KR20160106175A - 에놀라아제 1 조성물들 및 이의 용도 - Google Patents

에놀라아제 1 조성물들 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근육 전달용 Eno1 를 포함하는 조성물들을 제공한다. 또한, 본 발명은 상승된 혈당을 가진 피험자의 혈당을 정상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피험자에게 에놀라아제 1(enolase 1, Eno1)을 투여함으로써, 피험자의 혈당을 정상화하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 피험자의 내당능 장애, 인슐린 저항성, 당뇨병전증, 및 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 포함하는 하나 이상의 병태를 치료하는 방법들을 제공하며, 상기 방법은 상기 피험자에게 에놀라아제 1(Eno1)을 투여함으로써 피험자의 병태를 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 일부 방법들에서, Eno1은 근육으로 전달된다.

Description

에놀라아제 1 조성물들 및 이의 용도{Enolase 1 (ENO1) Compositions and Uses thereof}
연관 출원
본 출원서는 2014년 1월 13일자에 출원된 미국 가특허 출원 제61/926,913호, 2014년 6월 9월자에 출원된 미국 가특허 출원 제62/009,783호, 및 2015년 1월 7일자에 출원된 미국 가특허 출원 제62/100,881호 대한 우선권을 주장하며, 이들 문헌 각각은 전체로서 본 발명에 포함된다.
서열 목록 제출
본 출원서와 연관된 서열목록은 EFS-Web을 통한 전자형태로 제출되고, 이의 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 서열목록을 포함하는 텍스트 파일명은 119992_10620_Sequnece_Listing이다. 본 텍스트 파일의 크기는 33 KB이고, 본 텍스트 파일은 2015년 1월 13일자에 생성되었다.
식후 혈당 수치 상승시, 인슐린이 분비되어 말초 조직(골격근 및 지방) 세포를 자극하여 혈액에서 글루코스를 에너지원으로 활발하게 사용하게 한다. 인슐린 분비 또는 작용의 장애로 유발되는 혈당항상성유지의 결손은 일반적으로 당뇨병과 같은 대사장애를 초래하며, 이는 비만과 동반되어 유발될 수 있거나 비만에 의해 더욱 악화될 수 있다. 이러한 상태는 삶의 질을 떨어뜨리거나 또는 심지어 치명적일 수 있으므로, 혈류에서 글루코스 소모가 적절하게 되게끔 회복시켜주는 전략이 요구된다.
당뇨병은 췌장에 심각한 손상을 유발하는 질환들에(예를 들어, 췌장염, 종양, 코르티코스테로이드 또는 펜타미딘와 같은 특정 약물 투여, 철분 과다(즉, 혈색소증), 후천적 또는 유전적 내분비질환, 및 외과절제) 의해 2차적으로 발생될 수도 있지만, 가장 흔한 형태의 당뇨병은 일반적으로 인슐린 신호전달 시스템의 일차성 장애로부터 발생된다. 당뇨병의 두 가지 주요한 타입으로 제1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병(insulin dependent diabetes, IDDM)) 및 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병(insulin independent 또는 non-insulin dependent diabetes, NIDDM))이 있으며, 상기 두 타입은 각기 다른 발병 메카니즘에도 공통적인 장기간 합병증을 보인다.
제1형 당뇨병은 모든 1차성 당뇨병 사례중 약 10%를 차지를 하며, 췌장에서 인슐린 생성 베타 세포의 광범위한 파괴가 특징인 장기특이적 자가면역질환이다. 이로 인한 인슐린 생성의 감소는 불가피하게 글루코스 대사 장애를 초래한다. 인슐린 투여는 상기 당뇨병 환자에게 큰 도움이 되지만, 혈청에서 짧은 인슐린의 반감기가 정상혈당을 유지하는 데 있어 주요한 장애가 된다. 대체 치료 방법으로 췌도 이식이 있지만, 이 방법은 지금까지 제한적으로만 성공했다.
제2형 당뇨병은 대부분의 당뇨 환자들에게 영향을 미치며, 인슐린 분비 장애 및/또는 말초 조직의 감소된 인슐린 반응, 즉, 인슐린 저항성이 있는 것이 특징이다. 제2형 당뇨병의 발병과정은 명확하지는 않지만, 역학 연구를 통해서 볼 때 상기 당뇨병 타입은 복합적인 유전적 결함 또는 다형성의 누적이 그 원인일 수 있으며, 이러한 유전적 요인들은 각기 발병 감수성을 높이고 과체중, 다이어트, 운동부족, 약물, 및 과음 등의 환경적 요인에 의해 영향을 받는다고 한다. 제2형 당뇨병의 관리를 위한 다양한 치료법이 있지만, 다양한 부작용들이 초래되어 심신을 약화시킬 수 있다. 그래서, 제2형 당뇨병 진단을 받았거나 증상이 있는 환자들은 체중 감소, 식단 변화, 운동, 및 적절한 음주와 같은 건강한 생활 방식을 취하도록 자주 권고를 받는다. 하지만, 그러한 생활 방식의 변화만으로는 당뇨병으로 인한 혈관 및 장기 손상을 되돌리기에 충분하지 않다.
본 발명은 에놀라아제 1 조성물들 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 근육 전달용인 에놀라아제 1(Eno1) 또는 이의 단편을 포함하는 조성물들을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명을 상승된 혈당을 가진 피험자의 혈당을 정상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 혈당은 정상화된다. 하나의 양태에서, 내당능 장애, 인슐린 저항성, 당뇨병전증, 및 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 포함하는 하나 이상의 병태가 있는 피험자를 치료하는 방법들을 제공하며, 상기 방법은 상기 피험자에게 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 병태가 치료된다. 본 발명의 일부 방법들에서, Eno1은 근육으로 전달된다.
본 발명은 근육 세포 전달용인 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구체예들에서, Eno1는 Eno1 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1는 Eno1 핵산, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno 1은 인간 Eno1, 예를 들어, 인간 Eno1 폴리펩타이드 또는 인간 Eno1 핵산, 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조성물은 미세입자를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 나노입자를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1 또는 이의 단편은 생물학적으로 활성이다. 일부 구체예들에서, Eno1 또는 이의 단편은 정제된 내생(endogenous) 인간 Eno1 폴리펩타이드의 활성의 최소 90%의 활성을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 조성물은 인시츄 형성(in situ forming) 조성물을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 리포좀을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 덴드리머를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은, 예를 들어, Eno1 또는 이의 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조성물은 Eno1 또는 이의 단편(예를 들어, Eno1 폴리펩타이드, 예를 들어, 인간 Eno1 폴리펩타이드, 및 근육 표적화 잔기)을 포함하는 복합체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 근육 표적화 잔기는 골격근 및/또는 평활근 표적화 펩타이드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MTP는 ASSLNIA; WDANGKT; GETRAPL; CGHHPVYAC; 및 HAIYPRH 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체는, 예를 들어, Eno1 및 SMTP를 연결하는 연결자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 연결자는 공유 연결자, 비-공유결합 연결, 및 가역 연결자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체는 약제학적으로 허용가능한 덴드리머를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 덴드리머는 PAMAM 덴드리머이다. 일부 구체예들에서, 상기 덴드리머는 G5 덴드리머이다. 일부 구체예들에서, 상기 덴드리머는 무전하(uncharged) 덴드리머이다. 일부 구체예들에서, 상기 덴드리머는 아실화된(acylated) 덴드리머이다. 일부 구체예들에서, 상기 덴드리머는 PEGylated 덴드리머 또는 아세틸화된(acetylated) 덴드리머이다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체는 리포좀을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체는 미세입자 또는 나노입자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 인시츄 형성 조성물을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 Eno1은 근육 세포로 전달시 상기 복합체로부터 방출된다.
일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편 및 상기 표적화 잔기는 약 1:1 내지 약 1:30의 비율로 상기 복합체에 존재한다.
일부 구체예들에서, 상기 조성물은 주사 또는 주입용으로 제형화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 경구용으로 제형화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 비경구적 투여용으로 제형화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 근육 내 투여, 정맥내 투여, 또는 피하 투여용으로 제형화되었다.
본 발명은 상승된 혈당을 가진 환자의 혈당을 낮추는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 모든 약학적 조성물들을 포함한다.
본 발명은 감소된 글루코스 내성을 가진 피험자의 글루코스 내성을 향상시키는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 Eno1을 포함하는 약학적 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 모든 약학적 조성물들을 포함한다.
본 발명은 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성이 있는 피험자의 인슐린 반응을 개선하는 방법들을 제공하는 것으로, 상기 방법은 Eno 1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 모든 약학적 조성물들을 포함한다.
본 발명은 당뇨병이 있는 피험자를 치료하는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병이다. 일부 구체예들에서, 상기 당뇨병은 당뇨병전증이다. 일부 구체예들에서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병이다. 일부 구체예들에서, 상기 당뇨병은 임신성 당뇨병이다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 모든 약학적 조성물들을 포함한다.
본 발명은 상승된 HbA1c 수치를 가진 피험자의 HbA1c 수치를 낮추는 방법들을 포함하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 모든 약학적 조성물들을 포함한다.
본 발명은 비정상적인 혈당 수치 제어력을 가진 피험자의 혈당 수치 제어력을 개선하는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 모든 약학적 조성물들을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 비경구적으로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 경구로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 근육 내, 정맥 내, 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다.
본 발명은 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법들을 제공하는 것으로, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 피험자 유래의 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 검출하는 단계, 및 (b) 상기 생물학적 시료의 Eno1 수치를 설정된 한계값과 비교하는 단계. 여기에서, 상기 설정된 한계값 보다 낮은 Eno1 수치는 피험자의 혈당이 상승되었음을 지시하는 것을 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 상승된 혈당의 하나 이상의 진단 지표의 수치를 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 진단 지표는 HbA1c, 공복 혈당, 공급 혈당, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 면역학적 검정법 또는 ELISA에 의해 검출된다. 일부 구체예들에서, 상기 단계(a)는 (i) 상기 생물학적 시료를 Eno1과 선택적으로 결합하는 시약과 접촉하는 단계, 및 (ii) 상기 생체지표 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시약은 Eno1의 적어도 하나의 항원결정부위와 선택적으로 결합하는 항-Eno1 항체이다.
일부 구체예들에서, 상기 단계(a)는 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 결정하기 위하여 증폭 반응이 사용된다. 일부 구체예들에서, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 결정하기 위하여 혼성화 분석을 사용한다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 mRNA의 일부에 상보적인 올리고핵산염을 상기 Eno1 mRNA 검출을 위한 혼성화 분석에 사용한다.
일부 구체예들에서, 상기 피험자에서의 상승된 혈당은 제2형 당뇨병, 당뇨병전증, 임신성 당뇨병, 및 제1형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 병태의 특징이다.
본 발명은 피험자의 상승된 혈당을 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(a) 생물학적 시료와 Eno1과 선택적으로 결합하는 시약을 접촉하는 단계;
(b) 상기 시약과 Eno1 간에 복합체가 형성되도록 하는 단계;
(c) 상기 복합체의 수치를 검출하는 단계; 및
(d) 상기 복합체의 수치를 설정된 한계값과 비교하는 단계. 여기에서, 상기 설정된 한계값에 대한 상기 복합체의 수치는 피험자가 상승된 혈당으로 고통을 받고 있는지를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 시약은 항-Eno1 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 탐지 가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 수치를 검출하는 단계는 상기 복합체를 탐지 가능한 이차항체와 접촉하는 단계 및 이차항체의 수치를 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들의 수치를 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 혈당의 상기 하나 이상의 추가적인 지표들은 HbA1c 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다.
본 발명의 일부 구체예들에서, 상기 복합체 수치는 면역학적 검정법 또는 ELISA에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 상승된 혈당은 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 진단에 의해 상기 피험자에서의 혈당이 상승된 것으로 확인될 때 치료적 섭생을 투여하는 단계를 더 포함하고, 여기에서 상기 치료적 섭생은 약물치료 및 행동치료, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 약물치료는 (a) 메글리티나이드(meglitinide), (b) 설포닐우레아(sulfonylurea), (c) 디펩티딜 펩티다아제-4(dipeptidy peptidase-4, DPP-4) 저해제, (d) 비구아니드(biguanide), (e) 치아졸리딘디온(thiazolidinediones), (f) 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase) 저해제, (g) 아밀린 모사체(amylin mimetic); (h) 인크레틴 모사체(incretin mimetics); (i) 인슐린; 및 (j) 이들의 어떤 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 의한 치료를 포함한다.
일부 구체예들에서, 전술된 방법들 중 어떤 방법은 혈당 상승이 의심되거나 혈당 상승 위험이 의심되는 피험자를 선택하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 전술된 방법들 중 어떤 방법은 혈당 상승이 의심되거나 혈당 상승 위험이 의심되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 전술된 방법들 중 어떤 방법은 상기 생물학적 시료의 하나 이상의 상승된 혈당과 관련된 지표들의 수치를 상기 생물학적 시료보다 이전 시점에서 동일한 피험자로부터 수득된 시료, 정상 혈당을 가진 피험자 유래의 시료, 당뇨병전증이 있는 피험자 유래의 시료, 제2형 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료, 임신성 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료, 및 제1형 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 대조 시료의 하나 이상의 상승된 혈당과 관련된 지표들의 수치를 비교하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 피험자의 혈당 상승을 모니터링하는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(1) 혈당이 상승된 피험자 유래인 첫번째로 수득된 제1 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 결정하는 단계;
(2) 상기 피험자로부터 두번째로 수득된 제2 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 결정하는 단계; 및
(3) 상기 제2 시료의 Eno1 수치를 상기 제1 시료의 Eno1 수치와 비교하는 단계.
여기에서, 상기 두번째 수득은 상기 첫번째 수득보다 이후에 이루어지고, 상기 Eno1 수치에서의 변화는 상기 피험자의 상승된 혈당 상태에서의 변화를 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 단계(1) 및 (2)는 HbA1c 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당의 하나 이상의 추가적인 치료들의 수치를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 피험자는 제2 시료의 수득 전에 혈당 상승용 약제로 치료된다. 일부 구체예들에서, 제1 생물학적 시료와 비교하여 제2 생물학적 시료에서의 감소된 Eno1 수치는 상기 피험자에서의 혈당 상승을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 제1 생물학적 시료와 비교하여 제2 생물학적 시료에서의 향상되거나 동일한 Eno1 수치는 상기 피험자의 혈당 정상화를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자의 혈당 수치를 바탕으로 하여 상기 피험자에 대한 상이한 치료섭생을 선택하고 및/또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료 섭생은 약물치료 및 행동수정치료(behavioral modification therapy) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 약물치료는 (a) 메글리티나이드,(b) 설포닐우레아, (c) 디펩티딜 펩티다아제-4(DPP-4) 저해제, (d) 비구아니드, (e) 치아졸리딘디온, (f) 알파-글루코시다아제 저해제, (g) 아밀린 모사체; (h) 인크레틴 모사체; (i) 인슐린; 및 (j) 이들의 어떤 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 의한 치료를 포함한다.
본 발명은 피험자의 상승된 치료하는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 상승된 혈당을 가질 것으로 예상되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, (b) Eno1 수치에 대한 진단 정보를 수득하기 위하여 상기 생물학적 시료를 제출하는 단계, 및 (c) 상기 Eno1 수치가 한계치보다 높을 경우 치료적으로 효과적인 용량의 항-당뇨병 치료제를 투여하는 단계.
본 발명은 피험자의 상승된 혈당을 치료하는 방법들을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 생물학적 시료의 Eno1 수치에 관한 진단 정보를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 Eno1 수치가 한계치보다 높을 경우 치료적으로 효과적인 용량의 항-당뇨병 치료제를 투여하는 단계.
본 발명은 피험자의 상승된 혈당을 치료하는 방법들을 제공하며, 상기 방법들은 다음 단계들을 포함한다:
(a) Eno1 수치와 관련된 진단 정보를 확인하는데 사용하기 위하여 상승된 혈당을 가질 것으로 예상되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계,
(b) 상기 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 측정하는 단계, 및
(c) 상기 Eno1 수치가 한계치보다 낮을 경우, 혈당저하치료를 제공할 것을 의료인에게 추천하는 단계.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들의 수치에 대한 진단 정보를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들의 수치를 측정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들은 HbA1c 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예들에서, 상기 단계(c)는 Eno1 수치가 한계치보다 낮고 상승된 혈당의 상기 추가적인 지표 중 적어도 하나가 검출될 경우, 치료적으로 효과적인 용량의 글루코스 저하 치료를 제공하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 단계(c)는 Eno1 수치가 한계치보다 낮고 상승된 혈당의 상기 추가적인 지표의 적어도 하나가 존재할 경우, 글루코스 저하 치료를 제공할 것을 의료인에게 추천하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 면역학적 검정법 또는 ELISA에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 (i) 상기 생물학적 시료를 Eno1과 선택적으로 결합하는 시약과 접촉하는 단계, 및 (ii) 상기 생체지표 복합체를 검출하는 단계에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 시약은 Eno1의 적어도 하나의 항원결정부위와 선택적으로 결합하는 항-Eno1 항체이다.
일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다. 일부 구체예들에서, 증폭 반응은 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA의 양을 측정하는데 사용된다. 일부 구체예들에서, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA의 양을 측정하는 혼성화 분석이 사용된다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 mRNA 검출을 위한 혼성화 분석에서 Eno1 mRNA의 일부에 상보적인 올리고핵산염을 사용한다.
본 발명은 생물학적 시료 내 Eno1 검출용 키트를 제공하고, 상기 키트는 생물학적 시료 내 Eno1 수치를 측정하기 위한 적어도 하나의 시약, 및 Eno1 수치 측정을 위한 한 세트의 사용 설명서를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시약은 항-Eno1 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 항-Eno1 항체 검출용 수단을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-Eno1 항체 검출용 수단은 탐지 가능한 이차항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 시약은 Eno1 mRNA에 상보적인 올리고핵산염이다. 일부 구체예들에서, 상기 사용설명서는 생물학적 시료 내 Eno1 수치 검출용인 면역학적 검정법 또는 ELISA을 설명한다. 일부 구체예들에서, 상기 사용설명서는 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA 수치 분석을 위한 증폭 반응을 설명한다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA의 양을 결정하기 위하여 증폭반응이 사용된다. 일부 구체예들에서, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이다. 일부 구체예들에서, 상기 사용설명서는 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA의 양을 결정하기 위한 혼성화 분석을 설명한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 Eno1 mRNA의 일부에 상보적인 적어도 하나 올리고핵산염을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 상기 생물학적 시료의 HbA1c 및/또는 혈당 측정용인 적어도 하나의 시약을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 생물학적 시료가 채취되는 피험자의 HbA1c 수치, 공급 혈당 수치, 공복 혈당 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 측정하기 위한 사용 설명서를 더 포함한다.
본 발명은 혈당상승 검출법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판(a panel of reagents)을 제공한다.
본 발명은 혈당 상승을 치료하는 방법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판을 제공한다.
본 발명은 혈당 상승 치료를 모니터링하는 방법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판을 제공한다.
본 발명은 전술된 시약판 및 상승된 혈당의 하나 이상의 지표들의 수치에 관한 진단 정보를 제공하는 한 세트의 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 상승된 혈당을 진단 및/또는 치료하는 방법에서 상승된 혈당의 표지물을 검출하는데 특이적인 복수의 검출 시약을 포함하는 시약판의 사용을 제공하며, 상기 시약판의 적어도 하나 검출 시약은 Eno1을 검출하는데 특이적이고, 나머지 하나 이상의 검출 시약은 HbA1c 및 글루코스로 이루어진 군으로부터 선택되는 상승된 혈당 표지물의 지표를 검출하는데 특이적이다.
상기 언급한 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 피험자의 골격근 세포의 글루코스 유동(flux)은 향상된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자의 글루코스 유동을 향상시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 언급한 약학적 조성물들 중 어느 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자의 골격근 세포의 해당 활성 또는 용량을 향상시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 언급한 약학적 조성물들 중 어느 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자의 골격근 세포에서의 미토콘드리아의 유리 지방산 산화를 향상시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 언급한 약학적 조성물들 중 어느 것이다.
일부 구체예들에서, 상기 피험자는 상승된 혈당, 감소된 글루코스 내성, 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성, 당뇨병, 상승된 HbA1c 수치, 및 비정상적인 혈당 수치 제어력 중 어느 하나 이상을 갖는다.
상기 언급한 방법들 중 어느 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자는 인간이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 치료적으로 효과적인 용량의 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 약학적 조성물은 근육 세포 전달용이다. 상기 조성물의 일부 구체예들에서, Eno1은 Eno1 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 조성물의 일부 구체예들에서, Eno1은 Eno1 핵산 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 Eno1를 인코딩하는 발현 벡터 또는 이의 단편을 더 포함한다. 상기 조성물의 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 생물학적으로 활성이다. 상기 조성물의 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 정제된 내생 인간 Eno1 폴리펩타이드의 활성의 최소 90%의 활성을 갖는다. 상기 조성물의 일부 구체예들에서, 상기 Eno1은 인간 Eno1이다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 미세입자를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 나노입자를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 인시츄 형성 조성물을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 리포좀을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 근육 표적화 잔기를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 근육 표적화 잔기는 골격근 표적화 잔기이다. 일부 구체예들에서, 상기 근육 표적화 잔기 및 상기 Eno1 폴리펩타이드는 복합체이다.
본 명세서에서 설명되는 상기 조성물들의 일부 구체예들에서, Eno1은 근육 세포로 전달시 복합체로부터 방출된다. 본 명세서에서 설명되는 상기 조성물들의 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 비경구적 투여용으로 제형화된다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 경구용으로 제형화된다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 근육 내 투여, 정맥내 투여, 또는 피하 투여용으로 제형화된다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 상승된 혈당을 가진 환자의 혈당을 낮추는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 혈당이 줄어든다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 감소된 글루코스 내성을 갖는 피험자의 글루코스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 글루코스 내성이 향상된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성이 있는 피험자에서의 인슐린 반응을 개선하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 인슐린 반응이 개선된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 피험자의 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 당뇨병이 치료된다. 일부 구체예들에서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병 또는 제1형 당뇨병이다. 일부 구체예들에서, 상기 당뇨병은 당뇨병전증이다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 상승된 HbA1c 수치를 가진 환자의 HbA1c 수치를 낮추는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 HbA1c 수치가 감소된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 비정상적인 혈당 수치 제어력을 가진 피험자의 혈당 수치 제어력을 개선하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 혈당 수치 제어력이 개선된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
상기 언급한 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 피험자의 골격근 세포에서의 글루코스 유동은 향상된다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 피험자의 글루코스 유동을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 글루코스 유동이 향상된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 피험자의 골격근 세포의 해당 활성 또는 용량을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 골격근 세포의 해당 활성 또는 용량이 향상된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 피험자의 골격근 세포에서의 미토콘드리아의 유리 지방산 산화를 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 상기 피험자의 골격근 세포에서의 미토콘드리아의 유리 지방산 산화가 향상된다. 상기 언급한 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 상기 기술된 조성물들 중 어느 것이다.
상기 언급한 방법들의 일부 구체예들에서, Eno1은 비경구적으로 투여된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 경구로 투여된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 근육 내, 정맥 내, 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자는 상승된 혈당, 감소된 글루코스 내성, 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성, 당뇨병, 상승된 HbA1c 수치, 및 비정상적인 혈당 수치 제어력 중 어느 하나 이상을 갖는다.
상기 언급한 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 상승된 혈당, 감소된 글루코스 내성, 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성, 당뇨병, 상승된 HbA1c 수치, 및 비정상적인 혈당 수치 제어력 중 어느 하나 이상의 증상을 갖는 피험자를 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자는 인간이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법들에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 피험자 유래의 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 검출하는 단계, 및 (b) 상기 생물학적 시료의 Eno1 수치를 설정된 한계값과 비교하는 단계. 여기에서, 상기 설정된 한계값 보다 상기 시료의 낮은 Eno1 수치는 피험자의 혈당이 상승되었음을 지시하는 것을 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상승된 혈당의 하나 이상의 진단 지표의 수치를 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 진단 지표는 HbA1c, 공복 혈당, 공급 혈당, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 면역학적 검정법 또는 ELISA에 의해 검출된다. 전술된 방법의 일부 구체, 상기 단계(a)는 (i) 상기 생물학적 시료를 Eno1과 선택적으로 결합하는 시약과 접촉하는 단계, 및 (ii) 상기 생체지표 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 단계(a)는 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 탐지하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 탐지하기 위하여 증폭 반응이 사용된다. 일부 구체예들에서, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이다. 의 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 검출하기 위하여 혼성화 분석을 사용한다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 mRNA의 일부에 상보적인 올리고핵산염을 상기 Eno1 mRNA 검출을 위한 혼성화 분석에 사용한다.
전술된 방법의 일부 구체예들에서, 상기 피험자에서의 상승된 혈당은 제2형 당뇨병, 당뇨병전증, 임신성 당뇨병, 및 제1형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 병태의 특징이다.
일부 구체예들에서, 상기 언급한 방법들은 혈당이 상승된 것으로 확인될 때 상기 피험자에게 치료적 섭생을 투여하는 단계를 더 포함한다. 여기에서, 상기 치료적 섭생은 약물치료 및 행동치료, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 약물치료는 (a) 메글리티나이드(meglitinide), (b) 설포닐우레아(sulfonylurea), (c) 디펩티딜 펩티다아제-4(dipeptidy peptidase-4, DPP-4) 저해제, (d) 비구아니드(biguanide), (e) 치아졸리딘디온(thiazolidinediones), (f) 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase) 저해제, (g) 아밀린 모사체(amylin mimetic); (h) 인크레틴 모사체(incretin mimetics); (i) 인슐린; 및 (j) 이들의 어떤 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 의한 치료를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 혈당 상승이 의심되거나 혈당 상승 위험이 의심되는 피험자를 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방벙들은 혈당 상승이 의심되거나 혈당 상승 위험이 의심되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 전술된 방법들 중 어떤 방법은 상기 생물학적 시료의 하나 이상의 상승된 혈당과 관련된 지표들의 수치를 상기 생물학적 시료보다 이전 시점에서 동일한 피험자로부터 수득된 시료, 정상 혈당을 가진 피험자 유래의 시료, 당뇨병전증이 있는 피험자 유래의 시료, 제2형 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료, 임신성 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료, 및 제1형 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 대조 시료의 하나 이상의 상승된 혈당과 관련된 지표들의 수치를 비교하는 단계를 더 포함한다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 피험자의 혈당 상승을 모니터링하는 방법들을 제공하고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (1) 혈당이 상승된 피험자 유래인 첫번째로 수득된 제1 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 결정하는 단계; (2) 상기 피험자로부터 두번째로 수득된 제2 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 결정하는 단계; 및 (3) 상기 제2 시료의 Eno1 수치를 상기 제1 시료의 Eno1 수치와 비교하는 단계. 여기에서, 상기 두번째 수득은 상기 첫번째 수득보다 이후에 이루어지고, 상기 Eno1 수치에서의 변화는 상기 피험자의 상승된 혈당 상태에서의 변화를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 단계(1) 및 (2)는 HbA1c 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당의 하나 이상의 추가적인 치료들의 수치를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자는 제2 시료의 수득 전에 혈당 상승용 약제로 치료된다. 일부 구체예들에서, 제1 생물학적 시료와 비교하여 제2 생물학적 시료 에서의 감소된 Eno1 수치 는 상기 피험자에서의 혈당 상승을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 제1 생물학적 시료와 비교하여 제2 생물학적 시료에서의 향상되거나 동일한 Eno1 수치는 상기 피험자의 혈당 정상화를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 피험자의 혈당 수치를 바탕으로 하여 상기 피험자에 대한 상이한 치료섭생을 선택하고 및/또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료 섭생은 약물치료 및 행동수정치료(behavioral modification therapy) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 약물치료는 (a) 메글리티나이드,(b) 설포닐우레아, (c) 디펩티딜 펩티다아제-4(DPP-4) 저해제, (d) 비구아니드, (e) 치아졸리딘디온, (f) 알파-글루코시다아제 저해제, (g) 아밀린 모사체; (h) 인크레틴 모사체; (i) 인슐린; 및 (j) 이들의 어떤 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 의한 치료를 포함한다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 생물학적 시료의 Eno1 탐지용 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 다음을 포함한다: (a) 생물학적 시료 내 Eno1 수치를 측정하기 위한 적어도 하나의 시약; (b) 상기 생물학적 시료의 Eno1 수치(예를 들어, Eno1 수치를 기반으로 하는)를 결정하기 위한 한 세트의 사용 설명서; 및 (c) 상기 생물학적 시료의 혈당 수치를 측정하기 위한 한 세트의 사용 설명서. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 상기 생물학적 시료의 HbA1c 측정용인 적어도 하나의 시약을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 생물학적 시료가 채취되는 피험자의 HbA1c 수치, 공급 혈당 수치, 공복 혈당 수치, 및 글루코스 내성 중 적어도 하나를 측정하기 위한 사용 설명서를 더 포함한다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 또한 Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판에 관한 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 또한 혈당 상승을 치료하는 방법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판에 관한 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 또한 혈당 상승 치료를 모니터링하는 방법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판에 관한 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 또한 전술된 시약판 및 상승된 혈당의 하나 이상의 지표들의 수치에 관한 진단 정보를 제공하는 한 세트의 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
어떠한 양태들에서, 본 발명은 또한 혈당 상승을 진단 및/또는 치료하는 방법에서 상승된 혈당의 표지물들을 검출하는데 특이적인 복수의 검출 시약들을 포함하는 패널의 용도에 관한 것으로, 상기 패널의 적어도 하나 검출 시약은 Eno1의 검출에 특이적이고, 나머지 하나 이상의 검출 시약은 HbA1c 및 글루코스로 이루어진 군으로부터 선택되는 상승된 혈당 표지물의 지표를 검출하는데 특이적인 것을 특징으로 하는 패널의 용도에 관한 것이다.
이 외의 구체예들은 하기에서 제공된다.
본 발명에 따르면 에놀라아제 1 조성물들 및 이의 용도가 제공된다.
도 1a는 Eno1 및 인슐린으로 처리 또는 비처리된 평활근 근육모세포에서 글루코스 섭취를 도시하는 그래프이다. 도 1b는 인슐린이 없는 조건에서 0, 500, 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리된 평활근 근육모세포에서 글루코스 섭취를 도시한다.
도 2a 및 2b는 0, 500 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서 Eno1 단백질 양을 도시한다. 도 2c는 0, 500 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서 Eno1의 활성을 도시한다.
도 3a는 천연적인(native) Eno1 및 가열 불활화된(heat inactivated) Eno1의 활성을 도시한다. 도 3b는 활성 Eno1 및 가열 불활화된 Eno1에 의한 글루코스 섭취 유도를 도시한다.
도 4a 및 4b는 Eno1 단백질을 처리 또는 비처리한 후에 식이성 비만(diet induced obesity, DIO) 생쥐 모델에서의 글루코스 부하검사로써, (A) 시간경과에 따른 글루코스 제거를 도시하고, 이를 (B) 곡선하위면적(area under the curve, AUC)으로 도시한다.
도 5는 SDS-폴리아크릴아마이드젤전기영동(SDS-PAGE)으로 분석된 다양한 농도의 Eno1을 포함하는 폴리아크릴아마이드젤의 쿠마시 염색을 도시한다. L1: Precision Plus Protein 표준 Dual Color, L2: Eno1(10.0 μg), L3: Eno1(1.0 μg), L4: Eno1(0.1 μg).
도 6은 SDS-PAGE로 분석된 다양한 농도의 Eno1을 포함하는 폴리아크릴아마이드 젤의 은염색을 도시한다. L1: Precision Plus Protein 표준 Dual Color, L2: Eno1(10.0 μg), L3: Eno1(1.0 μg), L4: Eno1(0.1 μg).
도 7은 Eno1의 웨스턴블롯(western blotting) 분석을 도시한다. L1: Precision Plus Protein 표준 Dual Color, L2: Eno1(10.0 μg), L3: Eno1(1.0 μg), L4: Eno1(0.1 μg).
도 8은 Eno1 과 덴드리머(dendrimer) SMTP가 2:1 비율로 만들어진Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체의 제타(ξ) 전위 측정을 도시한다.
도 9는 다양한 온도에 저장한 후 Eno1 단독의(에놀라아제 단독의) 정규화된 활성 및 Eno1/G5-덴드리머/SMTP(에놀라아제/G5-SMC) 용액의 정규화된 활성을 도시한다.
도 10a 및 10b는 (A)형광 라벨링된Eno1-G5-PAMAM 덴드리머 복합체 및 (B)형광 라벨링되고 근육으로 적중된 Eno1-G5-PAMAM 덴드리머 복합체의 생쥐에서의 조직 분포를 보여주는 대표적인 형광영상이다.
도 11은 부형제(vehicle), G5-PAMAM 덴드리머, G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP, G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1, G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP중에 하나로 처리된 마른 생쥐 또는 DIO 생쥐의 체중을 보여주는 그래프이다.
도 12는 식염수 또는 G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP(50 μg/kg)를 식이성 비만 생쥐에 주입 후 1, 4, 및 24시간에서 혈당 수치를 도시하는 그래프이다.
도 13a는 마른 생쥐 및 당뇨병의 식이성 비만(diet induced obesity, DIO) 생쥐 모델을 대상으로 한 글루코스 부하검사로써, G5-PAMAM 덴드리머 +SMTP(DIO NP+SMTP) 또는 G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP(DIO 에놀라아제-1+NP+SMTP) 처리 1주일 후 결과를 도시한다. 도 13b는 도 13a에서 각 처리 그룹에 대한 곡선하위면적(area under the curve, AUC)을 도시한다. 도 13c 및 13c는 마른 생쥐 또는 부형제, G5-PAMAM 덴드리머(G5), G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP, G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1, G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP 중 한 가지로 2주간 처리된 DIO 생쥐에서의 글루코스 부하검사로써, (C) 시간경과에 따른 글루코스 제거를 도시하고, 이를 (D) 곡선하위면적(area under the curve, AUC)으로 도시한다.
도 14a 및 14b는 마른 생쥐 또는 부형제, G5-PAMAM 덴드리머, G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP, G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1, G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP 중 한 가지로 4주간 처리된 DIO 생쥐에서의 글루코스 부하검사로써, (A) 시간경과에 따른 글루코스 제거를 도시하고, 이를 (B) 곡선하위면적(area under the curve, AUC)으로 도시한다.
도 15는 마른 생쥐, 식이성 비만(diet induced obesity, DIO) 생쥐, G5-덴드리머(DIO + NP) 처리DIO 생쥐, 및Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체(DIO + Eno-1 + NP + SMTP) 처리DIO 생쥐에서 처리 8주후에 혈청 젖산 수치를 도시한다.
도 16a 및 16b는 db/db 생쥐(BKS.Cg-m　+/+　 Leprdb /J)에 부형제, G5-PAMAM 덴드리머(G5) + SMTP, 및25 μg/kg 또는 50 μg/kg의 G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP 중 하나를 처리하고 1주 후에 복강내 글루코스 부하검사를 한 것으로, (A) 시간경과에 따른 글루코스 제거를 도시하고, 이를 (B) 곡선하위면적(area under the curve, AUC)으로 도시한다.
도 17a 및 17b는 db/db 생쥐(BKS.Cg-m　+/+　 Leprdb /J)에 부형제, G5-PAMAM 덴드리머(G5) + SMTP, 및 25μg/kg 또는 50 μg/kg의 G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP 중에 하나를 처리하고 2주 후에 글루코스 수치를 시간별로 측정한 것으로, 부형제, G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP, 및 상기 명시된 투여량의 G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP를 주입한 직후부터 시간대별 글루코스 수치를 도시한다. 도 17a는 네가지 모든 처리 방법으로부터 얻은 결과를 도시한다. 도 17b는 30분 시점에서 두드러진 글루코스 수치 차이를 보이기 위해 G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP(G5+SMTP) 및 G5-PAMAM 덴드리머 + Eno1 + SMTP(Eno1+G5+SMTP) 50 μg/kg의 결과를 도시한다.
*도 18은 db/db diabetic 생쥐 모델에서 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체를 25 μg/kg 체중 또는 50 μg/kg 체중으로 하루에 한 차례 2주 동안 피하주사 했을 경우 공급 혈당 수치에 대한 효과를 도시한다. 공급 글루코스는 비공복 상태에서 Eno1 주입 24시간 이후에 측정되었다. 용어 "NP" 는 G5-덴드리머이다.
도 19는 db/db diabetic 생쥐 모델에서 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체를 100 μg/kg 체중 또는 200 μg/kg 체중으로 하루에 두 차례(아침 및 저녁) 피하주사 했을 경우 공급 혈당 수치에 대한 효과를 도시한다.
도 20은 G5-PAMAM 덴드리머(G5), G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP(G5-SMC), 및 아실화된(acylated) G5-PAMAM 덴드리머 + SMTP(G5-SMC-Ac)로 처리한 후 검출된 크레아틴 인산화효소(creatine kinase) 및 카스파제 3(caspase 3) 활성을 도시한다.
도 21은 Eno1 및 인슐린을 처리 또는 비처리한 인간 골격근 근육대롱세포에서의 p-Akt 단백질 수치를 도시한다.
도 22a는 정제된 Eno1으로 처리 또는 비처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서의 Glut1, Glut4, HK2 및 미오게닌(Myogenin) mRNA 수치를 도시한다. 도 22b는 정제된 Eno1으로 처리 또는 비처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서의 Glut1 단백질 수치를 도시한다. Glut 1 단백질 수치는 리보솜(ribosomal) 단백질 중앙값에 의해 정규화된 상대적인 값이다.
도 23은 글루코스 결핍(상단 패널) 및 글루코스 자극(하단 패널) 조건에서 정제된 Eno1으로 처리 또는 비처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서 글루코스-6-인산(glucose-6-phosphate, G6P) 수치를 도시한다.
도 24는 글루코스 결핍(상단 패널) 및 글루코스 자극(하단 패널) 조건에서 정제된 Eno1으로 처리 또는 비처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서 포스포에놀 피루브산(phosphoenol pyruvate, PEP) 수치를 도시한다.
도 25는 정제된 Eno1을 처리 또는 비처리하는 조건에서 팔미테이트(palmitate), CCCP 및 etomoxir로 순차적으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포(human skeletal myotube, HSMM) 배양에서의 산소 소모율(oxygen consumption rate, OCR)을 도시한다.
도 26은 정제된 Eno1을 처리 또는 비처리하는 조건에서 글루코스, 올리고마이신(oligomycin) 및 2-DG로 순차적으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포(human skeletal myotube, HSMM) 배양에서의 세포외 산성화율(extracellular acidification rate, ECAR)을 도시한다.
도 27a는 500 μg/ml 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리한 인간 골격근 근육대롱세포에서 미토콘드리아 함량을 비처리 대조군 인간 골격근 근육대롱세포에 대해 상대적으로 도시한다. 미토콘드리아 함량은 Eno1 처리 48시간 후 세포에 녹색 형광 미토콘드리아 염료인 Mitotracker Green를 첨가함으로써 결정되었다.
도 27b는 500 μg/ml 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리한 인간 골격근 근육대롱세포에서의 미토콘드리아 활성산소(mitochondrial reactive oxygen species, Mito-ROS) 생성을 비처리 대조군 인간 골격근 근육대롱세포(Eno 1 0 μg/ml)에 대해 상대적으로 도시한다. Mito-ROS는 무전하이면서 비형광의 활성산소(ROS) 지시약인 Dihydrorhodamin 123을 세포에 처리함으로써 측정될 수 있는데, 상기 지시약은 세포막을 가로질러 수동적으로 확산되어 양이온 로다민 123(rhodamine 123)으로 산화되어 미토콘드리아에서 녹색 형광을 내게 된다. Dihydrorhodamin 123 처리 후, 근육대롱세포는 트립신처리(trypsinized) 및 세척된 후 유동세포계수법(flow cytometry)으로 Mito-ROS 수치가 결정되어 진다.
도 28a는 0, 500, 또는 1000 μg/ml Eno1로 처리된 골격근 근육대롱세포에서의 5' AMP activated protein kinase(AMPK) 및 인산화된 AMPK(pAMPK) 수치를 도시한다. Lamin A/C는 대조군 단백질로 사용되었다.
도 28b는 기초 및 혈청 결핍 배양 조건에서 0, 500, 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리된 골격근 근육대롱세포에서의 AMPK 대 pAMPK(p-AMPK)의 비율을 도시한다.
도 29는 Eno1이 작용하는 방식에서 Nampt 의 잠재적 역할을 설명하는 작동 모델을 도식적으로 도시한다.
도 30은 분화 배지에서 4일간 분화 후 48시간 동안 500 μg/ml 또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서의 Nampt 활성을 비처리 대조군 인간 골격근 근육대롱세포(Eno 1 0 μg/ml)에 대해 상대적으로 도시한다.
도 31은 혈청 결핍된 인간 골격근 근육대롱세포에 재조합 세포외 Nampt(extracellular Nampt, eNampt)로 처리 후 2-DG 흡수를 도시한다.
도 32는 4일간 분화 후 Nampt 저해제 FK866을 포함 또는 미포함하는 분화 배지에서 48시간 동안 0, 500또는 1000 μg/ml Eno1으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포 배양에서 글루코스 섭취를 도시한다. FK866는 Eno1 처리 24시간 후에 첨가되어, 근육대롱세포는 FK866에 24시간 동안 처리되게 된다. 2-DG 흡수는 3시간 혈청 결핍 후에 측정되었다. FK866에 의한 Nampt 저해는 Eno1에 의한 글루코스 섭취를 제거했다.
도 33은 당분해 과정을 도식적으로 도시한다.
도 34a, 34b 및 34c는 인간 Eno1의 제1형 변이체(NCBI 접근번호 NM_001428.3)의 (A)아미노산(SEQ ID NO: 2) 및 (B)핵산 코딩(coding) 서열(SEQ ID NO: 1)을 도시한다.
도 35a, 35b 및 35c는 인간 Eno1의 제2형 변이체(NCBI 접근번호 NM_001201483.1)의 (A)아미노산(SEQ ID NO: 4) 및 (B)핵산 코딩 서열(SEQ ID NO: 3)을 도시한다. 인간 Eno1의 제2형 변이체 단백질은 MBP-1으로 불리기도 한다.
도 36a는 ENO2 mRNA(SEQ ID NO: 5)의 핵산 서열을 도시한다. 도 36b는 Eno2(SEQ ID NO: 6)의 아미노산 서열을 도시한다.
도 37a 및 37b는 ENO3 mRNA의 제1형 변이체(SEQ ID NO: 7) 및 제2형 변이체(SEQ ID NO: 8)의 핵산 서열을 각각 도시한다. 도 37c는 제1형 변이체 및 제2형 변이체 둘 다에 의해서 인코딩되는 Eno3 단백질(SEQ ID NO: 9)의 제1형 동형(isoform)을 도시한다. 도 37d는 ENO3 mRNA(SEQ ID NO: 10)의 제3형 변이체의 핵산 서열을 도시한다. 도 37e는 제3형 변이체에 의해서 인코딩되는 Eno3(SEQ ID NO: 11)의 제2형 동형의 아미노산 서열을 도시한다. 제1형 변이체와 비교했을 때, ENO3 mRNA의 제3형 변이체는 5' UTR에서 다르고, 5' 코딩 영역에서 두 개의 엑손(exons)이 결핍되어 있다. Eno3 단백질의 제2형 동형은 제1형 동형보다 짧으나, 동일한 N- 및 C-말단을 가지고 있다.
발견 플랫폼 기술은 당뇨병의 병리생리학을 유발하는 분명한 분자 특성을 기술하는데 사용되었다. Eno1은 인간의 주요한 생체외 당뇨병 모델들에서 상당히 조절되는 중요한 교점임을 상기 발견 플랫폼 기술을 통해서 확인되었다. 본 명세서에서 논의된 이어지는 생체외 및 생체내 연구들에서는 인슐린 의존적 및 비의존적 글루코스 섭취, 글루코스 내성, 인슐린 감수성, 및/또는 당뇨병, 예를 들면 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 당뇨병전증, 및 임신성 당뇨병에서 Eno1의 역할이 확인되었다. 좀 더 구체적으로 설명하자면, 인간 근육대롱세포에 Eno1 단백질의 처리는 근육대롱세포에서 인슐린 비의존적 및 의존적 글루코스 섭취 모두를 증가시키는 것으로 입증되었다. 이는 제1형, 제2형 두 가지 타입 모두의 당뇨병 치료에서 Eno1의 역할 및 인슐린 및/또는 인슐린 반응의 유무에 상관없이 두 조건 모두에서 글루코스 섭취에 대한 Eno1의 역할을 보여주는 것이다. 더욱이, 단독으로 또는 골격근을 표적으로 하는 덴드리머가 있는 하에서의 Eno1 단백질의 투여는 생쥐 식이성 비만 모델에서 글루코스 내성을 향상시켰고, 그리고 유사한 결과들이 제1형, 제2형 당뇨병의 유전적 모델들에서 예상되어진다. 상기 결과들은 Eno1이 글루코스 및 인슐린 반응을 정상화시키는데 효과적임을 증명하고, 그리고 따라서 Eno1이 글루코스 내성 향상 및 인슐린 감수성 증가/인슐린 저항성 감소에 유용하여, 그럼으로써 당뇨병을 치료함을 보여준다.
I. 정의
ENO1L, 알파-에놀라아제, 에놀라아제-알파, 타우-크리스탈린(tau-crystallin), 비신경 에놀라아제(non-neural enolase, NNE), 알파 에놀라아제 유사(like) 1, 포스포피루브산 수화효소(phosphopyruvate hydratase, PPH), 플라스미노겐-결합 단백질(plasminogen-binding protein), MYC 프로모터-결합 단백질 1(MYC promoter-binding protein 1, MPB1), 및 2-인산-D-글리세르산 하이드로-라이에이스(2-phospho-D-glycerate hydro-lyase)로도 알려진 에놀라아제 1,(알파)는 포유류에서 발견되는 세가지 에놀라아제 동종효소들 중에 하나이다. 인간 Eno1 동형들의 단백질 및 핵산 서열은 본 명세서 도 34 및 35에서 제공된다. 인간 질병의 치료를 위해 인간 아미노산 및 핵산 서열들이 바로 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 치료할 종들의 Eno1을 선택함으로써 인간이 아닌 동물들의 치료에 맞추어 쉽게 적용될 수 있을 것이다. 인간이 아닌 종들에 대한 Eno1의 아미노산 및 핵산 서열들은 당 기술분야에서 잘 알려 있으며 예를 들어 ncbi.nlm.nih.gov/genbank/에서 찾아볼 수 있다. 일부 구체예들에서는, 본 발명의 상기 조성물들 및 방법들에 사용된 Eno1은 포유류 Eno1이다. 바람직한 구체예에서는, Eno1은 인간 Eno1이다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "Eno1의 투여"는, 달리 언급되지 않는 한, Eno1단백질 발현을 위해 Eno1 단백질 또는 핵산 구조체의 투여로 이해된다. 일부 구체예들에서, Eno1 단백질은 Eno1 단백질 단편을 인코딩(encoding)하는 Eno1 단백질 단편 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 Eno1 단백질의 투여이다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 Eno1의 폴리뉴크레오티드 투여이다. 인간 Eno1의 단백질 및 핵산 서열들은 본 명세서에서 제공된다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 인간 Eno1의 제1 변이체 또는 제2 변이체의 투여를 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 인간 Eno1의 제1 변이체 및 제2 변이체의 투여를 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 인간 Eno1의 제1 변이체의 투여를 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 인간 Eno1의 제2 변이체의 투여를 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 오직 인간 Eno1의 제1 변이체만의 투여를 포함한다. 일부 구체예들에서, Eno1의 투여는 오직 인간 Eno1의 제2 변이체만의 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "생활성(biologically active)"은 내생 Eno1 단백질의 최소 한가지 활성을 가지는 Eno1 분자 또는 이의 단편을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 생활성 Eno1 분자 또는 이의 단편은 2-인산-D-글리세르산(2-phospho-D-glycerate, PGA)의 탈수를 촉진하여 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)로 전환시킨다. 일부 구체예들에서는, 생활성 Eno1 분자 또는 이의 단편은 PEP의 수화를 촉진하여 PGA로 전환시킨다. 일부 구체예들에서는, 생활성 Eno1 분자 또는 이의 단편은 세포, 예를 들어 근육 세포, 바람직하게는 골격근 세포, 의 글루코스 섭취를 증가시킨다. 일부 구체예들에서는, 생활성 Eno1 분자 또는 이의 단편은 글루코스 부하검사에서 혈당 수치, 예로써 공급 혈당 수치 또는 혈당 수치, 를 감소시킨다. 일부 구체예들에서는, 생활성 Eno1 분자 또는 이의 단편은 Nampt, 예를 들어, 세포외 Nampt (extracellular Nampt, eNampt), 에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 골격근 세포, 평활근 세포 등을 포함하여 용어 "근육으로 투여(administration to a muscle)", 용어 "근육으로 전달(delivery to a muscle)", 또는 용어 "근육 세포로 전달(delivery to a muscle cell)"은 바라던 전신효과(예를 들어, 비정상적인 혈당에 대한 혈당의 정상화(예를 들어, 글루코스 내성 및/또는 인슐린 감수성 증가, 또는 당뇨병 치료))를 주기 위해 근육(예를 들어, 근육 세포)에 Eno1의 유효량을 제공하기 위한 제제, 방법, 또는 이들의 결합으로 이해된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 근육으로 직접적인 투여, 및 바람직하게는 근육에서의 유지를 위해서 제제된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 근육에 직접적인 투여(즉, 근육내 투여)를 했으며, 상대적으로 적은 투여 횟수(예를 들어, 1주일에 한 번 또는 그보다 적게, 격주로 또는 그보다 적게, 한 달에 한 번 또는 그보다 적게, 두 달에 한 번 또는 그보다 적게, 세 달에 한 번 또는 그보다 적게, 네 달에 한 번 또는 그보다 적게, 다섯 달에 한 번 또는 그보다 적게, 여섯 달에 한 번 또는 그보다 적게)를 위해 바람직하게는 Eno1을 지효성 제제로 하여 사용했다. 일부 구체예들에서, 근육으로 Eno1의 전달을 증가시기키 위해 Eno1에 표적화 잔기를 달기 때문에 Eno1을 근육으로 직접 전달(예를 들어, 피하 또는 정맥으로 전달)할 필요가 없다. 근육으로의 투여는 Eno1의 전체 투여량이 근육 또는 근육 세포들로 전달될 필요는 없는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, Eno1의 최소 5%, 최소 10%, 최소 15%, 최소 20%, 최소 25%, 최소 30%, 최소 35% 가 근육(바람직하게는 골격근 및/또는 평활근)으로 전달된다. 일부 구체예들에서, 근육으로 표적화된 Eno1이 근육내 주입이 아닌 다른 방식으로 주입되었을 경우 근육 세포로 전달되는 Eno1의 양은 비표적화된 Eno1이 근육으로 전달되는 양보다 약 1.5 배 이상, 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 또는 6 배 이상 많다. 일부 구체예들에서, Eno1은 골격근으로 전달된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 평활근으로 전달된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 골격근 및 평활근으로 전달된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 평활근과 비교했을 때 골격근에 더 많은 양이 또는 우선적으로 전달된다. 일부 구체예들에서, 근육으로 전달되는 Eno1의 최소 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이 골격근으로 전달된다. 일부 구체예들에서, Eno1는 평활근으로 전달되지 않는다. 표적화 잔기에 의한 타겟분자의 상대적인 타켓팅 정도를 측정하는 분석은 당 기술분야에서 알려 있고, 본 명세서에 포함된 참고 문헌(예를 들어, Samoylova 외, 1999, Muscle Nerve, 22:460-466)에서 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "근육 표적화 잔기(muscle targeting 잔기들)" 는, 최소한으로, 근육 표적화 펩타이드(muscle targeting peptide, MTP), 예를 들어 골격근 및/또는 평활근 표적화 펩타이드(skeletal and/or smooth muscle targeting peptide, SMTP), 를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표적화 잔기는 인테그린(integrin) ανβ5 또는 ανβ53에 결합하는 리간드들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표적화 잔기는 CD-46 리간드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표적화 잔기는 필요한 경우에 아데노바이러스 35 섬유 단백질과 결합하는 아데노바이러스 펜톤 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 근육으로 표적화된 Eno1의 최소 5%, 최소 10%, 최소 15%, 최소 20%, 최소 25%, 최소 30%, 최소 35%는 근육-표적화 잔기에 의해 근육으로 전달되며, 일부 구체예들에서는 바람직하게는 골격근 및/또는 평활근으로 전달된다. 일부 구체예들에서, 근육내로 투여하는 방식이 아닌 다른 방식으로 투여되어 근육으로 표적화된 Eno1이 근육 세포로 전달되는 양은 표적화되지 않은 Eno1이 근육으로 전달되는 양에 비해서 약 1.5 배 이상, 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 또는 6 배 이상 많다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "근육 표적화 펩타이드(muscle targeting peptide)" 또는 용어 "MTP"는 상기 펩타이드의 탑재체(예를 들어, Eno1)의 근육 세포(바람직하게는 골격근 및/또는 평활근 세포)로의 이동을 증가시키는 펩타이드 서열로 이해된다. MTPs는 당 기술분야에서 알려 있고, 예를 들어, 미국특허 제6329501호; 미국공개특허공보 제20110130346호; 및 Samoylova 외, 1999, Muscle and Nerve 22: 460-466에서 제공되는데, 이들 각각은 전부 본 명세서에 포함된다. 일부 구체예들에서, MTP는 골격근 표적화 펩타이드이다. 용어 "골격근 표적화 펩타이드" 는 골격근 세포로 상기 펩타이드의 탑재체(예를 들어, Eno1)의 전달을 증가시키는 펩타이드 서열이다. 일부 구체예들에서, MTP는 평활근 표적화 펩타이드이다. 용어 "평활근 표적화 펩타이드"는 평활근 세포로 상기 펩타이드의 탑재체(예를 들어, Eno1)의 전달을 증가시키는 펩타이드 서열이다. 일부 구체예들에서, MTP는 골격근 세포 및 평활근 세포로 상기 MTP의 탑재체(예를 들어, Eno1)의 전달을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, MTP(예를 들어, 골격근 표적화 펩타이드 및/또는 평활근 표적화 펩타이드)는 심근 세포로 상기 MTP의 탑재제의 전달을 증가시키지는 않는다. MTP (예를 들어, 골격근 표적화 펩타이드)는 아래에 명시된 서열들로 이루어진 펩타이드를 포함하지만, 상기 펩타이드에 국한되지는 않는다(펩타이드 서열들: ASSLNIA; WDANGKT; GETRAPL; CGHHPVYAC; 및 HAIYPRH). 바람직한 구체예로, MTP는 아미노산 서열 ASSLNIA을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "탑재체"는 표적화 잔기에 의해 표적 세포에 전달에 필요한 잔기로 이해된다. 일부 구체예들에서, 탑재체는 펩타이드(예를 들어, Eno1 펩타이드)이다. 일부 구체예들에서, 탑재체는 핵산(예를 들어, Eno1 펩타이드를 인코딩하는 핵산)이다. 일부 구체예들에서, 탑재체는 더 나아가 추가적인 구성요소들(예를 들어, 덴드리머들, 리포좀들, 미세입자들) 또는 에이전트(예를 들어, 치료제들)과 같이 표적 세포로 Eno1 탑재체의 전달에 필요한 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "연결자(linker)" 는 표적화 잔기와 탑재체을 충분히 인접하도록 병치시켜서 표적화 잔기에 의해서 탑재체가 원하는 위치로 전달되게 하는 잔기로 이해된다. 일부 구체예들에서, 연결자는 공유 연결자, 예를 들어, 가교제(가역 가교제; 펩타이드 결합 포함),인데, 예를 들자면 이러한 경우에서는 탑재체는 표적화 잔기와 함께 동시에 번역(translation)되는 단백질이다. 일부 구체예들에서, 연결자는 탑재체 또는 표적화 잔기 중 하나에 공유결합으로 이어지고 다른 하나에 비공유결합으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 연결자는 덴드리머를 포함한다. 일부 구체예들에서, 덴드리머는 표적화 잔기에 공유결합으로 연결되고 탑재제(예를 들어, Eno1)에 비공유결합으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 연결자는 리포좀 또는 미세입자이고, 그리고 표적화 잔기는 리포좀 및 탑재체의 표면에 노출되는데, 이에 대한 예로, Eno1은 리포좀 또는 미세입자에 피막화된다. 일부 구체예들에서, 연결자 및 Eno1은 미세입자 연결자의 표면에 위치한다. 일부 구체예들에서, 표적화 잔기는 바이러스 입자의 표면에 위치하고 탑재체는 Eno1을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "연결된(linked)", "작동되게 연결된(operably linked)", 용어 "이어진(joined)" 등은 병치를 지시하며, 전술된 상기 구성 요소들은 복합체에 존재하게 되는데 이는 상기 구성 요소들이 의도된 방식으로 작용되게 한다. 상기 구성 요소들은 공유결합(예를 들어, 펩타이드 결합, 이황화 결합, 비자연적인 화학 결합)으로 연결될 수 있으며, 상기 공유결합은 수소 결합(예를 들어, 구멍들-안으로-마디 단백질 짝짓기(knob-into-holes pairing of proteins), 예를 들어, 미국특허 제5,582,996호 참조; Watson-Crick 뉴클레오타이드 짝짓기(nucleotide pairing)), 또는 이온 결합(예를 들어, 킬레이터 및 금속)을 통해 연결될 수 있는데, 상기 연결은 직접적으로 또는 연결자들(예를 들어, 펩타이드 서열들, 전형적으로 짧은 펩타이드 서열들; 핵산 서열들; 또는 화학적 연결자들, 여기서 화학적 연결자들은 고차구조나 대형구조(미세입자들, 구슬들(beads), 또는 덴드리머들을 포함)에 부착을 위한 연결자의 사용을 포함함)을 통해서 이루어진다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 복합체의 구성 요소들은 리포좀 및/또는 덴드리머 내에서 및/또는 상에서 패키징(packaging)에 의해 서로 연결될 수 있는데, 여기에서 상기 복합체의 일부 구성 요소들은 공유결합으로 부착될 수 있고 상기 복합체의 다른 일부 구성 요소들은 비공유결합으로 부착될 수 있다. 연결자들은 활성 분자들간이 서로 분리되게 하여, 제2 분자와 제1 분자의 연결을 통하여 상기 분자들의 활성이 실질적으로 저해되지 않게 한다(10% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만). 연결자들은 표적화 잔기에 Eno1을 연결시키는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 본 발명의 시약들이 사용된 각각의 조건들(즉, 전형적으로 생리적 조건들)하에서, 연결된 분자들(단, 공유결합으로 연결된 분자들은 제외)은 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 또는 10-12 미만의 결합 친화력(결합 친화성, Kd)을 가지거나, 또는 상기 명시된 값들에서 나눌 수 있는 모든 범위에 해당되는 결합 친화력을 가진다.
일부 구체예들에서, 탑재체 및 표적화 잔기는 약 1:1의 몰 비율로 복합체에 존재한다. 일부 구체예들에서, 표적화 잔기는 탑재제의 몰 초과 상태로 복합체에 존재한다. 일부 구체예들에서, 표적화 잔기 대 탑재제의 비율은 약 0.1:1, 약 0.2:1, 약 0.3:1, 약 0.4:1, 약 0.5:1, 약 0.6:1, 약 0.7:1, 약 0.8:1, 약 0.9:1, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 11:1, 약 12:1, 약 13:1, 약 14:1, 약 15:1, 약 16:1, 약 17:1, 약 18:1, 약 19:1, 또는 약 20:1 이다.
용어 "덴드리머" 는 중심 핵심에서 부터 방사상으로 나오는 다중 분지 단량체들로 구성된다. 덴드리머들을 만드는데 사용되는 구조 및 합성 방법들으로 인해, 덴드리머 합성으로부터의 생산물들은 이론적으로 단분산이다. 덴드리머의 핵심이 제거될 때, 덴드론들(dendrons)로 불리는 많은 수의 동일한 단편들은 중심 핵심의 다양성에 의존적인 덴드론들의 수로 남아있다. 핵심에서부터 주변으로 이동하면서 접하는 분기점들의 수는 세대(generation)(예를 들어, G-1, G-2, G-3 등)로 정의하는데, 높은 세대들의 덴드리머들은 낮은 세대들의 덴드리머들 보다 더 크고, 많이 분지되도, 더 많은 말단기들을 가진다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 덴드리머는 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 덴드리머이다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "혈당 상승된 피험자(subject with elevated glucose" 또는 용어 "증가된 혈당(increased blood glucose)"는 병리학적인 상태로 간주되는 충분한 기간 및 빈도로 혈당 상승을 가지는 피험자, 즉, 충분한 인슐린을 만들어내지 않거나 인슐린에 충분히 민감하지 못하여 피험자의 글루코스 수치가 식사후 장기간 높게 유지되는(예를 들자면, 식후 2시간 이상) 피험자 및/또는 높은 공복 혈당을 가지는 피험자로 이해된다. 일부 구체예들에서, 최소 100 mg/dl 공복 혈당 및 최소 140 mg/dl의 75-g 경구 글루코스 부하검사에서 2-시간 혈장 글루코스 중에 하나의 경우에 해당되는 피험자 또는 상기 두 가지 경우에 모두 해당되는 피험자는 혈당 상승된 피험자로 이해된다. 일부 구체예들에서, 최소 126 mg/dl의 공복 혈당; 최소 200 mg/dl의75-g 경구 글루코스 부하검사에서 2-시간 혈장 글루코스; 또는 최소 200 mg/dl의 임의 혈장 글루코스 중에 하나의 경우에 해당되는 피험자 또는 상기 경우들 중 두 가지 이상의 경우에 해당되는 피험자는 혈당 상승된 피험자로 이해된다. 일부 구체예들에서, 최소 92 mg/dl의 공복 혈당; 최소 180 mg/dl의 75-g 경구 글루코스 부하검사에서 1-시간 혈장 글루코스; 및 최소 153 mg/dl의75-g 경구 글루코스 검사에서 2-시간 혈장 글루코스 중에 하나의 경우에 해당되는 임신 피험자 또는 상기 경우들 중 두 가지 이상의 경우에 해당되는 임신 피험자는 혈당 상승된 피험자로 이해된다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼 일부 구체예들에서, 절대 인슐린 결핍을 야기하는 제1형 당뇨병 또는 췌장병을 가지는 피험자들은 혈당 상승된 피험자에 포함되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼 일부 구체예들에서, 절대 인슐린 결핍을 야기하는 제1형 당뇨병 또는 췌장병을 가지는 피험자들은 혈당 상승된 피험자에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "당화혈색소(HbA1c) 상승된 피험자" 또는 용어 "당화혈색소(A1c) 상승된 피험자"는 최소 5.7%의 당화혈색소 수치를 가지는 피험자로 이해된다. 일부 구체예들에서, 상기 기술된 피험자는 최소 6.5%의 당화혈색소를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "당뇨병"은 제1형 당뇨병이나 또는 제2형 당뇨병을 언급하거나, 또는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두를 언급하거나, 선택적으로는 임신성 당뇨병과 결합하여 언급하기 위한 것이다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 제2형 당뇨병을 포함한다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 제1형 당뇨병을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 임신성 당뇨병을 포함한다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 임신성 당뇨병을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 당뇨병전증를 포함한다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 당뇨병전증를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 당뇨병전증, 제1형 당뇨병, 및 제2형 당뇨병을 포함한다. 일부 구체예들에서, 당뇨병은 당뇨병전증 및 제2형 당뇨병을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "인슐린 저항성(insulin resistance)" 및 용어 "인슐린 불감성(insulin insensitivity)"은 호환적으로 사용될 수 있고 질환들, 특히 병리 질환들을 지시하는데, 상기 질환들에서는 인슐린 양이 혈당을 낮추는데 정상 피험자에서 보다 비효과적이서, 결과적으로 정상 범위 이상으로 혈당이 증가하게 되는데, 상기 언급한 혈당 증가는 인슐린 결핍에 의한 것은 아니다. 메카니즘에 제한됨 없이, 상기 질환들은 인슐린 수용체를 통한 신호전달의 감소와 일반적으로 연관된다. 일반적으로, 근육 및 지방 세포들에서 인슐린 저항성은 글루코스 섭취를 감소시키고 글리코겐(glycogen)과 트리글리세라이드(triglycerides) 각각으로 글루코스 저장을 감소시킨다. 간세포에서의 인슐린 저항성은 글리코겐 합성 저해를 초래하고 글루코스 생성 및 혈액으로 글루코스 방출을 억제하지 못 하게 한다.
인슐린 저항성은 "인슐린 기능저하(insulin insufficiency)"와 함께 동일한 피험자에게서 흔히 나타나며, 상기 "인슐린 기능저하" 또한 인슐린 결핍과는 무관하게 정상 범위 이상으로 혈당 증가(특히 병적인 혈당 증가)를 초래한다. 인슐린 기능저하는 인체에서 인슐린이 생산되고 존재하나 인슐린 작용의 부재와 연관되어 발생되는 질환이다. 상기 질환은 도세포(islet cell)의 결핍으로 인슐린이 생성되지 않는 제1형 당뇨병과는 구분된다.
본원 발명의 방법들의 목적으로는, 피험자가 인슐린 저항성/ 불감성, 인슐린 기능저하, 또는 둘 다에 걸려 있으면 구분할 필요는 없다.
용어 "내당능 장애(impaired glucose tolerance, IGT)" 또는 용어 "당뇨병전증(pre-diabetes)"는 글루코스 부하검사시 정상에서 고혈당 사이의 혈당 수치를 가지는, 즉, 비정상적인 글루코스 내성(예를 들어, 병리학적으로 비정상적인 글루코스 내성), 개인을 기술할 때 사용된다. 상기 기술된 개인은 임상적으로 당뇨병을 가진 것은 아니더라도 당뇨병에 걸릴 높은 위험이 있다. 예를 들어, 110 mg/dl를 초과하고 126 mg/dl(7.00 mmol/L) 미만의 공복 혈당 농도 또는 공복 혈청 글루코스 농도를 가지는 환자, 또는 140 mg/dl(7.78 mmol/L)를 초과하고 200 mg/dl(11.11 mmol/L) 미만의 식후 2시간 혈당 농도 또는 혈청 글루코스 농도를 가지는 환자에서 보이는 질환을 가리켜 내당능 장애라고 한다. 내당능 장애 또는 공복 혈당 장애로도 불리어 지는 당뇨병전증은 제2형 당뇨병, 심혈관계 질환의 발병 및 사망의 주요한 위험 요소이다. 당뇨병전증의 효과적 치료를 통해서 제2형 당뇨병의 발병을 억제하는 치료적 개입을 개발하는데 많은 초점이 맞추어져 왔다(Pharmacotherapy, 24:362-71, 2004).
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "병리학적인(pathological)" 상태는 임상적으로 받아들일 수 있는 질병의 한계점 또는 상태에 이르는 것이다. 병리학적 상태가 해결되지 않으면(예를 들어, 혈당 및/또는 당화혈색소 수치가 정상화되지 않으면), 상기 병리학적 상태는 피험자에게 심각한 악영향을, 특히 장기적으로, 초래할 수 있다. 병리학적인 상태들은 치료제, 수술, 및/또는 생활 방식의 변화를 통해서 회복될 수 있다. 병리학적인 상태는 만성적일 수도 있고 또는 만성적이지 않을 수 있다. 병리학적인 상태는 가역적일 수도 있고 또는 가역적이지 않을 수도 있다. 병리학적인 상태는 말기일 수도 있고 또는 말기가 아닐 수도 있다.
용어 "고인슐린혈증(Hyperinsulinemia)"은 인슐린 저항성을 가지는 피험자(정상혈당이거나 또는 정상혈당이 아닌)에서 공복 또는 식후 혈청(또는 혈장) 인슐린 농도가 인슐린 저항성을 가지지 않는 정상이고, 마른 개인의 상기 기술된 농도에 비해 그 이상으로 상승된 상태(즉, 공복 혈장 글루코스 검사에서 >100 mg/dl의 농도 또는 경구 글루코스 부하검사에서 > 140 mg/dl의 농도)로 정의된다.
"고혈당증(hyperglycemia)"(높은 혈당)은 혈당 수치가 매우 높은 상태이다. 전형적으로, 고혈당증은 혈당 수치가 180 mg/dl 보다 높게 증가할 때 발생한다. 고혈당증의 증상들은 잦은 배뇨, 과도한 갈증 및, 장기간에 걸친 체중 감소를 포함한다.
"저혈당증(hypoglycemia)"(낮은 혈당)은 혈당 수치가 매우 낮은 상태이다. 전형적으로, 저혈당증은 혈당 수치가 70 mg/dl 이하로 떨어질 때 발생된다. 저혈당증의 증상들은 우울, 사지의 무감각(특히 손 및 팔에서), 착란, 불안정 또는 어지럼증을 포함한다. 상기 상태는 사용 가능한 글루코스 양 이상으로 과잉의 인슐린인 존재할 때 발생되기 때문에, 인슐린 반응으로 때때로 언급된다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "당화혈색소 수치(HbA1c level)" 또는 용어 "당화혈색소 수치(A1c level)"는 이전 2달 및 3달 동안의 평균 혈당 수치를 평가하는 당화혈색소 검사에서 측정되는 당화혈색소(hemoglobin Alc, 당화혈색소) 수치로 이해된다. 당뇨병이 없는 개인은 일반적으로 4%에서 6% 사이의 당화혈색소 값을 가진다. 당뇨병전증은 5.7%에서 6.5%의 병리학적 당화혈색소 수치를 가지는 것이 특징인데, 이때 6.5%를 초과하는 당화혈색소 수치는 당뇨병의 징후이다. 당화혈색소에서 매 1% 증가는 약 30 mg/dL까지의 혈당 수치 증가를 나타내고 지속적인 혈당 상승으로 합병증의 위험을 증가시킨다. 바람직하게는, 본 발명에 따라서 치료되는 환자의 당화혈색소 값은 9% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5%까지 감소된다. 그러므로, 치료되는 환자의 과도한 당화혈색소 수치(즉, 5.7%를 초과하는 당화혈색소 수치)는 바람직하게는 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 까지, 또는 치료전 당화혈색소 수치에 좀 더 상대적인 값까지(즉, 처리전 수치 - 처리후 수치/처리전 수치) 낮아진다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "피험자(subject)"는 인간 및 인간이 아닌 동물(가축 피험자 포함)을 지시한다. 용어 "인간이 아닌 동물"은 모든 척추동물들(예를 들어, 포유류 및 포유류가 아닌 동물(예를 들어, 영장류, 생쥐, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류))을 포함한다. 바람직한 구체예로, 상기 피험자는 인간이고, 그리고 환자로 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "치료하다(treat)", 용어 "치료하는 것(treating)" 또는 용어 "치료(treatment)"는, 바람직하게는, 질병 또는 상태에 대한 하나 이상의 징후들 또는 증상들의 경감 또는 개선(그 결과 질병의 범위를 줄이고 질병의 안정화 상태를 약화시킴(즉, 악화시키지 않음)) 그리고 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화를 포함하는(하지만 그것에 국한되지 않고) 유익하거나 또는 요구되는 임상적 결과를 얻기 위한 행위를 지시한다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 치료는 인슐린 저항성 감소, 인슐린 감수성 증가, 인슐린 결핍 감소, 당화혈색소 수치 정상화 또는 증진, 혈당 수치(예를 들어, 공급 혈당 수치, 공복 혈당 수치, 글루코스 내성) 정상화 또는 증진, 및 최소 한 가지의 당뇨병 징후 또는 증상 개선 중에 하나 이상을 포함할 수 있다. 당뇨병(제2형 당뇨병 포함) 치료에서 치료 목표는 당화혈색소 수치 < 6.5%; 식전 혈당 80-120 mg/dl; 및 식후 2시간 혈당 < 140 mg/dl를 포함한다. 당뇨병전증 치료에서 치료 목적은 당화혈색소, 혈당 수치의 감소 및 정상 수치로 글루코스 반응을 포함한다. 치료는 치유력이 있거나 또는 치료의 이상적인 치료 목표에 도달할 필요는 없다. 치료의 결과는 정량적으로 밝힐 필요는 없다. 하지만, 일부 구체예들에서, 치료 결과들은 범위 끝 부분에서 정상 값에 대한 백분율 향상을 고려하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, 신진대사장애는 일부 측정값들(예를 들어, 혈당 수치, 당화혈색소 수치)의 과잉으로 특징되거나 다른 측정들(예를 들어, 인슐린 반응)에서의 결핍으로 특징된다. 150 mg/dl 의 공복 혈당 수치를 가지는 피험자는 50 mg/dl(150 mg/dl-100mg/dl, 최대 정상 혈당 수치)의 과잉 공복 혈당을 가질 것이다. 20% 과잉 혈당의 감소는 과잉 혈당에서 10 mg/dl 감소일 것이다. 유사한 계산은 다른 값에 대해서 만들어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, "글루코스 수치를 줄이는 것(reducing glucose levels)"은 정상화된 글루코스 수치를 얻기 위해(즉, 글루코스 수치가 150 mg/dl를 초과하지 않는) 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상으로 과잉의 글루코스를 줄이는 것을 의미한다. 바람직하게는, 식전 글루코스 수치는 정상 혈당 수치(즉, 60에서 150 mg/dL 사이, 70에서 140 mg/dL 사이, 70에서 130 mg/dL 사이, 80에서 125 mg/dL 사이, 그리고 바람직하게는 80에서 120 mg/dL 사이)로 감소된다. 상기 기술된 글루코스 수치 감소는 혈액으로부터 글루코스를 제거하는 것과 연관된 생활성들 중에 하나를 증가함으로써 얻어질 것이다. 그래서, 글루코스 수치를 감소시킬 수 있는 물질은 인슐린 생성, 분비, 또는 작용을 증가시킬 것이다. 예를 들어, 말초 조직에 의한 글루코스 섭취 증가 및/또는 간 글루코스 생성 감소에 의해서 인슐린 작용은 증가될 것이다. 또는, 상기 물질은 창자로부터 당질의 흡수를 감소시킬 것이고, 글루코스 수송체의 활성을 변화시킬 것이고(예를 들어, GLUT4 발현, 내재성 활성, 또는 전위 증가를 통해서), 인슐린-민감성 조직들의 양을 증가시킬 것이고(예를 들어, 근육 세포 또는 지방 세포 분화 증가를 통해서), 또는 지방 세포들 또는 근육 세포들에서 유전자 전사를 변화시킬 것이다(예를 들어, 대사경로 유전자들의 지방세포 발현에서 요소들이 변화된 분비). 바람직하게는, 상기 물질은 글루코스 제거와 연관된 할성들 중 하나 이상을 증가시킨다.
용어 "인슐린 신호전달경로 변화로 글루코스 수치 감소"는 인슐린 신호전달에 연관된 활성들 중에 하나를 변화(증가 또는 감소를 통해서)시켜서 혈장으로부터 글루코스의 제거를 증가시키는 전반적 결과를 낳게 되고 그리고 혈당을 정상화하게 된다. 예를 들어, 인슐린 신호전달경로의 변화로 인해 인슐린 생성, 분비, 또는 작용의 증가, 말초 조직들에 의한 글루코스 섭취 증가, 간에서의 글루코스 생성 감소, 또는 창자로부터 당질 흡수 감소가 유발된다.
용어 "치료적으로 효과적인 양"은 피험자에서 질병 치료에 충분한 양이다. 치료적으로 효과적인 양은 하나 이상의 투여에 적용되어 투여될 수 있다.
제2형 당뇨병에 대한 다수의 치료들은 약물 및 행동 개입을 포함하여 당 기술분야에서 알려 있다. 제2형 당뇨병의 치료 약물로는 메글리티나이드계(meglitinides)로 레파글나이드(repaglinide(Prandin)) 및 나테글나이드(nateglinide(Starlix)); 설폰요소제(sulfonylureas)로 글리피자이드(glipizide(Glucotrol)), 글리메피라이드(glimepiride(Amaryl)), 및 글리부리드(glyburide(DiaBeta, Glynase)); DPP-4 억제제(Dipeptidy peptidase-4, DPP-4, 저해제s)로 삭사글립틴(saxagliptin(Onglyza)), 시타글립틴(sitagliptin(Januvia)), 및 리나글립틴(linagliptin(Tradjenta)); 비구아나이드계(biguanides)로 메트포르민(metformin(Fortamet, Glucophage)); 치아졸리딘디온계(thiazolidinediones)로 로지글리타존(rosiglitazone(Avandia)) 및 피오글리타존(pioglitazone(Actos)); 및 알파글루코시다아제 억제제(alpha-glucosidase 저해제s)로 아카보스(acarbose(Precose)) 및 미그리톨(miglitol(Glyset))을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 인슐린들은 일반적으로 제2형 당뇨병 말기 치료시에만 사용되며, 그리고 초속효성 인슐린(rapid-acting insulin)으로 인슐린 아스파르트(insulin aspart(NovoLog)), 인슐린 글루리신(insulin glulisine(Apidra)), 및 인슐린 리스프로(insulin lispro(Humalog)); 속효성 인슐린(short-acting insulin)으로 인슐린 레귤러(insulin regular(Humulin R, Novolin R)); 중간형 인슐린(intermediate-acting insulin)으로 인간 인슐린 NPH(insulin NPH human(Humulin N, Novolin N)); 및 지속형 인슐린(성 insulin)으로 인슐린 글라진(insulin glargine (Lantus)) 및 인슐린 디터머(insulin detemir(Levemir))을 포함한다. 당뇨병 치료는 운동 및 체중 감량을 포함하는 행동 수정도 포함되며, 상기 체중 감량은 약물 사용 및 수술에 의해 촉진될 수 있다. 혈당 상승 및 당뇨병에 대한 치료는 병행될 수 있다. 예를 들어, 약물 요법는 행동 수정 요법과 병행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "진단(diagnosing)" 등은 관찰, 시험에 근거하여 피험자의 상태에 대한 임상적 또는 다른 평가를 지시하거나, 또는 질병, 장애를 가지는 피험자를 확인하는 상황을 지시하거나, 또는 적어도 하나의 지표(예를 들어, 질병, 장애의 징후나 증상과 같은)가 존재하는 조건을 지시한다. 일반적으로, 본 발명의 방법을 사용한 진단은 질병, 장애와 같은 다양한 지표들에 근거한 피험자에 대한 관찰을 포함하거나, 또는 본 발명에서 제공된 방법들과 함께 제시되는 조건을 포함한다. 진단 방법들은 질병 존재 유무를 보여준다. 단일 진단 검사는 일반적으로 검사받는 피험자의 질병 상태에 관하여 최종적인 결론은 제공하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "감시(monitoring, 모니터링)"는 첫번째 시점 그리고 그 뒤를 잇는 두번째 시점에 피험자에게서 질병의 징후나 증상을 한 가지 이상 평가하는 것으로 이해되며, 상기 감시를 통해 상태에 대한 징후 또는 증상의 심각성을 비교하고, 그리고 상태가 시간 경과에 따라 다소간 심각해지는지 여부를 결정한다.
용어 "투여하다(administer)", 용어 "투여하는 것(administering)" 또는 용어 "투여(administration)"는 피험자의 시스템 또는 피험자내의(또는 상의) 특별한 부위로 약학적 조성물 또는 물질의 전달하는 방법을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 물질은 경구적으로 또는 비경구적으로 투여된다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 물질은 정맥내로, 근육내로, 피하로, 피부층 사이로, 비강내로, 경구로, 경피로, 또는 점막으로 투여된다. 일부 바람직한 구체예들에서, 물질은 주입 또는 투약 방식으로 투여(예를 들어, 정맥내로, 근육내로, 피하로)된다. 일부 구체예들에서, 투여는 펌프사용을 포함한다. 일부 구체예들에서, 물질은 부분적으로 또는 전신으로 투여된다. 물질을 투여하는 것은 협력하여 일하는 다수의 사람들에 의해서 실행될 수 있다. 물질을 투여하는 것은 (예를 들어) 피험자에게 투여될 물질을 처방하는 것 및/또는 (직접적으로나 다른 것을 통해) 특정 물질을 취하도록 지침을 제공하는 것을 포함하는데, 이때 자가 전달(예를 들어, 경구복용, 피하 전달, 중심선을 통한 정맥내 전달 등)을 통해; 또는 훈련받은 전문가에 의한 전달(예를 들어, 정맥내 전달, 근육내 전달 등)을 통해 물질 투여가 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "공동 투여(co-administering)"는 당뇨병, 당뇨병전증, 글루코스 불내성, 또는 인슐린 저항성의 치료를 위한 물질의 투여시 Eno1을 공동으로 투여하는 것으로, 상기 물질의 투여 전에, 상기 물질의 투여와 동시에 또는 실질적으로 동시에, 상기 물질의 투여 직후에, 또는 상기 물질의 투여와 함께 간헐적으로 Eno1이 투여되는 것을 지시한다. 본 발명서에 명시된 Eno1 제제는 당뇨병, 당뇨병전증, 글루코스 불내성, 또는 인슐린 저항성의 치료를 위해 최소 한 가지의 다른 치료제와 함께 복합 치료에 사용될 수 있다. Eno1 및/또는 이의 약학적 제제들 및 다른 치료제는 추가적으로 작용하거나 또는 (좀 더 바람직하게는) 상승 작용에 의해 작용할 수 있다. 하나의 구체예로써, Eno1 및/또는 이의 제제는 당뇨병, 당뇨병전증, 글루코스 불내성, 또는 인슐린 저항성의 치료를 위해 다른 치료제와 동시에 투여된다. 다른 구체예로써, Eno1 및/또는 이의 약학적 제제는 당뇨병, 당뇨병전증, 글루코스 불내성, 또는 인슐린 저항성의 치료를 위해 다른 치료제의 투여 직후에 또는 다른 치료제의 투여 전에 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "시료(sample)"는 유사한 유체들, 세포들, 또는 피험자로부터 분리된 조직들의 집합체를 지시한다. 용어 "시료"는 피험자에게서 분리한 체액(예를 들어, 소변, 혈청, 혈액 유체, 림프, 부인과 유체, 방광 유체, 복수액, 안구액, 및 기관지 세척 및/또는 복막 세척으로 얻은 유체), 복수, 조직 시료 또는 세포를 포함한다. 다른 시료는 눈물 방울, 혈청, 뇌척수액, 배설물, 가래, 및 세포 추출물을 포함한다. 특별한 구체예들에서는, 시료는 소변 또는 혈청이다. 일부 구체예들에서 시료는 세포를 포함한다. 다른 구체예들에서는, 시료는 세포를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "대조 시료(control sample)"는 임상적으로 유의미한 비교 시료(예를 들어, 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 당뇨병, 또는 당뇨병전증을 앓지 않는 건강한 피험자로부터 분리된 시료; 또는 피험자의 이전 시점(예를 들어, 치료전, 치료 초기단계)에서 분리된 시료를 포함한다)를 지시한다. 대조 시료는 키트(kit)에서 제공되는 정제된 시료, 단백질, 및/또는 핵산일 수 있다. 상기 대조 시료들은 희석될 수 있다, 예를 들어, 검사 시료에서 분석물들의 정량적인 측정을 위해 계열 희석으로 희석될 수 있다. 대조 시료는 하나 이상의 피험자들로부터 분리된 시료를 포함할 것이다. 대조 시료는 측정받을 피험자로부터 초기 시점에서 만들어진 시료일 수도 있다. 예를 들어, 대조 시료는 비정상적인 혈당 수치 또는 당화혈색소 수치가 시작되기 전에, 질병 초기에, 또는 치료제(또는 치료제의 일부)를 투여하기 전에 평가 받은 피험자로부터 분리된 시료일 수 있다. 대조 시료는 동물 모델에서 분리된 시료이거나, 또는 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 당뇨병, 또는 당뇨병전증의 동물 모델로부터 분리된 조직 또는 세포에서 얻어진 시료일 수 있다. 측정들의 집합으로 이루어진 대조 시료에서 Eno1활성 또는 발현 정도는 (예를 들어) 적당한 통계적 측정(예를 들어, 평균값, 중앙값, 또는 가장 빈번한 값을 포함하는 중심 경향의 측정)에 기초하여 결정되어질 것이다.
용어 "대조 수치(control level)"는 피험자 또는 피험자 시료에서 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 당뇨병, 또는 당뇨병전증의 징후에 대한 용인되거나 설정된 수치를 지시한다. 아래에 언급되는 수치는 정상 수치로 고려된다:
-- 100 mg/dl 와 같거나 또는 미만의 공복 혈당.
-- 5.7% 와 같거나 또는 미만의 당화혈색소.
-- 140 mg/dl 와 같거나 또는 미만의 경구 글루코스 부하검사.
상기 수치를 넘는 수치는 병리학적 수치로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 생체지표의 "설정된 한계값(predetermined threshold value)" 은 생체지표의 수치(예를 들어, 생물학적 시료에서 발현 수치 또는 수량(예, ng/ml)) 또는 대조 시료/정상 시료에 상응하는 혈당 상승에 대한 다른 지표의 수치 또는 정상(또는 건강한) 피험자(예를 들어, 비정상적인 혈당을 가지지 않는 피험자)로부터 얻어진 대조 시료/정상 시료의 그룹의 수치를 지시한다. 설정된 한계값은 생물학적 시료에서 마커 수치 측정전에 결정되거나 또는 마커 수치와 동시에 측정되면서 결정될 것이다. 대조 시료는 이전 동일한 피험자로부터 얻어지거나 또는 다른 피험자로부터 얻어질 것이다
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "이전 시점(earlier time point)"에서 얻어진 시료는 충분히 지난 시점에서 얻어졌던 시료인데, 이후 시점과 비교하여 이전 시점에서의 시료에서 임상적으로 유의미한 정보를 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 최소 4주 전이다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 6주 전이다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 최소 2달 전이다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 최소 3달 전이다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 최소 6달 전이다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 최소 9달 전이다. 일부 구체예들에서, 이전 시점은 최소 1년 전이다. 다양한 피험자 시료들(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 그 이상)은 시간 경과에 따라 일정한 간격(또는 불규칙적으로) 얻어질 수 있고 지표 수치의 변화 추세가 분석될 수 있다. 특정 피험자를 검사하는 적절한 간격은 일반적 고려를 기초로 한 당 기술분야에서의 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "얻는 것(obtaining)"은 생산, 구매, 또는 다르게는 소유하는 것을 지시하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "검출하는 것(detecting)", 용어 "검출(detection)" 등은 시료에서 특정 분석물의 확인을 위해 수행되는 분석을 지시하는 것으로 이해된다(예를 들어, 시료에서 Eno1 발현 또는 활성 수치). 시료에서 검출되는 분석물의 양 또는 활성은 분석이나 방법에서 검출된 정도 이하 일수 있다. 검출하는 것 또는 검출은 글루코스 및/또는 당화혈색소 수치의 측정도 포함할 수 있다.
용어 "조절하다(modulate)" 또는 용어 "조절(modulation)"은 정도의 상향조절(즉, 활성화 또는 자극), 하향조절(즉, 저해 또는 억제), 또는 상기 두 가지를 함께 또는 따로 구분하여 지시한다. 용어 "조절자(modulator)"는 조절하는 복합체 또는 분자이고, 예를 들어, 작용제, 대항제, 활성제, 자극물질, 억제제, 또는 저해제일 수 있다.
용어 "발현(expression)"은 폴리펩타이드가 DNA에서 생성되는 과정을 의미하는 것으로 본 명세서에서는 사용된다. 상기 과정은 유전자가 mRNA로 전사되는 것과 전사된 mRNA가 폴리펩타이드로 번역되는 것과 연관된다. 사용된 맥락에 따라서 용어 "발현"은 RNA의 생성, 또는 단백질의 생성, 또는 RNA 및 단백질 두 가지 모두의 생성을 지시할 수도 있다.
용어 "유전자 발현의 정도(level of expression of a gene)" 또는 용어 "유전자 발현 정도(gene expression level)"는 mRNA(뿐만 아니라 전구 mRNA 신생 전사물(들), 전사 과정 중간산물들, 성숙 mRNA(들) 및 분해 산물들도 해당됨)의 정도를 지시하거나, 또는 세포내 유전자에 의해서 인코딩되는 단백질의 정도를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "증폭(amplication)"은 타겟 핵산 서열 또는 이의 보완물 또는 이의 단편들에 대한 다수의 복제물("amplicons") 얻기 위한 알려진 생체외 과정을 지시한다. 생체외 증폭은 완전한 타겟 부위 서열 또는 이의 보완물보다 적게 포함하는 증폭된 핵산의 생성을 지시한다. 알려진 생체외 증폭 방법들로는 전사-중재(transcription-mediated) 증폭, 복제효소-중재(replicase-mediated) 증폭, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭, 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR) 증폭 및 가닥-전위 증폭(strand-displacement amplification, SDA;다중 가닥-전위 증폭 방법(multiple strand-displacement amplification method, MSDA)포함) 등의 예들이 있다. 복제효소-중재 증폭은 자가-복제 RNA 분자들, 및Q-β-복제효소(Q-β-replicase)와 같은 복제효소(예를 들어, Kramer 외, 미국특허 제4,786,600호)를 사용한다. PCR 증폭은 잘 알려 있고, DNA 또는 cDNA의 두 개의 상보적 가닥들의 다중 복제물을 합성하기 위해 DNA 중합효소, 프라이머 및 열 사이클(thermal cycling)을 사용한다(예를 들어, Mullis 외, 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호). LCR 증폭은 다중 사이클의 부합, 결찰, 및 변성을 사용하여 타겟 및 이의 상보적 가닥을 증폭하기 위해 최소 4개의 분리된 올리고핵산염을 사용한다(예를 들어, 유럽공개특허공보 제0 320 308호). SDA는 타겟 서열을 포함하는 절반이 수정된 이중 DNA의 한 가닥을 절단하는 제한 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 프라이머를 포함하는 방법으로 프라이머 신장, 가닥 치환 단계의 연속으로 증폭되어진다(예를 들어, Walker 외, 미국특허 제5,422,252호). 알려진 두 가지 다른 가닥-전위 증폭 방법들은 핵산내부가수분해효소 절단이 요구되지 않는다(Dattagupta 외, 미국특허 제6,087,133호 및 미국특허 제6,124,120호(MSDA)). 당 기술분야에서의 상기 전문적인 기술들은 본원 발명의 올리고핵산염 프라이머 서열들이 중합효소에 의한 프라이머 신장을 기반으로 한 생체외 증폭 방법에 손쉽게 사용될 수 있다는 것을 이해한다(Kwoh 외, 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25참조 및 Kwoh 외, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi 외, 1988, Bio기술 6:1197-1202; Malek 외, 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260; 및 Sambrook 외, 2000, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Third Edition, CSH Laboratories). 당 기술분야에서 일반적으로 알려 있듯이, 올리고핵산염들은 선별된 조건하에서 상보적 서열에 결합되게 만들어진다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "항원(antigen)"은 피험자에서 항체 반응을 끌어내거나, 또는 항체에 인지되고 결합되는 분자(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 단편, 또는 다른 생물학적 일부분)를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "상보적(complimentary)"은 두 개의 핵산 가닥들의 부위들 사이에서 서열 상보성 또는 동일한 핵산 서열 내의 두 부위 사이에서 서열 상보성에 대한 폭넓은 개념을 지시한다. 첫번째 핵산 부위의 잔기가 아데닌(adenine) 잔기일 경우 두번째 핵산 부위의 잔기가 타이민(thymine) 또는 유라실(uracil)이면 두번째 핵산 부위가 첫번째 핵산 부위에 역평행하다고 하는데, 이때 첫번째 핵산의 잔기와 두번째 핵산의 잔기는 서로 간에 특이적인 수소 결합("염기짝짓기(base pairing)")을 형성할 수 있다고 알려 있다. 유사하게, 첫번째 핵산 가닥의 사이토신(cytosine) 잔기는 두번째 핵산 가닥의 잔기(만약 잔기가 구아닌(guanine)이면 첫번째 가닥에 역평행한)와 염기짝짓기를 할 수 있다고 알려 있다. 핵산의 첫번째 부위가 동일한 핵산 또는 다른 핵산의 두번째 부위에 상보적일 경우, 두 부위들은 역평행적으로 정렬되면서, 첫번째 부위의 최소 하나의 뉴크레오타이드 잔기가 두번째 부위의 잔기와 염기짝짓기 할 수 있다. 바람직하게는, 첫번째 핵산 부위는 첫번째 부분을 포함하고 두번째 핵산 부위는 두번째 부분을 포함하는데, 그로 인해, 첫번째 부분들과 두번째 부분들이 역평행한 방식으로 정렬될 때 첫번째 부분들의 뉴클레오타이드 잔기들의 최소 약 50%, 및 바람직하게는 최소 약 75%, 최소 약 90%, 또는 최소 약 95% 가 두번째 부분에 있는 뉴클레오타이드 잔기들과 염기짝짓기를 할 수 있다. 더 바람직하게는, 첫번째 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기들은 두번째 부분에 있는 뉴클레오타이드 잔기들과 염기짝짓기를 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 구문 "특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합(specifically binding)"이 항체 및 단백질(또는 펩타이드)의 상호 작용에 관하여 사용될 때, 상기 상호 작용은 단백질 상의 특정한 구조(즉, 항원결정기 또는 항원결정부위)의 존재에 의존적이라고 한다; 다시 말해서, 전반적인 단백질 보다는 특정한 단백질 구조를 인지 및 결합한다. 예를 들어, 항체가 항원결정부위 "A"에 특이적이면, 표지된 "A"와 상기 항체를 포함하는 반응에서 항원결정부위 A(또는 유리, 비표지된 A)를 포함하는 단백질의 존재는 항체와 결합을 이루는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
문구 "특이적 확인(specific identification)"은 분석을 통해서 관심을 가지는 표지물을 검출시, 충분히 낮은 배경지식 및 (사용된 시약들에서)교차 반응성을 가져서 상기 검출 방법이 진단적으로 유용한 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 표지물의 특이적인 확인을 위한 시약들은 상기 표지물의 하나의 동형에만 결합한다. 일부 구체예들에서, 표지물의 특이적인 확인을 위한 시약들은 상기 표지물의 하나 이상의 동형에 결합한다. 일부 구체예들에서, 표지물의 특이적인 확인을 위한 시약들은 상기 표지물의 알려진 모든 동형들에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 문구 "혈당 상승으로 의심되는 피험자(subject suspected of having elevated blood glucose)"는 혈당 상승을 나타내거나 또는 혈당 상승으로 일치되는 하나 이상의 징후들이나 증상들을 보이는 피험자 또는 혈당 상승으로 검사된(예를 들어, 일상적인 건강 진단 동안) 피험자를 지시한다. 혈당 상승으로 의심되는 피험자는 하나 이상의 위험 요소들을 가질 것이다. 혈당 상승으로 의심되는 피험자는 비정상적인 글루코스 수치, 대사, 또는 반응에 대해 일반적으로 검사되진 않는다. 하지만, "혈당 상승으로 의심되는 피험자(subject suspected of having elevated blood glucose)"는 초기 진단(예를 들어, 상승된, 하지만 확인되지 않은, 혈당의 단일 발생)을 받았지만, 상승 혈당의 정도는 알려지지 않은 개인을 포함한다. 상기 용어는 한 때 혈당 상승을 가졌던 사람들도 더 포함한다(예를 들어, 장기간(예를 들어, 최소 3개월, 최소 6개월 등) 동안 정상 혈당 및/또는 당화혈색소 수치를 유지했던 개인이 혈당 상승에 대해 치료 받은 경우).
관사들, 용어 "하나" 및 용어 "상기"는 별도로 명확하게 대조적으로 지시되지 않는 한, 상기 관사의 문법적 개체의 하나 또는 하나 이상(즉 최소 하나)을 지시한다. 한 예로서, 용어 "하나의 요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는" 는 본 명세서에서 문구 "포함하지만 국한되지는 않는"을 의미하기 위해서 사용되고, 문구 "포함하지만 국한되지는 않는"과 호환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥에서 분명하게 다르게 지시하지 않는 한, 본 명세서에서 용어 "및/또는"을 의미하기 위해서 사용되고, 용어 "및/또는"와 호환적으로 사용된다.
용어 "와 같은"는 본 명세서에서 문구 "와 같지만 국한되지는 않는"을 의미하기 위해 사용되고, 문구 "와 같지만 국한되지는 않는"와 호환적으로 사용된다.
특별한 언급이 없거나 또는 문맥상 명확히 언급되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "약"은 당 기술분야에서 정상 내성의 범위내(예를 들어, 평균의 2 표준편차내)로 이해된다. 약은 명시된 수치의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1 %, 0.05%, 또는 0.01% 내로 이해될 수 있다. 문맥에서 별도로 명확하지 않는 한, 본 명세서에서 제공된 모든 수치들은 용어 "약"으로 수식될 수 있다.
본 명세서에서의 변수의 정의에서 화학적 그룹에 대한 목록의 설명은 단일 그룹으로 상기 변수의 정의 또는 목록된 그룹들의 조합으로 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 발명에서의 변수 또는 양태에 대한 구체예의 설명은 단일 구체예로서의 상기 구체예 또는 다른 구체예들 또는 이의 부분들의 조합한 상기 구체예를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 조성물들 또는 방법들은 본 명세서에 제공된 다른 조성물들 및 방법들 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 범위들은 상기 범위내의 모든 값들에 대한 속기(shorthand)로 이해된다. 예를 들어, 1에서 50 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 으로 구성된 그룹으로부터의 어떠한 숫자, 숫자들의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
참고는 본 발명의 바람직한 구체예들에 자세히 만들어질 것이다. 본 발명은 바람직한 구체예들과 함께 기술되지만, 이는 상기 바람직한 구체예들에 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아닌 것으로 이해된다. 그와 반대되게, 첨부된 청구서에 규정된 대로 본 발명의 정신 및 영역 내에 포함될 수 있는 것으로 대안들, 수정들, 및 등가물들을 포함시키고자 의도된다.
IIA . 에놀라아제 1
에놀라아제 1,(알파) (Enolase 1, (alpha))은 또한 ENO1L, 알파-에놀라아제(alpha-enolase), 에놀라아제-알파(enolase-alpha), 타우 크리스탈린(tau-crystallin), 비신경 에놀라아제(non-neural enolase, NNE), 알파 에놀라아제 유사 1(alpha enolase like 1), 포스포피루브산 수화효소(phosphopyruvate hydratase,PPH), 플라스미노겐-결합 단백질(plasminogen-binding protein), MYC 프로모터-결합 단백질 1(MYC motor-binding protein 1, MPB1), 및 2-인산-D-글리세르산염 하이드로-라이에이스(2-phospho-D-glycerate hydro-lyase)으로도 알려 있으며 포유류에서 발견되는 세가지 에놀라아제 동종효소들 중에 하나이다. 각각의 동종효소는 2개의 알파, 2개의 감마, 또는 2개의 베타 서브유닛으로 구성된 동종이합체이고, 해당효소로 작용한다. 추가로, 알파-에놀라아제는 단량체 형태로 수정체 구조 단백질(타우 크리스탈린)로 작용한다. 상기 유전자의 선택적 이어맞추기(alternative splicing)는 짧은 동형이 생성되게 하고, 상기 동형은 c-myc 프로모터에 결합하고 종양 억제제로 역할하는 것으로 입증되었다. 몇몇 위유전자들(pseudogenes)이 확인되었는데, 1번 염색체의 긴 팔 상에 하나를 포함한다. 알파-에놀라아제는 하시모토 뇌병증(Hashimoto encephalopathy)에서 자가항원으로 확인되었다. 인간 Eno1에 관한 추가 정보는, 예를 들어, 유전자 ID 번호 2023 해당되는 NCBI 유전자 데이터베이스(참고, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2023, 본 출원서 출원일에 유효한 버전에서 참고로 본 명세서에 포함됨)에서 확인될 수 있다.
Eno1 변이체들
인간 Eno1은 두 가지 동형들이 알려 있다. 호모사피엔스 에놀라아제1,(알파)(ENO1), 제1형 전사 변이체, mRNA의 단백질 및 mRNA 서열들은 GenBank 접근번호 NM_001428(참조, www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001428.3, 본 출원서 출원일에 유효한 버전에서 참고로 포함됨)에서 확인될 수 있다. 상기 변이체는 세포기질에 위치하고, 알파-에놀라아제 활성을 가지는 긴 동형을 암호화한다. 상기 동형의 단량체 형태는 수정체 구조 단백질(타우 크리스탈린)로 작용하고, 이합체 형태는 에놀라아제로 작용하는 것으로 알려 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, Eno1은 Eno1의 제1형 전사 변이체이다.
호모사피엔스 에놀라아제 1,(알파)(ENO1), 제2형 전사 변이체, mRNA의 단백질 및 mRNA 서열들은 GenBank 접근번호 NM_001201483(참조, www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001201483.1, 본 출원서 출원일에 유효한 버전에 참고로 포함됨)에서 확인될 수 있다. 상기 변이체는 제1형 변이체과 비교시 5' 말단에서 다르고, 시작 코돈 하위에서 프레임에 맞게 번역을 시작하여, 그 결과 짧은 동형(MBP-1)이 생성된다. 상기 동형은 핵에 위치하고, c-myc 원암유전자의 프로모터에 결합하여 상기 유전자의 전사 억제제로 작용한다. 본 발명의 일부 구체예들에서, Eno1은 Eno1의 제2형 변이체이다.
상기 Eno1 단백질의 일부 추가적인 변이체들은, 예를 들어, 접근번호 P06733에 해당되는 UniProtKB/Swiss-Prot database 에 기술되었다. Eno1 단백질 변이체들의 예들은 아래 표1에 제시된다.
Eno1 변이체들.
AA 잔기 개질
AA개질
(AA modification)		 2 N-아세틸세린(N-acetylserine)
AA 개질 5 N6-아세틸라이신(N6-acetyllysine)
AA 개질 44 포스포타이로신(Phosphotyrosine)
AA 개질 60 N6-아세틸라이신; 대체(alternate)
AA 개질 60 N6-숙시닐라이신(N6-succinyllysine); 대체
AA 개질 64 N6-아세틸라이신
AA 개질 71 N6-아세틸라이신
AA 개질 89 N6-아세틸라이신; 대체
AA 개질 89 N6-숙시닐라이신; 대체
AA 개질 92 N6-아세틸라이신
AA 개질 126 N6-아세틸라이신
AA 개질 193 N6-아세틸라이신
AA 개질 199 N6-아세틸라이신
AA 개질 202 N6-아세틸라이신
AA 개질 228 N6-아세틸라이신; 대체
AA 개질 228 N6-숙시닐라이신; 대체
AA 개질 233 N6-아세틸라이신; 대체
AA 개질 233 N6-말로닐라이신(N6-malonyllysine); 대체
AA 개질 254 포스포세린(Phosphoserine)
AA 개질 256 N6-아세틸라이신
AA 개질 263 포스포세린
AA 개질 272 포스포세린
AA 개질 281 N6-아세틸라이신
AA 개질 285 N6-아세틸라이신
AA 개질 287 포스포타이로신
AA 개질 335 N6-아세틸라이신
AA 개질 343 N6-아세틸라이신
AA 개질 406 N6-아세틸라이신
AA 개질 420 N6-아세틸라이신; 대체
AA 개질 420 N6-말로닐라이신; 대체
AA 개질 420 N6-숙시닐라이신; 대체
자연 변이체
(Natural variant)		 177 N → K.
변이체 rs11544513[ dbSNP | Ensembl ]에 해당.
자연 변이체 325 P →Q.
변이체 rs11544514[ dbSNP | Ensembl ]에 해당.
돌연변이유발
(Mutagenesis)		 94 M →I: MBP1 단백질 생성. MBP1 단백질 비생성; I-97과 관련될 때.
돌연변이유발 97 M →I: MBP1 단백질 생성. MBP1 단백질 생성; I-94와 관련될 때.
돌연변이유발 159 대폭적인 활성 수치 감소
돌연변이유발 168 대폭적인 활성 수치 감소
돌연변이유발 211 대폭적인 활성 수치 감소
돌연변이유발 345 대폭적인 활성 수치 감소
돌연변이유발 384 L → A: 전사 억제 및 세포 성장 저해의 소실; A-388과 관련될 때.
돌연변이유발 388 L → A: 전사 억제 및 세포 성장 저해의 소실; A-384와 관련될 때.
돌연변이유발 396 대폭적인 활성 수치 감소
본 발명의 일부 구체예들에서, Eno1은 표1에 나열된 변이체들 중에 하나이다.
Eno1의 활성
Eno1은 이화해당경로(catabolic glycolytic pathway) 마지막 단계에서 2-인산-D-글리세르산(2-phospho-D-glycerate, PGA)에서 인에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)으로의 탈수를 촉매하는 핵심 해당효소이다. Diaz-Ramos 외, 2012, J Biomed Biotechnol. 2012: 156795 및 도33. Emden Mayerhoff-Parnas 해당경로(이화작용 방향)에서 에놀라아제 효소들은 PGA에서 PEP으로의 탈수를 촉매한다. 글루코스신합성(gluconeogenesis)동안 동화 경로(역반응)에서, Eno1는 PEP에서 PGA으로 수화를 촉진시킨다. 그래서, Eno1은 포스포피루브산 수화효소(phosphopyruvate hydratase)로도 알려 있다. 금속 이온들은 에놀라아제 활성 증가를 손상시키는 보조인자들이다; 이런 이유로 Eno1은 금속-활성화된 금속 효소(metal-activated metalloenzyme)라고도 한다. 마그네슘은 가장 높은 활성을 유발하는 자연 보조인자이고 상기 효소가 촉매 활성을 가지는데 요구된다. 상기 효소 활성에 추가적인 금속 이온들의 상대적인 활성화 강도 프로파일은 다음의 순서(Mg2+ > Zn2 + > Mn2 + > Fe(II)2 + > Cd2 + > Co2 +, Ni2 +, Sm3 +, Tb3 + 및 대부분의 2가의 금속 이온들)로 나타난다. 에놀라아제들에 의해 촉진되는 반응들에서, PGA의 카르복시산염 기(carboxylate group)에 인접한 탄소에서 알파-양성자(alpha-proton)가 추출되고, PGA는 엔올레이트(enolate) 음이온 중간체로 전환된다. 상기 중간체는 다양한 화학 반응(라세미화(racemization), 환이성화(cycloisomerization) 및 물이나 암모니아에서 베타 제거(beta-elimination)를 포함)에서 처리된다. Atlas of Genetics 및 Cytogenetics in Oncology 및 Haematology database, atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_ENO1.html을 참고.
효소적으로 활성을 가지는 에놀라아제는 이합체의(동종이합체 또는 이질이합체) 형태로 존재하고 역평행 방식으로 서로 마주한 두 개의 서브유닛으로 구성되어 있다. 효모균 및 인간에서 에놀라아제의 결정 구조는 결정되었고 촉매 메카니즘들은 제시되었다. Diaz-Ramos 외, 위에 인용됨. 상기 효소의 촉매 활성에 참여하는 다섯 잔기들은 진화에 걸쳐 상당히 보존되어 있다. 생체외 연구들은 돌연변이 에놀라아제 효소들(Glu168, Glu211, Lys345, Lys396 또는 His159 위치들에서 다른)의 활성 수치가 크게 감소됨을 증명하고 있다. 에놀라아제들의 필수적이고 보존된 부분은 에놀라아제의 활성 부위의 구조적인 변화들에 참여하고, 기질 또는 상기 기질의 유사체와 결합을 가능하게 하는 두 개의 Mg2+ 이온들 이다. Atlas of Genetics 및 Cytogenetics in Oncology database, 위에 인용됨. 일부 구체예들에서, 본 발명의 조성물들은 금속 이온 보조인자를 포함한다. 금속 이온 보조인자는 조성물에서 Eno1의 안정성을 증가시키고 생체내에서 Eno1의 활성을 증가시킨다. 하나의 구체예에서, 금속 이온 보조인자는 2가(divalent) 이다. 하나의 구체예에서, 2가의 금속 이온 보조인자는 Mg2 +, Zn2 +, Mn2 +, Fe(II)2 +, Cd2 +, Co2 +, 또는 Ni2 + 이다. 하나의 구체예에서, 상기 금속 이온 보조인자는 3가이다(예로 Sm3 + 또는 Tb3+).
Eno1의 활성은 예를 들어, 피루브산카이나제(pyruvate kinase, PK)/락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 분석을 사용하여 결정될 수 있을 것이다. 상기 에놀라아제 분석에 대한 반응은 아래와 같이 제시된다.
Figure pct00001
NADH에서 NAD+ 로의 전환 반응 속도는 예를 들어, 광자 기술 International, Inc.(pti-nj.com)의 PTI Quantamaster 40 분광광도계를 사용하여 NADH의 형광 감소를 측정함으로써 결정될 수 있을 것이다. 비색적 피루브산카이나제/락트산 탈수소효소 분석으로 Eno1의 활성을 측정하는 키트는 시판되고 있다(예를 들어, from ABCAM(Cambridge, MA; Cat. No. ab117994)로부터). 상기 ABCAM Eno1의 활성 분석은 아래 실시예 5에서 더 기술된다.
Eno1의 활성은 실시예 2에서 기술된 대로 인간 골격근 근육대롱세포(human skeletal muscle myotubes, HSMM)에서 글루코스 섭치에 대한 Eno1의 효과를 측정함으로써 결정되어질 수 있을 것이다.
일부 구체예들에서, Eno1 또는 이의 단편은 정제된 내생 인간 Eno1 폴리펩타이드의 활성의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 를 가진다. 일부 구체예들에서, Eno1, 이의 단편, 및 정제된 내생 인간 Eno1 폴리펩타이드의 활성은 피루브산카이나제/락트산 탈수소효소 분석 또는 상기 기술된 HSMM 글루코스 섭취 분석에 의해 결정된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 대로 덴드리머와 복합체를 이루는 Eno1 폴리펩타이드는 덴드리머와 함께 복합체를 이루고 있지않는 정제된 내생 Eno1 폴리펩타이드가 가지는 활성의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 를 가진다. 일부 구체예들에서, 덴드리머와 복합체를 이루는 Eno1 폴리펩타이드의 활성 및 덴드리머와 함께 복합체를 이루고 있지 않는 정제된 내생 Eno1 폴리펩타이드의 활성은 상기 기술된 피루브산카이나제/락트산 탈수소효소 분석 또는 HSMM 글루코스 섭취 분석에 의해 결정된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 대로 덴드리머 및 표적화 펩타이드와 복합체를 이루는 Eno1 폴리펩타이드는 덴드리머 및 표적화 펩타이드와 함께 복합체를 이루고 있지 않는 정제된 내생 Eno1 폴리펩타이드가 가지는 활성의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400% 또는 500%를 가진다. 일부 구체예들에서, 덴드리머 및 표적화 펩타이드와 복합체를 이루는 Eno1 폴리펩타이드의 활성 및 덴드리머 또는 표적화 펩타이드와 함께 복합체를 이루고 있지 않는 정제된 내생 Eno1 폴리펩타이드의 활성은 상기 기술된 피루브산카이나제/락트산 탈수소효소 분석 또는 HSMM 글루코스 섭취 분석에 의해 결정된다.
하나의 구체예에서, 금속 이온 보조인자(예를 들어, 2가 금속 이온 보조인자(예를 들어, Mg2 +, Zn2 +, Mn2 +, Fe(II)2 +, Cd2 +, Co2 +, 또는 Ni2 + ), 또는 3가 금속 이온 보조인자(예를 들어, Sm3 + 또는 Tb3+))를 포함하는 본 발명의 조성물에서 Eno1 또는 이의 단편은 정제된 내생 인간 Eno1 폴리펩타이드 활성의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400% 또는 500%를 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 기술된 대로 금속 이온 보조인자를 포함하는 조성물에서 Eno1 또는 이의 단편의 활성 및 정제된 내생 인간 Eno1 폴리펩타이드의 활성은 상기 기술된 피루브산카이나제/락트산 탈수소효소 분석 또는 HSMM 글루코스 섭취 분석에 의해 결정된다.
글루코스 유동
근육 글루코스 섭취 조절은 다음과 같이 3단계로 구성된다:(1) 근육으로 글루코스 전달, (2) 글루코스 수송체 GLUT4에 의한 근육 내로 글루코스 이동 그리고 (3) 헥소카이나아제(hexokinase, HK)에 의한 근육 내에서 글루코스의 인산화. 근육 글루코스 섭취의 생리적 조절은 혈액으로부터 세포내 공간의 간질로 글루코스가 이동한 다음 G6P로 인산화되는 것을 필요로 한다. 혈당 농도, 근육 혈액 흐름 및 근육에 모세혈관들의 생성은 혈액에서 간질로의 글루코스 이동을 결정한다. 원형질 막 GLUT4 양은 세포내로 글루코스의 수송을 조절한다. 근육 헥소카이나아제(hexokinase, HK) 활성, 세포의 HK 구획화 및 HK 저해제(G6P)의 농도는 글루코스를 인산화시킬 수 있는 능력을 결정한다. 상기 3단계(전달, 수송 및 글루코스 인산화)는 글루코스 유동을 포함하고, 그리고 모든 3단계는 글루코스 유동 조절에 중요하다. 하지만, 글루코스 인산화 하위 단계들도 글루코스 섭취에 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 해당작용 또는 글리코겐 합성의 가속은 G6P 감소, HK 활성증가, 글루코스 인산화 능력의 증가 및 가능성 있게는 근육 글루코스 섭취 자극을 시킬 수 있을 것이다. Wasserman 외, 2010, J Experimental Biology, 214권, 254-262쪽.
본 발명은, 최소 어느 정도는, Eno1이 글루코스 유동 경로의 일부 요소들에 영향을 준다는 발견(글루코스 수송체인 GLUT1, GLUT4의 발현 증가 및 헥소카이나아제 HK2의 발현 증가, 및 해당작용 경로 중간체인G6P 및 PEP 의 양의 증가를 포함)에 기초하고 있다. 그러므로, Eno1 처리는 글루코스 유동을 증가시키는 작용함을 지시한다.
본 발명은, 최소 어느 정도는, Eno1이 정상 피험자들의 근육 세포 및 제2형 당뇨병을 가지는 피험자들의 근육 세포에서 각기 다르게 조절되고 있다는 발견에 또한 기초하고 있다. 본 발명은 근육 세포에 Eno1의 처리는 상기 세포 내로 글루코스 섭취를 증가시킨다는 것과 식이성 비만을 가지는 생쥐에 Eno1의 투여는 글루코스 내성 및 인슐린 반응성을 정상화시킨다는 놀라운 발견에 더 기초한다.
그래서, 본 발명은 피험자에게 Eno1의 투여를 통해 당뇨병(최소 제1형 당뇨병, 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 및 임신성 당뇨병을 포함)과 전형적으로 연관된 혈당 상승의 치료를 위한 방법들을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 포유류에서 진단 및/또는 감시(예를 들어, 질병 진행 또는 질병 치료의 감시) 및/또는 혈당 상승 상태(예를 들어, 당뇨병)진단을 위한 방법들을 제공한다. 본 발명은 혈당 상승된 피험자의 혈액 또는 혈청에서의 Eno1 양에 관련된 진단 정보에 기초하여 치료 또는 치료 요법의 조절에 필요한 방법들을 또한 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법들을 실행하기 위한 패널들 및 키트들을 더 제공한다.
본 발명은 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하여, 피험자에서 글루코스 유동을 증가시키기 위한 방법들을 또한 제공한다. 일부 구체예들에서, 피험자에게 투여되는 약학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 약학적 조성물 중에 하나이다. 본 발명은 피험자의 골격근 세포에 글루코스 유동을 증가시키는 방법도 또한 제공하는데, 이는 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 구체예들에서, 피험자에게 투여되는 약학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 약학적 조성물이다.
본 발명은 골격근 세포에서 해당 활성(glycolytic activity)을 증가시키는 방법을 또한 제공하는데, 이는 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 구체예들에서, 피험자에게 투여되는 약학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 약학적 조성물이다.
본 발명 피험자의 골격근 세포에서 미토콘드리아의 유리 지방산 산화를 증가시키는 방법을 또한 제공하는데, 이는 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 구체예들에서, 피험자에게 투여되는 약학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 약학적 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "글루코스 유동 증가(increasing glucose flux)"는 (1)근육으로 글루코스 전달, (2)근육 내로 글루코스 수송, 그리고 (3) 근육 내 글루코스 인산화 중에 최소 하나 이상이 증가되는 것으로 이해된다. 특정한 구체예들에서, 글루코스 유동 증가는 근육 세포에서 해당 활성의 증가 또는 미토콘드리아의 유리 지방산 산화의 증가를 포함한다.
IIA . 에놀라아제 2 및 에놀라아제 3
에놀라아제 2(Enolase 2, Eno2)는 또한 감마 에놀라아제(gamma enolase), 신경 에놀라아제(neuronal enolase), 신경-특이적 에놀라아제(neuron-specific enolase, NSE), 또는 HEL-S-279로 알려 있고, ENO2 유전자에 의해 암호화된다. Eno2는 해당효소의 일종인 포스포피루브산 인산가수분해효소(phosphopyruvate phosphatase)이다. Eno2는 동종이합체이고 중추 신경계(central nervous system, CNS)에 있는 성숙한 신경세포들 및 신경 기원의 세포들에서 발견된다. 다양한 타입의 스트레스 하에서 신경세포들은 체순환으로 Eno2를 방출한다. Yee, 외, 2012, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53권, 제10호, 6389-6392쪽. ENO2 mRNA의 핵산 서열 및 Eno2의 아미노산 서열은 도36A 및 36B에서 각각 제시된다.
에놀라아제 3(Eno3)은 또한 베타 에놀라아제(beta enolase), 근육 에놀라아제(muscle enolase), 근육-특이적 에놀라아제(muscle-specific enolase, MSE), 또는 GSD13으로 알려 있고, ENO3 유전자에 의해 암호화된다. Eno3은 2-포스포글리세린산(2-phosphoglycerate) 과 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)의 상호 전환을 촉진한다. Eno3은 성인 골격근 세포에서 발견되며, 근육 발달 및 재생에 역할을 할 것이다. 인간 근육에서는, 에놀라아제 활성의 90% 이상을 Eno3가 차지한다. Eno3를 암호화하는 유전자의 돌연변이들은 글리코겐 저장 질병과 연관이 있다. Comi 외, 2001, Ann Neurol. 50권, 제2호, 202-207쪽. ENO3 mRNA의 세 가지 변이체들이 확인되었는데, 제1형, 제2형, 및 제3형 변이체가 있다. 제1형 및 제2형 변이체는Eno3 단백질의 제1형 동형을 암호화하고, 제3형 변이체는 Eno3 단백질의 제2형 동형을 암호화한다. ENO3 mRNA의 제3형 변이체는 5' UTR에서 다르고 제1형 변이체와 비교할 때 5' 코딩 부위에서 두 개의 엑손이 결손되어 있다. 단백질의 제2형 동형은 제1형 동형보다 짧으나, 동일한 N- 및 C-말단을 가지고 있다. 상기 제1형, 제2형 및 제3형 변이체의 핵산 서열들 및 Eno3의 제1형 및 제2형 동형의 아미노산 서열들은 도37a - 37e에서 제시된다.
Eno2 및/또는 Eno3은 본 명세서의 Eno1에 대한 부분에서 기술된 방법들, 약학적 조성물들, 시약판들, 및 키트들에서 대안적으로 사용되어 질 수 있을 것이다. 예를 들어, Eno2 및/또는 Eno3는 피험자에게 Eno2 및/또는 Eno3을 포함하는 약학적 조성물의 투여를 통해서 당뇨병(최소 제1형 당뇨병, 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 및 임신성 당뇨병 포함)과 전형적으로 연관된 혈당 상승 치료를 위한 방법들에서 사용될 수 있을 것이다. 더욱이, Eno2 및/또는 Eno3은 포유류에서 진단 및/또는 감시(예를 들어, 질병 진행 또는 질병 치료의 감시) 및/또는 혈당 상승(예를 들어, 당뇨병) 진단을 위한 방법들에 사용될 수 있을 것이다. Eno2 및/또는 Eno3은 상승 혈당을 가지는 피험자의 혈액 또는 혈정에서의 Eno2 또는 Eno3의 수치와 연관된 진단 정보를 기초로 하여, 치료 또는 치료 요법을 조절하기 위한 방법들 및 본 발명의 방법들을 실행하기 위한 시약판들 및 키트들을 위한 방법들에 또한 사용될 수 있을 것이다. 본 발명은 (예로, 근육 세포로 전달을 위한) Eno2 및/또는 Eno3을 포함하는 약학적 조성물들과 또한 연관된다.
III. 당뇨병 진단 및 분류
당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은, 흔히 단순히 당뇨병(diabetes)으로 언급되며, 신체가 충분한 인슐린을 생성하지 못 하거나 또는 세포들이 생성된 인슐린에 반응을 못 하기 때문에 높은 혈당을 가지게 되는데, 상기 원인으로 높은 혈당을 가지는 개인에게서 나타나는 대사 질환들의 집단을 당뇨병이라 한다. 높은 혈당은 다뇨증(polyuria)(잦은 배뇨), 조갈증(polydipsia)(증가된 목마름), 및 다식증(polyphagia)(증가된 배고픔)과 같은 전형적인 증상들을 낳는다.
제2형 당뇨병은 인슐린 저항성(세포들이 인슐린을 적절하게 사용하지 못 하는 조건)이 원인이며, 때때로 절대 인슐린 결핍과 결합되기도 한다. 인슐린에 대해 체내 조직들의 결핍된 반응은, 최소 어느 정도는, 인슐린 수용체를 수반한다고 확신되어 진다. 하지만, 특이적인 결점들은 밝혀지지 않았다.
제2형 당뇨병의 초기에는, 두드러진 이상은 인슐린 감수성 감소이다. 이 시기에서는, 인슐린 감수성을 향상시키거나 또는 간에서의 글루코스 생성을 감소시키는 여러 가지의 조치들 및 약물들로써 고혈당증은 회복되어질 수 있다. 당뇨병전증은 개인의 혈당 수치가 정상보다는 높으나 제2형 당뇨병으로 진단을 내릴 만큼 혈당 수치가 높지 않을 때 발생되는 조건을 지시한다.
제2형 당뇨병 인슐린 저항성을 가지는 조건에서 베타 세포들의 불충분한 인슐린 생성 때문이다. 정상 수치의 인슐린에 세포들이 적절하게 반응하지 못 하는 인슐린 저항성은 주로 근육들, 간, 및 지방 조직들에서 발생된다. 간에서, 인슐린은 정상적으로는 글루코스 방출을 억제한다. 하지만 인슐린 저항성을 가지는 조건에서는, 간은 부적절하게 혈액으로 글루코스를 방출하게 된다. 주로 인슐린 저항성을 가지고 인슐린 분비에서는 단지 사소한 결함이 있는 개인들과 약한 인슐린 저항성을 가지고 주로 인슐린 분비에서 결함이 있는 다른 개인들 사이에는 인슐린 저항성 대 베타 세포 기능 장애의 비율이 다르다.
제2형 당뇨병 및 인슐린 저항성과 연관된 다른 잠재적으로 중요한 메카니즘들은 다음을 포함한다: 지방 세포들 내에서 증가된 지질 분열, 인크레틴(incretin) 결핍 및 저항성, 혈액에서 높은 글루카곤(glucagon) 수치, 신장에서 염 및 물의 증가된 유지, 및 중추 신경계에서 부적절한 대사 조절. 하지만 췌장 베타 세포들에서의 인슐린 분비 결함이 또한 요구되기 때문에, 인슐린 저항성을 가지는 모든 사람들이 당뇨병에 걸리는 것은 아니다.
제1형 당뇨병은 체내에서 인슐린 생산의 실패가 그 원인이고, 현재로는 주사 인슐린 치료를 요한다. 제1형 당뇨병은 췌장에 있는 랑게르한스섬(islets of Langerhans)의 인슐린을 생성하는 베타 세포들(insulin-producing beta cells)의 결손으로 특징되어지며, 상기 결손은 인슐린 결핍을 유발한다. 병이 시작될 때는, 상기 병에 영향받은 대부분 사람들은 건강하고 건강한 체중을 보인다. 특히 초기에는 인슐린에 대한 민감성 및 반응성은 대개는 정상적이다. 하지만, 투여된 인슐린의 면역 시스템에 의한 제거로 인한 인슐린 저항성을 포함하여, 특히 말기에는, 인슐린 저항성이 발생할 수 있다.
A. 진단 기준
당뇨병의 진담 및 분류에 대한 기준은 American Diabetes Association에 의해서 Diabetes Care, 36:S67-74, 2013에 출판되었고, 이 명세서에서 참고로 포함되어, 다양한 타입의 당뇨병에 대한 자세한 정의를 제공한다. 당뇨병에 대한 진단 기준은 아래에 더 토론된다. 상기 참고는 다음과 같이 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 분류한다:
I. 제1형 당뇨병(베타 세포 파괴, 일반적으로 절대 인슐린 결핍을 초래)
A. 면역 매개(Immune mediated)
B. 특발성(Idiopathic)
II. 제2형 당뇨병(상대적 인슐린 결핍을 가지면서 인슐린 저항성이 지배적인 타입에서 인슐린 저항성을 가지면서 분비 결핍이 지배적인 타입까지를 범위로 한다.)
III. 다른 특이적 타입
IV. 임신성 당뇨병(Gestational diabetes mellitus)
진단 또는 평가 방법들을 실시하기 위한 방법들은 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 제공된 당뇨병에 대한 진단 기준은 다음과 같다:
당뇨병 진단 기준
당화혈색소 > 6.5%. 검사는 National Glycohemoglobin Standardization Program(NGSP)에 보증되고 Diabetes Control and Complications Trial(DCCT) 분석에 표준화된 방법을 사용하여 연구실에서 실시되어야 한다.*
또는
공복 혈장 글루코스(Fasting plasma glucose, FPG) >126 mg/dl(7.0 mmol/l). 공복은 최소 8 h 동안 칼로리 섭취가 없는 것으로 규정된다.*
또는
경구 글루코스 부하검사(oral glucose tolerance test, OGTT)동안 2-h 혈장 글루코스 >200 mg/dl(11.1mmol/l). 검사는 World Health Organization에 의해 기술된 대로 실시되어야 하고, 검사시 물에 녹인 무수의 글루코스 75 g의 등가를 포함하는 글루코스 부하를 사용하여야 한다.*
또는
고혈당증 또는 고혈당성 위기의 전형적 증상들을 보이는 환자에서, 임의 혈장 글루코스 >200 mg/dl(11.1 mmol/l).
* 명백한 고혈당증이 없을 경우, 기준 1-3은 반복 검사에 의해 확인되어야 한다.
본 명세서에서 제공된 당뇨병/ 당뇨병전증의 상승 위험에 대한 진단 기준은 다음과 같다:
당뇨병(당뇨병전증)의 상승 위험에 대한 기준*
공복 혈장 글루코스(Fasting Plasma Glucose, FPG) 100 mg/dl(5.6mmol/l)에서 125mg/dl(6.9 mmol/l)까지[공복 혈당 장애(Impaired Fasting Glucose) - IFG]
75-g 경구 글루코스 부하검사(oral glucose tolerance test, OGTT)에서 2-h 혈장 글루코스(Plasma Glucose, PG) 140 mg/dl(7.8 mmol/l)에서 199 mg/dl(11.0 mmol/l) 까지[내당능 손상(Impaired Glucose Tolerance) - IGT]
A1C 5.7-6.4%
*모든 세 가지 검사들에 대해서, 위험은 연속적이고, 범위의 하한 값 이하로 확장되고, 그리고 범위의 상한 값보다 불균형적으로 크게 된다.
본 명세서에서 제공되는 임신성 당뇨병에 대한 진단 기준 다음과 같다:
임신성 당뇨병(Gestational Diabetes Mellitus, GDM)의 검진 및 진단
75-g OGTT을 실시, 현성당뇨병(overt diabetes)으로 이전에 진단받지 않은 여성에서 임신 24-28주째, 공복 및 1, 2시간에 혈장 글루코스 측정.
OGTT는 최소 8시간의 야간 공복 후 아침에 실시되어야 한다.
GDM의 진단은 다음에서 보이는 혈장 글루코스 수치들이 초과될 때 한다:
- 공복: >92 mg/dl(5.1 mmol/l)
- 1 h: >180 mg/dl(10.0 mmol/l)
- 2 h: >153 mg/dl(8.5 mmol/l)
혈당 상승 또는 당뇨병의 진단 및/또는 감시를 위한 혈당 측정은 식사에 관하여 특이적인 시간적 요구로(예를 들어, 공복 혈당 또는 경구 글루코스 부하검사에서와 같은 검사를 실시하는데 요구되는 시간의 양) 인해 번거로울 수 있다. 더욱이, 명백한 고혈당증이 없을 경우, 기준 1-3은 반복 검사로 확인되어야 한다고 진단 기준은 명확하게 요구하고 있다. 진단 지표로 당화혈색소 수치의 사용은 시간 경과에 따른(즉, 약 이전 1-2달 동안) 혈당 수치를 표시해 주고, 검사를 실시하는데 특별한 일정 관리가 요구되지 않기 때문에 유리할 수 있다. 유사하게, Eno1 발현 정도는 특정한 일정 관리 요구 또는 음식 섭취 제한이나 요구 없이도 결정될 수 있다.
그래서, 어떤 면에서는 본 발명은 피험자에서 혈당 상승의 존재를 진단하는 방법과 연관된다, 다음을 포함하면서: (a) Eno1에 선택적으로 결합하는 시약과 생물학적 시료의 접촉; (b) 시약과 Eno1의 복합체 형성을 허용; (c) 복합체의 정도 검출, 및 (d) 설정된 한계값을 가지는 복합체의 정도를 비교함, 여기서 설정된 한계값 이하의 시료에서 복합체 정도는 피험자가 혈당 상승으로 고통받고 있음을 지시한다. 일부 구체예들에서, Eno 1에 선택적으로 결합하는 시약은 항-Eno1 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 탐지 가능한 라벨을 포함한다.
상기 기술된 방법의 일부 구체예들에서는, 복합체의 정도를 검출하는 단계는 탐지 가능한 이차 항체와 복합체의 접촉 및 이차 항체의 정도 측정을 더 포함한다. 상기 방법은 상승 혈당에 대한 하나 이상의 추가적인 지표들의 정도를 검출하는 것을 더 포함한다. 혈당에 대해 하나 이상의 추가적인 지표들은 당화혈색소 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 구성되는 집단으로부터 선택될 수 있을 것이다.
상기 언급한 방법의 일부 구체에들에서는, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다. 일부 구체예들에서는, 복합체의 정도는 면역학적 검정법 또는 ELISA로 검출된다. 일부 구체예들에서는, 피험자에서 혈당 상승의 존재는 질병 또는 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 및 임신성 당뇨병으로 구성된 집단으로부터 선택된 조건을 나타낸다.
B. 당뇨병, 인슐린 저항성, 및 인슐린 기능저하의 이차 질환들
당뇨병(제1형 및 제2형 모두 해당), 인슐린 저항성, 및 인슐린 기능저하가 원인인 비정상적인 글루코스 조절은 이차 질환들과 연관되는데, 상기 이차 질환들의 다수는 순환 장애가 원인이다. 이러한 상기 이차 질환들은 시력 감퇴, 말초신경병증, 궤양 및 감소된 상처 치유, 및 감소된 신장 기능을 포함한다. 정상 범위내로 글루코스 수치 및/또는 당화혈색소 수치의 유지는 상기 이차 질환들의 발생을 감소시킨다고 알려 있다. 혈당, 인슐린, 및 당화혈색소 수치의 정상화는 주된 병리(예를 들어, 내당능 장애, 혈당 증가)를 제한함으로써 이차 질환들의 발병을 감소시킬 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, Eno1은 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 인슐린 기능저하, 당뇨병, 또는 당뇨병전증과 연관된 이차 질환들의 치료에 사용되지 않는다. 일부 구체예들에서, Eno1은 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 인슐린 기능저하, 당뇨병, 또는 당뇨병전증과 연관된 이차 질환들의 치료에 사용된다.
IV. 투여량 및 투여 방식
투여에 대한 기술들 및 투여량은 화합물의 타입(예를 들어, 단백질 및/또는 핵산, 단독으로 또는 미세입자와 복합체를 이루거나, 리포좀, 또는 덴드리머)에 의존해 변하며 당 기술분야에서 숙련된 것들로 잘 알려 있거나 또는 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 치료적 화합물들은 단위 투여 제형으로 약제학적으로 허용가능한 희석제, 운반체, 또는 부형제와 함께 투여될 것이다. 투여는 비경구적, 정맥내, 피하, 경구, 국소적, 또는 국부적일 것이다. 일부 구체예들에서, 경구로 투여되지 않는다. 일부 구체예들에서, 국소적으로 투여되지 않는다. 바람직한 구체예들에서, 전신으로 투여되지 않는다. 다수의 사람들이 협력하여 약제 투여를 실시할 수 있다. 약제를 투여하는 것은 (예를 들어) 피험자에게 투여될 물질을 처방하는 것 및/또는 (직접적으로나 다른 것을 통해) 특정 약제를 취하도록 지침을 제공하는 것을 포함하는데, 이때 자가 전달(예를 들어, 경구복용, 피하 전달, 중심선을 통한 정맥내 전달 등)을 통해; 또는 훈련받은 전문가에 의한 전달(예를 들어, 정맥내 전달, 근육내 전달 등)을 통해 약제 투여가 이루어질 수 있다.
상기 조성물은 경구복용을 위해 정제, 알약, 캡슐약, 액상, 또는 지효성 알약의 형태일 수 있고; 또는 정맥내, 피하, 또는 비경구적 투여를 위해 액상의 형태일 수 있고; 또는 전신 투여를 위해 중합체 또는 다른 지효성 부형제의 형태일 수 있다.
당 기술분야에서 잘 알려진 제제들을 만드는 방법들은 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy"(20th ed., ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)에서 찾아 볼 수 있다. 비경구적 투여를 위한 제제들은 예들 들어, 부형제들, 멸균된 물, 식염수, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycols), 식물 유래 오일, 또는 수소로 경화 처리된 나프탈렌을 포함할 것이다. 생체에 적합하고, 생분해성 락티드(lactide) 중합체, 락티드/글라이콜리드(lactide/glycolide) 혼성 중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌(polyoxyethylene-polyoxypropylene) 혼성 중합체들은 화합물들의 방출을 조절하는데 사용될 것이다. 나노미립자 제제들(예를 들어, 생분해성 나노입자들, 고형 지질 나노입자들, 리포좀들)은 화합물들의 생물학적 분배를 조절하는데 사용될 것이다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구적 전달 시스템들은 에틸렌-비닐 아세테이트(ethylene-vinyl acetate) 혼성 중합체 입자들, 삼투 펌프들, 주입할 수 있는 수액 시스템들, 및 리포좀들을 포함한다. 제제에서 화합물의 농도는 투여되는 약의 용량 및 투여 경로를 포함하는 여러 요소들에 의존적으로 변한다.
상기 화합물은 약학적 산업에서 일반적으로 사용되는 무독성의 산부가 염들(acid addition salts) 또는 금속 복합체와 같은 약제학적으로 허용가능한 염으로써 선택적으로 투여될 것이다. 산부가 염들의 예들로 아세틱(acetic), 락틱(lactic), 파모익(pamoic), 말레익(maleic), 시트릭(citric), 말릭(malic), 아스코빅(ascorbic), 숙시닉(succinic), 벤조익(benzoic), 팔미틱(palmitic), 수베릭(suberic), 살리실릭(salicylic), 타알태릭(tartaric), 메탄술포닉(methanesulfonic), 톨루엔술포닉(toluenesulfonic), 또는 트리플루오로아세틱(trifluoroacetic)산 등의 유기산; 타닌산(tannic acid), 카르복시메틸셀롤로오스(carboxymethyl cellulose) 등의 중합체산; 및 염산(hydrochloric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 황산(sulfuric acid), 인산(phosphoric acid) 등의 무기산을 포함한다. 금속 복합체는 아연, 철 등을 포함한다.
경구 복용 제제들은 무독성 의약제학적으로 허용가능한 부형제들을 포함하는 혼합물에서 유효성분을 포함하는 알약들을 포함한다. 상기 부형제들은 예를 들어, 불활성 희석제들 또는 불활성 충전제들(예를 들어, 자당 및 소르비톨), 윤활제들, 활주제들, 및 항접착제들(예를 들어, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 아연, 스테아르산, 실리카, 수소화 처리된 식물 오일, 또는 활석)일 수 있다. 경구 복용 제제들은 씹을 수 있는 알약들, 또는 경질 젤라틴 캡슐약들(불활성의 고체 희석제에 유효성분이 혼합됨), 또는 부드러운 젤라틴 캡슐약들(물 또는 기름 매체에 유효성분이 혼합됨)로 제공된다.
상기 화합물을 투여하는 용량 및 시간은 피험자의 전반적인 건강 및 질병(예들 들어, 당뇨병, 당뇨병전증) 증상의 중증도를 포함하는 다양한 임상적 요소들에 의존한다.
A. 지속성 주사약들을 위한 제제들
높은 비율로 일차통과제거(first pass clearance)를 겪게 되는 생물제제 및 다른 제제들은 경구복용으로는 처리하기 어렵고 비경구적 경로를 통해서 투여되어야 할 것이다. 하지만, 피험자는 흔히 주입 방식의 자가 투여 제제에 거부감을 보이기 때문에(예를 들어, 피하주사, 특히 질병으로 인해 피험자가 아픔을 느끼지 못 할 때), 주사약으로 치료 요법을 준수하기는 어려울 수 있다. 주입에 의한 투여의 다른 경로들(예를 들어, 정맥내로, 근육내로)은 일반적으로 숙련된 전문가에 의한 투여를 요하며, 상기 제제의 잦은 투여는 불편하고 흔희 고통스럽게 한다.
제제들은 오일 기초의 주사(oil-based injections), 주사제 현탁, 주사 가능한 미립구들, 및 주사 인시츄 (in situ) 시스템들을 포함하지만 이에 국한되지 않는 주사제들의 지속적인 전달을 위해 만들어졌다. 지속성 주사 제제들은 동일한 화합물들의 전통적인 제제들과 비교시 많은 이점을 제공한다. 상기 이점으로는 최소 다음을 포함한다: 각각의 주입에 따르는 한정된 기간 동안 예측 가능한 약물 방출 프로파일; (의사의 지시에 대한) 더 나은 환자의 수용상태; 쉬운 적용; 일차통과대사(first-pass metabolism)를 회피함으로써 얻어지는 전신적 유용성의 향상; 치료 효율성의 절충 없이 투여 빈도의 감소(즉, 적은 주사 회수); 부작용 발생의 감소; 및 전반적인 의료비 격감.
1. 오일 기초의(Oil-based) 주사 용액 및 주사제 현탁 .
종래의 지속성 주사들은 수용매에 친지질성 약물들을 넣은 현탁액 형태로나 식물성 오일에 친지질성 약물들을 녹인 형태로 구성된다. 근육내 투여를 위해 시판되는 오일 기초의 주사약들은 할로페리돌 디코네이트(haloperidol deconate), 플루페나진 디코네이트(fluphenazine deconate), 테스토스테론 에난트사염(testosterone enanthate), 및 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate)를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 상기 지속성 제제들의 투여 빈도는 매 몇 주 정도이다. 현탁성 제제들에서, 약 흡수의 율속단계는 제제 또는 약 제제를 둘러싼 조직액에서 약 입자들의 용해이다. 물에 잘 녹지 않는 염 생성은 지속적인 약 흡수를 위해 약 입자들의 용해 속도를 조절하는데 사용될 수 있다. 하지만, 몇 가지 다른 요소들(주사 위치, 주사 양, 주사 위치에 침착물의 확산 정도) 및 오일 부형제 그 자체의 흡수 및 분배는 약의 약동학 프로파일에 전반적으로 영향을 미칠 수 있다. 요구되는 약물 방출 프로파일을 제공하기 위한 상기 요소들의 조절은 당 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 행해질 수 있다.
2. 중합체 기초의 미립구들(Polymer-based microsphere) 및 in-situ 형성들(in-situ formings).
중합체 기초의 지속성 주사들의 개발은 펩타이드 및 단백질 약제와 같은 고분자들에 대해 가장 적합한 전략들 중에 하나이다. 시판되는 미립구 제제들(microsphere preparations)은 류프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate), 프립토렐린 파모에이트(triptorelin pamoate), 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate), 리스페리돈(risperidone), 및 날트렉손(naltrexone)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 시판되는 인시츄 형성 삽입물들(in situ forming implants)은 류프로라이드 아세테이트를 포함하고, 파크리탁셀(paclitaxel) 및 부피바카인(bupivacaine)을 포함하는 인시츄 형성 삽입물은 임상시험 중이다. 상기 제제들은 근육내 투여에 해당된다. 고분자들에 대한 중합체 기초의 제제들이 가지는 이점은 다음을 포함한다: 생체외 및 생체내에서 고분자들의 안정화, 생물학적 이용 가능성의 증진, 생물학적 반감기의 연장, 환자 편의성 및 환자 수용상태의 증대, 및 투여 빈도의 감소.
주사 가능한 미립구들 및 인시츄 형성들을 제작함에 가장 중요한 요소는 적절한 생분해성 중합체의 선택이다. 생분해성 미립구들로부터 약물 분자의 방출은 중합체 기질 분해 및 중합체 분해를 통한 확산에 의해 조절된다. 혼성 중합체 비율의 조성물, 중합체 결정도, 유리 전이 온도, 및 친수성과 같은 중합체의 특질은 상기 방출 과정에 결정적인 역할을 한다. 구조, 고유의 중합체 특성, 중심 용해도, 중합체 친수성, 및 중합체 분자량은 약물 방출 역학에 영향을 주지만, 미립구로부터 약물 방출에 대한 가능한 메카니즘은 다음과 같다: 표면에서 초기 방출, 구멍을 통한 방출, 온전한 중합체 장벽을 통한 확산, 물에 불린 장벽을 통한 확산, 중합체 부식, 및 대부분 분해. 모든 상기 메카니즘들은 함께 방출 과정에 관여한다. 미립구 및 인시츄 형성에서 사용되기 위한 중합체들은 (지난 수십 년 넘게 집중적으로 연구되어온) 조절된 약물전달을 위해 여러 가지의 생분해성 중합체를 포함하나 이에 국한되지 않으며, 예로써 폴리락타이드(polylactides, PLA), 폴리글라이콜리드(polyglycolides, PGA), 폴리(락타이드-공동-글라이콜리드)(poly(lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone), PCL), 폴리글라이코네이트(polyglyconate), 폴리산무수물(polyanhydrides), 폴리오소에스테르(polyorthoesters), 폴리(다이옥사논)(poly(dioxanone)), 및 폴리아킬사이아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylates)을 포함한다. 인시츄 형성들에서 사용되는 열에 의해 유발되는 겔화(gelling) 시스템들은 열가역적인 졸/겔 전이(sol/gel transitions)를 보이고 낮은 임계 완용점을 가지는 특성이 있다. 상기 언급한 것들은 실온에서 용액 상태로 있고 임계 완용점 초과시 겔을 생성한다. 인시츄 응고 유기겔들(organogels)은 불수용성 양쪽 친매성 지질들로 구성되는데, 물에서는 부풀고 다양한 종류의 레오트로픽 액정을 형성한다.
B. 표적 투약(Targeted Drug Delivery)
작용할 위치로의 투약은 요구되는 전신 효과를 나타내는데 필요한 약물 양을 줄이게 해서 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 전신 노출을 제한하는 방법 또는 제제를(예를 들어, 근육내 주입, 윤활낭내 주입, 경막내 주입, 안구내 주입) 사용하여 표적하는 조직으로 약물 투여를 통해 작용할 위치로 약제가 전달될 수 있다. 상기 토론되었던 일부의 지속적인 전달 제제들은 근육내 투여에 해당 되고 근육 조직으로 국부적인 전달을 돕는다. 그렇지 않으면, 표적화 잔기들은 표적 위치로 투여를 위한 치료 탑재체들과 연관되거나 연결될 수 있다. 표적화 잔기들은 특이적 세포 타입에 결합하는 일부 잔기들 중에 어느 하나를 포함할 수 있다.
1. 표적화 잔기들
본 발명의 특정 구체예들은 표적화 잔기들의 사용을 포함하는데, 상기 표적화 잔기들의 예로는 다음과 같다: (앞에서 얘기되었듯이) 상대적으로 작은 펩타이드(예를 들어, 25 아미노산 또는 그보다 적게, 20 아미노산 또는 그보다 적게, 15 아미노산 또는 그보다 적게, 10 아미노산 또는 그보다 적게), 평활근 및/또는 골격근 표적화 펩타이드를 포함한 근육 표적화 펩타이드(muscle targeting peptides, MTP), ανβ3 인테그린 리간드(예를 들어, RGD 펩타이드 및 펩타이드 유사체들), ανβ3 인테그린 리간드, 또는 CD46 리간드를 포함한다. 상기 펩타이드들은 Eno1과의 복합체 형성을 이루기 위해, 그리고 상기 펩타이드들의 약동학 및/또는 약력학적 특성을 변형시키기 위해 하나 이상의 화학적 개질들을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 잔기는 작은 분자, 예를 들어, RGD 펩타이드 모사체일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 잔기는 아데노바이러스 35 유래의 단백질 및 선택적으로는 섬유 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 바이러스 단백질들은 바이러스 입자 상에 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 바이러스 단백질들은 바이러스 입자 상에 존재하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 잔기는 항체, 항체 단편, 항체 모사체, 또는 T-세포 수용체일 수 있다.
2. 표적 복합체(Targeted Complexes)
표적 Eno1 복합체는 근육내 주입(예를 들어, 피하주사, 정맥내 주입)외에 다른 경로로 투여될 수 있는데, 상기 경로를 통한 주입은 근육으로 상기 Eno1를 전달해준다. 표적 복합체는 Eno1에 직접적 또는 간접적으로 부착된 하나 이상의 표적화 잔기들을 포함한다. 표적 복합체의 형성은 실질적으로 또는 비가역적으로 Eno1의 활성 및 혈당 수치 및 인슐린 반응을 정상화시키는 Eno1의 효과를 저해하지 않는다. 일부 구체예들에서, 표적 복합체의 사용은 유효량 제공에 필요한 Eno1의 전체 양을 감소시킬 수 있다. 일부 예시적인, 비제한적인, 표적 복합체의 구체예들은 아래에 논의된다.
일부 구체예들에서, 상기 탑재체 및 상기 표적화 잔기는 약 1:1 몰 비율로 복합체에 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 잔기는 상기 탑재체의 몰 초과로(예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1; 8:1, 9:1,10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1; 18:1, 19:1,20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1; 28:1, 29:1, 30:1, 이상; 또는 어떠한 범위든 어떠한 두 값으로 괄호로 묶을 수 있음) 복합체에 존재하다. 일부 구체예들에서, 상기 탑재체 대 표적화 잔기는 약 1:5-1:15; 약 1:7-1:13, 약 1:8-1:12 이다.
본 발명의 상기 조성물들 및 방법들은 하나 이상의 (즉, 표적화 잔기-탑재체의 집단) 표적화 잔기-탑재체 복합체의 투여를 포함하는 것으로 이해된다. 그러므로, 탑재체당 표적화 잔기들의 개수는 복합체의 집단에서 탑재체당 표적화 잔기들의 평균 개수를 나타내는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 복합체의 최소 70%는 표적화 잔기들 대 탑재체의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 복합체의 최소 75%는 표적화 잔기들 대 탑재체의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 복합체의 최소 80%는 표적화 잔기들 대 탑재체의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 복합체의 최소 85%는 표적화 잔기들 대 탑재체의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 복합체의 최소 90%는 표적화 잔기들 대 탑재체의 선택된 몰 비율을 가진다.
a. 연결자들(Linkers)
일부 화학적 연결자들은 당 기술분야에 알려 있고 상업적인 자료들(예를 들어, Pierce Thermo Fisher Scientific Inc., 참조, 예를 들어, www.piercenet.com/cat/crosslinking-reagents)에서 이용 가능하다. 상기 물질들은, 가역적 또는 비가역적으로, Eno1에 하나 이상의 표적화 잔기들을 화학적으로 연결하는데 사용될 수 있다. 연결자들은 표적화 잔기를 Eno1에 직접적으로 붙이기 보다는, 표적화 잔기들 및 Eno1을 구조(예를 들어, 미세입자, 덴드리머)에 붙이는데 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 표적 복합체에 Eno1을 결합시키는 상기 연결자는 가역적이여서 상기 Eno1은 투여 후에 상기 복합체로부터 (바람직하게는 실질적으로 근육에) 방출된다.
b. 펩타이드 결합들(Peptide bonds)
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 표적 복합체는 펩타이드 표적화 잔기를 가지는 Eno1의 번역을 포함할 수 있다. 표적화 Eno1에 대한 아미노산 서열을 포함하는 발현 구조체들을 만들어 내는 방법들은 당 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 행해질 수 있다.
c. 리포좀들(Liposomes)
리포좀을 통한 전달 시스템들은 당 기술분야(전신 노출을 제한하는, 그로 인해 전신 노출 및 부정확한 효과들을 감소시키는, 제제들을 포함)에 알려 있다. 예를 들어, Doxil®는 긴-순환(long-circulating) 페길화(pegylated) 리포좀들(특정 타입의 암 치료에 콜레스테롤을 더 포함하는)에 독소루비신(doxorubicin)이 피막화된 조성물이다. Ambisome®, Abelcet®, 및 Amphotec®를 포함하는 암포테리신B(amphotericin B) 다양한 리포좀의 제제들은 정맥내 투여를 위해 다양한 인지질들, 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 황산염(cholesteryl sulfate)을 포함하는 리포좀들 또는 지질 복합체에서 만들어진다. Visudine®는 정맥내 투여를 위해 달걀의 포스포티딜 글라이세롤(phosphotidyl glycerol) 및 DMPC 에서 리포좀으로 제조된 베르테포르핀(verteporfin)이다. 리포좀의 제제들은 근육내 주입에 대해서 잘 알려 있다. Epaxal®은 비활성화된 A형 간염바이러스이고 Inflexal V®는 인플루엔자 바이러스 타입A 및 B의 비활성화된 헤마그루티닌(hemaglutinine)이다. 상기 두 바이러스 제제들은 DOPC 및 DOPE의 조합으로 제조된다. 상기 리포좀들 또는 생리적으로 허용되는 다른 리포좀들은 Eno1의 패키징(packaging)에 사용될 수 있고, 패키징 다음 근육으로 Eno1 전달을 위해 리포좀 표면은 표적화 잔기들로 부착되어질 수 있다. 상기 리포좀의 세포내 수송을 조절하는 추가적인 잔기들도 또한 포함될 수 있다. 세포로 상기 리포좀이 흡수 되면, 상기 리포좀은 상기 Eno1을 방출하여 Eno1이 치료적 효과를 가지게 한다.
d. 덴드리머들(Dendrimers)
덴드리머들은 Eno1의 하나 이상의 분자들과 다양한 표적화 잔기들의 부착을 위한 스캐폴드(scaffold)로 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 덴드리머는 Eno1에 연결되기 전에 표적화 잔기들로 장식된다.
e. 미세입자들(Microparticles)
미세입자들은 Eno1의 하나 이상의 분자들과 다양한 표적화 잔기들의 부착을 위한 스캐폴드로 사용될 수 있는데, 여기서 Eno1은 상기 미세입자들에 피막화되거나 부착된다. 일부 구체예들에서, 상기 미세입자는 Eno1과 연결되기 전에 표적화 잔기들로 장식된다.
f. 바이러스 벡터들(Viral Vectors)
바이러스 친화성은 오래 연구되어 왔고 관심되는 세포 타입으로 바이러스를 주입하는데 사용된다. Parker 외, 2013(Gene Therapy, 20:1158-64)는 골격근 및/또는 평활근 세포들로 전달을 증대시키는 혈청형 35의 파이버(fiber) 및 페톤(peton)을 가지는 아데노바이러스 혈청형 5 캡부위(capsite)를 개발했다. 상기 바이러스 벡터들 및 다른 바이러스 벡터들은 근육 세포들로Eno1 발현 구조체들의 전달을 위해 사용될 수 있다.
C. 덴드리머들 ( Dendrimers )
덴드리머들은 근육이 아닌 다른 경로로 투여된 Eno1을 근육으로 전달하기 위한 표적 복합체에 대한 백본(backbone)으로 본 발명의 내용에 사용될 수 있다. 또는, 덴드리머들은 근육내로 투여된 Eno1의 약동학 및 약력학적 특성을 조절하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 조성물들 및 방법들에서는, 덴드리머들은 약제학적으로 허용가능한 덴드리머들로 이해된다.
덴드리머 기초의 플랫폼들은 약제용에 사용되기 위해 관심을 받아 왔다. 다른 중합체 운반체들과 유사하게, 덴드리머들은 구조적 독성 및 면역원성을 회피하기 위해서 합성될 수 있다. 인간 단백질들의 크기, 용해도, 및 모양을 모방하는 상기 덴드리머들의 능력은 많은 치료 및 진단 시약들에 대한 이상적인 선택으로 상기 기술을 이끌었다. 1-10 나노미터의 크기는 덴드리머들이 혈관 내피 세포층을 가로질러 효과적으로 확산될 수 있게 하고, 세포로 내면화될 수 있게 하고 그리고 신장에 의해 빠르게 제거될 수 있게 한다. 상기 기술된 특징은 장기 독성을 회피하는데 도움을 주고, 그리고 빠른 분해가 가능한 플랫폼에 대한 필요성을 줄인다. 다양한 반응 표면 그룹들의 유용성은 덴드리머가 기능성 분자들의 높은 탑재체를 운반할 수 있게 하는데, 이는 작용 위치로의 표적 전달을 증가시켜, 이로 인해 효율성이 증가된다.
덴드리머들은 일부 생의학적 응용들 위해 생산되었거나 상업적 발달 하에 있다. 국소적이고, 폴리라이신(polylysine) 덴드리머에 기초한 살균제, VivaGelTM은 Starpharma에 의해 개발되었다. SuperFect®는 유전자 주입에 사용된 덴드리머에 기초한 물질이다. 덴드리머에 기초한 진단도구는 Gadomer-17(가돌리늄 킬레이트(gadolinium chelates)로 기능화된 폴리라이신 덴드리머를 포함하는 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging, MRI) 조영제), 및 Stratus® CS(신속하게 심근 경색을 진단하는 심장 마커에 대한 바이오센서)를 포함한다.
덴드리머들은 코어 쉘 구조(core-shell structure)로 규정되는데, 여기서 상기 덴드리머는 상기 중심부(core)에 더해진 각각의 추가적 쉘(shell) (또는 발생(generation))을 가지는 기능적인 표면 그룹들의 크기 및 수에서 약 두 배이다. 쉘은 당 기술분야에서 잘 알려진 방법들에 의해 단량체 반응을 교대함으로써 생성된다. 특이화된 덴드리머 백본(backbone)들은 단량체 단위들을 변화함으로써 합성될 수 있다. 상기 덴드리머의 생물학적 특성은 화학적 백본 및 표면 종료(surface termination)에 의해 큰 영향을 받는다. 덴드리머가 생체내 약물 전달을 위한 적합한 부형제가 되기 위해서는, 무독성이어야 하고, 면역을 유발하지 않아야 하고, 그리고 적절한 장벽들을 가로질러 특이적 위치로 표적화 및 도달할 수 있어야 하며, 한편으로는 순환에서 유지될 만큰 안정적이어야 한다. 문헌에서 합성되고 출판된 대부분의 덴드리머들은 생리적 조건들에서 불용성이거나 또는 기능적 분자들분자들을 추가한 뒤에 가용성으로 남아 있을 수 없고, 그리고 생물학적 적용에 부적합하다. 하지만, 일부 종류의 덴드리머들은 생의학적 응용들에 대해 유용한 스캐폴드로 밝혀졌다(예를 들어, 폴리에스테르(polyesters), 폴리라이신(polylysine), 및 폴리프로필렌아민(polypropyleneimine, PPI 또는 DAB) 덴드리머).
생의학적 응용들에서 가장 넓리 사용되는 덴드리머들은 폴리(아미도아민)(poly(amidoamine), PAMAM) 덴드리머들이다. 아크릴산 메틸(methyl acrylate)과 에틸렌 디아민(ethylene-diamine)의 반복적인 반응들로부터 합성되는 폴리아마이드(polyamide) 백본은 고분자의 수용성 유지에 도움을 주고 면역원성을 최소화시킨다. 다른 발생의 PAMAM 덴드리머들은 신체에서 쉽게 발견되는 구상 단백질들의 크기 및 특성을 또한 모방할 수 있다. 완전한 생성(full generation) PAMAM 덴드리머들의 아민(amine)이 끝에 위치한 표면(amine-terminated surface)는 표면 개질을 쉽게 하는데, 이는 생리적 조건들에서 상기 플랫폼이 메토트렉사트(methotrexate)와 같은 소수성의 치료 분자들의 운반 및 가용성화를 할 수 있게 한다. PAMAM 덴드리머들은 표면 아민들이 중성화 또는 적절하게 변형(예를 들어, 아실화)되면 거의 비특이적 독성을 보이지 않는다.
활성 표적화는 표적화 잔기와 같은 분자를 사용하여, 세포 특이적 분자들에 결합함으로써 표적화 잔기의 탑재체(약물 또는 다른것들)를 세포로 전달을 중재한다. 본 명세서에 제시되는 표적화 잔기들은 표적 세포들상에 많이 발현된 수용체들을 통해 흔히 결합한다. 표적화 리간드 및 세포 표면 수용체 간에 상호 작용은 치료제 또는 탑재체가 선택적으로 근육 세포들로 도달되게 하고, 더 나아가 수용체에 의해 중재되는 과정을 통해 세포 안으로 치료제 또는 탑재체가 도입되게 한다.
덴드리머 표면상에서 다중 결합 리간드의 전시와 연관된 다원자가의 효과는 단독 리간드와 비교시 수지상의 스캐폴더의 흡수를 증진시킨다. 다양한 리간드의 동시 결합에 의해서 유발되는 다원자가의 상호작용들은 덴드리머의 플랫폼에 대한 결합력을 증가시키는데, 이러한 결합력 증가는 심지어 각각의 리간드가 표적 수용체에 대해 낮은 친화력을 가지는 경우에도 일어난다. 상기 PAMAM 플랫폼은 항체들, 펩타이드들, T항원들, 및 엽산을 포함하는 다원자가 표적화 분자들의 부착을 위해 스캐폴더로 성공적으로 사용되어 왔다. 표적화 리간드는 세포 표면상에서 특이적인 수용체들이 발현되는 위치에 덴드리머들을 고정시킨다. 표적된 덴드리머-약물 접합체는 표적 세포들에 특이적으로 높은 투여량으로 전달되는데, 이때 정상 세포들로의 전달은 회피하게 되어, 잠재적인 전신 독성을 피하게 된다.
아세틸기들(acetyl groups)로 PAMAM 덴드리머들의 표면 아민(amines)을 중화시키는 것은 독성 및 비특이적인 덴드리머 흡수를 최소화한다. 상기 덴드리머의 아세틸 캡핑(capping)은 신체로부터 제거를 향상시켜서, 장기 치료로 생길 수 있는 효과를 최소화한다. 아미노 말단의 PAMAM 덴드리머들의 PEGylation는 면역원성을 감소시키고 용해도를 증가시킨다. PEG 말단의 덴드리머들은 양이온 모재(cationic parent material)와 비교시 증가된 혈류 반감기를 가진다. 히르록실(Hydroxyl) 및 매톡실(methoxyl) 말단의 폴리에스테르 덴드리머들은 40 mg/kg까지의 농도에서 생체내에서 무독성한 것으로 발혀졌다. 양이온 및 음이온 덴드리머들간 독성 차이는 생체내에서 또한 확인되었다. 제브라피쉬 배아 모델에서, 카르복시기(carboxyl) 말단의 덴드리머는 G4 아민(G4 amine) 말단의 덴드리머 보다 확실히 독성이 낮았다. 동일한 연구에서, RGD로 표면 개질은 또한 독성을 낮추었다.
상기 및 본 명세서에서 기술된 모든 덴드리머들은 본 발명의 Eno1 조성물들 및 유용한 방법들에 사용될 것으로 이해된다.
일부 구체예들에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 약 1:1에서 약 10:1(예를 들어, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1) 사이 이다. 하나의 구체예에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 약 3:1에서 7:1(예를 들어, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 또는 7:1) 사이이다. 하나의 구체예에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 4:1에서 6:1(예를 들어, 3:1, 4:1, 또는 5:1) 사이이다. 하나의 구체예에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 3:1에서 5:1(예를 들어, 3:1, 4:1, 또는 5:1) 사이이다. 또 다른 구체예에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 4:1에서 5:1 사이 이다. 또 다른 구체예에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 3:1에서 4:1 사이이다. 더 바람직한 구체예에서, 덴드리머 및 Eno1을 포함하는 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 Eno1 분자들 수의 비율은 약 5:1 이다.
복합체에서 덴드리머 대 Eno1 의 최적의 비율들은 당 기술분야에서 알려진 일반적인 방법들(예를 들어, 피루브산카이나제(pyruvate kinase, PK)/락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 분석 또는 본 명세서에 기술된 어떤 다른 분석들)을 사용하여, 덴드리머/Eno1 복합체에서 Eno1 활성의 측정을(예를 들어, 복합체를 이루지 않는 Eno1에 비교함으로써) 통해서 검사 및 선별될 수 있을 것이다. 덴드리머 대 Eno1의 최적 비율들은 생체외 분석에서 글루코스 섭취에 대한 덴드리머/Eno1 복합체의 효과를 측정함으로써(예를 들어, 본 명세서의 실시예 2에서 기술된 대로 인간 골격근 근육대롱세포(human skeletal muscle myotubes, HSMM)에서 글루코스 섭취를 측정함으로써, 또는 당 기술분야에 알려진 유사 분석들을 통해서) 또한 검사 및 선별될 수 있을 것이다. 덴드리머 대 Eno1의 최적 비율들은 생체내에서 혈당 수치에 대한 덴드리머/Eno1 복합체의 효과를 측정함으로써(예를 들어, 본 명세서의 실시예들 7 및 8에서 기술된 대로 당뇨병 생쥐 모델들에서 혈당에 대한 덴드리머/Eno1 복합체의 효과를 측정함으로써, 또는 당 기술분야에서 알려진 유사 모델들 또는 분석들을 통해서) 검사 및 선별될 수 있을 것이다. 복합체에서 덴드리머 대 Eno1의 최적 비율들은 바람직하게는 생체외 및/또는 생체내에서 Eno1의 활성을 유지시키고 또는 세포로 Eno1을 전달시킬 것이다.
본 발명의 상기 조성물들 및 방법들은 하나 이상의 투여를 포함하는 것으로 이해된다(즉, 덴드리머-Eno1-표적화 펩타이드 복합체의 집단). 그러므로, Eno1 분자들 대 덴드리머의 수는 복합체의 집단에서 Eno1 대 덴드리머의 평균 수를 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 70%는 덴드리머 대 Eno1의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 75%는 덴드리머 대 Eno1의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 80%는 덴드리머 대 Eno1의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 85%는 덴드리머 대 Eno1의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 90%는 덴드리머 대 Eno1의 선택된 몰 비율을 가진다.
일부 구체예들에서, 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 표적화 펩타이드들 수의 비율은 1:0.1에서 1:10 사이, 1:1에서 1:10 사이, 1:1에서 1:5 사이, 또는 1:1에서 1:3 사이이다. 일부 구체예들에서, 덴드리머 분자들 수 대 표적화 펩타이드들 수의 비율은 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10이다. 바람직한 구체예로, 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 표적화 펩타이드들 수의 비율은 약 1:1이다. 바람직한 구체예로, 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 표적화 펩타이드들 수의 비율은 약 1:2이다. 바람직한 구체예로, 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체에서 덴드리머 분자들 수 대 표적화 펩타이드들 수의 비율은 약 1:3이다.
일부 구체예들에서, 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체에서 표적화 펩타이드들 수 대 덴드리머 분자들 수의 비율은 최소 1:1, 최소 2:1, 최소 3:1, 최소 4:1, 최소 5:1, 최소 6:1, 최소 7:1, 최소 8:1, 최소 9:1 또는 최소 10:1 이다. 하나의 구체예에서, 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체에서 표적화 펩타이드들 수 대 덴드리머 분자들 수의 비율은 최소 3:1 이다.
본 발명의 상기 조성물들 및 방법들은 하나 이상의(즉, 표적화 펩타이드-Eno1-덴드리머 복합체의 집단) 투여를 포함하는 것으로 이해된다. 그러므로, 덴드리머당 표적화 펩타이드들의 수는 복합체의 집단에서 덴드리머당 표적화 펩타이드들의 평균 수를 나타낼 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 70%는 표적화 펩타이드들 대 덴드리머의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 75%는 표적화 펩타이드들 대 덴드리머의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 80%는 표적화 펩타이드 대 덴드리머의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 85%는 표적화 펩타이드 대 덴드리머의 선택된 몰 비율을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 복합체의 최소 90%는 표적화 펩타이드 대 덴드리머의 선택된 몰 비율을 가진다.
덴드리머 대 표적화 펩타이드의 최적의 비율들은 생체내 특정 조직들에 상기 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체의 표적화를 측정함으로써 선택될 수 있을 것이다(예를 들어, 본 명세서 실시예 6에서 기술된 대로 측정가능한 생체내 표지된 덴드리머/Eno1/표적화 펩타이드 복합체의 표적화를 측정함으로써).
V. 혈당 수치 및 조절에 대한 지표들의 검출 및 측정
혈당 상승 및 혈당 조절에 대한 지표들의 검출 및 측정 방법들은 측정될 지표의 성질에 의존적으로 변한다. 혈당 상승, 및 그로 인한 혈당 수치 조절의 결손 및 당뇨병의 중증도는 직접적으로 측정될 수 있거나(예를 들어, 혈액에서의 글루코스 양의 측정), 또는 간접적으로(예를 들어, 당화혈색소(헤모글로빈 및 글루코스의 반응 산물)의 양을 검출) 측정될 수 있다. 본 발명은 Eno1을 이용한 혈당 조절 검출에 대한 방법들을 더 제공한다.
본 발명은 본 발명의 혈당 수치 지표들을 검출 및/또는 측정하기 위한 적합한 수단들, 기술들, 및/또는 절차들을 고려한다. 숙련된 전문가는 본 발명의 지표들을 측정하기 위해 사용된 방법론들은 검출 또는 측정되는 지표의 종류(예를 들어, 글루코스, 케톤(ketones), mRNA, 또는 당화 폴리펩타이드를 포함한 폴리펩타이드) 및 생물학적 시료(예를 들어, 전혈, 혈청)에 최소 의존한다는 것을 이해할 것이다. 특정 생물학적 시료는 본 발명의 생체 지표들을 측정하기 전에 일부 특화된 처리들을 요구할 수도 있다(예를 들어, mRNA(예, Eno1 mRNA)가 생체지표인 경우 측정될 mRNA의 준비).
A. 확립된 지표들을 사용하여 혈당 및 혈당 조절의 직접적 및 간접적 측정
혈당 감시는 단일 시간 지점에서 직접적으로 혈액에서 글루코스의 농도(혈당증)를 탐지하는 방법이다. 특히 당뇨병 관리에 중요한 것으로, 혈당 검사는 혈액을 끌어내기 위해 피부를 뚫고(일반적으로 손가락에), 그런 다음 화학적 활성을 가지는 일회용 '테스트-스트립(test-strip)'에 혈액을 적용함으로써 행해질 수 있다. 다른 제조사들은 다른 기술을 사용하지만, 대부분의 시스템들은 전기적 특성을 측정하고, 상기 전기적 특성으로 혈액에서의 글루코스 수치가 결정된다. 상기 검사는 일반적으로 모세혈당으로 지시된다. 주기적인 또는 계속적인 사용을 위한 시판되는 혈당 측정기는 당 기술분야에 알려 있다. 혈당 수치의 주기적인 검출을 위한 혈당 측정기는 TRUEResult Blood Glucose Meter(TRUE), ACCU-CHEK Glucose Meter(ACCU-CHEK), OneTouch Glucose Meter(ONETOUCH), 및 FreeStyle Lite Blood Glucose(FREESTYLE LITE)를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 직접적으로 측정되는 혈당 수치는 정상 공급 혈당 수치보다 낮은 정상 공복 혈당 수치를 가지는 음식이 마직막으로 소비된 이후부터의 시간에 의존적으로 변할 것으로 이해된다. 직접적 혈당 감시는 글루코스의 높은 투여량의 소비 및 혈액으로부터 글루코스 제거의 속도에 대한 측정을 위한 글루코스 부하검사에 또한 사용된다.
당화혈색소(Glycated hemoglobin, hemoglobin A1c, HbA1c, A1C, Hb1c, HbA1c)는 주로 장시간에 걸친 평균 혈장 글루코스 농도를 확인하기 위해(즉, 간접적인 혈당 측정) 측정되는 헤모글로빈의 형태이다. 당화혈색소는 혈장 글루코스에 헤모글로빈의 노출로 인해 비효소성 당화 경로에서 형성된다. 글루코스의 정상 수치가 존재할 때, 전체 헤모글로빈의 퍼센트 또는 특정 혈액 농도로 측정되는 당화혈색소의 정상 양이 생성된다. 혈당 수치가 높을 때, 당화혈색소의 상승된 수치가 생성된다. 당화반응은 비가역 반응이다. 그러므로, 적혈구내의 당화혈색소 양은 세포가 노출된 글루코스의 평균 수치를 반영한다. 당화혈색소 측정은 글루코스 감시로 제공되는 스냅샷 이미지보다 장기간 혈청 글루코스를 감시하는 치료의 효율성을 평가한다. 상기 당화혈색소 수치는 이전 4주에서 3개월에 걸친 평균 혈당 농도에 비례한다. 당화혈색소 수치는 측정될 수 있는데, 예를 들어, 고속액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 또는 면역학적 검정법이 사용되어 질 수 있다. 단백질 분석물들의 검출 및 측정을 위한 방법들은 아래에 자세히 논의된다.
B. 핵산 지표들의 검출
일부 구체예들에서, 본 발명은 피험자에서 당뇨병 및/또는 글루코스 조절을 측정하기 위해(예를 들어, 혈당, 케톤, 및/또는 당화혈색소의 직접적 측정) 선택적으로 혈당의 다른 지표들과 결합하여 핵산 생체지표들(예를 들어, Eno1 mRNA 생체지표들)을 검출하는 것과 관련이 있다.
다양한 구체예들에서, 본 발명의 진단의/예후의 방법들은 일반적으로 혈액 시료에서 Eno1의 발현 수치의 결정과 관련된다. 독창적인 방법들의 실행에서 유전자 발현 수치의 결정은 적절한 방법에 의해 실시되어질 것이다. 예를 들어, 유전자 발현 수치의 결정은 관심 유전자로부터 mRNA의 발현 검출 및/또는 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 발현 검출을 통해서 실시될 수 있을 것이다.
Eno1을 암호화하는 핵산 검출을 위해서, 서던블릇분석(Southern blot analysis), 노더블롯분석(northern blot analysis), 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)(참조, 예를 들어, 미국특허들 제4,683,195호; 제4,683,202호, 및 제6,040,166호; "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis 외(Eds), 1990, Academic Press: New York), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase PCR, RT-PCR), anchored PCR, 경쟁 PCR(competitive PCR)(참조, 예를 들어, 미국특허 제5,747,251호), rapid amplification of cDNA ends(RACE)(참조, 예를 들어, "Gene Cloning 및 Analysis: Current Innovations, 1997, 쪽 99-115); 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR)(참조, 예를 들어, EP 01 320 308), one-sided PCR(Ohara 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 86: 5673-5677), 인시츄부합법(in situ hybridization), Taqman에 기초한 분석법들(Taqman-based assays)(Holland 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88: 7276-7280), 등차적표현행동(differential display)(참조, 예를 들어, Liang 외, Nucl. Acid. Res., 1993, 21: 3269-3275) 및 다른 RNA 지문(RNA fingerprinting) 기술들, 핵산 서열에 기초한 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA) 및 다른 전사에 기초한 증폭(transcription based amplification) 시스템들(참조, 예를 들어, 미국특허들 제5,409,818호 및 제5,554,527호), Q베타 리프리케이스(Qbeta Replicase), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 복구연쇄반응(Repair Chain Reaction, RCR), 뉴클레아제 보호 분석(nuclease protection assays), 감산에 기초한 방법들(subtraction-based methods), Rapid-Scan® 등을 포함한 하지만 이에 국한되지는 않는 적합한 방법들이 사용될 수 있다.
다른 구체예들에서, Eno1 의 유전자 발현 수치는 mRNA에서 생성되는 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA) 또는 상보적 RNA(complementary RNA, cRNA)를 증폭하고 마이크로어래이(microarray)를 사용하여 분석함으로써 결정될 수 있다. 많은 다른 분석 형태들 및 이들의 생산하는 방법들은 당 기술분야에서 숙련된 것들로 알려 있다(참조, 예를 들어, 미국특허들 제5,445,934호; 제5,532,128호; 제5,556,752호; 제5,242,974호; 제5,384,261호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,472,672호; 제5,527,681호; 제5,529,756호; 제5,545,531호; 제5,554,501호; 제5,561,071호; 제5,571,639호; 제5,593,839호; 제5,599,695호; 제5,624,711호; 제5,658,734호; 및 제5,700,637호). 마이크로어래이 기술은 동시에 다수 유전자들의 항정상태의 mRNA 수치의 측정을 가능하게 한다. 현재 폭 넓게 사용되는 마이크로어래이는 cDNA 분석들 및 올리고핵산염 분석들을 포함한다. 마이크로어래이를 이용한 분석들은 일반적으로 마이크로어래이상에 알려진 위치에 고정된 핵산 탐색자(nucleic acid probe)와 결합하는 시료의 cDNA 서열을 검출하기 위해 사용되는 표지된 탐색자(labeled probe)로부터 획득된 신호의 강도를 측정하는 것에 기초한다(참조, 예를 들어, 미국특허들 제6,004,755호; 제6,218,114호; 제6,218,122호; 및 제6,271,002호). 분석(어래이)에 기초한(Array-base) 유전자 발현 방법들은 당 기술분야에 알려 있고 특허 뿐만 아니라 많은 과학적 논문들에서도 기술되어 있다(참조, 예를 들어, M. Schena 외, Science, 1995, 270: 467-470; M. Schena 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93: 10614-10619; J. J. Chen 외, Genomics, 1998, 51: 313-324; 미국특허들 제5,143,854호; 제5,445,934호; 제5,807,522호; 제5,837,832호; 제6,040,138호; 제6,045,996호; 제6,284,460호; 및 제6,607,885호).
하나의 특정 구체예에서, 본 발명은 Eno1에 상응하는 핵산들을 증폭 및 검출함으로써 비정상적인 혈당으로 고통받는 피험자의 확인을 위한 방법을 포함하는데, 선택적으로는 혈당 상승에 대해 하나 이상의 추가적인 지표들과 결합된다.
증폭시 틀로 사용된 핵산은 표준 방법론들(Sambrook 외, 1989)에 따라 생물학적 시료에 포함된 세포들로부터 분리될 수 있다. 상기 핵산은 유전체 DNA 또는 분별된 또는 전체 세포 RNA일 수 있다. RNA가 사용될 경우, RNA를 상보적인 cDNA로 전환하는 것이 바람직할 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 RNA는 전체 세포 RNA 이고 증폭을 위한 틀로써 직접적으로 사용된다.
본 명세서에서 확인된 Eno1 뉴클레오타이드 서열들에 해당되는 핵산들에 선택적으로 결합하는 프라이머들의 쌍은 선택적 부합(hybridization)을 허용하는 조건하에서 분리된 핵산과 접촉하게 된다. 일단 결합하게 되면, 상기 핵산:프라이머 복합체는 틀에 의존적인(template-dependent) 핵산 합성을 촉진하는 하나 이상의 효소들과 접촉하게 된다. 증폭의 여러 회전("사이클(cycle)"로 지시됨)은 충분한 양의 증폭 산물들이 생산될 때까지 행해지게 된다. 그 다음으로, 상기 증폭 산물은 검출되게 된다. 일부 적용에서는, 상기 검출은 시각적 수단들에 의해 실시될 수 있을 것이다. 또는, 상기 검출은 화학발광(chemiluminescence), 포함된 방사성표지 또는 형광표지의 방사성 신티그램 촬영(방사성의 scintigraphy) 또는 전기적 또는 열 자극 신호를 사용한 시스템(AFFYMAX 기술; Bellus, 1994)을 통한 상기 증폭 산물의 간접적인 확인과 연관될 수 있을 것이다. 검출에 다음으로, 정상 환자들 및 혈당 상승을 가지는 환자들(예를 들어, 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 또는 제1형 당뇨병 환자들)의 통계적으로 의미있는 기준 집단과 함께 주어진 환자에서 보여지는 결과들을 비교할 수 있을 것이다. 이러한 방식으로, 다양한 임상적 상태들에서 검출된 핵산의 양의 상관관계를 보여줄 수 있다.
본 명세서에서 규정된 용어 프라이머(primer)는 틀에 의존적인(template-dependent) 과정에서 신생 핵산의 합성을 시동하는(priming) 능력을 가진 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 전형적으로, 프라이머들은 10에서 20의 올리고핵산염(바람직하게는 15에서 20 뉴클레오타이드 길이이지만, 더 긴 서열들도 사용될 수 있음)이다. 프라이머들은 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태로(비록 단일 가닥이 선호되지만) 제공될 수 있을 것이다.
많은 틀 의존적 과정들은 주어진 틀 시료에 존재하는 핵산 서열들을 증폭하는데 유용하다. 가장 많이 알려진 증폭 방법들 중에 하나는 중합효소 연쇄 반응(PCR로 지시됨)이며, 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및제4,800,159호, 및 Innis 외, 1990(각각에 대한 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 자세히 기술되어 있다.
PCR 시에, 두 가지 프라이머 서열들은 표적 핵산 서열의 다른 편에 있는 상보적 가닥 상에 상보적으로 만들어진다. 과량의 디옥시뉴클레오시드 3인산염(deoxynucleoside triphosphate)는 DNA 중합효소(DNA polymerase)(예를 들어,Taq 중합효소(Taq polymerase))를 포함하는 반응 혼합물에 첨가된다. 시료에 표적 핵산 서열이 존재하면, 상기 프라이머들은 표적 핵산에 결합할 것이고 상기 중합효소는 뉴클레오타이드를 추가함으로써 프라이머들이 표적 핵산 서열을 따라 확장되게끔 유도할 것이다. 상기 반응 혼합물의 온도를 높이거나 낮게 함으로써, 확정되 프라이머들은 반응 산물들을 형성하기 위해 표적 핵산에서부터 분리될 것이며, 과량의 프라이머들은 표적 핵산 및 반응 산물들에 결합할 것이고, 상기 반응은 되풀이된다.
역전사 중합효소연쇄반응 증폭의 절차는 증폭된 mRNA의 양을 정량하기 위해 실시될 것이다. RNA를 cDNA로 역전사시키는 방법들은 잘 알려 있고 Sambrook 외, 1989에서 기술되어 있다. 역전사에 대한 대안 방법들은 내열성의 DNA 중합효소를 활용한다. 상기 방법들은 1990년 12월 21일자로 출원된 국제공개공보 제WO 90/07641호에 기술되었다. 중합효소 연쇄 반응 방법론들은 당 기술분야에 잘 알려 있다.
증폭의 또 다른 방법은 연결효소 연쇄 반응("LCR")로써, 유럽특허출원공보 제320 308호에 기재되었고, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되어 있다. LCR에서, 두 개의 상보적 탐색자 쌍들은 준비되고, 표적 서열 존재하에서 각각의 쌍은 상기 표적의 반대편 상보적 가닥에 결합하게 되어 서로 인접하게 될 것이다. 연결 효소 존재하에서는, 상기 두 탐색자 쌍들은 단일체를 형성하기 위해 연결될 것이다. PCR에서처럼 온도 사이클링(temperature cycling)에 의해, 결합된 결찰된 단위들은 상기 표적에서 분리되고, 그 다음 과량의 탐색자 쌍들의 결찰을 위해 "표적 서열들"로 작용하게 된다. 미국특허 제4,883,750호는 표적 서열에 탐색자 쌍들을 결합시키는 LCR과 유사한 방법을 기술한다.
PCT특허출원공보 제PCT/US87/00880호 기술된 Q베타 리프리케이스(Qbeta Replicase) 는 또한 본 발명에서 또 다른 증폭 방법으로도 사용될 것이다. 상기 이 방법에서, 표적의 서열에 상보적인 부위를 가진 RNA의 복제 서열들은 RNA 중합효소의 존재하에 시료에 첨가된다. 상기 중합효소는 복제 서열을 복사할 것이고, 이는 그 다음에 검출된다.
등온 증폭(isothermal amplification) 방법은 또한 본 발명에서 핵산들의 증폭에 유용할 수 있을 것인데, 상기 방법에서 제한 효소들 및 연결 효소들은 제한 효소 인식부위의 한 가닥에 뉴클레오타이드 5'-[α-티오]-3인산(5'-[α-thio]-triphosphates)을 포함한 표적 분자들의 증폭을 이루는데 사용된다. Walker 외(1992)의 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함되었다.
가닥 치환 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA)은 여러 반복의 가닥 치환 및 합성(즉, 틈 번역(nick translation))과 연관이 있는 핵산들의 등온 증폭을 수행하는 또 다른 방법이다. 유사한 방법으로 복구연쇄반응(Repair Chain Reaction, RCR)은 증폭에 대한 표적된 부위를 통한 일부 탐색자들의 붙임(annealing)와 연관성을 가지는데, 붙임 후에 4개 염기들 중 단지 2개에 존재하는 복구 반응이 뒤를 따른다. 다른 두개 염기들은 쉬운 검출을 위해 바이오틴이 부착된 파생물들로써 첨가될 수 있을 것이다. 유사한 접근은 SDA에서 사용된다. 표적 특이적인 서열들은 사이클릭 탐색자 반응(cyclic probe reaction, CPR)을 사용하여 또한 검출될 수 있다. CPR에서, 비특이적인 DNA의 3' 및 5' 서열들을 가지는 탐색자 및 특이적 RNA의 중앙 서열은 시료에 존재하는 DNA에 결합된다. 결합시, 상기 반응은 리보핵산가수분해효소(RNase H)으로 처리되고, 상기 탐색자의 생성물은 절단처리 후 방출되는 독특한 산물로 확인된다. 원래의 틀(template)는 또 다른 사이클링(cycling) 탐색자에 부착되고 상기 반응은 반복된다.
계속해서 다른 증폭 방법들은 GB특허출원공보 제2 202 328호 및 PCT특허출원공보 제PCT/US89/01025호에 기술되었는데, 각각의 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함되며, 본 발명과 부합되게 사용될 수 있을 것이다. 이전 적용에서, "수정된(modified)" 프라이머들은 PCR 유사, 틀 및 효소 의존적 합성에 사용된다. 상기 프라이머들은 포착 잔기(capture moiety) (예를 들어, 바이오틴(biotin)) 및/또는 검출 잔기(detector moiety)(예를 들어, 효소)로 표지화되어 수정될 것이다. 후반의 적용에서는, 과량의 표지된 탐색자들은 시료에 더해진다. 상기 표적 서열의 존재시, 상기 탐색자는 결합하고 촉매작용으로 잘려지게 된다. 절단 후에, 상기 표적은 과량의 탐색자에 결합되어 온전한 상태로 방출되게 된다. 표지된 탐색자의 절단은 표적 서열의 존재를 신호한다.
다른 고려된 핵산 증폭 절차들은 핵산 서열 기초의 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA) 및 3SR을 포함하는 전사 기초의 증폭 시스템들(transcription-based amplification systems, TAS)을 포함한다. Kwoh 외(1989); Gingeras 외, PCT특허출원공보 제WO 88/10315호의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함되었다. NASBA에서, 상기 핵산들은 표준 페놀/클로로포름 추출(phenol/chloroform extraction), 임상적 시료의 열 변성, 용해 완충액의 처리 및 DNA 및 RNA의 분리를 위한minispin 컬럼(columns) 또는 RNA의 구아니디니움 클로라이드 추출(guanidinium chloride extraction)을 통해서 증폭을 위해 준비되어질 수 있을 것이다. 이러한 상기 증폭 기술들은 표적 특이적 서열들을 가지는 프라이머를 부착시키는 것과 연관된다. 중합된 이후에 DNA/RNA 잡종들은 리보핵산가수분해효소로 소화되고, 한편으로는 이중가닥DNA 분자들은 다시 열 변성된다. 어느 경우에나 외가닥DNA은 중합에 이어 두번째 표적 특이적 프라이머의 첨가로 완전한 이중가닥으로 만들어진다. 상기 이중가닥 DNA 분자들은 그 런다음 T7 또는 SP6와 같은 중합효소에 의해 다수로 전사된다. 등온 순환 반응에서, RNA는 이중가닥 DNA로 역전사되고, 그리고 T7 또는 SP6와 같은 중합효소에 반해서 한번 전사된다. 결과 산물들은(잘렸거나 완전하던 간에) 표적 특이적 서열들을 지시한다.
Davey 외, 유럽특허출원공보 제329 822호(본 명세서에서 전체 내용이 참고로 포함됨)는 순환적으로 합성되는 외가닥 RNA(single-stranded RNA, "ssRNA"), ssDNA, 및 이중가닥DNA(double-stranded DNA, dsDNA)와 연관된 핵산 증폭 과정을 밝혔으며, 이는 본 발명과 부합되게 사용될 것이다. ssRNA는 첫번째 프라이머 올리고핵산염에 대한 첫번째 틀로써, 역전사효소(RNA-의존적 DNA 중합효소)에 의해 길어진다. 그런 다음 상기 RNA는 리보핵산가수분해효소(ribonuclease H, RNase H)(DNA 또는 RNA와 두가닥으로 존재하는 RNA에 특이적인 RNA분해효소)의 작용으로 상기 결과물인 DNA:RNA 이중가닥으로부터 제거된다. 그 결과로 생긴 ssDNA는 두번째 프라이머에 대한 두번째 틀이며, 또한 RNA 중합효소( T7 RNA 중합효소로 대표됨) 프로모터의 서열을 포함한다. 상기 프라이머는 그 다음으로 DNA 중합효소(E. coli DNA 중합효소 1의 큰 "클레노브(Klenow)" 절편으로 대표됨)에 의해 확장되어, 그 결과 이중가닥DNA ("dsDNA") 분자가 생성되는데, 상기 dsDNA는 프라이머들 사이에 해당되는 원래의 RNA와 동일한 서열을 가지며 추가적으로 한 쪽 끝에는 프로모터 서열을 가진다. 상기 프로모터 서열은 상기 DNA에 대한 많은 RNA 복제물를 만들기 위해 적절한RNA 중합효소 의해 사용될 수 있을 것이다. 상기 복제물들은 그 다음으로 다시 상기 순환(cycle)에 들어가게 되어 결국 아주 신속한 증폭이 일어나게 된다. 적절한 효소의 사용으로, 상기 증폭은 각 순환에 효소를 추가하지 않고 등온적으로 행해질 것이다. 상기 과정의 순환적 성격 때문에, 시작 서열은 DNA 또는 RNA의 형태로 선택 되어질 수 있다.
Miller 외, PCT특허출원공보 제WO 89/06700호(전체 내용이 본 명세서의 참고로 포함됨)는 표적 외가닥 DNA("ssDNA")에 프로모터/프라이머 서열의 결합에 기초한 핵산 서열 증폭(상기 서열들의 많은 RNA 복제물의 전사로 이어지는)방식을 밝힌다. 상기 방식은 순환적이지 않다. 즉, 새로운 틀들이 그 결과로 생긴 RNA 전사물로부터 생성되지 않는다. 다른 증폭 방법들은 "race" 및 "one-sided PCR.TM."(Frohman(1990) 및 Ohara 외(1989), 각각은 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함됨)
상기 결과인 "두-올리고핵산염(di-oligonucleotide)"의 서열을 가지는 핵산의 존재하에 두 개(또는 그 이상) 올리고핵산염의 결찰에 기초한 방법들은 (그로 인해 상기 두-올리고핵산염을 증폭하는) 또한 본 발명의 증폭 단계에 사용될 수 있을 것이다(Wu 외(1989), 전체 내용이 본 명세서의 참고로 포함됨).
본 발명의 올리고핵산염 탐색자들 또는 프라이머들은 특정한 분석 구성방식 및 특정한 필요성 및 사용된 표적화 서열들에 의존하여 적합한 길이일 것이다. 바람직한 구체예로, 올리고핵산염 탐색자들 또는 프라이머들은 최소 10 뉴클레오타이드 길이(바람직하게는, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32... ), 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드 길이(15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32... )이고, 선택된 핵산 증폭 시스템 및/또는 사용된 부합(hybridization) 시스템에 대해 특별히 적합하게 되도록 맞추어질 것이다. 긴 탐색자들 및 프라이머들은 당 기술분야에 잘 알려 있듯이 또한 본 발명의 범주내에 있다. 30 이상, 40 이상, 50 이상의 뉴클레오타이드 길이를 가지는 프라이머들 및 100 이상, 200 이상, 300 이상, 500 이상, 800 이상 및 1000 이상의 뉴클레오타이드 길이를 가지는 탐색자들은 또한 본 발명에 포함된다. 물론, 긴 프라이머들은 비용이 많이 든다는 단점을 가져서, 15에서 30사이 길이의 뉴클레오타이드가 일반적으로 당 기술분야에서 프라이머로 사용된다. 당 기술분야에 잘 알려 있는 것으로, 10에서 2000이상까지의 뉴클레오타이드 길이 범위에 드는 가지는 탐색자들은 본 발명의 방법들에서 사용될 수 있다. 상기 기술된 일치성의 %에 대해서 말하자면, 비특이적으로 기술된 탐색자들 및 프라이머들의 크기(예를 들어, 16, 17, 31, 24, 39, 350, 450, 550, 900, 1240 뉴클레오타이드,... )는 또한 본 발명의 범주내에 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 올리고핵산염 탐색자들 또는 프라이머들은 특이적으로 Eno1 RNA(또는 그것의 상보적 서열) 또는 Eno1 mRNA에 부합된다. 좀 더 바람직하게는, 상기 Eno1 프라이머들 및 탐색자들은 혈당 상승 또는 비정상적인 혈당 조절(예를 들어, 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병과 관련된)과 연관된 Eno1 RNA를 검출하기 위해 선택된다.
다른 구체예들에서, 상기 검출은 부합화(hybridization) 기술을 활용할 수 있는 것을 의미하는데, 예를 들어, 특이적 프라이머 또는 탐색자가 관심의 표적 생체지표(예를 들어, Eno1)에 부합되도록 선택된 후에, 선별적인 부합의 검출이 이루어진다. 당 기술분야에 일반적으로 알려진 것처럼, 상기 올리고핵산염 탐색자들 및 프라이머들은 표적 서열과의 부합의 녹는점을 고려하여 제작될 수 있다(아래 참고 및 Sambrook 외, 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2nd Edition, CSH Laboratories; Ausubel 외, 1994, in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., N.Y.).
본 발명의 분석 조건들하에서 부합이 발생되게 하려면, 올리고핵산염 프라이머들 및 탐색자들은 Eno1 폴리뉴크레오티드의 일부분에 대해 최소 70%(최소 71%, 72%, 73%, 74% 이상), 바람직하게는 최소 75%(75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 이상) 및 더 바람직하게는 최소 90%(90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%)의 일치성을 가지는 올리고핵산염 서열을 가져야 한다. 본 발명의 탐색자들 및 프라이머들은 엄격한 부합 조건들하에서 부합되는(hybridize) 것들이고, 최소 중간정도로 엄격한 조건들하에서 Eno1 동종체들에 부합되는 것들이다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 탐색자들 및 프라이머들은 Eno1 유전자 서열들(예를 들어, cDNA 또는 mRNA)에 완전한 서열 일치성을 가진다. 다른 탐색자들 및 프라이머들은 컴퓨터 얼라인먼트(computer alignment)의 방법들 및 당 기술분야(예, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, edited by Cold Spring Harbor Laboratory, 2000)에서 알려진 서열 분석을 사용함으로써 쉽게 제작될 수 있고 본 명세서에서 밝혀진 Eno1 서열들에 기초한 본 발명에서 사용될 수 있다.
C. 혈당 조절에서 혈당의 폴리펩타이드 지표들의 검출
본 발명은 Eno1 및 당화혈색소를 포함한 혈당의 폴리펩타이드 지표들를 검출하는 적합한 방법을 고려한다. 일부 구체예들에서, 상기 검출 방법은 하나 이상의 Eno1 및 혈색소(특히, 당화혈색소)에 특이적으로 결합하는 항체를 수반하는 면역검출 방법이다. 다양하고 유용한 면역검출 방법들의 단계들은 과학 서적(예를 들어, Nakamura 외(1987), 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술되었다.
일반적으로, 상기 면역결합 방법들은 혈당 상승에서 단백질 또는 펩타이드 지표를 포함하는 것으로 의심이 되는 시료를 획득하는 것을 포함하고, 그리고 (경우에 따라) 면역 복합체들의 형성을 허용하는데 효과적인 조건들 아래에서 본 발명과 부합되게 항체로 시료를 접합하는 것을 포함한다.
상기 면역결합 방법들은 시료에서 반응을 보이는 요소의 양을 검출 또는 정량하는 방법들을 포함하는데, 상기 방법들은 상기 결합 과정 동안 형성된 면역 복합체의 검출 및 정량화를 요구한다. 여기서, 혈당 상승에서 단백질 또는 펩타이드 지표를 포함하는 것으로 의심이 되는 시료를 획득고, 항체로 시료를 접촉하고, 그런 다음 특이적 조건들하에서 형성되는 면역 복합체의 양을 검출 또는 정량할 수 있을 것이다.
혈당에서 지표의 검출에 관하여 언급하자면, 상기 분석된 생물학적 시료는 혈당에서 단백질 또는 펩타이드 지표(예, Eno1 또는 당화혈색소)를 포함하는 것으로 의심되는 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 예를 들어 당화혈색소일 경우에는 혈액일 수 있고, 또는 Eno1일 경우에는 혈액 또는 혈청일 수 있다.
면역 복합체(일차 면역 복합체)의 형성에 효과적이고 충분한 시간이 주어지는 조건들 하에서 항체(예를 들어, 생물학적 시료에서 Eno1, 당화혈색소, 또는 혈색소에 결합하는 검출 시약으로써)와 선택된 생물학적 시료를 접촉하는 것이다. 일반적으로, 복합체 형성은 간단히 생물학적 시료에 상기 조성물을 첨가하고 항체들이 존재하는 항원과 면역 복합체를 형성(즉, 항원에 결합하는 것)을 하도록 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 배양하는 일이다. 앞에서 기술되었듯이 충분한 시간의 배양 후에, 시료-항체 조성물(조직 단편들, ELISA 판, 점블럿(dot blot) 또는 웨스턴블럿(western blot))은 일반적으로 비특이적으로 결합한 항체들을 제거하기 위해서 세척되며, 검출될 일차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합한 항체들만 오로지 허용하게 된다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당 기술분야에 잘 알려 있고 수 많은 접근법들의 적용을 통해서 수행될 수 있다. 상기 방법들은 일반적으로 (당 기술분야에서 표준으로 사용되는 방사성의, 형광성의, 생물학적 또는 효소의 꼬리표들 또는 라벨들과 같은) 라벨 또는 표지물의 검출에 기초한다. 상기 라벨의 사용과 관련된 미국특허들은 미국특허 제3,817,837호; 제3,850,752호;제 3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함하며, 각각은 참고로 본 명세서에 포함된다. 물론, 당 기술분야에 알려 있듯이, 이차 항체 또는 바이오틴/아비딘 리간드 결합 정렬과 같은 이차 결합의 사용을 통해서 추가적인 장점들을 발견할 수 있을 것이다.
상기 검출에 적용된 항체(예를 들어, 항-Eno1 항체, 항-혈색소 또는 항-당화혈색소 항체)는 그 자체로 탐지 가능한 라벨에 연결될 수 있고, 그런 다음 간단히 상기 라벨을 검출할 수 있을 것이며, 그로 인해 결정되어질 조성물에서 일차 면역 복합체의 양을 확인할 수 있을 것이다.
또는, 일차 면역 복합체내에 결합하게 되는 첫번째로 첨가되는 요소는 결합된 항체에 결합력을 가지는 두번째 결합 리간드를 이용해서 검출될 수 있을 것이다. 상기 경우에는, 두번째 결합 리간드는 탐지 가능한 라벨에 연결될 것이다. 두번째 결합 리간들는 그 자체로 흔히 항체가 되며, 그래서 "이차(secondary)" 항체로 불려질 것이다. 상기 일차 면역 복합체는 이차 면역 복합체의 형성을 허용하는 효과적이고 충분한 시간이 주어지는 조건들하에서 표지된, 이차 결합 리간드, 또는 항체와 접촉한다. 이차 면역 복합체는 일반적으로 비특이적으로 결합되어진 표지된 이차 항체들 또는 리간드를 제거하기 위해 세척되고, 다음으로 이차 면역 복합체에 남아있는 라벨이 검출된다.
추가 방법들은 2단계 접근법을 사용한 일차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 암호화된 단백질, 펩타이드 또는 상응하는 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 (항체와 같은) 이차 결합 리간드는 상기 기술된 대로 이차 면역 복합체 형성에 사용된다. 세척 후에, 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 허용하는 효과적이고 충분한 시간이 주어지는 조건들하에서, 이차 면역 복합체는 이차 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 3차 결합 리간드 또는 항체와 접촉한다. 상기 3차 리간드 또는 항체는 탐지 가능한 라벨에 연결되며, 이로써 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 허용한다. 상기 시스템은 요구시 신호 증폭을 위해 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 면역검출 방법들은 혈당 상승, 혈당 조절 소실, 및 당뇨병과 같은 상태들의 진단에 분명한 유용성을 가진다. 본 명세서에서, 암호화된 단백질 또는 당화 펩타이드를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 또는 임상적 시료가 사용된다. 하지만, 상기 구체예들은 비임상적 시료들에 적용도 또한 포함한다(항원 또는 항체 시료들의 역가측정, 융합세포의 선별 등).
본 발명은, 특히, 면역검출 분석의 한 형태인 ELISA의 사용을 고려한다. 본 발명의 생체지표 단백질들 또는 펩타이드들은 비정상적인 혈당 및 당뇨병을 진단 및 예후 진단에서 ELISA 분석에서 면역원들로써 유용성을 찾을 수 있을 것으로 고려된다. 면역학적 검정법들(대부분의 시료 및 직접적 의미에서)은 결합 분석이다. 일부 바람직한 면역학적 검정법들은 다양한 종류의 당 기술 분야에서 알려진 효소 표식 면역 검사법(enzyme linked immunosorbent assays, ELISAs) 및 방사면역측정법(radioimmunoassays, RIA)이다. 조직 단편들을 사용하는 면역조직화학적 검출은 유용하다. 하지만, 검출은 상기 기술들에 국한되지 않고, 웨스턴 블럿팅(western blotting), 점 브로팅(dot blotting) 등이 또한 사용될 수 있을 것이다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 본 발명의 단백질 지표들에 결합하는 항체들은 단백질 친화성을 보이는 선별된 표면(폴리스티렌 마이크로티터 플레이트(polystyrene microtiter plate))에 고정된다. 그 다음, 혈당 수치의 지표를 포함하는 것으로 의심되는 검사 조성물(혈액 또는 혈청 시료와 같은)은 상기 홈(well)에 첨가된다. 결합되고 비특이적으로 붙어 있는 면역복합체를 제거하기 위한 세척 후에, 결합된 항원은 검출될 것이다. 검출은 일반적으로 탐지 가능한 라벨에 연결된 지표 단백질에 대해 특이적인 이차 항체의 첨가에 의해 이루어진다. 상기 종류의 ELSA는 단순한 "샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)"이다. 검출은 이차 항체의 첨가로 이루어질 수 있는데, 이차 항체 첨가 후 이차 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 삼차 항체가 첨가 되며, 상기 삼차 항체는 탐지 가능한 라벨에 연결되어 있다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, 혈당 지표 단백질들을 포함하는 것으로 의심되는 시료들은 표면 홈에 고정되고, 그런 다음 상기 지표에 결합하는 특이적 항체들과 접촉하게 된다. 결합되고 비특이적으로 붙어 있는 면역복합체를 제거하기 위한 세척 후에, 결합된 항원은 검출될 것이다. 초기 항체들이 탐지 가능한 라벨에 연결된 곳에서, 면역복합체는 직접적으로 검출될 것이다. 다시 언급하자면, 상기 면역복합체는 일차 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 이차 항체를 이용하여 검출될 수 있는데, 여기서 이차 항체는 탐지 가능한 라벨에 연결되어 있다.
사용된 구성방식과 관계없이, ELISA들은 코팅, 배양 또는 결합, 비특이적 결합 종 제거를 위한 세척, 및 결합 면역복합체 검출과 같은 어떤 특성들을 일반적으로 가진다. 다음과 같이 기술된다.
항원 또는 항체로 판(plate)을 코팅시, 일반적으로 하룻밤 동안 또는 지정된 시간의 기간 동안, 항원 또는 항체의 용액으로 판의 홈(well)을 배양할 것이다. 그 다음 불완전하게 흡수된 물질을 제거하기 위해 판의 홈들은 세척될 것이다. 그 다음 남아있는 홈들의 사용가능한 표면들은 검사 항혈청에 관해 항원과 관련하여 중성인 비특이적인 단백질로 코팅된다. 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 카세인(casein), 및 분유의 용액이 이에 해당된다. 상기 코팅은 고정화된 표면상에서 비특이적인 흡수 자리들을 차단하고 그렇게 함으로써, 표면에서 비특이적인 항혈청 결합에 의해 유발되는 백그라운드를 감소하게 한다.
ELISA들에서는, 직접적인 절차보다는 이차 또는 삼차 검출이 일반적이다. 그러므로, 홈에 단백질 또는 항체를 결합, 백그라운드를 낮추기 위한 무반응 물질로 코팅, 그리고 비결합된 물질 제거하기 위한 세척 후에, 면역복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건들하에서 고정화된 표면은 대조 생물학적 시료(예를 들어, 정상 혈당 및/또는 검사받을 충분한 혈당 조절을 가지는 피험자에서의 혈액 또는 혈청)와 접촉하게 된다. 그 다음 상기 면역복합체의 검출은 표지된 이차 결합 리간드 또는 항체, 또는 표지된 삼차 항체 또는 삼차 결합 리간드에 결합된 이차 결합 리간드 또는 항체를 요구한다.
문구 "면역복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건들하에서"는 바람직하게는 BSA, 소 감마 글로불린(bovine gamma globulin, BGG) 및 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)/트윈(Tween)과 같은 용액으로 항원들 및 항체들의 희석을 포함하는 조건을 의미한다. 상기 추가되는 물질들은 또한 비특이적인 백그라운드의 감소에 도움을 주는 경향이 있다.
용어 "적합한" 조건들은 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도에서 및 기간 동안 상기 배양이 이루어진다는 것을 또한 의미한다. 배양 단계들은 전형적으로 바람직하게는 대략 25에서 27℃에서 약 1에서 4시간, 또는 약 4℃ 정도에서 하룻밤 동안이다.
ELISA에서 모든 배양 단계들 이후에, 접촉된 표면은 복합체를 이루지 않은 물질의 제거를 위해서 세척된다. 하나의 바람직한 세척 절차는 PBS/Tween 또는 보레이트(borate) 완충액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함한다. 검사 시료와 원래적으로 결합된 물질과의 특이적 면역복합체의 형성, 그 다음으로 행해지는 세척에 이어서, 면역복합체의 발생이 심지어 적은 양이더라도 검출될 것이다.
검출 방법들을 제공하기 위해서, 이차 또는 삼차 항체는 검출을 허용하기 위해 라벨과 연결된다. 바람직하게는, 상기 라벨은 적절한 색원체성 기질과 배양시 색을 발생시키는 효소이다. 그래서, 예를 들어, 일정 기간 동안 그리고 더욱 면역복합체 형성을 선호하는 조건들에서(예를 들어, PBS-Tween과 같은 PBS를 포함하는 용액에서 상온에서 2시간 동안 배양), 일차 또는 이차 면역복합체는 우레아제(urease), 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 알칼린 인산가수분해효소(alkaline phosphatase) 또는 수소 과산화효소가 접합된(hydrogen peroxidase-conjugated) 항체와 접촉되고 배양된다.
표지된 항체로 배양되고, 이어서 결합되지 않은 물질의 제거를 위한 세척 후에, 라벨의 양은 정량화(예를 들어, 요소 및 브롬크레졸자색소(bromocresol purple)와 같은 색원체성 기질과의 배양을 통해) 된다. 그런 다음, 정량화는 (예를 들어, 가시 스팩트럼 분광광도계를 사용하여) 색 발생의 정도를 측정함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 단백질 생체지표들/지표들(예를 들어, Eno1, 당화혈색소)는 또한 단백질 질량 분광분석법 및 기기 장치를 사용하여 측정되고, 정량화되고, 검출되고, 그리고 다르게 분석되어 질 수 있다. 단백질 질량 분광분석법은 단백질 연구에 질량 분광분석법의 적용을 지시한다. 비록 국한하고자 의도하지는 않지만, 두 가지 접근법들이 질량 분광분석법을 이용하여 단백질 특징화를 하는데 일반적으로 사용된다. 첫번째로는, 손상되지 않은 단백질들은 이온화되고 그런 다음 질량 분석기로 주입된다. 상기 접근법은 단백질 분석의 "하향식(top-down)" 전략으로 지시된다. 전체 단백질들의 이온화에 대한 두 가지 주된 방법들은 전자분무이온화(electrospray ionization, ESI) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 이다. 두번째 접근법으로는, 트립신(trypsin)과 같은 단백질분해효소가 사용되어 단백질들이 작은 펩타이드들로 효소작용으로 분해된다. 그 뒤에 상기 펩타이드들은 질량 분석계로 주입되고, 펩타이드 질량 지문법(peptide mass fingerprinting) 또는 이중질량분석법(tandem mass spectrometry)에 의해 확인되어진다. 이런 이유로, 상기 후자의 접근법(또한 "상향식(bottom-up)" 단백질체학으로 불림)은 단백질들의 존재를 추론하기 위해서 펩타이드 레벨(level)에서 확인한다.
본 발명의 생체지표들의 전체 단백질 질량 분석은 흐름시간 질량 분광계(time-of-flight(TOF) MS), 또는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR)을 사용하여 행해질 수 있다. 상기 두 종류의 측정 계기는 넓은 질량 범위, 및 (FT-ICR의 경우) 높은 질량 정확도로 인해 유용하다. 가장 널리 사용되는 펩타이드 질량 분석에 대한 측정 계기는 MALDI 흐름시간(MALDI time-of-flight) 측정 계기인데, 왜냐하면 MALDI 흐름시간 측정 계기는 높은 속도로(1 PMF은 약 10초로 분석될 수 있음) 펩타이드 질량 지문(peptide mass fingerprints, PMFs)의 획득을 허용하기 때문이다. 다단 사중극자 흐름시간(Multiple stage quadrupole-time-of-flight) 및 사중극자 이온 트랩(quadrupole ion trap)도 또한 상기 적용에 유용하다.
단백질 지표들은 생물학적 배지 또는 시료에 공존하는 단백질들 및 분자들의 복합체 혼합물들에서 또한 측정될 수 있지만, 하지만, 시료의 분할이 요구되고 본 명세서에서 고려된다. 단백질들의 복합체 혼합물들의 이온화는 동일한 시료에서 좀 더 많은 단백질들이 "잠기게 하다(drown)"할 경향을 같게 하거나 또는 좀 더 적은 단백질에서 나오는 신호를 억제하는 상황을 유발할 수 있다는 것을 인정하게 될 것이다. 추가적으로, 복합체 혼합물에서 나오는 질량 스펙트럼은 혼합물 요소들의 압도적인 수로 인해 해석하기 어려울 수 있다. 분활은 질량 분광분석법 분석전에 단백질들의 복합체 혼합물을 첫번째 분리하는데 사용될 수 있다. 두 방법들은 단백질들, 또는 효소의 소화로부터 생기는 상기 단백질의 펩타이드를 분류하는데 널리 사용된다. 첫번째 방법은 전체 단백질들을 분류하고, 2차원 겔 전기영동(two-dimensional gel electrophoresis)으로 불리운다. 두번째 방법(고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, LC 또는 HPLC))은 효소 소화 후에 펩타이드들을 분류할 때 사용된다. 일부 상황에서는, 상기 기술들 두 가지를 결합하는 것이 바람직할 것이다. 단백질 혼합물들을 분류하기 위한 당 기술분야에서 알려진 다른 적합한 방법들도 또한 본 명세서에서 고려된다.
2D 겔(gel)상에서 확인되는 겔 반점은 일반적으로 하나의 단백질에서 기인하다. 만약 단백질의 일치성이 요구된다면, 일반적으로 겔 내 분해(in-gel digestion) 방법이 적용되는데, 이 방법에서는 관심의 단백질 반점은 잘라 내어지고, 단백질 가수 분해적으로 소화된다. 소화로 생성된 펩타이드 질량들을 펩타이드 질량 지문(peptide mass fingerprinting)을 사용하여 질량분광분석법에 의해 결정될 수 있다. 상기 정보가 상기 단백질의 명백한 확인을 허용하지 않으면, 단백질의 펩타이드들은 드 노브 시퀀싱(de novo sequencing)에 대해 이중질량분석법에 분석되어질 수 있다.
HPLC/MS을 사용한 단백질 혼합물들의 특성화는 당 기술분야에서 용어 "슛건 단백질체학(shotgun proteomics)" 및 다차원적 단백질 식별 기술(원의 Protein Identification Technology, MuDPIT)로 또한 지시될 수 있을 것이다. 단백질 혼합물의 소화로부터 생겨난 펩타이드 혼합물은 하나 또는 두 단계 액체 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)에 의해 분류된다. 크로마토그래피 단계로부터의 용리액은 전자분무 이온화를 통해 직접적으로 질량 스펙트로그래피로 주입되거나, 또는 MALDI를 사용하여 이후 질량 분석을 위해 작은 반점들의 나열 상에 내려 놓여 질 수 있다.
단백질 지표들(예를 들어, Eno1 또는 당화혈색소)는 여러 가지의 기술들을 이용한 MS를 사용하여 확인될 수 있는데, 상기 모든 기술들은 본 명세서에서 고려된다. 펩타이드 질량 지문은 알려진 단백질의 리스트의 소화를 통해서 생겨난 예상 질량들의 데이타베이스의 검색에 입력(input)으로 단백질 가수분해된 펩타이드들의 질량들을 사용한다. 참고 리스트에서 단백질 서열이 실험적 수치들과 일치되는 상당한 수의 예상 질량들을 생기게 하면, 상기 단백질이 원래의 시료에 존재한다는 일부 증거가 된다. 미세모세관 액체 크로마토그래피(microcapillary liquid chromatography, LC) 및 데이터베이스 검색과 함께 자동화되고, 데이터에 의존적인 전자분무이온하(electrospray ionization, ESI) 이중질량분석법(tandem mass spectrometry, MS/MS)에 대한 방법들 및 측정 계기들의 발달은 겔에서 분리되는 단백질들의 확인의 민감도 및 속도를 상당히 증가시켰다는 것을 더 나아가 인정하게 될 것이다. 미세모세관LC-MS/MS는 겔 전기영동 분리없이 혼합물들로부터 직접적으로 개개의 단백질들을 대규모로 확인하는 것에 성공적으로 사용되었다(Link 외, 1999; Opitek 외, 1997)
일부 최근 방법들은 질량 분광분석법에 의한 단백질들의 정량화를 가능하게 한다. 예를 들어, 탄소(13C) 또는 질소(15N)의 안정적인(예를 들어, 비방사성의) 중동위 원소들은 하나의 시료에 포함될 수 있고, 한편으로는 다른 하나의 시료는 상응하는 경동위원소들(예 12C 및 14N)로 표지될 수 있다. 상기 두 시료들은 분석전에 섞인다. 다른 시료들로부터 유도된 펩타이드들은 그들의 질량 차이로 인해 구분될 수 있다. 상기 펩타이드들의 피크(peak) 강도의 비율은 상기 펩타이드(및 단백질)의 상대적인 존재비에 해당된다. 가장 선호되는 동위원소 라벨링에 대한 방법들은 '세포배양에서 아미노산에 의한 안정적인 동위원소 라벨링(stable isotope labeling by 노 acids in cell culture, SILAC)', '트립신-촉매된 180 라벨링(trypsin-catalyzed 18O labeling)', '동위원소 부호화 친화성 꼬리표(isotope coded affinity tagging, ICAT)', '상대적 및 절대적 정량화를 위한 동중원소 꼬리표(isobaric tags for relative and absolute , iTRAQ)' 이다. 용어 "반정량적(Semi-quantitative)" 질량 분광분석법은 시료들의 라벨링 없이 실시될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 MALDI 분석(선형 모드로)으로 행해진다. 각각의 분자들(전형적으로 단백질들)로부터의 피크 강도, 또는 피크 영역은 시료에서 단백질의 양과 연관된다. 하지만, 상기 각각의 신호는 상기 단백질의 일차 구조, 상기 시료의 복잡성, 및 상기 측정 계기의 설정에 의존한다. 다른 종류의 "라벨 없는(label free)" 정량적 질량 분광분석법은 상대적인 단백질 양을 결정하기 위한 수단으로 소화된 단백질의 분광 셈(spectral counts)(또는 펩타이드 셈(peptide counts))을 사용한다.
하나의 구체예에서, 하나 이상의 단백질 지표들(예를 들어, Eno1, 당화혈색소)은 질량 분광법을 사용해서 복잡한 생물학적 시료로부터확인 및 정량될 수 있는데, 이는 (본 발명을 제한할려고 의도되지 않은) 다음에 나오는 예시적인 방법 또는 다른 질량 분광분석법에 기초한 방법들의 사용과 부합된다.
이 구체예의 첫번째 단계에서는, (A) 단백질의 복합 혼합물을 포함하는(최소 하나의 관심 지표를 포함) 생물학적 시료(예를 들어, 혈당 증가를 가질 것으로 의심되는 생물학적 시료)는 단편화 되고 안정적인 동위원소 X로 표지된다. (B) 다음으로, 알려진 양의 내부 표준이 생물학적 시료에 첨가되는데, 여기서 내부 표준은 최소 하나의 관심 표적 생체지표에 동일한 표준 단백질을 단편화시켜서 준비되고, 안정적인 동위원소 Y로 표지된다. (C) 다음으로, 얻어진 상기 시료는 LC-MS/MS 계기에 주입되고, 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM) 분석이 내부 표준에 대해 선택된 MRM 전이(transitions)를 사용하여 MRM 크로마토그램(chromatogram)을 획득하기 위해서 실시되어진다. (D) 상기 MRM 크로마토그램은 내부 표준(내부 표준 펩타이드)로부터 발생된 펩타이드와 동일한 유지 시간을 보이는 생물학적 시료로부터 발생된 표적 펩타이드를 확인하기 위해 보여지고, 표적 펩타이드 지표(indicator)의 피크 영역과 내부 표준 펩타이드의 피크 영역을 비교함으로써 검사 시료에서 표적 단백질 지표를 정량하게 된다.
어떠한 적합한 생물학적 시료는 LC-MS/MS/MRM 분석에 대한 출발점으로 사용될 수 있을 것이며, 상기 생물학적 시료로는 생물학적 시료들에 발생된 혈액, 소변, 침, 머리카락, 세포들, 세포 조직들, 생체검사 재료들, 및 이의 처리된 생성물들; 및 유전자 재조합 기술로 만들어진 단백질을 포함하는 시료들을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예들은 혈액 또는 혈청 시료들을 포함한다.
상기 (A)에서 (D)까지 각각의 단계들은 아래에 더 기술된다.
(A) 단계(단편화및 라벨링). (A) 단계에서는, 상기 표적 단백질 지표는 단편화되어 펩타이드들 집합체로 되며, 이어서 안정된 동위 원소 X로 표지된다. 상기 표적 단백질을 단편화하기 위해서, 예들 들어, 트립신(trypsin)과 같은 단백질 분해효소(프로티아제(protease))로 표적 단백질을 소화시는 방법, 또는 브롬화시안(cyanogen bromide)을 사용하는 방법과 같이 화학적 절단 방법들이 사용될 수 있다. 단백질 분해효소에 의한 소화가 바람직하다. 만약 단백질 분해 효소에 의한 소화가 완전하게 진행되면, 주어진 단백질의 몰 양은 트립신의 펩타이드 절단 생성물 각각에 대한 몰 양과 동일한 것으로 알려있다. 그래서, 주어진 단백질에서 트립신의 작용에 의해 생긴 펩타이드의 몰 양을 결정하는 것은 시료에서 원래 단백질의 몰 양을 결정하게 해준다. 표적 단백질의 절대적 정량은 상기 단백질 분해효소 소화(펩타이드들의 집합체)에 포함된 표적 단백질 유래의 펩타이드들의 절대적 양을 결정함으로써 이루어질 수 있다. 그래서, 단백질 분해효소에 의해 소화가 완전하게 진행되게 하기 위해서는, 상기 표적 단백질에 포함된 이황화 결합들을 환원 및 알킬화시키기 위해서 단백질 분해효소로 단백질을 소화시키기 전에 환원 및 알킬화 처리가 바람직하게는 실시된다.
그 뒤를 이어서, 획득된 상기 소화물(상기 생물학적 시료에서 표적 생체지표의 펩타이드들을 포함하는, 펩타이들의 집합체)은 안정된 동위 원소 X로 라벨링된다. 안정된 동위 원소들에 대한 예들로 수소 원자들에 대한 1H 및 2H, 탄소 원자에 대한 12C 및 13C, 및 질소 원자에 대한 14N 및 15N을 포함한다. 모든 동위 원소들은 상기 기술된 것들로부터 적당하게 선별될 수 있다. 안정된 동위 원소 X 에 의한 라벨링은 안정된 동위 원소를 포함하는 시약으로 상기 소화물(펩타이들의 집합체)을 반응시킴으로써 실시될 수 있다. 시판되는 상기 시약들의 바람직한 예들로 mTRAQ®(Applied Biosystems에서 생산)이 있으며, 이는 아민(amine) 특이적인 안정된 동위 원소 시약 키드이다. mTRAQ®는 2 또는 3 종류의 시약들(mTRAQ®-light 및 mTRAQ®-heavy; 또는 mTRAQ®-D0, mTRAQ®-D4, 및 mTRAQ®-D8)로 구성되는데, 상기 시약들은 동위 원소 라벨링의 결과로 그들 사이에 일정한 질량 차이를 가지고, 그리고 펩타이드의 N-말단 또는 라이신(lysine) 잔기의 일차 아민(primary amine)에 결합된다.
(B) 단계(내부 표준의 추가). (B) 단계에서는, 알려진 양의 내부 표준이 (A) 단계에서 획득된 시료에 더해진다. 본 명세서에 사용되는 내부 표준은 측정될 표적 단백질(표적 생체지표)처럼 동일한 아미노산 서열로 구성된 단백질(표준 단백질)을 단편화하고, 획득된 소화물(펩타이들의 집합체)를 안정된 동위 원소 Y로 라벨링함으로써 획득되어지는 소화물(펩타이드들의 집합체)이다. 상기 단편화 처리는 표적 단백질에 대해 상기에서 처럼 동일한 방식으로 실시될 수 있다. 안정된 동위 원소 Y로 라벨링하는 것은 표적 단백질에 대해 상기에서처럼 동일한 방식으로 실시될 수 있다. 하지만, 본 명세서에서 사용되는 상기 안정된 동위 원소 Y는 상기 표적 단백질 소화를 라벨링하는데 사용된 안정된 동위 원소 X와는 다른 질량을 가지는 동위 원소이어야 한다. 예를 들어, 상기 언급한 mTRAQ(등록 상표)(Applied Biosystems에서 생산)를 사용한 경우에서는, mTRAQ-경(light)이 표적 단백질 소화물을 라벨링하는데 사용될 때, mTRAQ-중(heavy)은 표준 단백질 소화물을 라벨링하는데 사용되어져야 한다.
(C) 단계(LC-MS/MS 및 MRM 분석). 단계에서는, (B) 단계에서 획득된 시료는 먼저 LC-MS/MS 장치에 넣어지고, 그런 다음 내부 표준에 대해 선별된 MRM 전이를 사용하여 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM) 분석이 실시된다. LC-MS/MS 장치를 사용하는 LC(liquid chromatography(액체 크로마토그래피))에 의해서, (B) 단계에서 획득된 상기 시료(안정된 동위 원소로 표지된 펩타이드들의 집합체)는 우선 1차원의 또는 다차원의 고성능 액체 크로마토그래피로 분리된다. 이러한 액체 크로마토그래피의 특이적 예들로 펩타이드들 사이의 전하 차이를 활용하여 분리가 이루어지는 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 및 펩타이드들 사이의 소수성 차이들 활용하여 분리가 이루어지는 역상 크로마토그래피(reversed-phase chromatography)를 포함한다. 상기 두 방법들은 결합하여 사용될 수 있을 것이다.
그 뒤를 이어서, 상기 분리된 각각의 펩타이드들은 직열로 연결된 두 질량 분석계들을 포함하는 직열 질량 분석계(tandem mass spectrometer, MS/MS spectrometer)를 사용하여 직열 질량 분석법에 적용된다. 상기 질량 분석계의 사용은 표적 단백질의 일부 펨토몰(fmol) 수치들의 검출을 가능하게 한다. 더욱이, MS/MS 분석은 펩타이드들 상에 있는 내부 서열 정보의 분석을 가능하게 하며, 그러므로 위양성(false positives) 없는 확인을 가능하게 한다. 다른 종류의 MS 분석계들은 또한 사용될 수 있는데, 그 예로는 자기 영역 질량 분광계(magnetic sector mass spectrometers, Sector MS), 사중극자 질량 분석계(quadrupole mass spectrometers, QMS), 흐름시간 질량 분석계(time-of-flight mass spectrometers, TOFMS), 및 푸르에르 전환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석계(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometers, FT-ICRMS), 및 이들 분석계들의 결합을 그 예로 들수 있다.
그 뒤를 이어서, 상기 획득된 데이타는 각각 단백질에 대해 실험적으로 검출된 펩타이드들을 나열하고 스펙트럼 할당(spectral assignment)을 수행하기 위해서 검색 엔진(search engine)에 연결된다. 상기 검출된 펩타이드들은 바람직하게는 각각의 단백질에 대해 그룹화되고, 바람직하게는 전구 이온의 값보다 더 큰 m/z 값을 가지는 최소 3개 단편들이고 그리고, (바람직하게는) 500이상의 m/z 값을 가지는 최소 3개의 단편들이 스펙트럼 상에서 신호 강도의 하향 순서로 각각의 MS/MS 스펙트럼에서부터 선별된다. 상기 단편들로부터, 두개 이상 단편은 강도의 하향식 순서로 선별되고, 평균 강도는 MRR 전이의 예상된 감도로 규정된다. 수많은 펩타이드들이 하나의 단백질로부터 검출될 때, 지수로 예상된 감도를 사용하여 가장 높은 감도를 가지는 최소 두개 펩타이드들이 표준 펩타이드로 선별된다.
(D) 단계(검사 시료에서 표적 단백질의 정량화). (D) 단계는 내부 표준(내부 표준 펩타이드)에서 유래된 펩타이드 처럼 동일한 유지 시간을 보이는 표적 단백질(관심 표적 생체지표)((C) 단계에서 검출된 MRM 크로마토그램에서에서) 유래된 펩타이드를 확인하는 것을 포함하며 그리고, 표적 펩타이드의 피크 영역과 내부 표준 펩타이드의 피크 영역을 비교함으로써 검사 시료에서 표적 단백질을 정량화하는 것을 포함한다. 상기 표적 단백질은 사전에 준비된 표준 단백질의 검정곡선을 활용하여 정량화될 수 있다.
상기 검정곡선은 아래와 같은 방법으로 준비될 수 있다. 첫번째, 상기 표지 생체지표 단백질의 아미노산 서열과 동일한 서열로 구성되는 재조합 단백질은 상기 기술된 대로 트립신(trypsin)과 같은 단백질 분해효소로 소화된다. 그 뒤를 이어서, 알려진 농도의 전구체-단편 전이 선별 표준(precursor-fragment transition selection s, PFTS)는 다른 종류의 안정된 동위원소들로 개별적으로 표지된다(즉, 하나는 내부 표준 펩타이드(IS로 표지된)를 표지할 때 사용된 안정된 이성질체로 표지되고, 반면 다른 것은 표적 펩타이드(T로 표지된)를 표지할 때 사용된 안정된 이성질체로 표지됨). 많은 수의 시료들은 일정 양의 IS-표지된 PTFS를 다양한 농도의 T-표지된 PTFS와 혼합해서 만들어진다. 상기 시료들은 MRM 분석을 실시하기 위해 상기 언급한 LC-MS/MS 장치에 넣어진다. 획득된 MRM 크로마토그램 상에서 T-표지된 PTFS 대 IS-표지된 PTFS의 비율(T-표지된 PTFS/IS-표지된 PTFS)은 검정곡선을 만들기 위해 T-표지된 PTFS의 양에 대해 플롯팅(plotting) 되어진다. 상기 검사 시료에 포함된 표적 단백질의 절대적인 양은 상기 검정곡선에서 참고하여 계산될 수 있다.
D. 항체들 및 라벨들 (예를 들어, 형광성 잔기들 및 염료들)
일부 구체예들에서는, 본 발명은 본 발명의 생체분자들의 아주 민감한 검출 및 정량을 위한 라벨(label)들을 포함하는 방법들 및 조성물들을 제공한다(예를 들어, Eno1 단독으로 또는 혈당 및 혈당 조절에 대한 최소 하나의 다른 지표(예를 들어, 당화혈색소, 케톤)와 결합하거나 또는 직접적인 혈당 측정). 입자들(예를 들어, 표지된 항-Eno1 항체 또는 표지된 이차 항체, 또는 Eno1 mRNA에 특이적으로 결합하는 표지된 올리고핵산염 탐색자)의 혼합물에서 표적 분자들의 검출 및 분별을 하기 위해 표적 분자들을 라벨링(labeling)하는데 많은 전략들이 사용될 수 있다는 것을 당 기술분야의 전문가는 인식할 것이다. 라벨 및 타켓의 비특이적 또는 특이적 상호 작용을 활용하는 방법들을 포함하는 모든 알려진 수단들에 의해 상기 라벨들은 부착될 수 있을 것이다. 라벨들은 검출 가능한 신호를 제공하거나 또는 전계(electric field)에서 입자의 움직임에 영향을 줄 것이다. 추가적으로, 라벨링은 직접적으로 또는 결합 파트너를 통해서 이루어질 수 있다.
일부 구체예들에서는, 상기 라벨은 관심 지표에 결합하는 결합 파트너를 포함하는데, 상기 결합 파트너는 형광성 잔기들에 연결된다. 본 발명의 상기 조성물들 및 방법들은 형광성이 높은 잔기들을 이용할 것이며, 그 예로는, 상기 잔기들의 여기 파장에 해당되는 레이저 방출 빛으로 자극받았을 때 최소 약 200 광자들을 방출할 수 있는 잔기를 예로 들 수 있으며, 여기서 상기 잔기들을 포함하는 적어도 약 5 미크론 직경의 반점에 레이저가 초점되어지며, 그리고 상기 레이저에 의해 상기 반점에서 검출되는 전체 에너지는 약 3 마이크로줄을 넘지 않는다. 본 발명의 상기 조성물들 및 방법들에 대해 적합한 잔기들은 아래에 좀 더 자세히 기술된다.
일부 구체예들에서는, 본 발명은 형광성 잔기들에 연결된 생물학적 분자에 대한 결합 파트너를 포함하는 생물학적 분자를 검출하기 위한 라벨을 제공하는데, 여기서 상기 잔기들의 여기 파장에 레이저 방출 빛으로 자극 받았을 때 형광성 잔기들은 최소 약 200 광자들을 방출할 수 있고, 여기서 상기 잔기들을 포함하는 적어도 약 5 미크론 직경의 반점에 레이저가 초점되어지며, 그리고 상기 레이저에 의해 상기 반점에서 검출되는 전체 에너지는 약 3 마이크로줄을 넘지 않는다. 일부 구체예들에서는, 상기 잔기들은 수많은 형광체들을 포함한다. 예를 들어, 약 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 2 내지 7, 2 내지 8, 2 내지 9, 2 내지 10, 또는 약 3 내지 5, 3 내지 6, 3 내지 7, 3 내지 8, 3 내지 9, 또는 3 내지 10 형광체들. 일부 구체예들에서는, 상기 잔기들은 약 2 내지 4 형광체들을 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 생물학적 분자는 단백질 또는 저분자이다. 일부 구체예들에서는, 상기 생물학적 분자는 단백질이다. 상기 형광체들은 형광성의 염료 분자들일 수 있다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성의 염료 분자들은 최소 하나가 치환된 인돌륨 링(indolium ring) 시스템을 포함하는데, 상기 인돌륨 링의 3-탄소상에 치환기는 화학적으로 반응성의 그룹 또는 접합 물질을 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 염료 분자들은 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680 또는 Alexa Fluor 700로 구성된 그룹으로부터 선별된 Alexa Fluor 분자들이다. 일부 구체예들에서는, 상기 염료 분자들은 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 680 또는 Alexa Fluor 700로 구성된 그룹으로부터 선별된 Alexa Fluor 분자들이다. 일부 구체예들에서는, 상기 염료 분자들은 Alexa Fluor 647 염료 분자들이다. 일부 구체예들에서는, 상기 염료 분자들은 염료 분자들의 첫번째 타입 및 두번째 타입(예를 들어, 두 개의 다른 Alexa Fluor 분자들, 예를 들어, 여기서 첫번째 타입 및 두번째 타입의 염료 분자들은 다른 발광 스펙트럼을 가짐)을 포함한다. 염료 분자의 첫번째 타입의 수 대 두번째 타입의 수의 비율은 예를 들어 4 대 1, 3 대 1, 2 대 1, 1 대 1, 1 대 2, 1 대 3 또는 1 대 4일 수 있다. 상기 결합 파트너는 예들 들어 항체일 수 있다.
일부 구체예들에서는, 본 발명은 본 발명의 생물학적 지표들의 검출을 위한 라벨을 제공하는데, 여기서 상기 라벨은 지표 및 형광성 잔기들에 대한 결합 파트너를 포함하며, 여기서 상기 잔기들의 여기 파장에 레이저 방출 빛으로 자극 받았을 때 형광성 잔기들은 최소 약 200 광자들을 방출할 수 있고 , 여기서 상기 잔기들을 포함하는 적어도 약 5 미크론 직경의 반점에 레이저가 초점되어지며, 그리고 상기 레이저에 의해 상기 반점에서 검출되는 전체 에너지는 약 3 마이크로줄을 넘지 않는다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성 잔기들은 형광성의 분자를 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성 잔기들은 수많은 형광성의 분자들(예를 들어, 약 2 대 10, 2 대 8, 2 대 6, 2 대 4, 3 대 10, 3 대 8, 또는 3 대 6 형광성의 분자들)을 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 라벨은 약 2 대 4 형광성의 분자들을 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성의 염료 분자들은 최소 하나가 치환된 인돌륨 링(indolium ring) 시스템을 포함하는데, 상기 인돌륨 링의 3-탄소상에 치환기는 화학적으로 반응성의 그룹 또는 접합 물질을 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성의 분자들은 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680 또는 Alexa Fluor 700으로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성의 분자들은 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 680 또는 Alexa Fluor 700으로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성의 분자들은 Alexa Fluor 647 분자들이다. 일부 구체예들에서는, 상기 결합 파트너는 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 다른 구체예들에서, 상기 항체는 다클론성의 항체이다.
다양한 구체예들에서, 관심 지표를 검출하기 위한 결합 파트너(예를 들어, Eno1 또는 당화혈색소)는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 용어 "항체"는, 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 폭넓은 용어이고 비자연적으로 생겨난 항체들(예를 들어, 단쇄(single chain) 항체들, 키메릭(chimeric), 양기능(bifunctional) 및 인화(humanized) 항체들, 그리고 이의 항원-결함 단편들을 포함) 뿐만 아니라 자연적으로 생기는 항체들을, 제한 없이, 포함하는 일반적인 의미로 사용된다. 항체의 "항원-결합 단편"는 항원 결합에 참여하는 항체의 부분을 지시한다. 상기 항원 결합 위치는 중쇄(heavy, "H" chain) 및 경쇄(light, "L" chain)의 N-말단 가변 부위(N-terminal variable("V") regions)의 아미노산 잔기들에 의해 형성된다. 항체가 작용하는 항원결정부위 또는 분자의 부분의 선택은(예를 들어, 다양한 형태의 분자들에 대해, 만약 존재한다면, 또는 전부에 대해(예들 들어, 모두, 또는 실질적으로 모든 분자들) 항체의 특이성을 결정한다는 것을 이해할 것이다.
항체들을 생산하는 방법들은 잘 정립되어 있다. 당 기술분야에 능숙한 전문인은 많은 절차들이 항체들 생산을 위해 유용하다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow 및 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), Cold Spring Harbor, N.Y에서 기술한 대로). 당 기술분야에 능숙한 전문인은 항체들을 모방한 결합 단편들 또는 Fab 단편들은 다양한 절차(Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992))들에 의한 유전적 정보로부터 또한 준비될 수 있음을 이해할 것이다. 분자들(예를 들어, 단백질들)에 대한 단일 클론의 및 다클론성의 항체들 및 표지물들은 또한 시판되고 있다(R and D Systems, Minneapolis, Minn.; HyTest, HyTest Ltd., Turku Finland; Abcam Inc., Cambridge, Mass., USA, Life Diagnostics, Inc., West Chester, Pa., USA; Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, Mass. 01742-3049 USA; BiosPacific, Emeryville, Calif.).
일부 구체예들에서는, 상기 항체는 다클론성의 항체이다. 다른 구체예들에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
항체들은 당 기술분야에 일반적인 기술로 알려진 모든 여러 가지 기술들에 의해 준비될 수 있을 것이다 (참조, 예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 일반적으로, 항체들은 세포 배양 기술들(본 명세서에서 기술된 대로 단일 클론 항체들의 발생)에 의해서 생산되거나, 또는 재조합 항체들의 생성을 허용하기 위해, 적합한 박테리아 또는 포유류 숙주세포들로 항체 유전자들의 도입을 통해서 생산될 수 있다.
단일클론 항체들은 Kohler 및 Milstein의 기술(Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976)과 같은 융합세포 방법 및 상기 융합세포 방법의 개량된 방법을 사용하여 만들어질 수 있을 것이다. 상기 방법들은 요구되는 특이성을 가지는 항체들을 생산할 수 있는 무한증식 세포주의 제작과 연관된다. 단일클론 항체들은 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호에서 기술된 방법)들에 의해 또한 만들어질 수 있다. 알려진 방법들에 사용된 항체들을 암호화하는 DNA는 일반적인 절차들이 사용되어 분리되고 그리고 염기서열이 결정될 것이다. 재조합 항체들, 항체 단편들, 및/또는 이의 융합들은 생체외 또는 원핵 세포들(예, 박테리아)에서 또는 진해 세포들(예, 효모, 곤충 또는 포유류 세포들)에서 발현될 수 있고, 그리고 더 나아가 알려진 방법들을 사용하여 필요에 따라 정제되어질 수 있다.
특히 더, 단일클론 항체들(monoclonal antibodies, MAbs)은 잘 알려진 기술들(본 명세서에 참고로 포함된 미국특허 제4,196,265호에서 예시된 기술들)을 통해서 쉽게 만들어질 수 있을 것이다. 일반적으로, 상기 기술은 선택된 면역원 조성물(예를 들어, 정제된 또는 부분적으로 정제된 발현 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드)로 적합한 동물을 면역시키는 것과 연관이 있다. 상기 면역 조성물은 항체를 생산하는 세포들을 자극시키기에 효과적인 방식으로 투입된다. 단일클론 항체들(MAbs)을 생성하는 방법들은 일반적으로 다클론성의 항체들을 만들기 위한 방법들과 동일한 방식으로 시작된다. 생쥐 및 랫과 같은 설치류는 바람직한 동물들이지만, 토끼, 양 또는 개구리 세포들의 사용도 또한 가능하다. 랫의 사용은 어떤 이점들(Goding, 1986, 쪽 60-61)을 제공할 것이지만, 생쥐가 선호되며, 그 중 BALB/c 생쥐가 가장 선호되는데, 그 이유는 가장 일상적으로 사용되고 일반적으로 높은 퍼센트의 안정된 융합을 주기 때문이다.
상기 동물들은 상기 기술된 대로 항원이 주입된다. 상기 항원은 필요시 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 같은 운반체 분자들과 결합되어질 수 있다. 상기 항원은 일반적으로 완전프로인트 또는 불완전프로인트(Freund's complete or incomplete) 항원보강제와 같은 항원보강제(adjuvant)와 혼합될 것이다. 동일한 항원으로 추가접종은 약 2주 간격으로 이루어질 것이다. 면역화 그 다음으로, 항체를 생산할 수 있는 가능성을 가진 체세포들, 특히 B 임파세포들(B 세포들)은 단일클론 항체 생성 프로토콜(protocol)에 적용되기 위해 선택된다. 상기 세포들은 생체 검사한 췌장, 편도선 또는 림프절, 또는 말초 혈액 시료로부터 획득되어질 것이다. 췌장 세포들 및 말초 혈액 세포들은 선호되는데, 전자는 분열하는 혈장아세포 단계에 있는 항체를 생산하는 세포들이 풍부한 원천이기 때문이고, 후자는 말초 혈액은 쉽게 접근되기 때문이다. 흔히, 동물들의 특정 집단은 면역처리될 것이고, 가장 높은 항체 역가를 가지는 동물의 췌장은 제거된 후 주사기로 분쇄되어 췌장 임파세포들이 획득되어질 것이다.
면역처리된 동물들에게서 얻어진 항체를 생산하는 B 임파세포들은 그 다음으로 무한증식의 골수세포들(일반적으로 면역처리되는 동물처럼 동일한 종의 세포)과 융합된다. 융합세포를 생산하는 융합 절차들에 사용되기에 적합한 골수세포주들은 바람직하게는 항체를 생산하지 않고, 높은 융합 효율을 가지고, 그리고 오직 요구되는 융합된 세포(융합세포)의 성장을 유지하는 특정 선택배지에서 세포성장을 가능하게하는 효소 결핍이 있다.
선택된 융합세포는 그 다음으로 연속적으로 희석되고 각각의 항체를 생산하는 세포주들로 복제되고, 그런 다음 상기 복제들은 단일클론 항체(MAb)를 공급하기 위해 무한하게 증식될 것이다. 상기 세포주들은 단일클론 항체 생산을 위해 두 가지 기본 방식으로 이용될 것이다. 융합 세포의 A 시료는 원래의 융합을 위해 체세포들 및 골수세포들을 제공하는데 사용되는 타입의 조직 적합성이 있는 동물로 주입(흔희 복강으로)될 것이다. 상기 주입된 동물에서는 융합된 세포 잡종에 의해 생산되는 특이적인 단일클론 항체를 분비하는 종양이 발전한다. 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액들은 고농도의 단일클론 항체를 얻기 위해 이용될 수 있다. 상기 각각의 세포주들은 또한 생체외에서 배양될 수 있는데, 거기서 단일클론 항체들은 자연스럽게 배양 배지로 분비되고, 이로부터 고농도의 단일클론 항체가 바로 얻어질 수 있다. 어떠한 방법에서든 생산된 단일클론 항체들은 더 나아가 (요구되면) 여과, 원심분리 및 HPLC 또는 친화성크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 분석이 사용되어 정제될 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체들은 생체내에서 융합 세포 세포들을 증대시킴으로서 대량으로 획득되어질 수 있다. 항체를 생산하는 종양의 성장을 유발하기 위해, 세포 복제들은 친세포(parent cell)와 조직 적합성이 있는 포유류(예를 들어, 동계 생쥐)로 주입된다. 선택적으로, 상기 동물들은 주사 전에 탄화수소, 특히 프리스탄(pristane(tetramethylpentadecane))과 같은 오일로 처리하여 준비시킨다.
본 발명과 부합되게, 본 발명의 단일클론 항체의 단편들은 상기 기술된 대로 생산된 단일클론 항체로부터 획득될 수 있는데, 펩신(pepsin) 또는 파파인(papain)과 같은 효소들 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합들의 분쇄에 의한 소화를 포함하는 방법들에 의해서 이루어진다. 또는, 본 발명에 포함되는 단일클론 항체 단편들은 자동화 펩타이드 합성장치를 사용하여 합성될 수 있다.
항체들은 인실리코(in silico)에서 디자인되고 합성적으로 발생된 폴리뉴크레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열들에 기초한 재조합 항체 라이브러리(library)로부터 또한 유도될 수 있다. 인실리코에서 창출되는 서열들의 디자인 및 획득에 관한 방법들은 당 기술분야에 알려 있다(Knappik 외, J. Mol. Biol. 296:254:57-86, 2000; Krebs 외, J. Immunol. Methods 254:67-84, 2001; 미국특허 제6,300,064호).
항원에 결합하는 단편들을 생산하기 위한 항체들의 소화는 당 기술분야에서 잘 알려진 기술들을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질 분해효소 파파인(papain)은 일부 단편들을 얻기 위해 우선적으로 IgG 분자들을 자르는데, 여기서 "F(ab)" 단편들 각각은 손상되지 않은 항원 결합 위치를 포함하는 공유결합 이질이합체를 포함한다. 상기 효소 펩신(pepsin)은 "F(ab')2" 단편을 포함하는 일부 단편들을 얻기 위해서 IgG 분자들을 자를 수 있으며, 여기서 상기 "F(ab')2" 단편은 항원에 결합하는 위치를 포함한다. "Fv" 단편들은 IgM, IgG 또는 IgA 면역 글로불린 분자의 우선적인 단백질 가수분해 분할로 생산될 수 있지만, 그러나 좀 더 일반적으로는 당 기술분야에서 알려진 재조합 기술들을 사용하여 유도된다. 상기 Fv 단편은 비공유결합 VH::VL 이질이합체를 포함하는데, 이는 항원인식 및 천연적 항체 분자의 결합 능력이 많이 보유된 항원 결합 위치를 포함하고 있다(Inbar 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662(1972); Hochman 외, Biochem. 15:2706-2710(1976); 및 Ehrlich 외, Biochem. 19:4091-4096(1980)).
본 명세서에서 기재된 폴리펩타이드 지표들에 특이적으로 결합하는 항체 단편들은 알려진 기술들(미국특허 제5,885,793호에 기술된 바와 같이)을 사용하여 scFvs의 라이브러리로부터 또한 분리될 수 있다.
매우 다양한 발현 시스템들은 항체 단편들(Fab 단편들, scFv, VL 및 VHs 포함)의 생산을 위해 당 기술분야에서 유용하다. 예를 들어, 원핵 및 진핵 근원의 발현 시스템들은 대량의 항체 단편들 생산에 사용될 것이다. 발현 시스템들의 특별한 장점은 대량의 항체 단편들이 배양 배지로 분비된다는 것이다. 항체 단편들 및 항체 융합 단백질들의 대규모 생산을 위한 진핵 발현 시스템들은 포유류 세포들, 곤충들 세포들, 식물들, 형질전환 동물들, 및 하등 진해성 세포들에 기초하여 기술되었다. 예를 들어, 항체 단편들의 효율적 비용으로 대량 생산은 효모 발효 시스템들에서 성취될 수 있다. 상기 유기체들의 대규모 발효는 당 기술분야에서 잘 알려 있고 일부 재조합 단백질들의 대량 생산에 현재 사용되고 있다.
본 발명의 방법들에 포함된 폴리펩타이드 생체지표들에 결합하는 항체들은 당 기술분야에서 숙련된 전문가들에게 잘 알려 있으며 일부 경우에는 구입할 수 있거나 또는 과도한 실험 없이도 얻어질 수 있다.
어떤 다른 구체예들에서는, 특히 mRNA 생체지표들 또는 다른 핵산에 기초한 생체지표들을 검출 또는 부합하기 위해서 올리고핵산염을 결합 파트너로 사용될 경우, 상기 결합 파트너들(예를 들어, 올리고핵산염)은 라벨(예를 들어, 형광성 잔기들 또는 염료)을 포함할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 모든 결합 파트너(예들 들어, 항체)는 형광성 잔기들로 또한 표지될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어로서 "형광성 잔기들"은 하나 이상의 형광체들을 포함하는데, 전체 형광이 본 명세서에 기술된 단일 분자 검출자에서 검출되는 그러한 잔기이다. 그래서, 형광성 잔기들은 단일 독립체(예를 들어, 양자점 또는 형광성의 분자) 또는 많은 수의 독립체들(예를 들어, 수많은 형광성의 분자들)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어로서 "잔기들"이 형광체들의 집단(예를 들어, 수많은 형광성의 염료 분자들)으로 지시될 때, 각각의 개별 독립체들은 분리되어 결합 파트너에 연결되거나 또는 독립체들이 그룹으로 검출할 수 있을 만큼의 충분한 형광을 제공한다면, 독립체들은 함께 연결될 것이다.
일반적으로, 상기 잔기들의 형광은 양자효율 및 (요구되는 검출, 정확도의 제한, 및 분석의 간결함에 대한 지속적인 필요성을 가지면서, 잔기가 단일 분자 검출기에서 백그라운드 수치 이상으로 검출 가능하게 끔 충분한) 광퇴색 결핍의 조합과 관련된다. 예를 들어, 일부 구체예들에서는, 상기 형광성 잔기들의 형광은 본 명세서에서 기술된 측정 계기에서, 약 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.00001, 또는 0.000001 pg/ml미만의 검출 한계에서 그리고 약 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만 또는 그보다 적은(예를 들어, 약 10% 또는 그보다 적게) 변동 계수를 가지면서 분자(예를 들어, 표지물)의 검출 및/또는 양 측정을 허용한다. 일부 구체예들에서는, 상기 형광성 잔기들의 형광은 본 명세서에서 기술된 측정 계기에서, 약 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 pg/ml미만의 검출 한계에서 그리고 약 10%의 변동 계수를 가지면서 분자(예를 들어, 표지물)의 검출 및/또는 양 측정을 허용한다. 본 명세서에 사용된 용어로서, "검출 한계," 또는 LoD는 관심 물질의 분자를 포함한 시료를 확인할 수 있는 최소의 농도(예들 들어, 0이 아닌 첫째 값(the first non-zero value )를 포함한다. 0의 가변성 및 표준 곡선의 경사도에 의해 정의된다. 예를 들어, 검출 한계 분석의 검출 한계는 표준 곡선 운영, 표준 곡선 0 값 결정, 및 상기 값에 대한 2 표준편차 첨가에 의해서 결정될 것이다. 상기 값에 동일한 신호를 생산하는 관심 물질의 농도는 "낮은 검출 한계" 농도이다.
더욱이, 상기 잔기들은 선택된 분석에서 사용과 일치되는 특성을 가진다. 일부 구체예들에서는, 상기 분석은 면역학적 검정법이며, 여기서 상기 형광성 잔기들은 항체에 부착되어진다; 상기 잔기들은 다른 항체들 또는 단백질들과 엉겨붙지 않은 특성을 가져야 하며, 또는 잘 엉겨붙지 않는 실험적 경험은 상기 분석의 정확성 및 간결성과 일치한다. 일부 구체예들에서는, 선호되는 형광성 잔기들은 예들 들어 염료 분자들인데, 상기 염료분자들은 1) 높은 흡수 계수; 2) 높은 양자 수율; 3) 높은 광안정성(낮은 광퇴색); 및 4) 관심 분자(예를 들어, 단백질)의 라벨링과의 양립성과 같은 특징들로 조합되어서, 본 발명의 분석자 및 시스템들을 사용하여 분석되어질 것이다(예를 들어, 관심 단백질의 침전을 유발하지 않거나, 또는 상기 잔기가 연결된 단백질의 침전을 유발하지 않으면서).
모든 적합한 형광성 잔기들은 사용될 것이다. 예로 Alexa Fluor 염료들(Molecular Probes, Eugene, Oreg.)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 상기 Alexa Fluor 염료들은 미국특허들 제6,977,305호; 제6,974,874호; 제6,130,101호; 및 제6,974,305호에 기재되었는데, 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 구체예들은 Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, 및 Alexa Fluor 750로 구성된 그룹으로부터 선택된 염료를 활용한다. 본 발명의 구체예들은 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700 및 Alexa Fluor 750로 구성된 그룹으로부터 선택된 염료를 활용한다. 본 발명의 구체예들은 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, 및 Alexa Fluor 750로 구성된 그룹으로부터 선택된 염료를 활용한다. 본 발명의 구체예들은 Alexa Fluor 647 분자를 활용하는데, 상기 Alexa Fluor 647 분자는 약 650과 660 nm 사이에서 최대 흡수를 보이고 약 660 과 670 nm사이에서 최대 방사를 가진다. 상기 Alexa Fluor 647 염료는 단독으로 사용되거나 또는 Alexa Fluor 염료들과 결합되어 사용된다.
일부 구체예들에서는, 본 발명의 분석 시스템들을 이용하여 시료에서 지표를 검출하기 위해 사용되는 상기 형광표지 잔기들은 양자점(quantum dot)이다. 반도체 나노크리스털 또는 인공 원자로도 알려진, 양자점(Quantum dots, QDs)은 100 에서 1,000 사이의 전자들을 포함하고 10-20 nm의 범위인 반도체 나노크리스털이다. 일부 QDs는 10-20 nm사이의 직경일 수 있다. QDs는 높은 양자 수율을 가지며, 이러한 특징은 광학적 적용에 유용하다. QDs는 여기(excitons) 형성에 의해 형광을 내는 형광단이며, 이는 전통적인 형광단들의 여기 상태와 유사하지만, 200나노초까지 좀 더 긴 수명을 가진다. 상기 특성으로 QDs는 낮은 광퇴색을 가지게 된다. QDs의 에너지 수치는 QDs의 크기 및 모양 변화, 및 QDs의 가능성의 깊이에 의해서 조절될 수 있다. 적게 여기된 QDs 의 하나의 광학적 특징은 천연색이며, 이는 점의 크기에 의해서 결정된다. 상기 점이 커질수록, 좀 더 빨갛거나, 또는 더 빨간 스펙트럼으로 형광발광한다. 상기 점이 작아질수록, 좀 더 파랗거나 좀 더 파란 끝쪽으로 간다. 에너지를 결정하고 이런 이유로 형광 빛의 색깔을 결정하는 밴드갭 에너지(bandgap energy)는 QD의 사각형 사이즈에 반비례한다. 좀 더 가깝게 접해 있는 큰 QDs는 더 많은 에너지를 가져서, QDs가 적은 에너지를 함유한 광자들(즉, 빨강 스펙트럼에 영역에 있는 광자들)을 흡수하게끔 한다. 점의 방출 빈도는 밴드갭에 의존적이기 때문에, 점의 출력 파장을 아주 정밀하게 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서는, 단일 분자 분석 시스템으로 검출된 단백질은 QD로 표지된다. 일부 구체예들에서는, 상기 단일 분자 분석계는 하나의 QD과 다른 파장의 다른 단백질들의 검출을 허용하는 여과장치를 사용하여 표지된 단백질을 검출하는데 사용된다.
E. 혈당의 분리된 고분자 지표들
1. 분리된 폴리펩타이드 지표들
본 발명의 한 양태는 지표 단백질 또는 이의 단편에 대항해 항체 생산을 유발하는 면역원들로 사용되기에 적합한 폴리펩타이드 단편들 뿐만아니라, 분리된 지표 단백질들 및 이의 생활성 부분들에 적용된다. 하나의 구체예에서, 상기 천연적 지표 단백질은 표준 단백질 정제 기술들을 사용하여 적절한 정제 방식에 의해 세포들 또는 조직들로부터 분리될 수 있다. 또 다른 구체예들에서, 전체 또는 지표 단백질의 일부분을 포함하는 단백질 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기술들에 의해 생산된다. 재조합 발현에 대안으로, 상기 단백질 또는 펩타이드는 표준 펩타이드 합성 기술들을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 재조합 단백질들은 수정될 수 있다(예, 당화, 당화혈색소의 검출을 위해 적절한 항원들을 제공하기 위한). 유사하게, 혈색소의 당화되지 않은 단편들은 당화되지 않은 혈색소 단독 또는 전체 혈색소에 결합하는 항체의 생산을 유발하는데 사용될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생활성 부분은 세포 물질들 또는 단백질이 유래되는 세포 및 조직에서부터 나올 수 있는 오염 단백질들이 실질적으로 존재하지 않거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체들이나 다른 화학물질들이 실질적으로 존재하지 않는다. 언어 "세포 물질들이 실질적으로 없는"는 단백질의 준비를 포함하는데, 이때 세포에서 분리되거나 재조합적으로 생산된 단백질은 상기 세포들의 세포내 요소들로부터 분리된다. 그래서, 실질적으로 세포 물질들이 없는 단백질은 이종 단백질(본 명세서에서는 또한 "오염 단백질"로 지시되는)을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 질량으로) 미만으로 가지는 단백질의 준비를 포함한다. 상기 단백질 또는 이의 생활성 부분이 재조합적으로 생산될 경우, 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않는다. 즉, 준비된 단백질 부피에서 약 20%, 10%, 또는 5% 미만으로 배양 배지가 존재한다. 단백질이 화학적 합성으로 생산될 경우, 바람직하게는 화학적 전구체들 또는 다른 화학 물질들이 실질적으로 존재하지 않는다. 즉, 상기 단백질 합성에 관련된 화학적 전구체들 또는 다른 화학 물질들로부터 분리된다. 그래서 상기 준비된 단백질에는 관심 폴리펩타이드 이외에 화학적 전구체들 또는 다른 화학 물질들이 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조 질량으로)미만으로 포함되게 된다.
지표 단백질의 생활성 부분들은 상기 지표 단백질의 아미노산 서열에서 유래되거나 상기 서열과 충분히 동일한 아미노산 서열들을 포함하는 폴리펩타이드들을 포함하는데, 상기 생활성 부분은 전체 길이의 단백질보다 짧은 아미노산들을 포함하고, 전체 길이의 단백질과 상응하는 최소 하나의 활성을 나타낸다. 일반적으로, 생활성 부분들은 전체 길이의 단백질과 상응되는 최소 하나의 활성을 가지는 영역 또는 잔기를 포함한다. 지표 단백질의 생활성 부분은 폴리펩타이드(예를 들어, 10, 25, 50, 100 이상 아미노산 길이)일 수 있다. 더욱이, (표지물 단백질의 다른 부분들이 제거된) 다른 생활성 부분들은 재조합 기술들로 준비되고 상기 지표 단백질의 천연적 형태가 가지는 하나 이상의 기능적 활성들에 대해 평가될 수 있다.
*바람직한 지표 단백질들은 서열 목록에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열들에 의해 암호화된다. 다른 유용한 단백질들은 상기 서열들 중에 하나에 실질적으로 동일(예를 들어, 최소 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)하고 자연 발생의 지표 단백질(자연적 대립유전자 변이 또는 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열에서 얼마간 다름)과 상응하는 기능적 활성을 유지한다.
두 개 아미노산 서열들의 퍼센트 일치성 또는 두 개 핵산들의 퍼센트 일치성을 결정하기 위해, 상기 서열들은 최적의 비교를 위해 정렬된다(예를 들어, 두번째 아미노 또는 핵산 서열과 최적의 정렬을 위해 첫번째 아미노산 또는 핵산 서열의 서열로 간격들이 도입될 수 있음). 그 다음, 상응하는 아미노산 위치들 또는 뉴클레오타이드 위치들에서 상기 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오타이드는 비교된다. 첫번째 서열에서 한 위치가 두번째 서열에서 상응되는 위치로써 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되었을 때, 상기 분자들은 상기 위치에서 동일하다. 바람직하게는, 상기 두 개 서열들 사이의 퍼센트 일치성은 글로벌 정렬을 사용하여 계산된다. 또는, 상기 두 개 서열들 사이의 퍼센트 일치성은 국부적 정렬을 사용하여 계산된다. 상기 두 개 서열들 사이의 퍼센트 일치성은 상기 서열들에 공유되는 동일한 위치들의 수에 대한 함수이다(즉, % 일치성 = 동일한 위치들의 # /전체 위치들의 # (예를 들어, 중복되는 위치들) x100). 하나의 구체예에서, 상기 두 개 서열들은 길이가 동일하다. 또 다른 구체예들에서, 상기 두개 서열들은 길이가 동일하지 않다.
두 개 서열들 간에 퍼센트 일치성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 바람직한 예로, 두 개 서열들의 비교를 위해 활용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 Karlin 및 Altschul의 알고리즘이다( Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서 수정됨). 상기 알고리즘은 'Altschul, 외(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410'의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램에 적용된다. 본 발명의 핵산 분자들에 상응하는 뉴클레오타이드 서열들을 얻기 위해, BLAST 뉴클레오타이드 검색은 상기 BLASTN 프로그램(스코어(score) = 100, 단어길이 = 12)으로 실시될 수 있다. 본 발명의 단백질 분자들에 상응하는 아미노산 서열들을 얻기 위해, BLAST 단백질 검색은 상기 BLASTP 프로그램(스코어= 50, 단어길이 = 3)으로 실시될 수 있다. 비교 목적으로 갭트(gapped) 정렬을 얻기 위해서, Gapped BLAST로 알려진 새로운 버전의 BLAST알고리즘이 'Altschul 외(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402'에서 기술된 대로 활용될 수 있으며, 상기 알고리즘은 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX 프로그램에 대해 갭트 국부적 정렬을 실시할 수 있다. 또는, PSI-Blast는 분자들 사이에 원연 관계(distant relationships)를 검출하는 반복적 검색을 실시하기 위해서 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 활용시, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 매개변수들이 사용될 수 있다. 참조 http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 또 다른 바람직한 예로, 서열들의 비교에 활용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예로 Myers 및 Miller의 알고리즘(Myers and Miller,(1988) CABIOS 4:11-17)이 있다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)으로 포함되어진다. 아미노산 서열들을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 활용할 때, PAM120 무게 잔여 표(PAM120 weight residue table), 12의 갭 길이 패널티(gap length penalty), 및 4의 갭 길이 패널티(gap length penalty)가 사용될 수 있다. 국부적 서열 유사성 및 정렬의 부분 확인을 위한 또 다른 유용한 알고리즘으로 'Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448'에서 기술된 대로 FASTA 알고리즘이 있다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들을 비교하기 위해 상기 FASTA 알고리즘이 사용될 때, 예들 들어 'PAM120 무게 잔여 표'가 2의 k-투플 값(k-tuple value) 로 사용될 수 있다.
두 개 서열들 사이에서 퍼센트 일치성은 상기 기술된 기술들과 유사한 기술들을 사용하여(갭(gap)을 허용하거나 허용하지 않으면서) 결정될 수 있다. 퍼센트 일치성 계산시, 오직 정확한 매치(mathch)만 세어진다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 단백질에 대항하는 항체들에 적용된다. 바람직한 구체예들에서, 상기 항체들은 표지물 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서 호환적으로 사용되는 용어들 "항체" 및 "항체들"은 면역 글로불린 분자의 면역 활성 부위를 포함하는 단편들 및 이의 파생물 뿐만 아니라 면역 글로불린 분자들을 지시한다. 즉, 상기 부분은 표지물 단백질과 같은 항원과 특이적으로 결합하는 항원 결합 위치(예를 들어, 표지물 단백질의 항원결정부위)를 포함한다. 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 단백질에는 결합하지만, 하지만 시료(예를 들어, 자연적으로 단백질을 포함하는 생물학적 시료)의 다른 분자들과는 실질적으로는 결합하지 않는 항체이다. 면역 글로불린 분자의 면역 활성 부위에 대한 예들로 단쇄 항체들(scAb), F(ab) 및 F(ab')2 단편들을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 분리된 단백질 또는 이의 단편은 항체들을 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 전체 길이의 단백질이 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로 본 발명은 면역원들로 사용될 항원 펩타이드 단편들을 제공한다. 본 발명의 단백질의 항원 펩타이드는 본 발명의 단백질들 중 한 단백질의 아미노산 서열의 최소 8(바람직하게는 10, 15, 20, 또는 30 이상)개 아미노산 잔기들을 포함하고, 단백질에서 최소 하나의 항원결정부위를 포함해서 그 결과 펩타이드에 대항해 유래된 항체는 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성하게 된다. 일부 구체예들에서, 상기 단백질은 번역된 후에 수정된다. 항원 펩타이드로 망라되는 바람직한 항원결정부위들은 단백질 표면상에 위치하는 부분들(예를 들어, 친수성 부위들)이다. 소수성 서열 분석, 친수성 서열 분석, 또는 이와 유사한 분석들은 친수성 부위들을 확인하기 위해서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 분리된 표지물 단백질 또는 이의 단편는 면역원으로 사용된다.
본 발명은 다클론성의 및 단일클론 항체들을 제공한다. 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물", 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 특정한 항원결정부위와 면역반응을 할 수 있는 한 종류의 항원 결합 부위만 포함하는 항체 분자들의 집단을 지시한다. 바람직한 다클론성의 및 단일클론 항체 조성물들은 본 발명의 단백질에 대항해서 유래된 항체들에 대해 선별된 항체들이다. 특히 바람직한 다클론성의 및 단일클론 항체 준비는 표지물 단백질 또는 이의 단편에 대항해서 유래된 항체들만 포함시키는 것이다. 다클론성의, 단일 클론의, 및 재조합 항체 및 항체 단편들을 만드는 방법들은 당 기술분야에 잘 알려 있다.
2. 분리된 핵산 지표들
본 발명의 한 양태는 Eno1 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산들을 포함하는 핵산 분자들에 적용된다. 본 발명의 분리된 핵산들은 Eno1 핵산 분자들을 확인하기 위한 부합 탐색자들로 사용되기에 충분한 핵산 분자들를 또한 포함하고, 그리고 이의 단편들(예들 들어, 특이적 생성물의 증폭 또는 표지물 핵산 분자들의 돌연변이에 대한 PCR 프라이머들로 사용되기에 적합한 핵산 분자들의 단편들)을 또한 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체 DNA) 및 RNA 분자들(예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오타이드 유사체들을 사용하여 생성되는 DNA 또는 RNA의 유사체들을 포함한다. 상기 핵산 분자는 외가닥 또는 이중가닥일 수 있는데, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 자연적 원천에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 것이다. 하나의 구체예에서, "분리된" 핵산 분자(바람직하게는 단백질을 암호화하는 서열들)은 핵산이 유래되는 유기체의 유전체 DNA에서 핵산에 자연적으로 측면에 정렬되는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열들)들의 유리이다. 예를 들어, 다양한 구체예들에서, 상기 분리된 핵산 분자는 핵산이 유래되는 세포의 유전체 DNA에서 핵산 분자와 자연적으로 측면에 정렬되는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오타이드 서열들을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, cDNA 분자와 같이 "분리된" 핵산 분자는 다른 세포의 물질이 실질적으로 존재하지 않거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체들이나 다른 화학물질들이 실질적으로 존재하지 않는다. 세포 물질이 실질적으로 없는 핵산 분자는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 이종 핵산("오염 핵산"이라고 본 명세서에서는 또한 지시됨)을 가지는 핵산 분자의 준비(preparations)를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술들을 사용하여 분리될 수 있고 본 명세서에서 기술된 데이타베이스 기록에 서열 정보가 있다. 상기 핵산 서열들의 전부 또는 부분을 사용하여, 본 발명의 핵산 분자들은 표준 부합법 및 클로닝 기술들(예들들어, Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기술되었듯이)을 이용하여 분리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기술들을 따라 틀로써 cDNA, mRNA, 또는 유전체 DNA를 사용하고 적절한 올리고핵산염 프라이머들을 이용하여 증폭될 수 있다. 증폭된 핵산은 적절한 벡터에 삽입되고 DNA 서열 분석에 의해서 특정지어질 수 있다. 더욱이, 본 발명의 핵산 분자의 전부 또는 일부에 상응되는 뉴클레오타이드는 표준 합성 기술들에 의해 만들어질 수 있다(예를 들어, 자동화 DNA 합성장치를 사용하여).
또 다른 바람직한 예로 구체예들에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 표지물 핵산의 뉴클레오타이드 서열 및 Eno1을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 가지는 Eno1 분자를 포함한다. 주어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 핵산 분자는 주어진 뉴클레오타이드 서열에 충분히 상보적이어서 주어진 뉴클레오타이드 서열과 부합화를 이루어 그로 인해 안정된 두가닥을 형성하는 핵산 분자이다.
더욱이, 본 발명의 핵산 분자는 핵산 서열의 단지 일부를 포함할 수 있는데, 여기서 전체 길이의 상기 핵산 서열은 Eno1 핵산을 포함한다. 또는 본 발명의 핵산 분자는 Eno1 단백질을 암호화하는 핵산의 단지 일부를 포함할 수 있다. 이러한 상기 핵산들은 예를 들어 탐색자 또는 프라이머로 사용될 수 있다. 상기 탐색자/프라이머는 일반적으로 하나 이상의 실질적으로 정제된 올리고핵산염으로 사용된다. 상기 올리고핵산염은 일반적으로 최소 약 15, 더 바람직하게는 최소 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400 이상 연이은 Eno1의 뉴클레오타이드와 엄격한 조건들하에서 부합화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다.
Eno1의 서열에 기초한 탐색자들은 Eno1에 상응되는 전사체 또는 게놈 서열들을 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 탐색자들은 이어맞춤접합을 횡단하는 핵산 서열들과 부합화한다. 상기 탐색자는 탐색자에 연결된 라벨 그룹(예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조 인자)을 포함한다. 이러한 상기 탐색자들 Eno1 단백질을 발현하는 또는 비정상적으로 발현하는 세포들, 조직들, 개인들을 확인하기 위한 진단의 검사 키트 또는 시약판의 일부로 사용될 수 있는데, 이것은 피험자 시료에서 Eno1을 암호화하는 핵산의 수치를 측정(예를 들어, mRNA 수치 검출)하거나 또는 Eno1를 암호화하는 유전자 또는 그의 번역 조절 서열들이 돌연변이 또는 삭제되었는지 여부를 결정함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 더 나아가 Eno1 단백질(예를 들어, 서열 목록에 제공된 서열을 가지는 단백질)을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 다른 (유전자 부호의 퇴화로 인한), 그래서 동일한 단백질을 암호화하는, 핵산 분자들을 포함한다.
아미노산 서열에서의 변화를 유발하는 DNA 서열 동질이상들은 집단(예를 들어, 인간 집단)내에 존재할 수 있다는 것은 당 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이해될 것이다. 이러한 유전적 동질이상들은 자연적 대립유전자 변이로 인해 집단내 개인들 사이에 존재할 수 있다. 대립형질은 주어진 유전적 위치에서 대안적으로 발생한 유전자들의 그룹 중에 하나이다. 추가적으로, RNA 발현 수치에 영향을 주는 DNA 동질이상들은 또한 존재해서 상기 유전자의 전반적인 발현 수치에 영향을 줄 수 있다는 것을(예를 들어, 조절 또는 분해에 영향을 주므로써) 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 문구 "대립형질 변이체"는 주어진 위치에 발생하는 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어들 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 지표에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 개방형 해독틀을 포함하는 핵산 분자들을 지시한다. 이러한 상기 자연적 대립유전자 변이들은 주어진 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 일반적으로 1-5%의 변화를 야기한다. 대체 대립형질들은 많은 다른 개인들에서 관심 유전자를 염기서열결정함으로써 확인될 수 있다. 상기 절차는 다양한 개인들에서 같은 유전자 위치를 확인하기 위한 부합 탐색자들을 이용함으로써 쉽게 수행될 수 있다. 자연적 대립유전자 변이의 결과이고 기능적 활성을 바꾸지 않는 모든 상기 뉴클레오타이드 변이들 그리고 그에 결과인 아미노산 동질이상들 또는 변이들은 본 발명의 범주내에 있다.
또 다른 구체예들에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 최소 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 이상 뉴클레오타이드 길이이고 엄격한 조건들하에서 Eno1 핵산 또는 Eno1을 암호화하는 핵산에 부합(hybridize)된다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 용어 " 엄격한 조건들하에서 부합된다"는 일반적으로 최소 60%(65%, 70%, 바람직하게는 75%)로 서로 동일한 뉴클레오타이드 서열들이 서로 부합된 상태로 유지되는 부합 및 세척 조건을 기술하기 위한 것이다. 이러한 엄격한 조건들은 당 기술분야에서 숙련된 것들로 알려 있고 'Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989)'의 6.3.1-6.3.6 부분에서 찾을 수 있다. 하나의 바람직한 예로, 엄격한 부합 조건들의 비제한적인 예로서 6X 염화나트륩/구연산나트륨(sodium chloride/sodium citrate, SSC)에서 약 45℃ 온도로 부합, 그 다음으로 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 50-65℃ 온도로 한번 이상의 세척.
F. 지표 적용들
*본 발명은 피험자에서 혈당 상승(예를 들어, 당뇨병전증, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병)을 진단하기 위한 방법들을 제공한다. 본 발명 더 나가서 진단 또는 진행 감시 또는 혈당 상승을 가진 피험자의 치료적 처리에 대한 반응성 감시를 위한 방법들을 제공한다.
한 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 획득될 수 있는 진단적 정보를 구성하는데, 상기 방법은 혈당의 최소 한가지 다른 지표(예를 들어, 혈당(예를 들어, 공급 혈당, 공복 혈당), 글루코스 내성, 케톤 수치 및 당화혈색소 수치)와 함께 Eno1의 수치를 분석, 검출, 및/또는 측정하는 것과 연관된다.
예를 들어, 폴리펩타이드 지표의 검출 및/또는 측정을 위해 본 발명의 방법들이 실행될 때, 본 명세서에서 기술된 대로, 상기 방법의 사용으로 생물학적 시료는 검출 시약과 접촉하게 되는데, 상기 검출 시약의 예로서 단일클론 항체를 들 수 있는데, 상기 항체는 관심 지표에 선택적으로 결합하여, 단백질-단백질 복합체를 형성하며, 상기 복합체는 더 나아가 직접적(항체가 라벨을 포함하면) 또는 간접적(라벨이 부착된 이차 검출 시약(예를 들어, 이차 항체)이 사용되면)으로 검출된다. 그래서, 본 발명의 방법은 본 발명의 폴리펩타이드 지표들을 검출 가능한 일차 항체 또는 일차 및 이차 항체를 포함하는 단백질-단백질 복합체로 변환시킨다. 이러한 상기 단백질-단백질 복합체를 형성시키는 것은 관심 생체지표의 존재를 확인하기 위해서 요구되고 본 발명의 방법들을 시행한 결과로써 관심 지표의 물리적 성격 및 특성을 필연적으로 변화시킨다.
Eno1 핵산들을 검출하기 위해서 본 발명의 방법들을 수행할 때 동일한 원리가 적용된다. 특히, 증폭 방법들이 Eno1 mRNA를 검출하기 위해서 사용될 때, 증폭 과정은, 사실상, 앰플리콘(amplicon) (즉, 새롭게 생성되고 원래의 생물학적 시료에는 존재하지 않는, 그로 인해 생물학적 시료를 물리적으로 변형시키는)의 새로운 집단의 형성을 초래한다. 유사하게, 부합 탐색자들이 Eno1 검출에 사용될 때, 분자들의 물리적 새로운 종들은 표적 생체지표 mRNA(또는 다른 핵산)에 탐색자들(선택적으로 라벨을 포함)를 부합함으로써 사실상 생성될 수 있고, 그 다음 검출된다. 이러한 상기 폴 리뉴크레오티드 생성물들은 효과적으로 새롭게 만들어지거나 또는 본 발명의 방법을 수행의 결과로써 형성된다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 혈당 상승(예를 들어, 당뇨병전증, 당뇨병(예를 들어, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병))을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법들은 혈당 상승의 발생 또는 재발을 진단하기 위해 숙련된 의사에 의해 사용되는 모든 다른 방법 및/또는 혈당 상승에 대해 치료받고 있는 피험자의 치료 중재에 대한 반응과 병행하여 실행될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 진단의 방법 및 예후의 방법들은 추가적인 및/또는 더 복잡한 또는 번거로운 검사들 또는 감시(예를 들어, 글루코스 부하검사, 연속적 글루코스 감시)가 피험자에게 실시되어야 하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 당뇨병전증 또는 당뇨병과 같이 복잡한 질병은 단일 검사를 사용해서 거의 진단하기 어렵다고 이해된다. 그러므로, 본 명세서에서 제공되는 진단의, 예후의, 및 감시 방법들은 일반적으로 당 기술분야에 알려진 다른 방법들과 병행하여 사용된다. 예를 들어, 본 발명서에서 제공되는 Eno1의 수치를 검출하는 방법들은 당화혈색소 수치 검출, 공복 또는 공급 조건하에서 혈당 검출, 또는 글루코스 부하검사와 병행하여 실시될 것이다.
치료 양생법(예를 들어, 약물 치료, 행동 수정, 수술, 또는 피험자에서 혈당 상승을 치료하기 위해 유용한 모든 다른 치료 접근)의 효능을 측정하는 방법들은 또한 제공된다. 상기 방법들로 시료들에서 Eno1 양이 평가되는데, 여기서 시료들로는 치료 양생법전 또는 이전 시점에서 피험자로부터 얻은 첫번째 시료 및 늦은 시점(예를 들어, 피험자가 치료 양생법의 최소 일부를 진행한 늦은 시점)에서 피험자로부터 얻은 두번째 시료가 있다. 본 발명의 방법은 표지물 수치 평가를 위해 정규적 또는 비정규적 간격들에서 두 개 이상의 시료들(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 이상 시료들)을 획득 및 분석하는 것을 포함한다. 쌍대 비교들은 연이은 또는 연잇지 않은 피험자 시료들 사이에서 만들어질 수 있다. 표지물 수치의 경향성 및 표지물 수치의 변화 속도는 두 개 이상 연이은 또는 그렇지 않은 피험자 시료들 모두에 대해서 분석될 수 있다. Eno1 발현 정도의 측정은 혈당의 감시 및 검출을 위한 다른 방법들와 함께 실시될 수 있다.
본 발명의 방법은 Eno1 발현 또는 활성의 조절에 의해 혈당 조절을 할 수 있는 화합물을 선별하는데 또한 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 세포, 바람직하게는 변화된 인슐린 감수성 또는 변화된 글루코스 섭치를 가지는 세포는 검사 화합물과 접촉하게 되고, 세포에서 Eno1의 발현 및/또는 활성을 조절하는 검사 화합물의 능력이 결정되어, 그로 인해 Eno1 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 (바람직하게는 Eno1 발현 또는 활성을 증가시키는, 그래서 세포에서 글루코스 섭취를 증가시키는) 화합물을 선별하게 된다.
본 명세서에서 기술되는 방법들을 사용하여, 여러 가지의 분자들은 (조절하는 분자들을 확인하기 위해서 탐색될 것임) 바람직하게는 Eno1의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 그렇게 확인된 화합물들은 글루코스 섭취 증가, 인슐린 감수성 증가, 및/또는 인슐린 저항성 감소 중에 하나 이상에 의해 혈당을 정상화시키기 위해서 피험자에게 제공될 수 있으며, 그로 인해 혈당 상승(예를 들어, 당뇨병전증 또는 당뇨병, 예를 들어, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병)이 치료될 수 있다.
본 발명은 예측 의학 분야에 적용되며, 상기 예측 의학에서는 예방을 목적으로 개인을 치료하기 위해 진단 분석, 예후의 분석, 게놈약학, 및 임상적 시도의 감시가 예후의 목적으로 사용된다. 그래서, 개인이 질병 또는 장애(당뇨병전증 또는 당뇨병(제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병 포함)과 같은, 국한되지는 않고, 혈당 상승과 연관된)가 발달될 위험성이 있는지를 결정하기 위해서, 본 발명의 하나의 양태는 Eno1 단백질 또는 핵산의 발현 수치를 결정하기 위한 진단 분석과 연관된다. 이러한 상기 분석들은 예후의 목적 또는 예상의 목적으로 사용되어 그로 인해 장애가 시작되기 전에 예방을 위해 개인 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 임상적 시도들에서 Eno1의 발현 또는 활성에 대한 물질들(예를 들어, 약제 또는 다른 치료 화합물들) 또는 행동학적 및/또는 식이적 개질의 영향을 감시하는데 적용된다. 상기 및 다른 적용들은 아래 부분에서 더 자세히 기술된다.
1. 진단 분석들
생물학적 시료에서 지표 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재 또는 변화를 검출하기 위한 예시적인 방법은 검사받는 피험자의 생물학적 시료(예, 혈액 또는 혈청)를 획득하는 것과 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들어, mRNA 또는 cDNA)를 검출할 수 있는 화합물 또는 물질로 생물학적 시료를 접촉하는 것과 관련된다. 그래서, 본 발명의 검출 방법은 mRNA, cDNA, 또는 단백질(번역 후 수정된 단백질들 포함)을 생체내 뿐만 아니라 생체외 생물학적 시료에서 검출하는데 사용될 수 있다.
생물학적 시료에서 지표 단백질 또는 핵산의 존재, 부재, 정도의 변화를 검출하기 위한 본 명세서에서 제공되는 방법들은 검출될 표지물 단백질 또는 핵산을 포함 또는 포함하지 않은 피험자로부터 생물학적 시료를 획득하는 것, 검출될 지표 단백질 또는 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 지표 특이적인 결합 물질(즉, 하나 이상의 표지물 특이적 결합 물질들)과 시료의 접촉, 및 만약 형성된다면, 지표와 지표 특이적인 결합 물질의 복합체를 검출하기 위한 검출 시약과 시료와의 접촉을 포함한다. 생물학적 시료에서 지표의 정도를 검출하기 위한 본 명세서에서 제공한 방법들은 상기 분석을 실시하는 단계들을 포함한다. 검출 방법들의 일부 구체예들에서, 시료에서 지표 단백질 또는 핵산의 정도는 없거나 검출할 수 있는 역치 이하이다.
상기 방법들은 지표 및 지표 특이적 결합 물질 간에 일시적 또는 안정적 복합체의 형성을 포함한다. 상기 방법들은 복합체가, 만약 형성된다면, 충분한 시간동안 형성되어 검출 시약이 복합체에 결합하고 검출 가능한 신호(예를 들어, 형광신호, 효소 반응의 산물로부터 나오는 신호(예를 들어, 과산화효소 반응, 인산가수분해효소 반응, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 반응, 또는 중합효소 반응))를 생산할 수 있기를 요구한다.
일부 구체예들에서, 모든 지표들은 동일한 방법을 사용하여 검출된다. 일부 구체예들에서, 모든 지표들은 동일한 생물학적 시료(예를 들어, 동일한 체액)를 사용하여 검출된다. 일부 구체예들에서, 다른 지표들은 다른 방법들을 사용하여 검출된다. 일부 구체예들에서, 지표들은 다른 생물학적 시료들(예를 들어, 혈액 및 혈청)에서 검출된다.
2. 단백질 검출
본 발명의 일부 구체예들에서, 검출되는 지표는 단백질이다. 일부 구체예들에서, 검출되는 지표는 번역후 수정된 단백질이다. 단백질들은 많은 분석들을 사용하여 검출되는데, 상기 분석에서는 검출될 지표 단백질과 지표 특이적인 결합 물질 사이의 복합체는 자연적으로 발생되지 않을 것이다. 예들 들어, 상기 요소들 중에 하나는 자연적으로 발생된 화합물이 아니거나 또는 검출에 대한 지표 및 지표 특이적인 결함 물질은 동일한 유기체로부터 얻어진 것이 아니기 때문이다(예를 들어, 생쥐, 쥐, 또는 염소 유래의 지표 특이적인 결합 항체를 사용한 인간 지표 단백질들의 검출). 본 발명의 바람직한 구체예로, 검출을 위한 지표 단백질은 인간 지표 단백질이다. 어떤 검출 분석들에서, 검출을 위한 인간 지표은 지표 특이적인, 인간이 아닌 동물의 항체들에 결합되므로, 상기 복합체는 자연적으로 형성되지 않을 것이다. 상기 지표 단백질의 복합체는 직접적으로 검출될 수 있는데, 예들 들어, 지표에 직접적으로 결합하는 지표 특이적 항체의 사용에 의해, 또는 지표와 지표 특이적 항체의 복합체에 또 다른 요소를 결함함으로써 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 또 다른 요소는 첫번째 지표 특이적 항체처럼 동일한 시간에 지표에 결합할 수 있는 두번째 지표 특이적 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 또 다른 요소는 지표 특이적 항체에 결합하는 이차 항체이며, 여기서 이차 항체는 바람직하게는 탐지 가능한 라벨(예를 들어, 형광표지, 효소의 라벨, 바이오틴)에 연결된다. 이차 항체가 효소의 탐지 가능한 라벨(예를 들어,과산화효소, 인산가수분해효소, 베타-갈락토시다제)에 연결될 때, 이차 항체는 적절한 기질과 효소의 탐지 가능한 라벨이 접촉하여 비색적, 형광성의, 또는 다른 검출가능한 생성물, 바람직하게는 정량적으로 검출가능한 생성물을 발산함으로써 검출된다. 본 발명의 방법에서 사용을 위한 항체들은 다클론성일 수 있지만, 하지만, 바람직한 예로, 단일클론 항체들이 사용된다. 원래의 항체, 또는 단편 또는 이의 유도체(예를 들어, Fab 또는 F(ab')2)는 본 발명에서 사용될 수 있다. 지표 단백질 검출의 이러한 전략은 사용된다. 예를 들어, ELISA, RIA, 웨스턴 블럿, 및 면역형광 분석 방법들에서 사용된다.
어떤 검출 분석들에서, 검출을 위해 생물학적 시료에 존재하는 지표는 효소(예를 들어, Eno1)이고, 검출 시약은 효소 기질(예를 들어, 2-포스포글리세르산(2-phosphoglycerate, 2-PG) 또는 인에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP), 또는 검출가능한 생성물을 생산하는 화합물들의 유사체)이다. 바람직한 구체예들에서, 검출될 지표 효소와 복합체를 이루는 기질은 인간에서 효소 기질이 아니다.
일부 구체예들에서, 상기 지표와 지표 특이적 결합 물질과의 복합체는 지표의 검출을 위해서 고체 지지체에 부착된다. 상기 복합체는 기질 상에서 형성될 수 있거나 또는 기질 상에 잡히기 전에 형성될 수 있다. 예를 들어, ELISA, RIA, 면역침전 분석, 웨스턴 블럿, 면역형광 분석, 겔 효소 분석에서, 검출을 위한 지표는 직접적 또는 간접적으로 고체 지지체에 부착된다. ELISA, RIA, 또는 면역형광 분석에서, 상기 지표는 일반적으로 항체 또는 결합 단백질을 통해서 고체 지지체에 간접적으로 부착된다. 웨스턴블롯 또는 면역형광 분석에서, 상기 지표는 일반적으로 고체 지지체에 직접적으로 부착된다. 겔 효소 분석들에 대해서는, 상기 지표는 겔(일반적으로 아크릴아마이드 겔)에 녹여지는데, 여기서 효소에 대한 기질이 통합되어 있다.
3. 핵산 검출
본 발명의 일부 구체예들에서, 상기 지표는 핵산(예를 들어, Eno1 핵산)이다. 핵산들은 많은 분석들을 사용하여 검출되는데, 검출될 지표 핵산과 지표 특이적 탐색자 사이의 복합체는 자연적으로 일어나지 않을 것이다. 예들 들어, 요소들 중 하나는 자연적으로 발생되는 화합물이 아니기 때문이다. 일부 구체예들에서, 상기 분석물은 핵산을 포함하고 상기 탐색자는 하나 이상의 단일 가닥 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자, DNA-RNA 혼성, PNA, 또는 하나 이상의 인공적 염기들, 당들, 또는 백본(backbone) 잔기들을 포함하는 수정된 핵산 분자)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 핵산은 형광 표지를 포함한 단일 가닥의 DNA분자이다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 핵산은 약 12에서 약 50개의 뉴클레오타이드 길이를 가지는 단일 가닥의 올리고핵산염 분자이다. 일부 구체예들에서, 검출될 상기 핵산은 mRNA이고 형성된 복합체는 mRNA에 상보적인 단일 가닥 DNA와 부합한 mRNA이다. 일부 구체예들에서, RNA는 프라이머로 RNA에 부합하는 단일 가닥 DNA를 사용하여 RNA틀로부터 (예를 들어, poly-A RNA를 전사하기 위한 일반적인 poly-T 프라이머) 첫번째 DNA분자(즉, cDNA 분자)를 생성함으로써 검출된다. 상기 cDNA는 표지물 특이적인 탐색자를 이용하여 증폭 반응(예를 들어, PCR, 프라이머 신장 분석)에 대한 틀로써 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 표지된 단일 가닥 DNA는 형광 인시츄 부합(fluorescence in situ hybridization, FISH)로 RNA 검출을 위해 또는 노던블랏(northern blot)으로 RNA 검출을 위해 시료에 있는 RNA에 부합될 수 있다.
예를 들어, mRNA의 검출을 위한 생체외 기술들은 노던 부합(northern hybridization), 인시츄 부합(in situ hybridization), 및 rtPCR을 포함한다. 유전체 DNA의 검출을 위한 생체외 기술들은 서던 부합(Southern hybridization)을 포함한다. mRNA의 검출을 위한 기술들은 PCR, 노던 부합, 및 인시츄 부합을 포함한다. 방법들은 질적인 방법과 양적인 방법 모두를 포함한다.
진단의, 예후의, 및 감시 분석들의 일반적 원리는 검출될 핵산 및 탐색자를 포함할 시료 또는 반응 혼합물을 준비하는 것과 관련되는데, 여기서 지표 핵산과 탐색자가 상호작용하고 결합할 수 있게 허용하는, 그래서 반응 혼합물에서 제거 및/또는 검출될 수 있는 복합체를 형성할 수 있게끔 적절한 조건들 및 충분한 시간이 주어져야 한다. 상기 분석들은 당 기술분야에서 알려진 여러 가지의 방식(예를 들어, PCR, FISH, 노던 블럿)으로 실행되어질 수 있다.
4. 발현 정도의 검출
Eno1 발현 정도는 절대적 발현 정도 또는 정규화된 또는 상대적 발현 정도에 기초하여 검출될 수 있다. 절대적 Eno1 발현 정도의 검출은 피험자의 치료를 감시할 때 또는 피험자에게서 혈당 수치 또는 혈당 조절의 변화 여부를 결정할 때 바람직할 것이다. 예를 들어, Eno1 발현 정도는 비정상적인 혈당에 대해 치료를 진행중인 피험자에서 측정될 수 있다(예를 들어, 정규 간격, 매월 간격으로). Eno1 발현 정도의 조절은 Eno1 발현 정도의 변화 추세를 시간 경과에 따라 관찰하기 위해서 감시될 수 있다. 피험자에서 Eno1 발현 정도는 정상 시료에서 Eno1 발현 정도 보다 높을 것이나, 그러나 이전 발현 수치보다 높을 것인데, 그러므로 피험자에 대한 치료 양생법의 이점을 지시한다. 유사하게, Eno1 발현 정도의 변화 속도는 치료 중재보다 행동 또는 식이 개질 치료를 받고 있는 피험자에게 중요할 수 있다. 각각의 피험자에서 Eno1 발현 정도에서 변화 (또는 변화 없음) 집단에서 존재하는 Eno1 발현 정도보다 피험자에 대해 치료 결정을 하는데 더 유의할 것이다. 정상적인 혈당을 가지는 것으로 보여지는 피험자에서, 상기 표지물이 집단에 대해 정상 범위내에 들지라도, Eno1 발현 정도에서 빠른 변화는 비정상적인 혈당을 나타내는 것이거나 또는 비정상적인 혈당에 연관된 상태가 발전되려는 성향일 것이다. Eno1 발현 정도는 하나 이상의 추가적인 혈당 상승의 지표들(예를 들어, 당화혈색소, 혈당 증가(공급 또는 공복 혈당 증가중에 하나 이상, 또는 글루코스 부하검사에서 글루코스 제거의 감소된 속도를 포함))과 병행하여 측정될 수 있다.
절대적 Eno1의 발현 수치에 기초하여 결정을 내리는 방안으로, 결정은 정규화된 Eno1의 발현 수치에 기초할 것이다. 발현 수치는 지표가 아닌(예들 들어, 계속적으로 발현되는 항존유전자(housekeeping gene)) 유전자의 발현에 지표의 절대적 발현 수치를 비교함으로써 정규화된다. 표준화에 대해 적합한 유전자들은 엑틴(actin) 유전자와 같은 항존유전자를 포함하고 혈액 또는 혈청에서 표준화에 대해 적합한 단백질들은 알부민(albumin)을 포함한다. 상기 표준화는 하나의 시료(예들 들어 정상 혈당을 가지는 피험자에서의 시료)에서 상기 발현을 또 다른 시료(예들 들어, 비정상적인 혈당을 가질 것으로 의심되는 피험자에서의 시료)와 비교하거나, 또는 다른 원천에서부터의 시료들 사이에서 상기 발현을 비교하는 것을 허용한다.
또는, 상기 발현 수치는 적절한 대조(예를 들어, 집단 대조, 이전 시점 대조 등)와 비교하여 상대적 발현 수치로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 기준치 결정에 사용된 상기 시료들은 정상 혈당의 피험자들로부터 얻어진 시료일 것이다. 세포 원천의 선택은 상대적 발현 수치의 사용에 의존적이다. 추가적으로, 데이타가 더 축적이 되면, 평균 발현 수치는 수정될 수 있고, 이로 인해 축적된 데이타를 기초로한 향상된 상대적 발현 수치를 제공할 것이다.
5. 임상 시험들의 감시
혈당 지표의 수치에 대한 물질들(예를 들어, 약물 화합물들)의 영향을 감시하는 것은 기초 약물 탐색 또는 단일 피험자의 치료 감시뿐만 아니라 임상 시험들에 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, Eno1 발현에 미치는 영향에 대한 한 물질의 효능은 혈당 상승에 대해 치료를 받고 있는 피험자들의 임상 시험들에서 측정될 수 있다. 바람직한 구체예로, 본 발명은 물질(예를 들어, 작용제, 대항제, 펩타이드 모사체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 저분자, 또는 다른 약제 후보)로 피험자 치료의 효율을 감시하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다. (i) 상기 물질의 투여전 피험자로부터의 전-투여 시료를 획득하는 것;(ii) 전-투여 시료에서 지표 Eno1의 발현 수치 및 선택적으로는 하나 이상의 혈당의 지표들(예를 들어, 혈당, 케톤, 또는 당화혈색소)을 검출하는 것;(iii) 피험자에서 하나 이상의 후-투여 시료들을 획득하는 것;(iv) 후-투여 시료들에서 상기 지표들의 발현 수치를 검출하는 것;(v) 후-투여 시료 또는 시료들에서 지표들의 수치와 전-투여 시료에서 지표들의 수치를 비교하는 것; 및(vi) 그에 맞춰 피험자에게 물질 투여를 변화시키는 것. 예를 들어, 치료 과정 동안 감소된 Eno1 발현 및 다른 지표들의 표준화의 결핍은 비효과적인 용량 및 용량 증가의 바람직함을 지시할 것이다. 반대로, 증가된 Eno1 발현 및 다른 지표들의 표준화는 효과적인 치료 및 용량을 바꿀 필요가 없다는 것을 지시할 것이다.
VI. 손상된 혈당 수치, 손상된 혈당 수치 조절, 및 당뇨병의 치료
본 명세서에서 증명된 것처럼, Eno1 단백질의 투여는 글루코스 섭취 및 반응을 향상시켜, 혈당 수치 및 혈당 수치 조절을 정상화시킨다. 본 발명은 상기 상태들의 최소 하나의 징후 또는 증상을 개선시키기 위해 피험자에게 Eno1을 투여함으로써, 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 인슐린 기능저하, 및 당뇨병(예를 들어, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 당뇨병전증, 및 임신성 당뇨병)으로부터 고통받는 피험자들을 치료하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, Eno1(바람직하게는 Eno1의 제1형 전사 변이체)은 피험자에게 투여될 수 있는데, 이때 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 인슐린 기능저하, 또는 당뇨병의 치료를 위해 최소 하나의 추가적인 물질이 피험자에게 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 것처럼, 상기 물질들은 순서에 맞추어 연속적으로 투여되거나 또는 동시에 투여될 수 있다. 피험자에게 다양한 물질들의 투여는 물질들 또는 동일한 투여 요법의 동시 제제를 요구하지 않는다.
Eno1을 사용한 내당능 장애, 혈당 증가, 인슐린 저항성, 인슐린 기능저하, 또는 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 치료 방법은 당뇨병 치료의 알려진 방법들 및 물질들과 결합되어질 수 있다. 많은 물질들 및 요법들은 당뇨병 치료에 대해 현재 유용하다. 치료들 위해 선택된 특이적인 물질은 피험자, 질병 상태의 특이적 증상들 및 중증도에 의존한다. 예를 들어, 어떤 구체예들에서, Eno1은 식이적 및/또는 행동적 수정(예를 들어, caloric restriction)과 함께 단독으로 또는 비만 수술과 결합하여 및/또는 증가된 물리적 활성과 결합하여 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, Eno1은 제2형 당뇨병의 치료를 위한 물질들과 투여될 수 있으며, 상기 물질들은 다음과 같다: 메트포르민(metformin)(Glucophage, Glumetza, others), 글리타존(glitazones)(예를 들어, 피오글리타존(pioglitazone)(Actos)), 글리피지드(glipizide)(Glucotrol), 글리부라이드(glyburide)(Diabeta, Glynase), 글리메피라이드(glimepiride)(Amaryl), 아카보스(acarbose)(Precose), 메트포르민(metformin)(Glucophage), 시타글립틴(Sitagliptin)(Januvia), 삭사그립틴(Saxagliptin)(Onglyza), 레피글니드(Repaglinide)(Prandin), 나테글리니드(Nateglinide)(Starlix), 엑세나타이드(Exenatide)(Byetta), 리라글루타이드(Liraglutide)(Victoza), 또는 인슐린. 인슐린들은 일반적으로 오직 말기 단계의 제2형 당뇨병 치료에 사용되고 빠르게 작용하는 인슐린(인슐린 아스파르트(insulin aspart)(NovoLog), 인슐린 글루리신(insulin glulisine)(Apidra), 및 인슐린 리스프로(insulin lispro)(Humalog)); 짧게 작용하는 인슐린(인슐린 레귤러(insulin regular)(Humulin R, Novolin R)); 중간 작용하는 인슐린(인슐린 NPH 인간(insulin NPH human)(Humulin N, Novolin N)), 및 지속성 인슐린(인슐린 글라진(insulin glargine)(Lantus) 및 인슐린 디터밀(insulin detemir)(Levemir))을 포함한다. 당뇨병 치료는 약제의 사용 및 수술로 촉진될 수 있는 체중감량 및 운동을 포함하는 행동 수정도 또한 포함할 수 있다. 혈당 상승 및 당뇨병의 치료는 결합될 수 있다. 예를 들어, 약물 치료는 행동 수정 치료법과 결합될 수 있다. 제1형 당뇨병의 치료에 사용되는 인슐린들은 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 인슐린들은 일반적으로 오직 말기 단계의 제2형 당뇨병 치료에 사용되고 빠르게 작용하는 인슐린(인슐린 아스파르트(insulin aspart)(NovoLog), 인슐린 글루리신(insulin glulisine)(Apidra), 및 인슐린 리스프로(insulin lispro)(Humalog)); 짧게 작용하는 인슐린(인슐린 레귤러(insulin regular)(Humulin R, Novolin R)); 중간 작용하는 인슐린(인슐린 NPH 인간(insulin NPH human)(Humulin N, Novolin N)), 및 지속성 인슐린(인슐린 글라진(insulin glargine)(Lantus) 및 인슐린 디터밀(insulin detemir)(Levemir))을 포함한다.
따라서, 일부 양태들에서, 본 발명은 피험자의 상승된 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:(a) 상승된 혈당을 가질 것으로 예상되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, (b) Eno1 수치에 대한 진단 정보를 수득하기 위하여 상기 생물학적 시료를 제출하는 단계, 및 (c) 상기 시료의 Eno1 수치가 한계치보다 높을 경우 상기 피험자에게 치료적으로 효과적인 용량의 항-당뇨병 치료제를 투여하는 단계.
일부 양태에서, 본 발명은 피험자의 상승된 혈당을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 상기 환자 유래의 생물학적 시료의 Eno1 수치에 관한 진단 정보를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 시료의 Eno1 수치가 한계치보다 높을 경우 상기 피험자에게 치료적으로 효과적인 용량의 항-당뇨병 치료제를 투여하는 단계.
일부 양태에서, 본 발명 피험자의 상승된 혈당을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법들은 다음 단계들을 포함한다: (a) Eno1 수치와 관련된 진단 정보를 확인하는데 사용하기 위하여 상승된 혈당을 가질 것으로 예상되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, (b) 상기 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 탐지하는 단계, 및 (c) 상기시료의 Eno1 수치가 한계치보다 낮을 경우, 상기 피험자에게 혈당저하치료를 제공할 것을 의료인에게 추천하는 단계.
상기에 기술된 방법들은 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들의 수치에 대한 진단 정보를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서는, 상기 방법은 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들의 수치에 대한 진단 정보를 수득하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들의 수치를 측정하는 단계를 더 포함한다. 상기 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 지표들은 HbA1c 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 언급한 방법의 일부 구체에들에서, 상기 단계(c)는 상기 시료 내의 Eno1 수치가 한계치보다 낮고 상승된 혈당의 상기 추가적인 지표 중 적어도 하나가 검출될 경우, 상기 피험자에게 치료적으로 효과적인 용량의 글루코스 저하 치료를 제공하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 단계(c)는 상기 시료 내의 Eno1 수치가 한계치보다 낮고 상승된 혈달의 상기 추가적인 지표의 적어도 하나가 탐지될 경우, 상기 피험자에게 글루코스 저하 치료를 제공할 것을 의료인에게 추천하는 단계를 더 포함한다.
상기에 기술된 방법들 중 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 면역학적 검정법 또는 ELISA에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 수치는 (i) 상기 생물학적 시료를 Eno1과 선택적으로 결합하는 시약과 접촉하는 단계, 및 (ii) 상기 생체지표 복합체를 검출하는 단계에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, Eno1와 선택적으로 결합하여 생체지표 복합체를 형성하는 상기 시약은 Eno1의 적어도 하나의 항원결정부위와 선택적으로 결합하는 항-Eno1 항체이다.
상기 기술된 방법들 중 일부 구체예들에서, Eno1 수치는 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA의 양을 측정함으로써 검출된다. Eno1 mRNA 양은, 예를 들어, 증폭 반응에 의해 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서는, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이다.
일부 구체예들에서는, 혼성화 분석은 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 검출하는데 사용된다. 일부 구체예들에서는, Eno1 mRNA의 일부에 상보적인 올리고핵산염은 상기 Eno1 mRNA 검출을 위한 혼성화 분석에 사용된다.
VI. 당뇨병 및 인슐린 저항성의 동물 모델들
제1형 및 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증과 같은 신진대사장애의 다수의 유전적 및 유도된 동물 모델들은 당 기술분야에 잘 특성화되어 있다. 상기 동물들은 인슐린 저항성 및 당뇨병의 치료에 Eno1의 효과를 증명하는데 사용될 수 있다. 제1형 당뇨병 모델들은 NOD 생쥐 및 쥐 및 생쥐에서 스트렙토조토신(streptozotocin) 유발 당뇨병(제1형 당뇨병의 모델들)을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 제2형 당뇨병의 유전적 및 유발 모델들은 렙틴(leptin) 결손 ob/ob 생쥐, 렙틴 수용체 결손 db/db 생쥐, 및 고지방이 공급된 생쥐 또는 쥐 모델들을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 각각의 모델들에서, 특이적 질병 특징들의 발병에 대한 시각표는 잘 알려있다. 상기 동물 모델들에서 당뇨병 및/또는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료에 Eno1의 효능을 증명하기 위해서, 당뇨병 또는 인슐린 저항성의 증상들이 나타나기 전 또는 후에 Eno1이 투여될 수 있다.
선택된 특이적 동물 모델 및 중재의 시간에 의존해서, 예를 들어, 당뇨병 또는 인슐린 저항성의 증상들이 나타나기 전 또는 후에, 상기 동물 모델들은 당뇨병 및/또는 인슐린 저항성의 예방, 치료, 진단, 및 감시를 위해 본 명세서에 제공된 방법들의 효능을 증명하기 위해서 사용될 수 있다.
VII. 약물 탐색
Eno1의 투여는 유발 당뇨병을 가진 동물들에서 혈당 정상화를 유발하는데, 이는 Eno1의 발현을 증가시키는 화합물들 또는 독립체들을 검출하기 위한 탐색을 통해서 새로운 치료제들을 확인하는데 있어 Eno1이 매력적인 타겟임을 보여준다. 그래서, 본 발명은 혈당 및 당뇨병을 조절하는데 잠재적으로 유용한 화합물들의 확인에 대한 방법들을 제공한다. 특히, 본 발명은 Eno1을 조절하는데 잠재적으로 유용한 화합물들의 확인에 대한 방법들을 제공하는데, 여기서 상기 화합물들은 혈당 및 당뇨병을 조절한다.
상기 분석들은 Eno1과 하나 이상의 분석 요소들(예를 들어, 검사 화합물들) 사이에 반응을 포함한다. 상기 다른 요소들은 검사 화합물 그 자체이거나, 또는 검사 화합물들 및 Eno1의 자연적 결합 파트너의 조합일 수 있다. 본 명세서에서 기술된 것들처럼 분석들을 통해 확인된 화합물들은 유용할 것이다(예를 들어, 조절하는데, 예를 들어, 질병을 저해하는 것, 개선하는 것, 치료하는 것, 또는 예방하는 것). Eno1 발현 정도를 조절하는데 대해 확인된 화합물들은 비정상적인 혈당 및/또는 당뇨병의 치료에 유용한 활성(예를 들어, 공급 및/또는 공복 글루코스 정상화, 글루코스 부하검사에서 글루코스 제거 및/또는 인슐린 수치 정상화, 당화혈색소 수치 정상화)에 대해 바람직하게는 더 검사를 받는다.
본 발명의 탐색 분석에 사용된 검사 화합물들은 천연 및/또는 합성 화합물들의 체계적인 라이브러리를 포함하는 이용 가능한 원천으로부터 얻어질 것이다. 검사 화합물들은 당 기술분야에서 알려진 조합적인 라이브러리 방법에서 수 많은 접근법들에 의해 얻어질 수 있을 것이며, 상기 방법으로는 다음을 포함한다. 생물학적 라이브러리; 펩토이드(peptoid) 라이브러리(펩타이드들의 기능을 가지는 분자들의 라이브러리, 하지만 새롭고, 비펩타이드 백본을 가져서 효소적 분해에 저항성을 보이지만 하지만 그럼에도 생활성을 가지는 분자들; 참고, 예를 들어, Zuckermann 외, 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); 공간적으로 다룰 수 있는 평행한 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘벌루우션을 요구하는 합성적 라이브러리 방법들; '원-비드 원-컴파운드' 라이브러리('one-bead one-compound' library) 방법; 및 친화성크로마토그래피 선별을 이용한 합성적 라이브러리 방법들. 상기 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 접근법들은 펩타이드 라이브러리에 제한적이고, 반면 상기 다른 네가지 접근법들은 펩타이드, 비펩타이드 올리고머 또는 화합물들의 저분자 라이브러리에 적용할 수 있다(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
분자 라이브러리의 합성에 대한 방법들에 대한 예들은 당 기술분야에서 찾을 수 있다. 예를 들어: DeWitt 외(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb 외(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann 외(1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho 외(1993) Science 261:1303; Carrell 외(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell 외(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 in Gallop 외(1994) J. Med. Chem. 37:1233.
화합물들의 라이브러리는 용액에(예를 들어, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), 또는 비드(bead) 상에(Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩(chip)상에(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 및/또는 포자에, (Ladner, USP 5,223,409), 프라스미드(lasmids)에(Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파지(phage)에 (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.) 존재할 수 있을 것이다.
본 발명의 검출 방법은 검사 화합물과 세포(예들 들어, 질병에 걸린 세포, 특히 비정상적인 인슐린 반응 및/또는 글루코스 섭취를 가지는 세포)의 접촉을 포함하고 세포에서 Eno1의 발현 및/또는 활성을 조절하는데 검사 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다. Eno1의 발현 및/또는 활성은, 선택적으로 혈당 수치의 검출 방법과 결합하여, 본 명세서에서 기술된 것처럼, 당 기술분야에서 알려진 모든 방법들을 사용하여 결정될 수 있다.
또 다른 구체예들에서, 본 발명은 Eno1 또는 이의 생활성 부분들의 기질인 검사 화합물들 또는 후보물질들을 탐색하는 데 대한 분석들을 제공한다. 또 다른 구체예들에서, 본 발명은 Eno1 또는 이의 생활성 부분들에 결합하는 검사 화합물들 또는 후보물질들을 탐색하는 데 대한 분석들을 제공한다. Eno1에 직접적으로 결합하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예들 들어, 당 기술분야에 알려진 모든 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 발명은 더 나아가 상기 기술된 탐색 분석들에 의해 확인된 새로운 물질들에 적용된다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 대로 확인된 물질을 적절한 동물 모델에 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, Eno1의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 물질은 상기 물질로의 치료에서 효능, 독성, 또는 부작용들을 결정하는데 동물 모델에서 사용될 수 있다. 또는 본 명세서에서 기술된 대로 확인된 물질은 상기 물질의 작용 메카니즘을 결정하기 위해서 동물 모델에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 상기 기술된 대로 치료를 위해 상기 기술된 탐색 분석법에 의해 확인된 새로운 물질들의 사용에 적용된다.
일부 구체예들에서, 상기 탐색 방법들은 다수-홈 분석 시약판(multi-well assay plate)의 많은 수의 홈들(wells)에 포함된 세포들을 사용하여 수행된다. 상기 분석 시약판들은 시판된다. 예를 들어, Stratagene Corp.(La Jolla, Calif.) 및 Corning Inc.(Acton, Mass.)부터 시판되고 예를 들어, 48-홈, 96-홈, 384-홈 및 1536-홈 시약판들을 포함한다.
결과들의 재현성은 동일한 후보 화합물의 동일한 농도로 한번 이상 분석을 함으로써 검사될 수 있을 것이다(예를 들어, 분석 시약판의 한개 이상의 홈에 세포들을 배양함으로써). 추가적으로, 후보 화합물들은 화합물들의 특성 및 화합물들의 작용 메카니즘의 특성에 의존해서 변화되는 농도에서 효과적일 것이기 때문에, 후보 화합물의 변화되는 농도는 검사될 것이다. 일반적으로, 1 fM 에서 약 10 mM까지 후보 화합물 농도는 탐색에 사용된다. 바람직한 탐색 농도는 일반적으로 약 10 pM 과 약 100 μM 사이에 있다.
본 발명의 탐색 방법은 "히츠(hits)" 또는 "리드즈(leads)"(요구되지만 최적화되지 않은 생활성을 가지는 화합물)을 제공할 것이다. 임상적 유용성을 위해 요구되는 모든 물리화학적, 약동학, 및 독소 요소들을 충족시키기 위해서 상기 화합물들을 대상으로 수행되는 리드 최적화는 향상된 후보 약물들을 제공할 것이다. 본 발명은 향상된 후보 약물들을 포함하고 혈당 및 인슐린 반응을 조절하는 치료제로써 상기 후보 약물들의 사용을 또한 포함한다.
VIII. 키트들 (KITS)/ 시약판들
본 발명은 질병 또는 장애, 장애의 재발, 또는 장애(예를 들어, 비정상적인 혈당 및/또는 당뇨병)에 대해 치료받고 있는 피험자의 생존을 진단, 예후, 또는 감시하는데 대한 조성물들 및 키트들을 또한 제공한다. 상기 키트들은 다음 중 하나 이상을 포함한다: Eno1에 특이적으로 결합하는 검출 가능한 항체, 염색할 피험자 조직 시료들 준비 및/또는 획득하는데 대한 물질들, 및 사용에 대한 지시들.
본 발명은 생물학적 시료에서 Eno1 단백질 또는 핵산의 존재들 검출하는 키트들을 또한 포함한다. 상기 키트들은 피험자가 비정상적인 혈당 및/또는 당뇨병의 발달로부터 고생하고 있는지 또는 증가된 위험에 있는지 여부를 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 상기 키트는 생물학적 시료에서 Eno1 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 물질 및 시료에서 상기 단백질 또는 mRNA의 양을 결정하는 수단들(예를 들어, 단백질 또는 이의 단편에 결합한는 항체, 또는 상기 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고핵산염 탐색자)을 포함한다. 키트들은 본 명세서에서 제공된 모든 방법들을 실행하는 데 대한 키트의 사용에 대한 지시들을 또한 포함하거나 또는 본 명세서에서 제공된 가르침에 기초한 키트 사용으로 획득된 결과들을 해석하는 것을 또한 포함한다. 상기 키트들은 비정상적인 혈당과 관련 없는 시료에서 대조 단백질(예를 들어, 시료에 존재하는 Eno1의 양의 표준화를 위한 조직 시료들에서의 엑틴(actin), 혈액 또는 혈액 유래 시료들에서의 알부민(albumin))의 검출에 필요한 시약들도 포함할 수 있다. 상기 키트는 대조로 사용을 위한 검출에 대한 정제된 표지자를 또한 포함하거나 또는 상기 키트로 실시된 분석의 양 측정을 위한 정제된 표지자를 또한 포함한다.
키트들은 피험자에서 비정상적인 혈당을 (또는 발달하는 비정상적인 혈당 및/또는 당뇨병의 성향을 보이는 피험자을 확인하기 위한) 진단하는 방법에서 사용을 위한 물질들의 시약판을 포함하는데, 상기 시약판은 Eno1 발현 정도의 검출을 위한 물질 및 혈당의 또 다른 지표(예를 들어, 당화혈색소)의 검출을 위한 물질을 포함하는 최소 두개의 검출 시약들을 포함하고 있다.
항체에 기초한 키트들 경우, 상기 키트는 다음의 예들을 포함한다:(1) Eno1에 결합하는 일차 항체(예를 들어, 고체 지지체에 부착된); 및, 선택적으로,(2) Eno1 또는 일차 항체에 결합하는 이차, 다른 항체 및 탐지 가능한 라벨에 접합된 이차, 다른 항체. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 다음을 포함한다: (1) 두번째 표지물 단백질에 결합하는 이차 항체(예를 들어, 고체 지지체에 부착된); 및, 선택적으로,(2) 당화혈색소 또는 혈색소(전체 또는 비수정 혈색소) 또는 이차 항체에 결합하는이차, 다른 항체 및 탐지 가능한 라벨에 접합된 이차, 다른 항체. 일차 및 이차 표지물 단백질들은 다르다.
올리고핵산염에 기초한 키트들 경우, 상기 키트는 다음의 예들을 포함한다:(1) 올리고핵산염, 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 올리고핵산염으로 Eno1을 암호화하는 핵산 서열과 부합함, 또는(2) Eno1 핵산 분자를 증폭하는데 유용한 프라이머들의 쌍. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 정량적인 PCR 방법들을 사용해 검출을 하기 위한 각각의 핵산 표지물에 대해 특이적인 세번째 프라이머를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 직접 또는 간접적(예를 들어, 당화혈색소 수치을 이용)으로 피험자에서 혈당을 측정하는 지시들을 더 포함한다.
크로마토그래피 방법들 경우, 상기 키트는 크로마토그래피에 의해 혈당의 하나 이상의 지표들(예를 들어, Eno1 및 당화혈색소)의 검출 및 확인을 허용하는 표지물(표지된 표지물 포함)을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 크로마토그래피 방법들에 대한 키트들은 하나 이상의 혈당 지표들의 유도화를 위한 화합물들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 크로마토그래피 방법들에 대한 키트들은 상기 방법의 지표들을 분해하는 칼럼(column)들을 포함한다.
Eno1의 검출에 대해 특이적인 물질들은 복합체 혼합물(예를 들어, 혈청, 혈액)에서 표지물의 검출 및 양 측정을 허용한다. 일부 구체예들에서, 상기 물질들은 종 특이적이다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 물질들은 종 특이적이지 않다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 물질들은 동형 특이적이다. 일부 구체예들에서, 상기 Eno1 물질들은 동형 특이적이지 않다. 일부 구체예들에서, 상기 물질들은 전체 Eno1을 검출한다.
일부 구체예들에서, 진단, 감시, 또는 혈당 상승 및/또는 당뇨병의 특성화를 위한 키트들은 Eno1의 발현 수치의 검출에 대해 특이적인 최소 하나의 물질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트들은 직접적으로 또는 간접적으로, 또는 둘다로, 시료에서 혈당 수치를 검출하는 지시들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 당화혈색소의 수치 검출을 위한 최소 하나의 물질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 키트들은 예를 들어, 완충 물질, 보존제, 단백질 안정화 물질, 반응 완충액들을 포함한다. 상기 키트는 탐지 가능한 라벨(예를 들어, 효소 또는 기질)을 검출하는데 필요한 요소들을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 대조 시료 또는 검사 시료에 비교 및 분석될 수 있는 대조 시료들의 연속을 또한 포함할 수 있다. 상기 대조들은 지표들의 알려진 수치를 가지면서, 적절하게, 정제된 단백질들 또는 핵산들의 대조 혈청 시료들 또는 대조 시료들일 수 있다. 상기 키트의 각각의 요소는 각각의 용기 내에 포함될 수 있고 모든 다양한 용기들은 키트 사용으로 실시된 분석들의 결과들을 해석하는 지시들과 함께, 단일 포장내에 있을 수 있다.
본 발명의 키트들은 본 발명의 방법들을 실행하는 데 대한 유용한 추가적인 요소들을 선택적으로 포함할 것이다.
예를 들어, 일부 양태에서, 본 발명은 생물학적 시료의 Eno1 탐지용 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 생물학적 시료 내 Eno1 수치를 측정하기 위한 적어도 하나의 시약 및 Eno1 수치 측정을 위한 한 세트의 사용 설명서를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시약은 항-Eno1 항체이다. 일부 구체예들에서는, 상기 키트는 상기 항-Eno1 항체 검출용 수단을 포함한다. 일부 구체예들에서는, 상기 항-Eno1 항체 검출용 수단은 탐지 가능한 이차항체이다. 일부 구체예들에서는, 상기 Eno1 수치 측정용 시약은 Eno1 mRNA에 상보적인 올리고핵산염이다.
상기 언급한 키트들의 일부 구체예들에서, 상기 사용설명서는 상기 생물학적 시료 내 Eno1 수치 검출을 위한 면역학적 검정법 또는 ELISA를 설명한다. 일부 구체예들에서는, 상기 사용설명서는 상기 생물학적 시료 내 Eno1 mRNA 수치 분석을 위한 증폭반응을 설명한다. 일부 구체예들에서는, 상기 증폭 반응은 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 검출하는데 사용된다. 일부 구체예들에서는, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)이다.
상기 언급한 키트들의 일부 구체예들에서는, 상기 지시들은 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA의 양을 검출하는 부합 분석을 제시한다. 일부 구체예들에서는, 상기 키트는 Eno1 mRNA의 부분에 상보적인 최소 하나의 올리고핵산염을 포함한다.
본 발명은 피험자 시료 및 최소 하나의 대조 물질에서 하나 이상의 혈당 지표들의 검출을 위한 물질들의 시약판들을 더 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 대조 물질은 생물학적 시료에서 지표를 검출 및 선택적으로는 생물학적 시료에 존재하는 지표의 양을 정량화하기 위한 것인데, 여기서 시약판은 양성 대조로 사용될 지표를 포함한 대조 시료와 함께 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 시약판은 양성 또는 음성 대조 각각을 제공하기 위해 생물학적 시료에 존재 또는 부재한 것으로 알려진 비정상적인 혈당에 관계없는 단백질 또는 핵산에 대한 검출 시약을 포함한다. 상기 시약판은 비정상적인 혈당과 관계 없는 시료에서 대조 단백질(예를 들어, 시료에 존재하는 지표의 양의 표준화를 위한 혈액 또는 혈액 유래 시료들에서의 알부민)의 검출을 위한 물질들과 함께 제공될 수 있다. 상기 시약판은 대조로 사용을 위해 검출을 위해 또는 시약판으로 실시된 분석의 정량화를 위해 정제된 지표(예를 들어, Eno1)와 함께 제공될 수 있다.
바람직한 구체예로, 상기 시약판은 Eno1의 검출을 위한 물질들을 (바람직하게는 대조 물질과 함께) 포함한다. 시약판에서, Eno1에 특이적인 물질에 의해 Eno1이 검출된다. 일부 구체예들에서, 상기 시약판은 당화혈색소의 검출을 위한 물질을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시약판은 생물학적 시료들 및 대조 시료들의 다양한 희석들(예를 들어, 계열 희석)의 분석을 허용하는 복제 홈들, 반점들, 또는 부분들을 포함한다. 바람직한 구체예로, 상기 시약판은 혈당의 하나 이상의 지표들의 정량적인 검출을 허용한다.
일부 구체예들에서, 상기 시약판은 하나 이상의 표지물들의 검출을 위한 단백질 칩(chip)이다. 일부 구체예들에서, 상기 시약판은 하나 이상의 표지물들의 검출을 위한 ELISA 시약판이다. 일부 구체예들에서, 상기 시약판은 하나 이상의 표지물들의 검출을 위한 정량적 PCR을 위한 시약판이다.
일부 구체예들에서, 검출 시약들의 시약판은 본 발명의 하나 이상의 표지물들에 대한 검출 시약 및 최소 하나의 대조 시료를 포함하는 단일 장치상에 제공된다. 일부 구체예들에서, 검출 시약들의 시약판은 본 발명의 두 개 이상 표지물들에 대한 검출 시약 및 최소 하나의 대조 시료를 포함하는 단일 장치상에 제공된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 다른 표지물들의 검출을 위한 다수의 시약판들은 시약판들 간의 결과들의 비교를 용이하게 하기 위해 최소 하나의 균일한 대조 시료와 함께 제공된다.
일부 구체예들에서, 시약판들 및 키트들은 피험자에서 혈당 측정에 대한 지시들 또는 조언을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키트 또는 시약판은 혈당의 측정을 위한 하나 이상의 물질들 또는 장치들과 함께 제공된다.
본 발명은 당뇨병(예를 들어, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 당뇨병전증, 인슐린 저항성, 글루코스 불내성, 비정상적인 혈당, 및 혈당 조절 소실)에서 최소 하나를 치료하기 위한 키트들을 또한 제공한다. 상기 키트들은 Eno1 및 사용을 위한 하나 이상의 지시들 및 적절하게, 투여를 위한 장치를 포함한다.
본 발명은 제한적으로 해석되지 말아야 할 다음의 예들에 의해 더 설명된다. 본 출원서에서 인용된 모든 참고들 및 특허공개공보들 및 특허출원공보들의 내용들은 본 발명에서 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1 - 당뇨병의 병인학에서 활성의 중요한 접속점으로서 에놀라아제 1(Eno1)을 동정하기 위하여 플랫폼 기술을 사용함
본 실시예에서, 주문 제작된 당뇨병 모델로부터 확보된 데이터를 통합하고 당뇨병 발생, 구체적으로 제2형 당뇨병을 유도하는 일치성 신규한 단백질들/경로를 규명하기 위하여 국제특허출원공보 제PCT/US2012/027615호에 상세히 설명되는 플렛폼 기술을 사용하였다. 이러한 분석에 의한 관계 맵(relational maps)은 당뇨병 병인학에서 활성의 중요한 접속점으로서 Eno1을 동정하였다. 그러므로, Eno1은 당뇨병과 관련된 진단/예후의 표지물뿐만 아니라 중요한 당뇨병 치료 타겟이다.
실시예 2 -근육대롱세포에서 Eno1에 의한 글루코스 섭취 조절
Eno1은 시판되는 발현 벡터를 사용하여 6X HIS 단백질 꼬리부와 재조합되어 E. coli에서 발현되었다. 상기 재조합된 Eno1을 당 기술분야에서 알려진 친화성크로마토그래피(affinity chromatography) 방법들을 사용하여 정제하였다. 바람직하게는, 본 발명에서 제공되는 방법들로 상기 단백질을 사용하기 위하여 상기 6X HIS 꼬리부을 절단하였다.
인간 골격근 근육모세포(human skeletal muscle myoblasts, HSMM)는 PromoCell에서 제공받았으며 제조사에 의해 추천되는 성장배지에서 배양하였다. HSMM 근육모세포(20,000 세포들/웰)를 실험 전 7일 동안 96 웰 배양접시에서 2% 말혈청를 사용하여 분화시켰다. 세포들을 인간 Eno1(500 μg/ml)으로 처리하였다. 세포들을 0.1% BSA 를 함유하는 200μl의 MBSS modified balanced salt 용액 완충액으로 2 회 세척한 후, 0.1% BSA를 함유하는 100 μl의 MBSS을 사용하여 4 시간 동안 혈청 결핍시켰다. 인슐린 자극 개시 시, MBSS 0.1% BSA 완충액에 있는 2x 시약100 μl 를 100 μl의 무혈청 배지에 첨가하여 실험을 위한 1x 농도로 제조하였다. 상기 2x 시약의 조성은 다음과 같다: 인슐린(0, 20 nM, 및 200 nM); 형광성의 글루코스 유사체 2-NBDG(500 μM). 세포들을 인슐린 및 형광성의 데옥시-글루코스 유사체2-NBDG로 30 분간 처리한 후, MBSS 완충액으로 2회 세척한 후, 50 μl MBSS 완충액을 웰들로 투여하였다. 글루코스 섭취는 세포과 없는 웰들을 사용하는 배경 검출과 함께 형광측정에 의해 검출하였다. 형광측정 판독 후에, 고정액(포르말린, 50 ul)을 웰에 담긴 50 μl MBSS에 첨가한 후, 100 μl의 1μM DAPI를 100 μl의 포르말린 및 MBSS 혼합물에 첨가하였다.
도 1a 및 1b에 도시된 것처럼, Eno1에 의한 근육대롱세포 치료는 인슐린 존재 및 부재 두 가지 경우 모두에서 글루코스 섭취를 상당히 향상시켰다(p = 0.025 Eno1처리되지 않은 인슐린 비의존적 글루코스 섭취 vs. Eno1 처리됨). 이러한 결과들은 인슐린 의존적 및 인슐린 비의존적 글루코스 섭취 모두에서 Eno1의 역할을 보여준다. Eno1 에 의해 유도된 인슐린 의존적 글루코스 섭취는 Eno1이 인슐린에 민감한 피험자의 적어도 골격근에서의 인슐린 신호 경로와 복잡하게 연관되어있음을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 인슐린 비의존적 글루코스 섭취에서 Eno1의 역할을 보여준다. 이러한 관찰결과는 인슐린 저항성을 겪고 있고 인슐린과잉혈증 또한 가지고 있는 제1형 및 제2형 당뇨병 피험자를 치료하는데 중요하고, 결과로서 인슐린 작용이 감쇠되고 이런 이유로 인슐린 비의존적으로 된다. 이러한 결과들은 Eno1이 더 이상 정상적인 인슐린 신호를 가지고 있지 않은 피험자들에서도 글루코스 섭취를 자극하는데 유용하다.
Eno1 흡수를 측정하기 위하여, 인간 골격근 근육대롱세포를 상기 기술된 정제된 Eno1 단백질로 48 시간 동안 처리하였다. 이 후, 세포들의 Eno1 수치를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 도 2a 및 2b에 도시된 것처럼, 500 μg/ml의 Eno1 또는 1000 μg/ml의 Eno1으로 처리된 세포들에서의 Eno1 수치는 미처리된 세포들에 비하여 상당히 높았다 1000 μg/ml의 Eno1으로 처리된 세포들에서의 Eno1 수치 또한 500 μg/ml의 Eno1으로 처리된 세포들에서 보다 높았다. 이러한 결과들은 Eno1이 투여량에 의존적인 방식으로 인간 골격근 근육대롱세포 내로 전달되었음을 나타낸다.
글루코스 섭취에서 Eno1 효소 활성의 역할을 확인하기 위하여, 정제된 Eno1을 88℃에서 90 초 동안 가열 불활화하고, 천연적(native) Eno1과 가열 불활화된 Eno1에서의 활성 수치를 비교하였다. Eno1의 활성은 Abcam(Cambridge, MA; Cat. No. ab117994)에서 생산된 Eno1 인간 활성 분석 키트를 사용하여 비색적 분석에 의해 확인하였다. 도 3a에 도시된 것처럼, 가열 불활화는 Eno1 효소 활성을 크게 감소시켰으나, 일부 잔기의 활성은 잔여하였다.
글루코스 섭취에 대한 천연적 Eno1 과 가열 불활화된 Eno1의 효과는 상기 기술된 방법들에 따라서 인간 골격근 근육대롱세포에서 비교하였다. 도 3b에 도시된 것처럼, 천역적(활성인) Eno1으로 처리된 근육대롱세포는 Eno1으로 처리되지 않은 근육대롱세포 에 비하여 상당히 높은 글루코스 섭취를 나타내었다. 가열 불활화된 Eno1로 처리된 근육대롱세포는 활성인 Eno1로 처리된 근육대롱세포와 비교하여 상당히 낮은 글루코스 섭취를 나타내었다. 이러한 결과들은 글루코스 섭취에 대한 Eno1의 효과가 Eno1 효소 활성에 의존적임을 나타낸다. Eno1을 함유하고 있지 않은 대조군과 비교하여 상기 가열 불활화된 Eno1 에서 관찰된 글루코스 섭취의 향상은 상기 가열 불활화된 효소의 Eno1 잔기 활성에 의한 것일 수 있다.
실시예 3 -식이성 비만(diet induced obesity, DIO ) 생쥐 모델들
두 종류의 실질적으로 동일한 식이성 비만 동물 모델들이 본 발명에서 제공되는 방법들에 따라 사용되었다.
제1 방법에서, 수컷 C57BL/6J 생쥐는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 제공받았으며, 처음에 12:12시간의 낮-밤 주기로 22℃에서 각 우리당 4 내지 5 마리씩 사육하였다. 6 주령이 시작될 때, 생쥐에게 고지방 식이(Research Diets Cat #: D12492; 60 kcal% 지방, 20 kcal% 단백질, 및 20 kcal% 탄수화물)를 제공하였다. 또한, 마른 대조군 생쥐를 확보하고 표준 식이를 제공하였다. 실험 전, DIO 생쥐의 몸무게는 마른 대조군 생쥐보다 상당히 많았다. 하나의 연구로, DIO 생쥐의 몸무게는 38.4 ± 0.6 g인 반면, 마른 생쥐의 몸무게는 29.9 ± 0.5 g이었다(p < 0.05).
제2 방법에서, 식이 유도된 비만 수컷 C57BL/6J 생쥐(12 주령) 및 대조군 마른 생쥐(12 주령)을 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 제공받았고, 처음에 12:12시간의 낮-밤 주기로 22℃ 에서 각 우리당 4 내지 5 마리씩 사육하였다. 생쥐들은 실험 전 일주일 동안 동물 시설에서 적응시켰고, DIO 그룹에 대한 고지방 식이 (Research Diets Cat #: D12492; 60 kcal% 지방, 20 kcal% 단백질, 및 20 kcal% 탄수화물) 또는 마른 그룹에 대한 저지방 식이(10% kcal% 지방)를 유지하였다.
실시예 4 -식이성 비만(diet induced obesity, DIO ) 생쥐에서 Eno1에 의한 글루코스 불내성 치료
상기 실험 프로토콜은 7 주 동안 고지방 식이를 유지한 후에 생쥐(n = 그룹당 10 마리)가 비만하게 되었을 때 시작하였다. 삼투 미니펌프들(Model 1004, Alzet, Cupertino, CA)을 제조사의 설명에 따라 0.1 ml의 Eno1 펩타이드 또는 부형제(인산완충식염수(PBS), pH 7.0)로 채웠다. 상기 펌프들을 멸균된 식염수로 4℃에서 하룻밤 동안 프라임(prime)하였다. 생쥐들을 아이소플루레인(isoflurane)(100% 산소에서 1 내지 3%)으로 마취하고, 수술 전에 70% 이소프로판올(isopropanol) 및 베타디엔(betadine) 용액으로 세척하였다. 견갑골 가운데 부분의 피하를 작게 절개하고, 이로 상기 펌프를 삽입하고, 상처를 봉합하였다. 동물들은 원래의 사육우리로 가기 전에 회복시켰다. 피하 삼투 미니펌프들의 이식에 의해, 펩타이드는 4 주 동안 0.11 μl/시간의 속도로 일정하게 주입되었다. 4 주 마다 펌프교환 수술을 수행하였다. 상기 펌프 주입 속도에 의해 계산된 정제된 Eno1 처치 양은 10 mg/체중 kg이었다.
글루코스 부하검사는(GTT) 일반적인 방법들을 사용하여 6 시간의 공복 후에 수행하였다. 요약하면, 처음의 공복 혈당 수치를 확인한 후, 1.5 g/체중 kg의 투여량으로 20% 덱스트로스 용액을 복강 내(ip) 주입하였다. 혈당 수치는 ACCU-CHEK® Advantage glucometer(ROCHE® Diagnostics, Indianapolis, IN)를 사용하여 글루코스 주입 후 15, 30, 60, 90, 및 120 분에 꼬리 동맥으로부터 측정하였다. GTT 동안 곡선하위면적(area under the curve, AUC)은 Graphpad Prism® 소프트웨어로 계산하였고, 상이한 처리 그룹 간의 유의성을 확인하고자 Student t-test 를 실시하다. 결과는 도 4a 및 4b에 도시하였다.
용이하게 관찰될 수 있듯이, Eno1으로 처리된 생쥐들은, 미처리된 생쥐들과 비교하여, 곡선 아래 혈당 영역에서 유의적인 감소를 보인다(p = 0.017). 이러한 데이타는, 글루코스 부하검사에서 확인된 것처럼, Eno1 단백질에 의한 비만 생쥐 처치는 글루코스 내성을 향상시킴을 나타내고, Eno1은 인슐린 저항성, 글루코스 불내성, 및 제2형 당뇨병 치료에 효과적임을 나타낸다.
실시예 5 -PAMAM 덴드리머 생산, 근육으로 적중된 Eno1
근육대롱세포에서 글루코스 섭취를 향상시키고 전신 투여 시 글루코스 내성을 향상시키는 데 있어서 Eno1의 효능을 설명하기 위하여, 근육으로 적중되는 Eno1을 제조하였다. 하기에서 설명되는 방법들을 사용하여 근육 표적화 펩타이드(MTP) ASSLNIA 및/ 또는 Eno1을 함유하는 검출 가능하게 표지된 G5-PAMAM 덴드리머들을 생산하였다. 덴드리머에 대한 상이한 비율의 MTP를 평가하였다. 구체적으로, 덴드리머 당 약 10 MTP 펩타이드들이 포함되거나, 덴드리머 당 약 3 MTP 펩타이드들이 포함되거나, 덴드리머 당 약 1 MTP 펩타이드들이 포함되었다.
Eno1 덴드리머 복합체를 제조하는 공정은 시약들의 최적의 비율 및 농도들을 동정하는 것을 포함한다. Eno1 모액은 완충액에서 제조하였고, 단백질 용액은 상이한 비율로 G5 덴드리머-근육 표적화 펩타이드(MTP) 컨쥬게이트와 혼합하였다. Eno1에 대한 덴드리머의 상이한 비율의 범위를 평가하였다. 구체적으로, Eno1 단백질 분자 당 약 하나의 덴드리머가 함유되거나, Eno1 단백질 분자 당 약 5 개의 덴드리머가 함유된다.
Eno1-덴드리머-SMTP 복합체의 안정성을 상이한 온도에서 평가하고, 안정성을 시판되는 Eno1 분석 제품을 사용하여 Eno1의 활성을 측정함으로써 3 내지 4 개월의 기간 동안 확인하였다. 선택된 접합체들 또한 생물 물리학적 기술들을 사용하여 평가하였고, 상기 생물 물리학적 기술들은 덴드리머-펩타이드 컨쥬게이트 및 Eno1간의 복합체 형성을 확인하기 위한 Dynamic Light Scattering(DLS) 및 UV-Vis 분광학을 포함한다.
Eno1 순도 확인: Eno1 단백질 5.32 mg/mL 용액의 순도는 쿠마시 및 은염색 및 웨스턴 블럿에 의해 확인하였다. 10 μg/웰 내지 100 ng/웰의 범위로 Eno1 단백질 희석을 준비하고 12-웰의 4-12% mini-PROTEAN® TGX gel[BIO-RAD Cat# 456-1095 Lot#4000 79200]에 로딩하였다. 레인 배치는 다음과 같다; 레인 1: 레더(레더, Precision Plus Protein Standard Dual Color[BIO-RAD Cat#161-0374]; 레인 2: Eno1(10.0 μg); 레인 3: Eno1(1.0 μg); 레인 4: Eno1(0.1 μg); 레인 5: 레더(Precision Plus Protein Standard Dual Color[BIO-RAD Cat#161-0374];레인 6: Eno1(10.0 μg); 레인 7: Eno1(1.0 μg); 레인 8: Eno1(0.1 μg); 레인 9: 레더(Precision Plus Protein Standard Dual Color[BIO-RAD Cat#161-0374]; 레인 10: Eno1(10.0 μg); 레인 11: Eno1(1.0 μg); 및레인 12: Eno1(0.1 μg). SDS-폴리아크릴아마이드젤전기영동은 200 V에서 20 내지 25 분간 수행하였다.
쿠마시 염색: 상기 겔을 영동한 후에, 상기 겔을 3개의 부분으로 동일하게 나누었다. 하나의 부분은 쿠마시 염색으로 염색하였다. 요약하면, 상기 겔을 100 mL의 쿠마시 염색 용액(40% 메탄올 및 7% 아세트산 내 0.025% 쿠마시 염색)에 침지하고 전자레인지에서 1 분간 가열하였다. 이후, 상기 겔이 45 분간 가볍게 흔들리면서 염색되도록 두었다. 염색이 완료된 후에, 상기 겔의 배경 염색이 어느 정도 제거될 때까지 탈염색 용액(40% 메탄올 및 7% 아세트산) 을 사용하여 탈염색하였다.
도 5에 도시된 것처럼, 상기 단백질은 약 47 KDa의 단일 밴드로 전기영동되었고, 상기 밴드 크기는 Eno1의 크기와 일치한다.
은 염색: 쿠마시 염색은 단백질 밴드를 가시화하는데 민감한 방법이 아니기 때문에, 3 등분된 겔의 또 다른 부분을 BIO-RAD's 은 염색 키트[BIO-RAD Cat#161-0443]를 사용하여 염색하였다. 수정된 염색 프로토콜은 후술된다.
도 6에 도시된 것처럼, 가외의 밴드들이 각 레인에서 확인될 수 있는데, 상기 밴드들은 레더의 밴드들과 일치한다. 이는 이웃하는 레인들로 레더가 누출되었기 때문이다. 화살표로 표지된 3 개의 밴드는 상기 레더 유래가 아니다. 가장 분명한 밴드는 약 47 kDa로, 상기 밴드는 Eno1의 크기와 일치한다. 상기 정제된 단백질 내에 2 개의 추가적인 밴드가 존재하지만, 이들 밴드들은 희미하므로, 이는 상기 Eno1의 전체적인 순도가 매우 높음을 나타낸다.
웨스턴블롯분석: 웨스턴 블럿에 의해 Eno1 일치성을 더 확인하였다. 이러한 목적을 위하여, 3 등분된 겔의 마지막 부분을 100 mL의 Tris-Glycine 완충액으로 옮기고, 트랜스블랏 SD 반건조 트랜스퍼 장치(transblot SD semi-dry transfer apparatus, BIO-RAD)를 사용하여 20V에서 2.0 시간 동안 0.2 μm PVDF 멤브레인(BIO-RAD)으로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼의 효율은 멤브레인 상의 미리 염색된 레더밴드의 존재를 관찰함으로써 확인하였다. 상기 멤브레인을 1 시간 동안 건조하였다. 이후, 상기 멤브레인을 메탄올로 1.0 분간 적시고, 실온에서 2 시간 동안 15.0 mL의 ODYSSEY® 블록킹 완충액(LICOR)으로 블록킹(blocking)하였다.
상기 블록킹을 완료한 후에, 상기 멤브레인을 4℃에서 30 μL의 항-ENOA-1 m-Ab(마우스, ABNOVA에서 구입함)을 함유하는 15.0 mL의 ODYSSEY® 블록킹 완충액으로 하룻밤 동안 배양하였다. 이후, 상기 멤브레인을 흔들면서 5분간 30 mL의 1X PBS-T로 3회 세척하였다. 상기 멤브레인을 IR염료® 800CW로 표지된 5 μL의 염소 항-마우스 이차 항체(LICOR에서 구입함)를 함유하는 15.0 mL의 ODYSSEY® 블록킹 완충액으로 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 상기 멤브레인을 30 mL의 1X PBS-T로 3 회 세척한 후, 교반하면서 30 mL의 1X PBS로 5 분간 2 회 세척하였다. 마지막으로, 상기 멤브레인을 LICOR ODYSSEY 적외선 이미지 장치를 사용하여 이미지화하였다. 도 7에 도시된 것처럼, 웨스턴블롯 분석에 의해 47 kDa의 뚜렷한 밴드가 Eno1 임을 확인하였다.
에놀라아제 -I/G5- PAMAM -SMTP의 제타(z)-전위 특징화: 2-3 골격근 표적화 펩타이드들(SMTPs)로 장식된 Eno1 및 Generation 5 PAMAM 덴드리머들을 Eno1/G5-SMTP 단백질/덴드리머 복합체를 형성하기 위하여 다양한 비율에서 복합체화하였다. 상기 덴드리머의 농도를 1.0 μM에서 일정하게 유지하고, 상기 Eno1의 농도를 0.1 μM 내지 10.0 μM에서 다양화하였다. 하기 표 2는 상기 에놀라아제-I/G5-덴드리머/SMTP 혼합물들이 어떻게 생산되었는지를 설명한다.
덴드리머 복합체 형성을 위한 Eno1 및 G5-덴드리머/SMTP의 다양한 조합.
Eno1/덴드리머 몰 비율 Eno1
(5.32 mg/mL)		 G5-덴드리머 SMTP
(30.0 mg/mL)		 PBS 완충액 pH=7.40
10:1
 88.3 μL 1.03 μL 910.67 μL
5:1 44.15 μL 1.03 μL 954.82 μL
2:1 17.66 μL 1.03 μL 981.31 μL
1:1 8.83 μL 1.03 μL 990.14 μL
1:2 4.42 μL 1.03 μL 994.55 μL
1:5 1.77 μL 1.03 μL 997.2 μL
1:10 0.88 μL 1.03 μL 998.09 μL
각각의 시료는 각 용량의 PBS에 G5-덴드리머/SMTP를 첨가함으로써 제조하였다. 이후, 낮은 속도에서 와동(vortexing)하면서 에놀라아제를 G5-덴드리머/SMTP 용액에 적가로 첨가하였다. 이후, 상기 시료를 분석하기 전에 20 분간 실온에서 배양하였다.
Malvern Instruments에서 생산된 Zetasizer Nano Z90s 기구를 사용하여 크기를 측정하였다. 상기 측정을 위하여 기본 매개 변수들을 사용하였고, 각각의 시료에 대한 3개의 별도의 측정이 이루어졌다. 도 8은 Eno1:덴드리머/SMTP의 몰비율이 2:1인 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체의 3 개의 시료들에 대한 대표적인 제타(z)-전위 데이타를 보여준다. 제타-전위는 Dynamic Light Scattering를 사용하여 측정하였다. 도 8에 도시된 것처럼, 상기 3 개의 시료의 피트들이 일치하는데, 이러한 결과는 상기 에놀라아제-SMTP 덴드리머 복합체의 균일한 전하 분배를 나타낸다.
에놀라아제-I/G5-SMTP 복합체의 안정성: 상기 에놀라아제-I/G5-덴드리머/SMTP 접합체의 안정성은 ENO1 인간 활성 분석 키트(ABCAM, Cambridge, MA; 제품번호: ab117994)를 사용하여 측정하였다. 요약하면, 상기 시료를 Eno1에 특이적인 단일 클론의 마우스 항체를 함유하는 미소판에 투입하였다. 상기 미소판을 실온에서 2 시간 동안 배양하고, Eno1을 미소판의 웰 내에서 면역포획(immunocapture) 하였다. 모든 다른 효소들을 제거하기 위하여 상기 미소판의 웰들을 세척하였다. Eno 1 활성은 피루브산카이나제(PK), 락트산 탈수소효소(LDH) 및 필요한 물질인 2-포스포-D-글리세르산염(2-phospho-D-glycerate, 2PG) 및 NADH을 포함하는 분석용 완충액 내에서 NADH의 소비에 의해 확인하였다. Eno1은 2PG를 포스포에놀피루브산염(phosphoenol피루빈산염)으로 전환하였고, 상기 포스포에놀피루브산염은 PK에 의해 피루빈산염(pyruvate)으로 변환되었다. 상기 피루빈산염은 LDH에 분비되도록 전환되고, 이러한 반응은 NADH를 요구한다. NADH 소비는 340 nm에서 흡광도 감소로 모니터링되었다.
상이한 시점에서 상이한 온도에서 저장된 에놀라아제-I/G5-덴드리머/SMTP 접합체 들의 활성은 상기 기술된 분석을 사용하여 측정하였다. 검사를 위해 500 ng의 Eno1 농도를 선택하였는데, 이는 상기 농도가 분석 키트의 동적 범위의 가운데이기 때문이다. 두 개의 상이한 용액 세트를 준비하였다. 하나의 세트는(대조군) Eno1을 단독으로 함유하였고(즉, 미접합된 Eno1), 다른 하나의 세트는 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 혼합물들을 함유하였다. 이후, 이러한 혼합물들을 -80℃, -20℃, 4℃, 22℃, 및 37℃에서 유지하였다. 결과로써, 첫 1 주일에서, 상기 모든 시료들은 활성이었고, 상기 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 접합체는 Eno1 단독의 경우보다 약간 더 높은 활성을 갖는 것으로 보였다. 하지만, 덴드리머를 함유하는지의 여부와 무관하게, 상기 용액의 활성은 이후 2 주 동안에 꾸준하게 감소하였다. 3 주 경에, 4℃, 22℃, 및 37℃에서 보관된 용액은 어떤 활성도 보이지 않은 반면, -80℃, 및 -20℃에서 저장된 용액은 상당한 안정성을 보였다. 본 연구의 마지막 주에(10 주), -80℃에서 보관되었던 상기 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 용액은 약 90%의 활성을 보유한 반면, Eno1 단독의 경우 활성은 단지 35%였다. 반면에, 20℃에서 유지된 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 용액은 약 24 % 활성인 반면, -20℃에서 저장된 Eno1 단독은 활성을 나타내지 않았다 (도 9).
실시예 6 - G5 PAMAM 덴드리머들을 사용하여 체내 Eno1 표적화 연구
Eno1을 함유하는 검출 가능하게 표지된 PAMAM 덴드리머 복합체를 이전 실시예에서 제공된 방법을 사용하여 제조하고, 피하 주사 후 생쥐에서의 조직 분포를 분석하였다. 구체적으로, 주입하기 72 시간 전에, 배경 형광을 제한하기 위하여, 생쥐에게 알팔파(alfalfa )가 없는 먹이를 공급하였다. 생쥐에게 3μg의 ENO1를 주사하였고/피하로 총 150μl(좌측으로 75μl, 우측으로 75μl)을 주사하였다. 상기 복합체에서 Eno1에 대한 덴드리머의 몰비율은 5:1이었다. 주입 후, 1, 4, 및 24 시간 후에, LI-COR 이미징을 위하여, 동물들을 희생시켰고, 박피하였고, 조직들을 제거하였다. 결과는 도 10a에 도시하였다.
도시된 것처럼, 1 시간에서, 상기 Eno1-PAMAM 덴드리머의 일반적인 전신 분포가 관찰되었다. 4 시간 후에, 상기 Eno1-PAMAM 덴드리머의 상당한 축적이 간, 신장, 및 피하 지방뿐만 아니라 상부 몸통에서 관찰되었다. 24 시간 후에, 상기 Eno1-덴드리머 복합체는 상당히 옅어졌고, 간 및 신장에서 상당하게 관찰되었다.
SMTP "ASSLNIA"를 함유하는 골격근 표적 Eno1-PAMAM 덴드리머 복합체를 사용하여 추적연구를 수행하였다 Eno1 및 SMTP((에놀라아제-Vivo Tag680xl)-(G5-SMTP))를 함유하는 검출 가능하게 표지된 PAMAM 덴드리머 복합체는 이전 실시예에서 제공된 방법을 사용하여 준비하였다. 상기 복합체에서 SMTP에 대한 덴드리머의 몰비율은 1:1이었다. 실험은 상기에서 필수적인 것으로 기재된 대로 진행하였다. 상기 골격근 표적 Eno1-PAMAM 덴드리머 복합체를 50 μg/체중 kg의 투여량으로 투여하였다. 도10B의 이미지들은 1 시간의 주입 후에 확보하였다. 심장 외의 기간들은 생쥐 체내에 두었다. 용이하게 관찰할 수 있듯이, 상기 근육으로 표적화된 Eno1 덴드리머 복합체은 심장이 아닌 골격근을 타겟하였다. 이러한 결과들은 상기 골격근 표적 Eno1-PAMAM 덴드리머 복합체가 Eno1을 골격근 세포들로 전달하는데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 7 - 식이성 비만(diet induced obesity, DIO ) 생쥐의 글루코스 불내성을 근육으로 적중된 Eno 1로 치료
식이 유도된 비만 수컷 C57BL/6J 생쥐(12 주령) 및 대조군 마른 생쥐(12 주령)를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 제공받았고, 처음에 12:12 시간의 낮-밤 사이클로 22℃에서 우리당 4 내지 5 마리의 생쥐를 사육하였다. 생쥐들을 치료 전 1 주일 동안 동물시설에서 적응시키고, DIO 그룹에 대한 고지방 식이(연구용 식이 Cat #: D12492; 60 kcal% 지방, 20 kcal% 단백질, 및 20 kcal% 탄수화물) 또는 마른 그룹에 대한 저지방 식이(10% kcal% 지방)를 유지하였다.
13 주령이 시작할 때, 모든 생쥐들은 매일 식염수 또는 G5 덴드리머, 골격근 표적화 펩타이드(SMTP), 및 정제된 Eno1(50 mg /체중 kg)을 포함하는 상이한 복합체들로 4 주 동안 피하주사 받았다. 실험에 의한 치료 중 4 주의 기간 동안, 복강내 글루코스 부하검사(intraperitoneal glucose 내성 tests, IPGTT)를 매일 실시하였다. 체중, 공급 글루코스, 및 단식된 글루코스를 치료 기간 동안 매우 측정하였다. 치료 동물 그룹들은 다음과 같다:
1. LFD - 마른 대조군 - 주사없음
2. HFD - 식염수대조군(G5+ SMTP + Eno1 과 동일한 부피)
3. HFD - G5 단독(50 μg/kg의 G5 + SMTP + Eno1 과 동일)
4. HFD -- G5+SMTP(50 μg/kg의 G5+ SMTP + Eno1 과 동일)
5. HFD -- G5+Eno1(50 μg/체중 kg)
6. HFD -- G5+SMTP+Eno1(50 μg/체중 kg )
상기 복합체에서 Eno1에 대한 덴드리머의 몰 비율은 5:1이었고, 상기 복합체에서 SMTP에 대한 덴드리머의 몰비율은 1:1이었고, 상기 덴드리머는 아세틸화되었다. 본 연구의 결과들은 도11, 12, 13, 14 및 15에서 도시하였다.
이러한 작은 코호트에서, 상기 치료 요법 중 어느 것도 본 연구 동안 모든 시간대에서 상기 DIO 생쥐의 체중에 유의적 효과를 갖는 것으로 확인되지 않았다 (참조, 도 11).
근육으로 적중된 Eno 1이 결합된 상기 덴드리머의 단일 투여량으로 생쥐 치료는 검사된 가장 이른 시점에서 혈당 수치에 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 도12에 도시된 것처럼, 50 μg/kg의 G5+SMTP+Eno1의 투여 1 시간 후에, 식염수대조군과 비교하여 혈당 감소가 관찰되었고, 이때 최대 감소는 4 시간에서 관찰되었다. 이러한 효과는 상기 단일 주사 후 24 시간에서는 더 이상 관찰되지 않았다.
근육으로 적중된 Eno 1이 결합된 상기 덴드리머 투여 개시 일주일 시점에, Eno1 덴드리머 SMTP 복합체(DIO 에놀라아제-1+NP+SMTP) 로 처리된 상기 DIO 생쥐에서의 글루코스 내성이 덴드리머 SMTP 복합체 단독으로(DIO NP+SMTP)처리된 DIO 생쥐의 글루코스 내성보다 상당히 낮았다(참조, 도 13a 및 13b).
근육으로 적중된 Eno 1이 결합된 상기 덴드리머의 투여 개시 후 2 주일 시점에, 상기 DIO 생쥐의 글루코스 내성은 여전히 상당히 개선되었다 (참조, 도6C 및 6D). 이러한 글루코스 내성의 개선은 덴드리머 복합체(DIO G5 +SMTP vs. DIO Eno 1 G5 +SMTP, p = 5.7 x 10-5, p = 0.002) 내 Eno 1의 존재에 의존적이었다. 이러한 효과는 상기 단일 주사 후 23 시간에서는 더 이상 관찰되지 않았다(데이타 미도시됨).
G5+SMTP+Eno1 치료의 유익한 효과는 1 주 및 2 주 시점에 관찰되었고 4 주 동안 유지되었다 4(참조, 도 14a 및 14b). 구체적으로, DIO Eno 1 G5 +SMTP로 처치된 생쥐의 글루코스 내성은 마른 생쥐의 글루코스 내성과 유사하였다. 글루코스 내성은 유의적으로 개선되었으며, 상기 덴드리머 복합체(DIO G5 +SMTP vs. DIO Eno 1 G5 +SMTP, p = 0.0017) 내 Eno 1의 존재에 의존적이었다. 이러한 상기 단일 주사 후 23 시간에서는 더 이상 관찰되지 않았다(데이타 미도시됨).
이러한 결과들은 덴드리머가 결합된 근육으로 적중된 Eno 1이 식이성 비만 동물모델의 글루코스 내성을 향상시키는데 효과적이고, G5+SMTP+Eno1은 식이성비만 생쥐모델의 혈당을 정상화하는데 효과적임을 보여준다. 이러한 결과들은 Eno1이 상승된 혈당, 글루코스 불내성, 및 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 치료하는데 유용함을 나타낸다.
상기 생쥐들은 상기 기술된 대로 추가적인 4 주 동안 처치되었고(총 8 주의 처치), 상기 처치의 8 주 후에, 마른 생쥐, 식이성 비만(diet induced obesity, DIO) 생쥐, G5-덴드리머로 처치된 DIO 생쥐, 및 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체로 처치된 DIO 생쥐에서 혈청 젖산수치를 확인하였다. 혈청에서의 젖산 수치는 Biovision(Milpitas, CA)에서 생산되는 젖산 비색적 분석 키트(lactate colorimetric assay kit)를 사용하여 측정하였다. 도 15에 도시된 것처럼, Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체는 젖산 혈청 수치를 상당히 낮추었다. 이러한 결과는 상기 Eno1/G5-덴드리머/SMTP 복합체로 처치된 DIO 생쥐에서 관찰되는 감소된 글루코스 수치는, 젖산에 대한 해당작용을 전가해서라기 보다는, 증가된 글루코스 산화로 인한 것임을 제안한다. 이는 젖산독증(lactate acidosis)의 원치않은 효과를 최소화하였을 것이다.
실시예 8 - 유전적 비만 동물모델인 db/db 생쥐에서 근육으로 적중된 Eno 1에 의한 글루코스 불내성 치료
수컷 비만 생쥐 및 당뇨병 db/db 생쥐(수컷 BKS.Cg-m +/+ Lepr db /J)를 시중의 업체로부터 구입하였다. 모든 생쥐들을 12:12 시간의 낮-밤 사이클로 22℃에서 우리당 2 내지 3 마리씩 사육하고, 동물 시설에서 3 주 동안 표준 일반 식이로 적응시켰다. 8 주령이 될 때, 식염수 또는 G5 덴드리머, 골격근 표적화 펩타이드(SMTP), 및 정제된 Eno1을 포함하는 상이한 복합체들을 피하주사로 매일 1회 투여하였다 (n = 그룹 당 6 마리). 처리 그룹들은 다음과 같다:
1. 식염수주입에 의한 db/db
2. G5+SMTP(25 μg/kg 투여량으로 Eno1+G5+SMTP 과 동일한 부피) 에 의한 db/db
3. Eno1(25 μg/체중 kg)+G5+SMTP에 의한 db/db
4. Eno1(50 μg/체중 kg)+G5+SMTP에 의한 db/db
상기 복합체에서 Eno1에 대한 덴드리머의 몰 비율 5:1이었고, 상기 복합체에서 SMTP에 대한 덴드리머의 몰비율은 1:1이었고, 상기 덴드리머는 아세틸화되었다.
7 일 째에, 상기 생쥐들에게 적절한 약제를 투여하고 상기 실시예에서 기술된 것처럼 IPGTT 의 투여 전에 먹이제공 없이 6 시간 동안 우리에 두었다. 결과들은 도 16a 및 16b에 도시하였다. 용이하게 관찰할 수 있듯이, Eno1+G5+SMTP로 생쥐를 처치함으로써, G5+SMTP로 처치된 생쥐들과 비교하여(p=0.015), Eno1(50 μg/체중 kg)+G5+SMTP으로 처치된 생쥐들에서 상당히 향상된 글루코스 제거와 함께 글루코스 공격 후 글루코스 내성의 향상이 확인되었다.
본 연구는 상기에서 나열된 처치 그룹 각각의 6 마리의 생쥐 중 3 마리의 생쥐를 사용하여 지속하였다. 생쥐들에게 추가적으로 1 주일 동안(총 2 주) 상기의 약제로 투여하였다. 공급된 혈당을 낮추는데 있어서 Eno1의 효과를 검사하였다. 구체적으로, 먹이 섭취를 제어하지 않고, 생쥐의 혈당 수치를 상기 활성제 투여직 후 2 시간 동안 확인하였다. 결과는 도 17a 및 17b에 도시된다. 도시된 것처럼, Eno1 (50 μg/체중 kg)+G5+SMTP의 투여는 공급 혈당을 감소시키고, G5+SMTP의 투여와 비교하여, 투여 후 30 분 내에 통계적으로 유의적인 혈당감소를 야기하였다. 하지만, Eno1+G5+SMTP 처치 후 30분 시점에 관찰된 상기 감소된 혈당은 Eno1 주입 후 24 시간에서 유지되지 않았다(도 18).
따라서, 혈당 수치에 대한 매일 두 차례 Eno1+G5+SMTP 투여의 효과 또한 db/db 생쥐에서 평가하였다. 처치는 4 주 동안 매일 두 차례(아침에 한 차례, 저녁에 한 차례) 피하주사에 의해 이루어졌다. 치료 그룹들은 다음과 같았다:
1. PBS
2. Eno1+G5+SMTP, 100 μg/체중 kg
3. Eno1+G5+SMTP, 200 μg/체중 kg
상기 Eno1+G5+SMTP 복합체에서 Eno1에 대한 덴드리머의 몰비율은 5:1이었고, 상기 Eno1+G5+SMTP 복합체에서 SMTP에 대한 덴드리머의 몰 비율은 1:1이었고, 상기 덴드리머는 아세틸화되었다.
처리군 2에 대한 총 하루 투여량은 200 μg/체중 kg의 Eno1+G5+SMTP이었고, 처리군 3에 대한 총 하루 투여량은 400 μg/체중 kg의 Eno1+G5+SMTP이었다. 먹이 섭취를 제어함 없이, 공급 혈당 수치는 저녁 주사 후 16 시간에서(즉, 아침주사 전에) 생쥐에서 확인하였다. 도 19에 도시된 것처럼, 200 μg/체중 kg의 Eno1+G5+SMTP의 매일 2 회 주사는, 대조군인 PBS 처치군과 비교하여, 공급 혈당 수치를 낮추었다.
따라서, Eno 1 G5 +SMTP에 의한 생쥐 처치는 db/db 생쥐에서의 글루코스 반응을 정상화하는 것으로 확인되었다. 실시예 7 및 8에서 설명된 데이터들 또한 Eno 1이 유도된 제2형 당뇨병 동물 모델 및 유전적 제2형 당뇨병 동물 모델 모두에서 글구코스 내성을 효과적으로 향상시킴을 보여준다.
실시예 9 - 덴드리머들을 함유하는 아실화된 SMTP vs 비아실화된 SMTP의 독성 비교
크레아틴 인산화효소 및 카스파제 3 분석을 사용하여 SMTP를 함유하는 아실화된 및 비아실화된덴드리머들의 독성을 비교하였다. 생쥐들을 스타우로스포린(staurosporine, 양성 대조군), 스타우로스포린 + 저해제(음성 대조군); G5 PAMAM 덴드리머들, SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들, 및 아실화된 SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들 중 하나로 주사하였다. 상기 복합체에서 Eno1에 대한 덴드리머의 몰 비율은 5:1이었고, 상기 복합체에서 SMTP에 대한 덴드리머의 몰비율은 1:1이었다. 주사 후, 시료들을 수거하였고, 시판되는 키트들을 사용하여 총 세포 용해물 및 카스파제 3 활성의 백분율로서 크레아틴 인산화효소 수치를 분석하였다. 결과들은 도 20에 도시하였다. 도 20에 도시된 것처럼, 1 μM 및 3μM 농도에서 G5 PAMAM 덴드리머들의 투여 및 3 μM 농도에서 SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들의 크레아틴 인산화효소 활성의 상당한 향상으로 귀결되었다. 이러한 결과는 아실화된 SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들의 경우에서는 관찰되지 않았다. 유사하게, 3uM의 G5 PAMAM 덴드리머들 및 SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들의 투여 후에 카스파제 3 활성에서의 상당한 향상이 관찰되었다. 그러나 상기 아실화된 SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들의 투여 시 카스파제 3 활성의 향상은 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 SMTP-G5 PAMAM 덴드리머들의 아실화가 독성을 감소시킴을 나타낸다.
실시예 10 -제2형 당뇨병 및 제1형 당뇨병을 가진 유전적 동물모델 및 유도된 동물모델의 글루코스 불내성을 근육으로 적중된 Eno 1으로 치료
수컷 비만 생쥐, 당뇨병 db/db 생쥐(수컷 BKS.Cg-m +/+ Lepr db /J), NOD1 생쥐, 또는 스트렙타조신(streptazocin) 처치된 생쥐를 확보하거나 생산하였다. 모든 생쥐들은 12:12 시간의 낮-밤 사이클로 22℃에서 우리당 2 내지 3 마리씩 사육하고 적절한 보통 식이(즉, 비만 생쥐에 대하여 고지방 식이, 다른 생쥐에 대하여 보통 식이)를 제공하면서 동물 시설에서 최소 1 주일 동안 적응시켰다. 적절한 나이에서, 일반적으로 약 8 주령에서, 식염수 또는 G5 덴드리머, 골격근 표적화 펩타이드(SMTP), 및 정제된 Eno1을 포함하는 상이한 복합체들(25 또는 50 mg/체중 kg) 를 1 내지 2 주의 기간 동안 매일 피하주사하였다. 매일 또는 연속적인 투여를 위해 상기 기술된 주입용 펌프(예를 들어, ALZET 펌프)를 사용할 수 있다. 또는, 상기 약제들은 다양한 제형 형태로 근육 내로 투여될 수 있다. 근육 내 주입은 일반적으로 피하주사보다 더 낮은 빈도로 수행된다 (예를 들어, 일반적으로 약 1주일에 한번).
상기 약제의 투여 후에, 2 주의 시간 동안, 무작위로 또는 시간경과에 따라, 복강내 글루코스 부하검사(intraperitoneal glucose 내성 tests, IPGTT)를 실시하고, 공복 혈당 및 공급 혈당을 측정하였다. 체중은 처치 기간 동안 매일 측정하였다. 상기 처리군들은 하기에 나타낸 목록의 적어도 하나 대조군(예를 들어, 1 또는 2) 및 적어도 하나 Eno1 처치를 포함한다:
1. 식염수주입
2. G5+SMTP(25 μg/체중 kg/일에서 Eno1+G5+SMTP과 동일한 부피)
3. Eno1(25 μg/체중 kg/일)+G5+SMTP
4. Eno1(50 μg/체중 kg/일)+G5+SMTP
5. Eno1(25 μg/체중 kg/일)
6. Eno1(50 μg/체중 kg/일)
제공되는 투여량은 예시적인 것으로 이로 한정되는 것으로 고려되어서는 안된다.
Eno 1 G5 +SMTP의 처치에 의해 상기 당뇨병 생쥐의 글루코스 반응이 정상화되는 것을 보여준다.
실시예 11 - 생쥐에서 글루코스 수치 및 글루코스 반응 평가
상기 복강내 글루코스 부하검사(IPGTT)는 상기에서 기술된 것으로 글루코스 내성 및 인슐린 반응을 평가하기 위해 일반적으로 사용된다. 혈당 및 인슐린 반응을 정상화하는 데 있어서 Eno 1 효능을 확인하기 위해 사용될 수 있는 다른 예시적인 방법들이 하기에서 제공된다. 신체 구성 및 대사를 평가하기 위한 방법들도 하기에서 제공된다.
복강내 인슐린 내성 검사( Intraperitoneal Insulin Tolerance, IPITT )
피루빈산염 대사를 평가하기 위하여, 인슐린 내성 검사(ITT)를 1 시간의 공복 후에 수행한다. 초기 혈당 수치를 확인한 후, 인간 인슐린(1-2 U/kg; Humulin R; Eli Lilly, Indianapolis, IN)을 주사(ip)한다. 혈당 수치는 상기 기술된 대로 인슐린 주입 후 15, 30, 60, 90 및 120 분에서 꼬리 정맥에서 측정한다. 상기 인슐린 주입 용량은 고지방 식이가 제공된 상기 생쥐 피험자에서 간 인슐린 저항성의 개시로 인한 인슐린 반응에 의해 실험에 의거하여 결정한다.
복강내 피루빈산염 내성 검사( IPPTT )
피루빈산염 내성 검사는 6 시간의 공복 후에 수행된다. 초기 혈당 수치를 확인한 후, 식염수에 용해된 피루빈산염을 주사한다(ip) (2 g/kg; Sigma, St. Louis, MO). 혈당 수치는 상기 기술된 대로 상기 피루빈산염 주입 후 15, 30, 60, 90, 및 120 분에서 꼬리 정맥에서 측정한다. 상기 검사 동안에 곡선하위면적(area under the curve, AUC)을 계산한다.
공급 혈당 수치
흥미 대상 약제의 투여 후에 무작위적으로 또는 정해진 시간 또는 정해진 시간 간격에서 임의로 식이된 생쥐들로부터 혈액 시료들을 수득하였다.
공복 혈당 수치
흥미 대상 약제의 투여 후에 정해진 시간 또는 정해진 시간 간격에서 소정의 시간 일반적으로 약 6 내지 8 시간) 동안 단식된 생쥐들로부터 혈액 시료들을 수득하였다. 혈당 수치를 측정한다.
혈당 수치를 평가하기 위한 지표 수치의 평가
제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병 마우스 모델들을 본 발명의 하나 이상의 약제 및 적절한 대조군들로 처치한다. 유지된 기간 동안 혈당 수치를 확인하기 위하여, A1c 및/또는 Eno1 단백질 및/또는 RNA의 수치를 측정하다.
이중에너지방사선흡수계측법 (Dual-energy X-ray absorptiometry,DEXA )
상이하게 처치된 그룹의 체질량 조성은 제조사에 의한 추천된 절차들에 따라서 LUNAR PIXImus® 마우스 농도계를 사용하여 이중에너지방사선흡수계측(DEXA) 스캐닝으로 확인한다. 무지방 체질량, 지방 체질량, 총 체조직 중량, 골밀도, 및 골 무기물 함량을 기록하고 분석한다.
종합적인 실험동물 모니터링 시스템(CLAMS)
수평적 및 수직적 활성, 식이 및 음료, 산소 흡수, 및 CO2 생성을 동시에 모니터링하기 위하여 CLAMS(Columbus 측정 계기, Columbus, OH, USA) 대사 모니터링 우리들을 사용한다. ASO 주사된 대조군 생쥐들을 개별적으로 CLAMS 우리에 두고, 1 내지 2 일 동안 상기 우리 내에서 적응시킨 후에 4 일 동안 모니터링한다. 단식 조건 및 식이 조건 모두에서 다양한 매개 변수가 기록된다. 먹이 및 음료 소비를 누적 데이터로 직접적으로 측정한다. 매 시간의 파일들은 각 매개 변수에 대한 모든 측정치들을 보여준다: 소비된 산소 부피(시간 당 ml/kg(VO2)), 생산된 이산화탄소 부피(시간 당 ml/kg(VCO2)), 호흡 교환 비율, 발열(kcal/h), 누적된 먹이(g), 누적된 음료(g), XY 총 활성(모든 수평적 빔은 계수를 방해함), XY 보행 활성(최소의 3 개의 상이한, 연이은 수평적 빔은 계수를 방해함), 및 Z 활성(모든 수직적 빔은 계수를 방해함). 상기 데이터는 30 초의 샘플링 기간 동안 기록된다. CLAMS 데이터는 무지방 체질량을 표준화함으로써 분석된다.
실시예 12 -인간 골격근 근육대롱세포에서 인슐린 자극된 p-맛에 대한 Eno1의 효과
인슐린 자극된 p-Akt(S473) 단백질 수치에 대한 정제된 Eno-1의 효과는 인슐린 치료과 함께 또는 인슐린 치료 없이 인간 골격근 근육대롱세포의 세포 배양에서 확인하였다. p-Akt 단백질 수치는 ELISA로 측정하였다. 도 21에 도시된 것처럼, 인슐린 처치는 Eno1 부재 하에서 tp-Akt 단백질 수치를 상승시켰고, p-Akt 단백질 수치에 대한 인슐린 효과는 Eno1 처리 시와 Eno1미처리시에서 유사하였다. 이러한 결과들은 Eno1이 p-Akt 단백질 수치의 인슐린 자극에 영향을 주지 않음을 나타내고, 근육 세포들에서 글루코스 섭취에 대한 Eno1의 효과는 인슐린에 비의존적이고, 상기 효과는 인슐린 저항성을 나타내는 세포들에서 발생할 수 있음을 제시한다.
실시예 13 - Eno1은 인간 골격근 근육대롱세포에서의 향상된 글루코스유동과 관련된다
글루코스 수송체 1(Glucose transporter 1, Glut1) 및 글루코스 수송체 4(Glucose transporter 4, Glut4)는 원형질 막을 통과하는 글루코스 수송에 관여하는 것으로, 골격근 내 우세한 촉진성 글루코스 수송체이다 (Jones 외, 1998, Journal of Applied Physiology, Vol. 84, 1661 내지 1666면). Glut4은 세포 내로의 인슐린 조절형 글루코스 수송에 관여한다. 미오게닌은 Glut1 및 Glut4 발현을 조절하는데 관여할 수 있는 근육 특이적 전사 인자이다(참조, 상기에 기잰된 문헌(Jones 외)). 헥소카이나아제 2(Hexokinase 2, HK2)는 글루코스를 인산화하여 글루코스-6-인산(glucose-6-phosphate, G6P)을 형성하는 것으로, 골격근 내의 우세한 헥소카이나아제이다.
Glut1, Glut 4, HK2 및 미오게닌의 발현을 Eno1으로 처리되거나 Eno1으로 처리되지 않은 인간 골격근 근육대롱세포 배양에서 측정하였다. 상기 근육대롱세포를 실시예 2에 기술된 것처럼 제조된 정제된 Eno1으로 처리하였다. Glut1, Glut4, HK2 및 미오게닌 mRNA 수치는 정량적인 PCR로 확인하였다. Glut1 단백질 수치는 MS 단백질체 분석(MS proteomics analysis)에 의해 확인하였다. 도 22a 및 22b에 도시된 것처럼, Eno1 처치는 Glut1, Glut4 및 HK2 mRNA 수치, 및 Glut1 단백질 수치를 향상시켰다. 이러한 단백질들은 글루코스 수송 및 대사에 관여하기 때문에, 이러한 결과들은 Eno1 처리가 골격근의 향상된 글루코스 유동과 관련 있음을 나타낸다.
글루코스 유동에서 Eno1 역할을 더 확인하기 위하여, G6P 및 phosphoenol 피루빈산염(PEP) 수치를 정제된 Eno1으로 처리되거나 미처리된, 글루코스 결핍된 인간 골격근 근육대롱세포 및 글루코스 자극된 인간 골격근 근육대롱세포에서 측정하였다. 글루코스-결핍 DMEM내에 상기 근육대롱세포를 15분 동안 배양함으로써 글루코스 결핍을 수행하였다. 글루코스 자극은 상기 근육대롱세포를 5 mM 글루코스로 15분간 처리함으로써 수행하였다. G6P 및 PEP 수치는 Biovision(Milpitas, CA; Cat. Nos. K657-100 및 K365-100)에서 판매하는 분석 키트들을 사용하여 측정하였다. 도 23 및 24에 도시된 것처럼, Eno1 처리는 글루코스 결핍된 인간 골격근 근육대롱세포 및 글루코스 자극된 인간 골격근 근육대롱세포 모두에서 G6P 및 PEP 수치를 상승시켰고, 이러한 결과는 Eno1 처리가 골격근의 향상된 글루코스 유동과 관련됨을 나타낸다.
실시예 14 - Eno1 작용 방식
글루코스 섭취에서 Eno1의 작용 방식을 더 확인하기 위하여, 인간 골격근 근관 세포들(human skeletal muscle myotube cells)에서 산소 소모율(oxygen consumption rate, OCR) 및 세포외 산성화율(세포외성 acidification rate, ECAR)을 측정하였다. OCR은 미토콘드리아 호흡의 지표이고, ECAR은 해당작용의 지표이다.
OCR 실험과 관련하여, 다양한 화합물들을, OCR 변화를 유도하기 위하여, 세포에 순차적으로 첨가하였다. 예를 들어, OCR을 높이기 위하여 팔미테이트 및 카보닐 시안화물 m-클로로페닐히드라존(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, CCCP, 산화성 인산화반응의 짝풀림제(uncoupler)) 를 첨가하였고, OCR 을 줄이기 위하여 에토모시르(etomoxir, 지방산 산화 저해제)를 첨가하였다. 각 웰에 KHB 완충액(pH 7.4)을 첨가하고, 측정 도중 2 분간 혼합을 수행하면서 3 분 마다 측정을 수행하였다. BSA-접합된 팔미테이트(최종 농도: 200 mmol/L), CCCP(최종 농도: 2 μM) 및 에토모시르(최종 농도: 50 mmol/L)를 순차적으로 주입하였다. 도 25에 도시된 것처럼, Eno 1 처리는 OCR을 높였다. 이러한 결과들은 Eno1 처리가 인간 골격근 근육대롱세포에서의 증가된 미토콘드리아의 유리 지방산 산화와 관련이 있음을 나타낸다.
기질로서 글루코스를 사용하는 ECAR 실험에서, 탄산나트륨 및 글루코스/피루빈산염-결핍 DMEM을 사용하였다. 글루코스, 올리고마이신, 및 2-DG을 최종 농도가 25 mmol/L이 되도록 순차적으로 주입하였다. 도 26에 도시된 것처럼, Eno1 처리는 ECAR을 향상시켰고, 이러한 결과는 Eno1 처리가 향상된 해당 활성 및 용량과 관련됨을 나타낸다.
Eno1로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포의 미토콘드리아 함량을 확인하기 위하여, 근육대롱세포를 48 시간 동안 500 μg/ml 또는 1000 μg/ml의 Eno1으로 처리한 후, 녹색 형광성의 미토콘드리아 염색제인 Mitotracker green(Invitrogen)을 첨가하였다. 15 분 동안 염색한 후에, 상기 근육대롱세포를 트립신 처리하고, 세척하고, 미토콘드리아 함량을 확인하기 위하여 유동세포계수를 수행하였다. 도 27a에 도시된 것처럼, Eno1 처리는 미토콘드리아 함량에 영향을 주기 않는다.
미토콘드리아의 ROS 또한 상기 기술된 Eno1 처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서 확인하였다. 미토콘드리아 ROS는 세포들을 멤브레인에 수동적으로 확산할 수 있는 무전하이고 비형광성인 활성산소(ROS) 지표인 Dihydrorhodamin 123(Life Technologies)으로 처리함으로써 확인하였다. 상기 Dihydrorhodamin 123은 미토콘드리아에 위치하고 녹색 형광을 나타내는 양이온 로다민 123으로 산화된다. 이후, 상기 근육대롱세포를 트립신 처리하고, 세척하고, 유동세포계수를 수행하였다. 인간 골격근 근육대롱세포를 Eno1으로 처리하는 것은 미토콘드리아의 활성산소 생성에 영향을 주지 않았다(도 27b).
이러한 결과들은 Eno1의 상기 작용 방식이 미토콘드리아 함량 또는 ROS 생성에서의 변화로 인한 것이 아님을 나타낸다.
Eno1의 작용방식을 더 확인하기 위하여, 비-인산화된 5' AMP 활성화된 단백질 키나아제(AMPK) 및 인산화된 AMPK(pAMPK) 수치를 0, 500, 또는 1000 μg/ml Eno1로 처리된 기저 인간 골격근 근육대롱세포 및 혈청 결핍된 인간 골격근 근육대롱세포에서 확인하였다. 근육대롱세포 융해 전 3 시간 동안, 기저 인간 골격근 근육대롱세포는 2% 말혈청을 함유하는 일반 분화 배지로 처리한 반면, 혈청-결핍된 근육대롱세포는 0.5% BSA를 함유하는 혈청 유리 DMEM으로 처리하였다. AMPK 및 pAMPK 수치는 상기 키나아제의 인산화되거나 비인산화된 형태에 특이적인 항체들을 사용하여 웨스턴블롯에 의해 확인하였다. 라민 A/C(Lamin A/C)에 특이적인 항체는 시료들 간의 로딩을 확인하기 위하여 사용하였다. 도 28a 및 28b에 도시된 것처럼, Eno1 처리는 기저 근육대롱세포 또는 혈청 결핍된 근육대롱세포의 pAMPK 수치에 영향을 주지 않는다. AMPK 활성 또는 인산화는 골격근에서의 글루코스 섭취를 조절하는, 예를 들어, 근육 수축 동안, 주요 인슐린 비의존적 경로들 중 하나이다. 따라서, pAMPK 수치에 대한 Eno1의 영향의 결핍은 종래의 신호 전달 하에서 Eno1 에 대한 신규한 작용 방식을 제안한다.
실시예 15 - 인간 골격근 근육대롱세포에서 Eno1 결합 파트너들
Eno1의 작용 방식을 더 확인하기 위하여, Eno1의 결합 파트너들을 미처리된 인간 골격근 근육대롱세포(내생 Eno1을 함유함) 및 50 μg/ml 또는 100 μg/ml의 6X 히스티딘 꼬리표가 달린 외인성 Eno1(histidine tagged exogenous Eno1)으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포에서 비교하였다. 내생적 Eno1을 Eno1에 특이적인 항체를 사용하여 미처리된 근육대롱세포에서 면역침전하였다(immunoprecipitates). 상기 외인성 Eno1은 6X 히스티딘 꼬리표가 달린 항체를 사용하여 면역침전하였다. 상기 내생 Eno1 및 외인성 Eno1의 결합 파트너들은 정량적인 단백질체 분석에 의해 동정되었고, 상기 결합 파트너들의 동일성은 웨스턴 블롯및/또는 역면역침전(reverse immunoprecipitation )에 의해 확인하였다.
니코닌아마이드 포스포리보실트랜스퍼라아제(Nicotinamide phosphoribosyltransferase, Nampt)는 상기 내생적 Eno1 및 외인성 Eno1 모두에 대한 결합 파트너로서 동정되었다. Nampt는 니코닌아마이드로부터 니코닌아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide, NMN)의 합성을 촉진하고, 근육 수축 및 분비에 관여한다. 도 29에 도시된 것처럼, Eno1은 해당작용 복합체의 일부로서 Nampt와 상호작용할 수 있다.
실시예 16 - Eno1 및 Nampt의 상호작용
Nampt 활성은, 4 일 동안의 분화 후에, 48 시간 동안 분화용 배지에서 인간 골격근 근육대롱세포를 500 μg/ml 또는 1000 μg/ml의 Eno1으로 처리하여 확인하였다. 근관 용해물들을 Cyclex(Nagano, 일본)사에서 판매하는 IgG 또는 항-Nampt 항체(Clone AF-1E12)를 사용하여 면역침전하였다. 면역침전된 근관 용해물들에 대한 Nampt 활성 분석을 Cyclex Nampt 활성 분석 키트(#CY-1251)를 사용하여 수행하였다. 도 30에 도시된 것처럼, Eno1 처리는 Nampt 활성을 증가시켰다. 또한, Eno1 처리는 인간 골격근 근육대롱세포에서 Nampt의 분비(eNampt)를 향상시켰다 (데이타 미도시됨).
2-DG 흡수는 3 시간 동안 혈청 결핍된 후, Abcam(Cambridge, MA)사에서 판매하는 재조합 세포외성(extracellular) Nampt(eNampt)으로 처리된 인간 골격근 근육대롱세포 에서 측정하였다. 2-DG 흡수는 Abcam(Cat. No. ab136956)사에서 판매하는 형광 글루코스 섭취 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 도 31에 도시된 것처럼, eNampt 첨가는 2-DG 흡수를 증가시켰다.
Eno1-유도된 글루코스 섭취에서 Nampt의 역할을 확인하기 위하여, 인간 골격근 근육대롱세포를 상기에서 기술된 대로 Eno1으로 48 시간 동안 처리하고, Nampt 저해제인 FK866를 Eno1 처리 개시 24 시간 후에 첨가하였다. 이 때, 총 FK866 처리 시간은 24 시간이었다. 2-DG 흡수는 상기 기술된 Abcam사의 글루코스 섭취 분석 키트를 사용하여 3 시간 동안의 혈청 결핍 후에 측정하였다. 도32에 도시된 것처럼, FK866에 의한 Nampt 억제는 Eno1-유도된 글루코스 섭취를 무효화 하였다. 이러한 결과는 Nampt이 Eno1-유도된 글루코스 섭취에서 작용함을 나타낸다.
등가물
당 분야의 기술자들은, 일반적인 실험뿐만 아니라, 본 발명에서 설명되는 많은 특정 구체예들 및 방법들의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물들은 하기 청구범위의 범위에 포함되는 것으로 의도하였다.
참고문헌의 포함
본 출원서에서 언급되는 각각의 참조문헌, 특허문헌, 특허출원서, 및 GenBank 번호는, 이들 각 문헌이 포함되는 것으로 기재된 것처럼, 본 발명에 참조로서 포함된다.
서열 설명
SEQ ID NO: 서열 설명
1 DNA 인간 Eno1, 제1 전사 변이체.
2 AA 인간 Eno1, 제1 전사 변이체.
3 DNA 인간 Eno1, 제2 전사 변이체.
4 AA 인간 Eno1, 제2 전사 변이체, c-myc 프로모터-결합 단백질-1(c-myc promoter-binding protein-1, MBP-1)로도 언급됨.
5 DNA 인간 Eno2.
6 AA 인간 Eno2.
7 DNA 인간 Eno3, 제1 전사 변이체. Eno3의 제1 동형체를 인코딩함.
8 DNA 인간 Eno3, 제2 전사 변이체. Eno3의 제1 동형체를 인코딩함.
9 AA 인간 Eno3, 제1 동형체.
10 DNA 인간 Eno3, 제3 전사 변이체. Eno3의 제2 동형체를 인코딩함.
11 AA 인간 Eno3, 제2 동형체.
SEQUENCE LISTING <110> Berg LLC <120> Enolase 1 (ENO1) compositions and uses thereof <130> 119992-10620 <140> PCT/US2015/011275 <141> 2014-01-13 <150> US 61/926,913 <151> 2014-01-13 <150> US 62/009,783 <151> 2014-06-09 <150> US 62/100,881 <151> 2015-01-07 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2204 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtggggcccc agagcgacgc tgagtgcgtg cgggactcgg agtacgtgac ggagccccga 60 gctctcatgc ccgccacgcc gccccgggcc atcccccgga gccccggctc cgcacacccc 120 agttcggctc accggtccta tctggggcca gagtttcgcc cgcaccacta cagggccgct 180 ggggagtcgg ggccccccag atctgcccgc ctcaagtccg cgggacgtca cccccctttc 240 cacgctactg cagccgtcgc agtcccaccc ctttccggga ggtgagggaa tgagtgacgg 300 ctctcccgac gaatggcgag gcggagctga gggggcgtgc cccggaggcg ggaagtgggt 360 ggggctcgcc ttagctaggc aggaagtcgg cgcgggcggc gcggacagta tctgtgggta 420 cccggagcac ggagatctcg ccggctttac gttcacctcg gtgtctgcag caccctccgc 480 ttcctctcct aggcgacgag acccagtggc tagaagttca ccatgtctat tctcaagatc 540 catgccaggg agatctttga 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Met Ser Ile Leu Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Phe Thr Ser Lys Gly Leu Phe Arg 20 25 30 Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Asn Asp Lys Thr Arg Tyr Met Gly Lys Gly Val Ser Lys 50 55 60 Ala Val Glu His Ile Asn Lys Thr Ile Ala Pro Ala Leu Val Ser Lys 65 70 75 80 Lys Leu Asn Val Thr Glu Gln Glu Lys Ile Asp Lys Leu Met Ile Glu 85 90 95 Met Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Val Glu Lys Gly Val 115 120 125 Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly Asn Ser Glu Val Ile 130 135 140 Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly 145 150 155 160 Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Ala 165 170 175 Asn Phe Arg Glu Ala Met Arg Ile Gly Ala Glu Val Tyr His Asn Leu 180 185 190 Lys Asn Val Ile Lys Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly 195 200 205 Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Lys Glu Gly Leu 210 215 220 Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Gly Lys Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Val 225 230 235 240 Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Phe Arg Ser Gly Lys 245 250 255 Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Asp Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Ser 260 265 270 Pro Asp Gln Leu Ala Asp Leu Tyr Lys Ser Phe Ile Lys Asp Tyr Pro 275 280 285 Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Gly Ala Trp 290 295 300 Gln Lys Phe Thr Ala Ser Ala Gly Ile Gln Val Val Gly Asp Asp Leu 305 310 315 320 Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg Ile Ala Lys Ala Val Asn Glu Lys Ser 325 330 335 Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu 340 345 350 Ser Leu Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Ala Asn Gly Trp Gly Val Met 355 360 365 Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu 370 375 380 Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 385 390 395 400 Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu 405 410 415 Leu Gly Ser Lys Ala Lys Phe Ala Gly Arg Asn Phe Arg Asn Pro Leu 420 425 430 Ala Lys <210> 3 <211> 2567 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aactaaagaa aagtttcccc atctcccagg agggttctgt gggccctcca gagatcatca 60 gcctcttcac gggctagaaa ggatccaggg aaggtctaac caatgacctg ccctgaatgg 120 tgagctgcag gtgtgtcatt tagtgtgatt ttcctgttga ctgactcata ggagccctgc 180 tctgtggcag agctagcctc tggctgtatt caaattgact tagtgtgtgt gcaacattga 240 cctttctaga gatagaacat gtggccaaat tacagaaaag cacatagggc tagatcacgc 300 attctcagtg gggcacccgg aaaactccaa aaaggctgca gggaggggac aatgatgaaa 360 tcaggttgtg aaacactggg ctggtgtcgc agtggtggtg ctgggtgttc agtcccgctt 420 taatgctgta agaagcactc tacacacacg aacatgttac catttgaccg ttgtttaatg 480 gcgtacgtgg ggacttagcc ggagcaggat gatgctgtgc cttgatggta atgagtgctc 540 agtaagtaag catttgtgga agattgaacg catggcccct gaaatgctct cctctgcttt 600 cctgccccct cactgtctct cactcgcagt ccttaatcac cggttctctt ctgagtctct 660 ctcatttttc cttcttcatc ctctgctggg caggcgtctc cagacccatt aagtatatta 720 atgagttcct ggcaccagcc ctgtgcactc 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gtatctatga ggctctggaa 240 ctaagagacg gagacaaagg ccgctacctg gggaaagcca agtttggggc caatgccatc 300 ctgggcgtgt ccttggccgt gtgtaaggcg ggagcagctg agaagggggt ccccctgtac 360 cgccacatcg cagatctcgc tgggaaccct gacctcatac tcccagtgcc agccttcaat 420 gtgatcaacg ggggctccca tgctggaaac aagctggcca tgcaggagtt catgattctg 480 cctgtgggag ccagctcctt caaggaagcc atgcgcattg gcgccgaggt ctaccaccac 540 ctcaaggggg tcatcaaggc caagtatggg aaggatgcca ccaatgtggg tgatgaaggt 600 ggcttcgcac ccaacatcct ggagaacaat gaggccctgg agctgctgaa gacggccatc 660 caggcggctg gttacccaga caaggtggtg atcggcatgg atgtggcagc atctgagttc 720 tatcgcaatg ggaagtacga tcttgacttc aagtcgcctg atgatcccgc acggcacatc 780 actggggaga agctcggaga gctgtataag agctttatca agaactatcc tgtggtctcc 840 atcgaagacc cctttgacca ggatgactgg gccacttgga cctccttcct ctcgggggtg 900 aacatccaga ttgtggggga tgacttgaca gtcaccaacc ccaagaggat tgcccaggcc 960 gttgagaaga aggcctgcaa ctgtctgctg ctgaaggtca accagatcgg ctcggtgacc 1020 gaatcgatcc aggcgtgcaa actggctcag tctaatggct ggggggtgat ggtgagccac 1080 cgctctgggg agactgagga cacattcatt gctgaccttg tggtggggct ctgcacagga 1140 cagatcaaga ctggcgcccc ctgccgctcg gagcgtctgg ccaaatacaa ccaactcatg 1200 aggatcgagg aggctcttgg ggacaaggca atctttgctg gacgcaagtt ccgtaacccg 1260 aaggccaagt gagaagctgg aggctccagg actccactgg acagacccag gtcttccaga 1320 cctgcttcct gaaataaaca ctggtgccaa ccaagaaaaa aaaaa 1365 <210> 11 <211> 391 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Met Gln Lys Ile Phe Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu His Thr Ala Lys Gly Arg Phe Arg 20 25 30 Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Gly Asp Lys Gly Arg Tyr Leu Gly Lys Ala Lys Phe Gly 50 55 60 Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Glu Lys Gly Val Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly 85 90 95 Asn Pro Asp Leu Ile Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly 100 105 110 Gly Ser His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu 115 120 125 Pro Val Gly Ala Ser Ser Phe Lys Glu Ala Met Arg Ile Gly Ala Glu 130 135 140 Val Tyr His His Leu Lys Gly Val Ile Lys Ala Lys Tyr Gly Lys Asp 145 150 155 160 Ala Thr Asn Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu 165 170 175 Asn Asn Glu Ala Leu Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Gln Ala Ala Gly 180 185 190 Tyr Pro Asp Lys Val Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe 195 200 205 Tyr Arg Asn Gly Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Asp Asp Pro 210 215 220 Ala Arg His Ile Thr Gly Glu Lys Leu Gly Glu Leu Tyr Lys Ser Phe 225 230 235 240 Ile Lys Asn Tyr Pro Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp 245 250 255 Asp Trp Ala Thr Trp Thr Ser Phe Leu Ser Gly Val Asn Ile Gln Ile 260 265 270 Val Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg Ile Ala Gln Ala 275 280 285 Val Glu Lys Lys Ala Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile 290 295 300 Gly Ser Val Thr Glu Ser Ile Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Ser Asn 305 310 315 320 Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr 325 330 335 Phe Ile Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr 340 345 350 Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Met 355 360 365 Arg Ile Glu Glu Ala Leu Gly Asp Lys Ala Ile Phe Ala Gly Arg Lys 370 375 380 Phe Arg Asn Pro Lys Ala Lys 385 390

Claims (80)

  1. 치료적으로 효과적인 용량의 Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 근육 세포 전달용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1은 Eno1 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1은 Eno1 핵산 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Eno1 또는 이의 단편을 인코딩(encoding)하는 발현 벡터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 생물학적으로 활성인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1 또는 이의 단편은 정제된 내생(endogenous) 인간 Eno1 폴리펩타이드의 활성의 최소 90%를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1은 인간 Eno1인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미세입자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 나노입자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 인시츄 형성(in situ forming) 조성물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 근육 표적화 잔기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 근육 표적화 잔기는 골격근 표적화 잔기인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 근육 표적화 잔기 및 Eno1 폴리펩타이드는 복합체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 Eno1은 복합체 근육 세포로 전달시 상기 복합체로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 비경구적 투여용으로 제조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 경구용으로 제조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 근육 내 투여, 정맥내 투여, 또는 피하 투여용으로 제조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 혈당을 낮추는 것을 특징으로 하는 상승된 혈당을 가진 피험자의 혈당을 낮추는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 상승된 혈당을 가진 피험자의 혈당을 낮추는 방법.
  22. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계로 포함하고, 이로 인해 피험자의 글루코스 내성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 감소된 글루코스 내성을 가진 피험자의 글루코스 내성을 향상시키는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 감소된 글루코스 내성을 가진 피험자의 글루코스 내성을 향상시키는 방법.
  24. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계로 포함하고, 이로 인해 피험자의 인슐린 반응을 개선하는 것을 특징으로 하는 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성이 있는 피험자에서의 인슐린 반응을 개선하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성이 있는 피험자에서의 인슐린 반응을 개선하는 방법.
  26. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 당뇨병을 치료하는 것을 특징으로 하는 피험자의 당뇨병을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병 또는 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 피험자의 당뇨병을 치료하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 당뇨병은 당뇨병전증 것을 특징으로 하는 피험자의 당뇨병을 치료하는 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피험자의 당뇨병을 치료하는 방법.
  30. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 HbA1c 수치를 낮추는 것을 특징으로 하는 상승된 HbA1c 수치를 가진 환자의 HbA1c 수치를 낮추는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 상승된 HbA1c 수치를 가진 환자의 HbA1c 수치를 낮추는 방법.
  32. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 혈당 수치 제어력을 개선하는 것을 특징으로 하는 비정상적인 혈당 수치 제어력을 가진 피험자의 혈당 수치 제어력을 개선하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 비정상적인 혈당 수치 제어력을 가진 피험자의 혈당 수치 제어력을 개선하는 방법.
  34. 제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제30항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자의 골격근 세포에서의 글루코스 유동이 향상되는 것을 특징으로 하는 비정상적인 혈당 수치 제어력을 가진 피험자의 혈당 수치 제어력을 개선하는 방법.
  35. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 글루코스 유동을 향상시키는 것을 특징으로 하는 피험자의 글루코스 유동을 향상시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피험자의 글루코스 유동을 향상시키는 방법.
  37. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 골격근 세포의 해당 활성 또는 용량을 향상시키는 것을 특징으로 하는 피험자의 골격근 세포의 해당 활성 또는 용량을 향상시키는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피험자의 골격근 세포의 해당 활성 또는 용량을 향상시키는 방법.
  39. Eno1 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로 인해 피험자의 골격근 세포에서의 미토콘드리아의 유리 지방산 산화를 향상시키는 것을 특징으로 하는 피험자의 골격근 세포에서의 미토콘드리아의 유리 지방산 산화를 향상시키는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 피험자에게 투여되는 상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피험자의 골격근 세포에서의 미토콘드리아의 유리 지방산 산화를 향상시키는 방법.
  41. 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1은 비경구적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Eno1은 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 Eno1은 근육 내, 정맥 내, 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제20항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 상승된 혈당, 감소된 글루코스 내성, 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성, 당뇨병, 상승된 HbA1c 수치, 및 비정상적인 혈당 수치 제어력 중 어느 하나 이상의 증상을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제20항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상승된 혈당, 감소된 글루코스 내성, 감소된 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 저항성, 당뇨병, 상승된 HbA1c 수치, 및 비정상적인 혈당 수치 제어력 중 어느 하나 이상의 증상을 갖는 피험자를 선택하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제20항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. (a) 피험자 유래의 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 검출하는 단계, 및 (b) 상기 생물학적 시료의 Eno1 수치를 설정된 한계값과 비교하는 단계를 포함하고, 상기 설정된 한계값보다 낮은 Eno1 수치는 피험자의 혈당이 상승되었음을 지시하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상승된 혈당의 하나 이상의 진단 지표의 수치를 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 상승된 혈당의 하나 이상의 추가적인 진단 지표는 HbA1c, 공복 혈당, 공급 혈당, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 Eno1 수치는 면역학적 검정법 또는 ELISA에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  52. 제47항에 있어서, 상기 단계(a)는 (i) 상기 생물학적 시료를 Eno1과 선택적으로 결합하는 시약과 접촉하는 단계, 및 (ii) 상기 생체지표 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 시약은 Eno1의 적어도 하나의 항원결정부위와 선택적으로 결합하는 항-Eno1 항체인 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  54. 제47항에 있어서, 상기 단계(a)는 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 검출하기 위하여 증폭 반응이 사용되는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 증폭 반응은 (a) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR); (b) 핵산 서열-기반 증폭 분석(nucleic acid sequence-based amplification assay, NASBA); (c) 전사 조절형 증폭(transcription mediated amplification, TMA); (d) 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR); 또는 (e) 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)인 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 Eno1 mRNA 용량을 검출하기 위하여 혼성화 분석을 사용하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 Eno1 mRNA의 일부에 상보적인 올리고핵산염을 상기 Eno1 mRNA 검출을 위한 혼성화 분석에 사용하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  59. 제47항에 있어서, 상기 피험자에서의 상승된 혈당은 제2형 당뇨병, 당뇨병전증, 임신성 당뇨병, 및 제1형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 병태의 특징인 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  60. 제47항 및 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 혈당 상승이 확인될 때, 상기 피험자에게 치료적 섭생을 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 치료적 섭생은 약물치료 및 행동치료, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 약물치료는 (a) 메글리티나이드(meglitinide), (b) 설포닐우레아(sulfonylurea), (c) 디펩티딜 펩티다아제-4(dipeptidy peptidase-4, DPP-4) 저해제, (d) 비구아니드(biguanide), (e) 치아졸리딘디온(thiazolidinediones), (f) 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase) 저해제, (g) 아밀린 모사체(amylin mimetic); (h) 인크레틴 모사체(incretin mimetics); (i) 인슐린; 및 (j) 이들의 어떤 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 의한 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  62. 제47항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 혈당 상승이 의심되거나 혈당 상승 위험이 의심되는 피험자를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  63. 제47항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 혈당 상승이 의심되거나 혈당 상승 위험이 의심되는 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  64. 제47항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료의 하나 이상의 상승된 혈당과 관련된 지표들의 수치를 상기 생물학적 시료보다 이전 시점에서 동일한 피험자로부터 수득된 시료, 정상 혈당을 가진 피험자 유래의 시료, 당뇨병전증이 있는 피험자 유래의 시료, 제2형 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료, 임신성 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료, 및 제1형 당뇨병이 있는 피험자 유래의 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 대조 시료의 하나 이상의 상승된 혈당과 관련된 지표들의 수치를 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자의 상승된 혈당 수치를 진단하는 방법.
  65. (1) 혈당이 상승된 피험자 유래인 첫번째로 수득된 제1 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 결정하는 단계;
    (2) 상기 피험자로부터 두번째로 수득된 제2 생물학적 시료에서 Eno1 수치를 결정하는 단계; 및
    (3) 상기 제2 시료의 Eno1 수치를 상기 제1 시료의 Eno1 수치와 비교하는 단계;를 포함하고,
    상기 두번째 수득은 상기 첫번째 수득보다 이후에 이루어지고, 상기 Eno1 수치에서의 변화는 상기 피험자의 상승된 혈당 상태에서의 변화를 나타내는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 단계(1) 및 (2)는 HbA1c 수치, 공복 글루코스 수치, 공급 글루코스 수치, 및 글루코스 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당의 하나 이상의 추가적인 치료들의 수치를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 피험자는 제2 시료의 수득 전에 혈당 상승용 약제로 치료되는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  68. 제65항에 있어서, 제1 생물학적 시료와 비교하여 제2 생물학적 시료에서의 감소된 Eno1 수치는 상기 피험자에서의 혈당 상승을 나타내는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  69. 제65항에 있어서, 제1 생물학적 시료와 비교하여 제2 생물학적 시료에서의 향상되거나 동일한 Eno1 수치는 상기 피험자의 혈당 정상화를 나타내는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자의 혈당 수치를 바탕으로 하여 상기 피험자에 대한 상이한 치료섭생을 선택하고 및/또는 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 치료 섭생은 약물치료 및 행동수정치료(behavioral modification therapy) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 약물치료는 (a) 메글리티나이드,(b) 설포닐우레아, (c) 디펩티딜 펩티다아제-4(DPP-4) 저해제, (d) 비구아니드, (e) 치아졸리딘디온, (f) 알파-글루코시다아제 저해제, (g) 아밀린 모사체; (h) 인크레틴 모사체; (i) 인슐린; 및 (j) 이들의 어떤 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 의한 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 피험자에서의 혈당 상승을 모니터링하는 방법.
  73. (a) 생물학적 시료 내 Eno1 수치를 측정하기 위한 적어도 하나의 시약;
    (b) 상기 생물학적 시료 내 Eno1 수치를 측정하기 위한 한 세트의 사용 설명서; 및
    (c) 상기 생물학적 시료 내 혈당 수치를 결정하기 위한 한 세트의 사용 설명서;를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 Eno1 탐지용 키트.
  74. 제73항에 있어서, 상기 생물학적 시료의 HbA1c 수치 측정용인 적어도 하나 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 Eno1 탐지용 키트.
  75. 제73항 및 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 채취된 상기 피험자의 HbA1c 수치, 공급 혈당 수치, 공복 혈당 수치, 및 글루코스 내성 중 적어도 하나를 측정하기 위한 사용설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 Eno1 탐지용 키트.
  76. 혈당상승 검출법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판(a panel of reagents).
  77. 혈당 상승을 치료하는 방법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판.
  78. 혈당 상승 치료를 모니터링하는 방법에 사용되고, Eno1 및 HbA1c용 검출 시약들을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약판.
  79. 제76항에 따른 상기 시약판 및 상승된 혈당의 하나 이상의 지표들의 수치에 관한 진단 정보를 제공하는 한 세트의 사용 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  80. 혈당 상승을 진단 및/또는 치료하는 방법에서 상승된 혈당의 표지물들을 검출하는데 특이적인 복수의 검출 시약들을 포함하는 패널의 용도에 관한 것으로, 상기 패널의 적어도 하나 검출 시약은 Eno1의 검출에 특이적이고, 나머지 하나 이상의 검출 시약은 HbA1c 및 글루코스로 이루어진 군으로부터 선택되는 상승된 혈당 표지물의 지표를 검출하는데 특이적인 것을 특징으로 하는 패널의 용도.
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