KR20160131259A

KR20160131259A - 조혈모세포의 세포주기를 조절하는 kai1 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160131259A
Application number: KR1020150063203A
Authority: KR
Inventors: 김효수; 허진; 최재일; 강진아; 남브니엘
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2016-11-16
Also published as: EP3292869A1; US20180133257A1; EP3292869B1; KR101757530B1; EP3292869A4; WO2016178514A1

Abstract

본 발명은 조혈모세포의 세포주기를 조절하는 KAI1 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조혈모세포의 세포 주기 조절용 조성물, 또는 혈액 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, KAI1(CD82)이 조혈모세포의 Hierarchy 중 가장 최상위의 조혈모세포(LT-HSC)에만 발현하고, 상기 KAI1을 이용하여 LT-HSC를 순도 높게 얻을 수 있는바, LT-HSC만을 순도 높게 이식함으로써 조혈모세포 이식의 다양한 부작용을 억제 할 수 있다. 또한, KAI1이 LT-HSC의 Quiescence(정지)에 중요하게 작용하며, LT-HSC의 Quiescence을 유지함으로써 다양한 Stress(5-FU, Irradiation)에 의한 세포 손상에 대해 저항성을 가지는바, 상기 세포를 이용하여 세포뱅크를 만들고 세포이식을 통한 혈액종양 세포치료제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

조혈모세포의 세포주기를 조절하는 KAI1 단백질 및 이의 용도{KAI1 PROTEIN CONTROLING CELL CYCLE OF HEMATOPOIETIC STEM CELL, AND USES THEREOF}

본 발명은 조혈모세포의 세포주기를 조절하는 KAI1 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조혈모세포의 세포 주기 조절용 조성물, 줄기세포 대량 배양 및 유지/저장 또는 혈액 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

백혈병은 혈액 세포, 특히 백혈구가 이상 증식하는 혈액종양의 일종으로서,제대로 성숙하지 못한 백혈구가 대량으로 혈액 속에 존재하고 있다(또한 이 백혈구는 생검 시 정상 백혈구보다 세포 기관을 포함한 세포의 크기가 휠씬 크다). 백혈구의 비정상적인 증식에 비해, 정상적인 혈구 세포의 수는 극히 적어지게 되어 면역기능은 물론 산소 운반이나 영양 공급과 같은 기본적인 혈액의 기능을 수행할 수 없게 된다. 또한 비정상적인 백혈구는 자가 면역 질환과 유사한 반응을 일으켜 정상 조직을 파괴하기도 한다. 백혈병은 세포의 분화정도에 따라 급성과 만성으로 나뉘고, 세포의 기원에 따라 골수성과 림프성으로 나뉜다. 이에, 백혈병은 크게 i) 급성 골수성 백혈병(Acute myelogenous leukemia, AML), ii) 만성 골수성 백혈병(Chronic myelogenous leukemia, CML), iii) 급성 림프모구 백혈병(Acute lymphocytic leukemia, ALL) iv) 만성 림프모구 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)의 네 부류로 나뉜다.

이러한 백혈병을 치료하는 방법 중 하나로 조혈모세포 이식(Hematopoietic Stem Cell Transplantation)이 있다. 조혈모세포 또는 조혈줄기세포는 혈액의 주요한 구성성분으로 잠재적으로 분화할 수 있는 세포이다. 조혈모세포는 골수에서 생산되는(단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기성 백혈구, 적혈구, 혈소판 등)세포들과 림프계(T세포, B세포, NK세포)등으로 분화 가능하다. 이 세포는 골수 조직에 있는 세포들의 1/10000라는 그 중요성과는 달리 상대적으로 작은 비율을 차지하지만, 자기 자신을 복제 할 수 있는 능력을 지녔기 때문에 혈액의 구성성분을 항상 제때에 생산 할 수 있다. 이에, 백혈병과 같이 세포분화 과정에서 이상이 생긴 경우나 재생불량성빈혈과 같이 조혈모세포의 숫자가 줄어들어 이상이 오는 경우에, 조혈모세포를 이식함으로써, 이들 질환을 근본적으로 치료할 수 있다.

하지만, 조혈모세포이식 후에는 면역기능의 저하가 장기간 지속되어 반복적인 세균감염이나 바이러스 감염, 진균 감염 등이 발생할 수 있고, 면역기능의 회복은 조혈모세포 이식편의 종류, 면역억제제 투여 기간, 이식편대숙주병 유무 등에 따라 차이가 나므로 감염 회복 정도도 차이가 난다. 동종이식의 경우에는 이식편대 숙주병이 발생할 수 있어 재발과 함께 이식의 성적을 좌우하는 중요 요소가 된다.

이에, 이러한 조혈모세포 이식의 부작용을 최소화하기 위한 연구가 주요한 과제 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 본 발명은 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 세포 주기 조절용 조성물, 또는 혈액 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는, 스트레스에 대한 저항성을 갖는 조혈모세포의 정제방법을 제공하는 것이다:

(a) 분리된 조혈모세포집단에서 KAI1의 발현여부를 분석하는 단계; 및

(b) KAI1이 발현된 조혈모세포만을 분리하여 수득하는 단계.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 세포 주기 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 KAI1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DARC 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조혈모세포는 장기간 조혈모세포(Long-term Hematopoietic stem cell, LT-HSC)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 조혈모세포의 GO기를 유지할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 PKC를 통해 TGF-β1 분비를 증가시킬 수 있다.

본 발명은 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 혈액종양은 림프종, 다발성 골수종, 골수성 백혈병 및 림프구성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 스트레스에 대한 저항성을 갖는 조혈모세포의 정제방법을 제공한다:

(b) KAI1이 발현된 조혈모세포만을 분리하여 수득하는 단계.

본 발명은 상기 방법에 의해 정제된 조혈모세포를 포함하는, 혈액 종양 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 조혈모세포에서 KAI1의 발현을 증가시키는 단계를 포함하되, 상기 조혈모세포는 장기간 조혈모세포(Long-term Hematopoietic stem cell, LT-HSC)인, 정지 조혈모세포를 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조혈모 세포와 rhDARC, DARC 양성 단핵구(Monocyte), DARC 양성 대식세포(Macrophage) 또는 DARC 양성 대식세포(Macrophage) 배양액과 공배양 하여 KAI1의 발현을 증가 또는 유지시킬 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 수득되는 정지 조혈모 세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 정지 조혈모세포는 체내 이식 효율이 증대되거나, 증식성, 분화성, 보관성 또는 안정성이 증대된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 정지 조혈모세포는 장기 이식 및/또는 재생 능력을 향상시킬 수 있다.

본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액 종양 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 약학적 조성물의 혈액 종양 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, KAI1(CD82)이 조혈모세포의 Hierarchy 중 가장 최상위의 조혈모세포(LT-HSC)에만 발현하고, 상기 KAI1을 이용하여 LT-HSC를 순도 높게 얻을 수 있는바, LT-HSC만을 순도 높게 이식함으로써 조혈모세포 이식의 다양한 부작용을 억제 할 수 있다.

또한, KAI1이 LT-HSC의 Quiescence(정지)에도 중요하게 작용하는바, Quiescence LT-HSC를 순도 높게 분류(sorting) 가능하기 때문에, 앞으로 Quiescence LT-HSC를 연구하는데 좋은 Tool이 될 수 있다.

더욱이, KAI1이 LT-HSC의 Quiescence(정지)에 중요하게 작용하며, LT-HSC의 Quiescence을 유지함으로써 다양한 Stress(5-FU, Irradiation)에 의한 세포 손상에 대해 저항성을 가지는바, 상기 세포를 이용하여 세포뱅크를 만들고 세포이식을 통한 혈액종양 세포치료제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 LT-HSC, ST-HSC 및 MPP 세포 각각의 population을 FACS Arial 기기를 이용하여 분류한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 LT-HSC, ST-HSC 및 MPP 세포의 RNA를 분리하여 CD9, CD37, KAI1(CD82) 및 CD151의 발현양을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 LT-HSC, ST-HSC 및 MPP 세포를 염색하여 KAI1, CD9, CD37 및 CD151 발현여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 최근 논문발표에서 보고된 표지자(HSC1, MPP1, MPP2)를 사용하여 추가로 KAI1을 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 KAI1(+)LT-HSC가 Bone에서 어디 위치해 있는지 확인하기 위해 C57BL/6 마우스의 bone을 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 직접 제작한 KAI1 Knock-out mouse Genomic DNA를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 11은 FACS analysis를 통해 WT과 KAI1 K/O Mouse의 BM에서 LT-HSC, ST-HSC 및 MPP 세포 수를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 WT과 KAI1 K/O Mouse의 BM 세포에 대하여 MethoCult™ GF M343를 이용하여 Colony Forming (CFU) Assay를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 LT-HSC을 정량하기 위해 long term culture-initiating cell (LTC-IC) assay를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 도 15는 WT과 KAI1 K/O mouse의 Bone-marrow (BM)를 얻고, 이들을 LT-HSCs (CD34-LSK) 세포에서 LSR II을 사용하여 ki67과 Hoechst 33342 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16 및 도 17은 in vivo에서 WT과 KAI1 K/O mouse의 proliferative activity를 측정하기 위해, Genomic DNA에 exogenous BrdU의 incorporation을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 WT과 KAI1 K/O Mouse의 LT-HSC에서 p21, p27 및 p57 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 WT과 KAI1 K/O Mouse의 LT-HSC의 Rb의 Phosphorylation을 FACS analysis를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 Lin(-)CD34(-) 세포 및 Lin(-)CD34(+) 세포에서 KAI1의 유전자 발현을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 shRNA construct를 사용하여 EML 세포에서 KAI1을 넉다운(Knock-down) 시킨 후, qRT-PCR을 이용하여 KAI1 Knock-down을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 EML 세포에서 KAI1을 과발현(Over-expression) 시킨 후, qRT-PCR을 이용하여 KAI1 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23 및 도 24는 KAI1 Knock-down 및 KAI1 Over-expression EML 세포의 RNA sequencing analysis를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 25 및 도 26은 KAI1 Knock-down 및 KAI1 Over-expression EML 세포에서 TGF-β1 및 TGFR2의 발현 증감을 RT-PCR과 Western Blot을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 27 및 도 28은 WT과 KAI1 K/O Mouse의 LT-HSC에서 TGF-β1, TGFR2 Positive 세포를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 29 및 도 30은 KAI1 Oever-expression EML 세포에 이들의 Inhibitor을 처리한 후, Western Blot을 이용하여 TGF-β1의 발현 및 분비를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 KAI1 Knock-down과 KAI1 Over-expression EML 세포에서, TGF-β1/TGFR의 하위 Pathway로 Smad2과 Smand3의 Phosphorylation, 및 CDK Inhibitor인 p21, p27, p57의 발현 증감여부를 Western Blot을 이용하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 KAI1 Over-expression EML 세포에 TGFR Inhibitor 또는 TGF-β1의 중화 항체를 처리한 후, p21, p27, p57 발현 증감여부를 Western Blot을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 33 및 도 34는 FACS를 통해 Mock/, KAI1 O/E EML에 cell cycle을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 35 내지 도 38은 sub-lethal irradiation을 준 WT mice에 5-FU를 Injection하여 골수에서 KAI1-positive LT HSCs과 proliferating blood cells의 연속적인 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 39 및 도 40은 sub-lethal irradiation 후에 KAI1-/- 및 WT mice 간 골수에서 total 또는 LSK cells의 회복을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 KAI1이 HSCs의 long term repopulating capacity 영향을 주는지 알아보기 위한 competitive BM transplantation (BMT) 실험의 개략적인 과정을 도시한 것이다.
도 42는 도 41에 의해 수행하여 수득된 골수세포의 FACS 분석 결과를 나타내 것이다.
도 43 및 도 44는 Serial BMT를 통해, Second BMT에서 KAI1 -/- mice의 HSPCs를 받은 mice의 골수세포와 WT mice의 HSPCs를 받은 mice의 골수세포 간의 LSK와 LT-HSCs를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 45 및 도 46은 각각의 KAI1-/- mice와 WT 유래한 HSPCs를 받은 mice의 CD34- LSK cells에서 cell cycle을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 47은 EML 세포에서의 KAI1 항체를 사용하여 Immunoprecipitation을 한 후 DARC(Duffy antigen receptor for chemokines)을 Western blot을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 MACS 기법을 이용하여 F4/80 양성 세포 또는 Lin(-) 세포를 공동배양 (co-culture) 후 KAI1과 DARC을 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 49는 실제 In vivo에서도 KAI1과 DARC의 상호작용을 확인하기 위해, C57 마우스의 Fimur(A) 또는 Tie2-GFP 마우스의 Fimur(B)을 Paraffine block을 만든 후 Section하여 Deparaffine 그리고 Retrival 과정을 거쳐 형광염색을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 50은 DARC(+) 세포가 어떤 세포인지를 보기위해, Endothelial cell, Stromal cell 그리고 Monocyte / Macrophage 에서의 DARC의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 51은 Lin(-)CD34(-) 및 Lin(-)CD34(+)에서의 KAI1 발현 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 52는 KAI1의 활성에 의한 PKC의 Phosphorylation을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 53은 rhDARC가 KAI1을 통해 PKCa의 phosphorylation을 증가시키는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 54는 qEML 세포에 Mock Raw 264.7 세포 그리고 DARC Knock-down Raw 264.7 세포 마지막으로 DARC Knock-down Raw 264.7 세포의 공배양에 더불어서 rhDARC을 전처리한 후에 2일동안 배양한 후에 세포주기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 55는 Lin(-)CD34(-)세포로 MACS(magnetic-activated cell sorting)을 이용하여 Sorting 하고나서 SCF(stem cell factor)을 넣고 배양을 한 후, KAI1(+) 세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 56 및 도 57은 G-CSF 혹은 5-FU와 같은 Stress 혹은 Mobilization niche에서는 Raw 264.7세포의 DARC의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 58은 Raw 264.7 세포의 DARC 발현을 shRNA을 이용하여 감소시킨 후, Total EML cell에서 Sorting한 Quiescent EML cell을 SCF을 첨가한 조건으로 Mock Raw264.7과 DARC knock-down Raw264.7 세포를 동시배양하는 경우의 KAI1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 59는 Paracrine 효과를 보기위해 Mock과 DARC Knock-down Raw 264.7 상등액을 얻어, EML 세포을 함께 배양하는 경우의 KAI1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 60은 EML cell로부터 qEML cell을 sorting 하고 SCF을 넣고 배양하고, KAI1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 61은 EML을 SCF넣고 배양하여 8시간 후에 KAI1을 IP을 하고 Mono/Poly ubiquitine을 Western을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 62 내지 도 64는 SCF를 qEML 단독, qEML + Mock Raw 264.7 세포, qEML + DARC Knock-down Raw 264.7 , qEML + DARC Knock-down Raw 264.7 + rhDARC, MG-132을 전처리한 qEML세포 모든 그룹에 넣고 3시간 동안 배양을 진행한 후에 Membrane binding 항체를 acidic buffer (50mM Glycine, 100mM NaCl, pH 2.5)를 이용하여 제거하고, Endocytosis된 KAI1-Biotin conjugation을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 65 및 도 66은 인간 LT-HSC를 LIN, CD38, CD34, CD93, CD45RA 항체로 염색하여 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 67은 human 제대혈에서 첫 번째로, MNC을 얻고 MACS을 이용하여 Lin(+) CD235(+)CD235(+) 세포들을 제거하고, 두 번째로 FACS을 이용하여 KAI1(+)LT-HSC와 KAI1(-)LT-HSC을 Sorting 하고, 3시간동안 Starvation을 후, rhDARC을 처리하고 Fixation/Permeabilization 후에 형광염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 68은 rhDARC에 의해 KAI1(+)LT-HSC의 Quiescent가 증가 하는지를 확인하기 위해, MNC을 얻고 Lin(+)CD235(+)DARC(+) 세포를 제거한 후에 3시간 동안 Starvation 과정 후에 rhDARC을 처리 후 2일 후에 세포주기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 69는 Human(제대혈)의 CD14 Positive 세포에서 DARC의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 70은 제대혈에서 Lin(-)CD235(-)DARC(-) 세포를 얻고, 같은 제대혈에서 일부는 MACS을 이용하여 Monocyte을 [Un-touched monocyte] 분리한 후, Growth factor에 의해 [SCF, Flt3-ligand, TPO, IL-3] HSC 단독 배양을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 71은 실시예의 결과들을 종합하여 나타낸 것이다.

본 발명자들은 조혈모세포 이식에 대한 부작용을 경감시키기 위한 방법에 대하여 연구 노력한 결과, 조혈모세포의 Hierarchy 중 가장 최상위의 조혈모세포(LT-HSC)에만 발현하는 KAI1(CD82)라는 표지(Marker)를 최초로 발견하였다. 또한, KAI1이 LT-HSC의 Quiescence(정지)에 중요하게 작용하며, LT-HSC의 Quiescence을 유지함으로써 다양한 Stress(5-FU, Irradiation)에 저항성을 가짐을 확인하고, 이게 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 세포 주기 조절용 조성물을 제공하며, 이때, 조혈모세포는 바람직하게는 장기간 조혈모세포(Long-term Hematopoietic stem cell, 이하 'LT-HSC'라 함)일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 LT-HSC에만 특이적으로 발현하는 KAI1(CD82) 단백질의 발현 조절을 통해 LT-HSC의 세포 주기를 조절할 수 있는 것에 특징이 있다. 즉, KAI1(CD82) 단백질의 발현을 증가시키면, PKC를 통한 TGF-β1 분비 증가로 인하여 LT-HSC의 GO기(휴지기, quiescence)를 유지할 수 있고, KAI1(CD82) 단백질의 발현을 감소시키면, 반대의 신호기전을 통해 LT-HSC의 증식과 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 KAI1(CD82) 폴리펩타이드는 인간에서 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 마우스에서 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 KAI1 폴리펩타이드을 코딩할 수 있는 어떤 유전자도 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는, LT-HSC, ST-HSC(Short-term Hematopoietic stem cell), 및 MPP(Hematopoietic multipotent progenitor) 세포 중 LT-HSC에서만 특이적으로 KAI1(CD82)이 발현한다는 것을 확인하였다(실시예 1 참조). 또한, KAI1(CD82) 발현 여부에 따른 LT-HSC의 세포주기 조절을 확인한 결과, WT 대비 KAI1 K/O mouse의 LT-HSC에서 G0가 감소된 반면, G1/S/G2 주기는 증가되었고, LT-HSC의 세포수도 감소되었으며(실시예 2 및 실시예 3 참조), KAI1이 Erk가 아닌 PKC에 의해 TGF-β1의 발현과 분비를 증가시킴을 확인하였다(실시예 4 참조).

이러한 실험결과로부터, KAI1 발현 조절을 통해 조혈모세포, 특히 LT-HSC의 세포주기 및 분화를 조절할 수 있고, 이를 통해 혈액 종양에 효과가 있다는 것도 알 수 있다. 따라서, KAI1 또는 KAI1의 발현을 증진시키는 물질은 조혈모세포의 휴지기를 유지할 수 있으며, 혈액 종양의 치료에도 효과가 있다고 할 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈액 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하며, DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈액 종양을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈액 종양에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "혈액종양"은 백혈구계 또는 림프계에서 발생하는 악성종양으로 림프종, 다발성 골수종, 골수성 백혈병 및 림프구성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 KAI1 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 상기 유효성분을 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 약제학적 제형으로 제조될 수 있으며, 제제의 형태에는 제한이 없다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 혈액종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 “약제학적 유효량”은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

또한, 본 발명에 따르면, KAI1(CD82)의 발현을 통해 LT-HSC의 quiescence를 유지할 수 있고, 이로 인해 LT-HSC가 다양한 스트레스에 대하여 저항성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는, KAI1(CD82)이 발현된 마우스 군에서 5-FU 및 irradiation에 대한 저항성을 가짐을 확인하였다(실시예 5 참조)

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 스트레스에 대한 저항성을 갖는 조혈모세포의 정제방법을 제공한다:

(b) KAI1이 발현된 조혈모세포만을 분리하여 수득하는 단계.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, KAI1 활성과 관련된 리간드(Ligand) 및 KAI1 발현의 조절기전을 확인한 결과, KAI1이 DARC와 상호작용하며, rhDARC, DARC 양성 단핵구(Monocyte) 또는 DARC 양성 대식세포(Macrophage)와 공배양을 통해 발현이 조절됨을 확인하였다(실시예 7 및 실시예 8 참조).

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 조혈모세포에서 KAI1의 발현을 증가시키는 단계를 포함하되, 상기 조혈모세포는 장기간 조혈모세포(Long-term Hematopoietic stem cell, LT-HSC)인, 정지 조혈모세포를 수득하는 방법을 제공하며, 이때 상기 조혈모세포는 rhDARC, DARC 양성 단핵구(Monocyte), DARC 양성 대식세포(Macrophage) 또는 DARC 양성 대식세포(Macrophage) 배양액과 공배양함으로써 KAI1의 발현을 증가 또는 유지시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 DARC 폴리펩타이드는 인간에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 마우스에서 유래된 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득되는 정지 조혈모 세포를 제공한다. 본 발명의 정지 조혈모세포는 체내 이식 효율이 증대되거나, 증식성, 분화성 또는 안정성이 증대될 뿐만 아니라 췌장 이식 향상, 간 재생 등의 장기 이식 또는 재생 능력도 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. Long-term Hematopoietic stem cell (LT-HSC) 표지자로서의 KAI1(CD82) 확인

KAI1(CD82)이 조혈모세포의 Hierarchy 중 가장 최상위의 조혈모세포(LT-HSC)의 표지자(marker)가 될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 진행하였다.

1-1. 세포 수득

먼저 LT-HSC, ST-HSC(Short-term Hematopoietic stem cell), MPP(Hematopoietic multipotent progenitor) 세포들을 얻기 위해, C57BL/6 Mouse의 Femur, Tibia로부터 골수세포를 얻어 Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하였다. 그리고 Lineage (CD3e, CD11b, CD45R/B220, Erythroid Cells, Ly-6G 및 Ly-6C), c-kit, Sca-1, Flt3, CD34 항체를 사용하여 염색을 하였다. 기존에 잘 알려진 표지자로 LT-HSC는 Flt3-CD34-LSK, ST-HSCs는 Flt3-CD34+LSK, MPPs는 Flt3+CD34+LSK로 규정하며, 이때 LSK는 Lineage(-)Sca-1(+)c-kit(+)을 의미한다. 각각의 population을 FACS Arial 기기를 이용하여 분류하였고, 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 population이 순도 높게 분류(sorting)된 것을 확인할 수 있었다.

1-2. LT-HSC에서의 KAI1(CD82)의 발현 확인

KAI1(CD82)이 LT-HSC에만 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-1에서 얻은 세포의 RNA를 분리하여 Tetraspanin으로 알려진 CD9, CD37, KAI1(CD82), CD151의 발현양을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 이때 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

구분	프라이머 서열
CD9	FW (Forward)	5′-AGTGCATCAAATACCTGCTCTTC-3'(서열번호 5)
CD9	RV (Reverse)	5′-CTTTAATCACCTCATCCTTGTGG-3'(서열번호 6)
CD37	FW (Forward)	5′-CTTCGTTTTCAACCTCTTCTTCT-3′(서열번호 7)
CD37	RV (Reverse)	5′-AACTGTGCATAGTCCCAACTCTC-3′(서열번호 8)
CD81	FW (Forward)	5′-TTCTACGTGGGCATCTACATTCT-3′(서열번호 9)
CD81	RV (Reverse)	5′-GCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG-3′(서열번호 10)
CD151	FW (Forward)	5′-TGCCTCAAGTACCTGCTCTTTAC-3′(서열번호 11)
CD151	RV (Reverse)	5′-CTGACTGGTGGTATCTCTTGACC-3′(서열번호 12)
KAI1 (CD82)	FW (Forward)	5′-CACTACAACTGGACAGAGAACGAG-3′(서열번호 13)
KAI1 (CD82)	RV (Reverse)	5′-TGTAGTCTTCAGAATGAATGTACCG-3′(서열번호 14)

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 대부분의 Tetraspanin은 LT-HSC, ST-HSC, MPP 모두에서 발현하는 반면, KAI1(CD82)은 LT-HSC에만 특이적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 상기 실시예 1-1에서 얻은 세포의 형광염색을 실시하였고, 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, KAI1이 LT-HSC에서만 발현한 반면, 다른 CD9, CD37, CD151은 LT-HSC, ST-HSC, MPP 모두에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 최근 논문발표에서, 좀 더 순도 높은 quiescent HSC 표지자로 HSC1 혹은 quiescent HSC는 CD48-CD229-CD244-CD150+LSK, MPP1 은 CD48-CD229-CD244-CD150-LSK, MPP2은 CD48-CD229+CD244-CD150-LSK로 규정되었는데, 이와 동일한 표지를 사용하여 추가로 KAI1을 염색한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HSC1 (quiescent HSC)에서 10% 정도 KAI1(+) 세포를 확인한 반면, 이외에 MPP1과 MPP2에서 KAI1(+)는 없음을 확인할 수 있었다.

다음으로 KAI1(+)LT-HSC가 Bone에서 어디 위치해 있는지 확인하기 위해 C57BL/6 마우스의 bone을 염색하였다. Bone 염색방법은 C57BL/6 Mouse의 Femur를 4% Paraformaldehyde로 24시간동안 고정을 진행하였다. 이후, Decalcification 용액에 상온에서 24시간 동안 두고, Paraffin block을 이용하여 슬라이드를 만들었다. Paraffin slide는 de-paraffin 과정을 통해 염색을 진행하였다. LT-HSC의 표지로 Lineage와 CD41, CD48을 Negative로 CD150와 KAI1이 동시에 발현하는 세포를 확인한 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 대부분 Bone lining에 위치해 있음을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, Lin(-)CD41(-)CD48(-)CD150(+)KAI1(+) 세포들은 대부분 Endosteal niche와 Arteriolar niche에 위치해 있었다. 한편, Endosteal niche와 Arteriolar niche은 기존 참고문헌에 따르면 quiescent HSC가 유지되는 곳으로 알려져 있다.

실시예 2. KAI1(CD82) 발현 여부에 따른 Bone-marrow (BM)에서 LT-HSC의 세포수 증감 확인

2-1. KAI1 Knock-out mouse 제작

본 발명자들은 세계 최초로 KAI1 Knock-out mouse를 직접 제작하였다. 보다 구체적으로, KAI1의 5번과 6번을 targeting하여 제작하였으며, 마우스의 Genomic DNA를 하기 표 2에 기재된 primer를 이용하여 KAI1 Knock-out mouse를 확인하였다(도 7 및 도 8 참조). 이때, 400bp는 Wild type, 300bp에서 KAI1 K/O mouse 이다.

구분	프라이머 서열
primer A	5'-GGGTCCCCTAGGAAATTCAA-3'(서열번호 15)
primer B	5'-ATGATGCAGATGTTCTCTCAGGGTG-3'(서열번호 16)
primer C	5'-ACAGGGGACTCACCC TACAAGG-3'(서열번호 17)

2-2. WT과 KAI1 K/O Mouse의 BM에서 세포수 비교

먼저, WT과 KAI1 K/O Mouse의 BM에서 LT-HSC, ST-HSC 및 MPP 세포 수를 비교하기 위해 FACS analysis를 진행하였고, 그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, WT에 비해서 KAI1 K/O Mouse에서 LT-HSC 표지자인 CD48(-)CD150(+)LSK의 세포수가 감소함을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 도 10에 나타낸 바와 같이, 또 다른 LT-HSC의 표지자로 알려진 CD34(-)Flt(-)LSK 세포수 또한 KAI1 K/O Mouse에서 감소되어 있었고, 도 11에 나타낸 바와 같이, 절대수에서도 KAI1 K/O Mouse에서 감소돼 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로, WT과 KAI1 K/O Mouse의 BM 세포에 대하여 MethoCult™ GF M343 (Stem Cell Technologies, Cat No. 03434)을 이용하여 Colony Forming (CFU) Assay를 진행하였고, 그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, WT 대비 KAI1 K/O Mouse에서 multi-potential granulocyte, erythroid, macrophage, megakaryocyte progenitors (CFU-GEMM)가 감소함을 확인할 수 있었다.

다음으로, LT-HSC을 정량하기 위해 long term culture-initiating cell (LTC-IC) assay를 진행하였다. 보다 구체적으로, Mouse stromal cell (OP9)을 30Gy로 irradiation을 진행하여 feeder cell로 사용하였다. 그리고 WT과 KAI1 K/O mouse의 BM에서 LSK 세포를 분류(sorting)하였고, 각각의 세포들을 feeder cell 위에 culture했다. Hydrocortisone이 첨가한 MyeloCult medium (StemCell technology)으로 culture하였으며, 일주일에 한번씩 Half-medium으로 교환하였다. 총 4주 culture한 후 CFU assay를 진행했고, 10일 후에 colony를 counting 했다. 그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, WT 대비 KAI1 K/O mouse에서 colony가 감소되어 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, KAI1 K/O mouse에서 LT-HSC의 세포수가 감소되어 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. KAI1(CD82) 발현 여부에 따른 LT-HSC의 세포주기 확인

먼저, WT과 KAI1 K/O mouse의 Bone-marrow (BM)를 얻고, 이들을 LT-HSCs (CD34-LSK) 세포에서 LSR II을 사용하여 ki67과 Hoechst 33342를 분석하였다. 그 결과, 도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, WT 대비 KAI1 K/O mouse의 LT-HSC에서 G0가 감소된 반면, G1/S/G2 주기는 증가됨을 확인할 수 있었다.

다음으로, In vivo에서 WT과 KAI1 K/O mouse의 proliferative activity를 측정하기 위해, Genomic DNA에 exogenous BrdU의 incorporation을 확인했다. 즉, BrdU 투여 후에 각각의 Mouse에서 BM세포를 얻어 LT-HSC의 BrdU Positive 세포들을 측정한 결과, 도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이, WT 대비 KAI1 K/O Mouse에서 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.

다음으로, HSC의 quiescence를 유지하는 중요한 유전자인 CDK Inhibitor(p21, p27, p57)를 확인하기 위해, WT과 KAI1 K/O Mouse의 LT-HSC를 분류(sorting) 한 후 RNA를 분리하여 RT-PCR을 진행 했다. 이때 사용된 프라이머 정보는 하기 표 3에 나타내었다.

구분	프라이머 서열
P21	FW (Forward)	5′-GAGAACGGTGGAACTTTGACTTC-3′(서열번호 18)
P21	RV (Reverse)	5′-GTGATAGAAATCTGTCAGGCTGGT-3′(서열번호 19)
P27	FW (Forward)	5'-CATGAAGAACTAACCCGGGACT-3'(서열번호 20)
P27	RV (Reverse)	5'-CAGAGTTTGCCTGAGACCCAAT-3'(서열번호 21)
P57	FW (Forward)	5'-AGATCTGACCTCAGACCCAATTC-3'(서열번호 22)
P57	RV (Reverse)	5'-GCTCTTGATTCTCGTCCTGCTC-3'(서열번호 23)

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, WT 대비 KAI1 K/O LT-HSC에서, CDK Inhibitor인 p21, p27, p57이 감소함을 확인할 수 있었다.

보통 CDK Inhibitor는 Retinoblastoma의 (Rb) Phosphorylation를 감소 시켜 세포주기를 멈추게 하는 것으로 알려져 있다. 이에, WT과 KAI1 K/O Mouse의 LT-HSC의 Rb의 Phosphorylation을 FACS analysis를 통해 확인한 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, WT 대비 KAI1 K/O Mouse에서 Rb의 Phosphorylation이 증가 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터, KAI1 K/O mouse LT-HSC는 휴지기(quiescence)가 감소됨을 알 수 있었다.

실시예 4. KAI1(CD82)이 LT - HSC의 quiescence을 유지하는 신호전달 기전 확인

4-1. 세포주 준비

KAI1이 LT-HSC의 quiescence을 유지하는 기전을 연구하기 위해, HSPC(Hematopoietic stem and progenitor cell) 연구에 많이 사용되어온 EML 세포주를 이용했다. EML 세포주는 Lin(-)CD34(-)가 quiescence 세포이며, Lin(-)CD34(+) 세포가 Cell cycle이 활발한 proliferative activity가 높은 세포이다. 상기 두 가지 population을 sorting하여 상기 표 1에 기재된 KAI1 프라이머를 사용하여 KAI1의 유전자 발현을 비교하였고, 그 결과 도 20에 나타낸 바와 같이, Lin(-)CD34(-)인 quiescence한 세포에서 KAI1이 발현이 높았으며, 반대로 Lin(-)CD34(+) 세포에는 발현하지 않음을 확인할 수 있었다.

4-2. EML 세포에서의 KAI1 Knock-down 또는 Over-expression

Lenti-virus를 이용하여 EML 세포에서 KAI1을 넉다운(Knock-down) 또는 과발현(Over-expression) 시켰다.

먼저, KAI1 Knock-down은 shRNA construct를 사용하였다 (Sigma-Aldrich, TRCN0000042409, TRCN0000042410, TRCN0000042411). Transduction 후에 puromycin (2 μg/ml)으로 selection을 진행하였다. 그리고 Real-time PCR (qPCR)을 이용하여 KAI1 Knock-down을 확인하였으며, 이때 사용한 qPCR 전용 KAI1 프라이머 정보는 하기 표 4에 나타내었다. 그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, shRNA construct 처리에 의해 EML 세포에서서 KAI1이 Knock-down됨을 확인할 수 있었다.

구분	프라이머 서열
KAI1	FW (Forward)	5′-GCCTGGGACTACGTGCAG-3′(서열번호 24)
KAI1	RV (Reverse)	5′-CCTCGTTCTCTGTCCAGTTGT-3′(서열번호 25)

다음으로 KAI1 Over-expression(O/E)을 하기 위해, KAI1 cDNA를 pLenti 6.3/v5-Dest (Invitrogen)에 삽입(insertion)하여 cloning을 진행하였다. KAI1 pLenti 6.3/V5-Dest은 ViraPower Packaging Mix (Invitrogen)와 polyethylenimine (PEI)를 사용하여 293FT cells에 transfection하였다. 그리고 48시간 후에 viral supernatant을 획득하고 filter을 거친 후에 ultracentrifugation을 이용하여 virus를 농축하였다. 이렇게 얻은 virus는 EML cell에 transduction한 뒤 48시간 후에 blasticidin S (5 μg/ml)을 이용하여 selection했다. 그리고 나서 상기 표 4에 기재된 프라이머를 사용하여 KAI1의 증가를 확인한 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, KAI1이 과발현 되어있음을 확인할 수 있었다.

4-3. KAI1 Knock-down, KAI1 Over-expression EML 세포 간의 비교실험

먼저, 상기 실시예 4-2를 통해 얻은 KAI1 Knock-down, KAI1 Over-expression EML 세포를 RNA sequencing analysis를 진행하였다. 그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, KAI1 Knock-down EML 세포에서 CDK Inhibitor의 감소뿐만 아니라 그것의 상위인 TGF-β의 감소를 확인할 수 있었다. 또한, 도 24에 나타낸 바와 같이, KAI1 Knock-down EML 세포에서는 Negative cell cycle의 유전자들이 감소된 반면, KAI1 Over-expression EML 세포에서는 Negative cell cycle의 유전자들이 증가 되어 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로, RT-PCR과 Western Blot을 이용하여 TGF-β1 및 TGFR2의 발현 증감을 확인하였다. 이때 사용된 프라이머 정보는 하기 표 5에 나타내었다.

구분	프라이머 서열
TGF-β1	FW (Forward)	5'-CGGACTACTATGCTAAAGAGGTCAC-3'(서열번호 26)
TGF-β1	RV (Reverse)	5'-GAGTTTGTTATCTTTGCTGTCACAAG-3'(서열번호 27)
TGFβR2	FW (Forward)	5'-CATCTTCTACTGCTACCGTGTCC-3'(서열번호 28)
TGFβR2	RV (Reverse)	5'-ATGTTCTCATGCTTCAGGTTGAT-3'(서열번호 29)

도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이, KAI1 Knock-down EML 세포에서 TGF-β1, TGFR2의 발현이 감소된 반면, KAI1 Over-expression EML 세포의 경우 TGF-β1, TGFR2의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.

다음으로, 실제 WT과 KAI1 K/O Mouse의 Femur, Tibia로부터 골수세포를 얻어 Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리 후 FACS 분석을 진행 하였다. Flt3-CD34-LSK세포인 LT-HSC에서 TGF-β1, TGFR2 Positive 세포를 비교해본 결과, 도 27 및 도 28에 나타낸 바와 같이, KAI1 K/O Mouse에서 TGF-β1, TGFR2 Positive 세포가 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 종래에 PKC와 Erk pathway에 의해 TGF-β1이 증가하는 것으로 알려져 있기 때문에, KAI1에 의해 TGF-β1의 발현을 증가시키는 연결고리를 찾기 위해, KAI1 Oever-expression EML세포에 이들의 Inhibitor을 처리한 후, Western Blot을 이용하여 TGF-β1의 발현 및 분비를 확인하였다. 그 결과, 도 29 및 도 30에 나타낸 바와 같이, KAI1은 Erk가 아닌 PKC에 의해 TGF-β1의 발현과 분비를 증가시킴을 확인할 수 있었다.

다음으로, KAI1 Knock-down과 KAI1 Over-expression EML 세포에서, TGF-β1/TGFR의 하위 Pathway로 Smad2과 Smand3의 Phosphorylation, 및 CDK Inhibitor인 p21, p27, p57의 발현 증감여부를 Western Blot을 이용하여 비교하였다. 그 결과 도 31에 나타낸 바와 같이, KAI1 Knock-down에서는 Smad3의 Phosphorylation 뿐만 아니라, p21, p27, p57도 감소함을 확인할 수 있었다. 반대로 Rb의 phosphorylation은 증가하였다. 한편, KAI1을 Over-expression에서는 이와 반대의 결과가 나타남을 확인할 수 있었다.

다음으로, TGF-β1에 의해 CDK Inhibitor가 증가 하는지를 확인하기 위해, KAI1 Over-expression EML 세포에 TGFR Inhibitor를 처리한 결과, 도 32에 나타낸 바와 같이, KAI1 Over-expression EML에 의해 증가된 p21, p27, p57이 TGFR Inhibitor을 처리한 group에서 다시 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 TGF-β1의 중화 항체를 이용하였을 때도 동일하게 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, KAI1 Over-expression에 의한 CDK inhibitor에 변화가 실제로 cell cycle 영향을 주는지 확인하기 위해, FACS를 통해 Mock/, KAI1 O/E EML에 cell cycle을 비교하였다. 그 결과 도 33 및 도 34에 나타낸 바와 같이, KAI1 O/E EML에서 G₀/G₁phase positive cell이 증가(58% vs 75%)해 있었고, EML cell에서 cell cycling을 활성화한다고 알려진 Lin-CD34+ population 보다 Lin-CD34- population이 증가해 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. Ablation 후에 골수의 재구축시 LT-HSC에서 KAI1(CD82)의 역할 확인

ablative intervention 후에 골수의 재구축(reconstruction)과 quiescent LT-HSC를 유지하는데 있어, KAI1의 역할을 확인하기 위해, sub-lethal irradiation을 준 WT mice에 5-FU를 Injection하여 골수에서 KAI1-positive LT HSCs과 proliferating blood cells의 연속적인 변화를 확인하였다. 그 결과 도 35에 나타낸 바와 같이, 5-FU는 actively cycling progenitors 또는 blood cells들의 세포사멸(apoptosis)을 유도하기 때문에, 골수에 있는 세포들의 수가 급격히 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 도 36 내지 도 38에 나타낸 바와 같이, 5-FU 처리로 인한 골수에서 세포들의 감소에 반응하여 새로운 세포들을 공급받기 위해 LT-HSCs에서 KAI1의 발현이 2^ndday부터 감소하기 시작하여 5^thday에 가장 낮은 발현을 보인 후, 2주 차까지 발현이 회복되는 것을 확인 할 수 있었다. 더욱이, LT-HSC KAI1 발현 감소로 5^thday부터 골수에서 분열을 시작하는 세포 수가 증가함을 확인할 수 있었다.

추가적으로, LT-HSCs에서 KAI1이 골수세포의 ablation후에 조혈모세포 회복에 있어 중요하다는 것을 확인하기 위해, sub-lethal irradiation 후에 KAI1-/- 및 WT mice 간 골수에서 total 또는 LSK cells의 회복을 비교하였다. 그 결과, 도 39 및 도 40에 나타낸 바와 같이, KAI1 -/- mice가 WT과 비교하여 골수에서 total 또는 LSK cells의 회복이 낮음을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, Ablation 후에 골수의 reconstruction시 LT-HSC에서 KAI1의 감소가 중요함을 알 수 있었다.

실시예 6. 골수세포 이식 후의 LT-HSC와 long term reconstitution에서 KAI1(CD82)의 역할 확인

먼저, KAI1이 HSCs의 long term repopulating capacity 영향을 주는지 알아보기 위해, competitive BM transplantation (BMT)실험을 하였고, 상기 실험의 개략적인 과정으로 도 41에 나타내었다. 즉, lethally irradiated recipient mice(CD45.1)에 HSPC-enriched 1x10⁵ Lin(-) BM cells (CD45.2, WT) + 5x10⁵competitor cells(CD45.1) 또는 HSPC-enriched 1x10⁵ Lin(-) BM cells (CD45.2, KAI1-/- mice) + 5x10⁵competitor cells(CD45.1)을 이식한 후 16주 후에 골수세포를 수득(harvest)하여 FACS 분석을 하였다. 그 결과, 도 42에 나타낸 바와 같이, KAI1 -/- cells에 Repopulating 능력이 WT cells에 비해 낮음을 확인할 수 있었다.

다음으로, Serial BMT를 통해, Second BMT에서 KAI1 -/- mice의 HSPCs를 받은 mice의 골수세포와 WT mice의 HSPCs를 받은 mice의 골수세포 간의 LSK와 LT-HSCs를 비교하였다. 그 결과, 도 43 및 도 44에 나타낸 바와 같이, KAI1 -/- mice의 HSPCs를 받은 mice의 골수세포가 WT mice의 HSPCs를 받은 mice의 골수세포보다 LSK와 LT-HSCs이 감소해 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로, 각각의 KAI1 -/- mice와 WT 유래한 HSPCs를 받은 mice의 CD34- LSK cells에서 cell cycle을 비교하였다. 그 결과, 도 45에 나타낸 바와 같이, G₀기의 LT-HSCs의 수와 정도가 WT 유래한 HSPCs를 받은 mice에서 더 높음을 확인할 수 있었다. 또한 도 46에 나타낸 바와 같이, LT-HSC의 분화 방향이 KAI1-/- mice에서 유래한 HSPCs를 받은 mice에서 myeloid lineage 쪽으로 향하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7. KAI1 활성과 관련된 리간드(Ligand) 확인

먼저, KAI1의 활성을 증가시키는 Ligand을 찾기 위해, EML 세포에서의 KAI1 항체를 사용하여 Immunoprecipitation을 한 후 DARC(Duffy antigen receptor for chemokines)을 Western blot을 한 결과, 도 47에 나타낸 바와 같이, KAI1이 DARC와 Interaction을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 반대로 DARC을 IP, KAI1을 Western을 하여도 동일한 결과를 얻었다.

다음으로, In vitro 상에서 KAI1과 DARC의 상호 작용을 형광염색을 통해 보여주기 위해, C57 Mouse의 Bone에서 F4/80 양성 세포를 MACS 기법을 이용하여 Sorting 후에 Dish에 seeding 하였고, 두 번째로 C57 Mouse의 HSC enriched population인 Lin(-) 세포를 MACS 기법을 이용하여 Sorting 후에 CFSE로 Tagging 하였다. 상기 두 가지 세포를 공동배양 (co-culture) 후 KAI1과 DARC을 염색을 통해 확인한 결과, 도 48에 나타낸 바와 같이, HSC의 KAI1과 Macrophage의 DARC 각각에 대해 서로 상호 작용 하고 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로, 실제 In vivo에서도 KAI1과 DARC의 상호작용을 확인하기 위해, C57 마우스의 Fimur을 Fixation 후 decalcification을 진행 하였고, 그 후에 Paraffine block을 만들었다. Section 후 Deparaffine 그리고 Retrival 과정을 거친 후 항체를 이용하여 형광염색을 진행하였다. 조혈모줄기세포 표지자로서 CD150, 그리고 KAI1과 DARC을 염색한 결과, 도 49의 (A)에 나타낸 바와 같이, KAI1(+)LT-HSC와 DARC가 서로 상호 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로, Tie2을 발현하는 세포에서만 GFP을 발현하는, Tie2-GFP 마우스의 Fimur을 앞서 설명한 동일한 방법으로 Paraffine block을 만든 후 Section하여 Deparaffine 그리고 Retrival 과정을 거쳐 형광염색을 진행하였다. 여기서 Tie2는 LT-HSC이다. 그 결과, 도 49의 (B)에 나타낸 바와 같이, KAI1(+)LT-HSC와 DARC가 실제 상호작용 하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과들로부터, LT-HSC의 KAI1은 DARC와 상호작용 한다는 것을 알 수 있었다.

다음으로, 골수에서 DARC(+) 세포가 어떤 세포인지를 보기위해, BM에서 특히, HSC을 지지해준다고 알려준 Endothelial cell, Stromal cell 그리고 Monocyte / Macrophage 에서의 DARC의 발현을 확인하였다. Endothelial cell은 CD45(-)Ter119(-)CD31(+)PDGFRa(-)에서, Stromal cell은 CD45(-)Ter119(-)CD31(-)PDGFRa(+)에서, 마지막으로 Macrophage는 F4/80(+)에서 확인하였다. 그 결과, 도 50에 나타낸 바와 같이, Endothelial cell과 Stromal cell에서는 대부분 DARC negative cell이였으며, 그와 반대로 Macrophage는 대부분 DARC Positive 세포임을 확인할 수 있었다.

한편, EML 세포에서 Quiescent 세포 Population으로 알려진 Lin(-)CD34(-)에서는 KAI1이 80%정도 Positive이다. 하지만 세포주기(Cell cycle)가 active한 population에서는 Lin(-)CD34(+)에서는 KAI1이 1%정도로 대부분 KAI1 Negative 세포이다(도 51 참조). 이에, Recombinant DARC에 의한 KAI1 활성 증가를 보기위해 EML cell에서 KAI1(+)가 대부분인 Lin(-)DARC(-)CD34(-) cell을 Magnetic-activated cell sorting (MACS) 기법을 이용하여 Sorting 하였다. 구체적으로 EML cell에 Lineage cocktail과 DARC 그리고 CD34 일차 항체를 넣고 30분 동안 4℃에서 Incubation을 하였고 그 이후에 3번 Washing 과정을 거쳤다. 1차 항체에 맞는 2^nd 항체를 30분 동안 4℃에서 Incubation하였고 3번 Washing 후 Magnetic column을 통해 Lin(-)DARC(-)CD34(-)인 Quiescent EML cell population (qEML) 을 얻었다. 이렇게 얻은 세포을 3시간동안 Stem cell factor가 없는, 1% FBS가 들어있는 IMDM 배양액에 1~3 시간 동안 Starvation을 한 후 rhDARC(recombinant human DARC)을 처리하여 KAI1의 활성에 의한 PKC의 Phosphorylation을 확인하였다. 그 결과, 도 52에 나타낸 바와 같이, rhDARC에 의해 PKCa의 활성이 증가 되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, rhDARC에 의해 KAI1을 활성화 시킬 수 있으며, DARC는 Mouse와 Human의 Homology가 대략 76% 정도로 recombinant human DARC는 mouse에서도 작용 한다는 것을 알 수 있었다. 추가적으로, rhDARC가 KAI1을 통해 PKCa의 phosphorylation을 증가시키는 것을 보기위해 Mock shRNA Lenti virus와 KAI1 shRNA Lentivirus [KAI1 Knock-down]을 EML 세포에 각각 도입한 후에 Lin(-)CD34(-)DARC(-)인 Quiescent EML 세포를 분리한 후에 rhDARC을 처리한 결과, 도 53에 나타낸 바와 같이, rhDARC은 KAI1을 통해 PKCa의 phosphorylation을 증가시킴을 확인하였다.

다음으로, EML 세포에서 이전에 언급한 Lin(-)CD34(-)DARC(-)을 Sorting 한 qEML 세포에 Monocyte을 공배양 하거나 혹은 rhDARC에 의해 실제 qEML의 Cell cycle에서 G0 phase을 유지하는지를 확인하기 위해 cell cycle 분석을 진행 했다. 보다 구체적으로, qEML 세포에 Mock Raw 264.7 세포 그리고 DARC Knock-down Raw 264.7 세포 마지막으로 DARC Knock-down Raw 264.7 세포의 공배양에 더불어서 rhDARC을 전처리한 후에 2일동안 배양한 후에 세포주기를 분석 하였다. 그 결과, 도 54에 나타낸 바와 같이, qEML세포에 Raw 264.7 세포를 공배양하면 G0의 세포가 대략 61%로 높게 유지되는 반면, DARC Knock-down Raw 264.7 세포와 공배양하면 G0 Phase가 감소 하는 것을 확인할 수 있었다. 여기에 rhDARC을 처리하면 효과가 Reverse 되는 것을 확인 하였다. 결론적으로 Mono/Macrophage의 DARC에 의해, qEML 세포의 KAI1을 통해 Quiescence가 유지 되는 것을 확인하였다.

실시예 8. KAI1(+)LT-HSC에서 KAI1 발현의 조절기전 확인

KAI1(+)LT-HSC는 Stress, Mobilization, Emergency niche에서 저항성을 갖고 그 이후 Recovery 과정에서 LT-HSC는 KAI1의 발현이 감소되고, Proliferation 또는 Differentiation 되었다. 이에, LT-HSC의 어떠한 기전에 의해 증가 또는 감소되는지 확인하였다.

먼저, EML 세포는 다양한 Type의 세포들이 일부 섞여 있다. Lin(-)CD34(-)세포로 MACS(magnetic-activated cell sorting)을 이용하여 Sorting 하고 나서 SCF(stem cell factor)을 넣고 배양을 하고, KAI1(+) 세포를 확인한 결과, 도 55에 나타낸 바와 같이, 2일 이내에 KAI1(+) 세포가 12%까지 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, Mouse Macrophage cell line인 Raw 264.7 세포와 co-culture한 후, KAI1(+) 세포를 확인한 결과, 도 55에 나타낸 바와 같이, Raw 264.7 세포와 co-culture하면 Quiescent EML cell에서의 KAI1 발현 세포는 83%로 MACS sorting 이후와 비슷하게 유지가 되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, Macrophage에 의해 LT-HSC의 KAI1 발현은 유지 되며, 이는 직접적인 효과 뿐만 아니라 Paracrine 효과도 있음을 알 수 있었다.

다음으로, G-CSF 혹은 5-FU와 같은 Stress 혹은 Mobilization niche에서는 Raw 264.7세포의 DARC의 발현을 확인한 결과, 도 56 및 도 57에 나타낸 바와 같이, G-CSF 혹은 5-FU와 같은 Stress 혹은 Mobilization niche에서는 DARC의 발현이 감소되며, LT-HSC의 KAI1도 감소됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, LT-HSC의 KAI1 감소는 DARC의 직접 혹은 간접적인 효과에 의한 것임을 알 수 있었다.

다음으로, Raw 264.7 세포의 DARC 발현을 shRNA을 이용하여 감소시킨 후, Total EML cell에서 앞서 설명한 동일한 방법으로 Sorting 하여 Qu iescent EML cell을 SCF을 첨가한 조건으로 Mock Raw 264.7과 DARC knock-down Raw264.7 세포를 동시배양하여 확인한 결과, 도 58에 나타낸 바와 같이, DARC가 감소된 Raw 264.7 세포와 동시배양하는 경우 Quiescen EML 세포의 KAI1 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 Paracrine 효과를 보기위해 Mock과 DARC Knock-down Raw 264.7 상등액을 얻어, EML 세포을 함께 배양 했다. 그 결과, 도 59에 나타낸 바와 같이, Paracrine 효과에 의해서도 KAI1의 발현이 유지되며, DARC Knock-down Raw 264.7 세포로부터 얻은 상등액에서는 Quiescent EML 세포의 KAI1의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

다음으로, KAI1의 감소는 Ubiquitination과 Endocytosis 두 가지 과정에 의해 감소되는바, EML cell로부터 qEML cell을 sorting 하고 SCF을 넣고 배양한 결과, 도 60에 나타낸 바와 같이, Ubiguitine degradation inhibitor인 MG-132을 넣은 조건에서는 KAI1의 발현이 감소하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 qEML을 SCF넣고 배양하면 8시간 후에 KAI1을 IP을 하고 Mono/Poly ubiquitine을 Western을 통해 확인한 결과, 도 61에 나타낸 바와 같이, KAI1의 Ubiquitin 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로 Endocytosis를 평가하기 위해서 앞서 언급한 방법으로 EML에서 MACS를 사용하여 qEML 세포를 얻은 다음 KAI1에 Biotin이 conjugation되어 있는 항체를 4℃에서 1시간동안 Incubation 시킨 후, Bounding 하지 않은 항체는 Washing 하였다. 그리고 나서 qEML 단독, qEML + Mock Raw 264.7 세포, qEML + DARC Knock-down Raw 264.7 , qEML + DARC Knock-down Raw 264.7 + rhDARC, 마지막으로 Endocytosis 과정의 Ubiquitin 과정에 의한 것인지를 확인하기 위해 qEML세포에 MG-132을 전처리 하였다. 그리고 SCF를 모든 그룹에 넣고 3시간 동안 배양을 진행한 후에 Membrane binding 항체는 acidic buffer (50mM Glycine, 100mM NaCl, pH 2.5)를 이용하여 제거하였다. 그리고 Endocytosis된 KAI1-Biotin conjugation을 확인하기 위해 Fixation/Permeabilization 후에 Streptavidin-555 Secondary 항체를 이용하였다. 그 결과 도 62 내지 도 64에 도시된 바와 같이, qEML 단독으로 배양하면 Growth factor 등에 의해 [SCF] KAI1은 Ubiquitination 되어 Endocytosis가 진행되어 KAI1이 감소한다. 하지만 Monocyte/Macrophage을 먼저 공배양 해주면 DARC에 의해 KAI1의 Endocytosis는 감소하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 인간 LT - HSC의 quiescence 유지에서 KAI1(CD82)의 역할 확인

KAI1의 발현이 mouse LT-HSC의 quiescence 유지에 중요하다는 지금까지의 실험 결과를 human에서도 동일하게 적용되는지 확인하기 위해 인간 탯줄 혈관 유래의 제대혈로 실험을 진행하였다. 제대혈은 기증자의 동의하에, heparin으로 코팅된 주사기에 모아져 전달되었다. 그 안에 포함되어 있던 단핵구 세포들은 Histopaque 1077을 이용하여 수득하였다. 이를 LIN, CD38, CD34, CD93, CD45RA 항체로 염색하여 FACS로 분석하였다. 그 결과, 도 65 및 도 66에 나타낸 바와 같이, 인간 LT-HSC인 LIN(-)CD38(-)CD34(-)CD93(+)CD45RA(-) population에서의 KAI1(+) LT-HSC들은 25% 정도를 차지하며, KAI1(-) population과는 달리, 대부분 G0기에 있었음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, human LT-HSC도 KAI1을 발현하며, KAI1을 발현하는 human LT-HSC는 quiescent하다는 것을 알 수 있었다.

추가적으로 human 제대혈에서 첫 번째로, MNC을 얻고 MACS을 이용하여 Lin(+) CD235(+)CD235(+) 세포들을 제거하고, 두 번째로 FACS을 이용하여 KAI1(+)LT-HSC와 KAI1(-)LT-HSC을 Sorting 하였다. 그리고 나서 3시간동안 Starvation을 후에 rhDARC을 처리한 후 30분 뒤에 Fixation/Permeabilization 후에 형광염색을 통해 PKC alpha의 phsphorylation을 확인하였다. 그 결과, 도 67에 나타낸 바와 같이, human에서도 rhDARC에 의해 KAI1(+)LT-HSC에서 PKA alpha의 pohosphrylation이 증가 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, rhDARC에 의해 KAI1(+)LT-HSC의 Quiescent가 증가 하는지를 확인하는 실험을 하기 위해 human 제대혈에서 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 MNC을 얻고 Lin(+)CD235(+)DARC(+) 세포를 제거한 후에 3시간 동안 Starvation 과정 후에 rhDARC을 처리 후 2일 후에 세포주기를 분석 하였다. 그 결과 도 68에 나타낸 바와 같이, KAI1(+)LT-HSC에서 rhDARC에 의해 G₀ phase가 증가 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, Human에서도 동일하게 확인한 결과, 도 69에 나타낸 바와 같이, Cord blood에서도 마찬가지로 Monocyte/Macrophage 표지자인 CD14 Positive 세포에서 대부분 DARC Positive 세포 인 것을 확인할 수 있었다.

마지막으로 Monocyte에 의해 LT-HSC의 KAI1의 발현이 Human에서도 조절되는지 확인하기 위해, 제대혈에서 동일한 방법으로 Lin(-)CD235(-)DARC(-) 세포를 얻고, 같은 제대혈에서 일부는 MACS을 이용하여 Monocyte을 [Un-touched monocyte] 분리했다. Growth factor에 의해 [SCF, Flt3-ligand, TPO, IL-3] HSC 단독 배양을 하면, 도 70에 나타낸 바와 같이, KAI1이 감소하지만 Monocyte와 공배양 혹은 rhDARC에 의해 KAI1의 발현이 감소하지 않고 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들의 내용을 종합하여 도 71에 나타내었다. 도 71에 나타낸 바와 같이, 첫 번째, Homeostasis 단계에서 Monocyte/Macrophage의 DARC에 의해 LT-HSC의 KAI1을 자극하여 [KAI1의 Phosphorylation 증가] PKCa을 phosphorylation 시키고 그리고 TGFb의 증가, TGFR1&2을 통해 Smad2/3을 경유하여 CDK inhibitor인 p21, p27, p57을 증가시켜 phospho-Rb을 감소킴으로써 LT-HSC의 Quiescence을 유지시킨다. 두 번째로, 5-FU, G-CSF 등과 같은 Emergency/Mobilization/Stress niche에 의한 상황이 되면, Monocyte/Macrophage의 DARC의 발현 감소 혹은 Monocyte/Macrophage 수의 감소에 의해 KAI1/DARC의 Complex는 깨지게 되고, 그로인해 주변의 Growth factor 등에 의해 LT-HSC의 KAI1은 Ubiquitination 되고 Endocytosis 된다. 그로 인해 KAI1(-)된 LT-HSC는 Cell cycle과 Differentiation이 증가 되어, 결국 Bone marrow Regerenation이 일어난다. Bone marrow regeneration으로 DARC(+)Monocyte/Macrophage는 다시 증가한다. 특히, KA1I(-)LT-HSC은 증식과 Monocyte/Macrophage로 분화가 될 수 있다. 그로 인해 LT-HSC의 KAI1은 다시 증가하여 Homeostasis을 유지할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> KAI1 PROTEIN CONTROLING CELL CYCLE OF HEMATOPOIETIC STEM CELL, AND USES THEREOF <130> PB14-12384 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens CD82 <400> 1 Met Gly Ser Ala Cys Ile Lys Val Thr Lys Tyr Phe Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Phe Gly Val 20 25 30 Trp Ile Leu Ala Asp Lys Ser Ser Phe Ile Ser Val Leu Gln Thr Ser 35 40 45 Ser Ser Ser Leu Arg Met Gly Ala Tyr Val Phe Ile Gly Val Gly Ala 50 55 60 Val Thr Met Leu Met Gly Phe Leu Gly Cys Ile Gly Ala Val Asn Glu 65 70 75 80 Val Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Ala Phe Leu Leu Leu Ile Leu 85 90 95 Ile Ala Gln Val Thr Ala Gly Ala Leu Phe Tyr Phe Asn Met Gly Lys 100 105 110 Leu Lys Gln Glu Met Gly Gly Ile Val Thr Glu Leu Ile Arg Asp Tyr 115 120 125 Asn Ser Ser Arg Glu Asp Ser Leu Gln Asp Ala Trp Asp Tyr Val Gln 130 135 140 Ala Gln Val Lys Cys Cys Gly Trp Val Ser Phe Tyr Asn Trp Thr Asp 145 150 155 160 Asn Ala Glu Leu Met Asn Arg Pro 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Leu Phe Ser Ile Ala Val Pro 100 105 110 Ile Leu Ala Pro Gly Leu His Ser Ala His Ser Thr Ala Leu Cys Asn 115 120 125 Leu Gly Tyr Trp Val Trp Tyr Thr Ser Ala Phe Ala Gln Ala Leu Leu 130 135 140 Ile Gly Cys Tyr Ala Cys Leu Asn Pro Arg Leu Asn Ile Gly Gln Leu 145 150 155 160 Arg Gly Phe Thr Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu Trp Gly Ala Ala Ala 165 170 175 Leu Leu Gly Leu Pro Val Ala Leu Ala Ser Asp Ala Tyr Asn Gly Phe 180 185 190 Cys Ala Phe Pro Ser Ser Arg Asp Met Glu Ala Leu Lys Tyr Met His 195 200 205 Tyr Ala Ile Cys Phe Thr Ile Phe Thr Val Leu Pro Pro Thr Leu Leu 210 215 220 Ala Ala Lys Gly Leu Lys Ile Ala Leu Ser Lys Gly Pro Gly Pro Trp 225 230 235 240 Val Ser Val Leu Trp Ile Trp Phe Ile Phe Trp Trp Pro His Gly Met 245 250 255 Val Leu Ile Phe Asp Ala Leu Val Arg Ser Lys Ile Val Leu Leu Tyr 260 265 270 Thr Cys Gln Ser Gln Lys Ile Leu Asp Ala Met Leu Asn Val Thr Glu 275 280 285 Ala Leu Ser Met Leu His Cys Val Ala Thr Pro Leu Leu Leu Ala Leu 290 295 300 Phe Cys His Gln Thr Thr Arg Arg Ser Leu Ser Ser Leu Ser Leu Pro 305 310 315 320 Thr Arg Gln Ala Ser Gln Met Asp Ala Leu Ala Gly Lys Ser 325 330 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9 forward primer <400> 5 agtgcatcaa atacctgctc ttc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9 reverse primer <400> 6 ctttaatcac ctcatccttg tgg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD37 forward primer <400> 7 cttcgttttc aacctcttct tct 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD37 reverse primer <400> 8 aactgtgcat agtcccaact ctc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD81 forward primer <400> 9 ttctacgtgg gcatctacat tct 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD81 reverse primer <400> 10 gctgttcctc agtatggtgg tag 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD151 forward primer <400> 11 tgcctcaagt acctgctctt tac 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta R2 forward primer <400> 28 catcttctac tgctaccgtg tcc 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta R2 reverse primer <400> 29 atgttctcat gcttcaggtt gat 23

Claims

KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 조혈모세포의 세포 주기 조절용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 KAI1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 DARC 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조혈모세포는 장기간 조혈모세포(Long-term Hematopoietic stem cell, LT-HSC)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 조혈모세포의 GO기를 유지하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 PKC를 통해 TGF-β1 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
KAI1(CD82) 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈액 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 DARC 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제8항에 있어서,
상기 KAI1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서,
상기 DARC 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제8항에 있어서,
상기 혈액종양은 림프종, 다발성 골수종, 골수성 백혈병 및 림프구성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
하기의 단계를 포함하는, 스트레스에 대한 저항성을 갖는 조혈모세포의 정제방법:
(a) 분리된 조혈모세포집단에서 KAI1의 발현여부를 분석하는 단계; 및
(b) KAI1이 발현된 조혈모세포만을 분리하여 수득하는 단계.
제13항에 따른 방법에 의해 정제된 조혈모세포를 포함하는, 혈액 종양 치료용 세포 치료제.
조혈모세포에서 KAI1의 발현을 증가시키는 단계를 포함하되, 상기 조혈모세포는 장기간 조혈모세포(Long-term Hematopoietic stem cell, LT-HSC)인, 정지 조혈모세포를 수득하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 조혈모 세포와 rhDARC, DARC 양성 단핵구(Monocyte), DARC 양성 대식세포(Macrophage) 또는 DARC 양성 대식세포(Macrophage) 배양액과 공배양 하여 KAI1의 발현을 증가 또는 유지시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
제15항 또는 제16항의 방법에 의해 수득되는 정지-조혈모 세포.
제17항에 있어서, 상기 정지 조혈모세포는 체내 이식 효율이 증대되거나, 증식성, 분화성, 보관성 또는 안정성이 증대된 것을 특징으로 하는, 정지-조혈모세포.
제17항에 있어서, 상기 정지-조혈모세포는 장기 이식 또는 재생 능력을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 정지-조혈모세포.