KR20160104278A - ASL9 gene controlling radial growth of plant and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식물의 비대 성장을 조절하는 ASL9 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ASL9 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 비대 성장을 조절하는 방법, 상기 방법에 의해 식물체의 비대 성장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물체의 비대 성장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 비대 성장 조절용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to an ASL9 gene that regulates plant growth, and more particularly to a method for regulating the expression of an ASL9 gene by transforming a recombinant vector containing the gene into a plant cell. A method for controlling hyperplasia, a method for producing a transgenic plant in which the hypertrophic growth of the plant is controlled by the above method, a transgenic plant in which the hypertrophic growth of the plant produced by the above method is controlled and a seed thereof, The present invention relates to a composition for controlling growth of plants containing an active ingredient.
식물의 관다발 조직은 물과 영양분을 비롯한 식물의 성장과 발달에 필요한 물질 이동통로로서 각각의 특이적 기능을 가진 세포들이 모여 특징적인 구조를 이룬다. 1차 생장인 길이 생장의 경우, 줄기에서의 관다발 조직은 가장 윗부분에 존재하는 정단 분열 조직에 의해서 생성되며, 분열 조직인 전형성층(procambium), 일차 체관부(primary phloem), 그리고 물관부(xylem)로 이루어지게 된다. 시간이 지남에 따라 2차 생장(secondary growth)을 위하여 속(bundle) 사이의 유관속관조직 내로 확장된 형성층(cambium) 세포들이 형성되고, 이들을 시원세포로 하여 이차 체관부와 물관부가 서로 다른 방향으로 발달함으로써 닫힌 원 모양의 구조를 이루게 된다.The vascular tissue of a plant is a material movement pathway necessary for the growth and development of plants including water and nutrients, and each cell having a specific function forms a distinctive structure. In the case of lengthy growth of the primary growth, the stem of the stem is formed by the top apical meristem at the top and consists of the progeny (procambium), the primary phloem, and the xylem . As time passes, cambium cells expanded into the tubular tissue between the bundles for secondary growth are formed, and the secondary tubules and the tubules are developed in different directions Thereby forming a closed circular structure.
줄기 및 뿌리의 관다발 조직의 발달은 다양한 식물생장호르몬이 관여하고 있다. 전반적인 분열조직의 활성과 밀접한 관련이 있는 옥신(auxin)과 사이토키닌(cytokinin)은 형성층 세포 분열에 영향을 미치고 지베렐린(gibberellin)과 에틸렌(ethylene)도 형성층 활성에 관여한다. 또한 브라시노스테로이드(brassinosteroid)는 관다발(vascular bundle)의 수나 양상(pattern)을 조절하며, 이는 옥신의 이동을 조절하여 생성되는 맥시마(maxima)에 따라서 결정된다. 이외에도 특정 유전자들이 각 조직 특이적인 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 예컨대 HD-ZIP Ⅲ 유전자 군에 속하는 ATHB8, CNA(ATHB15), PHB, PHV 및 REV가 모두 관다발 조직의 형성층에 주로 발현하며 이 유전자들에 의해서 각각의 관다발 안에서 체관부와 물관부의 발달 방향과 물관부 분화가 조절되고 있음이 알려져 있다. 또한, 다른 조절인자인 KANADI는 miRNA165/166을 통하여 앞서 언급한 HD-ZIPⅢ의 발현을 조절하고, 이는 옥신(auxin)과의 상호작용으로 관다발 조직의 형성을 조절할 것으로 보고된 바가 있다.The development of the vascular tissues of the stem and root are involved in various plant growth hormones. Auxin and cytokinin, which are closely related to the activity of the entire mitotic tissue, affect cambium cell division and gibberellin and ethylene also participate in cambium activation. Brassinosteroids also control the number or pattern of vascular bundles, which is determined by the maxima produced by controlling the transfer of auxin. In addition, specific genes are known to be involved in the formation of specific tissues. For example, ATHB8, CNA (ATHB15), PHB, PHV, and REV belonging to the HD-ZIP Ⅲ gene group are mainly expressed in the cambium layer of the vascular tissue, and the developmental direction of the tube and the vesicular division Is known to be regulated. In addition, another regulator, KANADI, regulates the expression of HD-ZIP III through miRNA165 / 166, which has been reported to regulate the formation of vascular tissue by interaction with auxin.
이렇게 복잡한 상호 조절 작용에 대해서 비교적 잘 연구되어 있음에도 불구하고 현재까지 관련된 유전자의 변형을 통하여 실제 생산할 수 있는 바이오매스의 양을 변화시킨 사례는 보고된 바가 없다. 이것은 특정 조직 발달에 관여하는 인자로는 바이오매스 생산량을 늘리기에 한계가 있음을 의미한다.Despite relatively well-studied interactions with these complex interactions, there have been no reports of changes in the amount of biomass that can actually be produced through the modification of related genes. This means that there is a limit to increasing biomass production as a factor involved in specific tissue development.
한편, ASL9(ASYMMETRIC LEAVES 2-like 9)는 LBD(LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN)에 속하는 전사인자 중 하나로서, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 뿌리의 맥관(vasculature)에서 발현되며, ASL9의 발현은 사이토키닌(cytokinin)에 의해 강하게 증가된다고 알려져 있다. ASL9 (ASYMMETRIC LEAVES 2-like 9), on the other hand, is one of the transcription factors belonging to LBD (LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN), Arabidopsis thaliana roots, and the expression of ASL9 is known to be strongly increased by cytokinin.
한국공개특허 제10-2011-0108809호에 '고구마 유래 SRD1 유전자 및 이들 이용한 다수성 형질전환 식물체'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2009-0004459호에 '식물에서의 바이오매스 생산 조절 방법'에 대해 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 식물체의 비대 성장을 조절하는 ASL9 유전자 및 이의 용도에 관해서는 밝혀진 바가 없다. Korean Patent Laid-Open No. 10-2011-0108809 discloses ' SRD1 gene derived from sweet potato and a multiple transgenic plant using them', Korean Patent Laid-Open No. 10-2009-0004459 discloses a method for controlling biomass production in plants However, as in the present invention, the ASL9 gene, which regulates plant growth, has not been disclosed.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 ASL9 유전자의 발현이 조절된 식물체를 이용하여, ASL9 유전자가 식물체의 비대 성장에 관여하는 것을 확인하였다. 특히 ASL9 유전자를 과발현시켜 식물체의 뿌리 및 줄기에 존재하는 형성층의 발달을 유도하여 결과적으로 식물체의 비대 성장을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 따라서, ASL9 유전자를 이용하여 식물체의 뿌리 및 줄기의 비대 성장이 조절된 식물체 및 이의 종자를 생산할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention has been made in view of the above-mentioned needs. In the present invention, it has been confirmed that the ASL9 gene is involved in the hyperplasia of plants by using a plant in which the expression of the ASL9 gene is regulated. In particular, it was confirmed that overexpression of the ASL9 gene induces the development of cambium present in the roots and stem of the plant, resulting in increased plant growth. Thus, the inventors have completed the present invention by confirming that the ASL9 gene can be used to produce plants and their seeds in which the growth of roots and stems of plants is controlled.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ASL9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ASL9 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 비대 성장을 조절하는 방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for controlling the hyperplasia of a plant, comprising the step of transforming a recombinant vector comprising ASL9 gene into a plant cell to regulate the expression of the ASL9 gene.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 식물체의 비대 성장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for producing a transgenic plant in which the plant growth is regulated by the above method.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물체의 비대 성장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides transgenic plants and seeds thereof that have been regulated in the growth of plants produced by the above method.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 비대 성장 조절용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling growth of plants containing the recombinant vector as an active ingredient.
본 발명은 식물체의 비대 성장을 조절하는 ASL9 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 ASL9 유전자의 발현을 조절함으로써 식물체의 뿌리 및 줄기의 비대 성장을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 상기 유전자는 생산성 증대에 관여하는 유전자로서, 향후 다양한 작물의 비대 성장 촉진을 통한 생산성 향상에 활용될 수 있으며, 특히 무, 고구마, 당근 등의 뿌리 작물과 목재 및 에너지원으로 쓰이는 목본 식물의 생산성 증대에 유용하게 활용될 수 있어 농업 및 식물종자산업의 발전에도 크게 기여할 수 있을 것이다.The present invention relates to an ASL9 Gene, and its use, and it has been confirmed that the expression of ASL9 gene of the present invention can be regulated to significantly increase the growth of root and stem of the plant. Therefore, the gene is a gene involved in an increase in productivity, and can be utilized for improving the productivity by promoting the growth of various crops in the future. In particular, the productivity of woody plants used as root crops such as radish, sweet potato, It can contribute to development of agriculture and plant seed industry.
도 1은 본 발명의 U2::ASL9:VP16 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 U2::ASL9:VP16 형질전환체 및 야생형(WT)의 ASL9 발현량을 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명의 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형(Col-0)의 형질을 분석한 결과이다. A는 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형의 사진, B는 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형 각각 10개체에 대한 줄기의 직경 측정 결과, **는 99%의 신뢰도로 유의성이 있음을 의미, C는 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형 각각 10개체에 대한 뿌리의 직경 측정 결과, D는 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형의 줄기 횡단면 미세절단 이미지, 화살표는 형성층, E는 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형의 뿌리 횡단면 미세절단 이미지
도 4는 본 발명의 U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형(Col-0) 식물체의 사이토키닌 처리에 따른 뿌리 및 줄기 굵기 변화를 분석한 결과이다. A는 뿌리 굵기 변화, BAP(6-benzylaminopurine)는 사이토키닌 활성을 나타내는 합성화합물, B는 줄기 굵기 변화Figure 1 shows the U2 :: ASL9: VP16 vector map of the present invention.
FIG. 2 shows the results of comparing the ASL9 expression levels of the U2 :: ASL9: VP16 transformant and the wild type (WT) of the present invention.
FIG. 3 shows the results of analysis of the traits of U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and wild type (Col-0) of the present invention. A shows the diameters of stems for 10 U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and wild type, B for U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and 10 wild type, respectively. C means U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis thaliana transformants and 10 wild-type roots, D indicates the diameter of U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and wild type Truncated cross-sectional microcut image, arrows representing cambial layer, E: U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and wild-type roots cross-section microcutting image
FIG. 4 shows the results of analysis of roots and stem thickness changes of U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and wild-type (Col-0) plants of the present invention according to cytokinin treatment. A is the root thickness change, BAP (6-benzylaminopurine) is the synthetic compound showing the cytokinin activity, B is the stem thickness change
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ASL9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ASL9 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 비대 성장을 조절하는 방법을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for regulating plant enlargement, comprising the step of transforming a recombinant vector comprising a gene encoding ASL9 protein into plant cells to regulate the expression of ASL9 gene to provide.
본 발명에 따른 ASL9 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.The range of the ASL9 protein according to the present invention includes a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein. Is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70%, more preferably at least 90%, more preferably at least 90% Quot; refers to a protein having a homology of at least 95% with a physiological activity substantially equivalent to that of the protein represented by SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 상기 ASL9 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 식물체의 비대 성장을 조절하는 특징이 있으며, ASL9 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.In addition, the present invention provides a gene encoding the ASL9 protein. The gene of the present invention is characterized by controlling the hypertrophic growth of a plant, and includes both genomic DNA and cDNA encoding the ASL9 protein. Preferably, the gene of the present invention may include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, homologues of the nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 . "% Of sequence homology to polynucleotides" is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >
본 발명의 상기 "유전자 발현 조절"은 식물체 내의 ASL9 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 감소시키는 것을 말한다.The above-mentioned "gene expression control" of the present invention refers to increasing or decreasing the expression of the ASL9 gene in plants.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 비대 성장을 조절할 수 있는 방법으로, 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ASL9 유전자를 과발현시켜 뿌리 또는 줄기의 형성층의 발달을 유도하여 식물체의 뿌리 및 줄기의 비대 성장을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a method according to one embodiment of the present invention, a recombinant vector comprising the gene of SEQ ID NO: 1 is transformed into a plant cell by overexpressing the ASL9 gene to regulate the plant growth of the plant, But it is not limited to this, as it may induce development and increase the growth of roots and stems of the plant.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.The term "vector" is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector ". The term "expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of a plant expression vector is a Ti-plasmid vector which is capable of transferring a so-called T-region to a plant cell when it is present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector will preferably comprise one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate, phosphinothricin and glufosinate, kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, But are not limited to, antibiotic resistance genes such as chloramphenicol.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the plant expression vector of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto.
"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.The term "promoter " refers to the region of DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constructive promoters may be preferred in the present invention because the choice of transformants can be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit selectivity.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.In the plant expression vectors of the present invention, conventional terminators can be used. Examples thereof include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium and the terminator of the Octopine gene of Tumefaciens, but the present invention is not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.
상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워크 모자이크 바이러스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다.By "gene overexpression" is meant that the gene is expressed at a level that is expressed in a wild-type plant. As a method of introducing the gene into a plant, there is a method of transforming a plant using an expression vector containing the gene under the control of a promoter. The above promoter is not particularly limited as long as it can overexpress an insertion gene in a plant. Examples of such promoters include, but are not limited to, 35S RNA and 19S RNA promoters of CaMV; A full-length transcriptional promoter derived from Peak Work Mosaic Virus (FMV) and a coat protein promoter of TMV.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.Transformation of a plant means any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and / or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the present invention into suitable progenitor cells. The method is based on the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373) 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), the use of various plant elements (such as, for example, Shillito et al., 1985, Bio / Technol.3: 1099-1102) (DNA or RNA-coated) particle impact method (Klein et al., 1987, Nature 327: 70), infiltration of plants or Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer by transformation of mature pollen or micro- Virus infection (
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다."Plant cell" used for transformation of a plant may be any plant cell. Plant cells are cultured cells, cultured tissues, cultivated or whole plants. "Plant tissue" refers to a tissue of differentiated or undifferentiated plant, including but not limited to roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used for culture, protoplasts, shoots and callus tissue. The plant tissue may be in planta or may be in an organ culture, tissue culture or cell culture.
또한, 본 발명은 ASL9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체의 비대 성장이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a transgenic plant in which plant growth is regulated, comprising transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding an ASL9 protein.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 ASL9 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the ASL9 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, ASL9 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the production method according to one embodiment of the present invention, the gene encoding the ASL9 protein may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 비대 성장을 조절할 수 있는 방법으로, 상기 ASL9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ASL9 유전자를 과발현시켜 뿌리 또는 줄기의 형성층의 발달을 유도하여 식물체의 비대 성장을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a method according to an embodiment of the present invention, a recombinant vector comprising a gene coding for the ASL9 protein is transformed into a plant cell by overexpressing the ASL9 gene so as to regulate the plant growth of the plant, It is possible to induce the development of the cambium to increase the plant growth, but the present invention is not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물체의 비대 성장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides transgenic plants and seeds thereof that have been regulated in the growth of plants produced by the above method.
또한 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이다. 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Also, the plants according to the present invention can be applied to plants such as Arabidopsis, eggplant, tobacco, red pepper, tomato, burdock, ciliaceae, lettuce, bellflower, spinach, modern sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage, Rice, barley, wheat, rye, corn, sorghum, oats, onion, etc., such as rice bran, watermelon, melon, cucumber, pak, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, pea, It is preferably a dicotyledon. The plants are preferably Arabidopsis thaliana , but are not limited thereto.
또한, 본 발명은, ASL9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 비대 성장 조절용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for regulating the growth of plants containing a recombinant vector comprising a gene encoding ASL9 protein as an active ingredient.
본 발명의 식물체의 비대 성장 조절용 조성물은 유효 성분으로서 본 발명의 ASL9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 비대 성장을 조절할 수 있는 것이다. 바람직하게는 상기 ASL9 유전자를 과발현시켜 식물체의 비대 성장을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The composition for controlling growth of plants of the present invention includes a recombinant vector containing the gene encoding the ASL9 protein of the present invention as an active ingredient and is capable of regulating the growth of the plant by transforming the gene into a plant. Preferably, the overexpression of the ASL9 gene may increase plant enlargement, but the present invention is not limited thereto.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.
U2U2 :::: ASL9ASL9 :: VP16VP16 벡터 및 형질전환 식물체 제작 Producing vectors and transgenic plants
애기장대(Arabidopsis thaliana)에서의 ASL9(At1g16530) 유전자의 과발현을 위한 구조물은 멀티사이트 게이트웨이 시스템(multisite gateway system, Invitrogen)을 이용하여 제작하였다. U2 프로모터(At2g27510)는 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭되었으며, BP 반응을 통해 pDONR P4-P1R에 삽입시켰다. ASL9 유전자의 암호영역은 표 1에 기재된 프라이머에 의해 PCR 후 BP 반응을 통해 pDONR 221에 삽입시켰으며, VP16 유전자는 전사활성인자(transcriptional activator)로서, 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR 후 BP 반응을 통해 pDONR P2R-P3에 삽입시켰다(표 1). 그 다음 U2 프로모터, ASL9 유전자 및 VP16 유전자는 LR 반응을 통해 목표 벡터(destination vector)인 dpGreen-BarT 벡터(Lee et al. 2006. PNAS 103: 6055-6060)에 삽입시켰다. 이렇게 형성된 형질전환용 벡터는 pSOUP을 가지고 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101에 도입한 후, 꽃 침지법(floral dip method)을 이용하여 개화 직전 암술머리에 접종하여 애기장대 식물체의 게놈에 도입하였다(도 1). Arabidopsis The structure for the overexpression of ASL9 (At1g16530) gene in thaliana was constructed using a multisite gateway system (Invitrogen). The U2 promoter (At2g27510) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the primers shown in Table 1 and inserted into pDONR P4-P1R through BP reaction. ASL9 The coding region of the gene was inserted into pDONR 221 through the BP reaction after the PCR with the primer shown in Table 1. VP16 gene was used as a transcriptional activator and the BP reaction was performed using the primer shown in Table 1 And inserted into pDONR P2R-P3 (Table 1). The U2 promoter, ASL9 Gene and VP16 The gene was inserted into the target vector dpGreen-BarT vector (Lee et al. 2006. PNAS 103: 6055-6060) through LR reaction. The thus-transformed vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens GV3101 having pSOUP, and then introduced into the genome of Arabidopsis thaliana plants by inoculation into a stigma immediately before flowering using a floral dip method 1).
실시예Example 1. One. U2U2 :::: ASL9ASL9 :: VP16VP16 가 도입된 형질전환 식물체에서의 Lt; RTI ID = 0.0 > ASL9ASL9 발현 분석Expression analysis
야생형 및 U2 :: ASL9 : VP16 형질전환 식물체를 5주간 키운 후, 각각 10개체를 모아 뿌리 및 줄기에서 총(total) RNA를 추출하였다. 뿌리에서는 잔근을 제거한 주근을 모아 RNA를 추출하였으며, 줄기에서는 로제트(rosette) 잎부터 0.5cm 윗부분을 1cm 크기로 자른 것을 모아 총(total) RNA를 추출하였다. 총(total) RNA 1μg에 올리고(oligo, dT)16 1㎕, dNTP가 각각 2.5mM로 한 것을 4㎕ 넣어준 후, 총 14㎕가 되도록 3차 증류수로 양을 채워주었다. 이 혼합물을 65℃에서 5분간 반응시킨 후, 얼음에서 1분간 급냉시킨 후 변성(denaturation)시켰다. 이 혼합물에 인비트로젠(Invitrogen)사의 0.1M DTT 1㎕, 제1가닥(First-strand) 5X 버퍼 4㎕, Superscript 역전사효소 1㎕를 넣어 총 20㎕로 만든 후 50℃에서 60분간 역전사 반응을 진행하고 70℃에 15분간 반응하여 역전사 효소를 비활성화시켰다. 이렇게 얻어진 상보적 DNA 20㎕에 3차 증류수 80㎕를 넣어 최종 볼륨 100㎕로 만든 후, 1㎕를 사용하여 Real-time PCR을 진행하였다. 마커(Marker)로는 GAPDH를 이용하였으며, 표 1에 기재된 프라이머를 사용하였다. ASL9의 발현량을 확인하기 위한 표 1에 기재된 프라이머(서열번호 11 및 12)를 이용하였다(표 1). GAPDH 및 ASL9 에 대해 각각 3회 반복실험을 진행하였다.Wild type and U2 :: ASL9 : VP16 transgenic plants were grown for 5 weeks, and then 10 individuals were collected, and total RNA was extracted from roots and stems. In the root, the main stem was removed and the RNA was extracted. Total RNA was extracted from the stem by cutting 1 cm of the upper part 0.5 cm from the rosette leaf. 4 μl of oligo (dT) 16 μl and dNTPs 2.5 mM each were added to 1 μg of total RNA, and the volume was filled with the third distilled water so that a total of 14 μl was obtained. The mixture was allowed to react at 65 DEG C for 5 minutes and then quenched for 1 minute on ice and then denaturated. 1 μl of 0.1 M DTT from Invitrogen, 4 μl of first-strand 5 × buffer, and 1 μl of Superscript reverse transcriptase were added to the mixture to make a total of 20 μl, followed by a reverse transcription reaction at 50 ° C for 60 minutes And reacted at 70 ° C for 15 minutes to inactivate the reverse transcriptase. To 20 μl of the obtained complementary DNA, 80 μl of the third distilled water was added to make a final volume of 100 μl, and real-time PCR was performed using 1 μl. As the marker, GAPDH was used, and the primer shown in Table 1 was used. The primers (SEQ ID NOS: 11 and 12) listed in Table 1 were used to confirm the expression level of ASL9 (Table 1). GAPDH And ASL9 About Each experiment was repeated three times.
그 결과 도 2에서 개시한 바와 같이, 야생형 줄기의 발현량을 기준으로 야생형 뿌리와 유전자도입 식물체에서의 상대적인 ASL9 발현량을 보여주었으며, 형질전환 식물체 뿌리 및 줄기에서의 ASL9 발현량이 야생형보다 눈에 띄게 증가한 것을 확인할 수 있다.
As a result, as shown in Fig. 2, the relative amount of ASL9 expression in wild-type roots and transgenic plants was shown based on the expression level of wild-type stems, and the expression level of ASL9 in transgenic plant roots and stems was significantly .
실시예Example 2. 2. U2U2 :::: ASL9ASL9 :: VP16VP16 가 도입된 형질전환 식물체의 뿌리 및 줄기 Of root and stem of transgenic plants introduced 비대성장Hypertrophic growth 측정 및 내부 구조 분석 Measurement and internal structure analysis
U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형(wild type, Col-0)을 5주간 키운 후, 성장 차이를 분석하였다. 지상부의 무게를 측정한 결과는 도 3A에 개시한 바와 같이, 형질전환체와 야생형 사이에 큰 차이가 없었다. 줄기의 굵기 변화를 알아보기 위해 로제트(rosette) 잎으로부터 0.5cm 위 줄기의 굵기를 야생형과 비교한 결과, 52%의 증가를 보였다(도 3B). 또한, 뿌리의 굵기 변화를 알아보기 위해 배축(hypocotyl) 아래 뿌리의 굵기를 야생형과 비교한 결과, 30.2%의 증가를 보였다(도 3C). 지상부의 발달에는 영향이 없으나 줄기와 뿌리의 굵기에 영향을 미치는 것으로 보이며, 더 자세히 이해하기 위해 횡단면 미세절단을 진행한 결과, 형성층이 더 크게 발달한 것을 확인할 수 있었다(도 3D 및 3E).
U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis transformants and wild type (Col-0) were grown for 5 weeks and the growth difference was analyzed. As a result of measuring the weight of the upper part, there was no significant difference between the transformant and the wild type, as shown in Fig. 3A. In order to investigate the change in the thickness of the stem, the thickness of the stalk 0.5 cm from the rosette leaf was compared with the wild type, showing a 52% increase (FIG. 3B). In addition, in order to investigate the change in root thickness, root thickness under hypocotyl was compared with that of wild type, showing an increase of 30.2% (FIG. 3C). The growth of the shoots was not affected, but it seemed to affect the thickness of the stem and root. As a result of cross sectional microcracking for better understanding, it was confirmed that the cambium developed more greatly (FIGS. 3D and 3E).
실시예Example 3. 3. 사이토키닌Cytokinin (( CytokininCytokinin ) 처리한 형질전환 식물체의 비대 성장 변화 분석Analysis of Growth Changes in Transgenic Plants
U2::ASL9:VP16 애기장대 형질전환체 및 야생형에 식물호르몬인 사이토키닌을 처리한 후 나타나는 변화를 관찰하였다. U2::ASL9:VP16 형질전환 식물체 및 야생형을 화분에서 4주간 키운 후, 사이토키닌을 0μM , 10μM 및 100μM 농도로 처리하였다. 1주일 후 식물체들의 뿌리 및 줄기의 직경을 측정하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 형질전환 식물체 및 야생형 모두 사이토키닌 처리 시에 직경이 증가하지만, 야생형의 직경에 비례한 형질전환 식물체 직경의 비율은 사이토키닌 처리시 더 증가하는 것으로 확인되었다(표 2 및 표 3). 따라서, ASL9이 사이토키닌에 반응하여 형성층의 활성을 더 증가시킨 것으로 판단된다. U2 :: ASL9: VP16 Arabidopsis thaliana transformants and the wild-type plant hormone, cytokinin. U2 :: ASL9: VP16 transgenic plants and wild type were grown in pots for 4 weeks and treated with cytokinins at 0, 10 and 100 μM concentrations. After one week, the roots and stem diameters of the plants were measured. As a result, as shown in Fig. 4, although the transgenic plants and the wild-type plants increased in diameter during the treatment with cytokinins, the ratio of transgenic plant diameters proportional to the diameter of the wild type was found to be further increased upon treatment with cytokinins (Table 2 and Table 3). Therefore, it was judged that ASL9 reacted with cytokinin to further increase the activity of the cambium.
(100μM BAP)U2 :: ASL9: VP16
(100 [mu] M BAP)
(100μM BAP)U2 :: ASL9: VP16
(100 [mu] M BAP)
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> ASL9 gene controlling radial growth of plant and uses thereof <130> PN15025 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 498 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgagacaaa agggtcacag acacggaaga acagtatcgc cttgtgccgg ctgtaaactt 60 ctccggcgaa aatgtgtgaa agattcatgc gtctttgctc cgtattttcc ggccaaagag 120 ccttacaagt ttgccattgt ccacaagatt tttggtgcta gtaatgtcaa taagatgttg 180 caggagctgt cggagaacca ccggagcgac gccgtggatt cgatggtgta cgaggccaac 240 gcgaggatac aagatcctgt gtatggatgt gtagggacaa tttcgtcgtt acacagacaa 300 ctggaaactc tccaaactca gctcgctttt gctcaagccg agttgattca tataaggacg 360 ctccaccgta ttcataccaa acccccgccg tacacggcaa gtaccgttac tttcccctcg 420 aacaaagact tctacagtga catcgacatg gctgttgcgt atacggatga tgccggagac 480 ttcctttggt cttgctag 498 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Arg Gln Lys Gly His Arg His Gly Arg Thr Val Ser Pro Cys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Leu Leu Arg Arg Lys Cys Val Lys Asp Ser Cys Val Phe 20 25 30 Ala Pro Tyr Phe Pro Ala Lys Glu Pro Tyr Lys Phe Ala Ile Val His 35 40 45 Lys Ile Phe Gly Ala Ser Asn Val Asn Lys Met Leu Gln Glu Leu Ser 50 55 60 Glu Asn His Arg Ser Asp Ala Val Asp Ser Met Val Tyr Glu Ala Asn 65 70 75 80 Ala Arg Ile Gln Asp Pro Val Tyr Gly Cys Val Gly Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu His Arg Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Gln Leu Ala Phe Ala Gln 100 105 110 Ala Glu Leu Ile His Ile Arg Thr Leu His Arg Ile His Thr Lys Pro 115 120 125 Pro Pro Tyr Thr Ala Ser Thr Val Thr Phe Pro Ser Asn Lys Asp Phe 130 135 140 Tyr Ser Asp Ile Asp Met Ala Val Ala Tyr Thr Asp Asp Ala Gly Asp 145 150 155 160 Phe Leu Trp Ser Cys 165 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggggacaact ttgtatagaa aagttgccta taaaagcttt cacgtttt 48 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggggactgct tttttgtaca aacttgctct tgtttatcac ctgcgtt 47 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggggacaagt ttgtacaaaa 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