KR20160142023A

KR20160142023A - 부종병 독소를 생산하는 대장균, 이를 이용한 부종병 독소의 생산방법 및 이를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물

Info

Publication number: KR20160142023A
Application number: KR1020150077810A
Authority: KR
Inventors: 변재원; 김종완; 김하영; 채명주; 이완규; 최환원; 홍성근; 윤인중
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장); 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2016-12-12
Also published as: KR101715625B1

Abstract

본 발명은 부종병에 이환된 돼지에서 시가독소(shigatoxin 2e variant)를 분비하는 시가독소 산생 대장균(Shigatoxin producing E. coli)을 돼지에서 분리한 후 백신주로 이용하고, 상기 백신주가 분비하는 부종병 독소(STX2e)를 대량으로 생산하는 방법 및 상기 백신주를 불활화하여 무독화된 톡소이드를 함유하는 돼지 부종병 예방용 백신에 관한 것이다.

Description

부종병 독소를 생산하는 대장균, 이를 이용한 부종병 독소의 생산방법 및 이를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물{Esherichia coli producing STX2e, method of producing STX2e by using the same and vaccine composition comprising the same}

본 발명은 부종병 독소(STX2e)를 생산하는 대장균, 이를 이용한 부종병 독소의 생산방법 및 이를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부종병에 이환된 돼지에서 시가독소(shigatoxin 2e variant)를 분비하는 시가독소 산생 대장균(Shigatoxin producing E. coli)을 돼지에서 분리한 후 백신주로 이용하고, 상기 백신주가 분비하는 부종병 독소(STX2e)를 대량으로 생산하는 방법 및 상기 백신주를 불활화하여 무독화된 톡소이드를 함유하는 돼지 부종병 예방용 백신에 관한 것이다.

대장균(Esherichia coli)은 포유동물 소화기관의 정상 세균총이다. 그러나 일부 대장균들은 병원성 인자를 획득하고, 돼지의 수송, 온도변화 등과 같은 스트레스 인자가 있을 때, 폭발적으로 증식하여 소장점막에 부착한 후 독소를 분비하여 설사 및 부종을 유발한다 (Fairbrother JM and Gyles CL 2012, Colibacilosis. Disease of swine. Wiley-Blackwell, West Sussex, UK, 723-749).

대장균증은 전세계적으로 발생하며, 독소의 유형에 따라 독소생산 대장균 (enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장병원성 대장균(enteropathogenic E. coli, EPEC) 및 시가독소 산생 대장균(Siga-like toxin producing E. coli, STEC) 등으로 구분하고 있다.

특히, 농장 환경이 불량하거나, 이유 스트레스 등에 의해 설사 및 부종병이 증가하고 있는데, 돼지의 부종병(porcine Edema disease in pigs)은 이유 및 육성자돈에서 다발하며, 기존의 돼지 설사병과 다르게 감염후 장 상피세포에 부착(F18ab)한 후 독소(STX2e)를 동시 또는 독소(STX2e)만 생산하여 질병을 일으킨다. 이렇게 생산된 독소는 혈액으로 흡수되어 전신의 혈관내피 세포를 파괴함으로써, 독성을 유발하고 부종을 일으킨다.

현재 부종병은 전세계적으로 발생하여 농장에 경제적 피해를 입히고 있으나, 부종병을 유발하는 독소(STX2e)의 대량 생산법이 개발이 미흡하고, 이러한 문제를 해결하기 위해 유전자 클로닝 기술을 이용한 대량 배양이 시도되고 있으나 (한국공개특허 제10-2010-0044813호), 산업적으로 사용시 백신을 만들 수 있는 충분한 독소 생산이 이루어지지 않기 때문에, 현재까지 돼지 부종병에 대한 백신 개발이 미흡한 실정이다.

한편, 담즙산의 일종인 소디움 이옥시콜레이트(sodium deoxycholate)가 소장에서 부종병 독소(STX2e)의 흡수를 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Waddell TE and Gyles CL, Infection and Immunity, 63(12), 4953-4956, 1995).

이에, 본 발명자들은 국내 돼지의 부종병 분포 조사를 통하여, 국내 돼지에서 유행하는 시가독소 생산 대장균(STEC)를 분리하여 병원성이 강하고 독소생산 능력이 우수한 균주를 선발하고, 소디움 이옥시콜레이트(sodium deoxycholate)가 독소의 흡수 뿐만 아니라, 생성 촉진에도 관여할 것이라는 가설하에 본 연구를 수행하여 독소의 생산을 촉진할 수 있는 방법을 확립하고, 독소를 불활화하여 안전성을 확인한 예방 백신을 사용함으로써, 돼지의 부종병 예방으로 인한 농가의 피해를 줄일 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 병원성이 강하고, 부종병 독소(STX2e) 생성능력이 우수한 대장균 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 부종병 독소(STX2e)를 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 대장균 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 부종병 독소(STX2e)를 생성하고, 혈청형이 O139인 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500104 (KCTC18389P) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 부종병 독소(STX2e)를 생성하고, 혈청형이 O139인 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500105 (KCTC18390P) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 EC 브로쓰(Escherichia coli broth)에 미토마이신(mitomycin) 및 소디움디옥시콜레이트(soidium deoxycholic acid)을 첨가한 배지에서 제1항 또는 제3항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부종병 독소(STX2e)의 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 국내 돼지에서 유행하는 부종병 대장균(F18ab, STX2e) 분리주를 이용하여 이 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 불활화하고, 안전성를 확인한 후 예방 백신용 항원으로 사용함으로써, 돼지 부종병을 효과적으로 예방함으로써, 돼지의 폐사율을 감소시킬 수 있다.

도 1은 베로세포에서 소디음 디옥시콜레이트를 첨가한 후의 세포변성 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 부종병 독소(STX2e)를 생성하고,혈청형이 O139인 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500104 (KCTC18389P)에 관한 것이다.

본 발명의 상기 대장균 KVCC-BA1500104 (KCTC18389P) 균주는 국내 돼지 유래의 부종병 독소 산생 대장균 분리주에서 선발된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 부종병 독소(STX2e)를 생성하고, 혈청형이 O139인 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500105 (KCTC18390P) 균주에 관한 것이다.

본 발명의 상기 대장균 KVCC-BA1500105 (KCTC18390P) 균주는 국내 돼지 유래의 부종병 독소 산생 대장균 분리주에서 선발된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 EC 브로쓰(Escherichia coli broth)에 미토마이신(mitomycin) 및 소디움디옥시콜레이트(soidium deoxycholic acid)을 첨가한 배지에서 상기 대장균 KEFS 0139(KVCC-BA1500104) 또는 대장균 KEFS 1163(KVCC-BA1500105) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부종병 독소(STX2e)의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 부종병 독소의 생산방법에서, 상기 EC 브로쓰는 펩톤 20.0g, 락토오즈 5.0g, 담즙염(bile salt No.3) 1.5g, 디포타슘 포스페이트(K₂HPO₄) 4.0g, 모노포타슘 포스페이트(KH₂PO₄) 1.5g, 소디움 클로라이드 5.0g으로 이루어진 조성에 증류수를 가하여 1,000mL로 만들고, pH를 6.5~7.5, 바람직하게는 ph 6.9~7.1로 적정한 후, 고압멸균하여 제조한다.

본 발명의 상기 부종병 독소의 생산방법은 EC 브로쓰에 미토마이신 및 0.3 소디움디옥시콜레이트를 첨가함으로써, 부종병 독소의 생산을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 상기 부종병 독소의 생산방법에서, 상기 배지는 EC 브로쓰에 5 μg/mL의 미토마이신 및 0.3 %(w/w)의 소디움디옥시콜레이트를 첨가한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 대장균 KVCC-BA1500104 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 대장균 KVCC-BA1500105 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

<실시예 1> 균주의 특성

(1). 돼지에서의 STEC 분포

국내 돼지 설사병 및 부종병 발생 농장에서 장 및 분변 등 200 건에서 병원성대장균을 분리하여 STEC (STX2e유전자를 보유) 64 균주를 분리하였는데, 국내 양돈장에서 분리된 STEC 분포 및 특성을 나타내는 하기 표 1에서 보는 바와 같이, 상기 분리된 균주는 대부분이 O139에 속하고, F18ab 유전자를 보유하는 균주들이었다.

(2). STEC 야외분리주의 시가 톡신 생성능

STEC 야외분리주 64주 중 59주를 EC 브로쓰에 5시간 동안 배양한 후, 베로 세포(vero cell)에 접종하여 확인한 결과, STEC 야외분리주을 이용한 베로 세포에서의 독소 생성율을 나타내는 하기 표 2와 같이, 39주가 양성으로 확인되었다

<실시예 2> 백신주의 선발

상기 실시예 1에서 분리한 STEC 야외분리주(64주)의 독소 생산능 및 마우스에 대한 병원성 조사를 실시하여, STEC 유전자 양성 분리주의 마우스 병원성 시험결과를 나타내는 하기 표 3과 같이, 백신주로서 대장균 KEFS 0139 주(O139, Stx2e+F18ab) 및 KEFS 1163 주(O139, Stx2e)를 각각 선발하였다.

상기 선발된 대장균 KEFS 0139 주를 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500104로 명명하고, 한국생명공학연구원의 미생물자원센터(KCTC)에 2015년 5월 21일자로 기탁번호 KCTC18389P로 기탁하였다. 또한, 대장균 KEFS 1163 주를 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500105로 명명하고, 한국생명공학연구원의 미생물자원센터(KCTC)에 2015년 5월 21일자로 기탁번호 KCTC18390P로 기탁하였다

<실시예 3> 백신주에서 독소생산 배지 선발 비교 시험

상기 선발된 백신주 KVCC-BA1500104를 EC 브로쓰 배지, EC 브로쓰 배지에 0.5μg/mL의 미토마이신 C를 첨가한 배지, 및 EC 브로쓰 배지에 0.5μg/mL의 미토마이신 C와 0.3%(w/w)의 소디움디옥시콜레이트를 첨가한 배지(300mL)를 37℃, 6시간 동안 200rpm으로 배양하여, 그 배양액의 상층액을 ELISA 검사를 한 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이, 미토마이신 C를 첨가한 배지군보다 미토마이신 C와 소디움디옥시콜레이트를 첨가한 배지군에서 3.5배 이상의 독소생산 상승효과를 확인하였다.

하기 표 4에서, 특이하게 stx2e에 반응하는 항체를 이용하여 발색하였기 때문에, 대조구 대비 흡광도로 독소(stx2e)의 생산량을 상대적으로 확인할 수 있는 것으로서, 단위는 없다.

여기에서, 상기 EC 브로쓰 배지는 펩톤 20.0g, 락토오즈 5.0g, 담즙염(bile salt No.3) 1.5g, 디포타슘 포스페이트(K₂HPO₄) 4.0g, 모노포타슘 포스페이트(KH₂PO₄) 1.5g, 소디움 클로라이드 5.0g으로 이루어진 조성에 증류수를 가하여 1,000 mL로 만들고, pH 7.0으로 적정한 후, 고압멸균하여 제조한 것을 사용하였다.

또한, 배양 상층액을 0.2μm의 필터로 여과하여 베로 세포(vero cell)에 접종한 후, 세포변성 유무를 확인한 결과, 표 5 및 도 1에서 보는 바와 같이, 미토마이신 C에 소디움디옥시콜레이트를 첨가한 배지군에서 3.4배 이상 증가하였다.

하기 표 5에서, 배양 상층액을 희석하여 베로 세포에 접종할 경우, 시가독소가 있을 때 세포의 사멸이 나타나는데, 이는 베로세포의 사멸이 나타나는 희석 배수를 나타내는 것이다.

하기 표 5는 각 시험구별 배양 상층액을 베로세포에 접종한 결과로서, 처리구별(배지단일과 미토마아산 c 첨가구, 미토마이신과 소디움 디옥시콜레이트 첨가구)로 배양 5시간에서 무첨가 대조구 보다 미토마이신과 소디움 디옥시콜레이트 첨가구에서 4배 이상의 희석배수 차이로 세포가 사멸하는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 시가 독소의 불활화 시험

(1). 마우스에 대한 병원성

부종병 독소(STX2e)의 마우스에 대한 반수 치사량(LD₅₀)에서, 독소 역가는 독소의 단백량을 조사하여 십진희석 후 독소의 역가를 측정하였다.

공격접종 후 7일 동안 확인하였으며, 그룹별로 5마리씩 마우스 복강에 0.2ml 공격접종하였다. LD₅₀은 123 ng/mL로 확인되었다 (시가독소(STX2e) 마우스의 병원성 시험 결과를 나타내는 하기 표 6 참조).

한편,상기 LD₅₀ 값은 Reed LJ et al. 1938 (Reed LJ, Muench H. 1938. A simple method of estimating 50% endpoint. The American Journal of Hygiene, 27(3), 493-497)의 방법을 이용하여 산출하였다.

(2). 부종병 독소(STX2e)의 불활화 및 안전성 시험

독소를 불활화시키기 위하여. 상기 실시예 3에서 배양한 배양 상층액에 0.3% 포르말린(formalin)을 첨가한 후, 37℃의 항온기에서 1주일간 보관하면서 독소의 불활화를 확인하였다.

포르말린에 의한 부종병 독소 불활화 효과를 나타내는 하기 표 7에서 보는 바와 같이, 포르말린 처리후 7일째에 처리구에서 독소의 불활화를 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 톡소이드 백신의 제조

EC 브로쓰 배지에 마이토마이신 C(0.5μg/mL) C 및 0.3% 소디움디옥시콜레이트를 첨가하고, 부종병 독소(STX2e)를 생성하는 시가독소 대장균(STEC) 균주(KVCC-BA1500104) 를 37℃에서 5시간 동안 쉐이킹(shaking) 배양하였다.

배양액을 8,000rpm, 30분의 조건으로 원심분리하여, 그 상등액을 10% 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)로 농축하여 1일간 인산 완충액(PBS)에 투석한 다음, 원심분리를 하여 그 상등액을 BCA 단백질 분석 키트(BCA protein assay reagent kit, Pierce)를 이용하여 농도를 측정하였다.

이때, 독소 역가는 베로 세포 및 ELISA 방법을 이용하여 특정하였다. 독소 역가를 1: 5,000으로 조정하고, pH를 7.0으로 조정하여 포르말린(0.3%, 37ºC 7일) 으로 중화하여 톡소이드 항원으로 제조하고, 4℃로 냉장보관하였다.

톡소이드 항원과 멸균된 15%(w/w)의 수산화 알루미늄겔(Al(OH)₃)을 1:1로 첨가한 후, 마그네틱 바를 이용하여 1시간 혼합하여 톡소이드 백신을 제조하였다.

<실시예 6> 톡소이드 백신의 실험동물 방어효과

부종병 독소(STX2e)에 대한 톡소이드 시험 백신(KVCC-BA1500104)의 마우스에 대한 방어효과를 시험한 결과, 실험동물에 대한 방어효과 시험 결과를 나타내는 하기 표 8에서 보는 바와 같이, 100%의 방어효과를 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명은 국내 돼지에서 유행하는 부종병 대장균(F18ab, STX2e) 분리주를 이용하여 이 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 불활화하고, 안전성를 확인한 후 예방 백신용 항원으로 사용함으로써, 돼지 부종병을 효과적으로 예방함으로써, 돼지의 폐사율을 감소시킬 수 있는 바, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC18389P

20150521

한국생명공학연구원

KCTC18390P

20150521

Claims

부종병 독소(STX2e)를 생성하고, 혈청형이 O139인 대장균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500104 (KCTC18389P) 균주.
제1항에 있어서, 상기 대장균은 국내 돼지 유래의 부종병 독소 산생 대장균 분리주에서 선발된 것을 특징으로 하는 균주.
부종병 독소(STX2e)를 생성하고, 혈청형이 O139인 대징균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500105 (KCTC18390P) 균주.
제3항에 있어서, 상기 대장균은 국내 돼지 유래의 부종병 독소 산생 대장균 분리주에서 선발된 것을 특징으로 하는 균주.
EC 브로쓰(Escherichia coli broth)에 미토마이신(mitomycin) 및 소디움디옥시콜레이트(soidium deoxycholic acid)을 첨가한 배지에서 제1항 또는 제3항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부종병 독소(STX2e)의 생산방법.
제5항에 있어서, 상기 배지는 EC 브로쓰에 5 μg/mL의 미토마이신 및 0.3 %(w/w)의 소디움디옥시콜레이트를 첨가한 것을 특징으로 하는 부종병 독소(STX2e)의 생산방법.
제1항 또는 제2항의 대징균(Eschrerichia coli) KVCC-BA1500104 (KCTC18389P) 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물.
제3항 또는 제4항의 대장균 KVCC-BA1500105 (KCTC18390P) 균주가 생성하는 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물.
제5항의 방법에 의해 생산된 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물.
제6항의 방법에 의해 생산된 부종병 독소(STX2e)를 포함하는 돼지 부종병 예방용 백신 조성물.