KR20170010019A - 방사선 및 화학적 손상으로부터 보호하기 위한 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(ｓｄｇ) 및 관련 화합물의 용도 - Google Patents

방사선 및 화학적 손상으로부터 보호하기 위한 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(ｓｄｇ) 및 관련 화합물의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20170010019A
KR20170010019A KR1020167037042A KR20167037042A KR20170010019A KR 20170010019 A KR20170010019 A KR 20170010019A KR 1020167037042 A KR1020167037042 A KR 1020167037042A KR 20167037042 A KR20167037042 A KR 20167037042A KR 20170010019 A KR20170010019 A KR 20170010019A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sdg
exposed
subject
radiation
cells
Prior art date
Application number
KR1020167037042A
Other languages
English (en)
Inventor
멜포 크리스토피도-솔로미도
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 filed Critical 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
Publication of KR20170010019A publication Critical patent/KR20170010019A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/075—Ethers or acetals
    • A61K31/085—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon
    • A61K31/09—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon having two or more such linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 (S,S)-SDG (R,R)-SDG, (S,R)-SDG (R,S)-SDG, SDG, SECO, EL, ED, 이의 유사체, 이의 입체이성체 및 다른 관련 분자를 사용하는 치료 및 예방 방법을 사용하는 방사선 방호 및 화학 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

방사선 및 화학적 손상으로부터 보호하기 위한 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(ＳＤＧ) 및 관련 화합물의 용도{USE OF SECOISOLARICIRESINOL DIGLUCOSIDES (SDGs) AND RELATED COMPOUNDS FOR PROTECTION AGAINST RADIATION AND CHEMICAL DAMAGE}
정부 관심
본 발명은 국립 보건원(National Institute of Health)이 수여한 허가 번호 R01 (CA133470), 1P30 ES013508-02, RC1AI081251 및 5-P30-CA-016520-34S2하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 입체이성체, 이의 대사산물 및 이의 유사체를 사용하여, 예를 들면, 발암 물질 유발 폐암 및 중피종으로부터 또는 차아염소산염 이온으로부터 방사선 방호 및 방사선 완화 및 화학 예방하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다.
이온화 방사선은 살아있는 유기체에 광범위한 범위의 해로운 효과를 생성한다. 인간은 전자 장치를 사용하는 경우, 진단 및 치료 방사선 치료 동안 직업상의 위험으로서, 원자력 사고의 배경 방사선으로부터, 공기 및 우주 여행 중 뿐만 아니라 장시간의 태양 노출(예: 일광욕을 하는 사람 또는 실외 노동자)로부터 방사선에 노출된다. 자연 방사선에의 노출은 여러 형태로 발생할 수 있다: 공기, 물 및 토양과 같은 천연 자원은 자연적으로 발생하는 방사선 방출 물질(방사선 핵종)과 접촉하면 오염될 수 있고, 라돈은 자연 방사선의 일반적인 공급원 중의 하나이다. 현재 전세계적인 개발은 잠재적으로 많은 사람들이 치명적인 양의 방사선에 노출될 수 있는 위험한 수단으로서 테러를 추가로 확립했다. 따라서, 방사선 노출 전 및 동안(즉, 방사선 방호제) 및 방사선 노출 후 치료(즉, 방사선 완화제)로서 투여될 수 있는 제제를 동정하는 것이 매우 중요하다.
또한, 폐암은 미국에서 암 사망의 주 원인이다. 국소 진행된 폐암에 대한 새로운 표적 치료제, 개선된 병기 및 수술 기술 및 수반되는 화학방사선 요법의 사용 증가에도 불구하고, 전체 사망률의 최소 감소만이 존재했다(참조: Tan & Spivack (2009) Lung Cancer 65:129-137). 암 화학 예방은 악성 종양이 발병하기 전에 발암 과정을 예방하고, 억제하거나 역전시키도록 설계된 특정 천연 또는 합성 제제에 의한 식이 및 약리학적 개입의 사용으로서 정의되었다(참조: Hong & Sporn, (1997). Science 278:1073-1077). 폐암 화학 예방에 대한 하나의 전략은 해독제 단계 II 효소의 상향조절을 통해 담배, 환경 및 다른 발암 물질의 대사와 소인을 조절하는 제제의 사용에 초점을 맞춘다. 많은 합성 및 천연 화합물은 단계 II 효소의 발현을 유도하는 것으로 공지되어 있다. Nrf2/ARE-조절된 단계 II 효소가 발암 물질에 대한 감수성을 저하시키기 위한 매우 유효한 전략이다는 개념을 지지하는 다수의 보고가 있다. 본 발명자들은 천연 물질의 풍부화 및 합성적 유래 둘 다로부터 아마인(FS) 및 이의 주요 리그난 SDG가 화학 발암 물질 유발 폐암의 마우스 모델에서 효과적인 폐암 화학 예방제임을 보여주는 데이터를 갖는다.
폐암의 약 85%는 흡연에 의해 유발된다. 담배 연기의 주요 폐암 발암 물질은 벤조[a]피렌(BaP)으로 대표되는 다환 방향족 탄화수소이다. 더 우수한 치료가 개발될 때까지, 사망을 줄이기 위한 최선의 희망은 스크리닝, 금연 또는 화학 예방을 통한 예방일 것이다. 화학 예방제는 많은 수의 노출되었지만 비교적 건강한 대상체에게 장기간 투여해야 한다. 그들은 안전하고, 무독성이고, 맛있고, 이상적으로 알맞은 가격이어야 한다. 다수의 화학 예방제가 폐암에서 연구되었지만, 어떤 것도 이러한 기준을 충족시키지 않는다. 가장 유망한 접근법 중의 하나는 단계 II 항산화 및 해독 효소의 상향조절이다. 불행히도, 지금까지 환자에게 시험된 단계 II 효소 활성화제, 예를 들면, 올티프라즈 또는 설포로판은 허용되지 않게 독성인 것으로 입증되었다(참조: Pendyala et al. (2001). Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10:269-272.). 따라서, 산화적 스트레스 및 담배 연기 중의 폐 발암 물질에 의해 유도된 DNA 손상을 예방하는데 효과적인 안전한 무독성 화학 예방제가 몹시 필요하다.
또 다른 익히 공지된 환경 발암 물질은 단열재료서 상업적으로 사용된 천연 수화된 섬유상 규산염 섬유 그룹을 의미하는 석면이다. 이하, 동물 모델 및 환자 모두에서, 석면 섬유 흡입이 악성 중피종(MM) 및 폐암과 같은 종양성 질환(참조: Carbone & Yang (2012). Clin Cancer Res 18:598-604; Neri et al. (2012). Anticancer Res 32:1005-1013) 뿐만 아니라 폐 섬유증을 유도할 수 있다는 것이 명확하게 확립되었다. MM은 약 1년의 중간 생존기간을 갖는 흉막 및 복막의 중피 세포로부터 생기는 매우 공격적인 암이다(참조: Sterman et al. (2005). Clin Cancer Res 11, 7444-7453; Sterman et al. (1999). Chest 116, 504-520; Benard et al. (1999). J Nucl Med 40, 1241-1245). 매우 초기 질환에서 수술 이외의 현재 치료법은 치료 효과가 없다(참조: Sterman & Albelda (2005). Respirology 10, 266-283.). 현재, MM은 미국에서 연간 약 3,000명의 사망을 유발하고, 서유럽에서 추가의 5,000명의 사망을 유발한다.
석면 사용이 많은 서양 국가에서 제한되었지만, 전세계 여러 나라에서 여전히 사용되고 있고, 2008년에는 2백만톤 이상이 채굴된 것으로 추정된다(참조: Survey, B.G. (2010). World Mineral Production 2004-08. Nottingham, UK, British Geological Survey). 따라서, 석면의 사용이 거의 예방 없이 증가된 제3 세계(특히, 인도)에서 MM 사례가 크게 증가할 것이다. 그러나, 선진국에서도 중요한 노출은 여전히 존재한다. 이들은 슈퍼 펀드 석면 유해 페기물 사이트 뿐만 아니라 기존의 석면(즉, 배관공, 파이프 피팅, 단열재, 단열재 제거 등)에 근로자를 노출시키는 다양한 종류의 직업을 포함한다. 또한, 환경 및 가정 노출이 존재한다. 예를 들면, 광업 또는 석면 공장이 폐쇄된 지역에서 MM의 위험이 증가된다.
석면과 암의 연관성에서 주요 문제는 흡입된 석면 섬유가 환자가 노출로부터 제거되는 경우에도 매우 장시간 동안 폐에 지속되어 연속적인 손상을 일으킬 수 있다는 것이다. 이 긴 잠복기(흔히, 30 내지 50년까지) 때문에, 과거에 노출된 개체는 평생 동안 MM 및 다른 암의 위험이 증가한다.
암의 화학 예방은 발암 개시 단계 또는 종양 세포의 암으로의 진행을 예방하고, 정지시키거나 역전시키는 것을 목표로 한다. 이 정의는 간단하기는 하지만, 효과적인 화학 예방제를 찾는 것은 매우 어려웠다. 첫째, 발암 물질이 암을 유발하는 메카니즘은 일반적으로 다수의 메카니즘을 포함하여, 효능 도전을 하고 다수의 작용을 갖는 제제를 필요로 한다. 둘째, 이 제제가 건강하지만 위험한 개체의 많은 집단에서 적은 수의 종양을 예방하는데 사용되기 때문에, 이는 매우 무독성이고 충분히 내성이고 경제적이어야 한다.
따라서, 발암 물질 또는 다른 유해한 화학 제제, 예를 들면, 화학전 제제, 염소 및 차아염소산염 이온 및 다른 유해한 독성 물질에 노출 전 및 동안 투여될 수 있는 제제(즉, 화학 예방제)를 동정하는 것이 또한 매우 중요하다.
하나의 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 대상체에게의 투여는 손상성 방사선 노출에 노출 전, 동안 및 후 투여를 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 방사선에 노출되었거나 노출될 대상체에서 방사선 손상을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 우발적 방사선 노출로부터 생성되는 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해 물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 노화를 유도하는 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 화학적 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 노출로부터 생성되는 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암 치료를 위한 방사선 요법으로부터 생성되는 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방사선 손상은 우발적 방사선 노출로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 방사선 손상은 암(예: 폐암) 치료를 위한 방사선 요법으로부터 생성된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직에 대한 방사선 유발 손상을 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직에 대한 방사선 유발 손상을 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 세포를 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 발암 물질 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 대상체에의 투여는 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에 노출 전, 동안 및 후 투여를 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에의 우발적 노출로부터 생성되는 발암 물질 손상으로부터 생체 분자를 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 폐암 또는 중피종을 유발하는 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질로부터의 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 발암 물질 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 생체 분자, 세포 또는 조직과의 접촉은 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에의 노출 전, 동안 및 후 접촉을 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 발암 물질 유발 암으로부터의 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될 대상체에서 발암 물질 유발 손상, 악성 형질 전환 및 암 발병을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 발알 물질 유발 암으로부터의 하나 이상의 발암 물질에 노출된 대상체를 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 차아염소산염 이온에 의한 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해 물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 대상체에게의 투여는 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에의 노출 전, 동안 및 후 투여를 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 차아염소산염 이온에 노출되었거나 노출될 대상체에서 차아염소산염 이온 유발 손상을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 차아염소산염 이온에 의한 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 차아염소산염 이온에 노출되었거나 노출될 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 생체 분자, 세포 또는 조직과의 접촉은 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에의 노출 전, 동안 및 후 접촉을 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상기한 방법 중의 하나에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명할 것이기 때문에 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내면서 단지 예시로써 제공되는 것으로서 이해되어야 한다. 또한, 적절한 경우, 본 발명의 임의의 구현예가, 구현예가 본 발명의 상이한 국면하에 기재되더라도 본 발명의 하나 이상의 다른 구현예와 배합될 수 있음이 예상된다.
도 1: 플라스미드(pBR322) DNA 완화에 대한 γ 방사선의 증가하는 조사량의 효과. 슈퍼 코일(SC)은 압축 형태를 나타낸다. 개방 코일(OC) 형태는 플라스미드의 완화되거나 손상된 형태를 나타낸다. ( a) - 슈퍼 코일(SC) 형태는 하위 현저한 밴드(3,000bps에서)인 반면, 개방 코일(OC) 형태는 상부 현저한 밴드이다. 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 플라스미드 DNA, 레인 4 및 5 - 10 Gy에 노출된 플라스미드 DNA, 레인 6 및 7 - 25 Gy에 노출된 플라스미드 DNA, 및 레인 8 및 9 - 50 Gy에 노출된 플라스미드 DNA. (b) - SC 및 OC 형태는 전체 플라스미드 DNA의 퍼센트로서 나타낸다. 각 조건에 대해, 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 나타낸다. P< 0.05는 유의한 것으로 간주된다. * 및 **는 각각 처리되지 않은 SC 및 OC 형태와 비교하여 상당한 차이를 나타낸다.
도 2: γ 방사선 유발 플라스미드 (pBR322) DNA 완화에 대한 합성 SDG (S,S), SDG (R,R) 및 상업적 SDG의 증가하는 농도의 효과. 모든 샘플은 25 그레이의 γ 방사선에 노출시켰다. SDG 농도는 25, 50, 100 및 250μM였다. 도 (a), (d) 및 (g)에서 - 25, 50, 100 및 250μM의 SDG ( S,S ), SDG ( R,R ) 및 SDG (상업적)의 존재하에 25Gy에 노출 후 플라스미드 DNA의 대표적인 아가로스 겔 스캔이 도시된다. 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 플라스미드 DNA, 레인 4 및 5 - 25μM, 레인 6 및 7 - 50μM, 레인 8 및 9 - 100M, 및 레인 10 및 11 - 250μM SDG. 도 (b), (e) 및 (h) - SC 및 OC 형태는 전체 플라스미드 DNA의 퍼센트로서 나타낸다. 각 조건에 대해, 모든 샘플을 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. P< 0.05는 유의한 것으로 간주된다. * 및 #는 각각 처리되지 않은 SC 및 OC 형태와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. ** 및 ##는 SDG 없이 25 Gy에 노출된 샘플과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. 도 (c), (f) 및 (i)에서, 플라스미드 DNA 완화의 SDG 의존 억제가 나타낸다. EC50 값은 곡선하에 제시된 2차 방정식으로부터 결정되었다.
도 3: 송아지 흉선 DNA 단편화에 대한 γ 방사선량의 증가 효과. γ-방사선에 노출된 DNA는 고분자량 DNA보다 더 빨리 이동하는 작은 분자량의 단편을 생성한다. 고분자량 DNA(>6,000bps)와 비교하여 저분자량 DNA 단편(<6,000bps)의 밀도를 결정하는 것은 방사선 유발 손상 정도를 반영한다. ( a) 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 송아지 흉선 DNA, 레인 4 및 5 - 25Gy에 노출된 DNA 및 레인 6 및 7 - 50Gy에 노출된 DNA. ( b) 고 및 저분자량 DNA 형태는 전체 DNA의 퍼센트로서 나타낸다. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *는 각각 처리되지 않은 형태와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 4: γ 방사선 유발 송아지 흉선 DNA 단편화에 대한 합성 SDG (S,S), SDG (R,R) 및 상업적 SDG의 증가하는 농도의 효과. 모든 샘플은 50 Gray의 γ 방사선량에 노출시켰다. SDG 농도는 25, 50, 100 및 250μM이었다. 도 (a), (c) 및 (e)에서 - 25, 50, 100 및 250μM SDG ( S,S ), SDG ( R,R ) 및 SDG (상업적)의 존재하에 50 Gy에 노촐 후 송아리 흉선 DNA의 대표적인 아가로스 겔 스캔이 도시된다. 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 DNA, 레인 4 및 5 - 25μM, 레인 6 및 7 - 50μM, 레인 8 및 9 - 100μM, 및 레인 10 및 11 - 250μM SDG. 도 (b), (d) 및 (f) - 고 및 저분자량 DNA 형태는 전체 DNA의 퍼센트로서 나타낸다. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. P< 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *는 처리되지 않은 DNA와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. #은 SDG 없이 50 Gy에 노출된 샘플과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 5: γ 방사선 유발 송아지 흉선 DNA 단편화에 대한 합성 SDG (S,S), SDG (R,R) 및 상업적 SDG의 매우 저농도의 효과. 모든 샘플은 50 Gy의 γ 방사선량에 노출시켰다. SDG 농도는 0.5, 1.0, 5.0 및 10μM이었다. 도 (a), (c) 및 (e)에서 - 0.5, 1.0, 5.0 및 10μM SDG ( S,S ), SDG ( R,R ) 및 SDG (상업적)의 존재하에 50 Gy에 노출 후 송아지 흉선 DNA의 대표적인 아가로스 겔 스캔이 도시된다. 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 DNA, 레인 4 및 5 - 0.5μM, 레인 6 및 7 - 1.0μM, 레인 8 및 9- 5.0μM, 및 레인 10 및 11 - 10μM SDG. 도 (b), (d) 및 (f)에서 - 고 및 저분자량 DNA 형태는 전체 DNA의 퍼센트로서 나타낸다. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *는 처리되지 않은 DNA와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. #은 SDG 없이 50 Gy에 노출된 샘플과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 6: γ 방사선 유발 송아지 흉선 DNA 단편화에 대한 SDG, SECO, ED 및 EL의 효과. 모든 샘플은 50 Gy의 γ 방사선량에 노출시켰다. SDG, SECO, ED 및 EL은 10μM 농도로 사용되었다. (a) 10μM SDG, SECO, ED 및 EL의 존재하에 50 Gy에 노출 후 송아지 흉선 DNA의 대표적인 아가로스 겔 스캔이 도시된다. 레인 1 -1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 DNA, 레인 4, 5 및 6 - IR 50 Gy, 레인 7 및 8 - SDG, 레인 9 및 10- SECO, 레인 11 및 12- ED, 및 레인 13 및 14 - EL. (b) 고 및 저분자량 DNA 형태는 전체 DNA의 퍼센트로서 나타낸다. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *는 처리되지 않은 DNA와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다. #은 50 Gy에만 노출된 샘플과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 7: 마우스 원발성 폐 세포의 방사선량 반응에 대한 SDG 처리의 효과. (a) 상피 세포; (b) 내피 세포 및 (c) WT 섬유아세포. 세포는 감마선 조사(0, 2, 4, 6, 8Gy) 전 6시간 동안 SDG의 상이한 농도로 처리하고, 배양했다. 모든 가시성 콜로니는 12 내지 14일째에 계수하였고, 생존 분획은 대조군 값에 대해 표준화하였다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타낸다. 조사된 세포의 경우 ** p≤ 0.001 * p≤ 0.01, #p≤ 0.05 대 전처리된 조사 세포 50μM SDG.
도 8: 알칼리성 코멧 검정을 사용하여 폐 세포 중의 방사선 유발 DNA 일본쇄 절단(SSB)의 평가. (a) 2-Gy 감마선 조사된 원발성 폐 세포(상피 세포, 내피 세포 및 WT 섬유아세포)에서 DNA 손상의 동태학적 평가; 적어도 100 내지 150개 세포를 각 처리에 대해 계수했다. DNA 손상은 각 세포에 대해 "꼬리 모멘트"를 계산함으로써 평가했다(꼬리 중의 DNA의 양 X 꼬리 길이의 생성물). * 비조사된 대조군의 경우 p≤ 0.001 대 그들 각각의 조사된 세포; (b) 조사된 원발성 폐 세포에 대한 SDG (50μM) 처리(조사 0, 2, 4, 6시간 전). 데이터는 평균±SEM으로서 나타낸다. 조사된 세포 대 SDG 전처리 조사 세포에 대한 * p≤ 0.001, #p≤ 0.01. 삽입: 원발성 폐 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 사진. 세포는 SDG(50μM)로 전처리하고, g-방사선(2 Gy)에 노출시키고, 아카로스에 매립하고, 용해시키고, 전기영동을 수행하고(0.66V/cm, 25분), SYBR 그린으로 염색하고, 형광 현미경하에 가시화한 후, 코멧 꼬리 형성에 대해 시험하였다. (A) 대조군 세포, (B) SDG (50μM), (C) 노출 30분 후 IR (2 Gy), (D) SDG(50μM, 6h)로 전처리되고 조사된 세포.
도 9: 조사된 뮤린 원발성 폐 세포 대 상피 세포, 내피 세포 및 WT 섬유아세포에서 γ-H2AX 병소의 유도의 형광 평가. 세포는 6시간 동안 SDG(50μM)로 처리하고, 감마선-조사했다(2 Gy). 목적하는 시간 간격으로, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, γ-H2AX 항체로 프로빙하고, 핵을 DAPI를 사용하여 대비염색시켰다. 세포를 형광 현미경하에 가시화하였다. 전체 세포(블루) γ-H2AX 양성 세포(그린)는 필드당 계수하였고, γ-H2AX 양성 세포의 퍼센트를 계산하였다. 적어도 500개의 세포를 각 처리당 계수하였고, 실험은 2회 수행하였다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타낸다. 조사된 세포 대 SDG 전처리된 조사 세포에 대하여 *p≤ 0.05, ** p≤ 0.005.
도 10: 뮤린의 폐 상피 세포에서 γ-H2AX 병소(그린)의 면역형광 가시화의 대표적인 패널. 세포를 SDG로 6시간 동안 전처리하고, 감마선 조사하고(2 Gy), 추가로 30분 동안 배양하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, γ-H2AX 항체로 프로빙하였다. DNA를 DAPI(블루)로 대비염색시켰다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 획득하였다.
도 11: 조사된 뮤린 원발성 폐 세포에서 γ-H2AX 병소 유발의 유동 세포 계측(FACS) 확인. 원발성 폐 세포 대 상피 세포(A), 내피 세포(B) 및 WT 섬유아세포(C)를 6시간 동안 SDG (50μM)로 처리하고, 감마선 조사하였다(2 Gy). 목적하는 시간 간격으로, 세포를 FACS 분석을 위해 처리하였다. 데이터는 수미트(Summit) 소프트웨어를 사용하여 정량화하고, 평균±SEM으로서 나타낸다. 조사된 세포 대 SDG 전처리 조사 세포에 대하여 *p≤ 0.05, ** p≤ 0.01.
도 12: 원발성 폐 세포에서 방사선 유발 세포자멸사 사망의 평가. 조사된 원발성 폐 세포 대 상피 세포(A), 내피 세포(B) 및 WT 섬유아세포(C)에 대한 SDG( 50mM) 전처리(6시간) 효과의 정량적 평가. 세포를 고정시키고, DAPI로 염색하고, 형광 현미경하에 형태학적 분석을 위해 가시화했다. 각 처리 후, 적어도 500개의 세포를 5개의 상이한 필드로부터 계수하였고, 세포자멸사 세포의 퍼센트를 계산하였다. 실험은 2회 수행하였다. 데이터는 평균±SEM으로서 나타낸다. 조사된 세포 대 SDG 전처리 조사 세포에 대해 *p≤ 0.05, ** p≤ 0.005.
도 13: 폐 상피 세포의 세포자멸사의 조절인자에 대한 SDG 처리 효과의 평가. 뮤린 원발성 폐 세포(상피 세포)는 2 Gy에 노출 전에 6시간 동안 SDG(50μM)로 처리했다. 세포를 조사 후 6, 24 및 48시간에 수거했다. 전체 RNA는 목적하는 시간 간격으로 상피 세포로부터 단리시키고, Bax 및 Bcl-2 유전자 발현에 대해 정량적 실시간 RT-PCR 분석에 의해 평가했다(A 및 B). 분석은 3회 수행하였고, 유전자 발현은 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. Bax 및 Bcl-2 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석; 대표적인 이미지(C) 및 β-액틴으로의 표준화에 의한 농도계 분석(D 및 E)으로 평가했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. SDG 처리 세포 또는 SDG + IR 처리 세포와 비교하여 IR-노출 세포에 대해 *p≤ 0.05, **p≤ 0.01.
도 14: 활성 카스파제-3 및 절단된 PARP의 수준의 방사선 유발성 증가에 대한 SDG의 효과. 뮤린 원발성 폐 세포(상피 세포)를 2 Gy 노출 전에 6시간 동안 SDG(50μM)로 처리했다. 세포를 방사선 조사 후 6, 24 및 48시간에 수거했다. 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 평가했다. (A) 대표적인 이미지 및 (B 및 C) β-액틴으로의 표준화에 의한 농도계 분석. 분석은 2회 수행했고, 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다. SDG 처리 세포와 비교하여 IR-노출 세포에 대해 *p≤ 0.05, **p≤ 0.01.
도 15: SDG는 차아염소산염 이온을 포착한다. 도 15a는 APF 및 HPF 형광의 ClO- 의존 증가를 도시한다. 도 15b는 SDG에 의한 ClO-의 포착을 도시한다. 도 15c는 합성 SDG 디아스테레오머 SDG(S,S) 및 SDG(R,R)의 포착 효과를 도시한다. 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 나타낸다. P< 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 16: SDG는 차아염소산염의 γ-방사선 유발 생성을 포착한다. 도 16a 및 b는 γ- 방사선 유발 증가 APF 및 HPE 형광을 도시한다. 도 16c 및 d는 APF 또는 HPE를 갖는 인산염 완충 생리 식염수(PBS) 중의 증가하는 방사선량에서 차아염소산염의 생성에 대한 SDG의 효과를 도시한다(참조: 도 15 범례). 도 16e, f 및 g는 타우린의 γ-방사선 유발 염소화를 도시한다. 도 16e는 타우린의 차아염소산염-의존 염소화를 도시한다. 도 16f는 모든 실험 조건에 대한 흡광도로서 타우린 클로라민을 도시한다. 도 16g는 도 16f에서와 같이 다양한 조건하에 차아염소산염 농도를 도시한다. 도 16a 내지 도 16e의 경우, 모든 샘플은 2회 작동시킨 반면, 도 16f 및 도 16g의 경우, 모든 샘플은 4회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 나타낸다. P< 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 17: 차아염소산염 유발 송아지 흉선 DNA 손상. 도 17a 및 도 17c는 HOCl에 노출 후 송아지 흉선 DNA의 대표적인 아가로스 겔 스캔을 도시한다. 도 17b 및 도 17d는 전체 DNA의 퍼센트로서 고 및 저분자량 DNA 단편을 도시한다. 도 17e 및 도17f는 플라스미드 DNA에 대한 차아염소산염 유발 손상에 대한 SDG의 효과를 도시한다. 도 17e는 HOCl에 노출 후 플라스미드 DNA의 대표적인 아가로스 겔을 도시한다. 도 17f는 전체 플라스미드 DNA의 퍼센트로서 제시된 SC 및 OC 형태를 도시한다. 도 17a의 경우, 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 DNA, 레인 4 및 5 - 0.1mM, 레인 6 및 7 - 0.2mM, 레인 8 및 9 - 0.4mM, 레인 10 및 11- 0.5mM 및 레인 12 및 13 - 0.6mM ClO-. 도 17c의 경우, 레인 1 - 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 DNA, 레인 4 및 0.5mM HOCl, 레인 6 및 7- 0.5mM HOCl + SDG (com) 1μM, 레인 8 및 9 - 0.5mM HOCl + SDG (S,S) 1μM, 레인 10-11 - 0.5mM HOCl + SDG (R,R) 1μM, 레인 12-13 - 0.5mM HOCl + 케르세틴 1μM 및 레인 14 및 15 - 0.5mM HOCl + 실리비닌 1μM. 도 17e의 경우, 레인 1- 1kb DNA 표준 래더, 레인 2 및 3 - 처리되지 않은 플라스미드 DNA, 레인 4 및 4.5mM HOCl, 레인 6 및 7 - 4.5mM HOCl + SDG 25μM. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 나타낸다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. * 및 #은 처리되지 않은 DNA와 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 18: 2-아미노퓨린(2-AP)의 차아염소산염 유발 변형에 대한 SDG의 효과(전- 및 후-처리). 도 18a는 모든 조건에 대한 대표적인 스펙트럼을 도시한다. 도 18b는 도 18a에서와 같이 상이한 조건하에 374nm에서 형광을 도시한다. 도 18c는 SDG에 의한 % 보호를 도시한다. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 나타낸다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. * 및 #은 각각 처리되지 않은 2-AP 대조군 및 처리된 것과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 19: SDG는 2-아미노퓨린(2-AP)의 γ- 방사선 유발 변형을 예방한다. 도 19a는 모든 조건에 대한 대표적인 스펙트럼을 도시한다. 도 19b는 374nm에서 형광을 도시한다. 각 조건에 대해, 모든 샘플은 2회 작동시켰다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 나타낸다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. * 및 #은 각각 처리되지 않은 2-AP 대조군 및 처리된 것과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 20: 핵염기 염소화로부터 DNA 보호에서 SDG 작용의 제안된 메카니즘.
도 21: 아마인 및 이의 리그난에 의한 화학 예방 메카니즘. SDG는 다단계 발암 과정을 억제함으로써 담배 및 기타 환경 발암 물질에 의한 폐 종양 발생을 완화한다. 본 발명자들은 리그난 SDG가 두 동물 모델 모두에서 Nrf2-조절 단계 II 해독 경로 및 아마도 다른 메카니즘의 조절을 통해 화학 예방 활성을 갖는다는 것을 나타내는 증거를 제공한다. 본 발명자들은, SDG의 보호 효과가 직접적인 ROS 포착 및/또는 간접적인 항산화/항염증 특성과 발암 물질 독성 및 DNA 손상의 감소에 의해 매개된다는 것을 지지하는 데이터를 추가로 제공한다.
도 22: SDG는 세포 중 벤조-알파-피렌에 의해 유발된 산화성 DNA 손상을 감소시킨다. SDG(10μM)를 25μM의 담배 및 환경 발암 물질 벤조-알파-피렌(BaP)에 노출된 인간 상피 세포(A549)에 첨가하고, DNA에 대한 산화성 손상을 8-옥소-7,8-디하이드로구아닌(8-옥소-dGuo)의 존재로 나타낸 바와 같이 질량 분석법을 사용하여 검출했다. SDG는 발암 물질 노출 후 3시간 및 6시간에 DNA 손상을 감소시켰다.
도 23: 세포 중 발암 물질 벤조-알파-피렌 유발 ROS. BaP에 뮤린 상피 세포의 노출은 산화환원-민감성 형광 염료에 의해 검출된 유해 반응성 산소 종(ROS)을 유도한다. 발암 물질에 노출 후 2시간이 지나면, 형광 강도의 강력한 증가는 세포 내 ROS 생성을 나타낸다.
도 24: SDG는 발암 물질 노출로부터 ROS 생성을 예방한다. 마우스 상피 세포를 10 또는 20μM BaP 및 증가하는 농도의 SDG(0, 0.1, 0.5, 1, 5μM SDG)에 노출시키고, ROS는 2시간 후(도 23에서 적절하게 결정된 바와 같이)에 검출했다. SDG는 유해한 ROS를 무시할 수 있는 수준으로 포착한다.
도 25: SDG는 BaP에 노출된 인간 상피 세포에서 유전독성 스트레스를 예방한다. BaP와 같은 강력한 발암 물질에 세포를 노출시키면 p53 단백질의 증가된 수준에 의해 나타낸 바와 같은 유전독성 스트레스를 유발한다. 이는 5, 10, 25 및 50μM 농도에서 SDG의 존재에 의해 조사량 의존적으로 완화된다.
도 26: SDG는 BaP에 노출된 인간 상피 세포에서 산화성 DNA 손상을 예방한다. BaP와 같은 강력한 발암 물질에 세포를 노출시키면 이본쇄 DNA 파단의 마커인 γ-H2AX의 증가된 수준에 의해 나타낸 바와 같이 산화성 DNA 손상을 유발한다. 이는 5, 10, 25, 50 및 100μM 농도의 SDG의 존재에 의해 조사량 의존적으로 완화된다.
도 27: SDG는 BaP에 노출된 인간 상피 세포에서 DNA 부가물 형성을 예방한다. BaP와 같은 강력한 발암 물질에 세포를 노출시키면 DNA 부가물의 형성을 유발한다. DNA 부가물은 발암 물질에 공유 결합된 DNA 단편이고, 악성 종양의 발병에 직접 관련된다. DNA 부가물 수준은 단독으로 또는 조합으로 제공된 SDG 또는 이의 대사산물 ED 및 EL의 존재에 의해 감소된다.
도 28: 화학 발암 물질 유발 페 종양의 마우스 모델. 마우스(A/J 균주)는 1mg/Kg 용량의 담배 및 환경 발암 물질 BaP(1주일에 1번)를 복강내로 4회 주사했다. 마우스는 노출시 아마인 또는 리그난 식이로 개시하였다. 마우스는 종양 부하, 마우스 체중 및 전체적인 건강 프로파일을 결정하기 위해 노출 후 각 시점에서 평가한다.
도 29: 아마인은 마우스의 종양 부담을 감소시킨다: 발암 물질에 노출된 뮤린 폐의 전반적인 병리학적 프로파일. BaP 노출 및 식이성 아마인 투여 수개월 후 뮤린 폐의 대표적인 임상적 이미지.
도 30: 아마인은 마우스의 종양 부담을 감소시킨다: 발암 물질에 노출된 뮤린 폐의 조직병리학적 프로파일. BaP 노출 및 식이성 아마인 투여 수개월 후 뮤린 폐의 대표적인 H&E-긴장 폐 절편. 대조군 식이(상부 패널) 또는 아마인(하부 패널)을 공급한 마우스로부터 화살표로 나타낸 결절은 아마인 공급 마우스에서 더 작게 나타난다. 각 패널은 상이한 동물을 나타낸다.
도 31: 아마인은 마우스의 종양 부담을 감소시킨다: 종양 부담의 정량적 평가. 조직학적 뮤린 폐 절편은 전체 종양 면적(A) 및 결절 크기(B)에 대해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형태학적으로 평가했다. 아마인 식이를 공급한 마우스에서 종양이 차지하는 폐의 면적의 유의한 감소가 있었다(p<0.03). 유사하게, 보다 적은 종양 결절 크기의 경향이 있었다.
도 32: 아마인은 마우스의 종양 부담을 감소시킨다: 종양 부담의 정량적 평가. 조직학적 뮤린 폐 절편은 폐당 종양 결절의 전체 수(A) 및 폐를 침입하는 % 종양(B)에 대해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형태학적으로 평가했다. 폐당 종양 결절이 적고(A), 아마인 보충으로 침입하는 종양이 덜하다(B)는 경향이 있었다.
도 33: 아마인 보충은 BaP에 의해 유발된 폐암으로부터 낭비 효과를 예방한다. 동물 체중은 BaP 노출 후 200일 동안 종방향으로 측정했다. BaP에 노출된 아마인 식이를 공급한 마우스는 대조군 식이 상의 BaP에 노출된 것들보다 높은 체중을 나타냈다.
도 34: 실시예 5의 실험 반응식
도 35: 포유동물 리그난 대사산물은 아마인(FS) 및 아마인 리그난 성분(FLC)-보충 식이의 매일 섭취 후 4일에 혈액에서 검출가능하다. 구체적으로, 엔테로디올(ED) 및 엔테로락톤(EL)은 액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분석법(LC/MS/MS)을 사용하여 검출될 수 있다. 식이는 2개의 식이에서 검출가능한 리그난 대사산물 수준에 반영된 필적할 만한 리그난 수준을 전달하도록 설계되었다.
도 36: 석면 노출 전 제공된 아마인(FS) 및 아마인 리그난 성분(FLC)은 대식세포(MF), 호중구(PMN) 및 림프구(Ly)의 수에 의해 증명된 바와 같이 복강내(ip) 청석면 석면 주사에 의해 유발된 복부 염증을 무디게 한다. 구체적으로, FS 및 FLC는 복부에 대식세포 유입을 상당히 감소시켰다. *p<0.05
도 37: 마우스는 FS 및 FLC 식이로 개시하고, 24시간 후에 석면에 노출시켰다. 혈장(B, D) 및 복부(A, C) 중 사이토카인 수준(TNFα 및 IL-1β)은 도 34에서 실험 반응식에 따라 노출 3일 후에 ELISA를 사용하여 결정하였다. 두 식이는 복부에서 전염증성 사이토카인의 분비 및 석면 노출에 의해 유발된 전신 순환을 예방하는 경향을 나타냈다.
도 38: 염증 세포는 또한 식이(A)로 낮추는 경향이 있는 반면, 400 및 800mg 청석면 석면에 의해 유발된 TNFα(b) 및 IL-1β(C) 사이토카인 수준은 석면 노출 후 1일에 식이에 첨가된 FLC에 의해 상당히 무뎌졌다(*p<0.05). *p는 석면에 노출된 대조군 식이와 비교하여 유의성을 나타낸다.
도 39: 마우스에서 가변적인 SDG 농도의 경구 섭식 후 SDG 및 대사산물의 혈장 농도.
도 40: 마우스에서 SDG의 가변 용량의 경구 섭식 후 폐에서 항산화 효소 유전자 발현 수준.
도 41: 100mg/Kg SDG의 경구 섭식 후 혈장(A) 및 폐 조직(B)에서 SDG 수준 및 AOE 유전자 발현의 상응하는 수준(C)의 동력학.
도 42a-b: 실시예 7의 실험 반응식.
도 43: 실시예 7의 임상 연구 설계.
도 44: 10% FS의 급식이 마우스 비강 상피에서 HO-1 및 NQO-1을 증가시킨다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯.
도 45: 40g FS 식이 후 인간 구강 상피 세포에서 HO-1 유전자 발현의 동역학. (0일째로부터 *P<0.05).
도 46: FS 상의 한명의 환자에서 뇨 IsoP 수준의 동역학.
도 47: FS 상의 표준 및 폐 이식 환자의 뇨 8-옥소-dGuo의 동역학.
도 48: SDG 또는 아마인 식이는 석면 유발 ROS/염증을 감소시키는 것으로 가정된다.
도 49: 염증성 사이토카인 분비 및 질산화성/산화적 스트레스를 검출하기 위한 세포의 석면 노출 실험 계획(반응식):
도 50: SDG는 시험관내에서 인간 중피 세포에 의한 석면 유발 ROS 분비를 무디게 한다.
도 51: 배양물 RAW 대식세포에서 석면 유발 산화적 스트레스(ROS 방출)의 평가: 석면 유발 ROS는 석면 노출 직후에 생성되어 관찰 기간 동안 지속되었다.
도 52: 석면에 노출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 산화적 스트레스를 감소시킨다.
도 53: 석면에 누출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 질산화적 스트레스를 감소시킨다.
도 54: 석면에 누출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 염증성 사이토카인 분비(IL-1β)를 감소시킨다.
도 55: 석면에 누출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 염증성 사이토카인 분비(TNF-α)를 감소시킨다.
도 56: 두 마우스 모델을 사용하여 석면 유발 중피종에서 SDG 시험: 석면 노출 후 유전적으로 중피종을 발병시키는 성향이 있는 적어도 2개의 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자들은 마우스에서 석면의 단일 용량에 대한 아마인 및 SDG의 급성 효과를 평가하고; 아마인 및 SDG가 가속화된 석면 유발 MM의 유전 모델에서 종양의 발병을 억제하는지의 여부를 시험한다.
도 57: 석면 감소 염증에 노출된 MEXTAG 마우스에 제공된 SDG가 풍부한 FLC 식이(35% SDG).
도 58: NF2 마우스의 석면 노출 실험 계획 및 아마인/SDG 리그난 제형화 평가:
도 59: 석면 노출 후 NF2 마우스에서 복부 염증의 동역학: 염증 세포 유입은 석면 노출 3일까지 최고점을 찍었고, 9일까지 점점 줄었다. 따라서, 3일이 모든 후속 실험에서 염증을 평가하기 위한 시점으로서 선택되었다.
도 60: 아마인 및 이의 SDG-풍부 리그난 성분은 석면 유발 염증(어린 마우스)을 무디게 한다: 전체 백혈구(A)는 비록 크지는 않지만, 식이에서 FS 또는 FLC 첨가로 감소되었다. 그러나, 세포 차이 및 특히 대식세포 수준에서 볼 때, 수준은 아마인 및 SDG-리그난 식이 둘 다에 의해 상당히 무뎌졌다(B).
도 61: 아마인 및 이의 SDG-풍부 리그난 성분은 석면 유발 염증(나이 많은 마우스)을 무디게 했다: 복부 석면(A)에 노출된 나이 많은 마우스는 딱 300,000 세포/mL(10배 이상)와 비교하여 복부 세척 유체 약 3,000,000 WBC/mL를 제공함으로써 석면에 더욱 더 민감하다. 결과는, 염증 세포 호중구(B) 및 대식세포(C)가 모두 어린 마우스보다 나이 많은 마우스에서 상당히 더 높았다는 것을 나타냈다.
도 62: SDG(식이 제형에 제공됨)가 풍부한 아마인 리그난 추출물은 나이 많은 마우스에서 석면 염증을 무디게 한다: 수컷 NF2 (129SV) (+/-) 마우스에 0일째에 400㎍의 석면을 주사했다(복강내). 마우스를 석면 노출 1주일 전(-7일)에 시험 식이(0% FS 또는 10% FLC)를 개시하고, 석면 노출 후 3일째에 희생시켰다. 복부 세정(AL)은 5mL 1× PBS(1ml의 배꼽 세정액을 원심분리시키고, 상청액을 동결시켰다)로 수행하였다. 혈장은 -80℃에서 동결 수집하였다. 세포는 세정액으로 평가하고, 전체 WBC 및 호중구, 대식세포 및 호산구가 모두 SDG-풍부 식이에 의해 상당히 감소되었다는 것을 나타냈다.
도 63: SDG(식이 제형에 제공됨)가 풍부한 아마인 리그난 추출물은 나이 많은 마우스에서 석면 염증성 사이토카인 분비 및 질산화적 스트레스를 무디게 한다: 수컷 NF2 (129SV)(+/-) 마우스는 0일째에 400㎍의 석면을 주사하였다(복강내). 마우스를 석면 노출 1주일 전(-7일)에 시험 식이(0% FS 또는 10% FLC)를 개시하고, 석면 노출 후 3일째에 희생시켰다. 복부 세정(AL)은 5mL 1× PBS(1ml의 배꼽 세정액을 원심분리시키고, 상청액을 동결시켰다)로 수행하였다. 혈장은 -80℃에서 동결 수집하였다. 사이토카인 IL1β 및 TNFα 뿐만 아니라 아질산염의 수준은 SDG-풍부 식이로 상당히 무뎌졌다.
다음 상세한 설명에서, 다수의 특정 상세가 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 기재된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 이러한 특정 상세 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 예에서, 익히 공지된 방법, 절차 및 성분은 본 발명을 모호하게 하지 않기 위해 상세하게 기재되지 않았다.
방사선 방호 및 화학 예방을 위한 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물을 사용하는 치료 및 예방 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 이성체(입체이성체 포함) 또는 이의 조합을 포함한다.
본원 발명자들은, 아마인, 이의 생물 활성 성분 및/또는 이의 분해물질 또는 대사산물이 생체 분자, 세포 및 조직을 방사선 손상, 차아염소산염 이온 유발 손상, 발암 물질 유발 손상 및 악성 종양으로부터 보호하는데 효과적임을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명자들은, 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물이 생체 분자, 세포 및 조직을 방사선 손상, 차아염소산염 이온 유발 손상, 발암 물질 유발 손상 및 암 발병으로부터 보호하기 위해 사용될 수 있음을 밝혀냈다.
본원에 제공된 방법에 따라 방사선 방호 또는 방사선 완화를 필요로 하는 대상체는 잠재적으로 유해한 양의 방사선에 노출될, 노출되는 또는 노출되었던 대상체이다. 이러한 노출은 방사선에 단일 노출, 주기적 노출, 산발적 노출 또는 지속적 노출일 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 이러한 방사선 노출은 우발적 노출, 부수적 또는 의도적 노출을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법에 따라서 방사선 방호 또는 방사선 완화를 필요로 할 수 있는 대상체의 예는 치료 섭생의 일부로서 방사선에 노출되는 환자(예: 방사선 요법을 필요로 하는 암 환자), 질환 또는 상태를 진단하기 위한 방사선에 노출되는 대상체(예: 치과용 또는 뼈 X-선을 받은 대상체, PET 스캔, CT 스캔 등을 받은 환자)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 방법에 따라서 방사선 방호 또는 방사선 완화를 필요로 할 수 있는 대상체의 예는 또한 이들의 직업 또는 라이프 스타일 선택의 결과로서 방사선에 노출될 수 있는 대상체(예: 비행기 비행 승무원 또는 다른 단골 항공 여행자, 및 심지어 평균 방사선 수준보다 높은 방사선에 노출되는 우주 여행자; 실험실 기술자 및 다른 노동자; 또는 전자 장치의 사용을 통해 누출된 대상체들) 또는 라돈의 축적(주거 또는 광산에서 축적)에 노출된 대상체들 또는 태양으로부터 자연 방사선에 노출된 실외 작업자 또는 일광욕자들을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라서 방사선 방호를 필요로 할 수 있는 다른 대상체는 누출 또는 유출(예: 원자로 누출 또는 사고 또는 실험실 유출)과 같이 방사선에 우발적으로 노출되는 대상체를 포함한다. 전쟁이나 테러의 결과로, 핵탄두의 폭발로 인해 방사선에 노출된 대상체도 또한 예상된다. 포함되는 추가의 대상체는 방사성 물질을 분산시키는 통상적인 폭발물의 테러리스트 폭발에 노출되는 대상체이다.
본원에 제공된 방법에 따라서 화학 예방을 필요로 하는 대상체는 잠재적으로 유해한 양의 발암 물질 또는 다른 독성 물질에 노출될, 노출되는 또는 노출된 대상체이다. 이러한 노출은 다수의 합성 또는 천연 발암 물질 또는 화학전 제제와 같은 다른 독성 물질의 하나 또는 조합에 단일 노출, 주기적 노출 또는 산발적 노출 또는 지속적인 노출일 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 노출은 우발적 노출, 부수적 또는 의도적 노출을 포함하는 것도 또한 이해된다. 이러한 노출은 직접 노출 또는 간접 노출일 수 있음도 또한 이해될 것이다. 예를 들면, 차아염소산염 이온에 대한 간접 노출은 이온화 방사선에 대한 직접 노출의 결과일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 화학 예방을 필요로 할 수 있는 대상체의 예는 그들의 직업 또는 라이프 스타일 선택의 결과로서 발암 물질 또는 다른 독성 물질에 노출될 수 있는 대상체(예: 석유 산업의 노동자; 자동자 배기 입자에 노출된 요금소 승무원; 실험실 기술자 및 다른 노동자)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 발명에 따라서 화학 예방을 필요로 할 수 있는 다른 대상체는 음료수 또는 공기 중 발암 물질의 누출 또는 유출(석면, 폴리방향족 탄화수소)과 같이 발암 물질에 우발적으로 노출되는 대상체를 포함한다. 습관(흡연가)의 결과로서 발암 물질에 노출되는 대상체도 또한 예상된다. 포함되는 추가의 대상체는 발암 물질 및 다른 암 촉진 물질, 예를 들면, 화학전 제제를 분산시키는 테러리스트 행위에 노출되는 대상체이다.
하나의 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 대상체에게의 투여는 손상성 방사선 노출에 노출 전, 동안 및 후 투여를 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 방사선에 노출되었거나 노출될 대상체에서 방사선 손상을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 우발적 방사선 노출로부터 생성되는 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해 물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 노화를 유도하는 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 화학적 발암 물질 및 천연 및 합성의 화학적 제제를 포함하는 독성 물질에의 노출로부터 생성되는 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암 치료를 위한 방사선 요법으로부터 생성되는 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방사선 손상은 우발적 방사선 노출로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 방사선 손상은 암(예: 폐암) 치료를 위한 방사선 요법으로부터 생성된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직에 대한 방사선 유발 손상을 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직에 대한 방사선 유발 손상을 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 방사선 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 세포를 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 발암 물질 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 대상체에의 투여는 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에 노출 전, 동안 및 후 투여를 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에의 우발적 노출로부터 생성되는 발암 물질 손상으로부터 생체 분자를 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해물질 또는 이의 대사산물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 폐암 또는 중피종을 유발하는 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질로부터의 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 발암 물질 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 생체 분자, 세포 또는 조직과의 접촉은 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에의 노출 전, 동안 및 후 접촉을 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 발암 물질 유발 암으로부터의 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될 대상체에서 발암 물질 유발 손상, 악성 형질 전환 및 암 발병을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 발알 물질 유발 암으로부터의 하나 이상의 발암 물질에 노출된 대상체를 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 차아염소산염 이온에 의한 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 아마인, 이의 생물 활성 성분, 분해 물질 또는 이의 대사산물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 대상체에게의 투여는 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에의 노출 전, 동안 및 후 투여를 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 차아염소산염 이온에 노출되었거나 노출될 대상체에서 차아염소산염 이온 유발 손상을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 차아염소산염 이온에 의한 손상으로부터 생체 분자(예: 핵산, 단백질 또는 지질과 같은 유전 물질), 세포 또는 조직을 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 차아염소산염 이온에 노출되었거나 노출될 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 상기 생체 분자, 세포 또는 조직과의 접촉은 화학 발암 물질 및 천연 및 합성 독성 물질에 대한 손상성 노출에의 노출 전, 동안 및 후 접촉을 포함한다. 전, 동안 및 후 시간은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 심지어 수년일 수 있다. 생물 활성 성분은 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상기한 방법 중의 하나에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
아마인, 이의 생물 활성 성분 및 이의 대사산물은 당해 분야에 공지되어 있고, 각각 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 공보 제2010/0239696호; 제2011/0300247호; 및 제2014/0308379호; 및 국제 특허 공보 제WO2014/200964호에 기재되어 있다.
아마인에서 발견된 1차 리그난은 식물에서 천연 상태의 접합체 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)로서 저장되는 2,3-비스(3-메톡시-4-하이드록시벤질) 부탄-1,4-디올(세코이솔라리시레시놀 또는 SECO)이다. SDG는 인간 장내에서 엔테로디올(ED) 및 엔테로락톤(EL)으로 대사된다. 엔테로디올 및 엔테로락톤의 합성 유사체가 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Eklund et al., Org . Lett., 2003, 5:491).
"분해 물질"은 SDG와 같은 분자의 보다 작은 분자로의 분해 생성물이다.
"대사산물"은 대사작용 또는 대사 공정에 의해 생성된 물질이다. 예를 들면, SDG의 대사산물은 EL 또는 ED이다.
대사산물은 천연 대사산물의 화학적으로 합성된 등가물일 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
"유사체"는 구조가 다른 화합물의 구조와 관련되는 화합물이다. 유사체는 합성 유사체일 수 있다.
"성분" 또는 "구성요소"는 혼합물 또는 화합물 중의 요소 또는 성분이다.
"생성물"은 화학적 반응으로부터 생성되는 물질이다.
"추출물"은, 예를 들면, 아마인으로부터 물질의 활성 성분 또는 농축 에센스를 함유하는 제제이다.
"약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 유효량의 활성 성분, 예를 들면, ( S,S )-SDG ( R,R )-SDG, 메소-SDG, SDG, SECO, EL, ED 및 이의 유사체를 의미한다. "치료학적 유효량"은 소정의 상태 및 투여 섭생에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다.
본원에 기재된 조성물은 "치료학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 용량 및 기간 동안 유효한양을 의미한다. 치료학적 유효량은 질환 상태, 년령, 성별 및 개체의 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하는 조성물의 능력과 같은 인자에 따라 가변적일 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 분자의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과보다 큰 것이다.
본원에 사용된 구 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 비례하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물과 접촉 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 담체 및/또는 투여 형태를 의미한다.
"약제학적으로 허용되는 부형제"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며 생물학적으로도 다르게도 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 의미하고, 수의학 뿐만 아니라 인간 약제학적 사용에 허용되는 부형제를 포함한다. "약제학적으로 허용되는 부형제"는 하나 또는 하나 이상의 이러한 부형제를 포함한다.
약제학적 조성물은 대상체에게 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들면, 경구, 비경구, 경점막, 경피, 근육내, 정맥내, 피내, 피하, 복막내, 심실내, 두개내, 종양내 또는 구강내로 투여될 수 있다. 조절 방출은 또한 활성을 이후 피하, 종양내, 구강, 피부 상에 패취로서 또는 질내 삽입될 수 있는 적절한 중합체에 매립시킴으로써 사용될 수 있다. 의료 장치를 활성 성분으로 코팅하는 것도 또한 포함된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 투여되고, 따라서 경구 투여용으로 적합한 형태, 즉, 고체 또는 액체 제제로 제형화된다. 적합한 고체 경구 제형은 정제, 캡슐, 환제, 과립, 펠릿 등을 포함한다. 적합한 액체 경구 제형은 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 오일 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성 성분은 캡슐로 제형화된다. 이 구현예에 따라서, 본 발명의 조성물은 활성 화합물 및 불활성 담체 또는 희석제 이외에, 다른 부형제 이외의 건조제 뿐만 아니라 젤라틴 캡슐을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제제의 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제형화된 액체 제제이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 질내 투여용으로 제형화된 액체 제제이다. 적합한 액체 제형은 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 오일 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내로 투여되고, 따라서 정맥내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 동맥내로 투여되고, 따라서 동맥내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 근육내로 투여되고, 따라서 근육내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 구강내로 투여되고, 따라서 구강내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 체표면에 국소적으로 투여되고, 따라서 국소 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 적합한 국소 제형은 겔, 연고, 크림, 로션, 점적제, 조절 방출 중합체 등을 포함한다. 국소 투여를 위해, 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물이 제조되고, 약제학적 담체를 포함하거나 포함하지 않고 생리학적으로 허용되는 희석제 중의 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 적용된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 조절 방출 조성물, 즉, 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물이 투여 후 시간 동안 방출되는 조성물이다. 조절 방출 또는 서방출 조성물은 친유성 데포(예: 지방산, 왁스, 오일) 중의 제형을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 즉시 방출 조성물, 즉, 아마인, 이의 생물 활성 성분 또는 이의 대사산물 모두가 투여 직후에 방출되는 조성물이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 조성물은 1일 1회 치료 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 2일마다 1회, 1주일에 1회 또는 2주에 1회 투여된다.
SDG를 추출하고 정제하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,705,618호에 기재되어 있다. SDG, 이의 입체이성체 및 유사체를 합성하는 기술은 전문이 참조로 인용된 문헌(참조: Mishra OP, et al. . Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, (19):5325-5328 및 국제 특허 공보 제WO2014/200964호)에 기재되어 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 생물 활성 성분은, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 또한 포유동물에서 쉽게 대사가능한 형태, 엔테로디올(ED) 또는 엔테로락톤(EL)으로 직접 화학적으로 합성될 수 있다.
(S,S)-SDG (R,R)-SDG, (S,R)-SDG (R,S)-SDG, 메소-SDG, SECO, EL, ED 또는 이의 유사체는 0.1ng/kg 내지 500mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
(S,S)-SDG (R,R)-SDG, (S,R)-SDG (R,S)-SDG, 메소-SDG, SDG, SECO, EL, ED 또는 이의 유사체에 의한 처리는 수일, 수개월, 수년 또는 무기간 단일 투여이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하는"은 치료적 치료 또는 예방적 또는 예방적 조치를 의미할 수 있고, 여기서 목적은 본원에 기술된 바와 같은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애 또는 둘 다를 예방하거나 경감시키는 것이다. 따라서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 조성물은, 예를 들면, 방사선, 발암 물질, 독성 물질 또는 차아염소산염 이온에 노출 전에 대상체에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 조성물은 노출 후 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 상태를 치료하는 것은 대상체에서 그 상태를 예방하고, 방해하거나 억제함을 의미할 수 있다.
또한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 치료 뿐만 아니라 예방적 또는 예방적 조치를 의미하고, 여기서 목적은 질환 또는 상태와 관련되는 목적하지 않은 생리학적 변화를 예방하거나 늦추는(경감시키는) 것이다. 유익하거나 목적하는 임상적 결과는 증상의 경감, 질환 또는 상태의 정도의 감소, 질환 또는 상태의 안정화(즉, 질환 또는 상태가 악화되지 않는 경우), 질환 또는 상태의 진행의 지연 또는 지체, 질환 또는 상태의 개선 또는 완화 및, 검출가능하든 검출가능하지 않든, 질환 또는 상태의 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상된 생존과 비교하여 생존을 연장시킴을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은, 예를 들면, 방사선, 발암 물질, 독성 물질 또는 차아염소산염 이온에 이미 노출된 것들, 뿐만 아니라 노출되기 쉬운 것들 또는 노출될 것으로 기대되는 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 및 본원에 기재된 방법 및 조성물을 필요로 하는 대상체는 폐 질환 또는 장애, 예를 들면, 천식, 암, COPD 및 중피종을 갖는 대상체를 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 노화와 관련된 장애 또는 상태, 예를 들면, 심혈관 장애 및 상태, 처진 피부 및 중추신경계(CNS) 질환(예: 알츠하이머 치매)을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 피부 장애 및 상태(예: 건선), 뿐만 아니라 미용 피부 상태(예: 주름 및 검버섯)을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 위장 장애 및 상태, 예를 들면, IBD 및 크론병을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 심혈관 장애 및 상태를 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 흑색종을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 안과 질환, 예를 들면, 황반 변성을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 유방암, 전립선암 및 자궁암과 같은 암을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 대상체는 인지 기능 장애 및 다른 인지 장애를 갖는 대상체를 포함한다.
용어 "대상체"는 포유동물, 예를 들면, 인간, 반려 동물(예: 개, 고양이, 새 등), 농장 동물(예: 소, 양, 돼지, 말, 가금 등) 및 실험실 동물(예: 랫트, 마우스, 기니아 피그, 새 등)을 포함한다. 인간 이외에, 대상체는 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 버팔로, 타조, 기니아 피그, 랫트, 마우스, 새(예: 잉꼬) 및 다른 야생, 가축 또는 상업적으로 유용한 동물(예: 닭, 거위, 칠면조, 물고기)을 포함할 수 있다. 용어 "대상체"는 모든 면에서 표준인 개체를 배제하지 않는다. 용어 "대상체"는 상태 또는 이의 후유증의 치료를 필요로 하거나 이에 민감한 인간을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
용어 "약" 또는 "대략적으로"은 값이 측정되거나 결정되는 방법에 부분적으로 의존하는, 당업자에 의해 결정된 특별한 값에 대해 허용되는 오차 범위내, 즉 측정 시스템의 한계를 의미한다.
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 보다 완전히 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 그들은 결코 본 발명의 광범위한 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1
합성 ( S,S ) 및 ( R,R ) - 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)는 감마 방사선 손상으로부터 노출된 플라스미드 및 게놈 DNA를 보호한다
핵 붕괴의 결과로서, 3가지 유형의 방사선, 즉, 양전하를 띄는 알파(α), 음전하를 띄는 베타(β) 및 전하가 없는 감마(γ)가 생성된다. γ-방사선의 경우, 전자파는 매우 작은 파장(<0.005nm)을 갖고, 따라서, 분자 및 원자를 이온화시킬 수 있는 고에너지를 갖는다. 생물학적 시스템 또는 용액에서, 이온화 방사선은 물의 방사선분해에 의해 하이드록실 라디칼(.OH)을 생성한다. 이러한 하이드록실 라디칼(.OH)은 지질, 단백질 및 게놈 DNA를 포함하는 세포상 성분에 대한 이온화 방사선 유발 손상의 주요 공급원이다. γ-방사선에 의해 생성된 하이드록실 라디칼(.OH)은 DNA에서 일본쇄 및 이본쇄 파단을 유도한다. (.OH) 라디칼은 데옥시리보스 및 퓨린 뿐만 아니라 피리미딘 염기로부터 H-원자를 추출하거나 염기의 이중 결합을 부가함으로써 DNA를 손상시킨다. 이러한 반응은 DNA 가닥 절단을 유도한다.
항산화제 및 유리 라디칼 포착 특성을 갖는 화합물은 방사선 방호제로서 기능하고, 방사선 유발 DNA 손상을 예방할 수 있다. 전임상 및 임상 시험을 실현 가능하게 하기 위해 다량의 SDG를 생산하기 위한 고비용, 가변성 및 어려움과 관련된 천연 자원으로부터 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)를 단리시키기 위한 복잡한 추출, 정제 및 농축 방법에 기인하여, SDG는 화학적으로 합성되었다. 천연 화합물, 바닐린 및 글루코스를 사용하여 SDG의 두 에난티오머(그들의 구조는 이하 도시된다)인 SDG (S,S) 및 SDG (R,R)이 성공적으로 합성되었다(참조: Mishra et al ., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, (19):5325).
Figure pct00001
SDG는 다른 것에 추가하여 크리스토피도우-솔로미도우 등(Christofidou-Solomidou et al.)에 의한 다수의 연구에서 강력한 항산화제 및 강력한 유리 라디칼 포착제인 것으로 나타났다. 중요하게는, 최근 연구에서, 합성 SDG 에난티오머는 강한 항산화제 및 유리 라디칼 포착 특성을 포함하는 것으로 나타났다(참조: Mishra et al ., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, (19):5325-5328). 본 실시예에서, 상업적 SDG와 비교할 때 합성된 SDG 에난티어머 ( S,S )-SDG 및 (R,R)-SDG의 방사선 방호 특성이 조사되고 평가되었다. 3개의 화합물의 방사선 방호 특성은 γ-조사에 플라스미드의 노출 후 수퍼 코일의 개방 코일 플라스미드 DNA (pBR322) 변환을 억제하는 SDG의 능력을 결정할 뿐만 아니라 γ-조사에 DNA의 노출 후 게놈 DNA 단편화의 억제를 평가함으로써 플라스미드 DNA 완화 검정을 사용하여 평가했다. SDG는 세코이솔라리시레시놀((SECO), 엔테로디올(ED) 및 엔테로락톤(EL)을 생성하기 위해 장내 세균에 의해 대사된다. 따라서, 게놈 DNA의 γ-조사 유발 단편화에 대한 SDG의 이러한 대사산물의 효과도 또한 평가되었다.
재료 및 방법
화학약품
플라스미드 DNA (pBR322), 브롬화에티듐, 초순수 10X TAE 완충제 및 1kb + DNA 래더를 인비트로겐(Invitrogen)(Life Technologies, Carlsbad,CA)으로부터 구입했다. 아가로스(초순수) 및 송아지 흉선 DNA는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(St. Louis, MO)로부터 구입했다. 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)(상업적). 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED) 및 엔테로락톤(EL)은 크로마덱스(Chromadex)(Irvine, CA)로부터 구입했다.
세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)의 합성
합성 SDG ( R,R ) 및 SDG ( S,S ) 입체이성체는 문헌(참조: Mishra et al ., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, (19):5325-5328)에 기재된 바와 같이 합성하였다.
γ-방사선에 플라스미드 DNA 및 송아지 흉선 DNA의 노출
SDG ( R,R ), SDG ( S,S ) 및 SDG (상업적)의 가변적 농도를 사용하거나 사용하지 않고 플라스미드 DNA (pBR322) 또는 송아지 흉선 DNA 샘플을 마크 1 세슘 (Cs-137) 조사기(J.L. Shepherd, San Fernando, CA)를 사용하여 1.7 Gy/분의 조사량 비율로 인산염 완충 생리 식염수, pH 7.4 (PBS)에서 γ 방사선에 노출시켰다.
방사선 유발 플라스미드 DNA 완화의 결정
방사선 유발 가닥 절단 및 수퍼코일(SC)의 개방 코일(OC)로 변환에 대한 시험 화합물의 효과는 플라스미드 DNA (pBR322)(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 결정하였다. PBS (pH 7.4) 중의 플라스미드 DNA(500ng)를 다양한 농도(25-250mM)의 SDG ( R,R ), SDG ( S,S ) 및 SDG (상업적)와 혼합하고, PBS 중에서 25 Gy로 조사하였다. 방사선 노출 후 30분에, 샘플을 적재 염료와 혼합하고, 100V에서 TAE 완충제(pH, 8.3)에서 아가로스(1%) 겔 전기영동에 적용하였다. 겔을 브롬화에티듐(0.5μg/ml)으로 40분 동안 염색하고, 20분 동안 세척한 다음, UV 투과 조명기(Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 가시화하였다. 포획된 겔 이미지를 스캐닝하고, 개방 코일(OC) 및 슈퍼 코일(SC) 플라스미드 DNA 밴드의 밀도는 겔-doc 이미지 분석기 프로그램에 의해 결정했다. SC 및 OC 플라스미드 DNA의 밀도는 전체 밀도(OC + SC)의 %로서 나타냈다.
방사선 유발 DNA 단편화의 결정
DNA 중의 방사선 유발 가닥 절단에 대한 시험 화합물의 효과는 송아지 흉선 DNA(Sigma, St.Louis, MO)를 사용하여 결정하였다. PBS(pH 7.4) 중의 DNA(500ng)를 다양한 농도(25 내지 250μM)의 SDG ( R,R ) SDG ( S,S ) 및 SDG (상업적)와 혼합하고, 30분 동안 50Gy로 조사하였다. 제2 계열의 실험을 0.5 내지 10μM 범위의 다양한 농도에서 수행하였다. 샘플을 적재 염료와 혼합하고, 100V에서 TAE 완충제(pH, 8.3)에서 아가로스(1%) 겔 전기영동에 적용하였다. 겔을 브롬화에티듐(0.5μg/ml)으로 40분 동안 염색하고, 20분 동안 세척한 다음, UV 투과 조명기(Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 가시화하였다. 포획된 겔 이미지를 스캐닝하고, 소아지 흉선 DNA 단편의 밀도는 겔-Pro 이미지 분석기 프로그램(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)을 사용하여 결정하였다. 송아지 흉선 DNA의 저분자량(<6000bps) 및 고분자량(>6,000bps) 단편의 밀도는 전체 밀도(저분자량 + 고분자량)의 %로서 나타냈다.
데이터 분석
수득된 데이터는 평균 값 ± 표준편차로서 나타낸다. 데이터는 Statview 프로그램을 사용하는 본페로니(Bonferroni) 교정을 사용하는 사후 비교로 분산의 일원 분석(ANOVA)에 적용했다. P 값 ≤ 0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
결과
합성 SDG ( R,R ), SDG ( S,S ) 및 SDG (상업적)의 방사선 방호 가능성은 플라스미드 DNA (pBR322)를 사용하여 결정하였다. 이 연구에 사용된 방사선 방호 검정은 γ-방사선에 노출 후 플라스미드 DNA가 노출되지 않은 플라스미드 DNA보다 더 느리게 이동한다는 원리에 기초한다. 이는 슈퍼 코일 플라스미드 DNA가 이의 압축 크기에 기인하여 아가로스 겔에서 더 빠르게 이동한다는 사실로 인해 단순하다. 비교로, 플라스미드 DNA 중의 방사선 유발 닉은 슈퍼 코일을 풀어 겔에서 더 느린 속도로 이동하는 비교적 큰 크기의 플라스미드를 생성한다. 따라서, 슈퍼 코일 플라스미드 DNA와 비교하여 개방 코일의 밀도를 결정하는 것은 방사선 유발 손상의 정도를 반영한다.
방사선은 조사량 의존적 SC의 OC DNA 플라스미드로의 변환을 일으킨다
상당한 DNA 손상을 일으키지만 방사선 완화제를 시험하기 위한 치료 창을 가능하게 하는 방사선량을 선택하기 위해, 플라스미드 DNA를 10, 25 및 50 Gy γ 방사선에 노출시켰다. 도 1a에 제시된 결과는, 플라스미드 DNA의 OC 형태에서 방사선량 의존 증가 뿐만 아니라 SC 형태에서 방사선량 의존 감소가 존재한다는 것을 나타낸다. SC 및 OC의 분포(도 1b)는, SC의 %가 각각 0, 10, 25 및 50 Gy에서 68.73±2.54%로부터 50.91±2.31, 38.37±3.73 및 35.66±4.24% (p< 0.05)로 감소되었음을 나타낸다. 동시에, OC의 %는 각각 0, 10, 25 및 50 Gy에서 31.26±2.50%로부터 49.08±2.31% 61.62±3.73% 및 67.33±4.24% (p<0.05)로 증가되었다. 이러한 초기 실험에 기초하여, 25Gy의 방사선량(상당하고 명백히 입증가능한 손상이 달성된 경우)이 상이한 SDG의 방사선 방호 특성을 결정하는 후속 실험을 위해 선택되었다.
플라스미드 DNA 완화 검정을 사용하는 합성 SDG의 방사선 방호 활성
플라스미드 DNA를 25Gy 감마 방사선의 선택된 조사량에 노출시키고(참조: 도 1), DNA 손상의 억제 %(SC 대 OC 형성)는 다양한 농도(25-250μM)에서 SDG 제제(합성 및 상업적) 각각에 대해 결정하였다.
25, 50, 100 및 250μM SDG(S,S)의 존재하에 25Gy에 노출 후 플라스미드 DNA의 대표적인 겔 블롯은 도 2a에 도시되고, 반정량적 농도 측정 분석은 도 2b에 도시되는 반면, 대조군과 비교한 억제 %는 도 2c에 도시된다. 흥미롭게도, 증가하는 농도의 SDG ( S,S )(25, 50, 100 및 250μM)의 존재하에, SC 형태의 비율은 증가하고, OC 형태의 밀도는 상당히 조사량 의존적으로 감소되었다(p<0.05). % 억제 플롯(도 2c)을 사용하여, 각 제제에 대해 EC50 값(즉, 25Gy에서 플라스미드 완화의 50%를 예방하는데 필요한 유효한 농도(EC))이 결정될 수 있고, SDG(S,S)의 경우 141.77μM이다. 플라스미드 DNA 완화를 방지하기 위한 이 값은 DPPH 유리 라디칼을 포착하기 위한 EC50 값에 필적할 만하다. 이러한 결과는 합성 SDG ( S,S ) 에난티오머의 방사선 방호 특성을 입증한다. 유사한 결과가 각각 127.96μM 및 98.38μM의 EC50을 갖는 SDG ( R,R ) 에난티오머(도 2d-f) 및 SDG (상업적)(도 2, g-i)에 대해 나타났다. 플라스미드 DNA 완화를 방지하기 위한 이러한 값은 DPPH 유리 라디칼을 포착하기 위한 각각의 EC50 값에 필적할 만하다. 이러한 결과는 두 합성 및 시판되는 천연 SDG 둘 다의 방사선 방호 특성을 입증한다.
방사선은 고분자량으로부터 저분자량 단편까지 조사량 의존성 DNA 단편화를 일으킨다
방사선은 도 3a 중의 DNA 겔에 도시된 바와 같은 NDA 단편화의 증가를 유도한다. 크기에 기초하여, 송아지 흉선 DNA 단편은 두 그룹: 고분자량(>6,000 bps) 크기 및 저분자량(<6,000 bps) 크기로 나누었다. 고분자량 및 저분자량 단편의 분포(도 3b)는, 고분자량 DNA의 %가 각각 25 및 50 Gy에서 88.16±0.50%로부터 67.82±7.89 및 34.94±4.45% (p<0.05)로 감소되었다는 것을 나타낸다. 동시에, 저분자량 단편의 비율은 각각 25 및 50 Gy에서 11.83±0.50으로부터 32.17±7.89% 및 65.05±4.45% (p<0.05)로 증가되었다. 결과(도 3b)는 50 Gy에서 DNA에 대한 손상을 나타내는 고분자량 DNA의 유의한 감소 및 저분자량 DNA 단편의 유의한 증가를 나타낸다. 이러한 초기 실험에 기초하여, 50 Gy의 방사선량(명확한 입증가능한 송아지 흉선 DNA 단편화가 관찰된 경우)을 상이한 SDG의 방사선 방호 특성을 결정하는 후속 실험을 위해 선택하였다.
송아지 흉선 DNA 단편화 검정을 사용하는 합성 SDG의 방사성 방호 활성
SDG ( R,R ), SDG ( S,S ) 및 SDG (상업적)의 방사선 방호 가능성은 상기한 바와 같이 송아지 흉선 DNA의 방사선 유발 단편화를 사용하여 결정하였다.
높은 SDG 농도(25- 250μM ) : 도 4a는 25, 50, 100 및 250μM SDG ( S,S )의 존재하에 50 Gy에 노출 후 송아지 흉선 DNA의 대표적인 DNA 겔을 도시한다. 증가하는 농도의 SDG ( S,S )(25, 50, 100 및 250μM)의 존재하에, 고분자량 DNA 형태의 비율은 방사선 노출 후 상당히 증가된(p<0.05) 반면, 저분자량 단편은 감소되었다. 다양한 농도의 SDG ( S,S )의 존재하에 고분자량 및 저분자량 크기 DNA 형태의 분포는 도 4b에 제시된다. 이러한 결과는 송아지 흉선 게놈 DNA를 사용하는 본 합성 SDG ( S,S ) 에난티오머의 방사선 방호 특성을 입증한다. 유사하게, 도 4c-d 및 4e-f에 제시된 결과는 각각 합성 SDG ( R,R ) 및 SDG (상업적)의 방사선 방호 특성을 나타낸다. 이러한 결과는 송아지 흉선 게놈 DNA를 사용하는 합성 SDG ( R,R ) 및 (S,S) 에난티오머의 방사선 방호 특성을 입증한다.
DNA 보호에서 SDG의 하한치를 추가로 결정하기 위해, 모두 3개의 SDG의 저농도를 시험하는 일련의 DNA 단편화 실험을 0.5-10μM의 범위로 실행하였다.
낮은 SDG 농도(0.5- 10μM ) : 산화방지제 및 유리 라디칼 포착 활성에 대한 이들의 EC50 값과 비교하여 저농도의 SDG ( S,S ), SDG ( R,R ) 및 SDG (상업적)에서 실행된 실험 결과는 도 5에 제시된다. 보다 높은 SDG 농도와 유사하게, 송아지 흉선 DNA 단편화 검정을 사용하여 이 단락에 제시된 이러한 결과는, 합성 SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R ) 에난티오머가 심지어 저농도에서 강한 방사선 방호 특성을 포함한다는 것을 입증한다.
송아지 흉선 DNA 단편화 검정을 사용하는 SDG 대사산물의 방사선 방호 활성
SDG 대사산물 SECO, ED 및 EL의 방사선 방호 가능성을 결정하고, 상기한 바와 같이 송아지 흉선 DNA의 방사선 유발 단편화를 사용하여 SDG와 비교하였다. 시험 제제 각각 10μM의 농도는 중간 값 유효량으로서 상기 나타낸 이전 발견에 기초하여 선택하였다. 결과는 도 6에 나타낸다. 데이터는, SDG 및 이의 대사산물 SECO, ED, EL이 이들의 방사선 방호 특성과 관련하여 등효력이다는 것을 입증한다.
논의
본 실시예의 결과는, 합성 SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R ) 에난티오머가 강한 방사선 방호 특성을 포함한다는 것을 나타낸다. 이러한 에난티오머의 방사선 방호 가능성은, 플라스미드 DNA (pBR322)를 사용하여 결정된 바와 같이, 그들의 농도 증가에 따라 증가되었다. 이러한 합성 SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R ) 에난티오머는 농도-의존 방식으로 플라스미드 DNA에 대한 방사선 유발 손상을 방지한다. SDG의 합성 이성체의 방사선 방호 가능성은 상업적 SDG에 필적할 만했다. 합성 에난티오머 SDG (S,S) 및 SDG ( R,R )는 또한 송아지 흉선 게놈 DNA의 방사선 유발 DNA 단편화를 방지했다. 시험된 최저 농도에서, SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R )은 합성 SDG ( S,S ) 및 SDG (R,R) 에난티오머의 강한 방사선 방호 특성을 입증하는 송아지 흉선 DNA의 저분자량 단편의 방사선 유발 생성을 완전히 방지했다. 저농도의 SDG ( S,S ), SDG ( R,R ) 및 SDG(상업적)를 사용하는 결과는, γ 방사선 손상으로부터 송아지 흉선 DNA를 보호하기 위해 필요한 농도가 그들의 산화방지제 및 유리 라디칼 포착 활성을 위한 EC50 값과 비교하여 더 낮다는 것을 나타냈다. 중요하게는, SDG, SECO, ED 및 EL의 포유동물 리그난 대사산물은 동등하게 강력한 DNA 보호 특성을 나타냈다.
플라보노이드는 강력한 항산화 활성을 포함하고, 구체적으로, 이러한 폴리페놀은 유리 라디칼 포착 활성을 포함하고, 시험관내에서 비타민 E 및 C보다 더 효과적인 항산화제인 것으로 공지되어 있다. 식이 및 약용 식물은 또한 산화적 스트레스와 관련된 많은 인간 질환을 예방하는 것으로 공지되어 있고, 유용한 방사선 방호제이다. 비타민 및 미네랄을 포함하는 항산화제는 방사선 노출 후 수년간 체르노빌 노동자의 염색체 이상 유발 인자의 수준을 억제했다. 본 발명자들은 흉부 방사선 손상 마우스 모델을 사용하여 방사선 유발 손상에서 미정백 곡물 식이 아마인, 리그난 폴리페놀이 풍부한 곡물 뿐만 아니라 SDG가 풍부한 아마인 리그난 제형의 역할을 조사해 오고 있다. 본 발명자들은, 아마인이, 방사선 노출 전후에 투여된 경우, 마우스의 방사선 유발 염증 및 산화적 스트레스를 완화시켰다는 것을 나타냈다. 본 발명자들은 또한 조사된 마우스에게 리그난 비페놀 SDG가 풍부한 아마인의 리그난 성분만을 함유하는 식이를 공급한 조사된 마우스가 또한 폐 염증 및 산화성 조직 손상을 향상시키면서 상당히 개선된 혈류역학적 측정 및 생존을 또한 나타냈다는 것을 입증했다. 이러한 연구는 리그난 SDG의 작용을 통해 아마인이 생체내 방사선 유발 조직 손상에 대해 보호적임을 나타냈다.
슈퍼옥사이드 음이온(O2 -), 하이드록실 라디칼(.OH) 및 과산화수소와 같은 반응성 산소 종(ROS)의 생성 증가는 다양한 실험적 및 병리학적 상태하에 조직 손상을 일으킨다. 반응성 산소 종은 세포 막 지질, 단백질 및 게놈 DNA의 산화성 변형에 의한 세포 손상을 유도한다. 다수의 연구는, 추출된, 정제된 또는 합성 아마인 SDG가 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 강력한 항산화제임을 나타냈다. 따라서, 항산화제로서 SDG는 방사선 요법을 받고 있는 환자의 방사선 유발 조직 손상을 포함하는 다양한 실험적 및 질환 상태하에 치료 가능성을 갖는다.
폴리페놀은 일반적으로 식물에서 글리코사이드로서 발생하며, 항산화 특성을 포함한다. 플라보노이드는, 항산화제로서, 반응성 산소 종의 생성, 유리 라디칼의 급냉, 전이 금속의 킬레이트화 및 그들을 펜톤(Fenton) 반응에서 산화환원 불활성이도록 하는데 관여하는 효소의 활성을 방해한다. 세코이솔라리시레시놀(SDG)은 아마인 중 주요 리그난이고, 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 강력한 항산화제인 것으로 나타났다. 아마인 리그난 세코이솔라리시레시놀(SDG)의 치료 가능성을 탐색하기 위해, SDG는 전구체 분자로서 바닐린을 사용하는 화학 반응에 의해 합성되었고, 합성 SDG (R,R) 및 SDG (S,S)의 항산화 특성은 그들의 환원력, 금속 킬레이트화 가능성, 및 하이드록실, 퍼옥실 및 DPPH 라디칼에 대한 유리 라디칼 포착 활성을 평가함으로써 결정되었다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 플라스미드 DNA (pBR322) 및 송아지 흉선 DNA에 대한 γ-방사선 유발 손상을 예방하는 그들의 잠재력을 평가함으로써 합성 SDG (R,R), SDG (S,S) 에난티오머 및 시판되는 SDG(대조군으로서)의 방사선 방호 특성을 조사했다. 플라스미드 DNA에 대한 방사선 유발 손상은 플라스미드 DNA의 개방 코일 형태의 증가 및 플라스미드 DNA의 슈퍼 코일 형태의 감소로 평가되었다. 게놈 DNA에 대한 방사선 유발 손상은 DNA 단편화의 수준을 결정함으로써 평가되었다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 무세포 시스템에서 방사선 유발 DNA 손상에 대한 합성 SDG ( R,R), SDG ( S,S ) 및 상업적 SDG의 효능을 조사했다.
SDG 분자의 항산화 특성은 이전에 입증되었다. 본 발명자들은 천연의 시판 SDG가 감마 방사선에 노출되 세포에서 강력한 유리 라디칼 포착 특성을 갖는다는 것을 나타냈다. 이러한 합성 SDG (R,R) 및 SDG (S,S) 에난티오머의 항산화 및 유리 라디칼 포착 특성이 조사되었고, 강한 환원력, 높은 금속 이온 킬레이트화 가능성, 및 하이드록실, 퍼옥실 및 DPPH 라디칼에 대한 높은 유리 라디칼 포착 활성을 포함하는 것으로 입증되었다. 합성 SDG (R,R) 및 SDG (S,S)의 이러한 특성은, 이러한 분자가 세포 산화환원 상태를 조절하고, 금속 이온 농도를 감소시키고, 산소 유리 라디칼을 포착하기 위한 강력한 잠재력을 보여준다는 것을 나타낸다. 합성SDG 에난티오머의 이러한 특성은 작용하고 유리 라디칼 반응의 개시, 전파 뿐만 아니라 종결의 3가지 단계 모두를 방지함으로써 기능하는 이들의 능력을 시사하여 이러한 기초 메카니즘이 잠재적으로 생체내에서 SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R ) 에난티오머의 방사선 방호 특성의 원인임을 암시한다.
수행된 하나의 관찰은, SDG에 의한 게놈 DNA의 최대 방사선 방호가 이미 그들의 유리 라디칼 포착 및 항산화 효과에 대한 EC50 값보다 훨씬 낮은 약 5.0μM 농도에서 달성되었다. 따라서, 항산화제 및 유리 라디칼 포착제로서의 SDG는 또한 DNA 방사선 방호제 및 방사선 완화제로서 기능할 수 있다.
요약하면, 본 실시예에서, 합성 SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R ) 에난티오머는 강력한 방사선 방호 특성을 포함하는 것으로 입증되었다. 이러한 에난티오머의 방사선 방호 가능성은 플라스미드 DNA (pBR322) 및 송아지 흉선 DNA를 사용하여 결정되었다. 합성 SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R ) 에난티오머는 농도 의존 방식으로 플라스미드 DNA에 대한 방사선 유발 손상을 방지했다. 합성 에난티오머 SDG ( S,S ) 및 SDG (R,R)은 또한 송아지 흉선 게놈 DNA의 방사선 유발 단편화를 방지했다. 5μM의 농도에서, SDG ( S,S ) 및 SDG ( R,R )는 이러한 에난티오머에 의해 포함된 강력한 방사선 방호 특성을 입증하는 송아지 흉선 DNA의 저분자량 단편의 방사선 유발 생성을 완전히 방지했다.
실시예 2
폐 세포에서 리그난 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)의 방사선 방호 특성
세포의 방사선 손상은 반응성 산소 종(ROS)의 생성에 의해 개시된다. 세포 기구에 ROS에 의해 가해진 손상의 스펙트럼은 지질 과산화, DNA-단백질 가교결합, 염기 변형, 부가물 형성 및 일본쇄 및 이본쇄 절단(DNA SSB 및 DSB)을 포함한다. 이러한 변형은 방사선 유발 세포자멸사 및 세포사에 관여한다. 세포 DNA 손상이 방사선 유발 세포사의 공지된 결정 인자이기 때문에, 유리 라디칼 반응을 방해하거나 방사선 유발 세포자멸사를 조절함으로써 방사선 손상으로부터 DNA를 보호할 수 있는 제제를 동정하고 이용하기 위해 상당한 노력이 행해졌다.
방사선 유발 유전독성의 에방은 노출시 시스템에 항상화제의 존재에 의해 달성될 수 있다. 항산화제가 유리 라디칼 연쇄 반응을 방해하는 ROS 포착제일 수 있기 때문에, 항산화제를 보충하여 방사선 유발 산화적 스트레스로부터 세포 DNA를 보호하는 것이 가능하다. 다수의 합성 및 천연 항산화 화합물이 이들의 방사선 방호 효능에 대해 연구되었다. 그러나, 그들 중 대부분은 효과적인 농도에서 고유의 독성 및 부작용을 나타내거나, 짧은 저장 수명 및 낮은 생체 이용률을 갖는다. 따라서, 효과적이고 무독성 방사성 방호제에 대한 연구는 식이성 항산화제 및 영양 보조 식품에 대한 조사가 이루어졌다.
본 발명자들은 고산소혈증, 산 흡인 손상 및 허혈/재관류 손상과 같은 산화성 폐 손상의 전임상 뮤린 모델에서 식이성 아마인(FS) 보충의 보호 효과를 평가했다. 본 발명자들은, FS의 보호 효과가 부분적으로 폐 조직에서 항산화 효소 발현을 향상시키는 이의 능력에 기인할 수 있다. 중요하게는, 식이성 FS는 노출 전 뿐만 아니라 노출 후에 제공될 때 흉부 방사선의 부작용을 완화시켰다. 이러한 연구에서, 식이성 아마인은 방사선 유발 산화성 폐 조직 손상을 감소시키고, 폐 염증을 감소시켰으며, 폐 섬유증을 예방했다.
이전 보고서는, 아마인의 다양한 작용은 항산화, 항염증성 및 항발암성 효과를 포함하는 것으로 나타난 이의 리그난에 기인할 수 있다고 시사했다. 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)는 가능하게는 FS 곡물의 유익한 건강 효과에 기여하는 현저한 FS 리그난(건조 중량의 약 1%)이다. SDG는 장내에서 장내 세균에 의해 포유동물 리그난, 즉 엔테로디올(ED) 및 엔테로락톤(EL)으로 대사된다. SDG는 아테롬성동맥경화증 및 당뇨병과 같은 질환의 전임상 모델의 수의 치료에 유익한 것으로 나타났다. SDG는 또한 동물 모델에서 심장 보호 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다. FS 리그난은 문헌(참조: Adolphe et al (Br J Nutr 2010, 103:929))에 의한 SDG의 건강 효과에 대한 최근 검토에 요약되어 있는 바와 같은 다양한 암 유형으로부터 보호되고, 동물에서 흑색종 전이를 감소시키는 것으로 보고되었다.
또한, SDG의 항산화 및 유리 라디칼 포착 특성은 충분히 입증되어 있고, 이는 화합물의 유리 라디칼 포착 능력이 방사선 방호 효능에 직접 관련될 수 있기 때문에 가장 중요하다. 폐 내피 세포에 대한 본 연구에서, SDG는 세포가 감마-방사선에 노출되었을 때 유리 라디칼 포착 특성을 나타내면서, SDG가 풍부한 전체 아마인 리그난 성분(FLC)은 마우스에서 방사선 방호 및 방사선 완화를 매개했다. 그러나, SDG의 방사선 방호 특성의 특성화는 확립되지 않았다.
이 연구는 FS 리그난 SDG의 방사선 방호 능력을 결정하고 이의 작용에 책임이 있는 가능한 메카니즘을 탐색하기 위해 수행되었다. 이 연구의 첫 번째 목적은 원발성 뮤린 폐 세포, 특히, 상피, 내피 세포 및 섬유아세포에서 방사선 유발 클론원성 사망에 대한 SDG의 역할을 평가하는 것이었다. 세포의 방사선 유발 생식사가 세포 DNA 손상에 직접 관련되기 때문에, 본 발명자들은 SDG가 알칼리성 코멧 검정(SSB) 및 γ-H2AX 병소의 형성(DSB)을 사용함으로써 방사선 유발 DNA 가닥 절단으로부터 세포를 보호할 수 있는지의 여부를 평가했다. 또한, 본 발명자들은 IR 유발 세포사로부터 뮤린 원발성 폐 세포를 예방하는데 있어서 SDG 전처리 효과를 조사했다. 다수의 연구가 IR 유발 세포사에서 전-세포자멸사 단백질 Bax(Bcl-2-관련 X 단백질)의 역할을 입증했다. 본 발명자들은 또한 SDG 보호의 메카니즘이 세포자멸사의 이러한 주요 조절 인자의 비율의 변화를 포함하는지의 여부를 결정하기 위해 Bax 및 이의 길항제 Bcl-2 (B 세포 백혈병/림프종 2) mRNA 발현에 대한 SDG의 직접 효과를 분석했다. 본 발견은 FS의 강력한 생물 활성 성분인 리그난 SDG가 폐 세포에서 방사선 방호를 매개하여 FS의 방사선 방호 효과에 대한 새로운 통찰력을 제공한다는 것을 확인한다.
재료 및 방법
시약
세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)는 시판된다(ChromaDex, Inc., CA). 코멧 검정 키트는 트레비겐, 인코포레이티드(Trevigen, Inc., (Gaithersburg, MD))로부터 구입했다. P-히스톤 H2AX(래빗 mAb)는 셀 시그널링 테크놀로지, 인코포레이티드(Cell Signaling Technology, Inc., (Danvers, MA))로부터 구입했다. 인산염 완충된 생리식염수(PBS), 소 혈청 알부민(BSA), L-글루타민을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 글루코스 1g/l, 중탄산나트륨 없음), HEPES 완충제, 트립신, 소 혈청 알부민(BSA), 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA), 4,6디아미디노 2-페닐 인돌(DAPI), 태아 소 혈청(FBS), 콜라게나제, 트리톤-X 100 및 디스파제는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 구입했다.
세포주
섬유아세포 및 내피 세포를 C57/bl6 마우스로부터 단리시켰다. 섬유아세포 단리를 위해, 마우스 폐를 수거하고, 디스파제(2mg/ml)로 45분 동안 배양하였다. 단편을 석출시키고, 섬유아세포를 이미 기재된 바와 같이 배양하고, 통로 3과 10 사이에 사용했다. 폐 미소혈관 내피 세포(PMVEC)는 이미 기재된 바와 같이 뮤린 폐로부터 단리시켰다. 간단하게, 새로 수거된 마우스 폐를 콜라게나제로 처리한 다음, 혈소판 내피 세포 접착 분자(PECAM)에 대한 mAb로 코팅된 자기 비드에의 접착에 의한 세포의 단리가 이어졌다. 상피 세포(C10) 세포는 원래 정상 BALB/c 마우스 폐 외식편으로부터 유래되었고, 비종양형성이고, 접촉 억제되고, 초기 통과시 페포 타입 2 세포 특징을 갖는다.
클론원성 생존
기하급수적으로 증식하는 세포는 단일 세포로서 플레이팅하고, 밤새 배양하였다. 세포를 조사 6시간 전에 리그난 SDG(10-50μM)의 다양한 조사량(2, 4, 6 및 8 Gy)으로 처리했다. 리그난 조사량은 10% 아마인이 소화될 때 혈액 순환에 도달된 생리학적 수준 이내이도록 동물 연구에 기초하여 선택되었다. 세포는 1.7Gy/분의 조사율로 마크 1 세슘(Cs-137) 조사기(J.L. Shepherd, San Fernando, CA)로 조사했다. 콜로니를 염색하고, 조사 10 내지 15일 후 계수하고, 생존율을 계산했다.
코멧 분석
기하급수적으로 증식하는 세포를 배양하고, 조사(2Gy) 전 상이한 간격으로 SDG(50μM)로 처리했다. 세포를 제조업자의 지침(Trevigen, Gaithersburg, MD)에 따라 코멧 검정을 위해 처리했다. 간단하게, 세포(PBS 중의 1x105 세포/ml)는 LMAgaroseR(1:10, v/v)와 혼합하고, 즉시 CometSlide™ 상에서 피펫화하였다. 이어서, 세포를 용해시키고(4℃, 30분), 비권취(RT)를 위해 어둡게 유지시켰다. 전기영동을 18V(200Amp)에서 25분 동안 수평 전기영동 장치에서 수행했다. 슬라이드를 DW로 2회 세척하고, 70% 에탄올에 고정시키고, 45℃에서 건조시켰다. DNA는 SYBR 그린(Trevigen)으로 염색했다. 그룹당 적어도 150개의 세포를 스코어링했다. 세포 및 코멧 꼬리 길이의 시각적 분석은 코멧 이미지 분석 소프트웨어(Comet Assay IV, Perceptive Instruments Ltd, Haverhill, UK)를 사용하여 측정했다. 이미지는 흑백 CCD FireWire 카메라를 사용하는 올림푸스 IX51 형광 현미경으로 포획했다.
γ- H2AX의 면역염색 및 유동 세포 계측
γ-H2AX의 면역염색을 위해, 세포를 유리 커버슬립 상에 플레이팅하고(5,000 세포/커버슬립), 50μM SDG로 전처리하고(6시간), 조사했다(2 Gy). 목적하는 시간 간격으로, 세포를 고정시키고(4% 파라-포름알데히드), 세척하고, PBST (PBS + 5% 염소 혈청을 함유하는 0.1% TritonX-100, 1% BSA)로 블록킹했다. 세포를 4℃에서 밤새 γ-H2AX 1차 항체(1:200)로 배양한 다음, PBST(3x5 분)로 세척하고 실온에서 1시간 동안 2차 항체(Alexa fluor® 488, Invitrogen, CA, USA)로 배양했다. 핵을 DAPI로 대비염색하고, 형광 현미경하에 가시화했다.
FACS 분석을 위해, 세포는 트립신화하고, PBS로 세척했다. 이어서, 세포를 45분 동안 고정시키고(Fix/Perm 완충제, eBioscience), 이후 투과화 세척 완충제(BioLegend, USA)를 사용하여 세척했다. 세포를 Alexa fluor® 488(1:100 v/v, Cell Signaling Technology, US)에 접합된 200㎕ 래빗 모노클로날 포스포-히스톤 γ-H2AX(Ser 139)에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 배양했다. 세포를 다시 세척 완충제로 세척하고 분석했다. CyAn ADP (Advanced Digital Processing) 유동 세포 계측기(Dako,Denmark) Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 γ-H2AX를 측정하였고, 양성 세포는 수미트 소프트웨어(Dako, Denmark)를 사용하여 정량화했다.
세포자멸사 세포의 형태학적 검출
세포자멸사 세포는 처음에는 큰 세그먼트에서, 후속적으로 뉴클레오솜 단편에서, 최종적으로 충분히 둘러싸인 세포자멸사 본체의 형성에서 핵 및 세포질의 응축, 막 번짐, 세포 수축 및 핵 DNA의 분해에 의해 형태학적으로 특성화된다. 세포자멸사를 겪는 세포의 백분율은 소핵 검출(세포유전학적 손상)용으로 사용된 슬라이드로부터 현미경으로 결정했다. 적어도, 500개 세포를 각 실험(실험은 2회 수행된다)에 대해 계수하고, 세포자멸사 세포의 퍼센트는 다음가 같이 결정되었다:
세포사 % = Na/Nt x 100
상기 식에서,
Na는 세포자멸사 본체를 갖는 세포의 수이고,
Nt는 분석되는 세포의 총 수이다.
정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의한 유전자 발현 분석
qPCR은 어플라이드 바이오시스템, 라이프 테크놀로지스(Applied Biosystems, Life Technologies)(Carlsbad,CA)에 의해 공급된 TaqMan® 프로브-기반 유전자 발현 검정을 사용하여 수행했다. 세포자멸사 유전자의 mRNA 발현에 대한 SDG 처리 효과를 평가하기 위해, 개별적인 TaqMan® 유전자 발현 검정을 Bax(Mm00432051_m1) 및 Bcl-2(Mm00477631_m1)에 대해 수행했다.
간단하게, 세포는 SDG(50μM, 6시간)로 전처리하고, 조사했다(2 Gy). 전체 RNA RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)를 사용함으로부터 단리시키고, NanoDrop 2000(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 정량화했다. 이어서, RNA의 cDNA로의 역전사를 어플라이드 바이오시스템, 라이프 테크놀로지스(Carlsbad,CA)에 의해 공급된 cDNA에 대한 고용량 RNA를 사용하여 VeritiR Thermal Cycler 상에서 수행했다. qPCR은 StepOnePlusTM 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) 상에서 반응 웰당 25ng의 cDNA을 사용하여 수행했다. 유전자 발현 데이터는 18S 리보솜 RNA로 표준화하고, ΔΔCT 방법에 따라서 처리되지 않은 샘플로 교정했다.
웨스턴 블롯에 의한 세포자멸사 검출
Bax(세포자멸사 촉진제), Bcl-2(세포자멸사 억제제), 절단된 카스파제-3, 및 절단된 폴리(아데노신 디포스페이트-리보스) 폴리머라제(PARP)의 수준에 의해 마우스 폐 상피 세포에서 면역블롯팅으로 결정했다. 간단히 말해서, 세포는 프로테아제 억제제를 함유한 PBS에 용해되었다. 그런 다음, 세포 용해물의 면역블롯 검정은 10 웰 SDS 12% NuPAGE 겔(Invitrogen, Carlsbad California)을 사용하여 수행했다. 전기영동은 200V에서 1시간 동안 수행했다. PolyScreen PV 이전 막(PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)으로의 이전은 25V에서 1시간 동안 수행했다. 막은 인산염 완충된 생리식염수 중의 5% 탈지분유로 밤새 블록킹했다. 이어서, 탈지분유는 버리고, 막은 1차 항체로 배양했다. Bax, Bcl-2, 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP의 단백질 수준은 BAX 및 Bcl-2에 대해 래빗 항마우스 모노클로날 항체, 및 래빗 항마우스 절단된 카스파제-3(Asp175), 모노클로날 항체 및 래빗 폴리클로날 항-절단된 PARP(214/215) 절단 부위 특이적 항체를 사용하는 제조업자 권장 희석액(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)을 사용하여 검출했다. 막은 5회 세척한 다음, 실온에서 45분 동안 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 2차 항체에서 배양했다. 막은 Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)를 사용하여 개발하고, 특정 2차 항체(Sigma, St.Louis, MO)에 의해 검출된 ß-액틴 발현 수준을 사용하여 적재하기 위해 조정된 특정 밴드(Bax의 경우 20kDa, Bcl-2의 경우 26kDa, 절단된 카스파제-3의 경우 17/19kDa 및 절단된 PARP의 경우 89kDa)의 농도 측정 스캐닝에 의해 정량화했다.
통계
결과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 클론원성 검정을 위한 생존 곡선은 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 소프트웨어(4.0)를 사용하여 제조했다. 그룹 사이의 통계적 차이는 분산의 일원 분석(ANOVA)을 사용하여 결정했다. 통계적으로 유의한 차이가 발견된 경우(p<0.05), 개별적 비교는 본페로니/던 시험(Bonferoni/Dunn test)(Statview 4.0)을 사용하여 수행했다.
결과
SDG 처리는 조사된 원방성 폐 세포의 콜로니 형성 능력을 증가시킨다
클론원성 생존 검정은 세포가 환경 및 의약 발암 물질, 이온화 에너지 등에 노출 후 임의의 유전 독성 스트레스를 받은 후 세포 생식사를 결정하기 위해 널리 사용되어 왔다. 이 실시예에서, 원발성 폐 세포(각각, 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포)의 클론원성에서 방사선 유발 감소의 SDG (10-50μM) 전처리의 효과를 평가했다. 결과는, SDG (10-50μM) 단독은 그들 각각의 처리되지 않은 대조군 세포(100%)와 비교하여 3개의 세포 유형 모두의 콜로니 형성 능력에 대해 임의의 부작용을 유도하지 않았다(도 1a-1c).
방사선 치료는 조사량 의존 방식으로 상피 및 내비 세포의 콜로니 형성 능력을 유의하게(p≤ 0.01) 감소시켰다. 세포가 조사 전 SDG로 처리된 경우, 생존률은 치료 그룹 모두에서 향상되었다(도 7a, 7b). 섬유아세포의 클론원성에서 방사선 유발 손상에 대한 최대 보호는 50μM SDG 전처리된 조사 그룹에서 관찰되었다(도 7c). 따라서, 본 발명자들은 본 추가 연구를 위해 SDG의 이러한 특별한 농도를 선택했다.
SDG는 조사된 원발성 폐 세포에서 DNA SSB의 형성을 예방한다
본 발명자들은 먼저 방사능 관련 조사량 2Gy 후 모든 세포 유형(내피, 상피, 섬유아세포)에서 DNA 손상의 동역학을 결정하는 연구를 수행했다. 예상된 바와 같이, 방사선 노출은 증가된 꼬리 모멘트에 의해 입증된 바와 같이 그들 각각의 조사되지 않은 대조군 세포와 비교하여 모든 세포 유형에서 상당한 DNA 손상을 유발했다. DNA 손상 정도는 조사 후 30분에 최대였다. DNA 손상 정도는 조사 후 시간이 60분에 도달할 때 감소되었고, 조사후 2시간까지 더 급격하게 감소했다. 따라서, 본 발명자들은 방사선 유발 DNA 손상에 관련된 추가의 연구를 위해 30분 시간 간격을 정했다(도 8a).
방사선 노출(2 Gy)은 그들의 비조사된 대조군 세포와 비교하여 코멧 꼬리 길이의 상당한 증가를 유도했다. 세포는 조사 전 다양한 시간 간격(0시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 24시간)으로 처리했다. 모든 시간 간격에 SDG(50μM)에 의한 세포의 전처리는 3개 형태의 폐 세포 모두에서 방사선 유발 코멧 꼬리 길이를 상당히 억제했다. 그러나, 모든 세포 형태에서 DNA의 방사선 유발 꼬리 모멘트에 대한 최대 보호는 조사전 6시간 SDG 처리에서 관찰되었다(도 8b). 조사된 (SDG의 존재하 및/또는 부재하) 폐 상피 세포 중 코멧 꼬리의 형성을 나타내는 대표적인 형광 현미경사진은 도 8b, 인서트에 나타냈다.
SDG 처리는 뮤린 원발성 폐 세포에서 γ- H2AX 병소의 형성을 파기한다
SDG가 산화성 DNA 손상으로부터 보호할 수 있는지에 대한 본 가설을 추가로 시험하기 위해, 본 발명자들은 또한 γ-H2AX 병소의 유도에 대한 SDG의 작용을 평가했다. 조사 후 뮤린 원발성 페 세포에서 γ-H2AX 형성에 의해 입증된 산화성 DNA 손상에 대한 SDG 전치료의 효과는 표준 현미경 생성 이미지 분석(도 9, 10) 및 유동 세포 계측법(도 11) 방법론 둘 다를 사용하여 평가했다. 형광 현미경 분석의 결과는, 방사선(2 Gy) 노출은 3개 세포 모두에서 γ-H2AX 병소의 형성에서 상당한 증가를 유도했다(도 9). 병소/세포의 수는 15분까지 상당히 증가되었고, 조사 후 30분에 피크에 도달했지만(각각 상피, 내피 및 섬유아세포에 대해 γ-H2AX-양성 세포의 46.7%±0.5, 33.6%±3.2 및 30.0%±1.4), 수는 비록 비조사된 대조군 세포보다 상당히 더 높지만 노출 1시간 이내에 현저하게 감소되었다. 모든 값은 그들 각각의 비조사된 대조군 세포(모든 세포 유형에 대해 p<0.005)와 비교하여 상당히 높았다(도 9).
SDG 전처리(IR 전 6시간)는, γ-H2AX 양성 세포의 수가 각각 조사된 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포에서 22.7%± 2.17, 21.92%±2.88 및 22.1%±1.9로 삼소되기 때문에(상피 세포의 경우 p<0.005, 내피 세포 및 섬유아세포의 경우 p<0.05), γ-H2AX의 유도를 상당히 감소시켰다. γ-H2AX 병소의 형성으로부터 세포를 보호하는 SDG의 능력은, SDG의 전처리가 3가지 유형의 폐 세포 모두를 방사선 유발 DNA 가닥 절단으로부터 보호하였기 때문에 세포 유형에 독립적인 것으로 나타났다. 도 10은 원발성 폐 상피 세포에서 γ-H2AX 양성 세포의 현미경 분석의 대표적인 형광 현미경사진을 도시한다.
방사선 노출 후 γ-H2AX 양성 세포의 유도를 둔화시키는 것에 대한 SDG의 보호 효과는 유동 세포 계측법을 사용하여 추가로 확인했다. 예상된 바와 같이, γ-H2AX 양성 세포의 유도에서 유사한 패턴이 조사후 관찰되었지만; γ-H2AX 양성 세포의 수는 모든 세포 유형에서 SDG 전처리에 의해 상당히 폐기된다(도 11).
SDG 처리는 원발성 폐 세포를 IR-유발 세포자멸사 사망으로부터 예방한다
세포자멸사와 관련하여 SDG의 세포보호 효과를 연구하기 위해, 핵을 현미경에 의한 가시화를 위해 DAPI로 염색하고, 계수했다. 현미경 분석은, 대조군 세포가 순수한 크로마틴(세포자멸사 세포 약 4 내지 5%)을 갖는 반면, 방사선 노출이 시간 및 용량 의존 방식으로 세포자멸사 세포의 비율을 상당히(p≤ 0.05) 증가시켰다는 것을 입증했다. 24시간에, 세포자멸사 세포의 비율은 각각 상피 세포 및 내피 세포에서 13.9%±1.08 및 15.1%±1.95로서 관찰되었다. SDG 전처리(50μM)는 도 12(a 및 b)에서 입증된 바와 같이 세포자멸사 세포의 비율에서 IR 유발 증가(각각, 상피 세포 및 내피 세포에서 9.9%±1.08 및 10.71%±1.45 세포자멸사 세포)에 유의하게(p≤ 0.05) 대응했다. 섬유아세포는 각각 24시간 및 48시간에 세포자멸사 세포의 현저한 36.4% 및 41.8% 향상을 유도했기 때문에, 가장 민감한 것으로 판명되었다. 중요하게는, 상피 및 내피 세포로 도시된 바와 같이, SDG에 의한 전처리는 폐 섬유아세포에서 또한 세포자멸사 정도를 상당히 감소시켰다(도 12c).
SDG 처리는 뮤린 원발성 폐 상피 세포에서 세포자멸사의 조절인자의 발현을 변형시킨다
DNA 손상 및 세포사를 둔화시키는데 있어서 SDG의 방사선 방호 효과를 추가로 설명하기 위해, 본 발명자들은, SDG가 전-세포자멸사 및 항-세포자멸사 조절인자 단백질의 비율을 변화시킬 수 있다고 가정했다. 따라서, 본 발명자들은 방사선의 존재 또는 부재하에 폐 세포의 SDG 처리가 Bax 및 Bcl-2의 유전자 발현을 변형시키는지 및 이러한 변화가 단백질 수준에서의 변화로 번역할 수 있는지를 시험했다. 이를 위해, 폐 상피, 내피 및 섬유아세포 세포를 SDG(50μM)로 처리하고, 효소 mRNA 수준은 qPCR에 의한 IR 후 6, 24 및 48시간에 평가했다(도 13a 및 13b). 본 발명자들은, 2 Gy가 IR 후 24 및 48시간에 전-세포자멸사 Bax mRNA 수준의 약 11배 증가를 유도하였고, 이는 SDG 전처리에 의해 유의하게(p<0.05) 억제되었다는 것을 관찰했다. 또는, 항-세포자멸사 Bcl-2 mRNA 수준은 방사선 노출에 기인하여 변경되지 않았지만, 각각 IR 처리 후 24 및 48시간에 SDG 전처리된 세포에서 6.6배 및 3.5배 증가되었다. Bax 및 Bcl-2 mRNA 수준의 변화의 웨스턴 블롯 분석에 의해 단백질 검증시, 본 발명자들은 SDG 전처리된 세포의 감소된 수준을 향하는 경향이 있는 Bax 및 Bcl-2 단백질 수준 둘 다에서 후속적인 증가를 발견했다(도 13c는 대표적인 블롯을 도시하고, 13d 및 13e는 밴드 밀도 정량화를 도시한다). SDG에 의해 관찰된 방사선 방호 뒤의 기준 메커니즘을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 세포자멸사 신호전달 캐스케이드: 실행자 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP에 관여하는 중요한 단백질의 수준을 변경하는데 있어서 SDG의 효과를 평가했가. 전체로서, 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP의 수준은 IR 후 6, 24 및 48시간에 조사된 세포에서 상당히 증가되었고, SDG 전처리된 세포에서 감소된 수준으로의 경향이 있었다(도 14a는 대표적인 블롯을 도시하고, 14b 및 14c는 밴드 밀도 정량화를 도시한다).
논의
이 실시예에서, 본 발명자들은 FS 리그난 SDG가 방사선 유발 산화성 DNA 손상 및 세포자멸사 사망에 대해 뮤린 원발성 폐 세포를 보호할 수 있음을 입증했다. 본 발명자들은, SDG 전처리가 클론원성 생존에 의해 측정된 IR 유발 세포독성을 향상시킬 뿐만 아니라 폐 세포에서 DNA 가닥 절단(DSBS 및 SSBS) 및 세포사의 유도를 감소시켰다는 것을 관찰했다. 중요하게는, 세포자멸사의 조절에 관련된 유전자의 발현은 또한 SDG 처리에 의해 변경되었다. 이러한 발견은, SDG가 방사선 시나리오에서 무독성 방사선 방호제로서 및 방사선 요법의 치료 지수를 개선시키는데 있어서 유용할 수 있음을 시사한다.
IR-유발 세포사는 클론원성 생존의 손실을 특징으로 하는 세포의 방사선감수성의 고전적인 마커이다. 유사하게, 본 발명자들은 또한 SDG 전처리에 의해 상당히 감쇄된 모두 3개의 뮤린 폐 세포에서 클론원성의 방사선량 의존 손실을 주목했다(도 7). 세포 DNA는 세포에서 IR 유발 손상의 1차 표적이다. 노출 동안 생성된 ROS는 돌연변이, 기저 병변, 가교결합, SSB 및 DSB에 걸친 세포 DNA의 변화의 어레이를 유도한다. DNA의 손상은 교체될 수 없고, 따라서, 회복될 필요가 있고, 회복되지 않고 잔류하는 경우, 세포는 세포자멸사 또는 괴사의 유도로 재분류될 수 있다. 따라서, 표적 세포 DNA의 보호는 유전독성 상해에 대한 방어의 제1 라인을 부여한다. ROS 생성은 노출 수초내에 발생하고, 조사후 수분 동안 지속한다. 따라서, 즉각적인 DNA 손상과 같은 초기 방사선 반응은 방사선 노출 후 수분 이내에 발생한다. 유사하게, 조사된 세포의 시간 의존적 동역학 연구에서, 본 발명자들은 또한 코멧 꼬리 길이에 의해 증명된 바와 같이, DNA 가닥 절던 정도는 노출 30분 이내에 그들의 최고 수준에 도달하고, 이후 감소된다는 것을 관찰했다(도 8a).
코멧 검정은 세포 수준에서 DNA 손상/회복을 검출하기 위한 민감한 기술이고, DNA 가닥 절단을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔다. 폴리페놀은 ROS 매개된 산화성 DNA 손상을 감소시킴으로써 방사선의 손상 효과로부터 정상 조직 또는 세포를 보호할 수 있는 능력을 갖는다. 본 연구에서, 표준 알칼리성 코멧 검정을 사용하여, 본 발명자들은 또한 뮤린 원발성 폐 세포에서 IR-유발 SSB에 대한 SDG의 역할을 평가했다. 본 결과는 다른 페놀류, 예를 들면, 크리신 및 에피카테킨을 위한 방사선 유발 DNA SSB로부터 유사한 보호 효과를 나타내는 다른 보고와 일치한다.
SSB는 세포에 의해 용이하게 회복되는 반면, DSB는 세포가 회복하기 더 어렵고 돌연변이 유발 가능성이 더 높기 때문에, DSB는 대부분 치명적인 세포성 사건을 나타낸다. H2AX 분자는 조사에 의해 도입된 각각의 DNA 이본쇄 절단을 위한 메가베이스 길이 크로마틴 도메인을 따라 포스포릴화되고(γ-H2AX), γ-H2AX 손실 또는 탈인산화는 DNA 회복과 시간적으로 상관된다. 본 발명자들은 SDG가 시험된 3가지 유형의 세포 모두에서 IR 유발 DSB로부터 세포 DNA를 보호했다는 것을 보고한다. 본 결과는 또한 레스베라트롤 및 녹차 카테킨과 같은 폴리페놀이 세포를 IR 유발 DNA 가닥 절단으로부터 보호한다는 것을 보여주는 일부 다른 연구와 일치한다. 그러나, 방사선의 부재하에, SDG는 이들 세포 중 어느 하나에서 임의의 독성 효과를 발휘하지 않았다. 산화성 DNA 손상이 많은 암의 전구체인 것으로 간주되기 때문에, 항산화제로서 작용하는 SDG에 의한 이러한 손상의 감소는 암의 위험을 감소시킬 수 있다.
세포 및 조직에서 IR 유발 세포자멸사가 부분적으로 세포에서 DNA 손상의 유도에 기인하는 것으로 익히 공지되어 있다. 다수의 메카니즘(O6-메틸구아닌, 염기 N-알킬화, 벌키 DNA 부가물, DNA 가교결합)이 DNA 손상 의존 세포자멸사에 관련되지만, DNA 이본쇄 절단은 세포자멸사 세포사를 유도하는데 중요한 역할을 한다. 이 연구에서, SDG에 의한 세포의 전처리는 폐 세포에서 방사선 유발 세포자멸사에 대해 보호하였고, 코멧 꼬리 길이 및 γ-H2AX 병소 형성을 억제했다. 따라서, 방사선 유발 세포자멸사 세포사에 대한 SDG의 보호 효과는 세포 산화적 스트레스를 감소시키는 이의 능력, 이온성 항상성의 회복 및 DNA 손상을 방지하는 이의 능력에 기인할 수 있다. 이러한 발견은 허혈-재관류 및 방사선 유발 조직 손상 및 조직에서 보호적 항-세포자멸사 효과를 매개하는 아마인 중의 가능한 생물 활성 성분으로서 SDG에 대한 점의 본 뮤린 연구에서 식이성 미정백 곡물 아마인의 항-세포자멸사 특성과 일치한다.
IR이 세포 환경에서 항산화 효소의 수준을 감소시키기 때문에, 항산화제에 의한 세포의 전처리는 ROS를 추가로 방해할 수 있고, 이에 의해 ROS와 생체 분자의 상호작용 위험을 감소시킨다. 이전 예에서, 본 발명자들은 아마인 리그난 복합체를 함유하는 식이를 동물에게 전공급하면 마우스 폐에서 보호 단계 II 항산화제 효소의 수준을 증가시킨다는 것을 초기에 보고했다. 이러한 작용에 대한 가정된 메카니즘은 항산화 반응 요소(ARE) 매개된 전사 유도의 활성화를 포함한다. 또한, Nrf2는 또한 산화 스트레스 매개 세포독성에 대한 보호를 담당하는 다양한 항산화 효소의 데노보 합성을 개시한다. 일부 다른 보고는 또한 쿠르쿠민 및 EGCG와 같은 폴리페놀은 단계 II 항산화제 효소를 유도하는 그들의 능력에 관여하는 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 발휘한다는 것을 시사한다.
이는 SDG가 DNA에 대한 이의 항산화 특성 및 보호 효과 덕분에 뮤린 원발성 폐 세포의 세포사를 감소시킨다는 결과로부터 명백하다. 본 발견은 석류에서 발견된 폴리페놀인 엘라그산이 HO-1 및 Nrf-2 유전자의 상향조절을 통해 UVA 유발 산화적 스트레스 및 세포자멸사에 대해 인간 케라티노사이트를 보호한다고 보고한 문헌(참조: Hseu et al (Food Chem Toxicol 2012, 50:1245))의 결과를 제시한다. 본 연구는 IR 유발 산화성 손상 및 세포자멸사 세포사를 방지하는 SDG의 방사선 방호 작용이 항산화제 방어 시스템의 직접 유도에 의해서일 수 있다는 새로운 증거를 제공한다.
이러한 결과를 종합하면, 아마인 중의 아마인 리그난 SDG가 동물 연구에서 미정백 곡물의 관찰된 보호 효과에 기여할 가능성이 있는 강력한 방사선 방호 특성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 3
세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)는 차아염소산 이온을 포착한다: 방사선으로부터 게놈 DNA의 SDG 보호의 신규 메카니즘
강력한 산화제인 차아염소산(HOCl)은 생리적으로 존재하는 클라이드 이온과 과산화수소(H2O2) 사이의 반응을 촉매작용하는 활성화된 미엘로퍼옥시다제에 의한 호중구에 의해 생성된다. 활성화 호중구는 H2O2 및 슈퍼옥사이드 음이온 O2·-를 생성한다. 생리학적 pH에서, HOCL 및 차아염소산염 이온(ClO-) 둘 다의 혼합물이 존재한다. HOCl은 산화성 손상에 의해 미생물을 사멸시킨다. 그러나, 과도한 생산은 조직의 손상을 일으키는 것으로 공지되어 있다. 차아염소산염은 아데닌 뉴클레오티드를 변형시켜 호중구 매개 독성의 주요 메카니즘인 것으로 나타나는 클로라민의 형성을 유도한다.
HOCl 및 이의 접합 염기 ClO는 아미노산, 펩티드, 단백질 및 지질을 산화시키고, 세포 DNA 및 RNA 중 염기를 염소화시키는 것으로 나타났다. HOCl/ClO-의 반응은 구아닌 및 티민의 엔도사이클릭 -NH 그룹 뿐만 아니라 구아닌, 아데닌 및 시토신 유도체의 엑소사이클릭 NH2 그룹에서 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드 둘 다의 변형을 유도하여 (RNHCl) 및 RR'NCl과 같은 클로라민의 형성을 초래한다. 주요 변형 염기는 SKM-1 세포의 DNA 및 RNA 중 5-클로로시토신, 8-클로로아데닌 및 8-클로로구아닌인 것으로 밝혀졌다.
γ-방사선이 원자 및 분자를 이온화할 수 있다는 것은 익히 공지되어 있다. 생물계 또는 용액에서, 이온화 방사선은 지질, 단백질 및 DNA를 포함하는 세포 성분에 대한 이온화 방사선 유발 손상의 근원인 것으로 간주되는 하이드록실 라디칼(·OH)을 생성한다. 그러나, 이러한 매우 불안정한 라디칼은 매우 고농도로 생리학적 매질에 존재하는 Cl- 이온에 의해 포착될 수 있다. 이는 반응성 염소 함유 중간체의 생성을 유도하고, 이중 비교적 안정한 ClO- 이온은 방사선 유도 독성물질이다. 클로라이드 함유 용액에서, ClO- 및 산화적 특성의 다른 활성 염소 유도체는 방사선분해의 생성물로서 형성되고, 그들은 유기체의 생리학적 기능의 억제에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 방사선 유발 DNA 또는 단백질 손상이 부분적으로 방사선 발생 ClO-에 의해 매개된다고 제안한다.
SDG의 화학적으로 합성된 두 디아스테레오머는 최근에 그들의 항산화, 유리 라디칼 포착 및 DNA 보호 특성에서 등효력인 것으로 나타났다. 본 연구는 매우 신규하고 특이적인 형광성 프로브를 사용하여 생리학적 생리 식염수 용액 중의 ClO-의 γ-방사선 유발 생성으로부터 DNA 방사선 방호에서 SDG를 평가한다. 차아염소산염 특이적 3'-(p-아미노페닐)플루오레세인(APF) 및 하이드록실 라디칼-감수성 3'-(p-하이드록시페닐)플루오레세인(HPF)은 상기 반응성 산소 종(ROS)의 결정을 위한 보다 높은 특이성 및 재현성을 제공한다.
재료 및 방법
화학약품
ROS 지시제 프로브 APF 및 HPF, 플라스미드 DNA (pBR322), 및 1kb 플러스 DNA 래더는 인비트로겐(Invitrogen)(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로부터 유래되었다.
차아염소산염의 결정
PBS 중의 ROS 프로브 APF 및 HPF의 형광은 차아염소산염의 존재하에 또는 γ-방사선 노출 후에 490㎚/515㎚에서의 여기/방출에서 측정되었다. 데이터는 상대 형광 단위(RFU)로서 표현된다.
타우린 클로라민을 결정함으로써 차아염소산염의 γ-방사선 유발 생성
타우린의 염소화는 TMB 검정을 사용하여 결정했다. 데이터는 타우린 클로라민(흡광도) 뿐만 아니라 ClO- 농도(μM)로서 표현된다.
송아지 흉선 및 플라스미드 DNA에 대한 차아염소산염 유발 손상
송아지 흉선 또는 플라스미드 DNA는 37℃에서 2시간 동안 차아염소산염으로 배양했다. DNA 샘플은 아가로스(1%) 겔 전기영동에 적용하고, 분석했다.
2- 아미노퓨린(2-AP)의 차아염소산염 유발 염소화의 결정
PBS 중의 2-AP를 차아염소산염에 노출시키고, 형광 스펙트럼은 374㎚에서 방출 최대로 360 내지 390㎚에서 기록했다. 2-AP의 변화 %를 계산했다.
데이터의 통계적 분석
수득된 데이터는 평균 값 ± 표준편차로서 나타낸다. 데이터는 Statview 프로그램을 사용하는 본페로니 교정을 사용하여 사호 비교로 분산의 일원 분석(ANOVA)에 적용했다. P 값 ≤ 0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
결과
이 연구에서, 본 발명자들은 생리학적 용액에서 방사선 노출로부터 DNA 보호의 잠재적인 메카니즘으로서 방사선 유발 ClO-를 포착하는 SDG의 능력을 조사했다.
SDG는 차아염소산염 이온을 포착한다
선택된 플루오로프로브의 특이성은 차아염소산나트륨을 사용하여 평가했다. 도 15a는 ClO- 농도의 증가(1-4μM)에 따라 APF 형광 강도의 선형 증가를 도시한다. 중요하게는, HPF 형광 강도는 단지 약간 증가하여 APF 형광이 주로 ClO--의존적임을 나타낸다. ClO- 용량은 후속적인 실험을 위한 이 범위 내이도록 선택되었다. 이어서, SDG(시판)에 의해 ClO-를 포착하는 SDG의 능력을 평가했다. 사실, SDG는 용량 의존적으로 ClO-를 감소시켰다(도 15b). 최종적으로, 본 발명자들은 합성 SDG 디아스테레오머 SDG(S,S) 및 SDG (R,R)의 ClO- 포착 효과를 평가했다. 0.5μM에서, SDG (R,R) 및 SDG (S,S), 및 SDG (상업적)은 확립된 ClO- 포착제인 실리비닌과 유사한 필적할 만한 효능으로 ClO-를 포착했다(도 15c).
SDG는 γ-방사선 유발 차아염소산염을 포착한다
방사선은 APF의 형광 강도의 증가로 입증된 바와 같이, ClO-를 용량 의존적으로 생성한다. 구체적으로, 50 Gy γ-방사선 유발 APF 및 HPF(도 16a)는 SDG(도 16a 및 b)에 의해 용량 의존적으로 감소되었다. APF 형광의 감소를 위한 초기 기울기(1,816.30)는 HPF(695.75)와 비교하여 더 커서 ClO-에 대한 SDG의 선택적 포착 효과를 나타낸다(인서트, 도 16a). APF 에 대한 SDG의 효과는 HPF와 비교하여 상당히 더 현저했다(도 16b). SDG는 증가된 APF(도 16c) 및 HPF(도16d) 형광(p<0.05)에 의해 나타낸 방사선 노출(25 및 50 Gy)로부터 ClO- 생성을 둔화시켰다 비율 APF/HPF는 SDG에 의해 감소되어 ClO-의 선택적 포착을 나타낸다.
타우린의 염소화로서 차아염소산염 중의 방사선량 의존적 증가
방사선 유발 ClO-은 생물학적 분자 중의 -NH 그룹을 염소화한다는 것을 확립하기 위해, 본 발명자들은 타우린의 방사선 유발 염소화를 평가했다. 결과(도 16e)는, 표준 생리식염수에서, γ-방사선은 50, 100 및 200 Gy에서 타우린 클로라민 형성을 상당히 증가시켜 γ-방사선이 클로라이드 농도에 의존적인(도 16f) ClO- 생성을 유도한다는 것을 나타냄을 보여준다. 결과는, 방사선이 생리학적 용액 중에서 생물 분자를 손상시킬 수 있는 ClO-을 유도한다는 강력한 증거를 제공한다.
SDG는 송아지 흉선 및 플라스미드 DNA에 대한 차아염소산염 유발 손상을 보호한다
본 발명자들은 ClO-가 게놈(도 17a-d) 및 플라스미드(도 17e-f) DNA에 대한 손상을 유도하는지를 결정했다. 사실, ClO-은 저분자량 단편의 증가로 용량 의존적 DNA 단편화를 유도한다(도 17a, b). 0.5mM 차아염소산염 1.0μM에 노출된 게놈 DNA에 대한 손상은 모든 SDG(시판 또는 합성)에 의해 공지된 항산화제 케르세틴 및 ClO- 포착제인 실리비닌에 필적할 만한 수준으로 둔화되었다(도 17c, d). 유사하게, 플라스미드 DNA에 대한 ClO-에 의한 손상은 SDG에 의해 둔화되었다(도 17e, f). 구체적으로, 본 발명자들은 아가로스 겔 전기영동에서 상이한 이동성 패턴을갖는 손상된 개방 코일-DNA와 비교하여 슈퍼 코일(SC) 플라스미드 DNA의 양을 평가했다. (25μM)에서 SDG의 존재는 플라스미드 DNA에 대한 ClO--유발 손상을 감소시키고, DNA를 OC (18.6%± 9.4%)와 비교하여 대부분 (81.3%±9.4%) 슈퍼 코일 형태로 보존했다.
2-AP의 차아염소산염 유발 염소화에 대한 SDG의 보호 효과
DNA에 대한 ClO- 손상이 핵염기에 의해 발생하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 퓨린의 형광성 유사체인 2-AP의 ClO- 유발 염소화를 평가했다. 방사선 노출에 의해 생성된 것들(도 15a, 16a, 17c)에 필적할 만한 농도(10μM)로 제공된 차아염소산염은 SDG에 의한 전처리(60초)로 예방된 2-AP 형광을 감소시켰다(도 18a 및 b). 가장 중요하게는(도 18b 및 c), SDG에 의한 후처리는 ClO-에 노출 후 +15, +30, +60, +120, +180 또는 +300초에 첨가되는 경우 차아염소산염 유발 2-AP 변형으로부터 상당한 회복을 초래했다. 이러한 결과는 퓨린 염기의 차아염소산염 유발 변형에 대한 SDG의 핵염기 보호 특성을 입증한다.
2-AP의 γ-방사선 유발 염소화에 대한 SDG의 보호 효과
방사선이 핵염기 염소화를 유발하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 상기한 바와 동일한 시스템, 즉 2-AP 형광을 사용했다(도 19a). 실제로, γ-방사선에의 노출은 형광 강도의 용량 의존적 감소를 초래했다(SDG에 의해 예방되는(도 19a 및 b) ClO-의 존재하의 것과 유사한 관찰(도 18a)). 이러한 결과는 γ-방사선이 핵염기의 염소화를 유도하고, 퓨린 염기의 이러한 방사선 유발 변형에 대한 SDG의 보호 특성을 확립했음을 입증한다.
방사선에 의한 핵염기 염소화를 예방하거나 완화시키는데 있어서 SDG 작용의 제안된 메카니즘
N-염소화 핵염기의 회복 또는 예방 메카니즘에 관해서, 본 발명자들은 전자 풍부 방향족 환에 의해 N-Cl-분자의 2개 전자 환원 또는 1개 전자 환원을 제안하여 유리 N-라디칼의 형성을 유도하고, 이는 또한 페놀계 SDG 잔기의 -OH 그룹으로부터 수소 원자를 포획한다. 반응식 1(도 20)은 SDG 보호의 제안된 메카니즘을 나타낸다. 본 연구의 결과는 차아염소산염 이온을 포착하고, 방사선 유발 DNA 손상으로부터 보호함으로써 SDG의 방사선 방호 작용의 새로운 메카니즘에 대한 증거를 제공한다.
논의
이 연구의 결과는 다음에 대한 증거를 제공한다: i) SDG, 공지된 리그난 항산화제 및 유리 라디칼 포착제는 화학적 수단 뿐만 아니라 방사선에 의해 생리학적 용액에서 생성된 차아염소산염 이온을 탈독성화하고; ii) SDG는 차아염소산염 유발 손상으로부터 게놈 DNA 뿐만 아니라 플라스미드 DNA를 보호하고; iii) SDG 방어(차아염소산염 유발 DNA 손상으로부터 보호 또는 회복)의 메카니즘은 차아염소산염의 포착 및 클로라민(-NCl)으로부터 핵염기 상의 아미노(-NH) 그룹의 재생을 포함하고; iv) γ-방사선에의 노출은 타우린 클로라민 형성을 증가시키고; v) γ-방사선에의 노출은 SDG에 의해 예방된 퓨린 염기의 염소화를 증가시키고; vi) SDG 작용은 호출 전 또는 후에 첨가될 경우, 차아염소산염 유발 손상으로부터 DNA를 보호하는데 동등하게 효과적이고, 즉, 이는 핵염기 염소화의 보호제 및/또는 완화제로서 작용할 수 있고; vii) 합성 SDG (S,S) 및 SDG (R,R) 디아스테레오머는 차아염소산염 이온을 포착하고, 시판되는 SDG, 실리비닌 및 케르세틴(천연 항산화제 플라보노이드)과 비교하여 차아염소산염 유발 DNA 손상을 예방하는게 동등하게 강력했다. 이러한 결과는 핵염기의 차아염소산염 유발 변형에 대한 SDG의 보호 및 완화 특성을 입증한다.
흉부 방사선 손상의 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자들은 미정백 식이 아마인, 리그난 폴리페놀이 풍부한 곡물 뿐만 아니라 SDG가 풍부한 아마인 리그난 제형의 조직 방사선 방호 역할을 확립했다. 이러한 연구는 생체내에서 방사선 유발 조직 손상에 대해 리그난 SDG의 방사선 방호 및 방사선 완화 특성을 강조했다. 추출된, 정제되거나 합성 아마인 SDG는 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 강력한 항산화제이다. SDG의 치료 가능성을 탐색하기 위해, 본 발명자들은 새로운 화학적 반응에 의해 SDG를 합성하고, 그들의 환원력, 금속 킬레이트화 가능성 및 ·OH, 퍼옥실 및 DPPH 라디칼에 대한 유리 라디칼 포착 활성을 평가함으로써 합성 SDG (R,R) 및 SDG (S,S)의 항산화 특성을 결정했다. 본 발명자들은 또한 플라스미드 DNA (pBR322) 및 송아지 흉선 DNA에 대한 γ-방사선 유발 손상을 예방하기 위한 그들의 가능성을 평가함으로써 합성 SDG (R,R), SDG (S,S) 디아스테레오머의 방사선 방호 특성을 입증했다.
본 발명자들은 또한 SDG에 의한 게놈 DNA의 최대 방사선 방호가 전형적으로 130 내지 200μM 범위인 그들의 유리 라디칼 포착 및 항산화 효과에 대한 EC50 값 이하인 약 5.0μM 농도에서 이미 달성된다는 것을 나타냈다. 이 연구에서 결정된바와 같이, 방사선 유발 차아염소산염을 포착하는데 있어서 SDG의 최대 효과가 0.5 내지 5μM 내에 속한다는 것을 주목하는 것이 흥미롭다. 이는, SDG의 DNA 보호 효과가 부분적으로 손상성 ClO-를 포착하는데 기인한다는 것을 시사한다. 2-AP의 차아염소산염 유발 변형에 대한 SDG의 보호 효과를 나타내는 결과는 SDG가 핵염기에 대한 차아염소산염 유발 손상을 예방함으로써 DNA를 보호한다는 것을 나타낸다.
HOCl은 기질로서 NADPH 옥시다제 및 클로라이드 이온에 의해 생성된 과산화수소를 사용하여 활성화된 호중구의 미엘로퍼옥시다제에 의해 생성된다. HOCl은 핵염기를 염소화하고 산화시킨다. HOCl이 핵염기를 염소화할 수 있기 때문에, 이는 유전독성을 일으킬 수 있다. 염소화 뉴클레오사이드가 동정되었고, 염증 및 암에 연관되어 있다.
SDG가 1) 핵염기의 염소화 및 산화를 일으키는 차아염소산염 이온을 포착함으로써; 2) 클로라이드 이온과 반응시킴으로써 차아염소산염을 생성하는 ·OH 유리 라디칼을 포착함으로써 DNA를 방사선 유발 손상으로부터 보호할 수 있는 다수의 가능한 메카니즘이 존재할 수 있다. 본 발명자들은 ·OH의 생산이 인산염 완충된 생리식염수(PBS) 뿐만 아니라 생리식염수 단독(예비 실험)에서 클로라이드 이온의 존재하에 대폭 감소되었음을 관찰했다. 신체의 생리학적 매질 중 클로라이드 이온의 고농도를 고려하면, 차아염소산염의 생산 및 DNA를 포함하는 세포 성분에 대한 차아염소산염 유발 손상의 유의성은 3) 루티올린, 켐프페롤 및 케르세틴과 같은 다수의 플라보노이드로서 DNA 염기 쌍과 관련시킴으로써; 4) 특히, C5, C6 및 C8에서 및 데옥시리보스 부위에서 퓨린 및 피리미딘 염기 상에서 양성자의 추출 또는 ·OH의 첨가를 블록킹함으로써 방사선 손상의 주요 메카니즘일 것이다. 이러한 메카니즘은 5) 최종적으로, 형성된 클로로아민의 환원에 의해 유리 라디칼 유발 DNA 손상으로부터 보호를 제안하고, 따라서 핵산에 내부 및 외부 아미노 그룹을 재생시킨다. 따라서, 차아염소산염 이온의 포착제로서 뿐만 아니라 차아염소산염 유발 염소화로부터 핵염기의 항산화제 및 유리 라디칼 포착제 및 보호제로서의 SDG는 DNA 방사선 방호제 및 방사선 완화제로서 기능할 수 있다.
차아염소산염은 차아염소산염 이온(ClO-), 차아염소산(HClO) 및 pH 의존적 양의 유리 염소(Cl2)의 혼합물로서 용액에 존재한다. 생리학적 pH에서, ClO- 및 HClO는 유력한 분자이다. ·OH와 같은 강한 단일-전자 산화제와 달리, 차아염소산염은 2개-전자 산화제이고, 덜 반응성이고 ·OH보다 더 선택적이다. 차아염소산염은 전자 풍부 방향족 환 및 NH-화합물을 염소화할 수 있다. 이는 1차 및 2차 알콜 뿐만 아니라 벤질 메틸렌 그룹 및 3급 메틴 그룹, 및 페놀을 산화시킨다. 상기 반응의 제1 단계는 염소화 후 가수분해/HCl 제거이다. SDG는 SDG가 분자가 강력한 차아염소산염 포착제이도록 하는 아미노 그룹을 제외한 상기 반응 부위 모두를 함유한다. 반응식 1(도 20)에서, 본 발명자들은 핵염기의 1-전자 또는 2-전자 환원을 사용하여 SDG에 의한 DNA 보호의 새로운 메카니즘을 제안했다.
요약하면, 본 발명자들은 SDG가 차아염소산염(ClO-) 이온을 포착하고, 방사선 유발 차아염소산염 및 DNA 손상을 예방한다는 것을 입증했다. 차아염소산염 이온이 염소화/산화에 의해 DNA 염기를 변형시킨 다음, 이어서 DNA 손상을 유도하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 본 발견은 SDG가 암 치료용 방사선 요법과 관련된 정상 조직 손상 또는 방사선에의 우발적 노출의 방사선 방호제로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
아마인 및 이의 리그난은 벤조 -알파- 피렌의 효과에 대해 보호한다
아마인, SDG 및 리그난 유도체는 다단계 발암 과정을 억제함으로써 담배 및 다른 환경 발암 물질에 의한 폐 종양형성을 완화시킨다(도 21). 이 실시예에서, 리그난 SDG가 동물 모델에서 Nrf2-조절 단계 II 해독 경로의 조절 및 아마도 다른 메카니즘을 통해 화학예방 활성을 가짐을 나타내는 실험이 제공된다. SDG의 보호 효과는 직접 ROS 포착 및/또는 간접 항산화/항염증성, 및 발암 물질 독성 및 DNA 손상의 감소에 의해 매개된다.
담배 및 환경 발암 물질 벤조-알파-피렌(BaP)에 뮤린 상피 세포를 노출시키면 산화환원 감수성 형광 염료에 의해 검출된 바와 같이 손상적 반응성 산소 종(ROS)을 유도한다(도 23). 발암 물질에 노출된 후 2시간 빨리, 형광 강도의 강력한 증가는 세포에서 ROS 생성을 나타낸다.
SDG가 세포에서 발암 물질에 의해 유도된 산화성 DNA 손상을 감소시킴을 입증하기 위해, SDG(10μM)를 25μM의 BaP에 노출된 인간 상피 세포(A549)에 첨가하고, DNA에 대한 산화성 손상은 8-옥소-7,8-디하이드로구아닌(8-옥소-dGuo)의 존재로 나타낸 바와 같이 질량 분석법을 사용하여 검출했다. SDG는 발암 물질 노출 후 3 및 6시간에 DNA 손상을 감소시켰다(도 22). 마찬가지로, SDG가 발암 물질 노출로부터 ROS 생성을 예방한다는 것을 입증하기 위해, 마우스 상피 세포를 10 내지 20μM BaP 및 증가하는 농도의 SDG(0, 0.1, 0.5, 1, 5μM SDG)에 노출시키고, ROS는 2시간 후에 검출시켰다. SDG는 유해한 ROS 무시할 수 있는 수준으로 포착했다(도 24).
유사하게, SDG는 BaP에 노출된 인간 상피 세포에서 유전독성 스트레스를 억제한다. BaP와 같은 강력한 발암 물질에 세포를 노출시키면 p53 단백질의 증가된 수준으로 나타낸 바와 같이 유전독성 스트레스를 유도한다(도 25). 이는 5, 10, 25 및 50μM 농도에서 SDG의 존재에 의해 용량 의존적으로 완화된다. SDG는 또한 BaP에 노출된 인간 상피 세포에서 산화성 DNA 손상을 억제한다. BaP와 같은 강력한 발암 물질에 세포를 노출시키면 이본쇄 DNA 절단을 위한 마커인 감마-H2AX의 증가된 수준에 의해 나타낸 바와 같이 산화성 DNA 손상을 유도한다(도 26). 이는 5, 10, 25, 50 및 100μM 농도에서 SDG의 존재에 의해 용량 의존적으로 완화된다. 또한, SDG는 BaP에 노출된 인간 상피 세포에서 DNA 부가물 형성을 억제한다. BaP와 같은 강력한 발암 물질에 세포를 노출시키면 DNA 부가물의 형성을 유도한다(도 27). DNA 부가물은 발암 물질에 공유 결합된 DNA의 단편이고, 악성 종양의 발병에 직접 연관된다. DNA 부가물 수준은 단독으로 또는 조합하여 제공된 SDG 또는 이의 대사산물 ED 및 EL에 의해 감소된다.
아마인 및 이의 리그난은 화학적 발암 물질 유발 폐 종양의 마우스 모델에서 보호를 제공한다. 마우스(A/J 균주)에게 담배 및 환경적 발암 물질 BaP(1주일에 1회)의 4회 주사를 1mg/Kg 용량으로 복강내 투여했다(도 28). 마우스는 노출시 아마인 또는 리그난 식이를 개시한다. 마우스는 종양 부담, 마우스 체중 및 전반적인 건강 프로필을 결정하기 위해 노출 후 다양한 시간에 평가한다.
아마인은 마우스에서 종량 부담을 감소시킨다:
도 29는 BaP 노출 및 식이성 아마인 투여 수개월 후 뮤린 폐의 대표적인 임상적 이미지를 제시한다. 도 30은 BaP 노출 및 식이성 아마인 투여 수개월 후 뮤린 폐의 대표적인 H&E-긴장된 폐 단편을 제시한다. 마우스 급식 대조군 식이(상부 패널) 또는 아마인(하부 패널)로부터 화살표로 나타낸 결절은 아마인 급식 마우스에서 더 작게 나타난다. 각 패널은 상이한 동물을 나타낸다.
조직학적 뮤린 폐 단편은 전체 종양 면적 및 결절 크기에 대해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형태학적으로 평가했다(도 31a 및 도31b). 아마인 식이를 급식한 마우스에서 종양에 의해 점령된 폐의 면적이 상당히 감소되었다(p<0.03). 유사하게, 종양 결절 크기가 작아지는 경향이 있었다. 조직학적 뮤린 폐 단편은 또한 폐당 종양 결절의 전체 수(도 32a) 및 폐를 침입하는 종양 %(도 32b)에 대해 형태학적으로 평가했다. 폐당 종양 결절이 적고(A) 아마인 보충으로 침입하는 종양이 적다(B)는 추세가 있었다.
최종적으로, 아마인 보충은 BaP에 의해 유발된 페암의 낭비 효과를 예방하는 것으로 나타났다. 동물 체중은 BaP 노출 후 200일 동안 종방향으로 측정되었다. BaP에 노출된 아마인 식이 급식 마우스는 대조군 식이에서 BaP에 노출된 것들보다 더 높은 체중을 나타냈다(도 33).
실시예 5
아마인 및 이의 리그난은 석면 유발 손상으로부터 세포 및 조직을 보호한다
도입
악성 중피종(MM)은 요법 및 치료를 위한 현실적인 기회가 없는 충격적이고 고통스러우며 치명적인 유형의 암이다. MM의 발병은 석면 섬유에의 노출에 직접적으로 관련되어 있다. 최근 연구는 석면 유발 암의 병인은 지속적인 석면 섬유에 의해 유발된 만성 염증 및 산화성 조질 손상에 기인한다는 것을 나타냈다. 미정백 아마인(FS)은 공지된 항산화, 항염증성 및 암 화학예방 특성을 갖는다. 이 실시예에서, 급성 석면 유발 염증 및 염증성 사이토카인 방출을 방지하는 식이로 제공된 리그난 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)가 풍부한 FS 및 이의 리그난 성분(FLC)의 능력은 Nf2+/ mut;Cdkn2a+/ mut 마우스에서 시험했다.
재료 및 방법
마우스 식이 및 석면 노출
리그난 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)가 풍부한 FS 및 이의 리그난 성분(FLC)을 설치류 식사로 제공했다. 마우스(Nf2+/ mut;Cdkn2a+/ mut)를 10% FS 또는 10% FLC 보충 식이 상에서 400mg의 청석면 석면의 단일 복강내 볼러스에 1일 후(+1) 또는 전(-1)에 배치하고, 복부 염증 및 전염증성 사이토카인 방출을 위해 3일 후에 평가했다(참조: 도 34). NF2 마우스 균주는 석면에 노출되었을 때 MM의 촉진된 형태를 개발하기 하기 때문에, 선택되었다.
조직 수거 및 분석
액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분석법(LC/MS/MS)을 사용하여, 포유동물 리그난 엔테로락톤(EL) 및 엔테로디올(ED)과 같은 아마인 리그난 대사산물의 전신 수준(즉, 혈장)은, FS가 이 마우스 균주의 장내 균총에 의해 효과적으로 대사되었고, 수준이 다른 마우스 모델의 것들에 필적할 만했다는 것을 보장하기 위해 평가했다.
복부 세척은 PBS를 사용하여 수행했고, 대식세포(MF) 및 호중구(PMN)의 수준은 사이토스핀 분석을 사용하여 결정했다.
논의
액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분석법(LC/MS/MS)을 사용하여, 포유동물 리그난 엔테로락톤(EL) 및 엔테로디올(ED)과 같은 아마인 리그난 대사산물의 전신 수준(즉, 혈장)은, FS가 이 마우스 균주의 장내 균총에 의해 효과적으로 대사되었고, 수준이 다른 마우스 모델의 것들에 필적할 만했다는 것을 보장하기 위해 평가했다(도 37). 대식세포(MF) 및 호중구(PMN)의 복부 세척 수준은 FS 및 FLC 모두가 석면에 의해 유발된 급성 복부 염증을 무디게 하였음을 나타냈다(도 36 및 도 38.) 또한, 전염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-1β의 수준은 EH한 식이성 제제로 감소되었다(도 37 및 도 38).
결론: 이 발견은 아마인 및 이의 리그난 성분의 화학예방 특성은 석면 유발 조직 및 세포 손상으로부터 보호까지 확장된다는 것을 나타낸다. 따라서, 아마인은 악성 중피종의 화학예방에 식이성 제제로서 사용될 수 있다.
실시예 6
생체내에 SDG 투여의 최적 용량 및 동역학
이 실시예에서, 수용성 형태의 경구 위관 영양법을 통해 SDG를 투여한 마우스에서 약물동역학, 생물이용률 및 용량 반응에 대한 데이터가 제시된다.
투여 연구: 5, 25, 50 및 100mg/Kg 체중의 SDG 용량을 마우스에게 경구 ㅌ투여하고(용량당 n=5), 4시간 후 조직을 분석을 위해 수집했다. SDG 및 이의 생물 활성 대사산물 ED, EL 및 SECO의 혈장 농도는 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법으로 분석하고, ng/mL로 표현하는(도 39) 반면, Nrf2-조절 항산화 효소(AOE), SDG의 세포내 표적 및 이의 대사산물의 유전자 발현 수준은 qRT-PCR을 사용하여 동일 동물로부터의 폐 조직에서 결정했다(도 40). HO1, NQO1 및 GST의 유전자 발현 수준은 5mg SDG/Kg으로 2 내지 3배 증가시켰고, 100mg/Kg SDG으로 기준선에 비해 평균 6배 증가에 도달했다. 유전자 수준은 폐 조직에서 단백질 수준의 더 적지만, 유의한 증가에 의해 뒷받침된다.
약물동역학 연구: 상당항 AOE 발현을 유발하면서 SDG가 순환중에 검출되도록 하는 용량으로서 100mg/kg 용량을 선택한 후, 약물동역학 연구는 표적 조직(즉, 폐)에서 생물 이용률 및 생물학적 효과를 결정하기 위해 수행했다. 혈액 샘플 뿐만 아니라 조직(폐, 뇌, 간, 신장, 비장)을 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간에 수집했다. SDG 수준은 혈장 및 폐에서 상기한 바와 같이 결정했다(도 41). 단일 용량 100mg SDG/Kg이 충분히 흡수되었고, 순수한 SDG가 투여 후 6시간까지 순환에서(도 41a), 플러슁된 혈액 비함유 폐 조직에서 4시간 동안(도 41b) 검출가능했다. SDG의 혈장 및 폐 조직 농도는 각각 투여후 30분에 0.8 및 12.6μM의 수준에 도달했다. 현저하게, 대표적인 AOE 유전자 발현 수준(HO-1, NQO1, GST)의 강력한 유도가 기준선에 비해 유의하게 증가되었다(p<0.05)(도 41c). 관찰된 유전자 발현 증가는 웨스턴 블롯팅(도시되지 않음)에 의해 결정된 단백질 수준의 증가와 상관된다. 중요하게는, 7일 동안 1일 2회 투여된 동일 용량에서 SDG가 불내성도 독성도 나타내지 않았다. 이러한 데이터는, 상당한 생물 이용률 및 효율이 이 가용성 SDG 형태에 의해 수득될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 인간 요법에서 SDG의 사용이 크기 촉진되고, 독성 위험은 거의 없다. 따라서, 50-100mg/Kg(1일당 1 또는 2mg SDG)의 용량은 표적 조직에서 예측된 보호 효과를 유도하기에 충분하고, 추가 연구에 사용될 수 있다.
실시예 7
발암의 개시 및 촉진 단계 중인 Nrf2 -결핍 마우스에서 BaP 유발 폐 종양형성 에 있어서 SDG의 효과.
폐 손상 모델로부터 데이터는 식이 중 FS 및 FS 유래 SDG가 폐에서 Nrf2 및 Nrf2-활성화 유전자 및 단백질을 상향조절할 수 있다. 이 실시예에서, Nrf2 녹아웃 마우스를 사용하여, 이 경로의 활성화가 SDG의 화학예방 효과의 중요한 메카니즘이다는 가설이 시험되고, SDG가 발암의 개시 및 촉진 단계 둘 다에서 활성을 갖는지를 결정한다.
Nrf2 -결핍 마우스에서 SDG의 효과.
이러한 실험에서, 야생형 A/J 마우스 중의 BaP 우발 폐암 모델에게 경구 투여된 합성 SDG의 효과는 A/J 배경(본 동물 시설에 현재 유지된 콜로니)에서 역교배된 Nrf2-결핍 마우스와 비교한다. 간결하게, 야생행(WT) 마우스의 한 그룹 및 녹아웃(KO) 마우스의 한 그룹에 대조군 식이를 급식한다. WT 마우스의 한 그룹 및 KO 마우스의 한 그룹은 도 42a에 도시된 바와 같이 (폐암 발병을 억제하는데 있어서 용량 반응 관계를 시험하기 위한) 50 및 100mg/Kg 1일 SDG 소비를 달성하기 위해 그들의 음료수를 통해 SDG를 투여한다. SDG 투여 연구 및 동역학은, SDG는 조직에서 식이가 정상 상태에 도달하기 위해 필요한 최소 시간인 것으로 결정되었기 때문에 적어도 수일 동안 투여되어야 하고, 1mg/마우스 벤조[a]피렌(BaP)을 1주일에 4회 주사를 복강내로 투여해야 한다고 결정했다. 경구 투여된(경구 위관 영양법 또는 음료수로) 50 및 100mg/Kg SDG는 모두 폐에서 단계 효소 발현을 유도할 수 있다(참조: 도 41). 마우스를 4, 6 및 9개월에 희생시키고(참조: 도 42b), 폐 조직은 a) 폐 부담의 조직학적 평가 및 이미지 분석에 의한 정량화, b) Nrf2-조절 AOE 발현 및 산화적 스트레스의 웨스턴 블롯 검출, c) 뮤린 조직 및 뇨에서 8-옥소-7,8-디하이드로-2'-데옥시구아노신(8-옥소Guo) 수준 및 d) DNA 부가물 형성을 위해 수거한다. 마우스의 서브세트는 a) 기관지 폐포 세척, 및 b) 각각 11b/Ly6G, CD11b/F4/80 및 항-CD3에 한 항체를 사용하여 호중구, 할성화 대식세포 및 T 세포와 같은 염증 세포의 FACS 분석을 사용하여 폐 염증에 대해 평가한다.
통계: 통계적 유의성을 달성하기 위해 그룹당 마우스의 최소 수가 필요하고, 20마리 마우스/그룹을 시사했다.
분석: 상기한 바와 같이(도 29 및 도 31 종양의 수 및 크기의 감소가 50 및 100mg/Kg SDG 둘 다를 투여한 WT 마우스에서 예상되지만, 결과는 100mg/Kg 용량(더 적은 종량)으로 더 심오하다. 대조군 식이 상의 WT 마우스와 비교될 때 BaP를 해독시키는 능력의 손상에 기인하여 더 많은 종양 수가 대조군(약물 없음)을 투여한 Nrf2 KO 마우스에서 기대된다. 그러나, 어떤 종양의 감소가 (약물을 투여하지 않은 KO 마우스와 비교하여) SDG를 수용한 Nfr2 KO 마우스에서 예상되지 않는데, SDG의 1차 효과가 Nrf2 활성화를 통해 매개되기 때문이다. Nrf2/SDG 마우스의 종양 부담에서 나타나는 모든 감소는 SDG의 직접적인 자유 라디칼 포착 효과와 같은 또한 기여하는 다른 메카니즘에 기인하고, 이는 산화적 스트레스의 마커를 측정함으로써 검출가능해야 한다.
발암의 개시 및/또는 촉진 단계에서 SDG 및 Nrf2 활성화의 역할.
상기 데이터는 BaP의 개시 및 촉진 단계 둘 다 동안 SDG 투여에 관한 명확한 역학적 데이터를 제공할 것으로 기대된다. 단지 개시 단계 동안(도 42a, 계획 B) 또는 단지 촉진 단계 동안(도 42a, 계획 C) SDG 보충 효능을 결정하는 것도 흥미롭다. 따라서, 이 반응식에 개요된 실험은 이러한 상이한 급식 스케쥴을 사용하여 야생형 A/J 마우스에서 수행한다.
분석: 종량 수 및 크기의 감소는 촉진 또는 개시 동안 SDG를 투여하는 경우 기대된다. 연구는 이 활성에 대한 단계 II 효소 상향조절의 기여도를 정의하기 위해, 상기한 바와 같이, Nrf2 KO 마우스에서 반복한다. Nrf2가 발암 동안 두 개의 역할을 갖고, 이중 하나는 종양 개시 동안 예방적이고, 두 번째는 악성 진행을 촉진시키는 것이다고 최근에 보고되었다. 이러한 발견은 폐암에서 악성 진행을 예방하는 Nrf2의 용도를 시사하는 반면, Nrf2 활성화제가 폐암 예방에 더욱 적합하다. SDG는 화학예방제로서 효과적일 것으로 기대된다. SDG의 항-발암 효과에서 Nrf2의 역할에도 불구하고, 전신 유체 (혈액) 또는 페 조직에서 miRNA의 조절과 같은 다른 메카니즘이 또한 관련되거나 심지어 더 중요할 수 있다.
산화적 스트레스의 전신 및 폐-특이적 바이오마커 상의 흡연자에게 SDG 보 충물의 투여 효과.
유적적 및 생화학적인 유전적 및 생화학적 종점을 갖는 SDG의 경구 투여의 임상적 연구가 설계된다.
선택된 집단: 제1 집단은 결코 흡연한 적이 없는 정상적인 건강한 지원자로 이루어진다. 이 그룹은 "비자극" 환경에서 SDG 보충에 의해 유발된 변화를 평가하기 위해 목적하는 유전자 및 산화성 바이오마커의 진정한 기준선 수준(가능성 낮음)의 평가를 가능하게 한다. 대상체의 제2 그룹은 현재 능동적 흡연가로 이루어진다. 이 그룹은 i) 그들이 활성 암 개시 위험이 높고, 화학예방 시험에서 가능한 대상체이고, ii) 흡연이 기도 상피에서 그 자체의 게놈 변화 뿐만 아니라 활성 산화적 스트레스를 유도한다는 것이 이미 나타났기 때문에 선택된다. 이 그룹은 또한 이 고위험 집단에서 SDG에 의한 산화적 스트레스의 증가된 마커의 감소의 결정을 가능하게 한다. 크로스오버 설계가 선택되고, 이때 각 환자는 또한 젤라틴 캡슐에 모두 제공된 또한 위약 대조군 및 SDG 보충물을 모두 소화한다(참조: 도 43).
투여량: 상업적 제제(BREVAIL™)는 원료 또는 미분된 아마인의 상이한 배치로 관찰된 SDG 함량 및 생체이용률의 현저한 변동을 회피하기 위해 선택되었다. 또는, 문헌(참조: Mishra et al ., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, (19):5325)에 기재된 것과 같은 합성 SDG가 사용된다. 약리학적 연구는 50mg의 SDG를 함유하는 이 제형의 매일 투여가 사례 대조군 연구에서 암 발생률의 감소와 관련되는 최고량에서 발견된 것들과 유사한 ENL 수준(중앙값, 63nmol/L)을 생성한다는 것을 나타냈다.
임상 연구: 연구는 단일 센터, 무작위화 이중 맹검 두 기간 크로스-오버 시험일 것이다. 1개월의 휴약 기간이 산재된 2개의 3주 치료 기간이 존재할 것이다(도 43). 크로스 오버 설계의 이론적 근거는 대상체 내의 치료의 비교가 비교로부터 임의의 "대상체 효과"를 제거하고, 연구의 효율과 힘을 향상시킨다는 것이다. 스무명(20)의 건강한 지원자(10명의 흡연자 및 10명의 평생 비흡연자)를 순서대로 3주 동안 매일 EITHER 50mg SDG(하나의 캡슐 BREVAIL™ 또는 합성 SDG)에 이어 1개월 휴약 기간, 이어서 위액(SDG 없는 동일 캡슐, 추가의 3주 동안 동일 제공업자(Lignan Research, San Diego, CA)에 의해 제공됨, 또는 3주 동안 위약, 1개월 휴약, 이어서, 3주 동안 50mg SDG를 소화하기 위해 무작위화한다. 경구 상피(구강 내시경에 의해 수득됨), 배출된 호흡 응축액, 뇨 및 혈액은 기준선, 2주, 3주, 7주, 9주 및 10주에 수득된다. 능동적 흡연 상태는 요로 코티닌 검정에 의해 확인될 것이다. 연구는 펜의 기관생명윤리위원회(Penn Institutional Review Board)에의해 승인받고, 모든 참가자는 서면 동의서를 제공할 것이다. 상세한 설문지는 포괄적인 흡연 기록, 및 환경적 담배 노출(ETS)을 포함하는 기준선에서 관리된다. 참가자는 부작용의 평가, 시험 제제 섭취의 준수, 중간 담배 및 약물 사용에 대한 데이터의 수집 및 샘플 수집을 위해 매주 볼 수 있다.
통계적 근거/동력 분석: 목적하는 주요 비교는 뇨중 8-옥소-7,8-디하이드로-2'-데옥시구아노신(8-옥소-dGuo)에 의해 측정된 바와 같이, 뇨중 산화적 스트레스에서 변화, 배출된 호흡 응축물 이소프로스탄(탐색) 중의 변화 및 SDG 처리 후 연구 대상체의 구강 상피에서 유전자 발현 수준의 변화이다. 20명의 환자는 이 탐색 연구를 위한 합리적인 힘을 제공할 것으로 예상된다. 이 연구의 특성 때문에, 교정은 다수의 비교를 위해 적용되지 않는다. 연구는 SDG 보충 효과의 평가를 얻기 위해 설계된다. 또한, 캐리오버 효과를 시험하기 위한 제한된 힘이 존재하지만, 4주 휴약 기간은 이러한 문제를 회피해야 한다는 것을 주목한다.
경구 SDG 섭취 후 구강 면봉 상피 세포에서 유전자 발현 변화의 평가
이러한 실험에서, 구강 점막 상피 세포는 기관지 상피 조직의 대용 조직으로서 사용된다. 이러한 세포는 침습성 기관지경 검사를 필요로 하는 기관지 상피 세포보다 수득하기가 더 쉽다(즉, 뺨의 단순한 면봉을 사용함으로써). 인간에서 이 접근법의 유효성은 구강 상피가 유전자 어레이 연구에서 기도 기관지 조직의 대용 조직으로서 작용할 수 있다는 증거로 뒷받침된다.
이 접근법은 마우스에 섭취된 FS를 사용하여 추가로 검증되었다. 마우스에게 대조군 또는 10% FS 식이를 3주 동안 급식한 후, 조직의 범위를 수거하고, 면역불롯에 의해 두 개의 대표적인 Nrf-2 유도성 단백질(HO-1 및 NQO1)의 발현에 대해 분석했다. 폐 및 간에서 이러한 마커의 현저한 증가가 나타났다(데이터는 도시되 않음). 중요하게는, 두 단백질의 비강 상피의 명확하게 검출가능한 증가가 보였고(도 44), 따라서 비인두 조직이 또한 폐의 대용으로서 사용될 수 있음을 입증했다. 인간에서 이 접근법을 지지할 일부 실현 가능성 데이터가 또한 존재한다. 미정백 FS(매일 40g)를 1주일 동안 2명의 정상 지원자에게 제공했다. 구강 면봉을 취하고, RNA를 연속 추출하고, cDNA를 제조했다. Nrf2-의존적 유전자 HO-1의 상대적 발현 수준을 측정했다. 도 45에 도시된 바와 같이, HO-1 mRNA 발현은 한 대상체에서 34%까지, 제2 대상체에서 63%까지 증가되었다(p<0.05). 이러한 데이터는 이 접근법이 실현가능하고, FS 및 SDG가 정상적인 건강한 지원자에서 Nrf2-의존성 유전자를 증가시킨다는 것을 보여준다.
시험에서, 구강 면봉은 대조군 및 흡연 대상체 모두 기준선 및 섬유 대조군 및 FS 식이 2 & 4주 후에 취했다. mRNA 및 cDNA를 상기한 바와 같이 생성하고, 대표적인 항산화제 및 NQO-1, HO-1 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함하는 단계 II 약물 대사 효소의 상대적 발현 수준을 평가하기 위해 RT-PCR에 적용한다. Nrf2-유도성 효소의 "고전적인" 대표인 것 이외에, 선택된 효소는 또한 중요한 역학적 역할을 할 수 있다. NQO1 는 담배 연기에 존재하는 프로-발암 물질의 해독 및 활성화에서 이중 역할을 한다. NQO1의 변형 유전자형은 일본 대상체에서 폐암 위험의 감소와 상당히 관련되었다. HO -1 은 또한 유전 연구에서 담배 연기 중의 산화제 및 방향족 탄화수소에 대한 세포보호제로서 관여했다. 따라서, HO-1은 또한 아마인의 효과를 모니터링하기 위한 중요한 바이오마커를 나타냈다. 다수의 연구는 GST 다형성, 흡연 및 폐암의 관계를 나타냈다. 중요하게는, 폐 세포 중의 벤조[a]피렌-유도 DNA-부가물은 폐 특이적 GST에 의한 사이토크롬 P-450- 및 알도-케토-리덕타제 매개 대사작용 둘 다로부터 생성되는 반응성 중간체의 해독으로 조절된다. 벤조[a]피렌이 중요한 폐 발암 물질이고, 이것이 담배 연기에 존재하기 때문에, GST는 흡연자에서 아마인의 효과의 바이오마커로서 모니터링된다.
데이터 분석: 5명의 정상 비흡연 지원자의 구강 면봉으로부터 유래된 cDNA의 대규모 풀은 모든 분석을 위한 "기준선" 비교 측정기로서 사용되도록 제조된다. 모든 시험 샘플로부터 cDNA는 β-액틴 및 GAPDH를 사용하여 이 풀로 표준화한다. 표준화되면, 각 연구 샘플을 기준선 비교 측정기와 비교하고, 퍼센트 또는 배수 변화를 계산한다. 1차 분석은 절대 흡연자 및 현재 흡연자에서 (대응 t-테스트를 사용하여) SDG 섭취 3주 전후 유전자 발현의 변화를 비교하는 것이다. 값은 또한 그들의 위약 대조군 샘플의 값과 비교된다. 추가의 분석은 휴약 값(반복 측정 ANOVA) 및 기준선 및 SDG 및 위약 후 비흡연자 및 흡연자 사이의 비교를 포함하는 모든 시점에 걸쳐 SDG에 의한 발현의 변화를 비교한다. 2주 대 3주 데이터 및 3주 대 휴약 데이터는 반응의 동역학을 확립하기 위해 비교한다.
동일 환자 집단에서 SDG에 의한 산화적 스트레스의 감소 측정
인간 대상체에서 산화적 스트레스를 측정하는 것이 어렵지만, 가장 확립된 접근법 중의 하나는 IsoP의 뇨 중 수준을 측정하는 것이다. 이 마커의 신뢰성 및 재현성 검정이 개발되었다. 데이터는 13주 이하 동안 40g FS를 섭취한 폐 이식을 대기 중인 환자로부터 수득했다. 뇨 IsoP는 꾸준히 감소하는 것으로 밝혀진 반면, FS의 경우, 산화적 스트레스의 전신 감소를 나타낸다(일부 IsoP 하위범주는 전-FS 수준의 26%로 ↓ 감소된다). 대표적인 환자의 데이터는 도 46에 제시된다. 담배 연기 중의 발암 물질인 BaP은 반응성 산소 종 매개 DNA 가닥 절단 및 8-옥소-7,8-디하이드로-2'-데옥시구아노신(8-옥소-dGuo) 형성을 유발한다. 8-옥소-dGuo는 LC-MRM/MS를 사용하여 생물학적 시험편(뇨, 간, 폐)에서 검출될 수 있다. 2명의 인간 지원자로부터의 데이터는, 3주 동안 40g FS의 매일 소비가 8-옥소-dGuo에서 감소하는 경향을 유도하고, 경향은 또한 동일 식이를 급식한 폐 이식 환자(n=5)에서도 나타났다는 것을 나타냈다(도 47).
시험: 시험에서, 뇨 샘플은 대조군 및 흡연 대상체 둘 다에서 다수의 시점에 취한다. 뇨 IsoP 및 8-옥소-dGuo의 수준은 맹검 방식으로 측정된다.
폐 산화적 스트레스를 평가하기 위한 배출된 호흡 응축물 : 이러한 대상체에서 기관지경 검사와 같은 침습적 시험을 실행하는 것이 불가능하다는 것을 감안하여, 비침습적 샘플 수집 기술, 배출된 호흡 응축물(EBC)이 폐 산화제 스트레스를 조사하기 위해 사용된다. 다수의 물질은 그것을 냉각시킴으로써(즉, 응축시킴으로써) 수득될 수 있는 액체에서 검출가능한 배출된 호흡에서 발견된다. 이 방법의 이점은 그것이 비침습적이고, 폐 중 산화적 스트레스 바이오마커의 실시간 분석 및 평가를 위한 비침습적 샘플링 방법으로서 편리하다는 점이다. 산화적 스트레스의 바이오마커는 H2O2, 이소프로스탄(IsoP), 말론디알데히드, 4-하이드록시-2-노네날, 항산화제, 글루타티온 및 질산화적 스트레스 마커를 포함한다. EBC 중 이소프로스탄 수준은 폐 산화적 스트레스에 대한 FS의 효과를 연구하기 위한 유용한 비침습적 접근법으로서 평가된다. 8-isoP는 대조군 대상체 및 흡연자로부터 수집된 EBC로부터의 측정치였다. 비흡연자의 수준은 시험 감도(1.2 pg/ml +/- 0.6, n=8) 근처에서 균일하게 낮았으며, EBC가 비흡연자에게 유용하지 않다는 것을 시사한다. 수준이 4명의 흡연자에서만 측정되었지만, 흥미롭게도 이들 대상체 중 두명은 훨씬 더 높은 수준 16pg/ml 및 6.5pg/ml를 가졌다. 따라서, 높은 기준선 수준을 갖는 ㅎ흐흡연자들에서, EBC는 폐 특이적 산화적 스트레스를 추적하기 위해 사용된다.
데이터 분석. 각 대상체에 대한 기준선 값을 결정하고, 치료(3주) 말기에 나타난 변화는 대응 t-테스트를 사용하여 평가된다. 추가의 분석은 휴약 값(반복 측정 ANOVA) 및 기준선 및 SDG 후 비흡연자와 흡연자 사이의 비교를 포함하여 모든 시점에 걸쳐 SDG에 의한 발현의 변화를 비교한다. 본 발명자들은 반응의 동역학을 확립하기 위해 2주 대 3주 데이터와 3주 대 휴약 데이터를 비교할 수 있다.
아마인 리그난 , SDG의 화학예방 특성
이러한 실험에서, SDG가 생체 이물질의 독성을 감소시키고, 설포라판과 유사하게 BaP와 같은 발암 물질을 해독시킬 수 있다는 가설이 시험된다. 먼저, 기관지 상피 세포 상의 SDG의 시험관내 효과가 평가된다. MTT 검정과 같은 세포독성 시험은 이하 기재된 모든 SDG 용량에 대해 수행된다. 둘째로, BaP 마우스 모델에게 경구 투여된 SDG가 평가된다.
정상 마우스 및 인간 원발성 폐 상피 세포 및 Nrf2 -매개 단계 II 효소 발현 의 유도에서 Bap의 SDG-매개 해독의 평가.
BaP(10 또는 20μM)는 상피 세포에 의해 대사적으로 활성화될 때 용량- 및 시간 의존적 방식으로 ROS를 유도한다(도 23). 마우스 연구를 위해, 이러한 세포가 비종양 형성성이고, 접촉 억제되고, 조사중인 모든 Nrf2-조절 기계를 함유한다는 점을 고려하여 불멸화된 C10 마우스 기관지 세포주(Balb/C 마우스로부터 유래됨)를 사용한다. 유사한 연구는 A549 세포(모델 인간 유형 1 폐포 상피 세포에 사용된 형질전환된, 그러나 매우 분화된 폐암 세포주 - 도 22-23 참조 및 중요하게는, 원발성 인간 기관지 상피 세포를 사용하여 수행된다.
직접 ROS 차단을 평가하기 위해, SDG 농도(0.1-10μM)를 10μM B[a]P와 동시에 첨가하고, 직접 항산화제 활성을 나타내는 H2DCF 형광성의 감소에 대해 측정한다. 액체 크로마토그래피/복수 반응 모니터링 질량 분석법(LC/MRM-MS)은 GSSG:GSH 비를 결정하는 것이다. BaP는 또한 LC-MRM/MS를 사용하여 측정될 수 있는 DNA 부가물 형성을 신속하게 유도할 수 있다(도 22). BaP에 의해 유발된 BaP-유발 산화적 DNA 손상은 8-옥소-dGuo 형성, 표준 COMET 이미지 분석을 사용하는 개별 세포의 꼬리 모멘트(데이터는 도시되지 않음), 또는 γH2AX의 검출을 위한 면역블롯의 농도 측정 분석(데이터는 도시되지 않음)에 의해 측정될 수 있다. DNA 부가물 ㅁ미및 산화적 변화를 평가하기 위해, SDG 농도 범위를 10μM B[a]P와 동시에 첨가하고, 이러한 변수들을 측정한다. 추가로, MTT 세포독성 검정은 발암 물질의 부재 및 존재하에 이러한 세포 상에서 직접 SDG 효과를 평가하기 위해 수행된다(FS 및 FLC는 단지 생체내에서 시험될 수 있다). 이어서, 기관지 상피 세포에서 단계 II ㅎ효소를 상향조절하는 정제된 SDG의 능력을 시험한다. 구체적으로, 리그난 SDG (0.1-10μM) 치료와 함께 배양 0, 1, 2, 4, 24, 48 및 72시간 후 GST-Ya, 및 NQO-1 메시지 및 단백질의 유도를 측정한다. 이러한 효소는 단계 II 시스템의 특유의 대표적인 ARE-조절 효소로서 선택된다. RT-PCR 및 면역불롯 분석을 수행한다. 단계 II 효소 상향조절의 시간 경과를 동정한 후, 상피 세포를 SDG로 전처리하고, 최대단계 II 유도 시점에 BaP를 첨가한다. 산화제 스트레스, DNA 손상 및 세포사는 상기한 검정을 사용하여 평가한다.
데이터 분석, 예상 결과 및 추가의 연구: 제1 세트의 연구는 SDG의 직접 항산화제 효과를 정의한다. SDG 자체가 없어지는 (따라서, 직접 항산화제 효과가 존재하지 않는) 이후 시점에서 수행된 제2 세트의 연구는 이의 단계 II 효소 유도 효과에 기인하는 SDG의 효과를 정의한다. 산화적 스트레스 및 염증의 추가의 측정이 혈장 산화적 스트레스 측정(혈장 말론디알데히드) 및 (IL-6, IL-1α, IL1β, TNF-α, C-반응성 단백질)과 같은 전염증성 스트레스 마커의 SDG에 의한 감소를 결정하기 위해 수행된다.
A/J 마우스-화학적 발암 물질 유발 폐 종양 형성의 뮤린 모델에서 SDG의 화학예방 특성
BaP-유발 종양형성의 진행에 대한 경구 투여된 SDG의 효과를 상기한 바와 동일한 연구 설계에 따라 A/J 마우스에서 연구한다(도 42a, 계획 A). SDG 보충 마우스는 대조군과 직접 비교한다, 단지 개시 단계 동안 SDG를 사용하는 연구(도 42a, 계획 B), 및 단지 촉진 단계 동안 SDG를 사용하는 연구(도 22a, 계획 C)를 포함하여 추적 연구가 수행된다.
통계: 동물 연구는 일반적으로 20마리 마우스의 두 그룹(예: 대조군 대 50mg/Kg SDG) 이상을 함유하고, ANOVA 또는 다른 적합한 선형 모델을 사용하여 분석한다. 모든 계산은 양측 시험, 0.05의 알파 수준 및 적어도 80% 동력을 가정한다
식이 그룹 비히클 BaP 총
대조군 (0) 20 20 40
50mg/Kg SDG 20 20 40
100mg/Kg SDG 20 20 40
총 60 60 120
표 1: 3개 실험 계획(참조: 도 42a: 계획 A, B, C)에 배치된 3개 시험 그룹 상의 마우스를 4, 6 및 9개월(3개 시점)에서 희생시켰다, 즉 3x3x3x20마리 마우스= 540 마리 마우스.
실시예 8
석면 유발 발암에 대한 SDG의 효과.
SDG 또는 아마인 식이는 석면 유발 ROS/염증을 감소시켜 1) ROS, 2) 감소된사이토카인; 3) 감소된 HMGB1; 4) 낮은 종양형성성 병소; 및 5) 적은 종양을 유도하는 것으로 가설된다. 근본적인 가설은 염증과 산화적 스트레스가 세포의 악성 형질전환을 감소시키고 종양 부담을 줄인다는 것이다(참조: 도 48).
아마인 리그난 SDG가 석면 유발 염증 및 산화적 및 질산화적 스트레스를 감소시킨다는 가설을 시험하기 위해, 마우스 복강 대식세포를 다양한 농도의 청석면 석면 섬유(10, 20, 30 및 40ng/cm2)에 노출시켰다. 석면 노출 후 가변 시간(3, 4, 6 및 8시간)에, 세포를 SDG(50μM)로 배양하고, 염증성 사이토카인 분비 및 질산화적/산화적 스트레스를 검출하기 위해 상청액을 24시간 후에 수집하였다(도 49).
SDG는 시험관내 인간 중피종 세포에 의해 석면 유발 ROS 분비를 무디게 한다(도 50). 세포에서 석면 유발 ROS를 검출하기 위한 실험 계획: (인간 중피종) HM 세포 또는 마우스 대식세포를 24시간 동안 20% DMEM에 플레이팅하고; 1시간 동안 HBSS 중의 20μM DCF를 첨가하고; 상청액을 H2O2(100μM), 석면(10μg 청석면/cm2) 및/또는 SDG(50μM)를 함유하는 1% DMEM으로 교환하고; 형광 수준을 석면 노출 개시후 36시간까지 모니터링했다. 결과는 석면 및 H2O2가 높은 수준의 ROS를 유도하지만, 매체에 SDG를 첨가하면 ROS 수준을 기준선 수준까지 상당히 감소시킨다는 것을 보여준다(도 50).
배양물 RAW 대식세포 중의 석면 유발 산화적 스트레스(ROS 방출)를 평가했다. 세포는 30분 동안 ROS-감수성 염료 H2DCFDA로 처리한 다음, 그들을 40μg/cm2 석면 섬유, 또는 4uM 차아염소선염 용액으로 비히클에 노출시키고, 형광 강도를 90분, 150분 및 27시간 동안 분광 광도계로 측정했다. 석면 유발 ROS는 석면 노출 직후에 생성되었고, 관찰 기간 동안 계속되었다(도 51).
석면에 노출 수시간 후에 대식세포에 투여된 SDG는 산화적 스트레스를 감소시킨다(도 52). 여성 C57/Bl6 마우스에게 2mL의 티오글리콜레이트를 주사하고, 복막 대식세포를 3일 후에 수거했다. 웰당 2백만개의 세포를 6 웰 플레이트에 플레이팅하고, 20μg/cm2 석면에 노출시켰다. 세포를 석면 노출 후 3, 4, 6, 또는 8시간에 25 또는 50μM SDG(합성 SDG)로 처리했다. 세포를 석면 노출 후 24시간에 수거했다. 동결된 상청액 샘플에 대해 분석을 수행했다. 결과는, 지질 과산화를 위한 마커인 말론디알데히드가 석면 노출로 경시적으로 증가되었음을 보여준다(도 52a). 세포에 첨가된 25 및 50μM SDG로, MDA의 수준은 상당히 감소되었다(p<0.05)(도 52b).
석면에 노출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 질산화적 스트레스를 감소시킨다(도 53). 석면 노출 후 세포에서 질산화적 스트레스를 둔화시키는데 있어서 SDG를 평가하기 위해, 암컷 C57/Bl6 마우스에게 2mL의 티오글리콜레이트를 주사하고, 복막 대식세포를 3일 후에 수거했다. 웰당 2백만개의 세포를 6 웰 플레이트에 플레이팅하고, 20μg/cm2 석면에 노출시켰다. 세포를 석면 노출 후 3, 4, 6, 또는 8시간에 25 또는 50μM SDG(합성 SDG)로 처리했다. 세포를 석면 노출 후 24시간에 수거했다. 동결된 상청액 샘플에 대해 분석을 수행했다. 결과는, 질산화적 스트레스의 마커인 아질산염이 석면 노출로 경시적으로 증가되었음을 보여준다(도 53a). 세포에 첨가된 25 및 50μM SDG로, MDA의 수준은 상당히 감소되었다(p<0.05)(도 53b).
석면에 노출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 염증성 사이토카인 분비(IL-1β)를 감소시킨다(도 54). 석면 노출 후 세포에서 염증성 사이토카인 분비(IL-1β)를 둔화시키는데 있어서 SDG를 평가하기 위해, 암컷 C57/Bl6 마우스에게 2mL의 티오글리콜레이트를 주사하고, 복막 대식세포를 3일 후에 수거했다. 웰당 2백만개의 세포를 6 웰 플레이트에 플레이팅하고, 20μg/cm2 석면에 노출시켰다. 세포를 석면 노출 후 3, 4, 6, 또는 8시간에 25 또는 50μM SDG(합성 SDG)로 처리했다. 세포를 석면 노출 후 24시간에 수거했다. 새로운 상청액 샘플에 대해 분석을 수행했다. 결과는, IL-1β, 전염증성 사이토카인이 석면 노출로 경시적으로 증가되었음을 보여준다(도 54a). 세포에 첨가된 25 및 50μM SDG로, IL1β의 수준은 상당히 감소되었다(p<0.05)(도 54b).
석면에 노출 수시간 후 대식세포에 제공된 SDG는 염증성 사이토카인 분비(TNF-α)를 감소시킨다(도 55). 석면 노출 후 세포에서 염증성 사이토카인 분비(TNF-α)를 둔화시키는데 있어서 SDG를 평가하기 위해, 암컷 C57/Bl6 마우스에게 2mL의 티오글리콜레이트를 주사하고, 복막 대식세포를 3일 후에 수거했다. 웰당 2백만개의 세포를 6 웰 플레이트에 플레이팅하고, 20μg/cm2 석면에 노출시켰다. 세포를 석면 노출 후 3, 4, 6, 또는 8시간에 25 또는 50μM SDG(합성 SDG)로 처리했다. 세포를 석면 노출 후 24시간에 수거했다. 새로운 상청액 샘플에 대해 분석을 수행했다. 결과는, TNF-α, 전염증성 사이토카인이 석면 노출로 경시적으로 증가되었음을 보여준다(도 55a). 세포에 첨가된 25 및 50μM SDG로, TNF-α의 수준은 상당히 감소되었다(p<0.05)(도 55b).
간단하게, 이 실시예에서 시험관내 실험은 (1) SDG가 인간 중피종 세포 및 마우스 RAW 대식세포에서 석면 유발 ROS를 블록킹하고; (2) SDG가 석면에 노출된 마우스 복막 대식세포에 의한 염증성 사이토카인 분비를 블록킹하고; (3) SDG가 석면에 노출된 마우스 복막 대식세포에서 산화적(지질 과산화) 및 질산화적 스트레스(아질산염 수준)를 블록킹한다는 것을 입증한다. 이러한 시험관내 실험은 석면 노출에 기인하는 만성 염증 및 최종적으로 악성종양을 둔화시키는데 있어서 SDG의 유용성을 결정하기 위한 생체내 실험을 지지한다.
따라서, SDG는 두 마우스 모델을 사용하여 석면 유발 중피종에서 시험되고, 여기서 마우스는 유전적으로 석면 노출 후 중피종을 발병시킬 것으로 진단된다. 이러한 모델을 사용하여, 이러한 마우스에서 석면의 단일 용량에 대한 아마인 및 SDG의 급성 효과를 평가할 뿐만 아니라 아마인 및 SDG가 이러한 가속화된 석면 유발 MM의 모델에서 종양의 발병을 억제하는지를 시험한다(도 56).
SDG-풍부 아마인 리그난 식이(FLC)는 MEXTAG 마우스에서 석면 유발 복부 염증을 둔화시킨다(도 57). 간단하게, 6마리 수컷 MEXTAG 마우스(10-12주령)에게 0.5mL의 용적으로 400μg의 청석면 석면을 복강내 주사했다. 마우스의 반을 석면 주입 전 2주 동안 SDG가 풍부한 FLC 식이(35% SDG) 상에 배치하고, 나머지는 표준 식이에 배치했다. 3일 후, 마우스를 5mL의 PBS로 세척하고, 세척액을 sups 및 세포 계수를 위해 채취했다. 사이토스핀을 수행하고, 3 내지 5개의 별도의 필드를 전체 세포의 차등-%가 계산되도록 계수했다. 0% FS 급식 마우스와 비교하여, 10% FLC 급식 마우스는 복부 세척 유체 WBC에서 26% 감소되었다(P=0.014)(도 57).
석면에 노출된 7주령 수컷 NF2 (129sv) (+/-) 마우스에서 급성 단계 연구를 식이에 투여된 아마인 및 리그난 SDG 제형의 효과를 평가하기 위해 수행했다. NF2 마우스의 석면 노출 및 아마인/SDG 리그난 제형 평가의 실험 계획은 도 58에 도시된다. 간단하게, 수컷 NF2 (129SV) (+/-)를 0일째에 복강내 주사를 통해 400μg의 석면에 노출시켰다. 마우스를 석면 노출 24시간 전(-1일)에 시험 식이(0% FS, 10% FS, 10% FLC; 그룹당 n=2 마우스)를 개시하고, 석면 노출 후 3일째에 희생시켰다. 복부 세척(AL)을 5mL의 1× PBS를 사용하여 수행했다. 염증 세포 유입은 3일까지 최고조에 달했고, 석면 노출 후 9일까지 감소되었다. 따라서, 모든 후속 시럼에서 염증을 평가하기 위한 시점으로서 3일을 선택했다(도 59).
아마인 및 이의 SDG-풍부 리그난 성분은 석면 유발 염증(젊은 마우스)을 둔화시켰다(도 60). 총 백혈구(도 60a)는 식이에 FS 또는 FLC 첨가로 감소되었지만, 현저히 감소되지는 않았다. 그러나, 세포 차이와 특히 대식세포 수준에서 볼 때, 수준은 아마인 및 SDG-리그난 식이 둘 다에 의해 상당히 둔화되었다(도 60b).
아마인 및 이의 SDG-풍부 리그난 성분은 석면 유발 염증(나이 많은 마우스)을 둔화시켰다(도 61). 복부 석면에 노출된 나이 많은 마우스(도 61a)는 단지 300,000 세포/mL(10배 이상)와 비교하여 약 3,000,000 WBC/mL의 복부 세척 유체를 제시함으로써 석면에 더 민감하다. 결과는, 염증성 세포 호중구(도 61b) 및 대식세포(도 61c)는 모두 젊은 마우스보다 나이 많은 마우스에서 상당히 더 높았다는 것을 나타냈다.
도 62: SDG(식이 제형에 제공된)가 풍부한 아마인 리그난 추출물은 나이 많은 마우스에서 석면 염증을 둔화시킨다(도 62). 수컷 NF2 (129SV) (+/-) 마우스에게 0일째에 400μg의 석면을 (복강내) 주사했다. 마우스를 석면 노출 1주 전(-7일)에 시험 식이(0% FS 또는 10% FLC)를 개시하고, 석면 노출 후 3일째에 희생시켰다. 복부 세척(AL)을 5mL 1×PBS로 수행했다(1ml의 배꼽 세척액을 원심분리시키고 상청액을 동결시켰다). 혈장은 -80°에서 동결 수집했다. 세포를 세척액으로 평가하고, 총 WBC 및 호중구, 대식세포 및 호산구가 모두 SDG-풍부 식이에 의해 상당히 감소되었음을 나타냈다.
SDG(식이 제형에 제공된)가 풍부한 아마인 리그난 추출물은 나이 많은 마우스에서 석면 염증성 사이토카인 분비 및 질산화적 스트레스를 둔화시킨다(도 63). 수컷NF2 (129SV)(+/-) 마우스에 0일째에 400μg의 석면을 (복강내) 주사했다. 마우스를 석면 노출 1주 전(7일)에 시험 식이(0% FS 또는 10% FLC)를 개시하고, 석면 노출 후 3일째에 희생시켰다. 복부 세척(AL)을 5mL 1×PBS로 수행했다(1ml의 배꼽 세척액을 원심분리시키고 상청액을 동결시켰다). 혈장은 -80°에서 동결 수집했다. 사이토카인 IL1β 및 TNFα 뿐만 아니라 아질산염의 수준은 SDG-풍부 식이에 의해 상당히 둔화되었다.
간단하게, NF2 마우스를 사용하는 이러한 생체내 실험은 (1) SDG-풍부 식이를 급식한 마우스는 복부 세척액 WBC에 의해 결정된 바와 같이, 복부 염증을 상당히 감소되었고; (2) SDG-풍부 식이는 복부 세척액 중의 호중구의 수를 감소시키고; (3) 전염증성 사이토카인, IL-1ß 및 TNFα의 수준은 SDG-풍부 식이를 급식한 마우스에서 감소되었고; (4) SDG-풍부 식이 급식 마우스는 석면 섬유에의 노출로 유발된 감소된 질산화적 스트레스의 감소를 나타내는 복부 세척액 아질산염의 수준을 감소시켰음을 입증한다.
이러한 실시예에서 이러한 연구는 SDG의 화학예방 활성을 입증한다. 대규모 바이오마커 연구는 구강 상피 및 SDG에 의한 산화적 스트레스 감소에서 단계 II 효소의 유도를 평가하기 위해 수행한다. 발암 물질 노출 대상체, 예를 들면, 이전 또는 현재 흡연자에게 경구 SDG 매일 투여 후 산화적 스트레스 및 염증을 측정하는 추가의 측정을 수행하고, 혈장 산화적 스트레스 측정(혈장 말론디알데히드) 및 (IL-6, IL-1α, IL1β, TNF-α, C-반응성 단백질, F2-이소프로스탄)과 같은 전염증성 스트레스 마커를 포함한다.
본 발명의 특정 특징이 본원에서 예시되고 기재되었지만, 많은 변형, 치환, 변화 및 등가물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 정신에 속하는 이러한 변형 및 변화 모두를 포함하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.

Claims (89)

  1. 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자, 세포 또는 조직을 방사선 손상으로부터 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 방사선에 노출될 사람인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 방사선에 노출된 사람인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 치료 절차의 일부로서 방사선에 노출되었거나 노출될, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 대상체가 방사선 요법을 받았거나 받을 암 환자인, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 암 환자가 폐암 환자인, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 진단 절차의 일부로서 방사선에 노출되었거나 노출될, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 진단 절차가 치과용 또는 뼈 X-선인, 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 진단 절차가 PET 또는 CT 스캔인, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 우발적으로 방사선에 노출된, 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 그들의 직업의 일부로서 방사선에 노출되었거나 노출될, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 직업이 실험실 기술자인, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 라돈에 노출된, 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 테러의 결과로서 방사선에 노출된, 방법.
  15. 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자, 세포 또는 조직을 발암 물질 유발성 손상, 악성 형질 전환 및 암 발병으로부터 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 하나 이상의 발암 물질에 노출될 사람인, 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 하나 이상의 발암 물질 또는 화학전 독성 물질에 노출된 사람인, 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 암을 갖는, 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 우발적으로 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  20. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 하나 이상의 발암 물질 또는 테러 행위의 결과로서 화학전 독성 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  21. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 습관의 결과로서 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 습관이 흡연인, 방법.
  23. 청구항 15에 있어서, 상기 대상체가 그들의 직업의 결과로서 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 대상체의 직업이 실험실 기술자인, 방법.
  25. 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 분자, 세포 또는 조직을 차아염소산염 이온에 의한 손상으로부터 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자가 핵산인, 방법.
  27. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자가 단백질 또는 지질인, 방법.
  28. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 (S,S)-SDG인, 방법.
  29. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 (R,R)-SDG인, 방법.
  30. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 합성 SDG인, 방법.
  31. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 SDG 유사체인, 방법.
  32. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 식이성 조성물로 투여되는, 방법.
  33. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 경구 투여함을 포함하는, 방법.
  34. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 약 1나노몰(nM) 내지 약 1몰(M) 농도의 SDG인, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 SDG 농도가 약 25μM 내지 약 250μM인, 방법.
  36. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간 대상체인, 방법.
  37. 방사선에 노출되었거나 노출될 대상체에서 방사선 손상을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 대상체가 치료 절차의 일부로서 방사선에 노출되었거나 노출될, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 대상체가 방사선 요법을 받았거나 받을 암 환자인, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 암 환자가 폐암 환자인, 방법.
  41. 청구항 37에 있어서, 상기 대상체가 진단 절차의 일부로서 방사선에 노출되었거나 노출될, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 진단 절차가 치과용 또는 뼈 X-선인, 방법.
  43. 청구항 41에 있어서, 상기 진단 절차가 PET 또는 CT 스캔인, 방법.
  44. 청구항 37에 있어서, 상기 대상체가 우발적으로 방사선에 노출된, 방법.
  45. 청구항 37에 있어서, 상기 대상체가 그들의 직업의 일부로서 방사선에 노출되었거나 노출될, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 대상체의 직업이 실험실 기술자인, 방법.
  47. 청구항 37에 있어서, 상기 대상체가 라돈에 노출된, 방법.
  48. 청구항 37에 있어서, 상기 대상체가 테러의 결과로서 방사선에 노출된, 방법.
  49. 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될 대상체에서 발암 물질 유발 손상, 악성 형질 전환 또는 암 발병을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 발암 물질 유발 손상, 악성 형질 전환 또는 암 발병이 암인, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 암이 폐암인, 방법.
  52. 청구항 50에 있어서, 상기 암이 악성 중피종인, 방법.
  53. 청구항 50에 있어서, 상기 대상체가 상기 암이 발병되지 않은, 방법.
  54. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 우발적으로 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  55. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 하나 이상의 발암 물질 또는 테러 행위의 결과로서 화학전 독성 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  56. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 습관의 결과로서 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 습관이 흡연인, 방법.
  58. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 그들의 직업의 결과로서 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 노출될, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 대상체의 직업이 실험실 기술자인, 방법.
  60. 청구항 49에 있어서, 상기 하나 이상의 발암 물질이 석면인, 방법.
  61. 청구항 49에 있어서, 상기 하나 이상의 발암 물질이 담배 연기인, 방법.
  62. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 흡연자인, 방법.
  63. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 이전의 흡연자인, 방법.
  64. 청구항 49에 있어서, 상기 대상체가 간접 흡연에 노출된 비흡연자인, 방법.
  65. 차아염소산염 이온에 노출되었거나 노출될 대상체에서 차아염소산염 이온 유발 손상을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  66. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 (S,S)-SDG인, 방법.
  67. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 (R,R)-SDG인, 방법.
  68. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 합성 SDG인, 방법.
  69. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 SDG 유사체인, 방법.
  70. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 식이성 조성물로 투여되는, 방법.
  71. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 경구 투여함을 포함하는, 방법.
  72. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 약 1나노몰(nM) 내지 약 1몰(M) 농도의 SDG인, 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 SDG 농도가 약 25μM 내지 약 250μM인, 방법.
  74. 청구항 37 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간 대상체인, 방법.
  75. 생체 분자, 세포 또는 조직을 방사선 손상으로부터 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  76. 생체 분자, 세포 또는 조직을 발암 물질 유발 손상으로부터 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  77. 생체 분자, 세포 또는 조직을 차아염소산염 이온에 의한 손상으로부터 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 생체 분자, 세포 또는 조직을 적어도 하나의 생물 활성 성분의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 생물 활성 성분이 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(SDG), 세코이솔라리시레시놀(SECO), 엔테로디올(ED), 엔테로락톤(EL), 이의 유사체, 이의 입체이성체 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  78. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자가 핵산인, 방법.
  79. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자가 단백질 또는 지질인, 방법.
  80. 청구항 73 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 (S,S)-SDG인, 방법.
  81. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 (R,R)-SDG인, 방법.
  82. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 합성 SDG인, 방법.
  83. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 SDG 유사체인, 방법.
  84. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 활성 성분이 약 1나노몰(nM) 내지 약 1몰(M) 농도의 SDG인, 방법.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 SDG 농도가 약 25μM 내지 약 250μM인, 방법.
  86. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 조직이 암 세포 또는 조직인, 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 암이 폐암인, 방법.
  88. 청구항 86에 있어서, 상기 암이 악성 중피종인, 방법.
  89. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자, 세포 또는 조직이 인간 생체 분자, 세포 또는 조직인, 방법.
KR1020167037042A 2014-05-30 2015-06-01 방사선 및 화학적 손상으로부터 보호하기 위한 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(ｓｄｇ) 및 관련 화합물의 용도 KR20170010019A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462005330P 2014-05-30 2014-05-30
US62/005,330 2014-05-30
US201562101296P 2015-01-08 2015-01-08
US62/101,296 2015-01-08
PCT/US2015/033501 WO2015184441A2 (en) 2014-05-30 2015-06-01 USE OF SECOISOLARICIRESINOL DIGLUCOSIDES (SDGs) AND RELATED COMPOUNDS FOR PROTECTION AGAINST RADIATION AND CHEMICAL DAMAGE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170010019A true KR20170010019A (ko) 2017-01-25

Family

ID=54700083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167037042A KR20170010019A (ko) 2014-05-30 2015-06-01 방사선 및 화학적 손상으로부터 보호하기 위한 세코이솔라리시레시놀 디글루코사이드(ｓｄｇ) 및 관련 화합물의 용도

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP3148560A4 (ko)
JP (2) JP2017520620A (ko)
KR (1) KR20170010019A (ko)
CN (2) CN107155304A (ko)
AU (2) AU2015266614A1 (ko)
CA (1) CA2950744A1 (ko)
IL (1) IL249219A0 (ko)
MA (1) MA39899A (ko)
WO (1) WO2015184441A2 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017278139A1 (en) * 2016-06-07 2019-01-03 University Of Pennsylvania Compositions and methods for protecting organs from ischemia/reperfusion injury associated with transplantation
EP3606325A4 (en) * 2017-04-03 2021-01-20 Gusto Global, LLC RATIONAL DESIGN OF BIOTHERAPEUTICS BASED ON MICROBES
US20210128596A1 (en) * 2017-09-27 2021-05-06 University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating septic cardiomyopathy
EP3687545A4 (en) * 2017-09-27 2021-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania USE OF SECOISOLARICIRESINOL (SDG) DIGLUCOSIDES AND RELATED COMPOUNDS IN PROTECTION AGAINST RADIATION-INDUCED CARDIOVASCULAR DYSFUNCTION
CN112601462B (zh) * 2018-08-31 2023-10-31 伊诺弗斯公司 植物抗氧化剂

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6486126B1 (en) * 1999-06-30 2002-11-26 University Of Saskatchewan Technologies Incorporated Antioxidant activity in SDG metabolites
CN1447689A (zh) * 2000-06-14 2003-10-08 阿拉·夏皮罗 辐射保护剂
CN100365005C (zh) * 2006-03-02 2008-01-30 江南大学 一种从亚麻籽中提取纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的方法
US20070293458A1 (en) * 2006-06-16 2007-12-20 Ip-6 Research Inc. Prevention of nuclear, solar, and other radiation-induced tissue damage
WO2008147563A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Flaxseed lignan complex, methods of using and compositions thereof
WO2010017332A2 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Radioprotectants targeting thrombospondin-1 and cd47
CN101759731B (zh) * 2008-12-25 2011-10-19 中国科学院兰州化学物理研究所 亚麻籽胶和开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的提取方法
AU2014278362B2 (en) * 2013-06-10 2017-07-13 The Scripps Research Institute Preparation of (S,S)-secoisolariciresinol diglucoside and (R,R)-secoisolariciresinol diglucoside

Also Published As

Publication number Publication date
MA39899A (fr) 2021-05-26
WO2015184441A3 (en) 2016-03-10
JP2017520620A (ja) 2017-07-27
IL249219A0 (en) 2017-02-28
AU2020270469A1 (en) 2020-12-17
EP3148560A4 (en) 2018-04-25
WO2015184441A9 (en) 2016-01-21
AU2015266614A1 (en) 2016-12-15
CN107155304A (zh) 2017-09-12
EP3148560A2 (en) 2017-04-05
CA2950744A1 (en) 2015-12-03
CN112336736A (zh) 2021-02-09
JP2020121987A (ja) 2020-08-13
WO2015184441A2 (en) 2015-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020270469A1 (en) Use of secoisolariciresinol diglucosides (SDGs) and related compounds for protection against radiation and chemical damage
Devi et al. TXNIP regulates mitophagy in retinal Müller cells under high-glucose conditions: implications for diabetic retinopathy
Ali et al. Melatonin attenuates D‐galactose‐induced memory impairment, neuroinflammation and neurodegeneration via RAGE/NF‐KB/JNK signaling pathway in aging mouse model
CN106163557B (zh) 用于杀死衰老细胞和用于治疗衰老相关疾病和病症的方法和组合物
de Jonge et al. Stimulation of the vagus nerve attenuates macrophage activation by activating the Jak2-STAT3 signaling pathway
Antkiewicz-Michaluk et al. Antidepressant-like effect of tetrahydroisoquinoline amines in the animal model of depressive disorder induced by repeated administration of a low dose of reserpine: behavioral and neurochemical studies in the rat
Mei et al. FA-97, a new synthetic caffeic acid phenethyl ester derivative, ameliorates DSS-induced colitis against oxidative stress by activating Nrf2/HO-1 pathway
US10966995B2 (en) Use of secoisolariciresinol diglucosides (SDGS) and related compounds for protection against radiation and chemical damage
Guo et al. Aluminum-induced suppression of testosterone through nitric oxide production in male mice
Zhou et al. Rhein regulates redox‐mediated activation of NLRP3 inflammasomes in intestinal inflammation through macrophage‐activated crosstalk
Rufener et al. Activity of mefloquine and mefloquine derivatives against Echinococcus multilocularis
Champa et al. Obatoclax kills anaplastic thyroid cancer cells by inducing lysosome neutralization and necrosis
Qin et al. Pyrroloquinoline quinone prevents knee osteoarthritis by inhibiting oxidative stress and chondrocyte senescence
Pietrofesa et al. The synthetic lignan secoisolariciresinol diglucoside prevents asbestos‐induced NLRP3 inflammasome activation in murine macrophages
EP3220908B1 (en) Compositions and methods for treating endometriosis
Wu et al. Therapeutic efficacy of novel memantine nitrate MN‐08 in animal models of Alzheimer’s disease
JP2023123633A (ja) 癌治療
Huang et al. Niclosamide suppresses T‑cell acute lymphoblastic leukemia growth through activation of apoptosis and autophagy
US20230310359A1 (en) Anti-Oncogenic Phytochemicals and Methods and Uses for Treating Cancer
US20120022129A1 (en) Targeting of Histone Deacetylase 2, Protein Kinase CK2, and Nuclear Factor NRF2 For Treatment of Inflammatory Diseases
US10688105B2 (en) Method of treating refractory rheumatoid arthritis associated with p53 mutation
WO2015164716A1 (en) Methods for the diagnosis and treatment of pulmonary fibrosis in subjects with hermansky pudlak syndrome
Zeng et al. Melatonin Improves Mitochondrial Dysfunction and Attenuates Neuropathic Pain by Regulating SIRT1 in Dorsal Root Ganglions
EP3880188A1 (en) Electrophiles and electrophile pro-drugs as rad51 inhibitors
WO2018199109A1 (ja) 神経変性疾患治療剤