KR20160094673A - p53 유전자의 발현을 활성화하는 피리도싸이에노피리미딘 유도체 및 그를 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents
p53 유전자의 발현을 활성화하는 피리도싸이에노피리미딘 유도체 및 그를 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Pyrido-thieno-pyrimidine 유도체인 N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dimethyl-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]thieno[2,3-d]pyrimidine-9-carboxamide (PTP) 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 p53 활성 증진용 조성물 및 그의 약학적 용도에 관한 것이다.
상기 유도체는 종양 세포에서 종양억제 단백질인 p53의 발현과 활성화를 유도하며, 그에 따라 종양 세포의 사멸과 생장 억제 작용을 나타낸다.
상기 유도체는 종양 세포에서 종양억제 단백질인 p53의 발현과 활성화를 유도하며, 그에 따라 종양 세포의 사멸과 생장 억제 작용을 나타낸다.
Description
본 발명은 신규한 p53 활성 증강 물질 및 그를 포함하는 암(종양) 치료제 조성물에 관한 것이다.
더 구체적으로, 본 발명은 Pyrido-thieno-pyrimidine 유도체인 N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dimethyl-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]thieno[2,3-d]pyrimidine-9-carboxamide (PTP) 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 p53 활성 증진용 조성물 및 그의 약학적 용도에 관한 것이다.
상기와 같은 조성물은 대장암 등의 치료제로 사용될 수 있다.
종양 억제 유전자인 p53은 DNA 손상, 저산소증 및 종양 유전자의 비정상적 발현과 같은 여러 스트레스에 의해 일어나는 세포 주기 변화, 세포 사멸, DNA 손상복구 및 세포노화 등과 같은 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Vousden, Cell, 103:691-694, 2000; Vogelstein et al., Nature, 408:307-310, 2000).
DNA 손상 후 일어나는 p53의 활성화는 p21, Bax, PUMA 및 MDM2와 같은 세포 주기 정체, DNA 손상복구, 세포 사멸에 관련된 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다(Juven et al., Oncogene, 8:3411-3416, 1993; Barak et al., EMBO J, 12:461-468, 1993).
p53 활성은 대부분 단백질로의 번역 후 수정 과정을 통해 조절되며, 세포가 스트레스를 받은 상황에서 p53이 작용하기 위해서는 p53의 안정화가 필수적으로 필요하다.
대부분의 세포에서 p53은 매우 낮은 정도로 발현하고 있으며, 이 단백질의 반감기는 수 분 정도에 불과한데, 이는 MDM2에 의해 p53 N-말단의 유비퀴틴화가 일어나 프토테오좀에 의한 단백질 분해가 지속적으로 일어나기 때문이다.
방사선이나 세포독성 물질에 의한 DNA 손상과 같은 스트레스 상황에서, ataxia telangiectasia mutated(ATM)/ATM과 Rad3-related(ATR) 활성화, p53 단백질의 인산화와 아세틸화, 그리고 MDM2의 p53에의 결합 약화 등을 통하여 p53은 안정화된다(Banin et al., Science, 281:1674-1677, 1998; Tibbetts et al, Genes Dev., 13:152-157, 1999).
세포의 사멸이나 생장억제 작용에서 p53은 매우 중요한 역할을 수행하고 있으므로, p53의 재활성화는 많은 항암 치료제의 개발 목표가 되고 있다.
따라서 본 발명자는 항암치료제로 사용할 수 있는 새로운 p53 활성 증강제를 발견하고 그 작용 기전을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 신규한 p53 유전자 활성 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 이를 통해 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dimethyl-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]thieno[2,3-d]pyrimidine-9-carboxamide(PTP)와 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 p53 유전자 활성 증강용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 조성물을 함유하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 한다.
p53은 DNA 손상, 저산소증 및 종양 유전자의 비정상적 발현과 같은 여러 스트레스에 의해 일어나는 세포 주기 변화, 세포 사멸, DNA 손상복구 및 세포노화 등과 같은 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하므로, 본 발명에 따른 p53 활성제를 사용하면 항암 치료효과를 나타낼 수 있다.
실제로 본 발명자들은 상기 조성물을 대장암 세포주에 적용하는 경우 암세포의 사멸이 증가되는 것을 확인하였다.
본 발명의 새로운 Pyrido-thieno-pyrimidine 유도체인 N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dimethyl-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]thieno[2,3-d]pyrimidine-9-carboxamide(PTP)는 종양 세포에서 종양억제 단백질인 p53의 발현과 활성화를 유도하며, 그에 따라 종양 세포의 사멸과 생장 억제 작용을 나타낸다.
따라서 본 발명의 조성물은 새로운 항암 치료제로 사용할 수 있으며, 또한 기존에 사용되는 항암치료제 및 치료방법과 병행하여 항암 치료의 효과를 높이는 데에도 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dimethyl-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]thieno[2,3-d]pyridine-9-carboximide(PTP)의 화학구조를 나타낸다.
도 2는 대장암 세포주인 HCT116 세포주에 PTP 처리 후 종양억제유전자인 p53의 프로모터 활성을 나타내는 루시퍼라아제 분석(A), HCT116 및 HT-29 세포주에 PTP 처리 후 p53과 p53의 하위 유전자인 p21의 단백질 발현변화를 확인한 웨스턴 블롯 결과(B) 및 p53의 하위 유전자인 p21과 PUMA의 mRNA의 발현 변화를 확인한 실시간 유전자 증폭 결과(C)를 나타낸다.
도 3은 HCT116 세포주에 PTP와 양성 대조군으로 p53 단백질의 분해를 유도하는 MDM2의 억제제인 Nutlin-3a을 각각 처리하고 Proximity Ligation Assay (PLA)를 통해 p53 단백질과 MDM2 단백질 사이의 결합변화를 공초점 형광현미경 사진(A) 및 정량적으로 분석한 결과(B)를 나타낸다.
도 4는 PTP 처리 후 HCT116 및 HT-29 세포주의 세포주기 변화를 나타내는 유세포 분석 결과(A) 및 HCT116 세포주에서 시간에 따른 세포주기 조절 단백질인 Cyclin의 발현변화를 확인한 웨스턴블롯결과(B)를 나타낸다.
도 5는 농도별 PTP 처리 후 6일째 HCT116 세포주의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색 사진(A) 및 이의 정량결과를 나타낸 그래프이다(B).
도 6은 HCT116과 HT-29 세포주의 PTP 처리에 의한 세포 생장 억제를 확인한 WST-1 분석 결과(A)와 PTP 처리 시간에 따른 세포사멸 증가를 확인한 유세포분석 결과(B)를 나타낸다.
도 7은 HCT116 세포주에서 PTP 처리에 의한 Erk1/2 단백질의 활성 증가를 확인한 웨스턴블롯 분석 결과 (A)와 Erk1/2 단백질 저해제인 U-0126(B) 및 Erk1/2의 siRNA 처리가 PTP에 의한 p53 단백질의 인산화 증가를 억제시킴을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과(C)를 나타낸다.
도 8은 HCT116과 HT-29 세포주에서 PTP 처리에 의해 p53 단백질의 아세틸화 증가를 확인한 웨스턴블롯 분석 결과(A)와 HT-29 세포주에서 p53 단백질의 아세틸화를 유도하는 p300의 siRNA(B) 및 p300의 저해제인 anacardic acid 처리(C)가 PTP 처리에 의한 p53 단백질의 아세틸화 증가를 억제시킴을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 HCT116 세포주에 PTP를 처리하고 Proximity Ligation Assay (PLA)를 통해 p53 단백질과 p53 단백질의 아세틸화를 조절하는 단백질들 사이의 결합변화를 공초점 형광현미경 사진(A) 및 정량적으로 분석한 결과(B)를 나타낸다.
도 2는 대장암 세포주인 HCT116 세포주에 PTP 처리 후 종양억제유전자인 p53의 프로모터 활성을 나타내는 루시퍼라아제 분석(A), HCT116 및 HT-29 세포주에 PTP 처리 후 p53과 p53의 하위 유전자인 p21의 단백질 발현변화를 확인한 웨스턴 블롯 결과(B) 및 p53의 하위 유전자인 p21과 PUMA의 mRNA의 발현 변화를 확인한 실시간 유전자 증폭 결과(C)를 나타낸다.
도 3은 HCT116 세포주에 PTP와 양성 대조군으로 p53 단백질의 분해를 유도하는 MDM2의 억제제인 Nutlin-3a을 각각 처리하고 Proximity Ligation Assay (PLA)를 통해 p53 단백질과 MDM2 단백질 사이의 결합변화를 공초점 형광현미경 사진(A) 및 정량적으로 분석한 결과(B)를 나타낸다.
도 4는 PTP 처리 후 HCT116 및 HT-29 세포주의 세포주기 변화를 나타내는 유세포 분석 결과(A) 및 HCT116 세포주에서 시간에 따른 세포주기 조절 단백질인 Cyclin의 발현변화를 확인한 웨스턴블롯결과(B)를 나타낸다.
도 5는 농도별 PTP 처리 후 6일째 HCT116 세포주의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색 사진(A) 및 이의 정량결과를 나타낸 그래프이다(B).
도 6은 HCT116과 HT-29 세포주의 PTP 처리에 의한 세포 생장 억제를 확인한 WST-1 분석 결과(A)와 PTP 처리 시간에 따른 세포사멸 증가를 확인한 유세포분석 결과(B)를 나타낸다.
도 7은 HCT116 세포주에서 PTP 처리에 의한 Erk1/2 단백질의 활성 증가를 확인한 웨스턴블롯 분석 결과 (A)와 Erk1/2 단백질 저해제인 U-0126(B) 및 Erk1/2의 siRNA 처리가 PTP에 의한 p53 단백질의 인산화 증가를 억제시킴을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과(C)를 나타낸다.
도 8은 HCT116과 HT-29 세포주에서 PTP 처리에 의해 p53 단백질의 아세틸화 증가를 확인한 웨스턴블롯 분석 결과(A)와 HT-29 세포주에서 p53 단백질의 아세틸화를 유도하는 p300의 siRNA(B) 및 p300의 저해제인 anacardic acid 처리(C)가 PTP 처리에 의한 p53 단백질의 아세틸화 증가를 억제시킴을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 HCT116 세포주에 PTP를 처리하고 Proximity Ligation Assay (PLA)를 통해 p53 단백질과 p53 단백질의 아세틸화를 조절하는 단백질들 사이의 결합변화를 공초점 형광현미경 사진(A) 및 정량적으로 분석한 결과(B)를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는 하기 실시예에 한정되지 아니하며 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 실시예들은 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명을 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것임을 밝힌다.
<실시예 1> 대장암 세포주에서 PTP에 의한 종양억제유전자 p53의 발현 및 활성 변화 측정
1-1. 세포배양
종양세포주인 대장암 세포주 HCT116과 HT-29(한국세포주은행)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, PAA Laboratories, Austria)과 항생제인 스트랩토마이신 100 mg/ml과 페니실린 100 unit/ml이 포함된 RPMI 1640 배지에서 5% CO2 농도 및 37℃의 온도가 유지되는 세포배양기로 배양하였다.
1-2. 루시퍼라아제 분석
HCT116 세포주에 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)을 이용하여 p53-Luc 리포터 벡터를 도입시킨 후, 1 mg/ml 농도의 G418을 포함하는 배지에서 배양하며 상기 리포터 벡터가 안정적으로 유지되는 세포를 선별하였다.
선별한 세포를 96-well 배양접시에 well 당 15,000개의 세포를 분주하고 24시간 배양한 다음, 7950 가지의 저분자 물질을 10 mM 농도로 처리하고 24시간 동안 반응시킨 다음, Promega 사의 Luciferase Assay Kit을 이용하여 루시퍼라아제 활성 변화를 확인하고 루시퍼라아제의 활성을 2배 이상 증가시키는 26종의 물질을 선별하였다.
이들 중 N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dimethyl-4-oxo-4H- p yrido[1,2-a] t hieno[2,3-d] p yridine-9-carboximide(PTP) (도 1)를 선별했으며, PTP의 농도가 증가함에 따라 루시퍼라아제의 활성이 증가함을 확인할 수 있었다(도 2A).
1-3. PTP 처리에 의한 p53 단백질 증가
HCT116과 HT-29 세포주에 10 mM의 PTP를 처리하고 1, 4, 8 및 24 시간 후에 RIPA buffer [50 mM Tris-Cl (pH8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% Deoxycholic acid, 1% NP-40]로 용해시키고 초음파 파쇄한 후, 12,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
처리한 PTP와 동량의 DMSO를 첨가한 세포를 대조군으로 이용하였다. 회수한 세포 추출물은 Bradford 방법(Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254 (1976))을 통해 단백질 정량을 수행하였으며, 동량의 세포 추출물은 4X SDS 샘플 버퍼(200 mM Tris-Cl (pH6.8), 8% SDS, 40% Glycerol, 30 mM b-Mercaptoethanol, 0.2% Bromophenol Blue)을 첨가한 후, 95℃에서 10분간 가열하고, SDS-Polyacrylamide gel에서 50 mA/gel로 2-3 시간 전기영동하였다. 전기영동 후 분리된 단백질은 350 mA/gel로 1 시간 30 분 동안 Nitrocellulose membrane (Whatman)으로 이동시켰다.
단백질이 부착된 membrane은 5% 탈지우유가 함유된 TBS-T 용액에 넣고 실온에서 1 시간 동안 방치한 후 1:2,000으로 희석한 1차 항체들을 넣고 4℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 1차 항체는 항-p53 항체, 항-p21 항체 및 항-b-actin 항체 (SantaCruz Biotechnology, USA)를 사용하였고, 2차 항체는 Horse Radish Peroxidase가 결합된 항-마우스 및 항-토끼 항체 (Assay Design)를 이용해 ECL (Enhanced Chemiluminescence) 시약 (Advansta사)으로 발광시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 확인하였다.
그 결과를 도 2B에 나타내었다.
HCT116 세포주에서는 대조군에 비해 PTP 처리 시간이 지남에 따라 p53과 p21 단백질의 발현이 증가하였으나, p53 유전자에 돌연변이를 가진 세포주인 HT-29 세포주에서 p53 단백질의 발현 차이는 보이지 않았으며 p53의 하위 유전자인 p21 단백질의 발현은 확인되지 않았다.
1-4. PTP 처리에 의한 p53의 전사인자 활성 증가
HCT116과 HT-29 세포주에 0, 2, 5 및 10 mM의 PTP를 첨가하고 16 시간 후 Hybrid-R Total RNA Purification Kit (GeneAll)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 1 mg의 RNA에 5 X PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio사)을 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성한 후, 10배 희석하고 2 ml의 cDNA와 qPCR SYBR-Green Master Mix (MBiotech)를 이용하여 CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, USA)에서 반응을 수행하였으며 CYPA 및 RPL16A mRNA를 기준으로 p53에 의해 전사가 조절되는 p21 mRNA와 PUMA mRNA의 양을 보정하였다.
실시간 유전자 증폭 실험에 사용한 primer의 정보를 표 1에 나타내었다.
수행한 실시간 유전자 증폭 실험 결과는 도 2C에 나타내었다.
HCT116 세포주에서 p53에 의해 조절되는 p21과 PUMA의 mRNA 발현은 PTP의 처리 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 확인되었으나, HT-29 세포주에서는 웨스턴블롯 분석 결과와 동일하게 p21과 PUMA mRNA 발현에 변화가 없음을 확인할 수 있었다.
1-5. PTP 처리에 의한 p53 단백질과 MDM2 단백질 결합 확인
HCT116 세포주를 18X18-mm 크기의 cover glass를 넣은 6-well 배양 접시에 well 당 100,000 개씩 분주하고 24 시간 배양하였다. 10 mM의 PTP를 8 시간 동안 처리한 후 PBS로 세척한 다음 4% Paraformaldehyde을 상온에서 15 분간 처리하여 고정하였다. 단백질 사이의 결합을 확인하기 위해 in situ Proximity Ligation Assay (PLA) (Olink, Sweden)를 수행하였다. 고정된 세포는 1% Tryton X-100을 5 분 동안 처리하여 세포막을 약화시키고, PBS 세척 후 Blocking Buffer를 37℃에서 30 분간 반응시켰다.
1차 항체는 항-p53항체와 항-MDM2항체(SantaCruz Biotechnology)를 함께 1:100으로 희석하여 4℃에서 16 시간 반응시켰다. 2차 항체는 anti-rabbit PLUS와 anti-mouse MINUS proximity probe를 혼합하여 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 37℃에서 30 분간 Ligation 반응한 다음, 2시간 동안 중합반응을 수행하고 DAPI로 대조염색한 후 공초점 형광현미경(LSM710; Carl Zeiss MicroImaging, Germany)을 통하여 관찰하였다.
종양억제 단백질인 p53과 MDM2의 결합을 확인하는 데 대조군으로는 처리한 PTP와 동량의 DMSO를 처리한 세포주를 사용하였고, MDM2 단백질의 저해제로 알려진 Nutlin-3a (10 mM)를 처리한 세포주를 양성 대조군으로 사용하였다. 또한 세포에서 자연적으로 일어나는 p53 단백질의 분해를 막아 PTP 처리에 의한 p53 단백질 양의 증가로 인한 실험 오류를 배제하고자 프로테오좀에 의한 단백질 분해를 막는 MG132 (5 mM)을 1 시간 전처리하고 PTP와 Nutlin-3a를 처리한 세포주로 in situ PLA를 수행하였다.
그 결과를 도 3A 및 도 3B에 나타내었다.
MG132를 처리하여 단백질 분해를 억제한 HCT116 세포주에서 p53 단백질과 MDM2 단백질의 결합은 대조군에 비해 약 8.2배에서 11.9배 가량 증가하였으나, PTP나 MDM2 억제제인 Nutlin-3a를 처리한 세포주에서는 MG132 처리에 의한 p53-MDM2 결합의 증가가 억제된 것으로 나타났다.
따라서 PTP 처리에 의한 p53 단백질 증가는 p53-MDM2 결합의 감소에 의한 것임을 알 수 있었다.
<실시예 2> 대장암 세포주에서 PTP에 의한 세포 주기 및 세포 생장 변화 측정
2-1. 대장암 세포주에서 PTP에 의한 세포 주기 변화 확인
세포주는 상기 1-1에서와 같이 유지하였으며, 대장암 세포주에서 PTP 처리에 의한 세포 주기 변화를 측정하기 위한 세포의 준비는 다음과 같이 수행하였다.
10 mM의 PTP를 24 시간 동안 처리한 세포는 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 배양 접시로부터 분리하고 원심 분리하여 세포만 수득하였다. 수득한 세포를 70% 에탄올로 고정한 후, PBS로 세척한 다음 50 mg/ml의 RNase A와 50 mg/ml의 Propidium Iodide를 처리하여 유세포 분석을 통하여 세포 주기를 확인하고, 그 결과를 도 4A에 나타내었다.
HCT116 세포주에서는 10 mM의 PTP를 24 시간 동안 처리한 세포에서 세포 주기 중 G1 phase에 정지되어 있는 세포의 수가 증가함을 알 수 있었으나, HT-29 세포주에서는 PTP 처리에 의한 세포 변화가 관찰되지 않았다.
PTP 처리에 따른 세포 주기 조절 단백질의 변화를 확인하기 위하여 상기 1-3에서 준비한 세포 추출물과 항-Cyclin A 항체, 항-Cyclin D1 항체 및 항-Cyclin E (SantaCruz) 항체를 이용하여 웨스턴블롯 분석을 실행하였으며 그 결과를 도 4B에 나타내었다.
G1 phase의 표지자인 Cyclin D1과 Cyclin E 단백질은 PTP 처리 시간이 증가함에 따라 그 발현이 증가하였고, S phase의 표지자인 Cyclin A의 발현은 PTP 처리 24 시간 후 감소함을 확인할 수 있었다.
2-2. 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 대장암 세포주의 PTP 유도 세포노화
확인
PTP에 의한 대장암 세포주의 세포 노화를 확인하기 위해 0, 5 mM 및 10 mM의 PTP를 6일 동안 처리한 HCT116 세포주에 대하여 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.
PTP를 처리한 세포를 PBS 세척한 후, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 15 분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 2회 세척하고 베타-갈락토시다아제 활성 염색 용액(40 mM Citrate/Na-phosphate (pH 6.0), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2,5mMK-ferrocyanide,5mMK-ferricyanide,1mg/mlX-gal)을 첨가한 다음, 37℃ 항온 배양기에서 16 시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛을 차단하기 위해 은박호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.
베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경을 이용하여 관찰하고, 그 결과를 도 5A에 나타내고 수치화하여 도 5B에 제시하였다. 도 5는 PTP 처리 농도에 따른 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색 결과를 나타낸 것으로, PTP 처리 농도가 증가함에 따라 세포 노화 역시 증가하는 것을 알 수 있었다.
도 4와 도 5의 결과로부터 PTP 처리 후 암 세포주의 세포 주기가 G1 phase에 정체되고 이와 함께 세포 노화가 진행됨을 알 수 있었다.
2-3. PTP에 의한 대장암 세포주의 세포 사멸 확인
PTP에 의한 대장암 세포주의 세포 생존 정도를 확인하기 위하여 세포 생존능 및 증식 분석을 다음과 같이 실시하였다.
HCT116과 HT-29 세포주를 96-well 배양접시에 well 당 2,000 개의 세포수로 분주하고 24 시간 배양한다. 0, 2, 5, 10 mM의 PTP를 첨가하고 48 시간 배양 후 Ez-Cytox Cell viability, Proliferatin & Cytotoxicity Assay Kit (대일랩서비스)를 이용하여 발색하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대비한 세포 수의 차이를 확인하였으며, 그 결과를 도 6A에 나타내었다.
도 6A에서와 같이, 5 및 10 mM의 PTP를 처리한 HCT116 세포주의 증식은 대조군에 비해 유의하게 감소하였으나, 5 mM의 PTP를 처리한 HT-29 세포주는 유의한 증식 억제를 보이지 않았음을 알 수 있었다.
PTP에 의해 세포 사멸이 일어나는지 위하여 10 mM의 PTP를 처리한 세포를 40 시간 및 64 시간 배양한 후, 2-1에서와 같이 세포를 고정시킨 후 유세포 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 6B에 나타내었다.
세포의 사멸 정도는 subG1 분획에 존재하는 세포의 수를 이용하여 확인하였으며, HCT116 세포주에서는 PTP 처리 시간이 증가함에 따라 subG1 분획에 존재하는 세포의 수가 점진적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, HT-29 세포주에서는 PTP에 의한 subG1 분획의 증가를 보이지 않았다.
따라서, PTP가 G1 phase 정체, 세포 노화, 세포 사멸을 통하여 HCT116 세포의 증식을 억제함을 알 수 있었다.
<실시예 3> 대장암 세포주에서 PTP에 의한 종양억제유전자 p53 발현 조절 기전 확인
3-1. Erk1에 의한 PTP 유도 p53 인산화 확인
PTP에 의해 유도되는 p53의 인산화의 분자적 기전을 확인하기 위하여 상기 1-3에서 준비한 세포 추출물을 이용해 p53 인산화 및 인산화를 유도하는 것으로 알려진 MAP kinase의 활성 정도를 항-phospho-p53 (S15) 항체, 항-phospho-Erk1/2 항체, 항-phospho-JNK1/2 항체 및 항-phospho-p38 항체 (Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 웨스턴블롯 분석을 통해 확인하였으며, 도 7A에 제시하였다.
HCT116 세포주에 PTP를 처리하고 시간이 지남에 따라 p53 단백질과 인산화된 p53 및 인산화된 Erk1/2의 발현이 증가함을 확인할 수 있었고, 다른 MAP kinase인 JNK1/2 및 p38 단백질의 인산화는 변화가 없음을 확인하였다.
이에 따라 p53 단백질의 인산화 증가가 Erk1/2에 의해 조절되는지 확인하기 위하여, HCT116 세포주에 Erk1/2의 저해제로 알려진 U-0126 (10 mM)을 1 시간 전처리하고 10 mM의 PTP를 8 시간 동안 처리한 다음 1-3에서와 같은 방법으로 세포 내 단백질을 추출하여 웨스턴블롯 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 7B에 나타내었다.
PTP에 의한 p53의 인산화는 U-0126을 전처리한 HCT116 세포주에서 U-0126을 처리하지 않은 세포주에 비해 저해되어 있음을 확인하였으나, p53 단백질의 발현량은 U-0126 처리의 여부에 상관없이 증가해 있음을 확인할 수 있었다.
U-0126과 같은 저해제에 의한 Erk1/2 활성 억제와 더불어 siRNA를 이용하여 Erk1/2의 발현을 억제하고 PTP를 처리하여 p53 인산화 변화를 확인하고자 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
20 nM의 Erk1 및 Erk2 siRNA를 500 ml의 OPTI-MEM 배지에 섞은 다음 RNAiMAX 시약 (Invitrogen, USA)을 5 ml 첨가하여 상온에서 15 분간 방치한 다음, 60 mm 배양 접시에 HCT116 세포주를 항생제가 포함되지 않은 RPMI 1640 배지에 현탁한 후 250,000개의 세포수로 분주하고 섞어둔 siRNA mix를 첨가하여 24 시간 동안 배양한다. 24 시간 후 항생제가 포함된 배지로 교환하고 24 시간 배양한 후 10 mM의 PTP를 8 시간 처리한 다음 1-3과 같은 방법으로 단백질을 추출한 다음 웨스턴블롯 분석을 실시하고 그 결과를 도 7C에 나타내었으며, 사용한 siRNA의 염기서열은 표 2와 같다.
Erk1과 Erk2에 대한 siRNA로 각각의 유전자의 발현을 억제시키고 PTP를 처리한 HCT116 세포주에서 PTP에 의한 p53의 인산화가 대조군 siRNA를 도입한 세포에 비해 억제되었음을 확인하였으나, U-0126을 처리한 실험에서와 같이 p53 단백질의 증가는 영향 받지 않음을 알 수 있었다.
따라서, PTP는 HCT116 세포주에서 Erk1/2에 의해 p53 단백질의 인산화를 유도함을 확인할 수 있었으나, p53 인산화가 p53 단백질의 발현 증가에 필수적 요소가 아님을 알 수 있었다.
3-2. p300에 의한 PTP 유도 p53 아세틸화 확인
p53 단백질의 안정화와 관련된 것으로 알려진 p53의 아세틸화를 확인하기 위해 상기 1-3에서 준비한 단백질과 항-Ac-p53 (K382) 항체, 항-Ac-H3 항체를 이용하여 웨스턴블롯 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 8A에 나타내었다.
HCT116 세포주 및 HT-29 세포주에서 PTP 처리 시간이 증가함에 따라 p53의 아세틸화가 증가함을 확인할 수 있었고, histone H3의 아세틸화 역시 증가함을 알 수 있었으며, 이를 토대로 PTP가 p53의 아세틸화를 유도함으로써 p53 단백질의 안정화를 증가시켜 p53 단백질의 증가를 유도함을 확인할 수 있었다.
PTP에 의한 p53 단백질의 아세틸화 증가의 분자적 기전을 확인하기 위하여 HT-29 세포주에 p53의 아세틸화를 유도하는 것으로 알려진 p300에 대한 siRNA와 p300의 저해제인 Anacardic acid (10 mM)를 처리한 후 1, 4, 8 시간 후 1-3에서 제시된 방법으로 세포 내 단백질을 추출하고 항-Ac-p53 (K382) 항체, 항-p300 항체를 이용하여 웨스턴블롯 분석을 수행하고 그 결과를 도 8B와 도 8C에 각각 나타내었다.
사용한 p300에 대한 siRNA의 염기서열은 표 3과 같다.
HT-29 세포주에 10 mM의 PTP를 처리한 경우, 아세틸화 된 p53의 발현이 처리 시간이 지남에 따라 증가함을 확인하였고, p300에 대한 siRNA를 이용하여 p300 유전자의 발현을 억제하거나 Anacardic acid로 p300의 활성을 억제하였을 때에는 PTP에 의해 증가하는 p53의 아세틸화가 일어나지 않음을 알 수 있었다.
3-3. PTP에 의한 p53-p300 결합 증가 확인
PTP에 의한 p53 아세틸화의 증가가 p300에 의한 작용인지 확인하기 위하여 p300외에 p53의 탈아세틸화를 유도하는 것으로 알려진 HDAC1과 SirT1 및 p300과 p53 사이의 결합의 변화를 확인하였다.
HT-29 세포주에 10 mM의 PTP를 8 시간 처리한 후, 항-p53 항체, 항-p300 항체, 항-HDAC1 항체 및 항-SirT1 항체를 이용하여 상기 1-5에서의 방법으로 in situ PLA 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 9A에 나타내었으며 이를 수치화 하여 도 9B에 제시하였다.
p53과 p300 단백질의 결합은 대조군에 비해 약 2.4배 가량 증가하였으나, p53과 HDAC1, p53과 SirT1의 결합은 대조군과 차이를 보이지 않았다.
따라서, 상기의 결과를 토대로 PTP는 HDAC1이나 SirT1를 통해 p53의 탈아세틸화를 억제하는 것이 아닌 p300을 통하여 p53의 아세틸화를 유도함을 알 수 있었으며, 이로 인해 PTP에 의한 p53 단백질의 안정화가 일어남을 알 수 있었다.
상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터 PTP는 p300에 의한 p53의 아세틸화를 통해 p53 단백질의 안정화를 유도하고, Erk1/2에 의한 p53의 인산화를 유도하여 대장암 세포의 세포노화와 세포 사멸을 증가시키며, 이는 대장암 세포주의 p53 유전자의 상태에 따라 그 반응성이 다름을 확인할 수 있었으며, 이로부터 PTP가 야생형 p53 유전자를 가지는 암세포에서 항암 효과를 나타낼 수 있음을 증명하였다.
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