KR20160103588A - 슈도노카르디아 종 유래의 진세노사이드 글리코시다제 및 이를 이용한 마이너 진세노사이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 슈도노카르디아 종(Pseudonocardia sp.) 유래 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁으로 전환시키는 우수한 활성을 나타내어, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁의 고수율 생산 및 대량생산에 이용될 수 있다.

Description

슈도노카르디아 종 유래의 진세노사이드 글리코시다제 및 이를 이용한 마이너 진세노사이드의 제조방법{Ginsenoside glycosidase derived from Pseudonocardia sp. and method for producing minor ginsenosides with the same}

본 발명은 슈도노카르디아 종(Pseudonocardia sp.) 유래 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

중요한 약초인 인삼은 수천년 동안 동아시아에서 널리 사용되어왔고 과거 수십년 사이에 서아시아에서도 유명해졌다. 인삼의 뿌리는 진세노사이드, 다당류, 펩타이드, 폴리아세틸레닉 알코올 그리고 지방산을 포함하며, 이 중 진세노사이드는 인삼의 주요한 구성 성분이다. 상기 진세노사이드는 혈관 이완, 항종양, 항당뇨, 항염증, 항산화를 포함한 인삼의 약학적인 작용에 주로 관여한다.

진세노사이드는 담마레인 골격을 가지는 아글리콘의 구조에 따라서 프로토파낙시디올(PPD), 프로토파낙사트리올(PPT) 및 올레아네인 진세노사이드로 분류된다. PPD 및 PPT 계열의 진세노사이드는 아글리콘의 C3, C6 또는 C20 위치에 붙는 당부분의 위치와 수에 따라서 하위 집단으로 분류된다. 예를 들어, 가장 큰 PPD 계열 진세노사이드 중 하나인 Rb₁ 은 4개의 글루코스 성분을 가지고 있으며, 상기 글루코스는 글리코시드 결합을 통해 아글리콘의 C3 및 C20 위치에 각각 결합한다. 또한 진세노사이드는 재배한 인삼에서 발견되는 양에 따라서 메이저 또는 마이너 진세노사이드로 나누어진다.

진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re 및 Rg₁ 은 전체 인삼 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 메이저 진세노사이드이다. 메이저 진세노사이드로부터 탈당이 일어난 마이너 진세노사이드(Rg₃, Rh₂, F₂, C-K, Rg₂, Rh₁, 및 F₁)은 더 적은 양이 존재한다. 이러한 마이너 진세노사이드는 이차 대사물 화합물이기 때문에 메이저 진세노사이드와 달리 화학 반응성을 가진다. 게다가 메이저 진세노사이드 보다 마이너 진세노사이드가 항암, 항당뇨, 항산화, 항노화와 같은 약효를 가진다고 보고되었다(Pharmacology of ginsenosides: a literature review, Chin. Med., 2010, 5, 20-22).

20(S)-진세노사이드 Rg₂(Rg₂(S))는 한국의 백삼 및 홍삼(Panax ginseng, C.A. Meyer)에서 발견되는 천연 진세노사이드이며, 홍삼(더 많은 마이너 진세노사이드를 가지는 열을 가한 인삼)에서 건조 질량의 0.02 %보다 더 적은 양으로 존재한다. 진세노사이드 Rg₂(S)는 중요한 신경 보호 약효가 있으며, 이것은 항산화, 세포사멸 억제 메커니즘을 가지는 신경 보호 물질로서 쥐의 뇌에서 미토콘드리아의 투과성 전이 기공을 억제한다. 그러므로 Rg₂는 잠재적으로 알츠하이머 질병의 치료제로 사용할 수 있다. 또한, Rg₂는 혈관성 치매 쥐의 신경 기능과 기억 능력을 향상시킨다. 그리고 Rg₂는 DNA 보수 증가 및 세포 괴사 감소를 통해 UVB에 의해 유도된 유전독성으로부터 세포를 보호할 수 있다. Rg₂는 출혈성 쇼크가 있는 개의 혈류역학 상태와 SOD(superoxide dismutase) 활성을 개선시키는데 큰 영향을 준다. 게다가 Rg₂는 사람 세포에서 관 벽에 백혈구 부착을 억제하여 혈관 염증 질환을 억제한다. 마지막으로 Rg₂는 간에서 글루코오스 생성을 억제하여 타입 2 당뇨병 환자의 치료제로 사용될 수 있다.

반면, 마이너 진세노사이드인 Rg₃는 항암활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 상기 진세노사이드 Rg₃는 폐 전이(lung metastasis)를 억제하며, 상기와 같은 전이 억제는 종양에 의해 유도되는 혈관신생(angiogensis)의 억제뿐만 아니라, 암세포의 침윤 및 부착(adhesion)을 억제하는 것과 관련되어 있다. 또한, 진세노사이드 Rg₃는 염증 등에 관여하는 전사인자인 NF-kB 및 AP-1 전사인자를 하향조절(down-regulation)하여, 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 기작 외에도 Rg₃는 세포내 칼슘 수준을 감소키는 것으로 알려져 있으며, 대장암에서는 세포예정사(apoptosis)를 유발하며, 전립선암에서는 암세포의 증식을 억제하며, 난소암에서는 단독 또는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 병용사용하였을 때 암세포의 증식 및 혈관신생을 억제하는 것을 보인바 있다. 진세노사이드 Rg₃는 상기와 같은 항암 효과 뿐만 아니라, AMPK(AMP-activated protein kinase) 신호전달 경로 및 PPAR-γ 억제를 통하여 항 비만 효과를 가지고 있음이 알려진바 있다. 이러한 이유로 Rg₃는 암 및 비만 등을 포함하는 다양한 질병에서 약학적 활성 성분으로서 많은 주목을 받아 오고 있다.

또 다른 마이너 진세노사이드 Rh₁은 항 알러지 및 항 염증 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 진세노사이드 Rh₁은 기억력 증진 효과 및 암에서 항 전이활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 에스트로겐 수용체를 활성화시키므로, 이러한 점에서 진세노사이드 Rh₁은 암을 비롯한 여러 질병 등에서 신규한 치료 물질로 여겨지고 있다.

홍삼화는 인삼의 보존과 효과 증진을 이루기 위해 특히 한국에서 수백 년 전부터 발달된 방법으로, 홍삼화 과정은 85 내지 100℃에서 18시간 동안 열처리를 한다. 이 과정을 통하여 인삼에 존재하는 메이저 진세노사이드들(Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁)의 20번 탄소의 탈글리코실화(deglycosylation)를 야기시켜서 진세노사이드의 활성을 증진시킬 수 있다. 이러한 홍삼화 과정은 마이너 진세노사이드의 함량을 증가시킬 수 있지만, 선택적인 stereoisomer 타입의 마이너 진세노사이드를 생산할 수 없는 단점을 지닌다. 즉, (S) 폼만이 아니라 항상 (R) 폼이 동시에 생기게 되어 (S) 폼의 마이너 진세노사이드의 함량이 낮아지는 단점이 있다. 또한, PPD 계열의 메이저 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rd를 약산성 조건에서 열처리를 하면 쉽게 20번 탄소의 탈글리코실화(deglycosylation)를 야기시켜 Rg₃을 만들 수 있지만, 이는 20번 탄소의 탈수화 형태(dehydration form)의 Rk₁, Rg₅라는 부산물을 생성하므로, Rg₃의 함량은 낮게 되는 단점을 지닌다.

마이너 진세노사이드를 얻는 또 다른 방법은 미생물이나 효소를 이용하는 것이다. 몇몇의 진세노사이드 가수분해 재조합 효소들이 만들어졌지만, 이들 중 다수는 PPT 계열 진세노사이드(Re, Rf 및 Rg₁) 보다는 PPD 계열 진세노사이드(Rb₁, Rb₂, Rc 및 Rd)에 대해 가수분해 능력을 가진다. 또한 PPT 계열 진세노사이드 혼합물을 이용하여 그램 단위의 Rg₂(S)를 얻은 내용이 Cui et al을 통해 보고된 바 있으나, 산출량이 낮았고(33.4%), 실리카 수지를 이용한 마지막 정제 과정이 복잡하다는 단점이 있었다(Appl. Environ. Microbiol., 2013, 79, 5788-5798).

이에, 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태의 희귀 진세노사이드를, 특히 20번 탄소에 위치한 당이 가수분해된 형태의 진세노사이드를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 슈도노카르디아 종(Pseudonocardia sp.) Gsoil 1536 균주로부터 메이저 형태의 진세노사이드에서 마이너 진세노사이드로의 생전환 활성을 가지는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 유전자를 수득하였고, 상기 유전자에 의해 코딩되는 진세노사이드 글리코시다제가 20번 탄소에 당을 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 20번 탄소의 당이 가수분해된, 마이너 진세노사이드를 효과적으로 전환시킬 수 있으며, 특히 100 그램 스케일의 Rg₂(S)를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 진세노사이드 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, F_2, Re 및 Rg₁으로 이루어지는 군으로부터 선택된 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해하여 탈글리코실화된 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 가용성인 마이너 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 진세노사이드 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, F_2, Re 및 Rg₁으로 이루어지는 군으로부터 선택된 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해하여 탈글리코실화된 형태인 가용성 마이너 진세노사이드로 전환하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 진세노사이드 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, F_2, Re 및 Rg₁으로 이루어지는 군으로부터 선택된 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해하여 탈글리코실화된 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 가용성인 마이너 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "PPD(protopanaxadiol) 계열의 진세노사이드"는 담마란(dammarane)계 사포닌으로, 3번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH기를 가지고 있는 PPD 또는 상기 PPD의 상기 -OH기가 하나 이상 글리코실화된 진세노사이드를 말한다. 이의 예로 Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rc, Rd, Ra₃, Rg₃, Rh₂, Rs₁, C-O, C-Y, C-Mc1, C-Mc, F₂, C-K, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 지페노사이드 LXXV(Gypenoside LXXV) 또는 Rs₂가 있다. 특히, 본 발명의 목적상 PPD 계열의 진세노사이드는 상기 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의해 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD로 전환될 수 있는 진세노사이드를 모두 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 Rb₁, Rd 또는 Rb₃가 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의하여 진세노사이드 Rg₃(S)로 전환될 수 있음을 확인하였다(도 6). 상기 PPD 계열의 진세노사이드는 바람직하게는 진세노사이드 Rb₁, Rd 또는 Rb₃이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드"는 담마란계 사포닌으로, 3번, 6번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH기를 가지고 있는 PPT 또는 상기 PPT의 상기 -OH기가 글리코실화된 진세노사이드를 말한다. 이의 예로 진세노사이드 Re, Rg₁, Rf, F₁, Rg₂, PPT(protopanaxatriol) 또는 Rh₁이 있다. 특히 본 발명의 목적상 상기 PPT 계열의 진세노사이드는 상기 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의해 진세노사이드 Rg₂ 또는 Rh₁으로 전환될 수 있는 진세노사이드를 모두 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 Re 및 Rg₁이 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의하여 각각 Rg₂(S) 및 Rh₁(S)으로 전환될 수 있음을 확인하였다(도 7). 상기 PPT 타입의 진세노사이드는 바람직하게는 Re 또는 Rg₁이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드는 분리 및 정제된 형태의 진세노사이드를 이용할 수도 있고, 또는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드들을 이용할 수도 있다. 즉, 진세노사이드를 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 화기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 구조를 도 1에 나타내었다.

본 발명에서 용어, "가용성인 마이너 진세노사이드"는 체내 흡수가 어려운 메이저(major) 형태의 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번째 탄소에 위치한 당인 글루코스, 자일로스, Glc(1→6)Glc 또는 Xyl(1→6)Glc를 가수분해하여 생성된, 상대적으로 체내 흡수가 용이한 마이너(minor) 형태의 진세노사이드를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메이저 형태의 PPD 계열 진세노사이드는 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, 또는 F₂를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 메이저 형태의 PPT 타입 진세노사이드는 Re 또는 Rg₁을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 가용성 진세노사이드는 진세노사이드 Rd, Rg₃, Rg₂, Rh₁, Rh₂, F₁, C-O, C-Mc₁, PPD 또는 PPT를 포함하며, 바람직하게는 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "Glc(1→6)Glc"는 글루코스(glucose, Glc)의 1번 탄소와 다른 글루로스의 6번 탄소가 α또는 β 결합으로 연결된 이당류를 의미하는 것으로, 구체적으로 글루코스의 1번 탄소와 다른 글루로스의 6번 탄소가 α 결합으로 연결된 이당류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "Xyl(1→6)Glc"는 자일로스(xylose, Xyl)의 1번 탄소와 글루로스의 6번 탄소가 α또는 β 결합으로 연결된 이당류를 의미하는 것으로, 구체적으로 글루코스의 1번 탄소와 다른 글루로스의 6번 탄소가 α 결합으로 연결된 이당류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rg₃"는 PPD 계열의 진세노사이드의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소에 두 개의 글루코스(Glc→Glc)가 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Rb₁, Rd 및 Rb₃ 등에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 말한다. 상기 진세노사이드 Rg₃는 Rg₃(S) 및 Rg₃(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rg₃(S)이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rh₂"는 PPD 타입의 진세노사이드의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소에 한 개의 글루코스가 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Rb₁, Rd 및 Rb₃ 등에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 말한다. 상기 진세노사이드 Rh₂는 Rh₂(S) 및 Rh₂(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rh₂(S)이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rg₂"는 PPT 타입의 진세노사이드의 기본 탄소 골격에 있어, 6번 탄소에 람노피라노실기가 연결된 글루코스(Glc(2→1)Rha)가 존재하는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Re에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 의미한다. 상기 진세노사이드 Rg₂는 Rg₂(S) 및 Rg₂(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rg₂(S)이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rh₁"은 PPT 타입의 진세노사이드의 기본 탄소 골격에 있어, 6번 탄소에 글루코스가 존재하는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Rg₁에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 의미한다. 상기 진세노사이드 Rh₁은 Rh₁(S) 및 Rh₁(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rh₁(S)이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 진세노사이드 Rg₃는 항암, 항산화 효과를 가지므로, 암과 같은 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이며, PPD 및 Rg₂는 항암, 면역증강 효과를 가지므로 암과 같은 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이고, Rg₂ 및 Rh₁는 항 알러지, 항 염증 활성을 지녀 염증성 질환 등에 사용될 수 있는 유용성을 지닌다. 다만, 이러한 유용성에도 불구하고 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 및 Rh₁은 인삼에 미량으로 존재하므로 대량생산할 필요가 있으며, 이때 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁, 특히 Rg₃(S), Rh₂(S), PPD(S), Rg₂(S) 또는 Rh₁(S)로 전환시킬 수 있는 적절한 효소를 규명해야한다. 다만, 같은 글리코시다제에 속하는 효소라 하더라도 그 효소 활성이 글루코시다제, 셀룰라제와 같이 다양한 효소 활성을 나타낼 수 있으므로, 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 및 Rh₁으로 전환시키는 활성을 지닌 적절한 효소를 규명해야할 필요성이 있다. 이에 본 발명자들은 이와 같은 활성을 갖는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 동정하여 그 기능을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 글리코시다제(Ginesenoside glycosidase)"는 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소를 의미한다. 진세노사이드 글리코시다제의 활성 정도 및 기능은 효소 종류마다 차이가 있다. 본 발명에서 서열번호 1로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 계열 또는 PPT 계열 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해시킬 수 있는 활성을 지니는 단백질로서, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열을 가지는 단백질뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 서열번호 1로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질이라면 본 발명에 포함될 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 유사성이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제는 슈도노카르디아 종(Pseudonocardia sp.) Gsoil 1536에서 유래한 효소로서, 이는 본원발명에서 BglPC28과 혼용될 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성을 가져, 글루코스, 자일로스, Glc(1→6)Glc 또는 Xyl(1→6)Glc가 치환된 분자를 연결하는 β1→2, β1→4, β1→6 결합을 분해할 수 있어, 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드인 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 슈도노카르디아 종 Gsoil 1536로부터 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 정제하였고, 이를 BglPC28로 명명하였다(실시예 1). 상기 BglPC28를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 2,232bp 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 743개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.

상기 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당에 대해 바깥쪽 및 안쪽 글루코스, 자일로스, Glc(1→6)Glc 또는 Xyl(1→6)Glc에 대한 선택적 가수분해능을 가진다.

본 발명의 일 실시예에서는 진세노사이드 Rb₁을 진세노사이드 Rd로 전환, 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 Rg₃(S)로 전환, 진세노사이드 Rb₃을 진세노사이드 Rd로 전환한 후 진세노사이드 Rg₃(S)로 전환하는 것을 확인하여, 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제가 PPD 계열의 진세노사이드의 20번 탄소의 글루코스에 대한 선택적 가수분해로 진세노사이드 Rg₃(S)를 제조할 수 있음을 확인하였다(도 6).

구체적으로, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Rd의 경우, 진세노사이드 Rd의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 한 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety)를 가수분해하여, 진세노사이드 Rg₃, 특히 Rg₃(S)로 전환시킬 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Rb₁의 경우, 진세노사이드 Rb₁의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 두 개의 글루코스 모이어티(Glc(1→6)Glc)를 가수분해하여, 진세노사이드 Rg₃, 특히 Rg₃(S)로 전환시킬 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Rb₃의 경우, 진세노사이드 Rb₃의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 두 개의 당 모이어티(Glc(1→6)Xyl)를 가수분해하여, 진세노사이드 Rg₃, 특히 Rg₃(S)로 전환시킬 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Gyp XVII, 또는 Gyp LXXV의 경우, 진세노사이드 Gyp XVII,또는 Gyp LXXV의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 두 개의 당 모이어티(Glc(1→6)Glc)를 가수분해하여, 각가 진세노사이드 Rh_{2 ,} PPD 및 Rh₂로 전환시킬 수 있으며, 특히 각각 Rh₂(S), PPD(S) 및 Rh₂(S)로 전환시킬 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 F₂의 경우, 진세노사이드 F₂의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 한 개 의 당 모이어티(glucose moiety)를 가수분해하여, 진세노사이드 Rh₂로 전환시킬 수 있으며, 특히 각각 Rh₂(S)로 전환시킬 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 글루코스, 자일로스, Glc(1→6)Glc 또는 Xyl(1→6)Glc에 대한 선택적 가수분해능을 가진다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Re의 경우, 진세노사이드 Re의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 한 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety)를 가수분해하여 진세노사이드 Rg₂, 특히 Rg₂(S)로 전환시킬 수 있다. 더불어 진세노사이드 Rg₁의 경우, Rg₁의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 한 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety)를 가수분해하여 진세노사이드 Rh₁, 특히 Rh₁(S)로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성인 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있으며, 이 단백질은 활성 및 안정성이 유지될 수 있는 한 다양한 온도 및 pH 조건에서 사용될 수 있으며, ZnCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, DTT 및 머캅토에탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속 및 화학 제재를 함께 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서 온도가 BglPC28 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, BglPC28의 활성 최적 온도는 37 ℃ 이었고, 37 ℃가 지나면 내열성이 빠르게 감소하여, 30 ℃ 와 25 ℃에서 효소는 각각 90.0% 와 67.2%의 상대적인 활성을 보였다(도 5a). 또한 효소는 30 ℃보다 낮은 온도에서 안정하였고, 활성의 최적 온도인 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하면 활성이 70.6%가 감소됨을 확인하였다(도 5b).

본 발명의 다른 일 실시예에서 pH가 BglPC28 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, BglPC28은 30 ℃의 인산 나트륨 완충액 pH 7.0에서 최적 pH 활성과 안정성을 가지고, pH 8.0부터 효소 활성이 빠르게 감소하며, pH 5.0에서 효소 활성은 58.1%까지 감소함을 알 수 있었다(도 5b).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서 금속 및 다른 화학 시약이 BglPC28 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, Mg^{2 +}는 BglPC28 활성에 영향을 주지 않았지만, 50 mM Cu²⁺에 의해 활성을 잃었고, 1 mM Hg^{2 +} 또는 10 mM SDS에 의해서도 활성이 억제되었다. 그러나 BglPC28의 활성은 티올기 억제제인 DTT와 β-메르캅토에탄올에 영향을 받지 않았다. 이를 통해 BglPC28의 촉매작용 부위에 설프히드릴기 없음을 알 수 있었다. 또한 킬레이트 시약인 EDTA는 BglPC28의 활성을 억제하지 않았는데, 이를 통해 효소 활성에 이가 양이온이 필요하지 않음을 알 수 있었다(표 1).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서 BglPC28의 기질 특이성 분석한 결과, BglPC28은 pNP-β-D-글루코피라노사이드와 pNP-β-L-아라비노피라노사이드에 대해 활성이 가장 높았고, pNP-α-D-글루코피라노사이드, pNP-β-D-글루코사미나이드 및 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대해서는 활성이 낮았지만, 이를 제외한 다른 PNP- 와 oNP-글리코시드에는 활성이 없었다(표 2).

본 발명의 진세노사이드 Rg₃를 제조하는 방법은 바람직하게는 Rd로부터 Rg₃로의 전환과정, Rb₁으로부터 Rg₃로의 전환과정, 또는 Rb₃로부터 Rg₃로의 전환과정을 포함하며, 진세노사이드 Rh₂를 제조하는 방법은 바람직하게는 Gyp XVII으로부터 Rh₂으로의 전환과정, 또는 F₂로부터 Rh₂으로의 전환과정을 포함하고, 진세노사이드 PPD를 제조하는 방법은 바람직하게는 Gyp LXXV로부터 PPD로의 전환과정을 포함하며, 진세노사이드 Rg₂를 제조하는 방법은 바람직하게는 Re로부터 Rg₂로의 전환 과정을 포함하고, 진세노사이드 Rh₁를 제조하는 방법은 Rg₁으로부터 Rh₁으로의 전환과정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 진세노사이드 글리코시다제의 전환 활성을 도 8a 및 8b에 나타내었다.

본 발명의 가용성인 마이너 진세노사이드를 제조하는 방법은 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양물과 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 조제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.

상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 PPD 계열의 진세노사이드를 전환시켜서 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, 또는 PPD로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPD 계열의 진세노사이드인 Rd로부터 Rg₃로의 전환활성, Rb₁으로부터 Rg₃로의 전환활성, Rb₃로부터 Rg₃로의 전환활성, Gyp XVII로부터 Rh₂로의 전환활성, Gyp LXXV로부터 PPD로의 전환활성, F₂로부터 Rh₂로의 전환활성을 지닌 형질전환체를 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 형질전환체는 PPT 계열의 진세노사이드를 전환시켜서 진세노사이드 Rg₂ 또는 Rh₁로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPT 계열의 진세노사이드인 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 Rg₂로의 전환활성 또는 진세노사이드 Rg₁로부터 Rh₁으로의 전환활성을 지니나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 비제한적인 예로는 대장균(E. coli )과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다.

또한, 상기 형질전환체를 배양하여 수득한 배양물을 이용하여 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 전환시켜 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁를 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 상기 배양물은 배양상등액 또는 세포 파쇄액을 모두 포함하며 세포가 포함 또는 불포함될 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 PPD 계열의 진세노사이드를 전환시켜서 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁으로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPD 타입의 진세노사이드인 진세노사이드 Rd로부터 Rg₃로의 전환활성, Rb₁으로부터 Rg₃로의 전환활성, Rb₃로부터 Rg₃로의 전환활성, Gyp XVII로부터 Rh₂로의 전환활성, Gyp LXXV로부터 PPD로의 전환활성, F₂로부터 Rh₂로의 전환활성을 지닌 형질전환체를 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 형질전환체는 PPT 계열의 진세노사이드를 전환시켜서 진세노사이드 Rg₂ 또는 Rh₁로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPT 계열의 진세노사이드인 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 Rg₂로의 전환활성 또는 진세노사이드 Rg₁로부터 Rh₁으로의 전환활성을 지니나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 BglPC28이 β-글루코시다제의 효소 활성을 지녀, PPD 계열의 진세노사이드인 Rb₁의 20번 탄소에 위치한 Glc(1→6)Glc를 분해하여 진세노사이드 Rg₃로 전환시키는 활성 및 진세노사이드인 Rb₃의 20번 탄소에 위치한 Xyl(1→6)Glc를 분해하여 진세노사이드 Rg₃로 전환시키는 활성을 지님을 확인하였고, 또한, PPT 계열의 진세노사이드인 Re의 20번 탄소에 위치한 글루코스를 분해하여 진세노사이드 Rg₂로 전환시키는 활성을 지니며, PPT 계열의 진세노사이드인 Rg₁의 20번 탄소에 위치한 글루코스를 분해하여 진세노사이드 Rh₁으로 전환시키는 활성을 지님을 확인하여, 본 발명의 진세노사이드 글루코시다제가 인삼 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 글루코스에 대하여 선택적 가수분해능이 있는 것을 확인하였다(도 6 및 7).

본 발명의 다른 일 실시예에서는 진세노사이드 Re가 Rg₂(S)로 전환되는 최적 조건을 결정하기 위해, 반응에서 Re의 기질 농도 및 효소 농도를 최적화하였다. 그 결과, 낮은 기질 농도(20 mg/ml)와 높은 조효소 농도(50 mg/ml)의 조건에서, 진세노사이드 Re는 4시간 안에 진세노사이드 Rg₂(S)로 완전히 전환되었다(도 9). 이 반응 속도는 20 mg/ml Re와 20 mg/ml 조효소 조건보다 3배 빠른 속도이고, 30mg/ml Re와 50 mg/ml 조효소 농도 조건보다 6배 빠른 속도이었다. 대용량 전환 과정에서 더 적은 양의 효소로 Re의 전환을 완료하기 위해, 20 mg/ml 기질과 20 mg/ml 조효소 조건을 채택하였다(도 9).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서는 대용량으로 진세노사이드 Re로부터 Rg₂(S)를 전환하기 위해, 10 L 교반-탱크 반응기(BiotronGX, Hanil science Co., 한국)에서 10% DMSO, 최종 농도 20 mg/ml의 진세노사이드(Re; 전체 150 g) 및 1.5 L의 재조합 BglPC28 조효소(20 mg/ml)를 포함한 7.5 L 반응액을 100 rpm에서 24시간 동안 pH 7.0, 30 ℃로 반응시킨 후, 4℃에서 냉각하였고, 15분 동안 5000 rpm 속도로 원심분리(Component R, Hanil science Co Ltd., Korea)하였다. 침전물은 5.0 L의 70 % 에탄올 용액에 두 번 용해시켰고, 여과지(Advantec, 일본)로 여과한 후, 상기 에탄올 추출물이 40% 에탄올 용액이 되도록 농도를 조정하였다.

HP20 수지(Mitsubishi, 일본)로 가득 찬 컬럼(3,170(L)×128(D) mm; Doointech, Korea)에 상층액과 40% 에탄올 용액을 함께 로딩하였다. 비드에 흡착된 유리당 분자와 원하지 않는 친수성 화합물들을 6 흡착제 부피(BV)의 물로 세척하였고, 마지막으로 흡착된 진세노사이드를 6BV의 95% 에탄올(extra pure grade; SK Chemicals, 한국)을 사용하여 용출시켰다.

그 결과, Re 중에서, BglPC28을 이용해서 Rg₂(S)로 전환될 수 있는 Re의 전체 몰량은 138.8 mmol이었고, 이는 150g에 대한 131.4 g과 일치하였다. 잔여물(18.6g)은 다른 타입의 진세노사이드, 수분 및 알 수 없는 불순물들로 구성되어 있었다. 생산된 진세노사이드 Rg₂(S)의 몰량은 120.9 mmol이었고, 그 결과 진세노사이드 Re를 Rg₂(S)로 전환하는 과정에서 회수율이 87.1%에 도달함을 알 수 있었다.

이를 통해 본원발명의 BglPC28는 진세노사이드 Re로부터 Rg₂(S)를 높은 순도로 전환할 수 있으며, 동시에 대량생산할 수 있음을 확인하여, 산업적으로 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 진세노사이드 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, F_2, Re 및 Rg₁으로 이루어지는 군으로부터 선택된 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해하여 탈글리코실화된 형태인 가용성 마이너 진세노사이드로 전환하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 PPD 계열의 진세노사이드, PPT 계열의 진세노사이드, 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 마이너 진세노사이드, 형질전환체 또는 이의 배양물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 인삼 진세노사이드의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 지니므로 마이너 진세노사이드인 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁을 생산하는 데 있어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 핵산을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 진세노사이드 글루코시다제를 코딩하는 핵산은 진세노사이드 글루코시다제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산인 한 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 유사성은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 슈도노카르디아 종(Pseudonocardia sp.) 유래 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁으로 전환시키는 우수한 활성을 나타내어, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, PPD, Rg₂ 또는 Rh₁의 고수율 생산 및 대량생산에 이용될 수 있다.

도 1은 프로토파낙시디올(PPD) 계열과 프로토파낙사트리올(PPT) 계열의 진세노사이드의 화학적 구조를 나타낸 도이다((S)-타입 진세노사이드; glc, β-D-glucopyranosyl; arap, α-L-arabinopyranosyl; araf, α-L-arabinofuranosyl; rha, α-L-rhamnopyranosyl; Gyp, gypenoside; C, compound; C-O, compound O; C-Y, compound Y, C-Mc₁, compound Mc₁; C-Mc, compound Mc; C-K, compound K).
도 2는 특성이 분석된 글리코사이드 가수분해효소 패밀리 3(GH3)의 계통 발생 분석을 나타낸 도이다. 아미노산 시퀀스는 NCBI/EMBL 데이터베이스와 CAZy 데이터베이스로부터 얻었다(일련 번호는 계통수에 나타내었다). 상기 계통수는 포아송 모형 및 한쌍 목록 삭제(pairwise deletion)와 함께 인접 결합 방법(neighbor-joining method)을 통해 제작되었다. 65 %보다 더 큰 1000개의 복제물의 비율로 표현되는 부트스트랩 값은 가지 끝에 나타내었다. 바는 100개의 아미노산 잔기 당 20개의 아미노산 잔기 치환을 나타낸다.
도 3은 진세노사이드 전환 BglPC28과 Bgp1 또는 글리코시드 가수 분해 효소 패밀리 3에 속하는 구조가 밝혀진 효소의 시퀀스 배열을 나타낸 도이다. 시퀀스 배열은 EBI-서버에서 디폴트 세팅을 이용하여 ClustalW를 통해 만들었고, Jalview (http://www.ebi.ac.uk/Vmichele/jalview/)에 의해 시각화하였다. 시퀀스 사이에 동일한 부분이나 높은 유사성을 보이는 부분은 각각 검정색 또는 회색 줄로 나타내었다. 보존 활성 부위 잔유물(일반적인 산/염기와 구핵 원자 잔유물)은 별표로 표시하였다. S. ven과 K. mar의 PA14 도메인은 박스로 나타내었다.
글리코시드 가수분해 패밀리 3의 Genbank ID는 다음과 같다: Pseudonocardia sp. Gsoil 1536 β-글루코시다제(BglPC28), JX960416; Microbacterium esteraromaticum KACC 16318 β-글루코시다제(Bgp1), AEX88466; Streptomyces venezuelae β-글리코시다아제(S. ven), AAC68679; Thermotoga neapolitanaDSM 4359Tβ-글리코시다아제(T. nea), ABI29899; Kluyveromyces marxianus β-글루코시다제(K. mar), ACY95404.
도 4는 GST-바인드 아가로스 수지를 이용한 정제 후, 재조합 BglPC28의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도이다(레인 1: 단백질 발현이 유도되지 않은 조 추출물, 레인 2: 단백질 발현이 유도된 재조합 BL21(DE3) 세포의 조 추출물의 가용성 부분, 레인 3: 단백질 발현이 유도된 재조합 BL21(DE3) 세포의 조 추출물의 침전물 부분, 레인 4: GST-바인드 아가로스 수지로 정제한 후의 GST-BglPC28, 레인 5: 트롬빈으로 절단 후 정제된 재조합 BglPC28).
도 5는 재조합 BglPC28의 활성과 안정성에 대한 온도(a)와 pH(b)의 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 재조합 BglPC28에 의한 PPD 계열 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rc 및 Rd의 전환을 박층크로마토그래피(TLC)로 분석한 결과를 나타낸 도이다. 샘플링 시간은 반응 후 10분과 24시간이었다(S: 진세노사이드 표준 물질).
도 7은 BglPC28에 의한 PPT 계열 진세노사이드 Re(a) 및 Rg₁(b)의 전환을 TLC로 분석한 결과를 나타낸 도이다(S: 진세노사이드 표준 물질).
도 8a는 재조합 BglPC28에 의해 PPD 계열 진세노사이드 Rb₁, Rb₃ 및 Rd이 각각 전환되는 경로를 나타낸 도이다.
도 8b는 재조합 BglPC28에 의해 PPT 계열 진세노사이드 Re 와 Rg₁이 각각 전환되는 경로를 나타낸 도이다.
도 9는 진세노사이드 Rg₂(S)의 생산 프로파일이 Re와 BglPC28 조효소의 농도에 따라 변화하는 것을 보여주는 도이다.
도 10은 GST-BglPC28에 의한 Re 전환을 보여주는 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다(S: 진세노사이드 표준 물질, a: 기질 Re, b: 24시간 동안 Re와 GST-BglPC28 를 반응시켜 생산된 Rg₂(S)).
도 11은 m/z가 783.8 [M-H]^-일 때 생산된 진세노사이드 Rg₂(S)의 전기분무 음이온 질량 스펙트럼(Electrospray negative ion mass spectrum)을 나타낸 도이다(Glc: 포도당, Rha: 람노오스).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 슈도노카르디아 종( Pseudonocardia sp .) 유래 진세노사이드 글리코시다제 ( ginsenoside glycosidase ) BglPC28 의 제조

실시예 1-1. 재료

Fusong Biotech Co. Ltd.(중국) 의 Panax quinquefolius의 뿌리로부터 얻은 진세노사이드 Re(순도: 87.6%)를 기질로 사용하였고, 98% 이상의 순도를 갖는 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Rg₂(S), Rh₂(S), F₂, compound K(C-K), PPD(protopanaxadiol), Rg₁, Re, Rg₂(S), Rh₁(S), 및 PPT(protopanaxatriol) 진세노사이드는 Nanjing Zelang Medical Technology Co. Ltd.(중국)에서 구매하였다. HPLC 등급의 메탄올과 아세토니트릴은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구매하였으며, 본 발명에서 사용한 다른 화학 물질들은 최소 분석용 시약 품질이었다. 진세노사이드 가수분해 활성을 가지는 슈도노카르디아 종(Pseudonocardia sp.) Gsoil 1536은 한국 포천의 인삼 밭의 토양 샘플로부터 분리하였고, R2A 아가(BD, USA)에서 호기 조건 하에 30 ℃로 배양하여 유전자 클로닝 실험에 사용하였다. Escherichia coli BL21(DE3)와 pGEX 4T-1 플라스미드(GE Healthcare, USA)는 각각 숙주 및 발현 벡터로 사용하였다. 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 Luria-Bertani(LB) 배지에서 암피실린(100 mg/l)을 첨가하여 배양하였다.

실시예 1-2. 포스미드 ( fosmid ) 라이브러리 설계와 포스미드 시퀀싱

CopyControl^TM 포스미드 생산 키트(Epicentre Technologies, WI)를 사용하여 슈도노카르디아 종 Gsoil 1536으로부터 진세노사이드 가수분해 글리코시다제 유전자를 클로닝하였다. 포스미드 라이브러리는 생산 회사의 프로토콜에 따라서 설계하였다. 감염된 E. coli는 40 μg/ml X-Glc(5-브로모-4-클로로-3-인도릴 β-D-글루코피라노사이드)와 12.5 μg/ml 클로람페니콜이 있는 LB 플레이트로 옮겨서 37℃ 에서 16시간 배양하였다. 파란색 클론을 진세노사이드 가수분해 클론으로 추정하여 선택하였고, TLC 실험을 통해 진세노사이드 가수분해 능력을 확인한 후, 하나의 클론을 포스미드 시퀀싱을 위해 선택하였다. 생산 회사의 프로토콜(포스미드 MAX DNA 정제 kit, Epicentre, WI)에 따라 포스미드 DNA를 정제하였고, Macrogen Co. Ltd.(한국)을 통해서 시퀀싱하였다. 마지막 시퀀스 어셈블리 과정은 DNASTAR 패키지(DNASTAR, WI)의 SeqMan 프로그램을 통해 수행하여, 두 개의 콘틱(contig)을 얻었다(14.3 및 4.7 kb).

실시예 1-3. BglPC28 의 계통 분석( Phylogenetic analysis )

데이터베이스 상동 검색은 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였다. 특정된 글리코실 가수분해효소들의 시퀀스들을 CAZY 데이터베이스(Carbohydrate-Active enZymes database(http://www.cazy.org))로부터 얻었고, 다중 정렬은 CLUSTAL_X 프로그램을 사용하여 수행하였다. 공백은 BioEdit 프로그램으로 수정하였고, 진화적 거리는 Kimura two-parameter 모델을 사용하여 계산하였다. MEGA5 프로그램에서 인접 결합 방법을 이용하여 1000개 복제를 토대로 한 부트스트랩 값으로 계통수를 제작하였다. 또한, ClustalW2 프로그램(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)을 사용하여 다수의 아미노산 시퀀스 배열 및 BglPC28의 아미노산 시퀀스의 보존 패턴과 상응하는 β-글루코시다제를 확인하였다.

그 결과, 일치 가게도(consensus tree)를 도 2에 나타내었다. BglPC28은 서브패밀리 5 내에 있고, Microbacterium esteraromaticum KACC 16318 유래의 특성이 분석된 β-글루코시다제(Bgp1)와 함께 분리된 클레이드(100 부트스트랩)를 형성하였다. GH3에서 몇 개의 진세노사이드 가수분해 β-글루코시다제는 이미 클로닝되었는데, 그 예로는 Bifidobacterium longum H-1 유래 β-글루코시다제(rApy-H11), Terrabacter ginsenosidimutans 유래 β-글루코시다제(BgpA), Aspergillus niger 유래 β-글루코시다제(BGL1), Actinosynnema mirum 유래 β-글루코시다제(BglAm), Mucilaginibacter sp. QM49 유래 β-글루코시다제(BglQM), Sanguibacter keddieii유래 β-글루코시다제(BglSk) 및 Flavobacterium johnsoniae UW101^T유래 β-글루코시다제(BglBX10)가 있다.

Microbacterium esteraromaticum 유래 진세노사이드 β-글루코시다제(Bgp1) 및 Streptomyces venezuelae, Thermotoga neapolitana 또는 Kluyveromyces marxianus 유래의 구조가 밝혀진 β-글루코시다제의 시퀀스와 BglPC28 시퀀스의 비교 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 구조가 밝혀진 세 개의 β-글루코시다제와의 서열정렬법을 통해, 별표로 표시된 BglPC28의 아미노산 D242와 E408은 가수 분해 반응 동안에 친핵체 및 산염기로 작용함을 알 수 있었다. 글리코시다제, 글리코실-전이효소, 프로테아제, 아미다제, 톡신 및 아드헤진과 같은 많은 단백질에 존재하는 PA14 도메인과 신호 전달 분자들이 몇몇 GH3 효소에서 발견되었다. 지지체 또는 탄수화물 결합 역할을 하는 PA14 도메인은 분석된 820개의 GH3 시퀀스 중 230개에서 발견되었으나, BglPC28 과 Bgp1에서는 PA14 도메인이 발견되지 않았다.

실시예 1-4. 재조합 BglPC28 의 발현 및 정제

조립된 DNA 시퀀스는 NCBI 웹사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)의 ORF Finder 프로그램을 사용하여 분석하였다. 예측된 ORF는 글리코실 가수분해효소 패밀리 3에 속한 β-글루코시다제의 두 개의 열린 읽기틀을 확인해주는 BLASTP를 사용해서 유사성 검색을 하였다. 유전자 클로닝에 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 시퀀스는 BglPC28의 DNA 시퀀스(GenBank accession no. JX960416)를 기반으로 하였고, 포워드 프라이머(5'-GGTTCCGCGTGGATCCATCGACCCCGTTGATCTCACCCTC-3', 서열번호 3) 및 리버스 프라이머(5'-GATGCGGCCGCTCGAGCTAGTTTTGTCCGACGTGTTGGGG-3', 서열번호 4)는 BamHI과 X hoI의 제한 부위(밑줄)를 각각 가진 프라이머로 제작하였고, Bioneer Co. Ltd.(대전, 한국)에서 합성하였다. PCR로부터 얻은 증폭된 DNA를 정제한 후, EzCloning Kit(Enzynomics Co. Ltd., 한국)를 사용하여 BamHI 과 XhoI으로 절단한 pGEX 4T-1GST 융합 벡터에 삽입하였다. 또한 제작된 재조합 pGEX-bglPC28은 E. coli BL21(DE3)에 도입되었고, 상기 E. coli BL21(DE3)를 0.6 OD₆₀₀값에 도달할 때까지 LB-암피실린 배지에서 37℃로 배양한 후, 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 이때 가용성 형태의 재조합 단백질의 생산량을 최대화하기 위해, 여러 인덕션 조건을 시험한 결과, 첫 인덕션 후에 0.15 mM IPTG 를 첨가하여 22℃ 조건에서 18 시간 동안 배양하면 가용성 재조합 단백질을 최대로 얻을 수 있음을 확인하였다.

상기 단백질 발현이 유도된 세포를 22℃에서 24시간 동안 추가적으로 배양한 후 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하여 수득하였다. 그 후 상기 세포를 100 mM 인산나트륨과 1% Triton X-100을 포함한 용액(pH 7.0)으로 두 번 세척한 후, 100 mM 인산나트륨(pH 7.0)에 재부유하였다. 상기 세포를 초음파(Vibra-cell, Sonics & Materials, CT, USA)를 사용하여 파괴한 후, 조세포 추출물을 얻기 위해 온전한 세포들과 잔해들을 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm 속도로 원심분리여 제거하였다. 상기 조세포 추출물을 GST 바인드 아가로스 수지(Elpisbiotech Co. Ltd, 한국)를 통해 정제하였고, 정제된 GST-BglPC28 재조합 단백질을 상온에서 12시간 트롬빈으로 배양하여 GST 태그를 제거하였다. 상기 세포 용해물의 상층액 및 정제된 재조합 단백질을 10% SDS-PAGE와 EZ-Gel 염색 용액(Daeillab Co. Ltd., 한국)을 사용하여 단백질의 균질성을 측정하였다(도 4).

그 결과, SDS-PAGE에서 확인한 GST-BglPC28 분자량은 아미노산 서열로 계산한 분자량 105 KDa과 유사함을 확인하였고, E. coli 용해물에 포함된 전체 가용성 단백질의 36.5±1.4 %가 재조합 GST-BglPC28임을 확인하였다.

이를 통해 가용성 형태의 재조합 단백질의 발현 수준이 높음을 알 수 있었으며, 이는 본 발명의 재조합 단백질이 산업적으로 이용될 수 있음을 시사하는 것이었다.

실시예 2. 온도, pH , 금속 이온 및 화학 시약이 BglPC28 활성에 미치는 영향 분석

실시예 2-1. BglPC28 활성 분석 방법

정제된 BglPC28의 비활성(specific activity)을 p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(pNPG)를 사용하여 분석하였다(50 mM 인산나트륨 버퍼 pH 7.0, 37℃). 10분 후에 Na₂CO₃를 첨가하여(최종 농도 0.5M) 반응을 종료하였고, p-니트로페놀의 방출을 405 nm에서 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad model 680; Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 즉시 측정하였다. 활성의 1단위는 1분당 1 μmol의 p-니트로페놀을 생성하는데 요구되는 단백질의 양으로 정의된다. 비활성은 단백질 밀리그램 당 단위로 표현된다. 단백질 농도는 바이신코닉 산(BCA) 단백질 분석법(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 소혈청알부민(Sigma)을 기준으로 측정되었고, 모든 분석법은 세 차례 수행되었다.

실시예 2-2. 온도가 BglPC28 활성에 미치는 영향

온도가 BglPC28 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, 2.0 mM pNPG가 포함된 최적 pH의 50 mM 인산칼륨 버퍼를 사용하여, 4 ℃부터 65 ℃까지 다양한 온도(4, 10, 18, 25, 30, 37, 45, 55 및 65 ℃)에서 효소를 5분 동안 인큐베이션하였다.

그 결과 BglPC28의 활성 최적 온도는 37 ℃ 이었고, 37 ℃가 지나면 내열성이 빠르게 감소하여, 30 ℃ 와 25 ℃에서 효소는 각각 90.0% 와 67.2%의 상대적인 활성을 보였다(도 5a).

BglPC28의 내열성을 분석하기 위해, 50 mM 인산칼륨 버퍼에서 여러 온도 조건으로 효소를 30분 동안 인큐베이션한 후, 얼음에서 10분 동안 식힌 다음, pNPG를 기질로 사용하여 활성을 측정하였다.

그 결과 효소는 30 ℃보다 낮은 온도에서 안정하였고, 활성의 최적 온도인 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하면 활성이 70.6%가 감소됨을 확인하였다(도 5b).

실시예 2-3. pH 가 BglPC28 활성에 미치는 영향

pH가 BglPC28 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, 1.0 mM pNPG를 기질로 아래의 버퍼를 사용하여 활성을 측정하였다.

(각각 50 mM; KCl-HCl(pH 2.0), 글리신-HCl(pH 3.0), 초산나트륨(pH 4.0 및 5.0), 인산나트륨(pH 6.0, 7.0 및 7.5), Tris-HCl(pH 8.0 및 9.0) 및 글리신-수산화나트륨(pH 10))

또한, BglPC28의 pH 안정성을 분석하기 위해, 각 버퍼에서 12시간 동안 4℃로 인큐베이션한 후, 활성(기질 2.0 mM pNPG, 50 mM 칼륨 버퍼)을 측정하였고, 그 결과를 최적 pH에서 측정된 활성의 백분율로 계산하여 도 5b에 나타내었다.

이를 통해 BglPC28은 30 ℃의 인산 나트륨 완충액 pH 7.0에서 최적 pH 활성과 안정성을 가지고, pH 8.0부터 효소 활성이 빠르게 감소하며, pH 5.0에서 효소 활성은 58.1%까지 감소함을 알 수 있었다(도 5b). 이러한 BglPC28의 중온성 최적 온도 및 중성 최적 pH 범위에서 안정적인 특성은 슈도노카르디아 종 Gsoil 1536을 분리한 토양 환경 조건과 일치하였고, 진세노사이드를 가수분해하는 GH3 패밀리에 속한, 박테리아 유래의 다른 효소와 비슷하였다.

실시예 2-4. 금속 및 다른 화학 시약이 BglPC28 활성에 미치는 영향

금속 및 다른 화학 시약이 BglPC28 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, BglPC28을 37 ℃에서 30분 동안 1 또는 10 mM(최종 농도)의 HgCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, SDS, 디티오트레이톨(DTT) 또는 β-메르캅토에탄올에서 인큐베이션한 후, 남은 활성을 pNPG를 기질로 측정하였고, 활성을 화합물이 없을 때 얻은 활성의 백분율로 표현하여 하기 표 1에 나타내었다.

그 결과 Mg^{2 +}는 BglPC28 활성에 영향을 주지 않았지만, 50 mM Cu^{2 +}에 의해 활성을 잃었고, 1 mM Hg^{2 +} 또는 10 mM SDS에 의해서도 활성이 억제되었다. 그러나 BglPC28의 활성은 티올기 억제제인 DTT와 β-메르캅토에탄올에 영향을 받지 않았다. 이를 통해 BglPC28의 촉매작용 부위에 설프히드릴기 없음을 알 수 있었다.

또한 킬레이트 시약인 EDTA는 BglPC28의 활성을 억제하지 않았는데, 이를 통해 효소 활성에 이가 양이온이 필요하지 않음을 알 수 있었다.

실시예 3. BglPC28 의 기질 특이성 분석

기질 특이성을 2.0 mM 발색 o-니트로페닐(ONP)과 p-니트로페닐(PNP)을 기질로 사용하여 37 ℃에서 5분 동안 측정하였고, 1 활성 단위는 1분당 1 μmol o-니트로페놀 또는 p-니트로페놀의 방출로 정의하였다. 사용한 기질들은 하기와 같다.

PNP-β-D-glucopyranoside, PNP-β-D-galactopyranoside, PNP-β-D-fucopyranoside, PNP-N-acetyl-β-D-glucosaminide, PNP-β-L-arabinopyranoside, PNP-β-D-mannopyranoside, PNP-β-D-xylopyranoside, PNP-α-D-glucopyranoside, PNP-α-L-arabinofuranoside, PNP-α-L-arabinopyranoside, PNP-α-L-rhamnopyranoside, PNP-α-D-mannopyranoside, PNP-α-D-xylopyranoside, ONP-β-D-glucopyranoside, ONP-β-D-galactopyranoside, ONP-β-D-fucopyranoside 및 ONP-α-D-galactopyranoside(모두 Sigma).

그 결과 표 2에서 알 수 있듯이, BglPC28은 pNP-β-D-글루코피라노사이드와 pNP-β-L-아라비노피라노사이드에 대해 활성이 가장 높았고, pNP-α-D-글루코피라노사이드, pNP-β-D-글루코사미나이드 및 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대해서는 활성이 낮았지만, 이를 제외한 다른 PNP- 와 oNP-글리코시드에는 활성이 없었다. pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 BglPC28의 높은 활성은 Terrabacter ginsenosidimutans, Microbacterium esteraromaticum 및 Mucilaginibacter sp. QM49 유래의 진세노사이드 전환 GH3 패밀리에서는 확인되지 않은 특성이었다.

a: 최종 기질 농도 2.0 mM

b: PNP-β-D-glucopyranoside에 대한 효소 활성 기준

실시예 4. 반응속도 변수 분석

BglPC28의 반응속도 변수를 분석하기 위해, 정제된 효소로 1-20 mM pNPG와 0.2 mM 내지 5.0 mM Re를 이용하여 효소 반응속도를 측정하였다. 활성의 1 단위는 1분당 1 μmol p-니트로페놀을 생성하거나 1 μmol Re를 전환하는데 요구되는 단백질의 양으로 정의하였으며, 모든 분석법은 세 차례 수행하였다. 각각의 반응속도 변수를 효소 반응속도 프로그램(Cleland, 1979)을 사용하여 측정하였고, 측정된 Km, Vmax, kcat 및 kcat/Km 값을 표 3에 나타내었다.

그 결과 pNPG와 Re에 대한 BglPC28의 Km 값은 각각 6.36 ± 1.10 mM 및 1.42 ± 0.13 mM이었고, Vmax 값은 각각 40.0 ± 2.55 μmol·분^-1·mg^-1(단백질) 및 5.62 ± 0.21 μmol·분^-1·mg^-1(단백질)이었다. 또한 kcat 값은 각각 52.7 ± 3.4 S^-1 및 7.40 ± 0.28 S^-1이었다. 또한, 촉매 효율성(kcat/Km)은 pNPG(8.63 ± 2.02 mM^-1S^-1)가 Re(5.28 ± 0.69 mM^-1S^-1)보다 높았다.

이를 통해 BglPC28의 진세노사이드에 대한 촉매 효율성은 Sulfolobus acidocaldarius 유래 β-글루코시다제(Rd 4.8 mM^-1min^-1; Rb₁ 4.8 mM^-1min^-1) 및 Mucilaginibacter sp.QM49 유래 β-글루코시다제(Rg₁ 1.64 ± 0.22 mM; Re 0.51 ± 0.07 mM)보다 높음을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 BglPC28이 다른 β-글루코시다제에 비해 마이너 진세노사이드의 산업적 생산에 훨씬 유리함을 시사하는 것이었다.

실시예 5. BglPC28 를 이용한 진세노사이드의 전환

BglPC28에 의한 5개의 PPD 계열 진세노사이드(Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rc 및 Rd)와 두 개의 PPT 계열 진세노사이드(Re 및 Rg₁)의 전환 과정을 TLC 및 HPLC를 통해 분석하였다.

먼저, 진세노사이드 Rb₁와 Re에 대한 전환 실험을 통해 GST 재조합 효소가 BglPC28의 활성에 영향을 주지 않음을 확인한바, 재조합 단백질 GST-BglPC28의 진세노사이드의 C3 또는 C20에 연결된 글루코스 모이어티에 대한 가수분해를 통해, 효소의 특이성 및 선택성을 분석하였다.

100 mM의 인산 나트륨 버퍼(pH7.0)를 사용한 0.1 mg/ml 효소 용액을 100 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.0)를 사용한 0.2%(w/v) Rb₁, Rb₂, Rb₃,Rc, Rd, Re 또는 Rg₁ 용액과 각각 동일한 부피로 37℃에서 반응시켰다. 규칙적인 시간 간격으로 반응물을 샘플링하였고, 상기 샘플링한 반응물을 전처리하여 TLC 및 HPLC를 통해 분석하였다(하기 실시예 ).

그 결과 TLC 분석(도 6 및 7)의 R_f 값과 HPLC의 보유 시간에서 알 수 있듯이, GST-BglPC28은 4개의 메이져 진세노사이드(Re, Rg₁, Rb₁ 및 Rd)를 전환하였다. BglPC28은 Re 및 Rg₁의 C20에 연결된 글루코스를 가수분해하여 각각 Rg₂(S) 및 Rh₁(S)로 전환하였다(도 7a, 7b). PPT 계열 진세노사이드에 더불어 BglPC28은 또한 PPD 계열 진세노사이드인 Rb₁, Rb₃, 및 Rd 또한 변환하였다. PPD 계열 진세노사이드에 대한 BglPC28의 전환 기전은 Rb₁, Rb₃, 및 Rd의 C20 부위의 외부 Glc(1→6)Glc Xyl(1→6)Glc 또는 글루코스를 직접적으로 가수분해하여 Rg₃(S)로 전환하는 것이다. 종합적으로, BglPC28은 Re, Rg₁, Rb₁, Rb₃와 Rd를 다음과 같이 가수분해하였다(도 8a 및 8b):

Re → Rg₂(S), Rg₁ → Rh₁(S), Rb₁ → Rg₃(S), Rd → Rg₃(S), 및 Rb₃ → Rg₃(S).

재조합 GST-BglPC28의 조효소 10 mg/ml은 10분 내에 Re, Rg₁, Rb₁ 와 Rd(1.0 mg/ml)를 전환시켰다. 보고된 다른 진세노사이드 가수분해 재조합 효소들은 대부분 아글리콘의 오직 C3 부위에서 내부 또는 외부 글루코스 부위만을 가수분해할 수 있었으며, 전술한 효소인 Bgp1, BglAm 및 BglQM은 BglPC28과 같은 진세노사이드 Re 와 Rg₁의 가수분해 대사 경로를 가지지만, 낮은 전환률과 복잡한 정제 과정을 요구하여 실제적으로 산업에 응용될 수 없었다. 그러나 본 발명의 BglPC28은 전환률이 높아 Rg₂(S)를 100 그램 단위로 생산할 수 있으므로 산업적으로 응용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 효소와 기질 농도의 최적화

진세노사이드 Re가 Rg₂(S)로 전환되는 최적 조건을 결정하기 위해, 반응에서 Re의 기질 농도를 최적화하였다. 최종 조효소 BglPC28 농도는 10, 20 및 50 mg/ml로 고정하였고, 최종 기질 농도는 20 및 30 mg/ml가 되도록 DMSO(100 mg/ml)에 진세노사이드 Re를 녹여 상기 효소와 반응시켰다. 상기 6 종류의 최적화 반응은 2 ml 에펜도르프 튜브에서 37 ℃로 24시간 동안 200 rpm에서 반응액 1 ml로 수행하였다. 규칙적으로 샘플링하여 TLC 와 HPLC를 통해 분석하였다(도 9).

그 결과, 낮은 기질 농도(20 mg/ml)와 높은 조효소 농도(50 mg/ml)의 조건에서, 진세노사이드 Re는 4시간 안에 진세노사이드 Rg₂(S)로 완전히 전환되었다. 이 반응 속도는 20 mg/ml Re와 20 mg/ml 조효소 조건보다 3배 빠른 속도이고, 30mg/ml Re와 50 mg/ml 조효소 농도 조건보다 6배 빠른 속도이었다. 다른 세 개의 반응 조건 하에서 전환은 40시간 이내에 완료되지 않았다. 그러므로, 이 세 개의 반응 조건은 하기의 실시예에서 제외하였다. 더 적은 양의 효소로 Re의 전환을 완료하기 위해, 하기 실시예의 대용량 전환 과정에서 20 mg/ml 기질과 20 mg/ml 조효소 조건을 채택하였다.

실시예 7. 진세노사이드 Re 의 대량생산

실시예 7-1. 진세노사이드 Rg ₂ ( S ) 의 대량생산을 위한 재조합 BglPC28 의 조효소 준비

재조합 BglPC28의 생산을 위해, 암피실린(100 μg/ml)이 포함된 LB 배지를 사용하여 10 L 교반-탱크 반응기(Biotron GX, Hanil science Co., 한국)에서 500 rpm, 5L 반응액으로 pGEX-bglPC28를 포함한 E. coli를 배양하였다. 100 mM 인산나트륨 버퍼를 사용하여 배지의 pH 값을 7.0으로 조정하였고, 600 nm에서의 OD 값이 3.0에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 2 %(w/v) 글루코스 및 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 박테리아 세포는 22℃ 조건에서 18시간 더 배양하였고, 4℃ 조건에서 20분 동안 5000 rpm으로 원심분리(Component R, Hanil science Co Ltd., 한국)하였다. 100 mM 인산염 버퍼(pH7.0)에 부유한 세포를 초음파 처리(Vibra-cell, Sonics & Materials, CT, USA)를 통해 파괴하였고, 조효소 상층액을 얻기 위해 정상 세포와 잔해물들을 4℃ 조건으로 5000 rpm에서 20분 동안 원심분리(Component R, Hanil science Co Ltd., Korea)하여 제거하였다. 재조합 BglPC28의 조효소는 100 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.0)를 사용하여 목적 농도로 희석하였고, Re를 전환하는데 이용하였다.

실시예 7-2. 재조합 BglPC28 의 조효소를 이용한 진세노사이드 Rg ₂ ( S ) 의 대량생산

대용량 전환을 위해, 10 L 교반-탱크 반응기(BiotronGX, Hanil science Co., 한국)에서 10% DMSO를 포함한 7.5 L 반응액을 100 rpm에서 24시간 동안 pH 7.0, 30 ℃로 반응시켰다. 최종 농도 20 mg/ml의 진세노사이드(Re; 전체 150 g)와 1.5 L의 재조합 BglPC28 조효소(20 mg/ml)로 100 mM 인산염 버퍼(pH 7.0)에서 반응을 시작하였다. 규칙적으로 샘플링하였고, 진세노사이드 Re로부터 Rg₂(S)의 생산을 HPLC를 이용하여 분석하였다.

실시예 7-3. 대량생산된 Rg ₂ ( S )의 정제

실시예 7-2의 Re와 BglPC28의 7.5 L 반응액을 4℃에서 냉각하였고, 15분 동안 5000 rpm 속도로 원심분리(Component R, Hanil science Co Ltd., Korea)하였다. 상층액 및 침전물에 있는 전환된 진세노사이드 Rg₂(S)를 각각 별도로 정제하였다. 대부분의 진세노사이드 Rg₂(S)는 고체 형태를 이루었고, 소량이 상층액에 용해되었다. 침전물은 5.0 L의 70 % 에탄올 용액에 두 번 용해시켰고, 여과지(Advantec, 일본)로 여과한 후, 상기 에탄올 추출물이 40% 에탄올 용액이 되도록 농도를 조정하였다.

진세노사이드 이외의 불순물을 제거하기 위해 HP20 수지(Mitsubishi, 일본)로 가득 찬 컬럼 크로마토그래피(3,170(L)×128(D) mm; Doointech, 한국)를 수행하였다. 상층액과 40% 에탄올 용액을 컬럼에 함께 로딩하였다. 비드에 흡착된 유리당 분자와 원하지 않는 친수성 화합물들을 6 흡착제 부피(BV)의 물로 세척하였고, 마지막으로 흡착된 진세노사이드를 6BV의 95% 에탄올(extra pure grade; SK Chemicals, 한국)을 사용하여 용출시켰다. 에탄올 용출액을 진공상태에서 증발시켜 수득한 가루를 100% 메탄올에 용해시켰고, HPLC를 통해 분석하였다(도 10).

상기 컬럼 크로마토그래피를 이용한 정제 결과, 약 24 L의 95 % 에탄올 용출액이 진공에서 증발되어, 113 g의 진세노사이드 Rg₂(S)를 얻을 수 있었고, HPLC를 통해 확인한 결과 크로마토그래피 후의 순도는 84.0±1.1 %이었다.

또한, API 2000을 통해 생산된 진세노사이드 Rg₂(S)의 전기분무 음이온 질량 스펙트럼(electrospray negative ion mass spectrum)을 분석한 결과, 생산된 진세노사이드 Rg₂(S)는 ESIMS의 m/z 783.8에서 가짜 분자 이온 피크[M-H] ^-를 보이는 흰색 가루이었고, 이는 C₄₂H₇₂O₁₃(분자량 계산치, 784.5)와 일치하였다. 이를 통해 생산된 Rg₂(S)를 확인할 수 있었다(도 11).

Re 중에서, BglPC28을 이용해서 Rg₂(S)로 전환될 수 있는 Re의 전체 몰량은 138.8 mmol이었고, 이는 150g에 대한 131.4 g과 일치하였다. 잔여물(18.6g)은 다른 타입의 진세노사이드, 수분 및 알 수 없는 불순물들로 구성되어 있었다. 생산된 진세노사이드 Rg₂(S)의 몰량은 120.9 mmol이었고, 그 결과 진세노사이드 Re를 Rg₂(S)로 전환하는 과정에서 회수율이 87.1%에 도달함을 알 수 있었다.

이를 통해 본원발명의 BglPC28는 진세노사이드 Re로부터 Rg₂(S)를 고수율 및 대량으로 생산할 수 있음을 확인한바, 상기 BglPC28가 다른 β-글루코시다제와 달리 마이너 진세노사이드를 산업적으로 생산하는데에 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 8. 분석 방법

실시예 8-1. 박층크로마토그래피 ( TLC ) 분석

60F₂₅₄ 실리카겔 플레이트(Merck, Germany) 및 CHCl₃: CH₃OH: H₂O(65: 35: 10, 저위상)를 용매로 사용하여 박층크로마토그래피(TLC) 분석을 수행하였다. 10% (v/v) H₂SO₄ 분무를 통해 시각화하고, 110 ℃에서 5분 동안 가열한 후 TLC 플레이트의 점을 진세노사이드 표준물질과 비교하여 확인하였다.

실시예 8-2. 고속액체 크로마토그래피( HPLC ) 분석

진세노사이드 Rb₁, Rd, Rg₂(S), Rh₂(S), F₂, C-K, Rg₁, Re 및 Rg₂(S)의 HPLC 분석은 4기 펌프, 자동 주입기, 단파장 UV 탐지기(model 730D) 및 피크 분석을 위한 Younglin's AutoChro 3000 소프트웨어를 갖춘 HPLC 시스템(Younglin Co., Ltd., 한국)을 이용하여 수행하였다. 분리를 위해 Prodigy ODS(2) C18 컬럼(5 μm, 150×4.6 mm i.d.; Phenomenex, USA)과 가드 컬럼(5 μm, 12.5 ×4.6 mm i.d.; Eclipse XDB C18)을 사용하였다. 이동상으로 아세토니트릴(A)과 물(B)을 사용하였고, 구배 용리는 17% 용매 A와 83% 용매 B로 시작하였고, 순차적으로 하기와 같이 바뀌었다;

A 17 ~ 25 %(12 ~ 20분), A 25 ~ 32 %(20 ~ 30분), A 32 ~ 55 %(30 ~ 35분), A 55 ~ 60 %(35 ~ 40분), A 60 ~ 80 %(40 ~ 45분), A 80 ~ 100 %(45 ~ 50분), A 100 %(50 ~ 54분), A 100 ~ 17 %(54.0 ~ 54.1분) 및 A 17 %(54.1 ~ 65분).

유속은 1.0 ml/분이었고, 검출은 203 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였으며, 주입 부피는 25 μl이었다.

실시예 8-3. LC / MS / MS 분석

정제 과정 후 전환된 Rg₂(S)를 확인하기 위해, 전기분무 이온화 질량 스펙트럼(ESI-MS)을 triple-quadrupole tandem mass spectrometer(API-2000, Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 음이온 모드에서 측정하였다. ESI 변수는 다음과 같다:

이온스프레이 전압 -4,200V, 이온 소스 가스 1(GS1) 20, 커튼 가스(CUR) 20, 충돌 가스(CAD) 2.

디클러스터링 퍼텐셜(DP), 집속 퍼텐셜(FP), 엔트런스 퍼텐셜(EP), 충돌 세포 엑시트퍼텐셜(CXP) 및 충돌에너지(CE)는 측정된 진세노사이드에 따라 다양하였다. 전체-촬영(full-scan) MS 분석을 위해 스펙트럼을 400 ~ 1,000 m/z 범위로 기록하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Intelligent Synthetic Biology Center <120> Ginsenoside glycosidase derived from Pseudonocardia sp. and method for producing minor ginsenosides with the same <130> KPA140576-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 743 <212> PRT <213> Pseudonocardia sp. Gsoil1536 <400> 1 Met Ile Asp Pro Val Asp Leu Thr Leu Ala Glu Lys Ala Ser Leu Ala 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Phe Trp Ser Ser Lys Ala Val Arg Asp Ile Pro Pro 20 25 30 Val Tyr Phe Thr Asp Gly Pro His Gly Val Arg Lys Gln Gly Glu Val 35 40 45 Thr Asp His Leu Gly Val Ala Met Ser Thr Pro Ser Thr Cys Phe Pro 50 55 60 Pro Ala Ala Gly Leu Ser Gln Ser Trp Asn Pro Glu Leu Val Gln Arg 65 70 75 80 Ile Gly Lys Ala Leu Ala Gln Glu Ala Arg Ala Gln Gly Val Asp Val 85 90 95 Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Ile Lys Arg His Pro Leu Gly Gly Arg 100 105 110 Asn Phe Glu Tyr Leu Ser Glu Asp Pro Ile Leu Ser Ser Glu Leu Gly 115 120 125 Ile Ala Trp Val Arg Gly Leu Gln Gly Glu Gly Ile Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu Thr Asp Arg His Arg Ile Ser 145 150 155 160 Ala Asp Ile Asp Pro Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Arg Ser Phe 165 170 175 Gln Arg Val Ile Gln Gln Ala Lys Pro Trp Thr Val Met Cys Ala Tyr 180 185 190 Asn Ala Leu Asn Gly Val Pro Val Ser Glu Asn Ser Phe Leu Leu Thr 195 200 205 Gln Val Leu Arg Asp Glu Trp Lys Tyr Asn Gly Leu Val Ile Ser Asp 210 215 220 Trp Gly Ala Val Thr Asp Arg Val Ala Ser Ala Arg Ala Gly Val Asp 225 230 235 240 Leu Glu Met Pro Pro Ser Glu Gly Ser Asp Gln Leu Leu Leu Asp Ala 245 250 255 Ala His Glu Gly Ala Ile Asp Ile Ala Ile Val Asp Arg Ile Ala Glu 260 265 270 Arg Ala Ile Ala Leu Ala Thr Lys Thr Arg His Gly Arg Thr Thr Ala 275 280 285 Pro Ala Ala Asp Leu Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Arg Glu Ala Ala 290 295 300 Arg Gln Ser Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ala Leu Leu Pro Leu 305 310 315 320 Thr Pro Gly Val Ala Val Ala Val Ile Gly His Gly Ala Val Ala Pro 325 330 335 Arg Phe Gln Gly Ala Gly Ser Ser Phe Val Asn Pro Thr Glu Val Asp 340 345 350 Ile Pro Phe Glu Glu Leu Val Gly Ile Gly Gly Pro Ala Val Arg Phe 355 360 365 Thr Gln Gly His Ser Val Asn Gly Ala Gly Asp Asp Glu Ala Leu Arg 370 375 380 Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Asp Val Ala Val Val Phe 385 390 395 400 Leu Thr Ala Asp Ile Glu Ser Glu Gly Arg Asp Arg Glu Asp Leu Asp 405 410 415 Ile Pro Ala Asp Gln Met Ala Leu Ala Leu Ala Val His Glu Ala Asn 420 425 430 Pro Arg Thr Ile Ile Val Leu Ala Arg Gly Gly Val Val Arg Leu Gly 435 440 445 Glu Leu Gln Ala Cys Pro Ala Val Leu Asp Gly Ala Leu Leu Gly Gln 450 455 460 Gly Ile Gly Arg Ala Leu Ala Glu Val Ile Tyr Gly Ile Ala Asn Pro 465 470 475 480 Ser Gly Lys Leu Ser Glu Thr Ile Pro Ile Arg Ile Glu Asp Ala Pro 485 490 495 Ala Phe Gly Asn Phe Pro Gly Glu Asn Gly His Val Arg Tyr Gly Glu 500 505 510 Gly Leu Leu Val Gly Tyr Arg Gly Tyr Asp Ala Arg Lys Gln Glu Val 515 520 525 Ser Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Gln Tyr Thr 530 535 540 Asp Leu Glu Val Gln Cys Val Asp Gly Gly Leu Glu Ala Arg Val Thr 545 550 555 560 Ile Thr Asn Thr Gly Pro Arg Ala Gly Arg Glu Val Ala Gln Phe Tyr 565 570 575 Thr Ser Leu Gln Gln Ser Ala Val Asp Arg Pro Leu Arg Glu Leu Lys 580 585 590 Gly Phe Ala Ser Ile Glu Leu Glu Pro Gly Gln Ser Gly Glu Val Thr 595 600 605 Ala Phe Ile Ala Gln Ala Asp Leu Ala Tyr Trp Asp Ile Arg Val Asn 610 615 620 Glu Trp Ile Val Glu Gly Gly Thr Tyr Glu Val Ser Val Gly Ala Ser 625 630 635 640 Ser Arg Asp Ile Arg Gly Thr Thr Phe Val Asp Ile Ile Gly Asp Glu 645 650 655 Val Thr Val Glu Leu Asn Leu His Ser Thr Val Gly Glu Phe Leu Ala 660 665 670 Asn Pro Val Thr Ala Pro Ile Leu Leu Glu Ala Leu Ser Ala Leu Val 675 680 685 Gly Pro Gly Glu Gln Thr Ala Val Gly Gly Asp Val Leu Thr Met Ile 690 695 700 Ser Ala Ala Pro Leu Gln Ser Met Leu Thr Leu Leu Gly Asp Asn Phe 705 710 715 720 Asp Arg Ala Ala Leu Asp Ala Leu Leu Glu Ala Ala Asn Val Arg Thr 725 730 735 Pro Gln His Val Gly Gln Asn 740 <210> 2 <211> 2232 <212> DNA <213> Pseudonocardia sp. Gsoil1536 <400> 2 atgatcgacc ccgttgatct caccctcgcc gaaaaagcat ccctggccag cgggggcagc 60 ttctggtcca gcaaagccgt ccgcgacatt ccgccggtct acttcaccga tggtccccac 120 ggagtgcgga aacagggcga ggtcacagac cacctcggcg ttgcgatgag cacaccgtcc 180 acatgcttcc ccccggctgc tggacttagc cagtcctgga acccggagct ggtccaaaga 240 atcggcaagg ccctggccca agaggcacgc gcgcagggtg tcgatgtgct gcttggtcca 300 ggagtgaaca tcaagcgaca cccgctcgga ggccggaact tcgagtacct ttccgaagac 360 ccaatactgt ccagcgaact cggtatcgcc tgggtgcgcg ggttgcaggg tgagggaatc 420 ggagcctcag tgaaacactt tgccgccaac aatcaggaga ccgatcgtca ccgcattagc 480 gccgacatcg acccgcgcgc gcttcgcgag atctacctcc gctccttcca gcgcgtcatt 540 cagcaggcga agccatggac cgtgatgtgc gcctataacg ccctaaacgg cgtgcctgta 600 tcggagaaca gcttcctgct tacccaagtg ctccgcgacg aatggaaata caacggcctg 660 gtcatcagcg attggggtgc ggtgaccgac cgtgtcgcct cagcccgtgc cggcgtcgat 720 ctcgaaatgc ctccctcgga agggtcggat cagcttcttc tcgatgccgc ccacgagggt 780 gccatcgaca tagccatcgt cgaccgcata gcagagcgcg ccattgctct cgctacgaaa 840 acccgccatg ggcgaaccac cgctccggcc gctgacctta aggagaacca tgcactcgcg 900 cgtgaggcag cgcggcagag catcgttctc ctcaagaacg atggggccct cctgccactg 960 acccctggcg tagcggtcgc agtcatcgga cacggggccg tcgcgcctag attccagggt 1020 gccggcagct ccttcgtcaa ccccaccgaa gtggatatcc catttgagga acttgtgggc 1080 attggtgggc ccgctgtccg cttcacgcaa ggtcattccg tcaacggcgc aggggacgac 1140 gaggcattgc gcgacgaggc cgtggccgca gcccgagcag cagacgtcgc agtcgtcttc 1200 ctcacggctg acatcgaatc agagggacgc gaccgggaag atctggacat tcccgccgat 1260 cagatggcgc tggcgcttgc cgtccacgag gccaaccccc gcacgatcat cgtccttgcg 1320 cgcggcgggg tcgtgcgcct tggcgagctc caagcttgcc ccgccgtcct cgacggcgcg 1380 ctcctgggcc aggggatagg ccgcgcactt gccgaggtga tctacggcat cgcaaatccg 1440 tcaggcaagc tctccgagac catccccatc cggattgaag atgcaccggc tttcggaaac 1500 ttcccgggag agaacggaca cgtccgctac ggcgagggac tgctggtcgg gtaccgagga 1560 tacgacgcac ggaagcagga agtctctttt ccgttcggcc atggcctgtc ctatacgaca 1620 ttccagtaca cagaccttga ggtccagtgt gtcgacggtg gtttggaggc ccgtgtgacg 1680 atcacaaaca ccggaccacg ggctggtcgc gaggttgccc agttctacac ctcgctgcaa 1740 cagtccgcgg tcgaccgtcc cttgcgagag ctgaaaggct tcgccagtat cgaactcgag 1800 cctgggcagt ccggtgaggt gacggcattt atcgctcagg cagacctcgc ttactgggac 1860 atccgggtta acgaatggat cgtcgagggc gggacatatg aggtctctgt gggagcttcg 1920 agccgtgaca tccgagggac caccttcgtc gacatcattg gcgacgaggt cacggtcgaa 1980 ctaaacctcc actccactgt gggggagttc ctcgccaatc ccgtgacggc tcccatcctt 2040 cttgaggccc tgtctgctct tgtcggaccg ggtgagcaga cggcagtcgg cggagacgtt 2100 ctcacaatga tttccgcagc acctctccag tccatgctca cactgctcgg cgacaatttc 2160 gatcgggccg cccttgacgc actcctggaa gcagccaacg tcagaacacc ccaacacgtc 2220 ggacaaaact ag 2232 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ggttccgcgt ggatccatcg accccgttga tctcaccctc 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gatgcggccg ctcgagctag ttttgtccga cgtgttgggg 40

Claims (6)

1. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 진세노사이드 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, F_2, Re 및 Rg₁으로 이루어지는 군으로부터 선택된 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해하여 탈글리코실화된 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 가용성인 마이너 진세노사이드를 제조하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 당은 글루코스, 자일로스, Glc(1→6)Glc 또는 Xyl(1→6)Glc인 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 가용성인 마이너 진세노사이드의 제조는 Rd로부터 Rg₃로의 전환과정, Rb₁으로부터 Rg₃로의 전환과정, Rb₃로부터 Rg₃로의 전환과정, Gyp XVII로부터 Rh₂로의 전환과정, Gyp LXXV로부터 PPD로의 전환과정, F₂로부터 Rh₂로의 전환과정, Re로부터 Rg₂로의 전환과정 및 Rg₁으로부터 Rh₁으로의 전환과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전환과정을 포함하는 것인 방법.
   
4. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 진세노사이드 Rb₁, Rd, Rb₃, Gyp XVII, Gyp LXXV, F_2, Re 및 Rg₁으로 이루어지는 군으로부터 선택된 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 당을 가수분해하여 탈글리코실화된 형태인 가용성 마이너 진세노사이드로 전환하기 위한 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 당은 글루코스, 자일로스, Glc(1→6)Glc 또는 Xyl(1→6)Glc인 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 가용성 마이너 진세노사이드로 전환은 Rd로부터 Rg₃로의 전환, Rb₁으로부터 Rg₃로의 전환, Rb₃로부터 Rg₃로의 전환, Gyp XVII로부터 Rh₂로의 전환, Gyp LXXV로부터 PPD로의 전환, F₂로부터 Rh₂로의 전환, Re로부터 Rg₂로의 전환 및 Rg₁으로부터 Rh₁으로의 전환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전환을 포함하는 것인 조성물.

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