KR20160149804A - 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물 - Google Patents

매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20160149804A
KR20160149804A KR1020150087467A KR20150087467A KR20160149804A KR 20160149804 A KR20160149804 A KR 20160149804A KR 1020150087467 A KR1020150087467 A KR 1020150087467A KR 20150087467 A KR20150087467 A KR 20150087467A KR 20160149804 A KR20160149804 A KR 20160149804A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
mass tag
peptide
fluorescence
gene mutation
Prior art date
Application number
KR1020150087467A
Other languages
English (en)
Inventor
박계신
이은희
김효선
Original Assignee
다이아텍코리아 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이아텍코리아 주식회사 filed Critical 다이아텍코리아 주식회사
Priority to KR1020150087467A priority Critical patent/KR20160149804A/ko
Publication of KR20160149804A publication Critical patent/KR20160149804A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/119—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being proteinic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/167—Mass label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/627—Detection means characterised by use of a special device being a mass spectrometer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 비교적 간단하게 유전자 변이를 검출할 수 있으며, 다양한 매스 태그 시퀀스를 도입하여 다중 검출에 사용할 수 있다.

Description

매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물{A method for detecting gene mutation using mass tag or fluorescence conjugated probe and a composition therefor}
본 발명은 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
유전자 분석을 위한 유전자 시료를 수득하기 위하여 가장 보편적으로 사용하는 방법으로 DNA 중합효소를 이용한 중합효소연쇄반응 방법이 있다. 상기 방법은 주형 DNA와 결합할 수 있는 프라이머의 길이와 염기서열을 임의로 조절해서 설계함으로써 목적하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 한 번의 반응으로 하나의 관심유전자만을 증폭시킬 수 있어 증폭하고자 하는 관심유전자의 개수가 많을 경우엔 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 하는 번거러움이 있다.
다수의 유전자 영역을 동시에 분석하기 위해서 여러 개의 중합효소연쇄반응을 한 튜브에서 수행하는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 방법이 널리 이용되고 있으나, 많은 프라이머를 한 튜브에서 동시에 사용함에 따라 프라이머들 간의 교차반응이 발생하게 되기 때문에 한 번에 증폭할 수 있는 유전자 영역의 수에는 한계가 있으며, 반응조건을 찾기 위한 많은 노력과 시간을 필요로 하고 민감도 및 특이도에서 좋은 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다 (Hardenbol et al., Nat. Biotechnol., 21:673, 2003).
최근, 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 사용하지 않고 공통 프라이머를 사용하여 다수의 유전자 영역을 동시에 증폭하여 대량 분석을 가능하게 하는 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 대표적인 기술로는 동시에 여러 유전자 영역의 단일염기다형성(SNP)을 분석할 수 있는 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIP)가 있다.
SNPlex는 oligonucleotide ligation assay(OLA) 이후에 exonuclease를 이용한 정제 과정을 수행하고 탐침의 양쪽 끝에 있는 공통 프라이머 염기서열로 중합효소연쇄반응 증폭을 한 다음, 마지막으로 탐침에 포함되어있는 ZipCode 염기서열을 이용해 DNA 칩에서 분석하는 방법이며(Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16:398, 2005),Goldengate assay는 고체 표면에 고정화된 genomic DNA에 upstream 탐침으로 대립유전자 특이적 프라이머 연장반응을 수행한 후에 downstream 탐침과 DNA연결 반응을 수행하고, 세척 과정을 거쳐 DNA 연결 반응이 되지 않은 탐침들을 제거한다. 그리고 SNPlex와 같이 탐침에 포함되어 있는 공통 프라이머 염기서열로 증폭시키고, 증폭된 중합효소연쇄반응 결과물을 Illumina BeadChip에서 분석하는 방법이다 (Shen et al., Mutat. Res., 573:70,2005).
Molecular inversion probes(MIP)는 Padlock 탐침을 사용하여 Gap-ligation을 한 이후에 DNA 연결이 되지 않은 탐침들과 genomic DNA를 exonucelase를 이용하여 제거하고 uracil-N-glycosylase를 이용해 Padlock 탐침을 선형화시킨 이후에 탐침에 포함된 공통 프라이머 염기서열을 이용해서 중합효소연쇄반응을 수행하고 GenFlex Tag Array(Affymetrix)에 혼성화시켜 단일염기다형성을 분석하는 방법이다 (Hardenbol et al., Nat. Biotechnol.,21:673, 2003).
그러나, 이러한 방법들은 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행해야 하거나, 여러 종류의 효소를 이용하여야 하기 때문에 서로 다른 샘플들 간의 오염이 발생할 수 있으며 실험방법이 복잡하다는 문제점이 있다.
[선행 특허 문헌]
대한민국특허 공개번호 제1020120088891호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)돌연변이 염기서열에 특이적으로 상보적으로 결합하는 올리고 DNA를 제작하고, 그 올리고 DNA의 5'말단에 말레이미드(maleimide) 그룹을 연결하여 말레이미드 변형된 DNA 올리고머를 합성하는 단계;b) 매스 태그 펩타이드의 C말단에 시스테아민(cysteamine)을 처리하여 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드 를 제조하는 단계; 및 c) 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머에 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드를 반응시키거나, 또는 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머에 형광을 부착시키거나, 또는 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머에 아민그룹이 포함된 화합물을 반응시켜서 제조된 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브를 제공하며,
여기서, 상기 펩타이드는 아미노산 1 내지 40개로 이루어진 펩타이드이며,
상기 아민 그룹이 포함된 화합물은 분자량 100 ~ 4,000 Da 크기의 물질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 매스 태그로 사용할 수 있는 펩타이드 조합은 1개 이상의 조합으로 가능하며 그 조합의 예는 위의 표와 같다. 펩타이드 조합에 사용된 아미노산은 20개의 아미노산 중 뭐든지 사용 가능하다.

Peptide 수		 조합 분자량(g/mole)
1개 Arg 89
2개 Ala-Arg 245
3개 Val-Ala-Arg 344
4개 Ala- Ala-Arg-Arg 473
4개 Val-Val-Arg-Arg 529
4개 Tyr-Tyr-Arg-Arg 657
4개 Leu-Leu-Arg-Arg 557
5개 Leu-Tyr-Val-Ala-Arg 621
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 펩타이드이며,
상기 DNA 올리고머는 서열번호 5 내지 8에 기재된 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 올리고머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 프라이머, DNA 중합효소 및 상기 본 발명의 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 상기 중합효소 연쇄반응 산물을 탈염한 후, 질량분석기 또는 형광측정기기로 측정하고, 측정값에 나타난 분자량(m/z) 또는 형광값으로 유전자 변이를 진단하는 단계를 포함하는 유전자 변이 검출 방법을 제공한다.
또 본 발명은 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 프라이머, 내열성 DNA 중합효소 및 상기 본 발명의 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 이 과정에서 상기 프로브 DNA가 해당 유전자의 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 이 경우에 상기 DNA중합효소에 의하여 상기 매스 태그 프로브 DNA는 절단되게 되고, 상기 절단된 매스 태그 신호를 측정하는 단계를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 변이는 BCR-ABL 융합 유전자 돌연변이인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9 내지 서열번호 12에 기재된 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 매스 태그가 부착된 DNA 올리고머 프로브 및 그 제조과정은 도 1에 간략하게 기재하였다.
본 발명의 Mass Tag Region은 Peptide 또는 질량 분석이 가능한 peptide 조합 및 물질이며,
Maleimide Modified DNA Oligomer는 DNA template와 특이적인 결합을 할 수 있는 DNA oligomer이며,
BCR-ABL fusion gene 검출을 위한 Mass Tag conjugated DNA oligomer는 하기와 같다.
① b3a2 fusion gene 검출
Peptide-maleimide-5’- AGTTCAAAAGCCCTTCAGCG-3’(서열번호 5)-C6SP
(Peptide: Ala-Ala-Arg-Arg;서열번호 1)
② b2a2 fusion gene 검출
Peptide-maleimide-5’- CAATAAGGAAGAAGCCCTTC-3’(서열번호 6)-C6SP
(Peptide: Val-Val-Arg-Arg;서열번호 2)
③ e1a2 fusion gene 검출
Peptide-maleimide-5’- GAGACGCAGAAGCCCTTCAG -3’(서열번호 7)-C6SP
(Peptide: Tyr-Tyr-Arg-Arg;서열번호 3)
④ BCR Normal fusion gene 검출
Peptide-maleimide-5’- GTAGGGCACCTTGGACCTCT -3’(서열번호 8)-C6SP
(Peptide: Leu-Leu-Arg-Arg;서열번호 4)
또한 본 발명은 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 프라이머, 내열성 DNA 중합효소 및 상기 본 발명의 매스 태그가 부착된 DNA 올리고머 프로브를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 이 과정에서 상기 프로브 DNA가 해당 유전자의 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 이 경우에 상기 DNA중합효소에 의하여 상기 매스 태그 프로브 DNA는 절단되게 되고, 상기 절단된 매스 태그 신호를 측정하는 단계를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 사용된 Primer의 서열은 하기와 같다.
Forward Primer 1: 5'-ttc aga agc ttc tcc ctg aca t-3'(서열번호 9)
Forward Primer 2: 5'-ccc ccg gag ttt tga gga tt-3'(서열번호 10)
Reverse Primer 1: 5'-tgt tga ctg gcg tga tgt agt tgc ttg g-3'(서열번호 11)
Reverse Primer 2: 5'-tcc ttt gca acc ggg tct gaa-3'(서열번호 12)
본 발명에 따르면 비교적 간단하게 유전자 변이를 검출할 수 있으며, 다양한 매스 태그 시퀀스를 도입하여 다중 검출에 사용할 수 있다.
도 1은 mass tag conjugated probe 디자인. 펩타이드의 C-말단에 cysteamine을 결합시켜 mass tag을 만든 후, maleimide modified DNA oligomer와 컨쥬게이션함.
도 2는 본 발명의 질량 분석 결과 그래프(MALDI-TOF)를 나타낸 그림으로, 유전자 변이를 가진 cDNA 샘플을 mass tag과 함께 PCR을 한 후, 질량분석기 (MALDI-TOF) 측정한 결과로, 각 샘플의 유전자 변이에 따라 펩타이드와 펩타이드 + 1 nucleotide가 측정된 것을 나타낸 결과 그래프. 측정값에 나타난 분자량(m/z) 으로 유전자 변이를 진단 할 수 있음을 확인하는 그래프
도 3은 Mass Tag에 conjugation을 위한 DNA Oligomer가 template에 binding 하는 것을 보여주는 결과
도 4는 Mass Tag 을 이용한 PCR 반응 결과를 나타낸 그림으로, 유전자 변이 cDNA template와 primer와 mass tag을 넣고 PCR을 한 결과 그림으로 각각의 유전자 변이에 해당하는 PCR이 잘 되었음을 확인하는 그림임.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 보호범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명의 BCR-ABL Fusion Gene 진단 방법은 Mass Tag을 이용한 PCR 단계, PCR 산물을 Desalting 하는 단계, 고감도 질량 분석기를 이용한 Mass Tag 측정 및 분석 단계로 이루어진다.
실시예 1:Mass Tag을 이용한 PCR
본 발명에 사용된 PCR mixture 조성은 하기 표 2와 같다.
Reagent vol(㎕)
1 10 x Buffer 10.0
2 dNTP (each2.5mM) 10.0
3 Primer mixture 10.0
4 Mass Tag Mixture 10.0
5 환자 cDNA (or STD mixture) 5.0
6 Taq Polymerase 0.5
7 D.W 54.5
8 Total 100.0
본 발명에 사용된 PCR 조건은 하기 표 3과 같다.
Cycles Temperature(℃) time
1 95 10 min
35 95 30 sec
60 45 sec
72 30 sec
1 72 10 min
1 4 ∞
실시예 2: PCR 산물의 Desalting
1)Sample Acidification;
상기 실시예 1에서 얻은 PCR 산물에 동량의 1% TFA를 넣어 주어 최종 농도 0.5% TFA가 되도록 acidify 시켰다.
2)TiO2 Tip Conditioning;
TiO2 Tip을 reserve tube에 꽂은 후, 0.03% TFA 20㎕를 넣고 3,000 x g 에서 2분간 원심분리하고, 이 과정을 2번 반복하였다.
3)Sample Binding;
상기 TiO2 Tip에 acidified 샘플을 넣고 1,000 x g에서 10분간 원심분리하고, 이 과정을 3번 반복하였다.
4) TiO2 Tip Washing;
상기 TiO2 Tip을 0.03% TFA 20㎕를 넣고 3,000 x g 에서 2분간 원심분리하고, 이 과정을 5번 반복하였다.
5)Sample Elution;
상기 TiO2 Tip에 1.0% NH4OH 50㎕를 넣고 1,000 x g에서 5분간 원심분리하고, 이 과정을 2번 반복하였다.
6)Sample Dry;
상기 Elution에서 얻은 100㎕의 샘플을 SpeedVac에서 완전히 말린다.
실시예 3:고감도 질량분석기를 이용한 Mass Tag 측정 및 분석
1)Matrix 준비
:10mg의 Matrix 1(CHCA, α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)과 5mg의 Matrix 2 (DHB, 2,5- Dihydroxybenzoic acid)를 각각의 튜브에서 아래의 조성대로 넣은 후, vortex로 완전히 녹인다.
① Matrix 1(CHCA): 700㎕ Acetonitrile, 250㎕ Water, 50㎕ 10% TFA
② Matrix 2(DHB): 100㎕ Acetonitrile, 900㎕ Water
→ Matrix 1과 Matrix 2는 1:1의 비율로 섞어서 사용하였다.
2)Sample 준비
: Desalting이 끝난 sample은 0.1% TFA 10㎕로 완전히 녹였다.
3)Sample Spotting
1) Sample 1㎕와 matrix mixture 5㎕를 섞어 준 후, MALDI Plate에 1㎕ Spotting 하였다.
4)MALDI-TOF 측정
측정 모드: Reflector Positive Mode
상기 실시예의 결과를 하기에 기재한다.
1) 측정된 분자량은 질량분석기에 따라 예상 분자량에 +1, or +33, or +113 m/z 된 값이 추가되어 나타날 수 있다. 또한 질량 분석기를 통해 측정되는 분자량(m/z) 값은 DNA oligomer에서 Maleimide만이 결합된 Mass tag region 부분(Mass tag region + Maleimide)과 DNA oligomer에서 1 개의 nucleotide가 결합된 Maleimide가 결합된 Mass tag region(Mass tag region + Maleimide+ 1개의 nucleotide)이 측정될 수 있다. 이러한 현상은 내열성 DNA 중합효소의 작용으로 나타나는 결과이다.
2) 측정된 분자량을 아래의 표 4와 5를 비교해 본 후, 유전자 변이 타입을 결정한다.
Fusion Type m/z +1 +33 +113
b3a2 933 934 966 1,046
b2a2 989 990 1,022 1,102
e1a2 1,117 1,118 1,150 1,230
BCR Normal 1,017 1,018 1,050 1,130
표 4는 Mass tag region + Maleimide
Fusion Type m/z +1 +33 +113
b3a2 1,246 1,247 1,279 1,359
b2a2 1,278 1,279 1,311 1,391
e1a2 1,445 1,446 1,478 1,558
BCR Normal 1,345 1,346 1,378 1,458
표 5는 Mass tag region + Maleimide + 1 nucleotide
3) 질량 분석 결과 그래프(MALDI-TOF)를 도 2에 기재하였다.
4) Mass Tag에 conjugation을 위한 DNA Oligomer가 DNA template에 binding 하는 것을 보여주는 결과를 도 3에 나타냈으며, 간단하게 설명하면 하기와 같다.
① DNA oligomer가 DNA template에 binding 한다는 것을 확인하기 위해, DNA oligomer가 primer로 작용할 수 있도록 5‘말단은 maleimide로 modify하고 3’말단은 modify 없이 제작하여 실험하였다.
② 각각의 DNA template에 primer 및 oligomer는 도 3에 기재된 표와 같이 넣고 반응하였다. 2번과 3번에서는 forward 또는 reverse primer가 없으므로, oligomer가 DNA template에 결합을 한다면 PCR 반응에서 반응 산물이 나타날 것으로 기대하였다. 실험 결과, 각각의 DNA template의 2번 또는 3번 조합에서 PCR 반응 산물이 나타났다. 즉, DNA oligomer가 PCR 반응이 결합이 잘되는 것을 확인하였다. 또한 1번 조합에서는 3개(forward primer, reverse primer, oligomer) 모두 primer로 작용할 수 있으므로 PCR 반응에서 1개에서 3개의 반응 산물이 나타날 수 있는데, PCR 반응 결과, 1~3개의 반응 산물이 관찰되었다.
5) Mass Tag 을 이용한 PCR 반응 결과는 도 4에 나타냈다.
<110> DIATECH KOREA CO., LTD. <120> A method for detecting gene mutation using mass tag or fluorescence conjugated probe and a composition therefor <130> HY150728 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Ala Ala Arg Arg 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 2 Val Val Arg Arg 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Tyr Tyr Arg Arg 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Leu Leu Arg Arg 1 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 5 agttcaaaag cccttcagcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 caataaggaa gaagcccttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 gagacgcaga agcccttcag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 8 gtagggcacc ttggacctct 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 9 ttcagaagct tctccctgac at 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 10 cccccggagt tttgaggatt 20 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 11 tgttgactgg cgtgatgtag ttgcttgg 28 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 12 tcctttgcaa ccgggtctga a 21

Claims (10)

  1. a)돌연변이 염기서열에 특이적으로 상보적으로 결합하는 올리고 DNA를 제작하고, 그 올리고 DNA의 5'말단에 말레이미드(maleimide) 그룹을 연결하여 말레이미드 변형된 DNA 올리고머를 합성하는 단계;b) 매스 태그 펩타이드의 C말단에 시스테아민(cysteamine)을 처리하여 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드를 제조하는 단계; 및 c) 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머에 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드를 반응시키거나, 또는 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머에 형광을 부착시키거나, 또는 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머에 아민그룹이 포함된 화합물을 반응시켜서 제조된 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브,
    여기서, 상기 펩타이드는 아미노산 1 내지 40개로 이루어진 펩타이드이며,
    상기 아민 그룹이 포함된 화합물은 분자량 100 ~ 4,000 Da 크기의 물질임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 펩타이드이며,
    상기 DNA 올리고머는 서열번호 5 내지 8에 기재된 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 올리고머인 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브.
  3. 제1항의 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브를 유효성분으로 포함하는 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출용 조성물.
  4. 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 프라이머, 내열성 DNA 중합효소 및 제1항의 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 이 과정에서 상기 프로브 DNA가 해당 유전자의 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 이 경우에 상기 DNA중합효소에 의하여 상기 매스 태그 프로브 DNA는 절단되게 되고, 상기 절단된 매스 태그 신호를 측정하는 단계를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유전자 변이는 BCR-ABL 융합 유전자 돌연변이인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 검출 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9 내지 서열번호 12에 기재된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자 변이 검출 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 중 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 검출 방법.
  8. 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 프라이머, DNA 중합효소 및 제1항의 매스 태그 또는 형광이 부착된 DNA 올리고머 프로브를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 상기 중합효소 연쇄반응 산물을 탈염한 후, 질량분석기 또는 형광측정기기로 측정하고, 측정값에 나타난 분자량(m/z) 또는 형광값으로 유전자 변이를 진단하는 단계를 포함하는 유전자 변이 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자 변이는 BCR-ABL 융합 유전자 돌연변이인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 검출 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9 내지 서열번호 12에 기재된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자 변이 검출 방법.

KR1020150087467A 2015-06-19 2015-06-19 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물 KR20160149804A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150087467A KR20160149804A (ko) 2015-06-19 2015-06-19 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150087467A KR20160149804A (ko) 2015-06-19 2015-06-19 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160149804A true KR20160149804A (ko) 2016-12-28

Family

ID=57724400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150087467A KR20160149804A (ko) 2015-06-19 2015-06-19 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20160149804A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6766236B2 (ja) 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法
CN105934523B (zh) 核酸的多重检测
KR101176091B1 (ko) 염색체 이상의 검출방법
JP3908784B2 (ja) Ｄｎａ配列変異の検出
US6294336B1 (en) Method for analyzing the nucleotide sequence of a polynucleotide by oligonucleotide extension on an array
KR20070011354A (ko) 취약 ｘ염색체 증후군과 같은 ｓｔｒｐ의 검출 방법
CN110564819A (zh) 用于多重核酸鉴定的产品和方法
WO2019157445A1 (en) Biomolecular probes and methods of detecting gene and protein expression
KR101964746B1 (ko) dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법
CN101248191A (zh) 分析靶核酸序列的方法与试剂盒
KR20180038252A (ko) 메틸화 dna 다중 검출방법
JP2002500362A (ja) 固相チップおよびそれに関する使用
WO2012119945A1 (en) Novel methods for detecting hydroxymethylcytosine
US20220056519A1 (en) Method and system for constructing sequencing library on the basis of methylated dna target region, and use thereof
EP1041160A1 (en) Methods for detecting mutation in base sequence
KR20160149804A (ko) 매스 태그 또는 형광이 부착된 프로브를 이용한 유전자 변이 검출방법 및 그 조성물
KR20150041657A (ko) 핵산의 정성적 및 정량적 검출을 위한 시클로펜탄-펩티드 핵산
CN110066882B (zh) 检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用
WO2000031300A2 (en) Genotyping by mass spectrometric analysis of short dna fragments
KR101247972B1 (ko) 호기성 그람음성 식중독균 감별진단용 ｐｎａ 마이크로어레이 및 이를 이용하여 상기 균을 감별진단하는 방법
KR20160129967A (ko) 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법
KR20150038944A (ko) 유전자의 메틸화 여부 및 비율의 분석방법
AU2002357968A1 (en) Method and integrated device for the detection of cytosine methylations
Consolandi et al. Development of oligonucleotide arrays to detect mutations and polymorphisms
KR20240032630A (ko) 핵산의 정확한 병렬 검출 및 정량화 방법