって７．４に調整されている）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃における結合またはハイブリダイゼーションの後、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％のＳＤＳを含む溶液中で４２℃において洗浄をすることに相当する条件を含む。核酸ハイブリダイゼーションに関連して用いられるとき、「中程度のストリンジェンシーの条件」の非限定的な例は、約５００ヌクレオチドの長さのプローブを用いたとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨによって７．４に調整されている）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃における結合またはハイブリダイゼーションの後、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％のＳＤＳを含む溶液中で４２℃において洗浄することに相当する条件を含む。核酸ハイブリダイゼーションに関連して用いられるとき、「低いストリンジェンシーの条件」の非限定的な例は、約５００ヌクレオチドの長さのプローブを用いたとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨによって７．４に調整されている）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃における結合またはハイブリダイゼーションの後、５×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳを含む溶液中で４２℃において洗浄することに相当する条件を含む。
ポリヌクレオチドは、単離して、追加のコード配列と組み合わせて（例えば、融合タンパク質として、プレタンパク質として、またはそれらの同類のものとして、精製用タグ、局在化シグナル）、非コード配列と組み合わせて（例えば、イントロンまたはインテイン、プロモータ（誘導型プロモータ、組織特異的プロモータ（根特異的、または葉特異的プロモータなど）を含む）、エンハンサ、ターミネータ、および類似のものなどの調節因子）、および／または、ポリヌクレオチドをコードする転写因子または転写因子のホモログペプチドが、内在性遺伝子、または外来遺伝子である、ベクター中または宿主環境に、コード配列ポリペプチドを含む。
適切な追加のコード配列（例えば、融合タンパク質として、プレタンパク質として、またはそれらの同類としての、精製用タグ、局在化シグナル）、非コード配列（プロモータ（誘導型プロモータ、組織特異的プロモータ（根特異的、または葉特異的プロモータなど）を含む）、エンハンサ、ターミネータ、およびそれらの同類などの調節因子）、および大腸菌などの原核生物において、および当該技術分野において公知である酵母および植物細胞を含むが、これらに限定されない真核生物において使用するためのベクター。
（ポリペプチド）
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼを提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、１次、２次、および／または３次グリコシル化をすることができる。ある実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、１次、２次、および３次グリコシル化をすることができる。他の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、２次、および／または３次グリコシル化をすることができる。ある実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼを含むが、これに限定されないグルコシルトランスフェラーゼである。グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１もしくはＵＧＴ７４Ｇ１などのステビア レバウディアナのＵＤＰ‐グルコシルトランスフェラーゼ、またはＯｓ０３ｇ０７０２０００などのイネのグルコシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを提供する。スクロースシンターゼもまた提供する。
ある実施形態においては、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼを提供する。ＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ２またはＵＧＴ７６Ｈ１などの、ＵＧＴ７６Ｇ１クレードの他のメンバーを含む。したがって、ある実施形態においては、配列番号１，３、５および７のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含むＵＧＴ７６Ｇ１、またはその断片および変異体を提供する。ある実施形態においては、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つに記載された配列を含む核酸分子によってコードされるＵＧＴ７６Ｇ１を提供する。
ある実施形態においては、配列番号２７に記載されたアミノ酸配列またはその断片および変異体を含むＵＧＴ７６Ｇ２を提供する。ある実施形態においては、配列番号２８に記載された配列を含む核酸分子によってコードされるＵＧＴ７６Ｇ１を提供する。
ある実施形態においては、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列、またはその断片および変異体を含むＵＧＴ７６Ｈ１を提供する。ある実施形態においては、配列番号３０に記載される配列を含む核酸分子によってコードされるＵＧＴ７６Ｇ１を提供する。
ある実施形態においては、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼを提供する。Ｏｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ１またはＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＧＴ９１クレードの他のメンバーを含む。したがって、ある実施形態においては、配列番号９に記載されたアミノ酸配列、またはその断片および変異体を含むＯｓ０３ｇ０７０２０００を提供する。ある実施形態においては、配列番号１０に記載される配列を含む核酸分子によってコードされるＯｓ０３ｇ０７０２０００を提供する。
ある実施形態においては、アミノ酸配列３１に記載されたアミノ酸配列、またはその断片および変異体を含むＵＧＴ９１Ｄ１を提供する。ある実施形態においては、配列番号３２に記載される配列を含む核酸分子によってコードされるＵＧＴ９１Ｄ１を提供する。
ある実施形態においては、配列番号３３に記載されたアミノ酸配列またはその断片および変異体を含むＵＧＴ９１Ｄ２を提供する。ある実施形態においては、配列番号３４に記載される配列を含む核酸分子によってコードされるＵＧＴ７６Ｇ１を提供する。
ある実施形態においては、ステビア レバウディアナのＵＧＴ７４Ｇ１を提供する。したがって、ある実施形態においては、ＵＧＴ７４Ｇ１は、配列番号１３に記載されたアミノ酸配列、またはその断片および変異体を含む。ある実施形態においては、ＵＧＴ７４Ｇ１は、配列番号１４に記載された配列を含む核酸分子によってコードされる。
他の実施形態において、本発明は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを提供する。シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼは、市販されている（ＣＧＴアーゼ、Ｔｏｒｕｚｙｍｅ ３．０Ｌ、ノボザイム株式会社の商標）。
ある実施形態においては、スクロースシンターゼを提供する。したがって、ある実施形態においては、スクロースシンターゼは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載されたアミノ酸配列、またはそれらの断片および変異体を含む。ある実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、または２６に記載される配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３に記載されたいずれか１つの配列、ならびにそれらの断片と、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のパーセントアイデンティティを有する配列を含むポリペプチドを提供する。当該技術分野における作業者は、関連する酵素の配列全体のアイデンティティまたはシミラリティは、５０％より少なくあり得るが、酵素の領域（触媒部位または触媒部位に隣接した領域など）は、保存されたアミノ酸を有し得、したがって関連する酵素は、同様の活性を有することをただちに理解するだろう。例えば、ＵＤＰＧ触媒部位に隣接した開口部に、保存されたアミノ酸が存在する。特に、ＵＧＴ７６Ｇ１の位置３７９におけるロイシンが保存されている。ある実施形態においては、核酸は、ある位置に配列ＳＤＦＧＬＤＱを有するＵＤＰ‐グルコシルトランスフェラーゼをコードする。ある実施形態においては、断片は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０アミノ酸の長さである。ある実施形態においては、ポリペプチド配列は、ＨＩＳタグなどの精製タグを含むがこれらに限定されない異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）配列を含む。ある実施形態においては、Ｎ末端に６×ＨＩＳタグを含むポリペプチドを提供する。他の実施形態において、Ｃ末端に６×ＨＩＳタグを含むポリペプチドを提供する。
グルコシルトランスフェラーゼ、およびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼの活性をスクリーニングするための方法は、当該技術分野において公知である。したがって、当該技術分野における作業者は、グリコシルトランスフェラーゼが、１次、２次、および／または２次グリコシル化をすることができるかどうかを決定することができる（例えば、Dewitte et al., J Biotechnol. 2016 Sep 10;233:49-55. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.06.034; Grubb et al., Plant J. (2014) 79, 92-105; Richman et al., Plant J. (2005) 41, 56-67; Tanaka et al., Plant Cell Rep. (1996) 15, 819-823; Tanaka et al., J. Nat. Prod (1993) 56(12), 2068-2072.を参照されたい）。さらに、スクロースシンターゼの活性をスクリーニングする方法もまた、当該技術分野において公知である（Baroja-Fernandez et al., PNAS. (2012) 109(1), 321-326. doi: 10.1073/pnas.1117099109; Barratt et al., Plant Physiol. (2001) 127, 655-664; Huber and Akazawa, Plant Physiol.(1986) 81, 1008-1013）。
（細胞および植物）
本発明は、本発明の１または２以上のポリペプチドを発現する細胞および植物をさらに提供する。細胞および植物は、本発明の１または２以上のポリペプチドを天然に発現してもよく、または、本発明の１または２以上のポリペプチドを発現するように改変されていてもよい。細胞は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、カンナビス サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、カンナビス インディカ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎｄｉｃａ）、およびカンナビス ルデラリス（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｒｕｄｅｒａｌｉｓ）を含むが、これらに限定されないカンナビスを含むが、これらに限定されない原核細胞、または真核細胞であり得る。
ある実施形態においては、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を提供する（ＵＧＴ７６Ｇ２およびＵＧＴ７６Ｈ１など）。したがって、ある実施形態においては、配列番号１、３、５および７のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする配列を含むＵＧＴ７６Ｇ１グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を提供する。ある実施形態においては、配列番号２７または２９に記載されたアミノ酸配列をコードする配列を含むＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を提供する。細胞は、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ９１Ｄ１およびＵＧＴ９１Ｄ２など）などのグルコシルトランスフェラーゼ、および／または配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載される配列を含むスクロースシンターゼなどのさらなるスクロースシンターゼをさらに発現することができる。
したがって、ある実施形態においては、配列番号１、３、５、および７に記載されたアミノ酸配列をコードする配列を含むＵＧＴ７６Ｇ１グルコシルトランスフェラーゼ、ならびに、配列番号１０に記載されたＯｓ０３ｇ０７０２０００グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を提供する。細胞は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載された配列を含むスクロースシンターゼをさらに発現することができる。
ある実施形態においては、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を提供する。したがって、ある実施形態においては、配列番号１０に記載されたアミノ酸配列をコードする配列を含むＯｓ０３ｇ０７０２０００グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を提供する。細胞は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載された配列を含むスクロースシンターゼなどのスクロースシンターゼをさらに発現し得る。
トランスジェニック細胞および植物（植物細胞、植物外植片（ｐｌａｎｔ ｅｘｐｌａｎｔ）、または植物組織）は、さまざまなよく確立された技術によって生成することができる。もっとも典型的には本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットである、ベクターの構築の後に、ポリヌクレオチドを細胞または植物に導入するために、標準的な技術を用いることができる。任意で、トランスジェニック植物を生成するために、植物細胞、外植片、または組織を、再生することができる。
ある実施形態においては、本発明の１または２以上のタンパク質を発現するよう遺伝子工学的に操作されたカンナビス植物を提供する。当該技術分野における作業者は、カンナビス植物を遺伝子工学的に操作するための適切なベクターおよびプロモータをただちに理解するだろう。例えば、分泌毛状突起特異的なプロモータなどの組織特異的プロモータを、本発明のタンパク質を、カンナビノイドが生成されるのと同じ組織、すなわち、植物の分泌毛状突起において発現するよう、用い得る。適切なプロモータエレメントは、シロイヌナズナに由来する細胞質Ｏ‐アセチルセリン（チオール）リアーゼ（ＯＡＳＡ１）酵素のためのプロモータを含む（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ａｌｃａｌａ ２００５）。
植物細胞の形質転換および再生は、いまやありふれており、作業者は、もっとも適切な形質転換技術を選択するだろう。適切な方法は、植物プロトプラストのエレクトロポレーション；リポソーム媒介形質転換；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介形質転換；ウイルスを用いた形質転換；植物細胞のマイクロインジェクション；植物細胞の微小発射体砲撃（ｍｉｃｒｏ‐ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；真空浸透；およびアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆｉｃｉｅｎｓ）媒介形質転換を含み得るが、これらに限定されない。形質転換は、配列の恒常的な、または一過性の発現を引き起こす様式での、植物へのヌクレオチド配列の導入を意味する。
クローン化した配列をもちいた形質転換による植物の特徴の改変の成功例は、この技術分野における現在の知識を例示するために役立ち、以下を含む例が、参照によって本明細書に組み込まれる：米国特許第５，５７１，７０６号；第５，６７７，１７５号；第５，５１０，４７１号；第５，７５０，３８６号；第５，５９７，９４５号；第５，５８９，６１５号；第５，７５０，８７１号；第５，２６８，５２６号；第５，７８０，７０８号；第５，５３８，８８０号；第５，７７３，２６９号；第５，７３６，３６９号および第５，６１０，０４２号。
形質転換の後に、形質転換ベクターに導入された優性選択マーカを用いて植物を選抜し得る。典型的には、そのようなマーカは、形質転換された植物に、抗生物質抵抗性または除草剤抵抗性を与え、形質転換体の選抜は、植物を適切な濃度の抗生物質または除草剤に対して曝露することによって達成することができる。
（方法）
本発明は、カンナビノイドグリコシドプロドラッグの生成方法、および本方法によって生成されたカンナビノイドグリコシドプロドラッグをさらに提供する。本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて(細胞系において、または植物内において)実行され得る。ある実施形態においては、カンナビノイドグリコシドプロドラッグの生成方法であって、該方法は、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドプロドラッグの生成方法を提供する。
アグリコンは：カンナビジオール、カンナビジバリン、カンナビゲロール、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、およびカンナビジオール酸を含むが、これらに限定されないカンナビノイド、アラキドノイルエタノールアミド（アナンダミド、ＡＥＡ）、２‐アラキドノイルエタノールアミド（２‐ＡＧ）、１‐アラキドノイルエタノールアミド（１‐ＡＧ）、およびドコサヘキサエノイルエタノールアミド（ＤＨＥＡ、シナプタミド）を含むが、これらに限定されないエンドカンナビノイド；ならびにバニリン、クルクミン、およびカプサイシンを含むが、これらに限定されないバニロイドを含むが、これらに限定されない。
当該技術分野における作業者は、１または２以上の糖供与体は、本方法で用いられる１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼ、および／または所望の最終生成物に依存することをただちに理解するだろう。例えば、ＵＤＰ‐グルコシルトランスフェラーゼについて、糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコース、ＵＤＰ‐グルクロン酸、ＵＤＰ‐マンノース、ＵＤＰ‐フルクトース、ＵＤＰ‐キシロース、ＵＤＰ‐フルオロデオキシグルコース、およびＵＤＰ‐ラムノースを含むが、これらに限定されない。シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼについて、糖供与体は、マルトデキストリンを含む。
ある実施形態においては、カンナビノイドグリコシドの生成方法であって、該方法はグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、糖供与体とともに、アグリコンをインキュベートする工程を含むカンナビノイドグリコシドの生成方法を提供する。上述した方法によって生成されたカンナビノイドグリコシドもまた提供する。特定の実施形態において、カンナビノイドグリコシドの生成方法であって、該方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、アグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの生成方法を提供する。他の特定の実施形態において、グリコシドプロドラッグの生成方法であって、該方法は、グリコシル化が可能である条件下で、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、マルトデキストリンとともに、アグリコンをインキュベートする工程を含む、グリコシドプロドラッグの生成方法を提供する。
カンナビノイドグリコシドの生成のための例示的な方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、カンナビノイドをインキュベートする工程を含む。上述した方法によって生成されたカンナビノイドグリコシドもまた提供する。
カンナビノイドグリコシドの生成のためのさらなる例示的な方法は、グリコシル化が可能である条件下で、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、マルトデキストリンとともに、カンナビノイドをインキュベートする工程を含む。上述した方法によって生成されたカンナビノイドグリコシドもまた提供する。
ある実施形態においては、カンナビノイドグリコシドの生成方法であって、該方法は、グリコシル化が可能である条件下で、１次グリコシルトランスフェラーゼおよび２次グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、アグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの生成方法を提供する。上述した方法によって生成されたカンナビノイドグリコシドもまた提供する。
当該技術分野の作業者は、１次グリコシルトランスフェラーゼおよび２次グリコシルトランスフェラーゼは、同時に提供することもでき、または連続的に添加することもできることを、ただちに理解するだろう。さらに、２以上の糖供与体を用いる場合、糖供与体は、同時に提供することもでき、または連続的に添加することもできる。そのような作業者は、得られたカンナビノイドグリコシドの構造は、グリコシルトランスフェラーゼを提供される順番に依存し得ることをさらに理解するだろう。さらに、２次グリコシルトランスフェラーゼに対する、１次グリコシルトランスフェラーゼの比率は、得られる生成物に影響を与え得る。当該技術分野における作業者は、グリコシルトランスフェラーゼの活性レベルは、比率に影響し得、比率は、当該技術分野における作業者がただちに決定することができることを、さらに理解するだろう。例えば、２次グリコシルトランスフェラーゼに対する、１次グリコシルトランスフェラーゼの比率は、１：１、１：２、１：１０、１：５０およびこれらの反対を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、カンナビノイドグリコシドの生成方法であって、該方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、アグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの生成方法を提供する。代替的な特定の実施形態において、カンナビノイドグリコシドの生成方法であって、グリコシル化が可能である条件下において、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下において、ＵＤＰ‐グルコースおよびマルトデキストリンとともに、アグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの生成方法を提供する。上述した方法によって生成されたカンナビノイドグリコシドもまた提供する。
カンナビノイド‐グリコシドを生成するための例示的な方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、カンナビジオール、カンナビジバリン、カンナビゲロール、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノールおよびカンナビジオール酸を含むがこれらに限定されないカンナビノイドをインキュベートする工程を含む。上述した方法によって生成されたカンナビノイド‐グリコシドもまた提供する。
カンナビノイド‐グリコシドを生成するためのさらなる例示的な方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下において、ＵＤＰ‐グルコースおよびマルトデキストリンとともに、カンナビノイドをインキュベートする工程を含む。上述した方法によって生成されたカンナビノイド‐グリコシドもまた提供する。
上述したグリコシル化方法のそれぞれを、低次のカンナビノイドグリコシドに適用して、高次のカンナビノイドグリコシドを形成し得ることも、本発明の範囲内である。例えば、本発明の任意のグリコシル化方法を用いて、カンナビノイドモノグリコシドをグリコシル化して、ジグリコシドを形成することができるし、カンナビノイドジグリコシドをグリコシル化して、トリグリコシドなどを形成することもできる。
カンナビノイドグリコシドの精製方法は当該技術分野において公知であり、例えばカラム精製などの固相抽出を含む。
本発明は、カンナビノイドグリコシドの生成のための、細胞培養および植物内における方法もまた提供する。前記方法は、１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼを、細胞または植物内において発現して、アグリコンを生成させる工程、およびカンナビノイドグリコシドを単離する工程を含む。ある実施形態においては、１または２以上のスクロースシンターゼもまた発現し得る。適切なベクターおよび遺伝子工学的方法は、当該技術分野において公知である。
本発明はまた、本発明のスクロースシンターゼを利用して、ＵＤＰをＵＤＰＧへと変換する方法を提供する。したがって、糖供与体としてＵＤＰ‐グルコースを利用する、カンナビノイドグリコシドの生成方法のある実施形態においては、方法は、ＵＤＰを再循環させるために、スクロースシンターゼの使用をさらに含む。ある実施形態においては、カンナビノイドグリコシドの生成方法であって、該方法は、グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１グルコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、アグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの生成方法を提供する。
ここから、特定の実施例を参照して、本発明を説明する。以下の実施例は、実施形態を説明することを意図しており、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図するものではないことが理解される。
＜実施例１：カンナビノイドのカンナビノイドグリコシドプロドラッグへの変換＞
グリコシル化反応は、５０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のＣＢＤ、２．５％のＵＧＴ７６Ｇ１精製酵素調製物、および２．５ｍＭのＵＤＰ‐グルコースからなる。バッファーを脱気し、チューブを窒素によってパージし、反応を光から保護して、２８℃で、１８０ｒｐｍのアジテーションをしながら、１８時間インキュベートした。それから反応を、等量のエチルアセテートによって３回抽出し、蒸発させて乾燥させ、半分の容量のＨＰＬＣグレードのメタノールに溶解した。５０マイクロリットルを、逆相Ｃ１８カラムに注入し、１０％からはじまり、９９％まで増加するアセトニトリルの勾配によって、溶出させた。ピキア パストリスにおける発現によって、ＵＧＴ７６Ｇ１を生成し、標準的な分子生物学的技術によって精製した。ＵＧＴ７６Ｇ１酵素は、ＵＤＰ‐グルコース依存的に、ＣＢＤをグリコシル化することがわかった。この活性は、存在するＵＤＰ‐グルコースの量に比例した。インキュベーション温度は、２８℃であり、高い温度は、ＣＢＤの有意な分解を引き起こし得ることから、許容可能な範囲は、２０℃から３０℃であろう。基質の光分解を防ぐために、反応は、暗闇において実施された。１２０から２００ｒｐｍの穏やかなアジテーションを、不活性雰囲気下で、反応液を混合するために用いた。
反応中の基質ＣＢＤを、Δ９ＴＨＣおよびＣＢＤＶによって置き換え、同一のやりかたで実行し、同様の結果を得た。さまざまな生成物を生成するために必要な酵素の組み合わせを、ＣＢＤ‐グリコシドについて表４に、ＣＢＤＶ‐グリコシドについて表５に、およびΔ９ＴＨＣ‐グリコシドについて表６に示した。
ＣＢＤに対する活性についてスクリーニングされた他の酵素は、ステビア レバウディアナのＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＰアーゼ、大腸菌のマルトデキストリンホスホトランスフェラーゼ（ＭａｌＰ）、およびイネのＯｓ０３ｇ０７０２０００（配列番号９）であった。ＵＧＴ７６Ｇ１以外には、他に試験されたいかなる酵素も、１次グリコシル化活性を有さなかった。
＜実施例２：ＣＢＤ‐モノグリコシドの２‐Ｏグリコシル化＞
組換えＯｓ０３ｇ０７０２０００酵素を、ＵＧＴ７６Ｇ１に対して相対的に１：２の比率で含むこと以外は、実施例１に記載した通りに酵素反応を実施した。サンプルを、実施例１と同様に抽出および分析した。組換えＯｓ０３ｇ０７０２０００酵素を、コドン最適化し、大腸菌ＢＬ２１‐ＤＥ３細胞において発現し、固定化金属イオンクロマトグラフィーによって精製した。
＜実施例３：ＣＢＤのアルファ‐グリコシド結合型ＣＢＤ化合物への変換＞
組換えシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ、Ｔｏｒｕｚｙｍｅ ３．０Ｌ、商標名、ノボザイム株式会社）を、ＵＤＰＧまたはＵＧＴ７６Ｇ１を用いなかったこと以外は、実施例１において示されるように、反応に加えた。マルトデキストリンは、最終濃度０．０５％で用い、Ｔｏｒｕｚｙｍｅ ３．０Ｌは、０．１％で用いた。実施例１と同様に、サンプルを抽出および分析した。さらに、カンナビノイドをカンナビノイド‐グリコシドへと変換するために、実施例１からの反応を実行し、それからＣＧＴアーゼおよびマルトデキストリンを追加し、十分な時間を与えて、カンナビノイド‐グリコシドとともにインキュベートした。結果的に得られた生成物は、カンナビノイド骨格上でのβ‐グリコシル化、および１次糖から発するα‐グリコシル化を含む。この追加の処理は、β‐プライムド，α‐グリコシル化カンナビノイド（β‐ｐｒｉｍｅｄ，α‐ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ）と称される、新しいカテゴリーの化合物を生成した。
＜実施例４：カンナビノイドグリコシドの精製＞
上述した生体触媒反応によってグリコシド生成物を生成し、Ｃ１８固相精製によって、均質に精製した。１００ｍｇ Ｈｙｐｅｒｓｅｐ Ｃ１８カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）をメタノールによって水和し、５０％のメタノール水溶液でリンスし、水でリンスし、グリコシル化反応をカラムに通過させ、水で洗浄し、１０％、２０％、および３０％のメタノールで洗浄し、グリコシド生成物を、４５および６０％のメタノール水溶液によって溶出させた。溶出液を乾燥し、エチルアセテートによって抽出し、乾燥させて完成させ、さらなる分析および試験のための、９５％より純粋なカンナビノイド‐グリコシドを生成した。
＜実施例５：カンナビノイドグリコシドプロドラッグのＨＰＬＣ分析＞
カンナビノイドアグリコンＣＢＤ、ＣＢＤＶ、Δ９‐ＴＨＣ、ＣＢＮ、１‐ＡＧおよび２‐ＡＧ、ＤＨＥＡ、ＡＥＡ、カプサイシン、ならびにバニリンのグリコシル化反応の反応生成物のＨＰＬＣライントレースを、図１６から２４に、それぞれ示した。酵素反応は、実施例１に記載された通りに実施した。実線は、開始アグリコンの溶出プロファイルを示し、点線は、グリコシル化反応生成物混合液の溶出プロファイルを示す。
図１６において、ＣＢＤアグリコンの保持時間は、１３．６５分であり、生成物のピークは、８．８７、９．０２、９．９７、１０．３３、および１０．３７分において観察された。
図１７において、ＣＢＤＶアグリコンの保持時間は、１２．７５分であり、生成物のピークは、８．５３、９．７０，および１０．０１分において観察された。
図１８において、ＴＨＣアグリコンの保持時間は、１４．４５分であり、生成物のピークは、９．４６、１０．６７、１０．９７、１１．２８、１１．６７、および１２．４９分において観察された。
図１９において、ＣＢＮアグリコンの保持時間は、１４．３２分であり、生成物のピークは、１０．８７、１１．５０、および１２．２５分において観察された。
図２０において、１‐ＡＧアグリコンの保持時間は、１４．１８分であり、かつ２‐ＡＧアグリコンの保持時間は、１４．３２分であり、生成物のピークは、１１．４０、１１．７８、１１．８３、１１．９７、１２．５３、１２．９２、１３．０７、および１３．３５分において観察された。
図２１において、ＤＨＥＡアグリコンの保持時間は、１３．７８分であり、生成物のピークは、１０．０９および１２．４３分において観察された。
図２２において、ＡＥＡアグリコンの保持時間は、１３．８７分であり、生成物のピークは、１２．４７分において観察された。
図２３において、バニリンアグリコンの保持時間は、１．９５分であり、生成物のピークは、１．２５から１．３５分において観察された。
図２４において、カプサイシンアグリコンの保持時間は、１１．７３分であり、生成物のピークは、１０．２３分において観察された。
＜実施例６Ａ：ＣＢＤグリコシドのＬＣＭＳ分析＞
図１６のＨＰＬＣライントレースに示したように、投入したＣＢＤアグリコン（ＶＢ１０１、１３．６５’）は、＋６５時間のインキュベーション時間の後に、元の量の５％が枯渇した。ＣＢＤ‐グリコシドは、ＨＰＬＣカラムから、８．８７、９．０２、９．９７、１０．３３、および１０．３７分において、溶出された。グリコシル化生成物を、ＬＣＭＳ分析によって同定した。グリコシル化生成物「ｇ１」はモノグリコシドであり、「ｇ２」はジグリコシドであり、「ｇ３」はトリグリコシドであり、および「ｇ４」はテトラグリコシドである。ＬＣ−ＬＲＭＳは、島津製作所製のＬＣ−ＭＳ ２０１０ ＥＶ装置で実施した。用いたＬＣカラムは、Ｓｉｌｉａ Ｃｈｒｏｍ ＸＤＢ Ｃ１８ ５ｕｍ、１５０Ａ、４．６×５０ｍｍであった。メソッドは、１２分間、５から９５のＨ２Ｏ：ＡＣＮ勾配であった。ＬＲＭＳのために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を、ポジティブモードで実施した。
ＶＢ１０１（ＣＢＤアグリコン）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ２１Ｈ３１Ｏ２）計算値（Ｃａｌｃｄ）：ｍ／ｚ＝３１５、実測値（Ｆｏｕｎｄ）：ｍ／ｚ＝３１５
（ＣＢＤｇ１）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ２７Ｈ４１Ｏ７）計算値：ｍ／ｚ＝４７７、実測値：ｍ／ｚ＝４７７
ＶＢ１０４（ＣＢＤｇ２）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ３３Ｈ５１Ｏ１２）計算値：ｍ／ｚ＝６３９、実測値：ｍ／ｚ＝６３９
ＶＢ１１０（ＣＢＤｇ２）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ３３Ｈ５１Ｏ１２）計算値：ｍ／ｚ＝６３９、実測値：ｍ／ｚ＝６３９
（ＣＢＤｇ３）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ３９Ｈ６１Ｏ１７）計算値：ｍ／ｚ＝８０１、実測値：ｍ／ｚ＝８０１、［Ｍ＋Ｋ＋Ｈ］＋（Ｃ３９Ｈ６１Ｏ１７Ｋ）計算値：ｍ／ｚ＝４２０、実測値：ｍ／ｚ＝４２０、［Ｍ＋ＡＣＮ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋（Ｃ４１Ｈ６３ＮＯ１７）計算値：ｍ／ｚ＝８６０、実測値：ｍ／ｚ＝８６０
（ＣＢＤｇ４）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ４５Ｈ７１Ｏ２２）計算値：ｍ／ｚ＝９６４、実測値：ｍ／ｚ＝９６４、［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋（Ｃ４５Ｈ７３Ｏ１８）計算値：ｍ／ｚ＝９８３、実測値：ｍ／ｚ＝９８３
（ＣＢＤｇ３）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ３９Ｈ６１Ｏ１７）計算値：ｍ／ｚ＝８０１、実測値：ｍ／ｚ＝８０１、［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ３９Ｈ６０Ｏ１７Ｎａ）計算値：ｍ／ｚ＝８２３、実測値：ｍ／ｚ＝８２３、［Ｍ＋Ｋ＋Ｈ］２＋（Ｃ３９Ｈ６１Ｏ１７Ｋ）計算値：ｍ／ｚ＝４２０、実測値：ｍ／ｚ＝４２０
＜実施例６Ｂ：Δ９‐ＴＨＣグリコシドのＬＣＭＳ分析＞
実施例６Ａを実施したのと同様の方法によって、Δ９‐ＴＨＣのグリコシル化反応の生成物（図１８のＨＰＬＣライントレースに示した）を、ＬＣＭＳ分析によって同定した。
ＶＢ３０１（ＴＨＣアグリコン）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ２１Ｈ３１Ｏ２）計算値：ｍ／ｚ＝３１５、実測値：ｍ／ｚ＝３１５、［Ｍ＋３ＡＣＮ＋２Ｈ］２＋（Ｃ２７Ｈ４１Ｎ３Ｏ２）計算値：ｍ／ｚ＝３１４、実測値：ｍ／ｚ＝３１４
ＶＢ３０４（ＴＨＣｇ２）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ３３Ｈ５１Ｏ１２）計算値：ｍ／ｚ＝６３９、実測値：ｍ／ｚ＝６３９
ＶＢ３０８（ＴＨＣｇ３）ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ３９Ｈ６１Ｏ１７）計算値：ｍ／ｚ＝８０１、実測値：ｍ／ｚ＝８０１、［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ３９Ｈ６０Ｏ１７Ｎａ）計算値：ｍ／ｚ＝８２３、実測値：ｍ／ｚ＝８２３、［Ｍ＋Ｋ＋Ｈ］＋（Ｃ３９Ｈ６１Ｏ１７Ｋ）計算値：ｍ／ｚ＝４２０、実測値：ｍ／ｚ＝４２０
＜実施例７：カンナビノイドグリコシドのＮＭＲ分析＞
図２７は、単離されたＶＢ１０４の１ＮＭＲスペクトルを示し、図２８は、単離されたＶＢ１１０の１Ｈ ＭＲスペクトルを示す。これらそれぞれの生成物は、ＣＢＤのグリコシル化反応によって生成された反応混合液から単離された。ＣＤ３ＯＤ中で調製されたそれぞれの化合物の１０ ｍｇ／ｍｌ溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、ＴｏｐＳｐｉｎ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇソフトウェアを用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００ ＭＨｚ装置で得た。
＜実施例８：溶解度分析＞
Ｃ１８保持時間は、ダイオードアレイ検出器（Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備え付けたＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ上のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ １００Ａ Ｃ１８カラム上でのアセトニトリルの増加の直線傾斜によって、経験的に決定された。表ＡのＣＬｏｇＰ値は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ）によって予測した。参照カンナビノイドを、ＨＰＬＣによって分析し、ｌｏｇＰ値（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を確立し、図２９に示すように、キャリブレーションラインを作成するために用いた。予測されたｃＬｏｇＰ値は、参照キャリブレーションラインと相関関係があった。図２９に示すように、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ保持時間を、表Ａに示すｃＬｏｇＰ値に対してプロットした。データポイントの番号は、表の番号と関連している。白地のダイヤモンドは、新規のカンナビノイドグリコシドを示し、黒字のダイヤモンドは、参照カンナビノイドおよび誘導体を示す。ＣｌｏｇＰ値はＣｈｅｍＤｒａｗ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ）によって予測した。すべてのデータポイントについて、直線回帰を実施した（Ｒ２＝０．９４５５）。
＜実施例９：生物学的利用能アッセイ＞
部位特異的な薬物送達に影響するグリコシル化の有効性を調査するために、経口的強制飼養によって、３匹のマウスにＶＢ１１０を投与し、動物を、３０、６０、および９０分の時点で殺した。８週齢のオスのスイスマウスを、１２時間飢餓状態にし、その後、１０％のエタノール米国薬局方（ＵＳＰ）、１０％のプロピレングリコールＵＳＰ、０．０５％のデオキシコール酸ナトリウムＵＳＰ、７９．９５％の生理食塩水 ＵＳＰ 中の１２０ｍｇ／ｋｇのＶＢ１１０を投与した。終了および組織摘出の後に、それから腸の内容物を抽出し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって分析した。図３０Ａに示すように、小腸の内容物は、完全なＶＢ１１０を示したが、切断されたＣＢＤを示さなかった。図３０Ｂに示すように、大腸の内容物は、６０および９０分の時点において、ＶＢ１１０およびＣＢＤの両方を含んでいた。このＶＢ１１０の切断は、センノシドベータ‐グリコシドについてみられた大腸における切断と一貫しており、大腸の微生物叢から分泌されたベータ‐グリコシダーゼに起因する。
＜実施例１０：ＣＢＤおよびＣＢＤグリコシドの投与に際して、大腸の内容物の分析＞
大腸におけるＣＢＤ‐グリコシドの代謝および切断を調査するために、ＣＢＤ‐グリコシドの混合物の水性溶液を、経口的強制飼養によって、マウスに投与した。対照として、ＣＢＤのクレモフォール、エタノール、および生理食塩水溶液を、第２のマウスに投与した。マウスはそれぞれ、２時間目に殺した。終了および組織抽出の後に、それから腸の内容物を抽出し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって分析した。この実施例において用いられたマウスは、溶液の投与の前に１２時間飢餓状態にした８週年のオスのスイスマウスである。
得られた抽出物を、島津製作所ＬＣ−ＭＳ ２０１０ ＥＶを用いて、ＬＣＭＳによって分析した。ＬＣ分離は、Ｓｉｌｉａ Ｃｈｒｏｍ ＸＤＢ Ｃ１８ ５ｕｍ、１５０Ａ、４．６×５０ｍｍを用いて実行した。メソッドは、１２分間、５から９５のＨ２Ｏ：ＡＣＮ勾配溶出であった。エレクトロスプレーイオン化によって、ネガティブモードで、低解像度ＭＳを実施した。分析の間、酢酸およびギ酸を、サンプル添加物として用いて、注入容積を２０μＬとした。
ＣＢＤ‐グリコシドの混合物を経口的に投与された動物の大腸の内容物の分析は、アグリコンおよびグリコシドの両方が、それぞれのヒドロキシ代謝産物とともに存在していたことを示した：
［ＣＢＤ−Ｈ］，［２ＣＢＤ−Ｈ］および［ＣＢＤ＊２ＯＨ＋ギ酸−Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ‐Ｈ］−（Ｃ２１Ｈ２９Ｏ２）計算値：ｍ／ｚ＝３１３、実測値：ｍ／ｚ＝３１３、［２Ｍ‐Ｈ］−（Ｃ４２Ｈ５９Ｏ４）計算値：ｍ／ｚ＝６２７、実測値：ｍ／ｚ＝６２７、［Ｍ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］−（Ｃ２２Ｈ３１Ｏ６ −）計算値：ｍ／ｚ＝３９１、実測値：ｍ／ｚ＝３９１
［ＣＢＤｇ１‐Ｈ］，［ＣＢＤｇ１＋Ｃｌ］および［２ＣＢＤｇ１‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ１‐Ｈ］−（Ｃ２７Ｈ３９Ｏ７）計算値：ｍ／ｚ＝４７５、実測値：ｍ／ｚ＝４７５、［Ｍｇ１＋Ｃｌ］−（Ｃ２７Ｈ４０Ｏ７Ｃｌ）計算値：ｍ／ｚ＝５１１、実測値：ｍ／ｚ＝５１１、［２Ｍｇ１‐Ｈ］−（Ｃ５４Ｈ７９Ｏ１４）計算値：ｍ／ｚ＝９５１、実測値：ｍ／ｚ＝９５１
［ＣＢＤｇ２−Ｈ］および［ＣＢＤｇ２＋酢酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ２‐Ｈ］−（Ｃ３３Ｈ４９Ｏ１２）計算値：ｍ／ｚ＝６３７、実測値：ｍ／ｚ＝６３７、［Ｍｇ２＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ３５Ｈ５３Ｏ１４ −）計算値：ｍ／ｚ＝６９７、実測値：ｍ／ｚ＝６９７
［ＣＢＤｇ３‐Ｈ］，［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ‐Ｈ］および［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ‐２Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ３‐Ｈ］−（Ｃ３９Ｈ５９Ｏ１７）計算値：ｍ／ｚ＝７９９、実測値：ｍ／ｚ＝７９９、［Ｍｇ３＊ＯＨ‐Ｈ］−（Ｃ３９Ｈ５９Ｏ１８）計算値：ｍ／ｚ＝８１５、実測値：ｍ／ｚ＝８１５、［Ｍｇ３＊ＯＨ‐２Ｈ］−２（Ｃ３９Ｈ５８Ｏ１８）計算値：ｍ／ｚ＝４０７、実測値：ｍ／ｚ＝４０７
ＣＢＤを経口的に投与された動物の大腸の内容物の分析は、ＣＢＤのヒドロキシ代謝産物が存在していたことを示した：
［ＣＢＤ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］および［２ＣＢＤ＊３ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］−（Ｃ２２Ｈ３１Ｏ６ −）計算値：ｍ／ｚ＝３９１、実測値：ｍ／ｚ＝３９１、［２Ｍ＊３ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ４４Ｈ６３Ｏ１２ −）計算値：ｍ／ｚ＝７８３．９、実測値：ｍ／ｚ＝７８４
同じ動物の血漿および脳を抽出し、ＣＢＤ‐グリコシドおよびＣＢＤの存在について、ＨＰＬＣによって分析した。ＣＢＤは、ＣＢＤアグリコンを受け取った対照の動物中にのみ存在していた（データは示していない）。同じ動物から、小腸の内容物もまた抽出し、ＣＢＤ‐グリコシドおよびＣＢＤの存在についてＨＰＬＣによって分析したが、小腸にＣＢＤアグリコンは存在しなかった（データは示していない。実施例１１で示したＴＨＣの切断のデータと一貫している）。大腸の内容物中にＣＢＤアグリコンが存在したことは、ＣＢＤ‐グリコシドの送達が成功したこと、およびその後、大腸にのみ存在するベータ‐グリコシダーゼ酵素によって、グリコシドの加水分解が起こったことを示す。切断されたＣＢＤが大腸に存在し、小腸には存在しなかったことは、グリコシドの分離が、大腸への移行に際してのみおこることを示す。ＣＢＤ解毒代謝産物ＣＢＤ‐２ＯＨの存在は、ＣＢＤの送達、および腸が上皮へ吸収され、ＣＢＤがそこで代謝されはじめることとも一貫する。この実施例は、ＣＢＤ‐グリコシドを投与し、吸収することなく安全にＣＢＤ‐グリコシドを小腸へと移行させ、大腸へと移行させ、そこで糖が切断されてＣＢＤを局所的に放出することができ、全身への吸収、およびＣＢＤが望ましくない効果を有し得る他の組織への送達を避けることの可能性を示す。
＜実施例１１：ＴＨＣ‐グリコシドの投与に際した、大腸の内容物の分析＞
大腸におけるＴＨＣ‐グリコシドの代謝および分離を調査するために、経口的強制飼養によって、２匹のマウスにＴＨＣ‐グリコシドの混合物の水性溶液を投与した。第１の動物は、２時間目に殺し、第２の動物は、４時間目に殺した。終了および組織摘出の後、それから小腸の内容物を抽出し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって分析した。この実施例において用いられたマウスは、溶液の投与の前に１２時間飢餓状態にした８週齢のオスのスイスマウスである。
得られた抽出物を、実施例１０において用いられたのと同じ条件下でＬＣＭＳによって分析した。
ＴＨＣグリコシドの投与から２時間後のマウスの大腸の内容物の分析は、ＴＨＣアグリコンおよびＴＨＣグリコシドの両方が、それぞれのヒドロキシ代謝産物とともに存在したことを示した。
［ＴＨＣ‐Ｈ］，［ＴＨＣ＊ＯＨ‐Ｈ］，［２ＴＨＣ＊３ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］および［ＴＨＣ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ‐Ｈ］−（Ｃ２１Ｈ２９Ｏ２）計算値：ｍ／ｚ＝３１３、実測値：ｍ／ｚ＝３１３、［Ｍ＊ＯＨ‐Ｈ］−（Ｃ２１Ｈ２９Ｏ３）計算値：ｍ／ｚ＝３２９、実測値：ｍ／ｚ＝３２９、［２Ｍ＊３ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ４４Ｈ６３Ｏ１２ −）計算値：ｍ／ｚ＝７８３．９、実測値：ｍ／ｚ＝７８３、［Ｍ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］−（Ｃ２２Ｈ３１Ｏ６ −）計算値：ｍ／ｚ＝３９１、実測値：ｍ／ｚ＝３９１
［ＴＨＣｇ１＋Ｃｌ］，［ＴＨＣｇ１＋酢酸‐Ｈ］，［２ＴＨＣｇ１‐Ｈ］，および［２ＴＨＣｇ１＋酢酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ１＋Ｃｌ］−（Ｃ２７Ｈ４０Ｏ７Ｃｌ−）計算値：ｍ／ｚ＝５１１、実測値：ｍ／ｚ＝５１１、［Ｍｇ１＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ２９Ｈ４３Ｏ９ −）計算値：ｍ／ｚ＝５３５、実測値：ｍ／ｚ＝５３５、［２Ｍｇ１‐Ｈ］−（Ｃ５４Ｈ７９Ｏ１４）計算値：ｍ／ｚ＝９５１、実測値：ｍ／ｚ＝９５１、［２Ｍｇ１＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ５６Ｈ８３Ｏ１６ −）計算値：ｍ／ｚ＝１０１１、実測値：ｍ／ｚ＝１０１１
［ＴＨＣｇ２‐Ｈ］，［ＴＨＣｇ２＋酢酸‐Ｈ］および［ＴＨＣｇ２＊ＯＨ＋ギ酸−Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ２‐Ｈ］−（Ｃ３３Ｈ４９Ｏ１２）計算値：ｍ／ｚ＝６３７、実測値：ｍ／ｚ＝６３７、［Ｍｇ２＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ３５Ｈ５３Ｏ１４ −）計算値：ｍ／ｚ＝６９７、実測値：ｍ／ｚ＝６９７、［Ｍｇ２＊ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ３４Ｈ５１Ｏ１５ −）計算値：ｍ／ｚ＝６９９、実測値：ｍ／ｚ＝６９９
［ＴＨＣｇ３‐Ｈ］，［ＴＨＣｇ３＋酢酸‐Ｈ］，［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ‐Ｈ］および［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ‐２Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ３‐Ｈ］−（Ｃ３９Ｈ５９Ｏ１７）計算値：ｍ／ｚ＝７９９、実測値：ｍ／ｚ＝７９９、［Ｍｇ３＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ４１Ｈ６３Ｏ１９ −）計算値：ｍ／ｚ＝８５９、実測値：ｍ／ｚ＝８５９、［Ｍｇ３＊ＯＨ‐Ｈ］−（Ｃ３９Ｈ５９Ｏ１８ −）計算値：ｍ／ｚ＝８１５、実測値：ｍ／ｚ＝８１５、［Ｍｇ３＊ＯＨ‐２Ｈ］−２（Ｃ３９Ｈ５８Ｏ１８ ２−）計算値：ｍ／ｚ＝４０７、実測値：ｍ／ｚ＝４０７
４時間後のＴＨＣグリコシド混合抽出物の分析は、ＴＨＣアグリコンおよびＴＨＣグリコシドの両方が、それぞれのヒドロキシ代謝産物とともに確認されたことを示した。
［ＴＨＣ‐Ｈ］，［ＴＨＣ＊ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］，［２ＴＨＣ＊３ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］および［ＴＨＣ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍ‐Ｈ］−（Ｃ２１Ｈ２９Ｏ２）計算値：ｍ／ｚ＝３１３、実測値：ｍ／ｚ＝３１３、［Ｍ＊ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ２３Ｈ３３Ｏ５ −）計算値：ｍ／ｚ＝３８９、実測値：ｍ／ｚ＝３８９、［２Ｍ＊３ＯＨ＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ４４Ｈ６３Ｏ１２ −）計算値：ｍ／ｚ＝７８３．９、実測値：ｍ／ｚ＝７８４、［Ｍ＊２ＯＨ＋ギ酸‐Ｈ］−（Ｃ２２Ｈ３１Ｏ６ −）計算値：ｍ／ｚ＝３９１、実測値：ｍ／ｚ＝３９１
［ＴＨＣｇ１＋Ｃｌ］，［ＴＨＣｇ１＋酢酸‐Ｈ］，［２ＴＨＣｇ１‐Ｈ］および［２ＴＨＣｇ１＋酢酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ１＋Ｃｌ］−（Ｃ２７Ｈ４０Ｏ７Ｃｌ−）計算値：ｍ／ｚ＝５１１、実測値：ｍ／ｚ＝５１１、［Ｍｇ１＋酢酸−Ｈ］−（Ｃ２９Ｈ４３Ｏ９ −）計算値：ｍ／ｚ＝５３５、実測値：ｍ／ｚ＝５３５、［２Ｍｇ１‐Ｈ］−（Ｃ５４Ｈ７９Ｏ１４）計算値：ｍ／ｚ＝９５１、実測値：ｍ／ｚ＝９５１、［２Ｍｇ１＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ５６Ｈ８３Ｏ１６ −）計算値：ｍ／ｚ＝１０１１、実測値：ｍ／ｚ＝１０１１
［ＴＨＣｇ２−Ｈ］および［ＴＨＣｇ２＋酢酸‐Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ２‐Ｈ］−（Ｃ３３Ｈ４９Ｏ１２）計算値：ｍ／ｚ＝６３７、実測値：ｍ／ｚ＝６３７、［Ｍｇ２＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ３５Ｈ５３Ｏ１４ −）計算値：ｍ／ｚ＝６９７、実測値：ｍ／ｚ＝６９７
［ＴＨＣｇ３‐Ｈ］，［ＴＨＣｇ３＋酢酸‐Ｈ］，［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ‐Ｈ］，［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ‐２Ｈ］および［ＣＢＤｇ３＊ＯＨ＋酢酸‐２Ｈ］ＭＳデータ：ＬＣ／ＥＳＩ−ＬＲＭＳ、［Ｍｇ３‐Ｈ］−（Ｃ３９Ｈ５９Ｏ１７）計算値：ｍ／ｚ＝７９９、実測値：ｍ／ｚ＝７９９、［Ｍｇ３＋酢酸‐Ｈ］−（Ｃ４１Ｈ６３Ｏ１９ −）計算値：ｍ／ｚ＝８５９、実測値：ｍ／ｚ＝８５９、［Ｍｇ３＊ＯＨ‐Ｈ］−（Ｃ３９Ｈ５９Ｏ１８ −）計算値：ｍ／ｚ＝８１５、実測値：ｍ／ｚ＝８１５、［Ｍｇ３＊ＯＨ‐２Ｈ］−２（Ｃ３９Ｈ５８Ｏ１８ ２−）計算値：ｍ／ｚ＝４０７、実測値：ｍ／ｚ＝４０７、［Ｍｇ３＊ＯＨ＋酢酸‐２Ｈ］−２（Ｃ４１Ｈ６２Ｏ２０ ２−）計算値：ｍ／ｚ＝４６７、実測値：ｍ／ｚ＝４６７
同じ動物の血漿および脳もまた抽出し、ＨＰＬＣによってＴＨＣ‐グリコシドおよびＴＨＣの存在について分析したが、どちらの化合物もこれらの組織において見られなかった（データは示していない）。同じ動物の小腸の内容物もまた抽出し、ＨＰＬＣによってＴＨＣ‐グリコシドおよびＴＨＣの存在について分析したが、ＴＨＣアグリコンは観察されなかった（データは示していない。実施例１０おいて示したＣＢＤ切断のデータと一貫している）。２時間および４時間における大腸の内容物中のＴＨＣアグリコンの存在は、ＴＨＣ‐グリコシドの送達が成功し、その後大腸中のベータ‐グリコシダーゼによってグリコシドが加水分解されたことを示す。分離したＴＨＣが大腸中に存在し、小腸中には存在しなかったことは、グリコシドの切断が、大腸への移行に際してのみおこることを示す。大腸中のＴＨＣ解毒代謝産物の存在は、ＴＨＣアグリコンが存在し、小腸上皮によって吸収され、ＴＨＣアグリコンがそこで代謝されはじめることを、さらに証明する。この実施例は、ＴＨＣ‐グリコシドを経口投与し、吸収することなくＴＨＣ‐グリコシドを小腸へと移行させ、大腸へと移行させ、そこで糖が切断されてＴＨＣを局所的に放出することができ、全身への吸収、およびＴＨＣが望ましくない精神活性を有し得る中枢神経系への送達を避けることの可能性を示す。
＜実施例１２：ステビア レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）からの新規のスクロースシンターゼアイソフォームの発見＞
多数の研究グループは、単純なＵＤＰからＵＤＰＧへの再循環系を利用して、生成物の形成に必要なＵＤＰＧの量を減少させている（Ｈａｒｄｉｎ ２００４，Ｂｕｎｇａｒａｎｇ ２０１３）。これらの研究は、葉組織で見つかった１次スクロースシンターゼのアイソフォームが、おそらくフルクトースをＵＤＰＧとともに反応させることによって、スクロースの合成を実行し、スクロースを生成して、ＵＤＰを消費することを特徴付けた。
植物はスクロースシンターゼ酵素の様々なアイソフォームを含むことが知られていることから、ステビア レバウディアナ植物に由来する、ＵＤＰ＋スクロースＵＤＰＧ＋フルクトースへの逆反応のより高い活性を有する代替的なＳＵＳ酵素の同定が実行された。ステビオールグリコシドは、ステビア属の葉で高いレベルで存在することから、ステビア属の葉に由来するスクロースシンターゼは、ＵＤＰをＵＤＰＧへと再循環させる逆反応を触媒する、改善した能力を有するだろうことが仮定された。６つのスクロースシンターゼのアイソフォームが、ステビアのトランスクリプトーム中から同定され、そのすべてが、シロイヌナズナでみつかった６つのアイソフォームと同様のホモロジーを有しており、それらのホモログに関連して命名された。これらの転写産物を、材料および方法に記載した通りにクローン化し、対応する配列ＩＤ情報を本明細書に列挙した。
減少したＵＤＰＧインプットに対してＵＧＴ反応を促進する能力について、酵素活性を試験およびアッセイした。最良のアイソフォームであるＳｒＳＵＳ４は、ステビオール１９‐Ｏ‐グルコシルトランスフェラーゼＳｒＵＧＴ７４Ｇ１によって媒介される、ステビオール殺生物剤のステビオシドへのグリコシル化と共同して、スクロースとともに、ＵＤＰをＵＤＰＧへと再循環させることができる。
二量化を防ぐために植物内で一般的にリン酸化されているＮ末端のセリン残基を変異するために、標的突然変異誘導を実施した（Ｈａｒｄｉｎ ２００４）。位置１３のセリン（Ｓ１３Ｄ）をアスパラギン酸残基へと変異させることによって、ＳｒＳＵＳ１‐Ｓ１３Ｄ変異体を作成し、したがって、リン酸化模倣タンパク質を形成した。さらに、ＳｒＳｕｓ１‐Ｓ１３Ｒを作成するために、大きな電化を有する残基であるアルギニンによってセリンを置換することでＬ１４Ｉを生成し、酵素の二量体化および不活性化もまた防いだ。スクロースシンターゼ変異体は、その天然のものと比較して、ＵＤＰＧ生成活性の改善を示した。ＳｒＳＵＳ５（配列番号１９および２０）は、ステビア属のトランスクリプトーム中で同定され、プライマーを設計したが（配列番号６７および６８）、ｃＤＮＡから増幅することはできなかった。ＳｒＳｕｓ４は、すぐれたＵＤＰＧ再循環活性を示し、ＳｒＳｕｓ１で見られた活性に対し、２０％の改善を示した。ＳｒＳｕｓ４は、スクロースの存在下において、ＵＤＰをＵＤＰＧへと変換する逆反応を実行するための理想的なアイソフォームであることが提唱された。カンナビノイドグリコシドの中規模の精製のために、Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーカラムを用いた。３３ｇの樹脂を有するバイオタージ（Ｂｉｏｔａｇｅ）フラッシュＣ１８カラムを洗浄し、ロードし、洗浄し、ペリスタルティックポンプを用いて溶出し、上に列挙した自然落下式Ｈｙｐｅｒｓｅｐカラムと同様の分離および精製を得た。
ＳＵＳアイソフォームのＵＤＰＧ生成についての相対的な活性は、以下の通りである：
ＳｒＳｕｓ４＞ＳｒＳｕｓ１‐タグなし＞ＳｒＳｕｓ６＞ＳｒＳｕｓ２＞ＳｒＳｕｓ１＞６×Ｈｉｓ‐ＳｒＳｕｓ１＞ＳｒＳｕｓ３
＜実施例１３：カンナビノイドグリコシドの改善したｉｎ ｖｉｔｒｏの触媒反応＞
ＵＧＴ酵素によるカンナビノイドグリコシドの形成は、ヌクレオチド糖供与体ＵＤＰＧを、化学量論的な量、必要とすることから、グリコシル化反応の後、消費されたＵＤＰを、再循環または再捕捉することには利点がある。ステビア レバウディアナに由来するＳＵＳ４アイソフォームを利用して、投入するヌクレオチドとしてＵＭＰのみを使用して、カンナビノイドグリコシドを生成することに成功した。
２段階反応がおこり、１段階目は、ＵＭＰからＵＤＰを生成し、２段階目は、ＵＧＴ反応と並行して、ＵＤＰからＵＤＰＧを生成する。はじめに、５０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．２、２００ｍＭのＵＭＰジナトリウム塩、２００ｍＭのＡＴＰジナトリウム塩、１ＭのＭｇＣｌ２、５０％のグリセロール中の１０％のＵＭＰＫ組換え酵素を含む５Ｌの反応物を調製した。反応物を、２８℃において、かき混ぜながら、２４時間より長くインキュベートした。５Ｌの反応物１を、０．４５ミクロンでろ過して沈殿物を取り除き、それから、５０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．２、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、２００ｍｌのＤＭＳＯ中の２００ｍｇのＣＢＤ、５０％のグリセロール中の５ＬのＵＧＴ７６Ｇ１、５０％のグリセロール中の２．５ＬのＳｒＳＵＳ４を含む５０Ｌの反応物に加えた。主要な５０Ｌ反応物を、それから混合し、反応させた。反応が完了した後、２００ｍｌのＤＭＳＯ中の追加の２００ｍｇのＣＢＤを加え、同じ条件で、インキュベーションを続けた。反応によって残りのＣＢＤが消費された後、混合液を、５ｋＤａの限界ろ過膜を用いて、タンジェンタルフローろ過によってろ過し、酵素および微粒子を取り除き、それから５００Ｄａのナノろ過膜を用いて濃縮した。カンナビノイドを含むナノろ過残余分をそれから水和したＣ１８フラッシュカラムに加え、１０〜３０％のメタノールで洗浄し、４０〜６５％のエタノールで溶出した。溶出液をそれからロータリーエバポレーションによって濃縮して、すべての溶媒を取り除き、真空のビーカー中でシェル凍結（ｓｈｅｌｌ−ｆｒｏｚｅｎ）し、凍結乾燥させた。それから生成された粉末状のカンナボシドを回収し、−２０℃において封をしたバイアル内で貯蔵した。スクロースのストック溶液のオートクレーブは、反応活性を大きく低下させることから、キャラメル化および糖分解を防ぐために、スクロースはろ過滅菌されるべきである。
本発明の前述の実施形態は、例示であり、多くの方法によって変更することができることは明らかである。このような現在または将来の変形は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱であると見なされるべきではなく、当業者には明らかであろうそのようなすべての変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
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Claims (79)

  1. 式（Ｉ）を有するカンナビノイドグリコシドプロドラッグ化合物、またはその薬学的に適合する塩：

    （式中、Ｒは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；
    Ｒ’は、Ｈ、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル、または３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルであり；かつ
    Ａは、カンナビノイド化合物、エンドカンナビノイド化合物、またはバニロイド化合物の、ヒドロキシル基の反応を通して形成されたアグリコン部分構造である。）。
  2. 請求項１に記載の化合物であって、ＡはＡ’、Ａ’’、またはＡ’’’であり、
    Ａ’は：
    Ａ’’は：
    かつ
    Ａ’’’は：
    Ｇは、Ｈ、β‐Ｄ‐グルコピラノシル、３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル、またはβ‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１→３）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１→３）‐Ｄ‐グルコピラノシルである、化合物。
  3. ＡはＡ’である、請求項２に記載の化合物。
  4. Ａ’は：

    であり；
    Ｇは上述した通りである、請求項３に記載の化合物。

  5. から選ばれる、請求項４に記載の化合物。
  6. Ａ’は：


    であり；
    Ｇは上述した通りである、請求項３に記載の化合物。
  7. から選ばれる、請求項６に記載の化合物。
  8. Ａ’は：

    である、請求項３に記載の化合物。

  9. から選ばれる、請求項８に記載の化合物。
  10. Ａ’は：

    である、請求項３に記載の化合物。
  11. から選ばれる、請求項１０に記載の化合物。
  12. ＡはＡ’’である、請求項２に記載の化合物。
  13. Ａ’’は：
    である、請求項１２に記載の化合物。
  14. から選ばれる、請求項１３に記載の化合物。
  15. Ａ’’は：
    であり；
    Ｇは上述した通りである、請求項１２に記載の化合物。
  16. から選ばれる、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ａ’’は：
    であり、
    Ｇは上述した通りである、請求項１２に記載の化合物。

  18. から選ばれる、請求項１７に記載の化合物。
  19. Ａ’’は：
    である、請求項１２に記載の化合物。

  20. から選ばれる、請求項１９に記載の化合物。
  21. ＡはＡ’’’である、請求項２に記載の化合物。
  22. Ａ’’’は：
    である、請求項２１に記載の化合物。
  23. から選ばれる、請求項２２に記載の化合物。
  24. Ａ’’’は：
    である、請求項２１に記載の化合物。

  25. から選ばれる、請求項２４に記載の化合物。
  26. Ａ’’’は：
    であり、
    Ｇは上述した通りである、請求項２１に記載の化合物。
  27. から選ばれる、請求項２６に記載の化合物。
  28. ＶＢ１０２、ＶＢ１０３、ＶＢ１０４、ＶＢ１０５、ＶＢ１０６、ＶＢ１０７、ＶＢ１０８、ＶＢ１０９、ＶＢ１１０、ＶＢ１１１、ＶＢ１１２、ＶＢ１１３、ＶＢ１１４、ＶＢ１１５、ＶＢ１１６、ＶＢ１１７、ＶＢ１１８、ＶＢ１１９、ＶＢ１２０、ＶＢ１２１、ＶＢ１２２、ＶＢ１２３、ＶＢ１２４、ＶＢ１２５、ＶＢ１２６、ＶＢ１２７、ＶＢ１２８、ＶＢ１２９、ＶＢ１３０、ＶＢ１３１、ＶＢ１３２、ＶＢ１３３、ＶＢ１３４、ＶＢ２０２、ＶＢ２０３、ＶＢ２０４、ＶＢ２０５、ＶＢ２０６、ＶＢ２０７、ＶＢ２０８、ＶＢ２０９、ＶＢ２１０、ＶＢ２１１、ＶＢ２１２、ＶＢ２１３、ＶＢ２１４、ＶＢ２１５、ＶＢ２１６、ＶＢ２１７、ＶＢ２１８、ＶＢ２１９、ＶＢ２２０、ＶＢ２２１、ＶＢ２２２、ＶＢ２２３、ＶＢ２２４、ＶＢ２２５、ＶＢ２２６、ＶＢ２２７、ＶＢ２２８、ＶＢ２２９、ＶＢ２３０、ＶＢ２３１、ＶＢ２３２、ＶＢ２３３、ＶＢ２３４、ＶＢ３０１、ＶＢ３０２、ＶＢ３０３、ＶＢ３０４、ＶＢ３０５、ＶＢ３０６、ＶＢ３０７、ＶＢ３０８、ＶＢ４０２、ＶＢ４０３、ＶＢ４０４、ＶＢ４０５、ＶＢ４０６、ＶＢ４０７、ＶＢ４０８、ＶＢ５０２、ＶＢ５０３、ＶＢ５０４、ＶＢ５０５、ＶＢ５０６、ＶＢ５０７、ＶＢ５０８、ＶＢ６０２、ＶＢ６０３、ＶＢ６０４、ＶＢ６０５、ＶＢ６０６、ＶＢ６０７、ＶＢ６０８、ＶＢ６０９、ＶＢ６１０、ＶＢ６１１、ＶＢ６１２、ＶＢ６１３、ＶＢ６１４、ＶＢ６１５、ＶＢ６１６、ＶＢ６１７、ＶＢ６１８、ＶＢ６１９、ＶＢ６２０、ＶＢ６２１、ＶＢ６２２、ＶＢ６２３、ＶＢ７０２、ＶＢ７０３、ＶＢ７０４、ＶＢ７０５、ＶＢ７０６、ＶＢ７０７、ＶＢ７０８、ＶＢ７０９、ＶＢ７１０、ＶＢ７１１、ＶＢ７１２、ＶＢ７１３、ＶＢ７１４、ＶＢ７１５、ＶＢ７１６、ＶＢ７１７、ＶＢ７１８、ＶＢ７１９、ＶＢ７２０、ＶＢ７２１、ＶＢ７２２、ＶＢ７２３、ＶＢ８０２、ＶＢ８０３、ＶＢ８０４、ＶＢ８０５、ＶＢ８０６、ＶＢ８０７、ＶＢ８０８、ＶＢ９０２、ＶＢ９０３、ＶＢ９０４、ＶＢ９０５、ＶＢ９０６、ＶＢ９０７、ＶＢ９０８、ＶＢ１００２、ＶＢ１００３、ＶＢ１００４、ＶＢ１００５、ＶＢ１００６、ＶＢ１００７、ＶＢ１００８、ＶＢ１１０２、ＶＢ１１０３、ＶＢ１１０４、ＶＢ１１０５、ＶＢ１１０６、ＶＢ１１０７、ＶＢ１１０８、ＶＢ１１０９、ＶＢ１１１０、ＶＢ１１１１、ＶＢ１１１２、ＶＢ１１１３、ＶＢ１１１４、ＶＢ１１１５、ＶＢ１１１６、ＶＢ１１１７、ＶＢ１１１８、ＶＢ１１１９、ＶＢ１１２０、ＶＢ１１２１、ＶＢ１１２２、ＶＢ１１２３、ＶＢ１１２４、ＶＢ１１２５、ＶＢ１１２６、ＶＢ１１２７、ＶＢ１１２８、ＶＢ１１２９、ＶＢ１１３０、ＶＢ１１３１、ＶＢ１１３２、ＶＢ１１３３、ＶＢ１１３４、ＶＢ１１３５、およびＶＢ１１３６から選ばれる、化合物。
  29. 請求項１から２８のいずれか１項に記載の化合物、および薬学的に許容される担体、希釈剤、添加剤、またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
  30. 被験者に対するカンナビノイド薬の部位特異的送達のための方法であって、請求項１から２８のいずれか１項のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを投与する工程を含む、方法。
  31. 前記カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、経口投与のために調合されている、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記カンナビノイドグリコシドプロドラッグは、非経口投与のために調合されている、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記カンナビノイドグリコシドは、経皮投与のために調合されている、請求項３０に記載の方法。
  34. 被験者に対するカンナビノイド薬の部位特異的送達のための方法であって、請求項２９に記載の薬学的組成物を、それを必要とする被験者に対して投与する工程を含む、方法。
  35. 前記薬学的組成物は、経口投与のために調合されている、請求項３４に記載の方法。
  36. 薬学的組成物は、非経口投与のために調合されている、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記薬学的組成物は、経皮投与のために調合されている、請求項３４に記載の方法。
  38. カンナビノイド薬の被験者の血液脳関門を越える送達を容易にするための方法であって、請求項１から２８のいずれか１項に記載のカンナビノイドグリコシドプロドラッグを、それを必要とする被験者に投与する工程を含む、方法。
  39. 有効量の請求項１から２８のいずれか１項に定義されるカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含む、抗微生物剤。
  40. 有効量の請求項１から２８のいずれか１項に定義されるカンナビノイドグリコシドプロドラッグの、抗微生物剤としての使用。
  41. 有効量の請求項１から２８のいずれか１項に定義されるカンナビノイドグリコシドプロドラッグを含む、洗浄剤。
  42. 有効量の請求項１から２８のいずれか１項に定義されるカンナビノイドグリコシドプロドラッグの、洗浄剤としての使用。
  43. １または２以上のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  44. 前記１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グリコシルトランスフェラーゼである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼは、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記１または２以上の糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコース、ＵＤＰ‐グルクロン酸、ＵＤＰ‐マンノース、ＵＤＰ‐フルクトース、ＵＤＰ‐キシロース、ＵＤＰ‐ラムノース、ＵＤＰ‐フルオロ‐デオキシグルコース、およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項４３から４５のいずれか１項の方法。
  47. 前記糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコースである、請求項４６の方法。
  48. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  49. グリコシル化が可能である条件下で、第１のグリコシルトランスフェラーゼおよび第２のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  50. 前記糖供与体はＵＤＰ‐グルコースであり、前記第１のグリコシルトランスフェラーゼはＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼであり、および前記第２のグリコシルトランスフェラーゼはＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼである、請求項４９に記載の方法。
  51. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼ、およびＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  52. 前記カンナビノイドアグリコンは、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、またはバニロイドである、請求項４３から５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記方法によって製造される前記カンナビノイドグリコシドは、請求項１から２８のいずれか１項で定義される前記式（Ｉ）の化合物である、請求項４３から５１のいずれか１項に記載の方法。
  54. グリコシル化が可能である条件下で、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、マルトデキストリンとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  55. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースおよびマルトデキストリンとともに、カンナビノイドアグリコンをインキュベートする工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  56. 前記ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、５、または７に記載の配列を含む、請求項４４、４８、５１、５２、および５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号９に記載の配列を含む、請求項４５、５０、および５１のいずれか１項に記載の方法。
  58. スクロースシンターゼとともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項４３から５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記スクロースシンターゼは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、または２５に記載の配列を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. １または２以上のグリコシルトランスフェラーゼを、細胞または植物内で発現させてカンナビノイドアグリコンを生成させる工程、および前記カンナビノイドグリコシドを単離する工程を含む、カンナビノイドグリコシドの製造方法。
  61. １または２以上のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、低次のカンナビノイドグリコシドをインキュベートする工程を含む、高次のカンナビノイドグリコシドの製造方法。
  62. 前記１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記１または２以上のグリコシルトランスフェラーゼは、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記１または２以上の糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコース、ＵＤＰ‐グルクロン酸、ＵＤＰ‐マンノース、ＵＤＰ‐フルクトース、ＵＤＰ‐キシロース、ＵＤＰ‐ラムノース、ＵＤＰ‐フルオロ‐デオキシグルコース、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６１から６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコースである、請求項６４に記載の方法。
  66. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、低次のカンナビノイドグリコシドをインキュベートする工程を含む、高次のカンナビノイドグリコシドの製造方法。
  67. グリコシル化が可能である条件下で、第１のグリコシルトランスフェラーゼ、および第２のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１または２以上の糖供与体とともに、低次のカンナビノイドグリコシドをインキュベートする工程を含む、高次のカンナビノイドグリコシドの製造方法。
  68. 前記糖供与体は、ＵＤＰ‐グルコースであり、記第１のグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼであり、および前記第２のグリコシルトランスフェラーゼは、Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼである、請求項６７に記載の方法。
  69. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼ、およびＯｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースとともに、低次のカンナビノイドグリコシドをインキュベートする工程を含む、高次のカンナビノイドグリコシドの製造方法。
  70. 前記低次のカンナビノイドグリコシドは、低次のカンナビノイドグリコシド、低次のエンドカンナビノイドグリコシド、または低次のバニロイドグリコシドである、請求項６１から６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記方法によって製造された前記高次のカンナビノイドグリコシドは、請求項１から２８のいずれか１項に定義される、式（Ｉ）の化合物である、請求項６１から７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. グリコシル化が可能である条件下で、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、マルトデキストリンとともに、低次のカンナビノイドグリコシドをインキュベートする工程を含む、高次のカンナビノイドグリコシドの製造方法。
  73. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼおよびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ‐グルコースおよびマルトデキストリンとともに、低次のカンナビノイドグリコシドをインキュベートする工程を含む、高次のカンナビノイドグリコシドの製造方法。
  74. 前記ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、５、または７に記載の配列を含む、請求項６２、６６、６９、７０、および７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記Ｏｓ０３ｇ０７０２０００またはＯｓ０３ｇ０７０２０００‐様グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号９に記載の配列を含む、請求項６３、６８、および６９のいずれか１項に記載の方法。
  76. スクロースシンターゼとともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項６１から７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記スクロースシンターゼは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３または２５に記載の配列を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、ＵＤＰ−グルコースとともに、低次のグリコシドをインキュベートする工程を含み、
    前記低次のグリコシドはステビオールグリコシド以外である、高次のグリコシドの製造方法。
  79. グリコシル化が可能である条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１‐様グルコシルトランスフェラーゼの存在下で、アグリコンをＵＤＰ−グルコースとともにインキュベートする工程を含む、グリコシドの製造方法。
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