KR20160105922A - 간성뇌증 치료용 스테로이드 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간성뇌증의 치료에 사용하기 위한 스테로이드 화합물인 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
Description
본 발명은 간성뇌증 치료용 스테로이드 화합물에 관한 것이다.
간성뇌증(HE)은 급성 및 만성 간 질환에서 심각한 신경정신(neuropsychiatric) 및 신경인지 합병증이다. HE는 만성 간 질환의 크고 증가하는 유병률 때문에 중요하고 증가하는 건강관리 문제이다. HE는 수면-각성 주기, 인지, 기억, 학습, 운동 협응, 의식, 감소하는 에너지 수준 및 성격의 변화로 특징되고, 최소한의 HE(MHE)로부터 명백한 HE(OHE)에 이른다. MHE는 인지 손상으로 나타나고 건강 관련 삶의 질 및 운전과 같은 복잡한 일을 수행하는 능력에 악영향을 미친다. 또한, OHE는 임상적으로 정신 및 운동 장애로 나타나고 증상은 진정제 투여 및 혼수상태(coma)를 통한 방향감각상실의 범위로 나타난다.
자연적으로 발생하는 스테로이드는 강력한 물질대사의 대상이 될 수 있으며 일반적으로 경구 투여에 적합하지 않다. 내인성 스테로이드 호르몬인 프레그네놀론(pregnenolone), 프로게스테론, 데옥시코르디코스테론, 코티손 및 코티솔, 테스토스테론의 대사산물뿐만 아니라 프레그네놀론으로 알려진, 안드로스텐디온 및 디하이드로에피안드로스테론의 대사 산물은 다양한 연구의 대상이 되어왔고, 적어도 부분적으로 포유동물에서 신경학적인 신호체계에서 그들의 역할이 알려져 있다. 스테로이드 대사산물은 CNS 증상 및 장애를 유도하고 스테로이드는 감마-아미노뷰티르산 수용체-염화 이온운반체(inonphore) (GABAA-R) 복합체에서 양성 조절자로 역할을 하므로 GABAA 수용체 조절 스테로이드(GAMS)로 불린다.
특정 스테로이드는 특정 GABAA 수용체 인핸서로 밝혀졌다. 이러한 스테로이드의 예는 그중에서도(inter alia ) WO 2008/063128에 개시되어 있다. 이들 스테로이드의 일부는 강력하고 예를들어, 약학적 투여량에서 기억상실증(amnesia), 진정 및 마취를 유도하는 능력을 갖는 것으로 나타났다. WO 99/45931 및 WO 03/059357은 스테로이드의 길항작용을 개시하고 있다. Wang 등. 2000(Acta Physiol Scand 169, 333-341) 및 Wang 등. 2002 (J Neurosci 22(9):3366-75)는 3β-OH-5α-프레그난-20-온 및 다른 3β-OH-5α/β 프레그난 스테로이드의 길항작용 효과를 개시하고 있다. WO2006/056794 및 WO2010/144498은 간기능부전, 간성뇌증 및 문맥성 고혈압(portal hypertension)의 치료를 위한 화합물의 이용을 개시하고 있다. 간성뇌증 및 관련 질병에 대한 신규하고 효과적인 치료를 제공할 필요가 있다.
본 발명은 간성뇌증(hepatic encephaloathy) 치료용 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime)은 GABAA 수용체 조절 스테로이드 길항제(GAMSAs)로 알려진 화합물의 부류에 속한다.
본 발명자들은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime)이 알로프레그난올론(allopregnanolone) 및 테트라하이드록시코르티코스테론(tetrahydrodeoxycorticosterone, THDOC)과 같은 내인성 스테로이드에 의해 GABAA 수용체의 양성 조절을 선택적으로 억제할 수 있음을 밝혀내었다. 이러한 스테로이드는 진정, 인지 장애 및 운동 장애를 유발하는 것으로 알려져 있으며, 뇌에서 이들의 농도는 간 질환-유발 고암모니아혈증(hyperammonemia) 및 HE(간성뇌증)를 앓는 환자들에서 증가한다.
그러나, 본 발명자들은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 GABAA 수용체에서 감마-아미노뷰티르산(GABA)의 작용에 대한 길항작용을 가지지 않는 것을 밝혀내었다. 이러한 놀라운 선택성은 경련을 포함하는 부작용을 초래할 수 있는 GABAA 수용체에 결합하는 GABA의 억제로써 안전성 관점에서 이점이 있다.
또한, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 α1 및 β5 GABAA 수용체 아형의 모두에서 작용하고 운동 및 인지 손상 모두에 긍정적인 효과, 및 진정 효과를 나타낼 수 있고, GABAA 수용체의 과-활성화를 야기한다. 운동 및 인지 손상에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 긍적적인 효과는 HE(하기(vide infra) 쥐에서 간성뇌증 및 문맥대정맥의 문합)의 두 동물 모델에서 설명하고 있다.
HE의 존재하는 치료법과는 달리, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 생체 내 암모니아 수준에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 치료에서 보완적인 용도의 가능성이 있다는 것이 명백하다.
따라서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 특히 HE 및 관련 질병의 치료에 매우 적합하다는 것을 믿을만한 좋은 근거이다.
도 1은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime)이 혈중 아미노산 농도에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 값은 그룹 당 12 래트의 평균±SEM이고, 대조군으로부터 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다; ***, p< 0.001. CV=비히클(vehicle)을 투여한 대조군 래트; HAV=비히클을 투여한 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심을 투여한 고암모니아혈증 래트.
도 2는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 방사형 미로에서 고암모니아혈증 래트의 공간 학습을 복원하는 것을 나타낸다. 상기 도는 방사형 테스트에서 작업 오류를 보여준다. 블록 1에서 작업 오류. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. # P < 0.05 대 HAV. CV=비히클을 투여한 대조군 래트; HAV=비히클을 투여한 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심으로 투여된 고암모니아 혈증 래트.
도 3은 모리스 수중 미로 테스트에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 고암모니아혈증 래트의 특별한 기억을 복원하는 것을 나타낸다. 상기 도는 3일차 첫 시도에서 플랫폼을 찾는 시간을 나타낸다. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. HAV 대 CV p=0.052. CV=비히클로 투여된 대조군 래트; HAV=비히클로 투여된 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심으로 투여된 고암모니아혈증 래트.
도 4는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 고암모니아혈증 래트의 운동 협응을 복원하는 것을 나타낸다. 값은 그룹 당 15 래트의 평균±SEM이다. CV값과 현저하게 다른 값은 *으로 나타내고, p<0.05, HAV와 현저하게 다른 값은 ###으로 나타낸다, p<0.001. CV=비히클로 투여된 대조군 래트; HAV=비히클로 투여된 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심으로 투여된 고암모니아혈증 래트.
도 5는 전체 혈장 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도를 나타낸다. 5일차 및 매일 주사 치료의 마지막주 동안 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 피하 주사 후 4 및 23 시간 후의 대조군 및 고암모니아혈증 래트에서 전체 혈장 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도. HA=고암모니아혈증 동물.
도 6은 20 mg/kg의 매일의 주사 7주 후에 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 피하 주사 1-2 시간 후의 대조군 및 고암모니아혈증 래트에서 비결합(unbound)* 뇌 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도를 제공한다.
*비결합 뇌 농도 = 캐리어 단백질 또는 뇌 조직에 결합되지 않은 뇌에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 분획(fraction)
도 7은 α1β2γ2L GABAA 수용체의 테트라하이드록시코르티코스테론(THDOC) 강화된 활성을 나타내는 대표적인 전기생리적인 측정을 제공한다. 인간 α1β2γ2L GABAA 수용체를 발현하는 HEK-293 세포는 30 μM GABA 또는 30 μM GABA 플러스 100 nM THDOC에 40 ms 동안 노출시켰다. THDOC+GABA의 적용 전에 THDOC로 20초간 전배양하였다.
도 8은 α1β2γ2L 및 α5β3γ2L GABAA 수용체의 THDOC 강화된 활성 및 GABA의 무억제의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온(GAMSA) 길항작용을 나타내는 대표적인 전기생리적인 측정을 제공한다. A) α1β2γ2L GABAA 수용체와 함께 30 μM GABA의 100 nM THDOC 강화된 활성의 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 길항작용, B) 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 α1β2γ2L GABAA 수용체의 30 μM GABA 활성을 길항하지 않는다. C) α5β3γ2L GABAA 수용체와 0.3 μM GABA의 200 nM THDOC 강화된 활성의 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 길항작용; THDOC의 효과의 길항작용을 나타낸다, D) 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 α5β3γ2L GABAA 수용체의 0.3 μM GABA 활성을 길항하지 않는다.
도 9는 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 운동 협응을 복원하기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 운동 협응은 평균대 걷기(bean walking) 테스트를 사용하여 평가하였다. (A) 대조군(CV) 또는 비히클을 투여한 고암모니아혈증(HAV) 래트 및 3(HA3), 10(HA10) 또는 20(HA20) mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 투여한 고암모니아혈증 래트의 데이터를 나타낸다. (B)는 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클을 투여한 PCS 래트 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7 (PCS0.7) 또는 2.5 (PCS2.5) mg/kg으로 투여한 PCS 래트의 데이터를 나타낸다. 값은 각 바에서 나타나는 래트의 수의 평균±SEM이다. 대조군 또는 샴(sham) 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다. 고암모니아혈증 또는 비히클을 투여한 PCS 래트과 현저하게 다른 값은 "a"로 나타내었다 * p< 0.05; a p< 0.05; aa p< 0.01; aaa p< 0.001.
도 10은 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 모리스 수중 미로에서 공간 기억을 복원하기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 모리스 수중 미로에서 공간 학습 기억은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 3(HA3), 10(HA10) 또는 20(HA20) mg/kg를 투여한 고암모니아혈증 래트에 대해 대조군(CV) 또는 비히클을 투여한 고암모니아혈증(HAV) 래트에서 평가했고(A, B) 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7(PCS0.7) 또는 2.5(PCS2.5) mg/kg로 투여된 PCS 래트에 대해 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클을 투여한 PCS 래트에서 평가했다(C, D). (A, C) 다른 세션 동안 플랫폼을 도달하기 위한 탈출 잠재기(초 단위) (B, D) 기억 테스트 동안 정확한 사분면에서 시간 소요(%). 값은 각 바에서 나타나는 래트들의 평균±SEM이다. 대조군 또는 샴-래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다. 고암모니아혈증 또는 비히클을 투여한 PCS 래트와 현저하게 다른 값은 "a"로 나타내었다 * p< 0.05; a p< 0.05.
도 11은 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 방사형 미로에서 공간 기억을 복원하기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 방사형 미로에서 공간 학습은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 3(HA3), 10(HA10) 또는 20(HA20) mg/kg을 투여한 고암모니아혈증 래트에 대해 대조군(CV) 또는 비히클을 투여한 고암모니아혈증(HAV) 래트에서 평가했고(A, B) 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7(PCS0.7) 또는 2.5(PCS2.5) mg/kg로 투여된 PCS 래트에 대해 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클 투여한 PCS 래트에서 평가했다(C, D). (A, C) 다른 세션 동안 작동 에러. (B, D) 1-2일 동안 작동 에러. 값은 각 바에서 나타나는 래트들의 평균±SEM이다. 대조군 또는 샴 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다. 고암모니아혈증 또는 비히클로 처리한 PCS 래트와 현저하게 다른 값은 "a"로 나타내었다 * p< 0.05; a p< 0.05; aa p>0.01.
도 12는 밤동안 자발적인 운동활성을 증가시키고 PCS 래트의 활동일주기(circadian rhythm)를 부분적으로 복원시키기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 운동 활성은 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클 또는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7(PCS0.7) 또는 2.5(PCS2.5) mg/kg로 투여한 PCS 래트에서 평가했다. 각 시간 동안 운동 활성은 A에 나타내었다; 밤과 낮 동안의 활성 비율은 B에 나타내었고 낮 또는 밤 동안 전체 활동은 C에 나타내었다. 빛은 7:00 pm에 꺼졌다. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. SM 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다;* p<0.05, ** p<0.001. PCS 래트와 현저하게 다른 값은 a로 나타내었다 a p<0.05.
도 13은 낮 동안 수직 활성을 정상화시키고 PCS 래트의 활동일주기를 부분적으로 복원시키기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명했다. 실험은 도 12에서 기술된 바와 같이 수행하나 수직값을 나타내었다. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. SM 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다;* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. PCS 래트와 현저하게 다른 값은 a로 나타내었다 a p<0.05; aa p<0.01.
도 14는 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 행동 테스트에서 혈장 및 뇌에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 노출을 나타낸다. A) 고암모니아혈증 래트 및 B) PCS 래트에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 전체 혈장 농도는 μM로 나타내었다. C) 고암모니아혈증 래트 및 D) PCS 래트에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 비결합 뇌 농도는 nmol/kg로 나타내었다. 사용된 투여량, 3, 10 및 20 mg/kg/day의 고암모니아혈증 래트 및 0.7 및 2.5 mg/kg/day의 PCS 래트와 같은 상이한 래트 모델에서 유사한 노출에 주의하라. 데이터는 연구 끝에 얻은 것이고, 즉, 매일 한 번씩 피하로 참깨 오일에서의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 매일 투여하고 9주 후에 수득하였다.
도 2는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 방사형 미로에서 고암모니아혈증 래트의 공간 학습을 복원하는 것을 나타낸다. 상기 도는 방사형 테스트에서 작업 오류를 보여준다. 블록 1에서 작업 오류. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. # P < 0.05 대 HAV. CV=비히클을 투여한 대조군 래트; HAV=비히클을 투여한 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심으로 투여된 고암모니아 혈증 래트.
도 3은 모리스 수중 미로 테스트에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 고암모니아혈증 래트의 특별한 기억을 복원하는 것을 나타낸다. 상기 도는 3일차 첫 시도에서 플랫폼을 찾는 시간을 나타낸다. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. HAV 대 CV p=0.052. CV=비히클로 투여된 대조군 래트; HAV=비히클로 투여된 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심으로 투여된 고암모니아혈증 래트.
도 4는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 고암모니아혈증 래트의 운동 협응을 복원하는 것을 나타낸다. 값은 그룹 당 15 래트의 평균±SEM이다. CV값과 현저하게 다른 값은 *으로 나타내고, p<0.05, HAV와 현저하게 다른 값은 ###으로 나타낸다, p<0.001. CV=비히클로 투여된 대조군 래트; HAV=비히클로 투여된 고암모니아혈증 래트; HA+GAM=3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심으로 투여된 고암모니아혈증 래트.
도 5는 전체 혈장 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도를 나타낸다. 5일차 및 매일 주사 치료의 마지막주 동안 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 피하 주사 후 4 및 23 시간 후의 대조군 및 고암모니아혈증 래트에서 전체 혈장 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도. HA=고암모니아혈증 동물.
도 6은 20 mg/kg의 매일의 주사 7주 후에 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 피하 주사 1-2 시간 후의 대조군 및 고암모니아혈증 래트에서 비결합(unbound)* 뇌 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도를 제공한다.
*비결합 뇌 농도 = 캐리어 단백질 또는 뇌 조직에 결합되지 않은 뇌에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 분획(fraction)
도 7은 α1β2γ2L GABAA 수용체의 테트라하이드록시코르티코스테론(THDOC) 강화된 활성을 나타내는 대표적인 전기생리적인 측정을 제공한다. 인간 α1β2γ2L GABAA 수용체를 발현하는 HEK-293 세포는 30 μM GABA 또는 30 μM GABA 플러스 100 nM THDOC에 40 ms 동안 노출시켰다. THDOC+GABA의 적용 전에 THDOC로 20초간 전배양하였다.
도 8은 α1β2γ2L 및 α5β3γ2L GABAA 수용체의 THDOC 강화된 활성 및 GABA의 무억제의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온(GAMSA) 길항작용을 나타내는 대표적인 전기생리적인 측정을 제공한다. A) α1β2γ2L GABAA 수용체와 함께 30 μM GABA의 100 nM THDOC 강화된 활성의 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 길항작용, B) 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 α1β2γ2L GABAA 수용체의 30 μM GABA 활성을 길항하지 않는다. C) α5β3γ2L GABAA 수용체와 0.3 μM GABA의 200 nM THDOC 강화된 활성의 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 길항작용; THDOC의 효과의 길항작용을 나타낸다, D) 1 μM 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 α5β3γ2L GABAA 수용체의 0.3 μM GABA 활성을 길항하지 않는다.
도 9는 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 운동 협응을 복원하기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 운동 협응은 평균대 걷기(bean walking) 테스트를 사용하여 평가하였다. (A) 대조군(CV) 또는 비히클을 투여한 고암모니아혈증(HAV) 래트 및 3(HA3), 10(HA10) 또는 20(HA20) mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 투여한 고암모니아혈증 래트의 데이터를 나타낸다. (B)는 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클을 투여한 PCS 래트 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7 (PCS0.7) 또는 2.5 (PCS2.5) mg/kg으로 투여한 PCS 래트의 데이터를 나타낸다. 값은 각 바에서 나타나는 래트의 수의 평균±SEM이다. 대조군 또는 샴(sham) 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다. 고암모니아혈증 또는 비히클을 투여한 PCS 래트과 현저하게 다른 값은 "a"로 나타내었다 * p< 0.05; a p< 0.05; aa p< 0.01; aaa p< 0.001.
도 10은 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 모리스 수중 미로에서 공간 기억을 복원하기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 모리스 수중 미로에서 공간 학습 기억은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 3(HA3), 10(HA10) 또는 20(HA20) mg/kg를 투여한 고암모니아혈증 래트에 대해 대조군(CV) 또는 비히클을 투여한 고암모니아혈증(HAV) 래트에서 평가했고(A, B) 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7(PCS0.7) 또는 2.5(PCS2.5) mg/kg로 투여된 PCS 래트에 대해 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클을 투여한 PCS 래트에서 평가했다(C, D). (A, C) 다른 세션 동안 플랫폼을 도달하기 위한 탈출 잠재기(초 단위) (B, D) 기억 테스트 동안 정확한 사분면에서 시간 소요(%). 값은 각 바에서 나타나는 래트들의 평균±SEM이다. 대조군 또는 샴-래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다. 고암모니아혈증 또는 비히클을 투여한 PCS 래트와 현저하게 다른 값은 "a"로 나타내었다 * p< 0.05; a p< 0.05.
도 11은 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 방사형 미로에서 공간 기억을 복원하기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 방사형 미로에서 공간 학습은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 3(HA3), 10(HA10) 또는 20(HA20) mg/kg을 투여한 고암모니아혈증 래트에 대해 대조군(CV) 또는 비히클을 투여한 고암모니아혈증(HAV) 래트에서 평가했고(A, B) 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7(PCS0.7) 또는 2.5(PCS2.5) mg/kg로 투여된 PCS 래트에 대해 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클 투여한 PCS 래트에서 평가했다(C, D). (A, C) 다른 세션 동안 작동 에러. (B, D) 1-2일 동안 작동 에러. 값은 각 바에서 나타나는 래트들의 평균±SEM이다. 대조군 또는 샴 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다. 고암모니아혈증 또는 비히클로 처리한 PCS 래트와 현저하게 다른 값은 "a"로 나타내었다 * p< 0.05; a p< 0.05; aa p>0.01.
도 12는 밤동안 자발적인 운동활성을 증가시키고 PCS 래트의 활동일주기(circadian rhythm)를 부분적으로 복원시키기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명한다. 운동 활성은 샴-수술한 대조군(SM) 또는 비히클 또는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7(PCS0.7) 또는 2.5(PCS2.5) mg/kg로 투여한 PCS 래트에서 평가했다. 각 시간 동안 운동 활성은 A에 나타내었다; 밤과 낮 동안의 활성 비율은 B에 나타내었고 낮 또는 밤 동안 전체 활동은 C에 나타내었다. 빛은 7:00 pm에 꺼졌다. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. SM 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다;* p<0.05, ** p<0.001. PCS 래트와 현저하게 다른 값은 a로 나타내었다 a p<0.05.
도 13은 낮 동안 수직 활성을 정상화시키고 PCS 래트의 활동일주기를 부분적으로 복원시키기 위한 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 능력을 설명했다. 실험은 도 12에서 기술된 바와 같이 수행하나 수직값을 나타내었다. 값은 그룹 당 8 래트의 평균±SEM이다. SM 래트와 현저하게 다른 값은 별표로 나타내었다;* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. PCS 래트와 현저하게 다른 값은 a로 나타내었다 a p<0.05; aa p<0.01.
도 14는 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 행동 테스트에서 혈장 및 뇌에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 노출을 나타낸다. A) 고암모니아혈증 래트 및 B) PCS 래트에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 전체 혈장 농도는 μM로 나타내었다. C) 고암모니아혈증 래트 및 D) PCS 래트에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 비결합 뇌 농도는 nmol/kg로 나타내었다. 사용된 투여량, 3, 10 및 20 mg/kg/day의 고암모니아혈증 래트 및 0.7 및 2.5 mg/kg/day의 PCS 래트와 같은 상이한 래트 모델에서 유사한 노출에 주의하라. 데이터는 연구 끝에 얻은 것이고, 즉, 매일 한 번씩 피하로 참깨 오일에서의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 매일 투여하고 9주 후에 수득하였다.
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위해 사용되며, 이로 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 것과 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 가장 넓은 의미로 사용되며, 적어도 하나의 활성 성분 및 임의의 담체, 보조제, 희석제, 구성성분 등을 포함하는 모든 약학적으로 적용가능한 조성물을 포함한다.
용어 "투여 경로"뿐 아니라 "투여" 및 "투여의 방식(mode)"은 또한 가장 넓은 의미로 사용된다.
본 발명에 따라 사용되는 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime)은 주로 투여의 국소(local), 국부(topical) 또는 전신 방식으로 치료되는 간성뇌증의 상태에 가장 적합한지 여부에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 이러한 상이한 투여 방식은 예를들어 국부(예로, 피부), 국소(안구와 다양한 점막인 예를들어, 질 및 직장 투여를 포함), 경구, 비경구 또는 상부 및 하부 기도를 포함하는 폐이다. 이러한 조성물 및 제제의 제조는 일반적으로 약학 및 제조 분야의 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명의 조성물의 제형에 적용될 수 있다.
용어 "길항제(antagonist)"는 다른 물질, 작용제(agonist)가 그 효과를 유도하는 것을 저해하는 물질이다. 본 명세서에서, 용어 길항제와 차단기(blocker)는 교차사용된다.
용어 "유형 A 간성뇌증"은 일반적으로 급성 간 부전과 관련된 간성뇌증을 의미하며, 일반적으로 뇌 부종과 관련되어 있다.
용어 "유형 B 간성뇌증"은 일반적으로 관련 고유 간 질환 없이 간문맥 단락(portal systemic shuntting)에 의해 야기되는 간성뇌증(바이패스)을 의미한다.
용어 "유형 C 간성뇌증"은 일반적으로 간경변 환자에서 발생하는 간성뇌증을 의미한다 - 이 유형은 에피소드적, 지속적 및 최소증상 뇌증으로 세분화된다.
용어 "최소증상(minimal) 간성뇌증"은 일반적으로 임상적으로 명백한 인지 기능장애를 야기하지 않지만, 신경 심리학적 연구로 입증할 수 있는 간성뇌증을 의미한다.
용어 "명백한(overt) 간성뇌증"은 일반적으로 넓은 범위의 정신 및 운동 장애를 가진 신경정신학적 증상으로 나타나는 임상적으로 명백한 간성뇌증을 의미한다. 명백한 간성뇌증은 여러 시간 또는 여러 날 동안 이전에 안정했던 환자 또는 지속적으로 신경정신학적으로 이상이 있던 환자에게서 에피소드적으로 발생할 수 있다.
용어 "고암모니아혈증"은 일반적으로 과량의 혈중 암모니아로 특징되는 대사성 장애를 의미한다.
용어 "간 이식"은 일반적으로 예를들어 급성 간부전 또는 간경화에 의해 병든 간을 제거하고, 이를 기증자의 건강한 간으로 교체하는 수술 과정을 의미한다. 대부분의 간 이식 수술은 사망한 기증자의 간을 사용하지만 간은 또한 살아있는 기증자(건강한 사람의 간의 일부)로부터 받아올 수 있다. 예를들어 간경변을 앓는 환자는 일반적으로 간성뇌증을 겪고 수술 전의 간성뇌증은 이식 후 신경학적 합병증의 중요한 예측인자이다.
용어 "급-만성 간부전"은 일반적으로 간경변의 급성 대상부전(decompensation), 적어도 하나의 장기 부전을 의미하거나 높은 단기 사망률을 가진 하위집단에 속한다.
용어 "대상성 간경변(compensated cirrhosis)"은 일반적으로 어떤 임상적인 증거가 없는 간경변을 의미하나 점근 식도(asymptotic esophageal) 또는 위 정맥류, 및 피로 및 에너지 손상, 식욕감퇴 및 체중 감소, 구토 또는 복통과 같은 초기 증상을 포함한다.
용어 "비대상성 간경변(decompensated cirrhosis)"은 일반적으로 황달, 복수, 부종, 간성뇌증, 위장관 출혈, 문맥성 고혈압, 세균 감염 또는 임의의 합병증과 같은 임상적인 증거 범위를 갖는 후기 간경변을 의미한다.
용어 "문맥성 고혈압(portal hypertension)"은 일반적으로 관련 간내문맥정맥 단락술(transjugular intrahepatic portosystemic shunt; TIPS)을 동반하는 또는 동반하지 않는 간경변을 수반하는 간 정맥압 구배를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 일반적으로 질병 또는 장애 간성뇌증이 발생하는 것을 예방하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "완화"는 일반적으로 질병 또는 장애 간성뇌증의 감소 또는 이로부터의 해방(freedom)을 의미한다.
간성뇌증을 앓고 있는 환자는 이에 제한되지 않지만, 수면-각성 주기, 인식, 기억, 학습, 운동 협응, 인지, 감소된 에너지 수준 및 성격 변화, 인지 손상, 방향감각상실 및 혼수상태(coma)를 포함하는 증상들을 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이 간성뇌증의 치료에 사용될 수 있음을 보여주었다.
본 발명의 제1양태에서, 간성뇌증 치료용 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명의 일구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 A 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 B 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 C 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 최소증상 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 명백한 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증에 사용되는 화합물은 급성 간부전 환자에 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증에 사용되는 화합물은 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성적 간 질환 환자에 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 유형 A 간성뇌증, 유형 B 간성뇌증, 유형 C 간성뇌증, 최소증상 간성뇌증, 명백한 간성뇌증과 같은 간성뇌증의 예방 또는 완화를 위해 급성 간부전 환자, 또는 급-만성 간부전을 동반하거나 또는 동반하지 않는 만성 간 질환 환자에 사용된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 간 이식 전에, 동안에 또는 후에 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 간성뇌증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학적 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 간성뇌증의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 A 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 B 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 C 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 최소증상 간성뇌증이다.
본 발명의 도 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 명백한 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 환자는 급성 간부전을 앓고 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 환자는 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환을 앓고 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 간이식 전에, 동안에, 또는 후에 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학적 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 간성뇌증을 예방 또는 완화하는 방법을 제공한다. 상기 간성뇌증은 유형 A 간성뇌증, 유형 B 간성뇌증, 유형 C 간성뇌증, 최소증상 간성뇌증 또는 명백한 간성뇌증일 수 있다. 또한, 상기 예방은 급성 간부전 환자 또는 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간질환 환자에 적용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 문맥성 고혈압 치료용 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 용도는 또한 문맥성 고혈압의 예방 또는 완화일 수 있다. 문맥성 고혈압 환자는 일반적으로 만성적인 간 질환, 간경변 또는 급성 간부전과 같은 간 질환을 앓는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학적 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 문맥성 고혈압의 치료방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 문맥성 고혈압의 예방 또는 완화에 사용될 수 있다. 문맥성 고혈압 환자는 일반적으로 만성적인 간 질환, 간경변 또는 급성 간부전과 같은 간 질환을 앓는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 간 대상부전(decompensation) 치료용 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 용도는 또한 간 대상부전의 예방 또는 완화일 수 있다. 간 대상부전 환자는 일반적으로 만성 간 질환과 같은 간 질환을 앓거나 위장관 출혈, 감염, 간문맥 혈전증 또는 탈수와 같은 촉발성 증상(precipitating event)을 갖는 것으로 의심될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능상 염을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 간 대상부전의 치료방법을 제공한다. 간 대상부전 환자는 일반적으로 만성 간질환과 같은 간 질환을 앓거나 위장관 출혈, 감염, 간문맥 혈전증 또는 탈수와 같은 촉발성 증상(precipitating event)을 갖는 것으로 의심될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 간성뇌증 치료용 약제를 제조하기 위한 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 A 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 B 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 유형 C 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 최소증상 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간성뇌증은 명백한 간성뇌증이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 용도는 상기 간성뇌증은 급성 간부전 환자를 치료하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 용도는 상기 간성뇌증은 급-만성 간부전을 동반하는 또는 동반하지 않는 만성 간질환 환자를 치료하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 사용은 간 이식 전에, 동안에 또는 후에 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약제의 제조에서 상기 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도는 급성 간부전 환자 또는 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환 환자에서 유형 A 간성뇌증, 유형 B 간성뇌증, 유형 C 간성뇌증, 최소증상 간성뇌증, 명백한 간성뇌증과 같은 간성뇌증을 예방 또는 완화하기 위한 것이다.
이 양태의 또 다른 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 간성뇌증 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 용도는 또한 간성뇌증의 예방 또는 완화에 있다.
본 발명의 추가적인 양태에서, 고암모니아혈증에 의한 증상의 억제 또는 치료용 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명의 추가적인 구현예는 급성 간부전 환자 또는 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환 환자에게서 유형 A 간성뇌증, 유형 B 간성뇌증, 유형 C 간성뇌증, 최소증상 간성뇌증, 명백한 간성뇌증과 같은 간성뇌증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이다; 상기 치료 또는 예방은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 리팍시민(rifaximin), 락툴로스(lactulose), 오르니틴 아세트산페닐(ornithine phenylacetate) 및 글리세롤 페닐 낙산염(glycerol phenyl butyrate)과 같은 암모니아 저하 화합물의 공동투여(co-administeration)를 포함하며, 바람직하게는 암모니아 저하 화합물은 리팍시민 또는 락툴로스이고, 가장 바람직하게는 암모니아 저하 화합물은 리팍시민이다.
본 발명의 추가적인 구현예는 급성 간부전 또는 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환 환자에서 유형 A 간성뇌증, 유형 B 간성뇌증, 유형 C 간성뇌증, 최소증상 간성뇌증, 명백한 간성뇌증과 같은 간성뇌증의, 치료 또는 예방 방법이다; 상기 치료 또는 예방은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 리팍시민(rifaximin), 락툴로스(lactulose), 오르니틴 아세트산페닐(ornithine phenylacetate) 및 글리세롤 페닐 낙산염(glycerol phenyl butyrate)과 같은 암모니아 저하 화합물의 공동투여(co-administeration)를 포함하며, 바람직하게 암모니아 저하 화합물은 리팍시민 또는 락툴로스이고, 가장 바람직하게 암모니아 저하 화합물은 리팍시민이다.
본 발명의 추가적인 구현예는 급성 간부전 환자 또는 급-만성 간부전을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환 환자에서 유형 A 간성뇌증, 유형 B 간성뇌증, 유형 C 간성뇌증, 최소증상 간성뇌증, 명백한 간성뇌증과 같은 간성뇌증의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 용도이다; 상기 치료 또는 예방은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 리팍시민(rifaximin), 락툴로스(lactulose), 오르니틴 아세트산페닐(ornithine phenylacetate) 및 글리세롤 페닐 낙산염(glycerol phenyl butyrate)과 같은 암모니아 저하 화합물의 공동투여(co-administeration)를 포함하며, 바람직하게는 암모니아 저하 화합물은 리팍시민 또는 락툴로스이고, 가장 바람직하게는 암모니아 저하 화합물은 리팍시민이다.
본 발명의 추가적인 양태는 최소증상 간성뇌증 또는 명백한 간성뇌증과 같은 간성뇌증의 치료에 사용하기 위하여 각각의 가능한 치환부위에서 하나 이상의 수소원자가 중수소 또는 삼중수소로 치환될 수 있는 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이다.
본 발명의 추가적인 양태는 조직 또는 체액(fluid)에서 화합물의 농도를 결정하는 것을 포함하는 분석에 사용하기 위하여 각각의 가능한 치환부위에서 하나 이상의 수소원자가 중수소 또는 삼중수소로 치환될 수 있는 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심이다.
본 발명에 따르면, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 다음 중 하나의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다: 정맥주사로, 비강으로, 직장으로, 구강으로(bucally), 질내로, 경피로, 근육내 및 경구로. 일 구현예에 따르면, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 정맥 내로 투여된다. 또 다른 구현예에 따르면, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 비강으로 투여된다. 크림, 겔, 연고 또는 지효성(slow release) 접착 의약 패치 형태로 제형화된 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심을 이용한 피부 투여는 비슷하게 자기 치료(self-medication)에 적합한 투여의 또 다른 가능한 형태이다.
이 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 적절한 보조제, 담체, 희석제 및 비히클(vehicles)과 함께 통상적으로 사용되는 선택된 경로에 적합한 화학적 형태에서 약학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물은 일반적인 약학 절차에 따라 적응하거나 조정될 수 있다. 경구 투여에 통상적으로 사용되는 보조제 및 비히클은 예를들면 충진제 또는 이산화 티타늄, 무수 락토스, 실리카, 실리카 콜로이달리스(colloidalis), 메틸셀룰로스, 스테아레이트 마그네슘, 셀룰로스 미정질(microcrystalline)과 같은 현탁제 등이다. 정맥 내 투여에 통상적으로 사용되는 보조제 및 비히클은 예를들면 주사를 위한 멸균수(WFI), 멸균 버퍼(예를들면 pH 7.4 용액 버퍼링) 알부민 용액, 지질 용액, 사이클로덱스트린 등이다. 경피 투여에 통상적으로 사용되는 보조제와 비히클은 예를들면 바셀린, 유동 파라핀, 글리세린, 물, MCT 오일, 참깨 오일, 식물성 오일 등이다. 투여량은 치료 의사에 의해 평가되는 가능한 다른 요소들뿐 아니라, 투여의 방식, 치료되기 위한 특정 상태 또는 바라는 효과, 성별, 나이, 무게 및 환자의 건강에 따라 당연히 달라질 수 있다.
본 발명은 예시적인, 비-제한적인 실시예들에 의해 설명될 것이다.
실시예
1.
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온
옥심
(
3α
-
ethynyl
-
3β
-hydroxyandrostan-17-one
oxime
)의 합성
단계 1: 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one)의 합성
3, 17-안드로스탄디온(androstandione) (5.0 mmol)을 질소 하 상온에서 건조한 THF 50 mL에 용해하였다. 에티닐 브롬화 마그네슘 (1.1 당량)을 교반하면서 상온에서 적가하여 첨가하고, 상기 용액을 질소 흐름 하에 상온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서 용액을 포화된 NH4Cl(aq)과 다이클로로메테인(3×30 mL)으로 추출한 수용상으로 퀀치시켰다(quenched). 모아진 유기상(organic phase)은 감압상태에서 증발시켰고, 그 결과물인 노란 오일을 다이클로로메탄에 용해시키고, 브라인(brine)으로 세척시킨 후 MgSO4로 건조시켰다. 용액을 진공하에 감소시키고, 잔여물을 실리카 플래시 칼럼 크로마토그래피(1:4 다이에틸에터: 디클로로메탄)로 정제하여 일반적으로 수율 65%를 얻었다. 최종적인 부산물의 미량은 다이에틸에테르로 추가 재결정화하여 제거될 수 있다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d6): δ 2.43 (s, 1H); 2.42 (m, 1H); 2.10-2.04 (m, 2H); 1.02 (m, 1H); 0.86 (s, 3H); 0.83 (s, 3H).
단계 2: 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime)의 합성
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(10 mmol)을 실온 및 대기압(air atmosphere)에서 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에서 디클로로메탄 5 mL 및 에탄올 50 mL로 용해시켰다. 4당량의 NH2OH 염산 염(hydrochloride) 및 4당량의 아세트산염 나트륨 5 mL을 H2O에 용해시킨 후, 스테로이드 용액에 첨가하였다. 20 mL의 에탄올을 첨가하고 혼합물을 밤새 환류(reflux) 상태에 두었다. 그 후 혼합물을 차갑게 냉각하고 용매를 감압상태에서 제거하였다. 백색 잔여물은 50 mL H2O 및 50 mL 다이클로로메탄으로 처리하고 수용상을 3×30 mL 다이클로로메탄으로 추출하였다. 그리고 나서 모아진 유기상은 MgSO4로 건조시키고 여과하였고 용매를 감암 하에 제거하였다. 최종 잔여물을 실리카 플러쉬 칼럼 크로마토그래피 다이클로로메탄 : 다이에틸에터 4:1로 정제하여 일반적으로 수율 95-100% (양적인; quantitative)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d6): δ 2.51-2.47 (m, 2H); 2.43 (s, 1H); 1.00 (m, 1H); 0.80 (m, 1H); 0.90 (s, 3H), 0.83 (s, 3H).
실시예
2. 간성뇌증(hepatic
encephalopathy
) 동물 모델에서
3α
-
에티닐
-
3β
-하이드록시안드로스탄-17-온
옥심의
치료효과
투여 및 테스트
스케쥴
본 연구에서, 만성적인 고암모니아혈증의 동물 모델은 간성뇌증에 존재하는 많은 인지 및 운동 변이(alterations)를 재생산하기 위해 사용되었다. 래트는 그들의 음식에 암모니아를 함께 식이하였고 2주 후에 암모니아가 풍부한 음식으로 그들은 간성뇌증 증상을 발전시켰다. 평균대 걷기 테스트는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 투여 3 및 4주차 동안 이루어졌고 반면에 모리스 수중 미로 테스트는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 투여의 4번째 내지 5번째 주 동안 이루어졌으며, 방사형 미로 테스트는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 투여의 6 및 7주차 동안 이루어졌다.
연구는 동물에서 두가지 시리즈로 나뉘어지고(수컷 위스털(Wistar) 계통 래트), 각 시리즈는 다음의 그룹을 포함한다; 비히클을 투여한 대조군(CV, 시리즈 당 n=8), 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심을 투여한 대조군(C+GAM, 시리즈당 n=8), 비히클을 투여한 고암모니아혈증 래트(HAV, 시리즈 당 n=8), 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심을 투여한 고암모니아혈증 래트(HA+GAM, 시리즈 당 n=8). 20 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 또는 비히클로 매일 한 번씩 투여는 9 a.m 근처에서 1 ml/kg의 피내 주입으로 수행하였다. 투여는 암모늄 포함 식이요법으로 시작하고 1주 후에 시작하였고 전체 실험 기간 동안 계속되었다.
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 테스트 물품(article)은 참깨 오일에서 20 mg/kg의 현탁액으로 준비되었다.
방사형 미로에서 공간학습
방사형 미로는 공간 학습을 평가하기 위한 방법으로 고안되었다. 장비는 8개의 균등한 크기의 암(arm)에 접촉하는 중앙 공간으로 구성되어있다. 암은 70 cm 길이 및 10 cm 넓이이고 중앙 공간은 30 cm 지름이다. 미로는 검정 퍼스펙스(Perspex)로 만들어졌고 바닥으로부터 80 cm 솟아있다. 각 암은 먼 쪽 면(5 cm)에서 보다 중간 영역(30 cm)에 가까운 옆면에서 더 높은 높이의 측벽을 가진다. 각 암의 가장 먼쪽에서, 오목한 컵을 음식 보상을 위치시키기 위해 설치하였다(Hernandez-Rabaza V. 외 2010).
미로에서 래트를 거주시키기 위해, 래트는 훈련 동안 제자리에 남겨진 말단신호(다른 크기의 포스터 및 물질)의 존재 하에 이틀 연속으로 10분 동안 미로를 탐색하도록 하였다.
방사형 미로에서 훈련은 각 3번의 시도의 다섯개 블럭으로 구성되고, 10일 연속으로 수행하였다. 업무는 임의적인 배열에 따라 상이한 암의 끝에 각각 위치된 4개의 펠렛(pellet)을 위치시키는 것을 포함한다. 배열은 각 래트에 특이적이고 훈련동안에 고정시켜놓았다. 공간 참조 에러 및 작업기억의 수는 계수되고 블럭 당 참조 및 작업 에러의 수로 표현되었다. 또한, 학습 인덱스는 업무의 학습을 평가하기 위해 사용되었고 올바른 선택-참조 에러의 수로 정의하였다(Hernandez-Rabaza 외.2010)
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 방사형 미로에서 고암모니아혈증 래트의 공간 학습을 복원하였다. 고암모니아혈증 래트는 감소된 공간 학습을 보여주고 방사형 미로 업무에서 더 많은 작업 에러를 수행하였다. 공간 기억은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심에 의해 완전히 복원되었다(도 2).
실시예
3. 간성뇌증(hepatic
encephalopathy
) 동물 모델에서
3α
-
에티닐
-
3β
-하이드록시안드로스탄-17-온
옥심의
치료효과
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 2에 설정된 것과 동일하다.
모리스
수중미로장치(Morris water maze)
에서 공간 기억
미로는 공간 학습을 평가하기 위한 방법으로 고안되었다(Morris R.1984). 테스트는 독단적으로 4개의 사분면으로 나뉜 검은 둥근 풀(160 cm 지름, 40 cm 높임)을 사용하여 수행하였다. 물 불투명도는 검은 페인트를 첨가하여 얻었다. 지름이 10 cm인 투명한 플렉시글라스(Plexiglas) 플랫폼을 훈련 세션 동안에 하나의 사분면의 중앙에 물 표면 아래에 2 cm로 침지하였다(Monfort 외., European Journal of Neuroscience, 2007, 25, 2103-211).
테스트는 다음과 같이 수행하였다; 첫날은 훈련 전 날이었고, 래트는 물에 적응하기 위해서만 30초 동안 3번 물에 위치시켰다. 그리고 나서 래트를 3일 동안 보이지 않는 플랫폼의 고정된 위치를 학습하는 훈련을 시켰다. 각 훈련 시도는 랫트를 플랫폼이 없는 3개의 사분면 중 하나에 벽을 마주보는 풀(pool)로 위치시키는 단계를 포함한다. 다른 시작점은 무작위로 각 시도에 사용되었다. 훈련은 하루에 5번 수영으로 구성되었다. 각 동물들은 플랫폼을 찾기 위해 최대 120초가 허용되었고 플랫폼에 15초 동안 남겨졌다. 만약 래트가 120초 안에 플랫폼에 위치하는 것을 실패하면, 수동으로 실험자에 의해 플랫폼으로 가이드 받았다. 본 테스트의 목적은 래트가 보이지 않는 플랫폼이 어디에 있는지 학습하고 가능한 짧은 시간 내에 도달할 수 있도록 하는 것이다. 숨겨진 플랫폼을 찾기 위한 시간, 속도 및 경로는 뷰포인트 회사(Viwe point company)에서 제공하는 비디오 추적 시스템(Viewpoint 2.5, Champagne au Mont D` Or, France)으로 기록하였고 업무 학습의 측정으로 사용되었다. 15번의 훈련 시도 후에, 플랫폼을 풀로부터 제거하였고, 래트는 풀에서 90초 동안 수영하도록 하였고, 훈련이 기록되는 동안에 플랫폼이 위치하고 있었던 사분면에서 시간을 보냈다.
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 모리스 수중 미로에서 고암모니아혈증 래트의 공간 기억을 완전히 복원시켰다. 고암모니아혈증 래트는 감소된 기억력을 보였고 플랫폼을 찾기위해 대조군 보다 더 많은 시간이 필요했다(도 3).
실시예
4. 간성뇌증(hepatic
encephalopathy
) 동물 모델에서
3α
-
에티닐
-
3β
-하이드록시안드로스탄-17-온
옥심의
치료효과
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 2에 설정된 것과 동일하다.
평균대 걷기(beam walking)에서 운동
협응
(motor coordination)
평균대 걷기 테스트에서 랫트는 폐쇄된 탈출 플랫폼에 도달하기 위한 높고 좁은 평균대를 횡단하도록 훈련받았다. 평균대는 부드럽고 둥근 나무(20 nm 지름)로 만들었다. 평균대는 바닥으로부터 1 m 솟아있다. 측정된 운동 협응의 파라미터는:다리 넘어지기(또는 다리 결함) 및 평균대를 횡단하기 위한 지연 시간이다. (Jover 외., 2006; Carter 외., 2010). 랫트가 길들여지기 위해, 실험자들은 랫트를 평균대 시작점에 놓았고 랫트가 3번 평균대를 건너가는 것을 도와주었다. 이 후에, 테스트는 3개의 연속적인 시도로 구성되었다. 왼쪽 또는 오른쪽 뒷다리가 평균대에서 미끌릴때마다 각각의 시도를 기록하였다.
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 평균대 걷기 테스트에서 고암모니아 혈증(hyperammoniemic) 랫트의 운동 불협응을 완전히 반전시켰다. 고 암모니아 혈증 랫트는 운동 불협응(in-coordination)을 보였다(넘어짐 횟수의 증가=다리 결함)(도 4).
실시예
5. 외인성 투여 후 혈장 및 뇌 조직에서
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드
록시안드로스탄-17-온
옥심의
농도
혈장의 획득
혈액은 암모니아 투여 2주 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 투여 1주의 마지막에 래트(실시예 2)의 꼬리로부터 채취하였고 또한 동물 희생(sacrifice) 동안 목으로부터 채취하였다. 혈장을 얻기 위해, EDTA 7.5 nM을 첨가하고 5분 동안 1500 r.p.m에서 원심분리하였다.
암모니아 측정
혈액 샘플에서 암모니아 농도는 포켓 켐바(Pocket chemBA, Woodley Equipment Company Ltd, United Kingdom), 암모니아 분석기를 사용하여 측정하였다. 장치는 즉각적인 테스트를 가능하게 하고 결과값은 3분 및 20초에 전달되었다. 이는 또한 원심성 분리와 같은 전처리의 필요성을 제거했다.
희생(sacrifice)
래트는 참수에 의해 희생당했다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 측정을 위해 소뇌를 포함하는 뇌의 절반을 모으고 -80℃에서 보관하였다. 다른 뇌 부분(소뇌, 대뇌 피질, 해마 및 선조체)을 GAMS의 가능한 측정을 위해 해부하고 -80℃에서 보관하였다.
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온
옥심의
농도 분석
수집된 뇌 및 혈장 샘플은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 농도를 위해 분석되었다. 혈장 및 뇌 샘플을 상온에서 해동하였다. 혈장은 아세토니트릴로 3배 부피로 단백질-침전되었고 뇌 조직은 조직:PBS (pH 7.4)의 1:4 비로 균질화되었고 그리고 나서 초음파 분해 20분 동안 메탄올:아세토니트릴(1:1)의 두배 부피로 추출하였다. 그리고 난 후 샘플을 섞어주고 10000 xg로 10분 동안 원심분리하였다(Heraeus Pico 17 centrifuge). 그 후, 상청액을 동일 부피의 PBS로 희석하고 분석하였다. 일부 샘플은 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 너무 높은 농도 때문에 10-배 희석물로 재분석하였다. 희석물은 PBS 버퍼의 37.5% 아세포니트릴 용액으로 만들었다.
표준은 블랭크 혈장/뇌 세포분쇄액(homogenate)을 0.5 내지 5000 ng/ml의 농도로 소량 첨가하여 제조하였고 그렇지 않으면 샘플로 처리하였다. 측정은 LC-MS로 하였다.
결과
암모니아 측정: 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 혈중 암모니아 레벨에 영향을 미치지 않는다. 혈중 암모니아 레벨은 대조군 래트(47±3 μM)와 비교하여 암모니아 식이를 먹인 래트(167±17 μM)에서 증가하였다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심은 대조군 래트(55±7 μM) 또는 고암모니아혈증 래트(139±15 μM)에서의 혈중 암모니아 수치에 영향을 미치지 않았다(도 1). 이러한 결과는 간성뇌증 증상이 감소된 암모니아 수치를 가지는 것을 나타내는 이전 연구들과 비교할때 괄목할만하다.
노출 후
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온
옥심의
측정
본 연구에서, 혈장에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 전체 농도는 투여 5일째 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심 투여 마지막주에, 주사 후 4시간 및 23시간에서 각각 분석되었다. 혈장에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 농도는 도 5에 나타내고 뇌 농도를 도 6에서 나타내었다. 5일 투여 후에 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 농도는 주사 후 4시간 보다 주사 후 23시간에 더 낮았고, 반면 투여 마지막 주에 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 비슷한 농도가 각각 그룹에서 4시간 및 23시간 경과시 모두 발견되었다. 뇌에서, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 유사한 농도가 대조군(91±4.1 nmol/kg 비결합* 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심) 및 HA 래트(106±15.4 nmol/kg 비결합* 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심)에서, 마지막 투여 후 1-2 시간일때 발견되었다(도 6). 농도는 24시간에 걸쳐 굉장히 높은 수준 및 안정한 농도를 나타내었다.
*결합되지 않은(unbound) 뇌 농도 = 담체 단백질 또는 뇌 조직에 결합되어 있지 않은 뇌에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심의 분획
실시예
6.
GABA
A
수용체에서
GABA가
아닌
THDOC의
효과에
길항작용하는
(antagonize)
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온
옥심의
능력
α1β2γ2L
및
α5β3γ2L
GABA
A
수용체로 전체 세포 전압 클램프 전기생리학
전기생리학 측정을 위해, 리졸브 칩(Resolve chip)을 갖는 Dynaflow? 시스템을 사용하였다(Cellectricon, Goteborg, Sweden). HEK-293 세포는 영구적으로 인간 α5, β3 및 γ2L GABAA 수용체 서브유닛(α5β3γ2L) 또는 인간 α1, β2 및 γ2L GABAA 수용체 서브유닛(α1β2γ2L)의 구성적 발현(constitutive expression)을 위해 인간 CMV 프로모터를 포함하는 벡터로 형질감염시켰다. 세포주는 GABA 및 THDOC에 우수한 반응성을 가지는 것으로 선택하였다. 측정 전에 세포는 다음을 포함하는 세포 외 용액(EC, extracellular solution)에서 15분 동안 95% 공기 및 5% CO2에서 37°C로 배양하였다: 137 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 1.0 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 및 10 mM 글루코스, 0.1 % DMSO pH 7.4. 그 후에 분리된 세포를 Dynaflow 칩 용기의 EC 용액에 첨가하였다.
전체-세포 전압 클램프 기록은 상온에서 이루어졌다(Haage 외., 2002; Neher, 1992에서 액체 접합 전위에 대한 보상으로 21-23 ℃, -17 mV). PClamp 9.0 소프트웨어, 디지데이터(digidata) 1322A 컨버터, 및 AxonPatch 200B(Axon Instruments, Foster City, CA)에 의해 명령펄스가 생성되고, 데이터가 수집되었다. 패치 전극(Patch electrodes)(2-6 MΩ)을 다음을 포함하는 세포 내 용액(IC)으 로 채웠다: 140 mM Cs-글루코산염(gluconate), 3.0 mM NaCl, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1.0 mM EGTA, 2 mM Mg-ATP, 0.1 % DMSO, pH 7.2.
THDOC 및 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심을 다이메틸 설폭사이드(DMSO)로 용해하였고 그 후에 0.1% DMSO를 포함하기 위해 EC 용액으로 희석하였다.
상이한 프로토콜들이 다른 전기생리학 측정을 위해 사용되었다. 생체 내에서 α1β2γ2L-GABAA 수용체가 시냅스 내에 존재하는 것처럼, 높은 GABA 농도(30 μM)의 짧은 적용(40 ms) 상황과 닮은 조건이 사용되었다. 대조적으로, α5β3γ2L-GABAA 수용체는 시냅스 외부에 존재하고, 따라서 사용되는 조건은 낮은 GABA 농도(0.3 μM)에 긴 노출(6초)이다. THDOC의 EC75 농도, 즉 α1β2γ2L 연구에서 100 nM 및 α5β3γ2L 발현 세포가 측정될 때 200 nM이 사용된다. 두 세포 유형 모두에서 THDOC 또는 THDOC 플러스 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 사전노출이 GABA 적용 전에 사용되었다.
GABA의 존재에서 스테로이드 효과는 측정된 파라미터에서 세포간 및 세포내 변이의 효과를 피하기 위해 대조군에 대해 평균화하였고, 각 세포는 고유의 대조군을 위해 사용되었고 커브 아래 영역(AUC)을 분석하였다.
결과
GABAA 수용체에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 효과는 수용체의 인간 변이를 발현하는 재조합 HEK293-세포에서 전기생리학적 측정으로 연구하였다. GABA 존재하에서 α1β2γ2L GABAA 수용체의 100 nM THDOC-강화된 활성을 도 7에 나타내었다.
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온(1 μm)은 GABAA 수용체의 α1β2γ2L 및 α5β3γ2L 서브유닛 변이체 모두에서 THDOC의 효과를 부분적으로 길항한다(도 8A 및 C). α1β2γ2L 수용체와 함께 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 29±4.7%의 GABA의 THDOC 강화(P<0.001)를 억제하고 α5β3γ2L 수용체와 함께 억제는 49±4.7%이다(P<0.001, 표 1)
대조적으로, 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온(1 μM)은 GABAA 수용체의 GABA-활성을 억제하지 않는다(도 8B 및 D). GABA가 수용체의 유일한 활성자일때 α1β2γ2L GABAA 수용체(-3.1±1.7%, NS) 또는 α5β3γ2L GABAA 수용체(-3.8±1.5%, NS)에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 현저한 영향은 없다(표 1).
| GABAA 수용체 | [GAMSA] μM | [GABA] μM | [THDOC] nM | GAMSA 효과 | P-값 |
| α1β2γ2L | 1 | 30 | 100 | -29 ± 4.7 % | < 0.001 |
| 1 | 30 | - | -3.1 ± 1.7 % | > 0.05, NS | |
| α5β3γ2L | 1 | 0.3 | 200 | -49 ± 4.7 % | < 0.001 |
| 1 | 0.3 | - | -3.8 ± 1.5 % | > 0.05, NS |
실시예
7. 다른
타겟
및 수용체에서
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온의 선택성
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 결합이 신경전달물질 수용체의 모든 종류를 포함하는 수용체, 이온 채널 및 효소에 대해 측정되었다. 전체 113 타겟에서 10 μM의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 두 번 테스트되었다(Perkin Elmer, 주문제작된 화면). 결합 활성은 리간드 결합의 50% 억제 보다 많거나 동등하게 정의되었다.
결과
10 μM의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 연구된 신경전달물질 관련 수용체, 스테로이드 수용체 또는 펩타이드 수용체의 어떤 것에서도 결합 활성을 보이지 않았다.
실시예
8. HE 및 문맥 대정맥(
porta
-
caval
)
문합(anastomosis)을
갖는
래트의
운동 협응에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 치료 효과
투여 및 테스트
스케쥴
래트에서 만성적인 고암모니아혈증. 수컷 Wistar 종 래트(140-160g)를 암모니아 아세트산염을 포함하는 식이로 먹여 고암모니아혈증을 유도하였다(무게의 30%)(Felipo 외, European Journal of Biochemistry, 1988, 176, 567-571)
문맥대정맥의 문합 ( Porta - caval anastomosis ). 수컷 Wistar 종 래트(220-240g)를 아이소플루레인으로 마취하였고, 끝부터 측면까지의 문맥대정맥의 문합은 Lee 및 Fisher에 의해 개시된 방법으로 수행하였다(Surgery, 1961, 50, 668-672). 대조군 래트는 샴 수술하였고; 그들은 간문맥 및 하대 정맥에 10분 간 클램프되었다.
문맥대정맥의 문합 절차를 거친 래트는 본 명세서에서 "PCS 래트"라 부른다.
적합한 측정을 동물에 고통 및 불편함을 최소화하기 위해 취하였다. 실험은 당 소 센터의 CEBA(Comite de Experimentacion y Bienestar Animal)에서 승인을 받았고 유럽 위원회 (2010/63/EU)의 지시의 가이드라인 및 실험 동물의 케어 및 관리를 위한 스페인법(R.D. 1201/2005)에 맞추어 수행하였다.
3α - 에티닐 - 3β - 하이드록시안드로스탄 -17-온 투여. 참깨 오일 내의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 래트의 등의 피내 주입으로 매일 1회 투여하였다. 두 개의 다른 실험 세트는 고암모니아혈증 래트에서 수행하였다. 첫째 세트에서 래트의 4 그룹이 사용되었다: 1) 비히클을 주입한 대조군 래트; 2) 비히클을 주입한 고암모니아혈증 래트; 3) 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 20 mg/kg을 주입한 대조군 래트; 4) 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 20 mg/kg을 주입한 고암모니아혈증 래트.
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 주입한 대조군 래트는 이들 래트에서는 어떠한 관련성 있는 효과가 발견되지 않았기 때문에 그 후에 포함되지 않는다.
실험의 두번째 세트에서 래트의 5 그룹이 사용되었다: 1) 비히클을 주입한 대조군 래트; 2) 비히클을 주입한 고암모니아혈증 래트 및 3-5) 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 3, 10 또는 20 mg/kg을 주입한 고암모니아혈증 래트. 각 실험에서 그룹당 6-8 래트가 사용되었다.
PCS 래트를 사용하는 실험을 위하여, 다음과 같은 래트 그룹이 사용되었다: 1) 비히클을 주입한 샴 래트; 2) 비히클을 주입한 PCS 래트; 3-4) 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 0.7 또는 2.5 mg/kg을 주입한 PCS 래트. 각 실험에 사용된 래트의 수는 상응하는 도면에 나타나거나 상응하는 도면의 설명에 나타난다.
통계학적 분석
데이터는 각 도면에 표시된 래트 수의 평균±SEM으로 나타낸다. 통계학적 중요성은 오직 하나의 매개변수를 비교했을 때, 양 방향 ANOVA 및 Bonferroni 사후 실험 및 Student's 티-테스트로 평가하였다. 분석은 Windows의 GraphPad PRISM 소프트웨어(GraphPad software사., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
운동
협응
. 평균대 걷기 테스트.
운동 협응은 Gonzalez-Usano 등(ACS Chemical Neuroscience, 2014, 19, 5(2), 100-105)에 기술된 바와 같은 방식으로 나무 평균대(20 mm 지름)를 사용하여 테스트하였다. 래트를 땅으로부터 약 1 미터에 위치한 1 미터 길이의 나무 평균대를 횡단하도록 하였고, 발 미끄러짐(슬립)의 수는 두 명의 관찰자에 의해 기록하였다. 래트는 측정이 기록되기 전에 5회까지 평균대를 가로질러 가게하여 테스트를 위해 훈련되었다. 발 미끄러짐(슬립)의 수는 운동 불균형(in-coordination)의 측정이다.
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 고암모니아혈증 및 PCS 래트 모두에서 운동 협응을 복원시킴을 나타낸다.
고암모니아혈증 래트는 평균대 걷기 테스트에서 대조군 래트(1.0±0.1)보다 더 높은(p<0.05) 수의 미끄러짐(1.4±0.1)으로 운동 불협응을 나타낸다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 투여는 고암모니아혈증 래트에서 운동 협응을 복원시킨다(도 9A). 효과는 통계학적으로 3 mg/kg(0.8±0.1 슬립, p<0.05) 및 20 mg/kg(0.78±0.07 슬립, p<0.05)의 투여량에서 현저하였다.
PCS 래트는 또한 평균대 걷기 테스트에서 샴-수술한 대조군 래트(0.71±0.07)보다 더 높은(p<0.01) 수의 미끄러짐(1.2±0.1)으로 운동 불협응을 나타냈다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 투여는 PCS 래트에서 운동 협응을 복원시킨다(도 9B). 0.7 mg/kg의 투여량에 대한 미끄러짐 수는 0.75±0.10 (p<0.05 대 PCS 래트)이다. 2.5 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 운동 협응을 개선하고, 샴 래트와 비슷한 값으로 돌아왔다(0.8±0.1 미끄러짐; p 대 PCS 래트=0.058)(도 9B).
실시예
9. HE 및 문맥 대정맥(
porta
-
caval
)
문합(anastomosis)을
갖는
래트
의 공간 기억 및 공간 학습에 대한
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온의 치료 효과
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 8에서 설정된 것과 동일하다.
모리스
수중미로
테스트에서 공간 기억 및 학습
테스트는 Monfort 등.(European Journal of Neuroscience, 2007, 25, 2103-2111)에서 기술된 것과 같은 방식으로 임의로 4개의 사분면으로 나뉘어진 서큘러 풀(circular pool, 160 cm 지름, 40 cm 높이)을 이용하여 수행하였다. 사전 훈련 후에, 래트는 3일 동안 보이지 않는 플랫폼의 고정된 위치를 학습하는 훈련을 했다. 훈련은 래트를 플랫폼이 없는 3개의 4분면 중 하나에서 벽을 마주하고 있는 풀에 위치시키는 단계를 포함한다. 다른 시작점은 무작위로 각 시도에 사용되었다. 훈련은 하루에 3번 수영하는 것으로 구성되어 있다. 각 동물은 플랫폼을 찾는 데 최대 120초가 허락되었고 플랫폼에서 20초 동안 방치하였다. 만약 래트가 120초 안에 플랫폼에 위치하는 것을 실패하면, 래트는 플랫폼으로 실험자에 의해 수동으로 가이드 되었다. 숨겨진 플랫폼을 찾는데 필요한 시간은 수동으로 기록하였고 업무의 학습의 척도로 사용하였다. 공간 기억은 플랫폼을 제거하고 플랫폼이 위치하는 사분면에 래트가 소비한 시간을 측정함으로써 24시간 후에 평가하였다.
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 고암모니아혈증 및 PCS 래트에서 모리스 수중 미로 테스트에서 공간 기억을 복원시키는 것으로 나타났다.
고암모니아혈증 래트는 모리스 수중 미로에서 감소된 공간 기억을 나타낸다. 모든 그룹의 래트는 플랫폼을 찾는 것을 학습하였고 이에 도달하기 위한 지연 속도는 3일 훈련 기간 동안 감소되었다(도 10A). 학습 능력은 고암모니아혈증 래트에서 미세하게 감소되었고, 플랫폼에 도달하기 위해 대조군보다 더 많은 시간이 필요하였다.
공간 기억은 고암모니아혈증 래트에서 현저하게 감소하였다(p<0.05). 기억 테스트에서, 고암모니아혈증 래트는 대조군 래트(시간의 39±2%)보다 오른쪽 사분면에서 더 적은 시간(시간의 30±2%) 동안 남아있었다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 투여는 고암모니아혈증 래트에서 모리스 수중 미로에서 공간 기억을 복원시켰다. 정확한 사분면에서 소요한 시간의 비율은 3, 10 및 20 mg/kg 투여량에 대하여 각각 41±4, 42±5 및 38±3이다(도 10B).
PCS는 또한 모리스 수중 미로에서 감소된 공간 기억을 나타낸다. 모든 그룹의 래트는 플랫폼을 찾는 것을 학습하였고 이에 도달하기 위한 지연 시간은 3일 훈련기간 동안 감소하였다(도 10C). 공간 기억은 PCS 래트에서 현저하게 감소하였다(p<0.05). 기억 테스트에서 PCS 래트는 대조군 래트(시간의 41±2%)보다 오른쪽 사분면에서 더 적은 시간(시간의 31±3%) 동안 남아있었다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 투여는 PCS 래트에서 모리스 수중 미로에서 공간 기억을 복원시켰다. 정확한 사분면에서 소요한 시간의 비율은 0.7 및 2.5 mg/kg 투여량에 대하여 각각 34±4 및 39±3이다(도 10D).
실시예
10. HE
랫트
및 문맥 대정맥(
porta
-
caval
)
문합(anastomosis)을
갖는 래트의 공간 학습에 대한
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온의 치료 효과
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 8에 설정된 것과 동일하다.
방사형 미로 테스트(radial maze test)에서 공간 기억
장치는 8개의 동일 크기의 암(arms)에 접촉되어 있는 중앙 영역으로 구성되어 있다. 암은 70 cm 길이 및 10 cm 넓이이고 중앙 영역은 30 cm 지름이다. 극단적으로 먼 각 암은 음식 보상을 포함하는 컵을 가지고 있었다. 래트는 미로에 적응하기 위해 먼 신호(cue)의 존재하에서 이틀 연속으로 10분 동안 미로를 탐색하였다. 방사형 미로에서 훈련은 6일 연속으로 하루에 3번의 시도로 구성되어 있었다. 업무는 Hernandez-Rabaza 등. (Addiction Biology, 2010, 15, 413-423)에 기술되어 있는 것과 같이 무작위의 배열에 따라 다른 암의 끝에 각각 위치하는 4개의 펠렛을 위치시키는 것을 포함하였다. 작동 메모리 에러(동일한 시도에 이미 방문한 바 있는 암에 방문함)의 수는 기록되고 작동 에러로 표현되었다.
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 방사형 미로 테스트에서 공간 학습을 복원시키는 것으로 밝혀졌다.
고암모니아혈증 래트는 방사형 미로에서 감소된 공간 학습을 나타내었다. 도 11A에 나타낸 것과 같이, 작동 에러의 수는 1-3일 차에 대조군 래트에서 보다 고암모니아혈증 래트에서 더 높았다. 모든 그룹의 래트는 훈련 기간 동안 학습하였고 대조군 및 고암모니아혈증 래트 사이의 차이는 3일차 후에 현저하지 않았다(도 11A). 1-2일차에서 작동 에러의 수는 대조군 래트(11±1.5 에러)에서보다 고암모니아혈증 래트(18±3 에러)에서 더 높았다(p<0.05). 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 투여한 고암모니아혈증 래트는 대조군과 같이 행동하였다. 에러의 수(대조군으로부터 현저한 차이 없음)는 3, 10 및 20 mg/kg 투여량에 대하여 각각 6.5±2.8, 8.8±1.9 및 12±2이었다(도 11B-C)
PCS 래트는 또한 방사형 미로에서 감소된 공간학습을 나타낸다. 도 11C에서 나타낸 바와 같이, 작동에러의 수는 1 및 2일차에서 샴 래트에서보다 PCS 래트에서 더 높았다. 모든 그룹의 래트는 훈련 기간 동안 학습하였고 샴 및 PCS 래트 사이의 차이는 3일차 후에 현저하지 않았다(도 11C). 1-2일차에서 작동 에러의 수(도 11D)는 샴 래트(10±2 에러)에서보다 PCS 래트(22±2 에러)에서 더 높았다(p<0.01). 0.7 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온으로 PCS 래트에 투여는 방사형 미로에서 수행능력을 개선시키기에 불충분하였다(23±2에러). 2.5 mg/kg 투여는 방사형 미로에서 PCS 래트의 수행능력을 완전히 정상화시켰다(11±1 에러, p<0.05 대 PCS).
실시예
11. PCS
랫트에서
활동일 주기(
cirdadian
rhythm) 및 야행성 운동
활동에 있어서
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온의 치료 효과
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 8에 설정된 것과 동일하다.
자발적인 운동(locomotor) 활동의 활동일 주기
운동 활성은 액티미터(Med Associates, S t. Albans, VT)를 사용하여 측정하였다. 래트는 오픈 필드 활성 챔버(43 x 43 x 31 cm)에 개별적으로 놓아두었고, 운동 활성은 명암 조건(L:D), 12h:12h에서 14일 동안 계속적으로 측정하였다. 데이터는 5분 간격으로 기록하였다. 운동 활성은 적외선 동작 감지기의 배열에 의하여 측정되었고, 세 방향, x, y 및 z에 위치시켰다. 하나의 보행 카운트(ambulatory count)는 래트가 x 또는 y 위치에서 3개의 연속적인 적외선 감지기를 방해할 때 장치로 기록하였다. 수직 카운트는 래트가 z 위치에서 적외선 감지기를 방해할 때 기록하였다. 소프트웨어는 보행 카운트 또는 수직 카운트와 같은 운동 활성이 다른 파라미터를 측정하도록 하였다(Ahabrach 외. Journal of Neuroscience Research, 2010, 88, 1605-14).
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 밤동안 자발적인 운동 활성을 증가시키고 PCS 래트의 활동일 주기를 부분적으로 회복시키는 것으로 밝혀졌다.
PCS 래트는 밤동안(래트의 활동기) 대조군 래트(4546±584 카운트)보다 현저하게 낮은(p<0.05) 1849±176 카운트의 감소된 운동 활성(보행 카운트)을 나타냈다. 0.7 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 2652±275 카운트로 PCS 래트에서 활성을 약간(p<0.05) 증가시켰다. 2.5 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 보행 카운트에 영향을 미치지 않았다(2235±170 카운트 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온)(도 12A 및 12C).
밤 동안 보행 활성 대 낮 동안 활성의 비는 PCS 래트에서 감소하고, 이는 변경된 활동일 주기를 나타낸다(도 12B). 대조군 래트에서 이 비율은 3.3±0.4이고 PCS 래트에서 0.8±0.16으로 감소하였다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 투여한 PCS 래트는 활성의 밤/낮 비에서 부분적이나 현저한 개선(p<0.05)을 나타내고, 이는 0.7 및 2.5 mg/kg에서 각각 1.7±0.2 및 1.6±0.3에 도달하였다(도 12B). 이는 활성의 활동일 주기의 부분적인 복원을 나타낸다.
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 또한 낮 동안 수직 활성을 정상화시키고 부분적으로 PCS 래트의 활동일 주기를 복원시키는 것으로 밝혀졌다.
PCS 래트는 밤 동안(래트의 활동기) 561±108 카운트로 감소된 수직 활성을 나타내었고, 이는 대조군 래트(1228±138 카운트)에서보다 현저하게(p<0.05) 낮았다. 0.7 mg/kg 또는 2.5 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 밤 동안 수직 활성에 영향을 미치지 않았다(각각 664±121 및 695±185 카운트)(도 12A 및 12C)
대조적으로, PCS 래트는 낮동안 682±114 카운트의 증가된 수직 활성을 나타내고 이는 대조군 래트(391±64 카운트)보다 현저하게 높았다(p<0.05). 0.7 mg/kg 또는 2.5 mg/kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 낮 동안 수직 활성을 완전히 정상화시켰고, 각각 339±47 및 424±44 카운트에 달했다(도 12A 및 12C).
밤 동안 수직활성 대 낮 동안 활성의 비는 PCS 래트에서 감소하고, 이는 변경된 활동일 주기를 나타낸다(도 12B). 대조군 래트에서 이 비율은 3.7±0.6이고 PCS 래트에서 0.8±0.01로 감소하였다(p<0.001). 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 투여한 PCS 래트는 활성의 밤/낮 비에서 부분적이나 현저한 개선(p<0.01)을 나타내었고, 이는 0.7 및 2.5 mg/kg에서 각각 2.1±0.4 및 1.9±0.6에 도달하였다(도 12B). 이는 활성의 활동일 주기의 부분적인 복원을 나타낸다.
실시예
12.
고암모니아
혈증
(
hyperammonemic
) 및 PCS
랫트에서
혈중 암모니아 농도에 있어서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 투여의 효과
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 8에 설정된 것과 동일하다.
암모니아 측정
혈중 암모니아는 키트 Ⅱ 암모니아 Arkay 테스트(PocketChemBA, Arkray)를 사용하고 20 μL의 신선한 혈액을 이용하여 제조자의 설명에 따라 측정하였다.
결과
3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온은 고암모니아 혈증 및 PCS 랫트에서 암모니아 수치에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
혈중 암모니아 레벨은 대조군(47±3 μM)과 비교하여 고암모니아 혈증 랫트에서 167±16 μM로 증가하였다(p<0.001). 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 20 mg/kg으로 투여하는 것은 고암모니아 혈증 랫트(139±14 μM)에서 암모니아 수치에 영향을 미치지 않았다.
유사한 결과를 PCS 랫트에서 얻었다. 혈중 암모니아 수치는 PCS 랫트(348±27 μM)에서 샴 랫트(125±31 μM)와 비교하여 증가하였다(p<0.001). 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 투여는 혈중 암모니아에 영향을 미치지 않고, 0.7 및 2.5 mg/Kg의 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온을 투여한 PCS 랫트에서 각각 302±30 및 294±37 μM로 남아있었다.
실시예
13. 투여 기간 후
고암모니아
혈증
및 PCS
랫트의
혈장(plasma) 및 뇌 조직에서의
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온의 농도
투여 및 테스트
스케쥴
투여 및 테스트 스케쥴은 실시예 8에 설정된 것과 동일하다.
3α
-
에티닐
-
3β
-
하이드록시안드로스탄
-17-온 노출의 분석
투여기간의 마지막에 꼬리 정맥으로부터 혈장을 얻었고 단두술(decapitation)에 의한 희생 후에 뇌를 모으고 즉시 드라이 아이스로 얼렸다. 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 노출의 분석을 위해 뇌 조직은 조직:PBS(pH 7.4)의 1:4 비율로 균질화하였고 그 후 메탄올:아세토니트릴 (1:1)의 2배 부피로 추출하였고, 반면에 혈장은 아세포 니트릴의 3배 부피로 단백질-침전시켰다. 분석은 Waters ACQUITY UPLC + Waters XEVO-TAS triple 사중극자(quadrupole) 질량 분광기(Admescope Oy, Oulu, 핀란드)로 수행하였다. 뇌에서 자유 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 노출량을 측정하기 위해 뇌 세포분쇄액(homogenate)에 결합되지 않은 분획(Fub; Fraction unbound)을 투석에 의해 측정하였고, HA에서 Fub는 0.70이고, PCS에서 Fub는 1.43%이다(Admescope Oy, Oulu, 핀란드).
결과
고암모니아 혈증 랫트에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 3, 10 및 20 mg/Kg의 하루 한 번 투여는 혈장 및 뇌 조직 모두에서 투여량-의존적 노출 결과로 나타났다. 행동기능검사(behavioral test) 동안, 혈장에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 전체 농도는 각각 0.34±0.03, 1.08±0.11, 1.95±0.61 μM이었고, 뇌 조직에서 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온의 비결합 농도는 각각 6.1±1.4, 11.6±1.4, 23±5 nmol/kg이었다(도 14A)
또한, PCS 랫트에서 노출은 투여량 의존적이었고 이러한 랫트에 사용된 낮은 투여량은 0.7 및 2.5 mg/Kg이고 노출은 고암모니아 혈증 랫트에서 매우 비슷하였다. 행동기능검사 동안 혈장에서 전체 농도는 0.7 및 2.5 mg/kg/일에서 각각 0.48±0.09 및 1.64±0.30 μM이었고, 뇌에서 비결합된 농도는 각각 6.18±0.97, 및 17±2 nmol/kg이었다.
Claims (28)
- 간성뇌증(hepatic encephaloathy) 치료용 화합물 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
- 제1항에 있어서, 상기 간성뇌증은 최소증상(minimal) 간성뇌증인 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 간성뇌증은 명백한(overt) 간성뇌증인 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 간성뇌증은 유형 A 간성뇌증인 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 간성뇌증은 유형 B 간성뇌증인 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 간성뇌증은 유형 C 간성뇌증인 것인 화합물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 급성 간부전(acute liver failure) 환자에게 투여되는 것인 화합물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 급만성 간부전(acute on chronic liver failure)을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환을 갖는 환자에게 투여되는 것인 화합물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 간 이식(liver transplantation) 전에, 동안에 또는 후에 제공되는 것인 화합물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심과 암모니아 저하 화합물(ammonia-lowering compound)의 공동투여(co-administeration)를 포함하는 것인 화합물.
- 제10항에 있어서, 상기 암모니아 저하 화합물은 리팍시민(rifaximin), 락툴로스(lactulose), 오르니틴 아세트산페닐(ornithine phenylacetate) 및 글리세롤 페닐 낙산염(glycerol phenyl butyrate)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 암모니아 저하 화합물은 리팍시민 및 락툴로스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모니아 저하 화합물은 리팍시민인 것인 화합물.
- 약학적으로 허용가능한 담체(carriers), 부형제 및/또는 희석제와 함께 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
- 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학적 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 간성뇌증을 치료하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 간성뇌증은 최소증상 간성뇌증인 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 간성뇌증은 명백한 간성뇌증인 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 간성뇌증은 유형 A 간성뇌증인 것인 방법.
- 제15항 있어서, 상기 간성뇌증은 유형 B 간성뇌증인 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 간성뇌증은 유형 C 간성뇌증인 것인 방법.
- 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 급성 간부전(acute liver failure)을 앓고 있는 것인 방법.
- 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 급만성 간부전(acute on chronic liver failure)을 동반하거나 동반하지 않는 만성 간 질환을 앓고 있는 것인 방법.
- 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 간 이식(liver transplantation) 전에, 동안에 또는 후에 제공되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심과 암모니아 저하 화합물(ammonia-lowering compound)의 공동투여(co-administeration)를 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 암모니아 저하 화합물은 리팍시민(rifaximin), 락툴로스(lactulose), 오르니틴 아세트산페닐(ornithine phenylacetate) 및 글리세롤 페닐 낙산염(glycerol phenyl butyrate)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 암모니아 저하 화합물은 리팍시민 및 락툴로스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모니아 저하 화합물은 리팍시민인 것인 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한, 약학적으로 허용가능한 담체(carriers), 부형제 및/또는 희석제와 함께 3α-에티닐-3β-하이드록시안드로스탄-17-온 옥심(3α-ethynyl-3β-hydroxyandrostan-17-one oxime) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물.
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