KR20160148770A - 충돌법에 의한 세균 및 바이러스 동시 채취 및 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법에 관한 것으로, 그 목적은 공기중의 세균과 바이러스를 한번에 시속하고 간단하게 채취할 수 있는 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하나의 시험챔버에 의해 세균과 바이러스를 채취 및 정량하는 방법에 있어서; 숙주세균이 도말된 TSA배지를 시험챔버내의 에어샘플러에 장착하고, 상기 TSA배지에 도말된 숙주세균을 숙주로 하는 바이러스와, 타 세균을 시험챔버내에 동시 분사하는 분사단계; 분사된 세균과 바이러스를 에어샘플러에 의해 채취하여 시료를 생성하는 미생물 채취단계; 상기 에어샘플러에 의해 생성된 시료를 배양하여 군락을 형성시키는 배양단계; 배양단계 후, 시료에서 바이러스의 감염에 의해 세균증식이 억제되어 형성된 플라크(plaque)의 수를 계수하고, 시료에서 채취된 세균의 증식에 의해 형성된 분사세균의 colony의 수를 계수하는 계수단계;를 포함하되, 상기 세균 및 바이러스가 채취된 TSA 배지는, 에어샘플러에 의해 TSA 배지에 세균 및 바이러스가 채취되도록 되어 있다.

Description

충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법{Method for simultaneous sampling and quantification of bacteria and host-based virus}

본 발명은 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법에 관한 것으로, 공기 중의 세균 및 바이러스를 하나의 배지에 의해 동시에 채취하여 신속하고 간단하게 정량할 수 있는 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법에 관한 것이다.

근래에 들어 대기오염이 심각해지면서 실내 공기에는 각종 바이러스, 대장균 또는 곰팡이 등과 같은 병원균을 포함하여 냄새원인이 되는 각종 유기물 함량이 높아지고 있다.

일반적으로 바이러스는 기생하는 숙주에 따라 식물성바이러스, 동물성바이러스 및 세균바이러스(박테리오파아지)로 구분되며, 대기 중에서 이동하는 바이러스는 0.02∼0.2㎛로 크기가 매우 작아 연구하기가 어려우며, 사람과 동물에게 다양한 형태로 피해를 주는 질병의 원인이 될 뿐 아니라, 경우에 따라서는 경제적으로도 많은 피해를 줄 수 있다.

기존에는 상기와 같은 바이러스 정량을 위하여, 셀 모노레이어에 바이러스를 감염시켜 바이러스 용액을 만들고, 상기 바이러스 용액을 멸균처리된 고체배지 위에 가한 다음, 숙주(host) 액체배지에 혼합하여 흔들어 생성된 플라크 수를 카운트하는 방법에 의해 이루어지고 있어, 바이러스 정량작업이 다수번의 작업을 통해 이루어지므로 바이러스 정량에 많은 시간 및 작업이 복잡해지게 되는 문제점이 있었다.

또한, 현재 사용되는 미생물 시료채취방법에는 충돌법, 세정법 및 필터법 등이 있으며, 상기 충돌법의 경우 앤더슨 시료 채취기 (Anderson Sieve Sampler)는 패트리접시에 3% 젤라틴이 포함된 트립토즈 포스페이트 배양액을 넣어서 공기함유 입자 내에 존재하는 바이러스를 포집하는 방법이지만, 포집되는 바이러스의 수가 제한되고 일정하지 않아 정량분석 방법으로 사용할 수 없는 문제점이 있었다.

또한, 세정법의 경우 임핀저 내에 폴리에틸렌클리콜과 같은 바이러스 농축물질을 넣고 대기를 일정한 유속으로 펌핑하여 대기 중의 에어로졸 바이러스를 포집하는 방법이 있으나, 이와 같은 방법은 바이러스 농축물질에 포집된 바이러스를 멸균된 튜브에 넣고 여과지로 여과한 후 포르말린을 넣어 바이러스를 고정하여 포집하므로, 포집까지 다수번의 작업이 수행되는 문제점이 있었다.

또한, 필터법의 경우 젤라틴 필터를 배지 상부에서 바로 녹이고 배양 후 형성된 콜로니(colony)를 세어 세균을 정량하며, 바이러스는 생리식염수 혹은 0.1 % 펩톤용액에 젤라틴 필터를 녹이고 교반자석을 이용하여 충분해 용해시킨 후 멤브레인 필터로 거른 용액을 숙주와 함께 배지 상부에 도말하여 배양 후 형성된 플라크(plaque) 수를 세어 바이러스를 정량하는 다수번의 작업이 수행되는 문제점이 있었다.

또한, 종래에는 하나의 챔버내에서 바이러스와 세균을 채취 및 정량하고자 할 경우, 먼저 하나의 세균(또는 바이러스)를 챔버내에 분사하여 분사된 세균(또는 바이러스)를 채취 및 정량한 후, 챔버를 클리닝(살균)하고, 다시 또다른 바이러스(또는 세균)을 챔버내에 분사하여 이를 채취 및 정량하는 방법을 사용하고 있어, 하나의 챔버내에서 바이러스와 세균을 채취 및 정량하기 위해서는 동일한 작업을 최소 2번 반복실험하여야 하므로, 많은 채취시간이 소요되고, 챔버의 클리닝작업이 별도로 이루어져야 하므로, 전체 작업시간이 많이 소요되는 문제점이 있었다.

또한, 미생물 종류에 따른 위험정도와 노출한계를 파악하기 위해 실내환경에서 에어샘플러를 통한 세균과 바이러스의 채취 및 정량이 필요하나, 바이러스와 세균을 동시에 채취하고 정량하는 방법은 지금까지 찾아볼 수 없었다.

공개특허공보 공개번호 특2003-0085829(2003.110.07) 공개특허공보 공개번호 10-2010-00584442(2010.05.25)

본 발명의 목적은 공기중의 세균과 바이러스를 한번에 시속하고 간단하게 채취할 수 있는 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하나의 시험챔버에 의해 세균과 바이러스를 채취 및 정량하는 방법에 있어서; 숙주세균이 도말된 TSA배지를 시험챔버내의 에어샘플러에 장착하고, 상기 TSA배지에 도말된 숙주세균을 숙주로 하는 바이러스와, 타 세균을 시험챔버내에 동시 분사하는 분사단계; 분사된 세균과 바이러스를 에어샘플러에 의해 채취하여 시료를 생성하는 미생물 채취단계; 상기 에어샘플러에 의해 생성된 시료를 배양하여 군락을 형성시키는 배양단계; 배양단계 후, 시료에서 바이러스의 감염에 의해 세균증식이 억제되어 형성된 플라크(plaque)의 수를 계수하고, 시료에서 채취된 세균의 증식에 의해 형성된 분사세균의 colony의 수를 계수하는 계수단계;를 포함하되, 상기 세균 및 바이러스가 채취된 TSA 배지는, 에어샘플러에 의해 TSA 배지에 세균 및 바이러스가 채취되도록 되어 있다.

본 발명은 숙주(host)가 도말된 배지를 이용하여 충돌법에 의해 세균과 바이러스를 동시에 채취하도록 되어 있어, 한 개의 시험시료로 숙주의 군집에 접촉된 바이러스가 형성하는 플라크의 수와 배지에 접촉된 세균이 형성한 콜로니 수를 계수하는 효율적인 정량방법을 제시한다.

본 발명은 공기 중에 혼재하는 세균 및 바이러스를 간단한 방법으로 동시에 채취할 수 있어 대기 중의 병원성 미생물 상황을 신속하게 파악하고 이동을 예측하여 이에 대한 대처 방안을 강구할 수 있도록 한다.

본 발명은 충돌법에 의해 세균과 바이러스가 채취되므로, 종래의 세정법 및 필터법을 이용한 미생물 채취에 비하여 채취정량과정이 간단하다.

본 발명은 실제거주 또는 생활공간에 준하는 시험챔버 내에서 진행되므로, 실제 생활환경에 대한 정확한 미생물 검출(채취)이 가능하다.

본 발명은 실제거주 또는 생활공간에 준하는 시험챔버 내에서 미생물 채취가 진행되므로, 공기정화기의 성능평가 시험에 적용할 수 있다.

도 1 은 본 발명에 따른 세균과 바이러스 채취과정을 보인 블록예시도
도 2 는 본 발명에 따른 에어샘플러의 개념을 보인 예시도
도 3 은 본 발명의 실시예에 따른 결과를 보인 사진예시도
도 4 는 도 3 의 "A" 확대 사진예시도

도 1 은 본 발명에 따른 바이러스와 세균의 채취과정을 보인 블록예시도를, 도 2 는 본 발명에 따른 에어샘플러의 개념을 보인 예시도를 도시한 것으로,

본 발명은 세균이 도말된 TSA배지를 시험챔버내의 에어샘플러에 장착하고, 상기 TSA배지에 도말된 세균을 숙주로 하는 바이러스와, 타 세균을 시험챔버내에 동시 분사하하는 분사단계;

분사된 세균과 바이러스를 에어샘플러에 의해 채취하여 시료를 생성하는 미생물 채취단계;

상기 에어샘플러에 의해 생성된 시료를 배양하여 군락을 형성시키는 배양단계;

배양단계 후, 시료에서 바이러스의 감염에 의해 세균증식이 억제되어 형성된 플라크(plaque)의 수를 계수하고, 시료에서 채취된 세균의 증식에 의해 형성된 분사세균의 colony의 수를 계수하는 계수단계;를 포함하되,

상기 세균 및 바이러스가 채취된 TSA 배지는, 에어샘플러에 의해 TSA 배지에 세균 및 바이러스가 채취되도록 되어 있다.

상기 분사단계는, 하나의 시험챔버내에 채취하고자하는 바이러스와 세균을 동시에 분사하는 단계로, 시험챔버내의 에어샘플러에 숙주세균이 도말된 TSA 배지를 장착하고, 네블라이저에 의해 시험챔버내에 바이러스와 세균을 분사한다.

상기 시험챔버는 실제거주 또는 생활공간에 준하는 30 ㎥ 내지 120 ㎥ 의 밀폐공간을 구비하고, 미생물 분사 전 UV 램프에 의한 살균 및 HEPA 필터 등을 구비한 공기정화장치에 의해 시험챔버내 공기를 청정화하며, 실링팬을 가동하여 시험챔버내 공기를 교반하면서 미생물을 분사한다.

이때, 분사되는 바이러스는 mL 당 바이러스 (PFU, plaque forming unit) 수를, 세균의 경우 mL 당 세균 수 (CFU, colony forming unit)를 미리 정량해서 분사하게 되는데, 이때의 액체배지는 증류수나 PBS 용액이 된다. 또한, 챔버의 용적이 다를 경우, 분사하는 양도 다르게 설정되나, 에어샘플러로 바이로사/세균을 채취하여 배양한 플라크/콜로니의 수가 배지당 300 CFU(PFU)를 넘지 않도록 분사한다. 이는 시험자가 채취 농도를 미리 정하고 채취량에 맞게 계산된 농도를 분사함이 바람직함을 의미한다.

상기 분사단계에 사용되는 숙주세균이 도말된 TSA 배지의 제조는 특별히 한정되는 것은 아니나, 상기 숙주세균이 도말된 TSA 배지는 숙주세균을 미리 액체배지에 배양한 후 약 1 mL 를 취해 0.7 % agar 5 mL 와 혼합하여 25 mL TSA 상부에 도포하는 방식으로 제조할 수 있다. 이와 같은 숙주세균의 도말은 에어커튼 기능으로 외부오염의 가능성을 차단한 클린벤치 내에서 이루어진다.

이때, 상기 숙주세균이 도말된 TSA 배지의 양은 20 mL 이상, 충돌법으로 채취할 경우, 바람직하게는 25 mL를 구비하도록 한다. 상기 배지의 양이 20 mL 미만일 경우, 미생물의 크기에 따라 관성력에 차이를 보이므로, 포집효율이 상대적으로 낮아질 수 있기 때문에 바이러스와 같이 크기가 작은 경우에는 채취효율을 높이기 위하여 배지의 량을 늘려야 한다. 따라서 상기 배지의 양은 25 mL 를 구비하는 것이 가장 바람직하다.

상기 바이러스 및 숙주세균은, 세균바이러스와 상기 세균바이러스의 숙주에 해당되는 세균을 의미하는 것으로, 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니다. 일예로 상기 세균은 황색포도상구균, 대장균 등등을 사용할 수 있으며, 상기 세균을 숙주로 하는 바이러스는 SA11, T3, PHI-X174 등등을 사용 할 수 있다.

상기 바이러스와 함께 분사되는 세균은, 세균바이러스의 숙주에 해당하지 않는 다른 세균을 의미하며, 그 종류가 특별히 한정되는 것은 아니다. 일예로 상기 세균은 Staphylococcus epidermidis , Serratia Marcescens 등등을 사용 할 수 있다.

상기 PHI-X174 는 대장균 (Escherichia coli)을 숙주 (host)로 하여 증식하는 0.027 ㎛ 크기의 세균바이러스로, 핵산 주변을 둘러싸는 피막 단백질(캡시드)로 구성되어 있는 DNA 파지이다. 상기 대장균은 간균에 속하는 장내 세균의 하나로, 대체로 비병원성 균이며, 인체 및 각종 동물의 장 안에 서식하고 배설물에 의해 자연계에도 널리 분포하고 있다. 그람 염색에 음성을 나타내며 크기는 2∼4㎛이다.

상기 Serratia Marcescens 는 막대 모양의 그람음성 장내세균으로, 일반적으로 성인의 호흡기, 요로 및 어린이의 위장에 병원성이 있고, 환경에 풍부하게 존재하며, 습기가 많은 욕실에서 증식하고, 분홍 혹은 주황빛의 얇은 막을 형성한다. BL1 (Biosafety level) 등급으로 분류된 직경 0.4㎛의 세균이다.

이때, 상기 네블라이저의 분사입자크기 및 성능은 아래 [표1]에 나타내었으며, PHI-X174, Escherichia coli, Serratia Marcescens 는 [표2]에 따른다.

[표1]

[표2]

상기 미생물 채취단계는 세균이 도말된 TSA 배지에 상기 세균을 숙주로 하는 바이러스와 함께 분사된 타 세균을 동시에 채취하는 단계로, 분사단계에 의한 미생물(바이러스 및 세균)의 분사 후, 실링팬을 정지하고 실내공기 및 분사미생물의 균질화가 이루어지도록 10∼30 분 경과 후 에어샘플러에 의한 충돌법 즉, 시험챔버내로 분사된 바이러스와 세균을 숙주세균이 도말된 TSA 배지에 충돌시켜 시료를 생성한다.

상기 분사단계 및 바이러스 채취단계에서, 시험 챔버내의 온습도 조건은 온도 23±3 ℃ 및 상대습도 50±5 % 으로 수행한다.(단, 상대습도는 박테리오페이지가 불활성화 되지 않을 습도를 권장한다.)

상기 배양단계는 바이러스와 세균의 채취단계에 의해 채취된 시험시료를 배양시키는 단계로, 35℃ 호기성 조건의 인큐베이터에서 배양하되, 상기 배양 이후, 배양된 시료 내 바이러스와 세균의 플라크 및 콜로니 수가 배지당 50∼200 PFU(CFU) 의 범위에 들도록 수행하여, 패트리접시에 바이러스에 의한 플라크와 세균에 의한 콜로니가 동시에 생성되도록 배양한다.

상기 계수단계는 배양에 의해 패트리접시에 존재하는 플라크와 콜로니 중, 바이러스에 의해 숙주세균의 증식이 억제되어 생성된 플라크와, 임팩터의 홀(hole)에 들어가 TSA 배지 상에 채취되어 증식한 세균의 콜로니 수를 구분하여 계수한다.

즉, 세균이 도말된 TSA배지에 상기 세균을 숙주로 하는 바이러스가 채취될 경우, 바이러스의 증식여부에 따라 숙주인 세균의 증식이 저해되어, 세균의 군락에 구멍이 생성되므로, 이와 같이 형성된 플라크(plaque)의 수를 계수한다.

또한, 바이러스와 동시에 분사된 세균(바이러스의 숙주에 해당되지 않은 세균)은 배양에 의해 증식되어 형성된 콜로니 수를 계수한다.

이와 같이 이루어진 본 발명의 세균 및 바이러스 동시채취방법은, 숙주세균이 도말된 TSA에, 충돌법에 의해 상기 세균을 숙주로 하는 바이러스와 타 세균이 함께 채취되므로, 기존에 별도로 수행된 두 미생물의 채취 및 정량을 간단하고 신속하게 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

실시예 1

- 시험숙주세균 : 대장균 (Escherichia coli)

- 숙주세균이 도말된 TSA 배지 : 25 mL

- 시험바이러스 : PHI-X174

- 시험세균 : Sarratia Marcescens

에어샘플러 : MAS-100NT (Merck 사 제품, Norminal flow 100 L/min, Sampling vol. : 50 L, Diameter of head : 10 cm)

시험챔버 : 용적 60 ㎥, 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±5 %

조건 : 채취용 배지의 제조를 위해 전원을 10분 이상 가동하여 외부오염을 충분히 차단한 조건의 클린벤치 내에서 미리 준비한 대장균 배양액 1 mL를 취해 0.7 % agar 5 mL와 혼합하여 25 mL TSA 배지 상부에 도말한 후, 충분히 굳을 때까지 건조시켜 준비했다. 준비한 배지를 시험챔버내 에어샘플러에 장착한 후 퇴실하였다. 세균 및 바이러스 분사 전 UV 램프를 가동하여 살균하고 공기정화장치 (HEPA 필터유닛에 의한 필터링, 공기조화설비에 의한 온습도 조절)를 사용하여 청정화를 수행하였다. 이후 실링팬을 약 10분간 가동하면서 네블라이저에 의해 PHI-X174 와 Sarratia Marcescens 를 분사하고, 균질화한 다음에, 실링팬을 오프시킨 다음, 30분간 정체시킨 후 에어샘플러에 의해 채취하였다.

상기와 같이 채취된 시험시료를 35℃에서, 24시간 동안 인큐베이터에서 호기성 조건으로 배양하였으며, PHI-X174 의 증식 여부에 따라 대장균의 증식이 저해되어 플라크가 형성되는지, Sarratia Marcescens의 증식에 의한 분홍빛의 콜로니가 형성되는지 여부를 관찰하였다.

도 3 은 본 발명 실시예 1 에 대한 결과를 보인 사진 예시도를, 도 4 는 도 3 의 "A" 확대사진 예시도를 도시한 것으로, 박테리오페이지가 숙주에 감염되어 숙주의 증식이 억제됨에 따라 도말된 노란빛의 대장균 층에 플라크가 생기는 것을 관찰할 수 있다. 또한, 충돌법에 의해 배지 상부에 채취된 세균이 증식하여 hole 모양에 따라 원형으로 분홍빛의 콜로니가 생기는 것을 관찰할 수 있다.

본 발명은 상술한 특정의 바람직한 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위내에 있게 된다.

Claims (3)

1. 하나의 시험챔버에 의해 세균과 바이러스를 채취 및 정량하는 방법에 있어서;
   숙주세균이 도말된 TSA배지를 시험챔버내의 에어샘플러에 장착하고, 상기 TSA배지에 도말된 숙주세균을 숙주로 하는 바이러스와, 타 세균을 시험챔버내에 동시 분사하는 분사단계;
   분사된 세균과 바이러스를 에어샘플러에 의해 채취하여 시료를 생성하는 미생물 채취단계;
   상기 에어샘플러에 의해 생성된 시료를 배양하여 군락을 형성시키는 배양단계;
   배양단계 후, 시료에서 바이러스의 감염에 의해 세균증식이 억제되어 형성된 플라크(plaque)의 수를 계수하고, 시료에서 채취된 세균의 증식에 의해 형성된 분사세균의 colony의 수를 계수하는 계수단계;를 포함하되,
   상기 세균 및 바이러스가 채취된 TSA 배지는, 에어샘플러에 의해 TSA 배지에 세균 및 바이러스가 채취되도록 한 것을 특징으로 하는 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법.
   
2. 청구항 1 에 있어서;
   상기 숙주세균이 도말된 TSA 배지는 숙주세균을 액체배지에 배양한 후 1 mL 를 취해 0.7 % agar 5 mL 와 혼합하여 25 mL TSA 상부에 도포하여 제조된 것을 특징으로 하는 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법.
   
3. 청구항 1 또는 청구항 2 에 있어서;
   상기 숙주세균은 황색포도상구균 또는, 대장균이고,
   상기 숙주세균을 숙주로 하는 바이러스는 SA11 또는, T3 또는, PHI-X174 이며,
   바이러스와 함께 분사되는 세균은, Staphylococcus epidermidis 또는, Serratia Marcescens 인 것을 특징으로 하는 충돌법에 의한 세균 및 바이러스의 동시채취 및 정량방법.

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