KR20160127971A

KR20160127971A - 골아세포분화 및 혈관신생 촉진 아미노산 펩타이드 bone forming peptide 5(BFP5)에 대한 용도

Info

Publication number: KR20160127971A
Application number: KR1020150059575A
Authority: KR
Inventors: 윤택림; 김형근; 선종근; 김지현; 강주연
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 전남대학교병원
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2016-11-07
Also published as: US10221227B2; EP3290435B1; EP3290435A4; CN106084029B; CN106084029A; EP3290435A1; US20160318984A1; KR101747824B1; WO2016175532A1

Abstract

본 발명은 골아세포 분화 및 혈관신생 촉진에 유효한 단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 골아세포분화 또는 골형성 활성 및 혈관신생 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

골아세포분화 및 혈관신생 촉진 아미노산 펩타이드 bone forming peptide 5(BFP5)에 대한 용도{Peptide for promoting osteogenesis or vascularization and use thereof}

본 발명은 골아세포 분화 또는 혈관신생 촉진에 유효한 단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 골아세포분화 활성 또는 혈관신생 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

뼈의 감소는 골량의 변화에 의한 영향을 많이 받게 되는데 이러한 골량의 변화에 대한 주요 요인으로는 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받고, 최근에는 노화, 운동 부족, 저칼슘 식이, 폐경 또는 난소 절제 등에 의하여 뼈의 감소와 함께 골다공증을 유발하는 것으로 알려져 있다.

골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 골밀도가 엷어지고 골수강이 넓어지면서 증세가 진전됨에 따라 뼈가 매우 약해져서 작은 충격에도 골절 같은 뼈 관련 질환의 발생이 쉽게 나타난다.

개인차는 있지만 백인보다는 흑인의 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 일반적으로 14 내지 18세에 골량이 가장 높고 노년에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히, 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이때 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고, 이로 인하여 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 되는 것이다.

따라서, 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 고령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.

또한, 뼈와 관련된 질환으로는 골다공증 이외에도 골관절염(osteoarthritis) 및 골결손질환 등이 있는데, 골관절염은 관절의 연골이 손상되면서 국소적으로 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로 퇴행성관절염이라고도 한다. 크게 두 가지 원인이 있는데 관절의 연골이나 뼈는 정상적인데 비해 관절에 과도한 부하가 걸려 관절 조직이 손상을 받거나, 부하는 정상적인데 비해 관절의 연골이나 뼈가 약한 경우이다.

골결손 질환은 인체의 여러 부위에서 나타날 수 있는데, 그 주된 원인으로 골질 손실을 동반한 급성 외상, 수술 중 조직제거로 인한 골손실을 동반한 급성외상, 골 절제(boneresection)를 수반한 만성 감염, 분절성 골결손을 동반한 만성 불유합 등을 들 수 있다.

이와 같은 골질환 치료와 관련되어 전세계적으로 약 1,300억 달러 이상의 시장이 형성되어 있으며 그 규모는 향후 계속적으로 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.

특히 골다공증을 예로 들어 살펴보면 현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있고, 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를, 1997년 미국 릴리사(Lilly Co.)에서는 선택적인 에스트로젠 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 라록시펜(raloxifene)을 골다공증 치료제로 개발한 바 있다.

한편, 골다공증 치료제로서 골흡수 억제제인 에스트로겐이 가장 널리 사용되고 있으나, 에스트로겐의 상용이 자궁내막암, 유방암의 발생빈도를 증가시키고, 혈전증, 담석증, 고혈압, 부종, 유방통 등을 유발시킬 수 있으며, 폐경 후 에스트로겐과 프로게스테론을 동시 투여한 여성을 추적 관찰한 결과, 유방암, 뇌졸중, 폐색전 등의 발생률이 높다는 것이 증명되었다.

이외에도 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제 또는 칼슘 제제 등이 골다공증 치료제로서 사용되나, 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지며 복용방법이 까다롭고 식도염을 유발시키며, 비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 용이하지 않으며, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다. 더욱이, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이다. 따라서, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 기존의 치료물질을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.

현재, 뼈 형태 발생 활성은 TGF(형질 전환 성장 인자)-β 수퍼패밀리에 속하는 뼈 형태 발생 인자 BMP에 대해서 보고되어 있다(Science 150, 893-897, 1965; Science 242; 1528-1534, 1988). 알려진 BMP종은 BMP-1 내지 BMP-14이다. 이 중, BMP-2 내지 BMP-14는 뼈 형태 발생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. BMP-2 내지 BMP-14의 BMP는 여러 가지 뼈 기능 장애 및 뼈 질환의 치료적 처치에 효과적인 것으로 여겨지고 있지만, 이들은 자연계에 극소량으로 존재한다.

따라서, 이러한 처치에 이용되는 BMP-2 내지 BMP-14를 입수가능하게 다량으로 얻는 데는 재조합 단백질의 제조를 필요로 한다. 재조합 단백질의 제조는 일반적으로 저분자량 화합물에 비해 비용이 많이 소요된다. 다른 한편, 그의 단백질적 특성 때문에 물성 및 투여의 면에서 의약으로서는 많은 제약이 있다. 이러한 점들을 고려하여 본 발명자들은 상기 BMP 단백질과 동일한 활성을 갖는 저분자량 유기 화합물로서 15개의 아미노산 서열로 이루어진 BFP1(Bone Peptide Protein 1)을 개발한 바 있다.

본 발명자들은 천연 골형성단백질(BMP)과 동일하거나 우수한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 BMP보다 저가생산이 가능하고 안정성이 우수한 펩타이드를 제조하고자, 다양한 종류의 인간 유래 단백질로부터 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성이 우수할 뿐만 아니라 안정성도 우수한 펩타이드를 선택함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 골아세포 또는 혈관내피세포에 작용하여 분화를 촉진함으로써 분화인자 활성을 나타내는 케모카인(Chemokines) 유래 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 골아세포분화인자 또는 골형성인자-유효성 또는 혈관신생인자 유효성의 질환 또는 상태(conditions)의 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생촉진인자활성을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 허혈성괴사를 포함한 혈관질환의 개선 또는 치료에 유효한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 저분자량 유기 화합물로서 15개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하므로, 부작용이 없고 약효가 우수하면서도 생산단가가 상대적으로 낮은 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 골아세포분화인자 또는 골형성인자의 활성을 갖는 펩타이드를 포함하여 골아세포분화 또는 골형성 속도를 실험자의 의도에 따라 조절할 수 있는 골아세포 분화배지조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 분화인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 세포의 분화 촉진능을 갖는다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 세포는 골아세포 또는 혈관내피세포이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 SDF-1d 단백질로부터 유래된다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 또는 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골관절염 치료 또는 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골결손질환 치료 또는 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골아세포분화배지조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관질환 치료 또는 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 혈관질환은 허혈성괴사이다.

본 발명의 효과는 다음과 같다.

먼저, 본 발명의 펩타이드는 골아세포 또는 혈관내피세포에 작용하여 분화를 촉진함으로써 분화인자 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 골아세포분화인자 또는 골형성인자-유효성 또는 혈관신생인자 유효성의 질환 또는 상태(conditions)의 개선 또는 치료에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 저분자량 유기 화합물로서 15개의 아미노산 서열로 이루어지므로, 부작용이 없고 약효가 우수하면서도 생산단가가 상대적으로 낮은 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생촉진인자활성을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 허혈성괴사를 포함한 혈관질환의 개선 또는 치료에 유효하게 작용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 분화인자활성을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 골다공증, 골관절염 또는 골결손질환의 개선 또는 치료에 유효하게 작용할 수 있다.

또한, 본 발명의 골아세포분화배지조성물은 분화인자활성을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 골아세포분화 또는 골형성 속도를 실험자의 의도에 따라 조절할 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드 BFP 5의 아미노산 서열이다.
도 2는 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드 BFP 5의구조도이다.
도 3은 BFP 5에 의한 골아세포분화를 통해 축적되는 미네랄리제이션을 측정하는 알리자린 레드 염색을 통하여 확인한 결과 사진이다.
도 4는 BFP 5에 의해 골아세포 특정 유전자인 알칼라인포스파타아제가 발현되는 정도를 측정하는 실험 결과 그래프이다.
도 5는 BFP 5에 의해 골아세포 특정 유전자들인 렁스2, 알칼라인포스파타아제, 오스테오폰틴, 콜라겐 타입1, DLX5, 오스트릭스의 유전자가 발현되는 정도를 측정한 실험결과 사진이다.
도 6은 BFP 5가 골아세포에서 발현되는 단백질인 알칼라인포스파타아제와 오스트릭스가 발현되는 정도를 측정한 실험결과 사진이다.
도 7은 BFP5를 농도별로 처리하고 골아세포에서 발현되는 단백질인 알칼라인포스파타아제의 발현정도를 관찰한 결과 사진이다.
도 8은 BFP5를 농도별로 처리하고 골아세포에서 발현되는 단백질인 오스트릭스의 발현정도를 관찰한 결과 사진이다.
도 9는 세포에 VEGF, FGF, SDF-1a, SDF-1g와 함께 BFP5를 처리하여 BFP5가 혈관신생에 관련하여 미치는 효과를 관찰한 결과사진이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다. 다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 및 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명자들은 천연 골형성단백질(BMP)과 동일하거나 우수한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 BMP보다 안정성이 우수하고 저가로 생산 가능한 펩타이드를 제조하고자, 다양한 종류의 인간 유래 단백질로부터 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성이 우수할 뿐만 아니라 안정성도 우수한 펩타이드를 선택하였다.

특히, 본 발명자들은 BMP의 기능과 관련 있는 부위에 기초하여 본 발명의 펩타이드를 합성한 것이 아니라 인간 케모카인(Chemokines) 중 특정 부위를 기초로 합성한 것에 그 기술적 특징이 있다. 즉, C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12)로 알려진 stromal cell-derived factor 1 (SDF-1)의 델타형의 일부부위를 기초로 합성하였기 때문이다.

사실, 케모카인은 선택적으로 백혈구 소집단의 세포접합, 화학유인작용, 활성화 등을 조절하는 사이토카인으로 세포 유주를 주된 작용으로 하며, 4개의 보존된 시스테인 잔기를 가지는 분자량 10kD(90~130 a.a) 정도의 물질로서 연속된 두개의 cystein의 위치에 따라 CC chemokine과 CXC chemokine의 두 가지 종류로 구분되는데, 사실상 골아세포 분화기능은 가지고 있지 않다.

본 발명의 펩타이드는 SDF-1d-유래의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함 한다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 도 1에 도시된 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다. 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열에 개시된 바와 같이 15개의 아미노산으로 구성된 새로운 서열을 갖는데, 본 발명자들은 서열목록 제1서열의 펩타이드를 bone forming peptiede 5 (BFP 5)로 명명하였다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

서열목록 제1서열 펩타이드는 천연 BMP 또는 케모카인 중 하나 이상과 유사한 작용을 수행하여 수용기와 결합하여 분화인자와 같은 기능을 수행한다. 특히 골아세포 또는 혈관내피세포의 분화를 촉진하는 기능을 한다.

본 발명의 펩타이드는 천연 BMP 또는 케모카인과 거의 동일하거나 더 우수한 활성으로 생리활성을 발휘할 뿐만 아니라, 열안정성 및 산과 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성이 우수하다. 따라서, 상기 우수한 장기 보존성을 가지는 본 발명의 펩타이드는 의약품 및 의약외품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.

따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 1일 당 0.0001-100㎍이고, 바람직하게는 0.0001-1㎍/ml이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

실시예

Pro-Pro-Arg-Ala-Cys-Pro-Thr-Ala-Arg-Ala-Leu-Cys-Glu-Ile-Arg(서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin: CTL resin, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Arg(pbf)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척 하여 Arg(pbf)-CTL Resin을 제조하였다.

새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Ile-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합 용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Ile-Arg(pbf)-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Glu, Fmoc-Cys(trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Ala, Fmoc-Arg, Fmoc-Ala, Fmoc-Thr, Fmoc-Pro, Fmoc-Cys(trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Arg, Fmoc-Pro 및 Fmoc-Pro 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Pro-Pro-Arg-Ala-Cys-Pro-Thr-Ala-Arg-Ala-Leu-Cys-Glu-Ile-Arg-OH 펩타이드를 0.65 g 합성하였다(수율: 93%).

실험예 1

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열의 구조를 확인하기 위하여 온라인의 PEP-FOLD 서버에서 제공하는 프로그램을 이용하여 15개 아미노산 서열을 넣어 확인하고 그 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2로부터, 서열목록 제1서열의 펩타이드가 알파-나선구조를 가지고 있음을 관찰할 수 있었다.

실험예 2

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP5의 골아세포분화 활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. 골아세포 및 골아세포분화배지의 준비

10% FBS가 첨가된 DMEM에 1x10⁴개의 중간엽 줄기세포(Balb/c mouse bone marrow stromal cell로부터 클론됨)가 들어가도록 분주한 후, 약 3일 동안 약 37℃의 온도를 유지하는 5%의 이산화탄소가 함유된 대기속에서 배양하여 본 실험에 사용되는 골아세포로서 상기 중간엽 줄기세포가 준비되었다. 골아세포 분화 배지(osteogenic differentiation medium: 이하"ODM")는, 50㎍/㎖ 아스코르브산, 10^-8M 덱사메타손 및 10mM 베타-글리셀로포스페이트 등이 첨가된 DMEM으로 이루어진다.

2. 미네랄리제이션의 측정

상기 중간엽줄기세포가 골아세포로 분화가 이루어지면 칼슘이 축적 되는데, 이때 칼슘이온의 축적 정도는 골아세포의 분화정도를 의미하고, 칼슘이온의 축적정도는 알리자린 염색을 통하여 붉은색으로 염색이 되는 정도를 관찰하면 확인할 수 있는 점에 착안하여 알리자린 레드 염색을 통하여 미네랄리제이션을 측정하였다. 즉 골아세포로 분화가 촉진될수록 알리자린 레드에 의해 염색되는 부분이 많이 이루어지기 때문이다. 따라서 골아세포 분화배지에 알리자린 레드를 넣고 서열목록 제1서열 펩타이드(BFP 5)를 처리한 후 알리자린 레드의 염색정도를 보고 골아세포 분화 정도를 확인할 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 상기 골아세포 분화 배지에 준비된 골아세포 즉 중간엽 줄기세포를 옮겨서 3일 동안 배양한 후, BFP 5를 0.01㎍/㎕, 0.1㎍/㎕, 1㎍/㎕, 10 ㎍/㎕씩 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다. 그 후, 배양된 상기 중간엽 줄기세포를 얼음에 냉각시킨 70% 에탄올로 한 시간 동안 고정하고, 알리자린 레드-s(alinzarin red-s)용액으로 약 10분 동안 염색하여 칼슘의 침착정도로 무기질화를 확인하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP5에 의한 골아세포분화를 통해 축적되는 미네랄리제이션을 측정하는 알리자린 레드 염색을 통하여 확인한 결과 사진인 도3으로부터, 1㎍/㎕의 BFP 5가 들어간 세포에서 가장 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있었고, BFP1을 이용하여 골아세포 분화를 확인한 결과와 비교해 보면, 본 발명의 BFP 5와 비교하여 동등하거나 더 약한 정도로 염색됨을 확인할 수 있었다. 또한, 케모카인 SDF 1α의 골아세포분화능은 알려진 바 없었으나 실험결과 약한 염색을 확인할 수 있어 골아세포분화를 촉진할 수 있는 기능을 갖는 것으로 보인다. 따라서, 케모카인 유래 합성 펩타이드인 BFP 5가 BMP-7 유래 합성 펩타이드인 BFP 1과 비교하여도 동등하거나 그 이상의 골아세포 분화를 촉진능을 갖는 것을 알 수 있다.

실험예 3

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5에 의해 골아세포 특정 유전자인 알칼라인포스파타아제가 발현되는 정도를 측정하는 실험을 골아세포에서 발현되는 효소인 알칼라인포스파타아제의 효소활성을 키트를 이용하여 수행하였고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 골아세포로 분화가 이루어지게 되면, 골아세포 특정 유전자가 발현이 나타나는데, 특히 역전사유전자증폭(RT-PCR)을 이용하여 골아세포 특정 유전자인 알칼리포스파타아제의 발현을 측정하였는데, 알칼라인포스파타아제가 1㎍/㎖의 BFP 5 농도에서 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다.

실험예 4

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5가 골아세포분화 활성에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 골아세포 특정 유전자들인 렁스2, 알칼라인포스파타아제, 오스테오폰틴, 콜라겐 타입1, DLX5, 오스트릭스의 유전자가 BFP 5 에 의해 발현되는 정도를 항체를 이용하여 형광현미경 분석하고 그 결과사진을 도 5에 각각 나타내었다.

도 5로부터, 골아세포에서 발현되는 유전자들인 렁스2, 알칼라인포스파타아제, 오스테오폰틴, 콜라겐 타입1, DLX5, 오스트릭스의 유전자가 BFP5를 처리한 세포에서 강하게 발현됨을 관찰할 수 있었다.

즉, 골아세포로 분화가 이루어지게 되면 골아세포 특정 단백질의 발현이 나타나는데, 이러한 단백질의 발현을 이들 단백질에 대한 항체를 세포에 반응시켜 결합한 정도를 형광현미경을 이용하여 확인한 결과, 알칼라인포스파타아제(alkaline phosphatase)는 골형성의 지표가 되는 효소로서 골아 세포의 분화 중기에 생성되는데, 알칼라인포스파타아제는 BFP 5에서 발현이 강하게 나타남을 확인할 수 있었고,렁스-2(Runx-2) 역시 골아세포에서 골아세포 특정 단백질을 생산하는데 중요한 작용을 하는 전사조절인자로서, 골아세포 분화에 중요한 역할을 수행한다. 이러한 렁스-2 역시 BFP 5에서 발현이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.

실험예 5

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5가 골아세포분화 활성에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 골아세포에서 발현되는 단백질의 발현을 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 도시된 바와 같이, 알칼라인포스파타아제와 오스트릭스가 BFP5에 의해 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다.

실험예 6

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5의 골아세포분화 활성에 미치는 유효한 농도를 확인하기 위해 BFP5를 농도별로 처리하고 골아세포에서 발현되는 단백질인 알칼라인포스파타아제의 발현정도를 관찰하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7로부터, 골아세포분화 활성에 미치는 BFP 5가 0.1 내지 1㎍/㎖로 처리되면 가장 골아세포가 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5의 골아세포분화 활성에 미치는 유효한 농도를 확인하기 위해 BFP5를 농도별로 처리하고 골아세포에서 발현되는 단백질인 오스트릭스의 발현정도를 관찰하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8로부터, 골아세포분화 활성에 미치는 BFP 5가 0.1㎍/㎖로 처리되면 가장 골아세포가 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 8

실시예에서 제조된 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5가 혈관신생과 관련하여 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 세포에 VEGF, FGF, SDF-1a, SDF-1g와 함께 BFP5를 처리하여 BFP5가 혈관신생에 관련하여 미치는 효과를 관찰하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9로부터, 혈관신생에 관련된 단백질인 VEGF의 발현을 확인한 결과, BFP5를 처리한 세포에서 VEGF의 발현이 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 실험결과들로부터 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5가 종래에 골아세포분화를 촉진하는 것으로 알려진 BMP-7이나 BFP 1보다 더 골아세포 분화 촉진에 중요한 영향을 미치게 되므로 BMP-7과 동일하거나 그 이상의 골형성 강도를 가지고 더 넓은 범위에서 빠른 골형성을 유도할 수 있는 것을 분명히 알 수 있다. 또한, 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5가 BFP1보다 상당히 낮은 처리 농도에서 동일하거나 그 이상의 골형성촉진 기능성을 갖는 것이 명백하다.

그 결과 본 발명의 약학조성물은 골다공증 및/또는 골관절염에 유효한 치료제로 작용할 수 있다. 또한, 동일하게 본 발명의 약학조성물을 골결손질환의 골결손 부위에 채워넣거나 투여하게 되면 골형성촉진을 통해 골수복을 효과적으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 혈관신생촉진인자활성을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 허혈성괴사를 포함한 혈관질환의 개선 또는 치료에 유효한 치료제로 작용할 수 있다.

한편, 구체적인 실시예로 제시하지는 않지만 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드인 BFP 5를 골아세포분화배지조성물에 첨가하게 되면 골아세포를 이용하는 실험시 실험자가 실험속도를 조절할 수 있어 용이하게 실험을 수행할 수 있는 것은 당연하다할 것이다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속한다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Peptide for promoting osteogenesis or vascularization and use thereof <130> DPP-2015-0036-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BFP 5 derived from stromal cell-derived factor 1 <400> 1 Pro Pro Arg Ala Cys Pro Thr Ala Arg Ala Leu Cys Glu Ile Arg 1 5 10 15

Claims

서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 분화인자 활성을 나타내는 펩타이드.
제 1 항에 있어서,
상기 펩타이드는 세포의 분화 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 2 항에 있어서,
상기 세포는 골아세포 또는 혈관내피세포인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서,
상기 펩타이드는 SDF-1d 단백질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 또는 개선용 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골관절염 치료 또는 개선용 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골결손질환 치료 또는 개선용 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골아세포분화배지조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관질환 치료 또는 개선용 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 혈관질환은 허혈성괴사인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.