KR20160149477A

KR20160149477A - 방향족 화합물을 활용한 전도성 고분자와 무기 나노입자의 복합체

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Publication number: KR20160149477A
Application number: KR1020150086512A
Authority: KR
Inventors: 함승주; 허용민; 서진석; 이택수; 방도연; 김진영; 강병훈
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2015-06-18
Publication date: 2016-12-28
Also published as: KR101711738B1

Abstract

본 발명은 방향족 화합물을 활용한 전도성 고분자와 무기 나노입자의 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 강한 산성 및 고온의 조건 없이도 방향족 화합물을 활용하여 전도성 고분자 간의 친화력을 줄임으로써 전도성 고분자와 무기 나노입자를 합성하여, 암 진단 및 치료에 효과적으로 활용 가능한 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

방향족 화합물을 활용한 전도성 고분자와 무기 나노입자의 복합체{Complex Of Conductive Polymer And Inorganic Nanoparticle Using Material With Aromatic Compound}

본 발명은 방향족 화합물을 활용한 전도성 고분자와 무기 나노입자의 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

나노 기술은 물질을 원자, 분자 수준에서 조절 및 제어하는 기술로서 신물질, 또는 신소자 창출에 적합하여 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지 및 환경 등 매우 다양하다.

현재 나노 기술은 다양하게 발전하고 있으며 크게 세 가지 분야로 나눌 수 있다. 첫째, 나노 소재로 극미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술. 둘째, 나노 소자이면서 나노 크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술. 셋째, 나노-바이오라 불리는 나노 기술을 생명공학에 응용하는 기술.

특히, 나노-바이오 분야에서 무기 나노입자들은 생체 물질의 분리, 자기공명 영상 진단 프로브, 거대자기저항센서를 포함한 바이오 센서, 마이크로 유체계 센서, 약물/유전자 전달, 및 자성 고온치료 등의 넓은 응용범위에 걸쳐 사용되고 있다.

전도성 고분자의 하나인 폴리아닐린(Polyaniline, PANI)은 약 10³ S/cm 정도의 전기 전도도를 가지고 대기 중 안정성이 뛰어나며 다른 전도성 고분자에 비해 합성이 용이하고 저렴하다는 장점을 가지고 있다.

이런 전도성 고분자와 자성을 가지는 무기 나노 물질의 혼합체는 시너지 효과를 일으키며 암 진단 및 치료 등에 활용될 수 있다. 특히, 폴리아닐린은 도핑 과정에서 전자의 이동을 유도하고 들뜬 상태의 에너지 준위를 낮춰주는 고유한 상변화(Emeraldine base(EB)→Emeraldine salt(ES))를 일으켜 다양한 분야로의 응용 가능성이 큰 후보 물질로 인식되어 왔다.

그러나, 전도성 고분자는 방향족 구조를 통한 π-π상호작용과 전도성 고분자 간의 수소결합 때문에 다른 무기 나노 물질간의 결합이 어렵다. 이런 문제점으로 인해, 상대적으로 폴리아닐린보다 유연하고 다루기 쉬운 아닐린 단량체를 중합하거나, 전도성 고분자를 무기 나노 물질에 열 처리하는 과정이 필요했다. 그러나, 이런 과정은 강한 산성이거나 고온의 조건을 필요로 하기 때문에 효율성이 떨어지고, 중합 과정에서 모든 전도성 고분자와 무기 나노입자가 결합하지 않기 때문에 결합하지 않은 전도성 고분자를 제거하는 과정 또한 필요했다.

따라서, 강한 산성 및 고온의 조건을 필요로 하지 않는 전도성 고분자와 무기 나노입자의 합성 방법과 이를 위해 전도성 고분자 간의 친화력을 줄이는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한편, 파이렌(Pyrene)은 방향족 탄화수소로, 4개의 벤젠링 구조를 가지고 있어 π-π상호작용을 가지고 있으며 이를 통해 파이렌이 나노입자의 표면에 잘 부착될 수 있다. 이렇게 파이렌이 부착된 무기 나노입자에 폴리아닐린을 혼합하면 폴리아닐린 간의 친화력을 낮출 수 있고, 폴리아닐린과 파이렌이 부착된 무기 나노입자를 분산시킬 수 있다는 이점이 있다.

특허 문헌 1: 대한민국 공개특허 제2012-0049467호 특허 문헌 2: 대한민국 공개특허 제2012-0011668호

본 발명의 목적은, 강한 산성 및 고온의 조건 없이도 전도성 고분자 간의 친화력을 줄여 전도성 고분자와 무기 나노입자를 합성하여, 암 진단 및 치료에 활용 가능한 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 무기 나노입자;

상기 무기 나노입자와 결합된 방향족 화합물; 및

상기 방향족 화합물과 결합된 전도성 고분자를 포함하는 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 복합체; 및

상기 복합체에 결합된 조직 특이적 결합 성분을 포함하는 다기능성 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은, 무기 나노입자 및 방향족 화합물을 유기 용매와 혼합하여 제1오일상을 제조하는 단계;

전도성 고분자를 유기 용매에 용해시켜 제2오일상을 제조하는 단계;

상기 제 1 및 제 2 오일상을 수상과 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및

상기 에멀젼에서 오일상을 제거하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 제 1 항의 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 복합체 또는 다기능성 복합체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 진단 및 치료용 조영제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 복합체 또는 다기능성 복합체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 복합체 또는 다기능성 복합체; 및

진단 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 프로브를 제공한다.

본 발명에 따른 복합체는, 파이렌을 가교제로 이용함으로써 기존의 필요 조건인 산성과 고온의 대기 조건이 없어도 전도성 고분자와 무기 나노입자의 합성이 가능하며, 상기 복합체는 암 진단 및 치료 등으로 용이하게 활용할 수 있으며, 바이오 메디컬 센서 및 연료전지로도 효과적으로 적용된다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 복합체(MPANs)의 투과전자현미경 사진이다.
도 2는 파이렌이 부착된 복합체(MPANs)의 입도 분포(A)와 파이렌이 부착되기 전의 입도 분포(B)를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 파이렌의 양에 따른 복합체(MPANs)의 입자 크기를 나타낸 그래프이다.
도 4는 FBS의 농도에 따른 복합체(MPANs)의 입자 크기를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 복합체(MPANs)와 무처리 폴리아닐린 나노입자(PANPs)의 10 % 농도의 FBS에서의 입자 크기를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 염 농도에 따른 복합체(MPANs)의 입자 크기를 나타낸 그래프이다.
도 7은 흡광 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이며, A는 복합체(MPANs)가 도핑된 용액이고, B는 복합체(MPANs)가 도핑되지 않은 용액이다.
도 8은 실시예 및 증류수의 온도 상승 결과 그래프이며, A는 복합체(MPANs) 용액이고, B는 증류수이다.
도 9는 MPANs의 암 진단 효과를 확인하기 위한 자기공명영상(MR) 사진이며, I는 A-431(EGFR 과발현 암세포)이고, II는 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)이며, A는 1mg 농도의 CET-MPANs이고, B는 0.2mg 농도의 CET-MPANs이다.
도 10은 암세포들의 이완도 변화를 나타낸 그래프이며, I는 A-431(EGFR 과발현 암세포)이고, II는 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)이고, A는 1mg 농도의 CET-MPANs이고, B는 0.2mg 농도의 CET-MPANs이다.
도 11은 광열 요법을 수행한 결과이며, I는 A-431(EGFR 과발현 암세포)이고, II는 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)이며, A는 CET-MPANs가 처리된 암세포에 NIR 레이저를 10분 동안 조사한 결과이고, B는 레이저 조사 없이 CET-MPANs만 처리한 결과이며, C는 CET-MPANs 없이 NIR 레이저만 10분 동안 조사한 결과이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 본 발명에서 첨부된 도면은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소하여 도시된 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 도면을 참고하여 상세하게 설명하고, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명에서 'MPANs'는 본 발명에 따른 무기 나노입자; 상기 무기 나노입자와 결합된 방향족 화합물; 및 상기 방향족 화합물과 결합된 전도성 고분자를 포함하는 복합체를 의미한다.

본 발명에서 '복합체'와 'MPANs'는 동일한 의미이다.

본 발명에서 'CET-MPANs'는 치료항체(Cetuximab)를 부착한 MPANs를 의미한다.

이하, 본 발명에 따른 복합체를 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 복합체는,

무기 나노입자;

상기 무기 나노입자와 결합된 방향족 화합물; 및

상기 방향족 화합물과 결합된 전도성 고분자를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 복합체는,

상기 무기 나노입자는 자성을 가지고, 직경이 1 내지 1000 nm, 구체적으로는 2 내지 100 nm인 입자라면 특별히 제한하지는 않는다.

하나의 예로서, 본 발명에 따른 무기 나노입자는 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금일 수 있다. 또한, 상기 무기 나노입자는 표면이 소수성인 무기 나노입자일 수 있으며, 표면이 소수성인 무기 나노입자라면, 통상적인 범위 내에서 제한 없이 사용 가능하다.

상기 금속은 특별히 제한하지는 않으나, Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고,

상기 자성 물질은 특별히 제한하지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄, 및 M_xO_y (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y ≤5)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이며,

상기 자성 합금은 특별히 제한하지는 않으나, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 무기 나노입자는 양친매성 화합물과의 결합을 안정화시키기 위하여 유기성 표면안정제와 결합될 수 있다. 무기 나노입자와 유기성 표면안정제의 결합은 무기 나노입자의 전구물질에 유기성 표면안정제가 배위하여 착화합물을 형성하여 이루어진다.

상기 유기성 표면안정제(surface stabilizer)는 상기 나노입자의 상태와 크기를 안정화시킬 수 있는 유기 기능성 분자를 의미하며, 예를 들어 계면활성제를 들 수 있다.

상기 계면활성제는 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide)를 포함하는 양이온 계면활성제 올레산(oleic acid), 라우르산(lauric acid), 또는 도데실산(dodecylic acid)과 같은 포화 또는 불포화 지방산, 트리옥틸포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide: TOPO), 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine: TOP), 또는 트리부틸포스핀(tributylphosphine)과 같은 트리알킬포스핀 또는 트리알킬포스핀옥사이드, 올레익아민(oleic amine), 트리옥틸아민(trioctylamine), 또는 옥틸아민(octylamine)과 같은 알킬아민(alkyl amine), 또는 알킬티올(alkyl thiol)을 포함하는 중성 계면활성제 및 소디움 알킬 설페이트(sodium alkyl sulfate), 또는 소디움 알킬 포스페이트(sodium alkyl phosphate)을 포함하는 음이온 계면활성제를 사용할 수 있으나, 나노입자의 상태와 크기를 안정화시키는데 효과적인 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 나노입자의 안정화 및 균일한 크기 분포를 고려할 때, 포화 또는 불포화 지방산 및/또는 알킬아민을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른, 방향족 화합물은 소수성 상호작용에 의하여 무기 나노입자와 결합된 것일 수 있다.

상기 방향족 화합물은, 2이상의 고리가 융합된 융합환(fused ring) 화합물인 것일 수 있다. 또한, 상기 방향족 화합물은 C₆ 내지 C₃₀ 범위인 방향족 화합물일 수 있다. 본 발명에 따른 방향족 화합물의 종류로는, 2이상의 고리가 융합된 융합환(fused ring) 화합물이라면 제한 없이 사용 가능하지만, 구체적으로 예를 들면, 안트라센(Anthracene), 페난트렌(Phenanthrene), 테트라센(Tetracene), 크리센(Chrysene), 트리페닐렌(Triphenylene), 파이렌(Pyrene), 펜타센(Pentacene), 벤조피렌(Benzo[a]pyrene), 코란눌렌(Corannulene), 벤조페리렌(Benzo[ghi]perylene), 코로넨(Coronene), 및 오발렌(Ovalene)으로부터 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 전도성 고분자는, π- π 상호작용에 의하여 방향족 화합물과 결합된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 방향족 화합물은 지방족의 리간드로 둘러 쌓인 무기물질(무기 나노입자)에 첨가되면, 소수성 상호작용을 통해 무기 나노입자와 결합될 수 있으며, 이후에 방향족 화합물이 결합된 무기 나노입자를 전도성 고분자에 유인하면, 전도성 고분자와 방향족 화합물 간의 π- π 상호작용이 유발되어 전도성 고분자 간의 친화력을 낮추어, 전도성 고분자와 무기 나노입자 간의 친화력을 높일 수 있다.

상기 전도성 고분자는, 방향족 고리를 포함하는 고분자일 수 있으며, 그 종류로는 방향족 고리를 포함한다면 특별히 제한하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 전도성 고분자는 모노머수준의 벤젠을 포함할 수 있다. 상기 전도성 고분자의 종류를 구체적으로 예룰 들면, 폴리[플루오렌](Poly(fluorene)s), 폴리페닐렌(polyphenylenes), 폴리파이렌(polypyrenes), 폴리아줄렌(polyazulenes), 폴리나프탈렌(polynaphthalenes), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리카바졸(polycarbazoles), 폴리인돌(polyindoles), 폴리아제핀(polyazepines), 폴리아닐린(polyanilines), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리[3,4-에틸렌디옥시티오펜](poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리[p-페닐렌 설파이드](poly(p-phenylene sulfide)), 폴리[p-페닐렌 비닐렌](Poly(p-phenylene vinylene)) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 다기능성 복합체를 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 다기능성 복합체는,

본 발명에 따른 복합체; 및

상기 복합체에 결합된 조직 특이적 결합 성분을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 다기능성 복합체는 친수성 영역에 조직 특이적 결합성분을 도입하여 복합체에 표적지향성을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 조직 특이적 결합 성분의 종류는, 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 다기능성 복합체는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 상피세포암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.

이와 같은 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데, 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라고 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 수용성 나노입자의 활성성분 결합영역에 결합시켜 만든 복합체는 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다.

또한, 본 발명에서 종양 마커는 하기 표1에 나타낸 바와 같이 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다.

종류	종양 마커의 예	활성 성분의 예
리간드	시냅토타그민 I의 C2	포스파티딜세린
	아넥신 V	포스파티딜세린
	인테그린	인테그린 수용체
	VEGF	VEGFR
	안지오포이에틴 1, 2	Tie2 수용체
	소마토스타틴	소마토스타틴 수용체
항원	암성 태아성 항원	허셉틴(Genentech, USA)
	HER2/neu 항원	허셉틴(Genentech, USA)
	전립선 특이 항원	리툭산(Genentech, USA)
수용체	폴산 수용체	폴산

종양 마커가 리간드인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 복합체의 활성성분으로 도입할 수 있는데 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다.

본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

종양 마커가 항원인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 복합체의 활성성분으로 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다.

종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 복합체의 활성성분으로 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다.

상술한 바와 같이, 항체는 본 발명에 있어서 특히 바람직한 활성성분이다. 항체는 특정 대상과만 선택적이고 안정적으로 결합하는 성질을 갖고 있으며, 항체의 Fc 영역에 있는 리신의 -NH2, 시스테인의 -SH, 아스파라긴산 및 글루탐산의 -COOH는 수용성 복합체의 활성성분 결합영역 작용기와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있기 때문이다.

이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다. 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용 시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.

한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 복합체의 활성성분으로 이용할 수 있다.

또한, 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 활성성분 결합영역의 작용기와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌[Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209]에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다[Sarinet al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448].

이하, 본 발명에 따른 복합체의 제조방법을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 복합체의 제조방법은,

무기 나노입자 및 방향족 화합물을 유기 용매와 혼합하여 제1오일상을 제조하는 단계;

상기 에멀젼에서 오일상을 제거하여 복합체를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계를 거침으로써 하나 이상의 무기 나노입자가 양친매성 화합물 코팅에 의해 특정 자극에 의해 감응성을 띄는 복합체가 제조될 수 있다.

특히, 전도성 고분자의 결합영역을 가지는 파이렌 구조를 포함하는 물질과 전도성 고분자가 화학적으로 결합된 복합체가 제조된다. 상기 화학적 결합은 파이-파이 결합(π-π interaction)으로, 이 결합은 화학 원소 간의 이중 결합 형성 시, π 오비탈에 전자가 채워지며, 그 오비탈에 위치한 전자간의 결합을 의미한다.

본 발명에 따른 무기 나노입자는 무기 나노입자 전구체와 유기성 표면안정제를 용매에서 반응시켜 제조되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 무기 나노입자는, 무기 나노입자 전구체와 유기성 표면안정제를 혼합 가열하여 무기 나노입자 전구체를 열분해하여 제조된 것일 수 있다.

먼저, 표면안정제가 포함된 용매에 나노입자 전구체를 투입하여 혼합시킨다. 상기 무기 나노입자 및 유기성 표면안정제의 구체적인 종류는 상술한 바와 같다.

무기 나노입자 전구체는 금속과 -CO, -NO, -C5H5, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속 화합물을 사용할 수 있으며, 예를 들어 아이언 펜타카르보닐(iron pentacarbonyl, Fe(CO)₅), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn₂(CO)₁₀) 등의 금속 카르보닐계열의 화합물 또는 철 아세틸아세토네이트(Fe(acac)₃) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 등의 다양한 유기금속 화합물들을 사용할 수 있다.

또한, 무기 나노입자 전구체는 금속과 Cl^-, 또는 NO₃ ^- 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염을 사용할 수 있으며, 예를 들어 삼클로로화철(FeCl₃), 이클로로화철(FeCl₂), 또는 철 나이트레이트(Fe(NO₃)₃) 등을 사용할 수 있다.

또한, 합금 나노입자와 복합 나노입자 합성에서는 상술한 2종 이상의 금속의 전구체의 혼합물을 사용할 수 있다.

또한, 상기 용매는 나노입자 표면에 유기성 표면안정제가 배위된 착화합물의 열분해 온도에 근접하는 높은 끊는점을 갖는 것이 이라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들어 옥틸 에테르(octyl ether), 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether), 데실 에테르(decyl ether), 또는 벤질 에테르와 같은 에테르계 화합물; 피리딘, 또는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 헤테로고리 화합물; 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌, 또는 벤젠과 같은 방향족 화합물; 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 술폭사이드 화합물; 디메틸포름아마이드(DMF)와 같은 아마이드 화합물; 옥틸알코올, 또는 데칸올과 같은 알코올; 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 또는 헥사데칸과 같은 탄화수소; 또는 물; 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

상기 혼합 반응 조건은 특별히 제한되지 않으며, 무기 나노입자의 전구체 및 표면안정제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 반응은 실온 또는 그 이하의 온도에서도 형성될 수 있으나, 통상적으로는 30 내지 200 ℃의 범위로 가열 및 유지시키는 것이 바람직하다.

상기 혼합 반응 후, 무기 나노입자 전구체를 열분해하여 나노입자를 성장시킨다. 이때, 반응조건에 따라 균일한 크기 및 형상의 금속 나노입자를 형성할 수 있으며, 열분해 온도 역시 무기 나노입자 전구체 및 표면안정제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 구체적으로는 50 내지 500 ℃에서 반응시킬 수 있다.

이렇게 제조된 나노입자는 공지의 수단을 통하여 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 유기 용매로는, 무기 나노입자와 방향족 화합물을 혼합하는데 문제가 없는 것이라면 제한 없이 사용가능하며, 예를 들어, 클로로포름, 노르말 헥산, 메틸렌클로라이드, 톨루엔, 벤젠 등의 비극성 유기 용매 계열 또는 펜탄, 사이클로펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 디옥산, 클로로포름, 디에틸에테르 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 사용될 수 있다.

하나의 예로서, 본 발명에 따른 에멀젼을 형성하는 단계는 유화제의 존재 하에 수행될 수 있다. 이때, 사용 가능한 유화제로는 에멀젼을 형성하는데 효과적인 것이라면 통상적인 범위 내에서 제한 없이 사용 가능하며, 예를 들면, 카로복실메틸화된 폴리비닐알코올, 카르복실메틸폴리비닐알콜, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아마이드, 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리라틱산, 폴리아크릴산, 폴리카프로락톤, 폴리스티렌설포네이트, 폴리 수산화에틸 메타아크릴레이트, 키토산, 폴리솔베이트 80, 폴리비닐술폰산, 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 다기능성 복합체의 제조방법을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 다기능성 복합체는,

본 발명에 따른 복합체 및 조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계를 포함할 수 있다.

이 단계는 복합체의 표면에 가교제를 이용하여 조직특이적 결합성분을 화학적으로 결합시켜 세포 표적 효율을 향상시킬 수 있다.

상기 조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계는,

가교제를 사용하여 상기 복합체의 표면의 일부에 결합영역을 제공하는 단계; 및

상기 결합영역과 조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계에서 이용 가능한 조직특이적 결합성분의 구체적인 종류는 상술한 바와 같다.

또한, 상기 가교제는 특별히 제한되지는 않으나, 1,4-디이소티오시아나토벤젠(1,4-Diisothiocyanatobenzene),1,4-페닐린 디이소시아네이트(1,4-Phenylene diisocyanate), 1,6-디이소시아나토헥산(1,6-Diisocyanatohexane), 4-(4-말레이미도페닐)뷰트릭산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester), 포스겐(Phosgene solution), 4-(말레이미도)페닐 이소시아네이트(4-(Maleinimido)phenyl isocyanate), 1,6-헥산디아민(1,6-Hexanediamine), p-니트로페닐클로로포르메이트(p-Nitrophenyl chloroformate), 노말-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide), 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 1,1′-카르보닐디이미다졸(1,1′-Carbonyldiimidazole), 3-말레이미도벤조익산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(3-Maleimidobenzoic acid Nhydroxysuccinimide ester), 에틸렌디아민(Ethylenediamine), 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(Bis(4-nitrophenyl) carbonate), 숙시닐 클로라이드(Succinyl chloride), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride), N,N′-디숙신 이미딜 카르보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate), N-숙신이미딜3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(NSuccinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate), 또는 숙시닉 언하이드라이드(sucinic anhydride) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

상기 가교제는 양친매성 화합물 및 복합체의 표면의 일부와 반응하여 -COOH, -CHO, -NH₂, -SH, -CONH₂, -PO₃H, -PO₄H, -SO₃H, -SO₄H, -OH, -NR₄ ⁺X^-, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기, 또는 -알킬기와 같은 활성성분의 결합영역을 제공한다.

상기 결합영역과 조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계에서, 결합영역과 조직 특이적 결합성분의 결합은 각 결합성분의 종류 및 이의 화학식에 따라 변화될 수 있으며, 그 대표적인 예를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

본 발명의 복합체의 제조방법 또는 다기능성 복합체의 제조방법은 일반적으로 침전물로 생성되는 복합체를 통상의 방법, 예를 들어, 원심분리 또는 여과를 통해 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 동시 진단 및 치료용 조영제 조성물을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 조영제 조성물은, 본 발명에 따른 복합체 또는 본 발명에 따른 다기능성 복합체를 유효성분으로 포함하는 동시 진단 및 치료용 조영제 조성물일 수 있다.

본 발명의 복합체는 약제학적 활성성분과 화학적으로 결합하거나 화학적인 봉입을 통해 무기 나노입자를 포함하고, 조직특이적 결합성분이 상기 복합체의 표면에 결합되어 있어 표적지향이 가능하여 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 진단이 가능하며, 동시에 치료가 가능한 전달체로 사용할 수 있다.

상기 조영제 조성물은 본 발명에 따른 복합체 외에 영상학적으로 허용 가능한 담체를 함께 사용할 수 있으며, 상기 영상학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.

또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 본 발명에 따른 복합체가 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다.

상기 복합체에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)의 이용이 바람직하다.

자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.

본 발명의 복합체는 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle) 등에 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 복합체를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 본 발명에 따른 복합체는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영 효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 자성 복합체의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자 기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.

또한, 본 발명의 복합체는 거대 자기-저항 바이오센서(Giant magnetic resistance(GMR)sensor)의 진단 물질로 이용할 수 있다. 자성 복합체는 기존의 마이크로 미터(10 m) 크기의 비드[미국 특허 제6,452,763호; 제 6,940,277호; 제6,944,939호; 미국 공개 특허 제2003/0133232호] 보다 더 우수한 자기적 특징, 수용액에서의 콜로이드 안정성, 낮은 비선택성 결합을 나타낼 수 있으므로, 기존 거대자기저항 바이오 센서의 검출한계를 크게 높일 수 있는 가능성을 갖고 있다.

또한, 본 발명의 복합체는 자성 마이크로 유체 센서를 이용한 분리 및 검출, 약물 또는 유전자의 전달, 자성 고온 치료법에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 본 발명에 따른 복합체 또는 다기능성 복합체를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있으며, 이러한 담체의 예로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등을 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콘산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저지환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 상피세포암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 다중 진단 프로브에 대에 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 다중 진단 프로브는, 본 발명에 따른 복합체 또는 다기능성 복합체; 및

진단 프로브를 포함할 수 있다.

상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다.

상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 수용성 자성 복합체에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1 자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한, 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.

상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn 화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO₂, Al₂O₃)를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

제조예1 : 폴리아닐린(PANI)의 합성

1M의 HCl 수용액 300ml에 아닐린 단량체 0.2mol을 첨가하였다. 산화제로, 1M의 HCl 수용액 200ml에 암모늄 퍼설페이트(Kanto Chemical) 용액 0.05mol을 한 방울씩 첨가하여 하룻밤 동안 상온에서 중합반응하였다. 여과를 통해 얻은 중합체 염을 1M의 수산화나트륨(Aldrich) 용액 500ml에 재분산하였다. 그 후, 탈양성화된 폴리아닐린을 여과하고 아세톤 500ml에 다시 재분산하였다. 마지막으로 여과하여 진공 오븐에서 48시간 동안 건조시켜 폴리아닐린 가루를 제조하였다.

제조예 2: MnFe ₂ O ₄ 자성 나노입자( MNPs )의 제조

벤질 에테르 용매 20ml에서 2mmol의 철(Ⅲ) 아세틸아세토네이트(Aldrich), 1mmol의 망가니즈(Ⅱ) 아세틸아세토네이트(Aldrich), 10mmol의 1,2-헥사데칸디올(Aldrich), 6mmol의 도데칸산(Aldrich), 및 6mmol의 도데실아민(Aldrich)을 200℃에서 2시간, 300℃에서 1시간 동안 열 분해 화학반응(thermal decomposition)하여 제조하였다.

모든 반응은 질소 대기 상태에서 진행하였으며, 혼합물을 상온에서 식히고 결과물을 순수 에탄올 용액 20ml에 두 번 원심 분리하여 정제하였다.

그런 다음, 시드 매개 성장법(Seed-mediated growth method)을 통해 MnFe₂O₄ 자성 나노입자를 12nm로 키웠다.

제조예 3: 카르복시메틸폴리비닐알코올( carboxymethylated polyvinyl alcohol, CMPVA )의 제조

3g의 폴리비닐알코올(PVA; Aldrich)을 30ml 증류수에 용해시킨 후, 수산화나트륨(NaOH; Aldrich) 용액 5g/10ml를 폴리비닐알코올 용액에 천천히 가하고 브로모아세트산(Aldrich) 수용액 10g/5ml를 주사기로 한 방울씩 떨어뜨렸다. 상온에서 하루 동안 자석 혼합 시킨 후, 이를 중화시키기 위해 1M HCl 용액을 첨가하고 과량의 에탄올로 침전시킨 후 동결 건조하여 카르복시메틸폴리비닐알코올(CMPVA)을 제조하였다.

실시예 1: 복합체( MPANs )의 제조

본 발명에 따른 복합체를 제조하기 위해, 제조예 2에 의한 자성 나노입자 1mg과 다양한 양의 파이렌(pyrene) 분자(1.58nmole 내지 24.7μmole)를 오일상인 4ml의 클로로포름(chloroform; 덕산과학, 한국)에 용해시키고 4시간 동안 반응시켜 합성물을 안정화시켰다. 그 후, 제조예 1에서 제조한 폴리아닐린 가루 10mg을 6ml의 클로로포름에 용해시킨 용액을 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 이 합성물을 제조예 3에서 제조한 CMPVA 200mg을 포함한 20ml의 수용액에 넣고 혼합물을 제조하여 포화상태가 되었을 때, 상기 혼합물을 ultrasonicator(새한 SH-2100, 한국) 190W로 15분간 에멀젼화하였다. 그런 다음, 상온에서 하루 동안 두어 유기용매를 증발시키고, MPANs는 Centrifugal filter(Centriprep YM-3, 50kDa molecular weight cut-off(MWCO))와 Amicon(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)에 5000rpm에 20분 동안 3번 돌려 정제하여, 본 발명에 따른 복합체(Magnetic Polyaniline Nanohybrids, 이하 MPANs라 함)를 제조하였다.

도 1은 제조된 MPANs의 투과전자현미경(TEM, JEM-1011, JEOL, Japan) 사진이다. 도 2는 파이렌이 부착된 MPANs의 입자 크기 분포(A)와 파이렌이 부착되기 전의 입도 분포(B)를 비교하여 나타낸 것이며, 이때, 입도 분포는 광산란 (ELS-Z, Otsuka electronics)을 사용하여 측정하였다. 도 1 및 2를 참조하면, MPANs의 입자 크기가 약 200nm 정도인 것을 알 수 있으며, 파이렌이 부착된 MPANs의 입도 분포가 월등히 높음을 확인할 수 있다.

도 3은 가교제로 다양한 양(0.001μmol, 0.01 μmol, 0.1 μmol, 1 μmol)의 파이렌을 부착시킨 MPANs의 hydrodynamic diameter를 레이저 산란(ELS-Z, Otsuka Electronics, Japan)을 통해 측정한 결과 그래프이다. 그 결과, 파이렌의 양이 0.01 μmole일 때, 약 200nm 정도로 가작 작은 입자 크기를 가짐을 알 수 있었다.

실시예 2: 치료항체( Cetuximab )를 부착한 MPANs 의 합성

본 발명에 따른 다기능성 복합체를 제조하기 위해, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC; Tokyo Chemical Industry, TCI) 16mg, 술포-N-하이드로옥시숙신이미드(Sulfo-N-hydroxysuccinimide, sulfo-NHS; Pierce(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 18mg 및 치료항체(Cetuximab, CET; Roche pharmaceutical, Ltd) 1mg을 4℃에서 MPANs와 반응시켜 Cetuximab을 MPANs의 표면에 접합(CET-MPANs)시켰다. 그리고, 과량의 증류수로 4℃에서 48시간 동안 희석시켜 정제하였다.

물에 녹는 폴리아닐린 나노입자를 제조하기 위해, 10mg의 폴리아닐린을 6ml의 클로로포름에 용해하여 실시예 1과 같은 과정으로 합성하여, 치료항체(Cetuximab)를 부착한 MPANs (이하 CET-MPANs라 함)를 제조하였다.

실험예 1: MPANs 및 폴리아닐린 나노입자( PANPs )의 콜로이드 안정성 확인

실시예 1에 따른 MPANs와 무처리 폴리아닐린 나노입자(이하, PANPs)의 콜로이드 안정성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. MPANs와 PANPs의 콜로이드 안정성은 염(Sodium Chloride)과 세럼(FBS) 하에서의 저항 능력을 관찰함으로써 측정하였다

먼저, 0.1ml의 MPANs 용액 1mg/ml를 다양한 농도(0%, 5%, 10%, 15% 및 20%)의 세럼(fetal bovine serum, FBS; Gibco(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)) 2ml에 각각 넣고 상온에서 하루 동안(약 24시간) 반응시킨 후, 세럼의 농도에 따른 MPANs 용액의 안정성을 레이저 스케터링(laser scattering)을 통해 측정하였다. PANPs의 안정성 측정도 MPANs와 동일한 방법으로 진행하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, FBS의 농도가 높아질수록 MPANs의 평균 입자 크기는 점점 작아짐을 관찰하였다.

도 5는 10% 농도의 FBS에서 하루 동안(약 24시간) 반응시킨 후 MPANs와 PANPs(아무 처리도 하지 않은 폴리아닐린 나노입자)의 직경(hydrodynamic diameter)을 나타내며, MPANs의 평균 입자 크기가 약 200nm정도로 PANPs보다 약 7배 작음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 MPANs는 FBS의 농도가 높을수록 콜로이드 안정성이 높아지며, 무처리의 폴리아닐린 나노입자(PANPs) 보다 월등히 높은 콜로이드 안정성을 나타냄을 확인하였다.

다음으로, 0.1ml의 MPANs 용액 1mg/ml를 다양한 농도(0.01M, 0.025M, 0.05M 0.1M 0.25M, 0.5M, 1M)의 염(sodium chloride) 2ml에 각각 넣고 상온에서 하루 동안(약 24시간) 반응시킨 후, 염의 농도에 따른 MPANs 용액의 안정성을 레이저 스케터링(laser scattering)을 통해 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같으며, 염 농도가 0.5M 일 때 평균 입자크기가 200 nm 이하로 가장 작게 나타나는 것을 알 수 있었다.

실험예 2: MPANs 의 광열학적 민감도 평가

실시예 1에서 제조된 MPANs의 광열학적 민감도를 평가하기 위해, 흡광도 및 용액의 온도 증가를 알아보기 위한 실험을 수행하였다.

MPANs의 흡수 스펙트럼은 흡광 스펙트로미터 (Mecasys UV-2120, 한국)로 관찰하였으며, NIR 레이져 조사에 대한 MPANs용액과 증류수의 광열학적 민감도를 평가하기 위해, 0.5 mg/ml MPANs 용액을 NIR 간섭성 다이오드 레이져 빛(808 nm, 5 W/cm2)에 4분 동안 노출시켰고, 두 용액의 온도 증가는 thermo couple(187 True RMS Multimeter, Fluke)을 이용하여 다극 탐지기로 관찰하였다.

흡수 스펙트럼 관찰 결과는 도 7에 나타내었으며, MPANs용액과 증류수의 온도 상승 결과는 도 8에 나타내었다.

도 7에서 A는 MPANs가 도핑된 용액의 흡수 스펙트럼을 나타내며, B는 MPANs가 도핑되지 않은 용액의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 그래프 왼쪽의 사진에서 1 은 B의 용액 사진이며, 2는 A의 용액 사진이다. 도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 MPANs가 도핑된 용액의 최대 발광 파장은 800 nm 정도인 것을 확인할 수 있다.

도 8에서 A는 MPANs 용액의 시간에 따른 온도 상승 결과를 나타내며, B는 증류수의 온도 상승 결과를 나타낸다. A의 온도가 시간이 지날수록 가파르게 상승하는 것으로 보아 본 발명의 MPANs 는 열에 의해 민감하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: MPANs 의 암 진단 및 치료 효과 확인

실시예 2에 따른 CET-MPANs의 암 진단 및 치료 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

먼저, CET-MPANs의 암 진단 효과를 확인하기 위해, 표적 세포주 A-431(EGFR 과발현 암세포) 및 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)에 대한 표적 능력을 자기공명영상 사진(MR 이미징)을 통해 확인하였다. 여기서 사용된 A-431과 MCF-7 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 얻었다.

결과는 도 9에 나타내었으며, I는 A-431(EGFR 과발현 암세포)이고, II는 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)이며, A는 1mg 농도의 CET-MPANs이고, B는 0.2mg 농도의 CET-MPANs이다. 도 9에서 보는 바와 같이, 1mg과 0.2mg의 CET-MPANs 농도로 처리된 A-431 세포의 T2-weighted MR 이미지는 농도가 증가함에 따라 어두워지는 것을 관찰할 수 있다. 반면에, MCF-7 세포에서는 CET-MPANs 농도에 상관없이 밝은 이미지를 나타내고 있고, 아무 처리도 하지 않은 대조군(Ctrl) 세포에서도 마찬가지였다.

T2-weighted MR 이미지에서 CET-MPANs가 표적인 암세포에 잘 전달된 경우에는 다른 조직에 비해 어두운 이미지를 얻게 된다. 이에 비추어 볼 때, A-431 세포에 MPANs의 표면에 있는 치료항체에 의한 CET-MPANs의 표적 능력의 결과로 확인할 수 있다.

도 10은 상기 암세포들의 이완도를 나타내는 그래프이며, I는 A-431(EGFR 과발현 암세포)이고, II는 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)이고, A는 1mg 농도의 CET-MPANs이고, B는 0.2mg 농도의 CET-MPANs이다. 도 10을 참조하면, CET-MPANs가 표적인 암세포에 잘 전달된 경우에는, 높은 R₂값을 나타냄을 관찰하였다.

따라서, 본 발명에 따른 MPANs가 암 진단을 위한 표적지향성이 있음을 확인하였다.

두 번째로, CET-MPANs의 암 치료 효과를 확인하기 위해, 암에 대한 광열 치료에 적용되는 것이 시험되었다. 치료제로서의 가능성은 CET-MPANs가 처리된 A-431 세포와 MCF-7 세포에 NIR 레이저를 10분 동안 조사(808nm, 20 W/cm²)함으로써 분석되었으며, 세포의 생존 능력은 칼세인-AM 염색으로 확인하였다.

결과는 도 11에 형광 현미경 사진으로 나타내었으며, I는 A-431(EGFR 과발현 암세포)이고, II는 MCF-7(EGFR 저발현 암세포)이며, A는 CET-MPANs가 처리된 암세포에 NIR 레이저를 10분 동안 조사한 결과이고, B는 레이저 조사 없이 CET-MPANs만 처리한 결과이며, C는 CET-MPANs 없이 NIR 레이저만 10분 동안 조사한 결과이다. 도 11의 IA에서 점선으로 표현된 원 안의 어두운 구멍은 CET-MPANs에 의해 암세포가 사멸된 결과이다. 그러나, A-431의 레이저를 조사한 바깥 부분과 MCF-7에서는 세포의 생존을 나타내는 형광 빛이 검출되었다.

따라서, 본 발명에 따른 다기능성 복합체인 CET-MPANs는 암 치료 또는 광열 치료에 효과적으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.

Claims

무기 나노입자;
상기 무기 나노입자와 결합된 방향족 화합물; 및
상기 방향족 화합물과 결합된 전도성 고분자를 포함하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
무기 나노입자는 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 2 항에 있어서,
상기 금속은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고,
상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄, 및 M_xO_y (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y ≤5)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이며,
상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 무기 나노입자는 유기성 표면안정제와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 방향족 화합물은 소수성 상호작용에 의하여 무기 나노입자와 결합된 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
방향족 화합물은 2이상의 고리가 융합된 융합환(fused ring) 화합물인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 6 항에 있어서,
융합환 화합물은 안트라센(Anthracene), 페난트렌(Phenanthrene), 테트라센(Tetracene), 크리센(Chrysene), 트리페닐렌(Triphenylene), 파이렌(Pyrene), 펜타센(Pentacene), 벤조피렌(Benzo[a]pyrene), 코란눌렌(Corannulene), 벤조페리렌(Benzo[ghi]perylene), 코로넨(Coronene), 및 오발렌(Ovalene)으로부터 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 전도성 고분자는 π- π 상호작용에 의하여 방향족 화합물과 결합된 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서,
전도성 고분자는 방향족 고리를 포함하는 고분자인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 9 항에 있어서,
방향족 고리를 포함하는 전도성 고분자는 폴리[플루오렌](Poly(fluorene)s), 폴리페닐렌(polyphenylenes), 폴리파이렌(polypyrenes), 폴리아줄렌(polyazulenes), 폴리나프탈렌(polynaphthalenes), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리카바졸(polycarbazoles), 폴리인돌(polyindoles), 폴리아제핀(polyazepines), 폴리아닐린(polyanilines), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리[3,4-에틸렌디옥시티오펜](poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리[p-페닐렌 설파이드](poly(p-phenylene sulfide)), 폴리[p-페닐렌 비닐렌](Poly(p-phenylene vinylene)) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항의 복합체; 및
상기 복합체에 결합된 조직 특이적 결합 성분을 포함하는 다기능성 복합체.
제 11 항에 있어서,
조직 특이적 결합 성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다기능성 복합체.
무기 나노입자 및 방향족 화합물을 유기 용매와 혼합하여 제1오일상을 제조하는 단계;
전도성 고분자를 유기 용매에 용해시켜 제2오일상을 제조하는 단계;
상기 제 1 및 제 2 오일상을 수상과 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및
상기 에멀젼에서 오일상을 제거하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 제 1 항의 복합체의 제조방법.
제 13 항에 있어서,
무기 나노입자는 용매의 존재 하에서 무기 나노입자 전구체와 유기성 표면안정제를 혼합 가열하여 무기 나노입자 전구체를 열분해하여 제조된 것을 특징으로 하는 복합체의 제조방법.
제 13 항에 있어서,
에멀젼을 형성하는 단계는 유화제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 복합체의 제조방법.
제 1 항의 복합체 및 조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계를 포함하는 제 11 항의 다기능성 복합체의 제조방법.
제 16 항에 있어서,
조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계는
가교제를 사용하여 상기 복합체의 표면의 일부에 결합영역을 제공하는 단계; 및
상기 결합영역과 조직 특이적 결합성분을 결합하는 단계를 포함하는 다기능성 복합체의 제조방법.
제 1항에 따른 복합체 또는 제 11 항에 따른 다기능성 복합체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 진단 및 치료용 조영제 조성물.
제 1항에 따른 복합체 또는 제 11 항에 따른 다기능성 복합체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항에 따른 복합체 또는 제 11 항에 따른 다기능성 복합체; 및
진단 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 프로브.